本发明涉及通过微粒乳状液法(miniemulsion method)制备纳米颗粒 的方法，所述纳米颗粒是通过向反应系统添加一定量的稳定剂而产生的。 本发明进一步涉及通过该方法制备的纳米颗粒以及它们用于治疗疾病和 病症的用途，所述治疗需要药剂穿过一个或更多的生理屏障，特别是血脑 屏障。

纳米颗粒为检测和治疗多种疾病，特别是癌症，提供了新希望。因此， 纳米颗粒在许多医药领域，特别是癌症治疗中，具有巨大的潜力。保证直 接向癌细胞递送肿瘤杀死药物，从而避免化学疗法不受欢迎的副作用，在 医药界中引起了对纳米颗粒的极大兴趣。

另外，除靶向递送外，纳米颗粒在其穿越人和动物体某些屏障的能力 上显示了惊人的效果。例如，在美国专利申请S.N.08/203,326和平行的国 际专利申请号PCT/EP 95/00724(相应地，WO 95/22963)中报导了通过纳 米颗粒的方式能够将药物递送到哺乳动物的机体，特别是人的机体，并且 能够穿越血脑屏障进行传输，所述纳米颗粒是与药物复合的(掺入的，吸 附的或吸收的)，并且由适当的表面活性剂制成的包衣所围绕。上述两篇 申请中均教导了药物可以是免疫抑制剂或抗癌剂。描述了大量的常规和可 商购的表面活性剂，例如聚山梨酯80或吐温80，作为适当的表面活性剂。

WO 98/56361也涉及纳米颗粒，并且其公开了不需要如WO 95/22963 所教导地那样应用围绕纳米颗粒/药物复合物的额外包衣。

按照现有技术，根据掺入的药剂是疏水性或亲水性的不同，利用单(水 包油)或多乳化作用(水包油包水)，通过一般称为“溶剂中乳化-挥发技 术”制备纳米颗粒。

产生纳米颗粒后，溶剂从乳化剂中挥发掉。通过离心法，或优选地超 速离心法(120,000-145,000g)从残余物分离纳米颗粒，用水洗涤，重新离心 并倾析。

从现有技术还已知在微粒乳状液中实现向多聚体的转化。微粒乳状液 是例如水，油相和一种或多种具有小滴尺寸约为50-500nm的表面活性剂 的分散体。认为微粒乳状液是亚稳定的(参见乳状液聚合作用和乳状液多 聚体(Emulsion Polymerization and Emulsion Polymers，编辑P.A.Lovell和 Mohamed S.El-Aasser，John Wiley和Sons，Chichester，纽约，Weinheim， 1997，第700页以及下列等等；Mohamed S.El-Aasser，乳状液聚合作用和 乳胶技术中的进展(Advances in Emulsion Polymerization and Latex Technology)，第30界年度短期课程(30th Annual Short Course)，卷3，6 月7-11日，1999，乳状液多聚体学院(Emulsion Polymers Institute)，Lehigh University，伯利恒(Bethlehem)，宾夕法尼亚州，美国)。这些分散体在清 洁产品，化妆品或美体产品领域中发现了广泛的应用。

例如，由国际专利申请WO 98/02466或由德国专利DE-A-196 28 143 和DE-A-196 28 142已知，通过烯属不饱和单体的自由基微粒乳状液聚合 作用制备水性第一分散体。在这些已知过程的情形中，单体在不同的低分 子量、低聚或多聚疏水性物质的存在下能够共聚合。

优选的纳米颗粒形成方法是如K.Landfester等开发的微粒乳状液技 术：

此时，将微粒乳状液定义为临界稳定的、大小为50-500nm的油滴的 分散体，是通过剪切包含水、表面活性剂(或“稳定剂”)和疏水物的系 统而制备的。该微粒乳状液中单体的聚合作用导致具有与最初小滴大约相 同尺寸的粒子。图1中示意性地显示了微粒乳状液聚合作用的原理(K. Landfester，微粒乳状液中的聚合反应(Polyreactions in miniemulsions)，高 分子快讯(Macromol.Rapid Comm.)2001，896-936.K.Landfester，N. Bechthold，F.Tiarks，和M.Antonietti，可多聚微粒乳状液的剂型和稳定机制 (Formulation and stability mechanisms of polymerizable miniemulsions).高 分子(Macromolecules)1999，32，5222.K.Landfester，微粒乳状液中的近 期发展——剂型和稳定机制(Recent Developments in miniemulsions- Formation and Stability Mechanisms).高分子专题论文(Macromol.Symp.) 2000，150，171)。

WO0209862(DE 10101892)公开了用于制备包含活性成分或物质的多 聚体胶囊、小丸或小滴的方法，该方法借助于利用适当单体的非自由基微 粒乳化液聚合作用，优选地加聚作用，原位包封所述活性成分或物质。由 上述方法制备的包含活性成分或物质的多聚体媒介物系统能够作为递送 系统使用，特别是在化妆品和美体领域、医药品、粘和过程和/或洗涤和清 洁剂领域中。

DE19852784公开了借助于表面活性剂(S1)和共表面活性剂(S2) 稳定油/水微乳状液(micro-emulsion)或微粒乳状液(miniemulsion)的方法， 其中(S2)由为提供渗透性稳定的乳状液而选出不溶于水的化合物组成， 该化合物不包括十六烷、十六醇、十二烷硫醇、长链甲基丙烯酸烷基酯和 染料蓝70。还公开了渗透性稳定的微乳状液或微粒乳状液，其包含油相， 水相，表面活性剂(S1)和如上所定义的超疏水性共表面活性剂(S2)。

WO2004017945公开了纳米颗粒对将DNA转染到真核细胞中的用途。 其进一步公开了在人或动物体内向靶器官的DNA施用。特别地， WO2004017945教导了纳米颗粒对向人或动物体内受肿瘤影响的靶器官 如，例如脑肿瘤情形中的脑，施用与癌症治疗相关DNA的用途。 WO2004017945还公开了利用对DNA和纳米颗粒间结合起增强剂作用的 物质(“稳定剂”)。特别是，将二乙基氨基乙基-(DEAE)-葡聚糖和葡聚糖 70.000列为稳定剂。

然而，按照WO2004017945，制备那些纳米颗粒的唯一方法是通过常 规乳状液聚合作用，例如，直接从溶剂中的单体溶液形成纳米颗粒。

本发明的目的是提供改进的用于制备药物递送媒介物的方法，所述媒 介物能够高产率地，并以固体含量(solid content)获得。此外，本发明的 目的是提供用于制备药物递送媒介物的方法，所述方法适合于该媒介物的 大规模生产。此外，本发明的目的是提供用于药剂递送媒介物，其明确地 与所需的释放特征相适应。本发明的目的尤其是提供递送媒介物，该媒介 物适合用于改变医学状态，能够明确地穿过动物或人体的主要生理或生物 屏障，并且随之显示出在靶组织中改良的释放特征，如药剂持续的释放或 延长的释放。本发明另外的目的是避免使用表面活性剂，例如聚山梨酯80， 作为纳米颗粒上的包衣。

这些目的通过独立权利要求的主题实现。在从属权利要求中阐述了优 选的实施方案。

作为一般说明，本发明的纳米颗粒是通过“微粒乳状液法”形成的， 其本身是众所周知的，并且例如公开于K.Landfester，“微粒乳状液中的 聚合反应(Polyreactions in miniemulsions)”，高分子快讯(Macromol.Rapid Comm.)2001，896-936.K.Landfester，N.Bechthold，F.Tiarks，和M.Antonietti， “可聚合微粒乳状液的剂型和稳定性机制(Formulation and stability mechanisms of polymerizable miniemulsions)”中。该技术主要通过涉及不 同顺序的制备步骤而区别于众所周知的常规方法(如，例如WO2004017945 中所使用的)：在该方法中，使微粒乳状液形成多聚粒子，该微粒乳状液 在亲水性连续相中包含分散的疏水性、含有单体的小滴。在常规方法中， 多聚体直接由含有单体的溶液形成。

因此，术语“微粒乳状液”用于本文时通常指一种技术，通过该技术 产生分散体，该分散体含有分散在连续相中的连续的W(亲水的)和O(疏 水的)相。而且，该术语涉及形成的1-1.000nm的乳状液滴，通常大约 50-500nm(聚合作用后的粒子尺寸相同或几乎相同)。

常规方法和微粒乳状液方法的另一个区别是后者中，在方法开始时使 两液相相接触，且随后形成乳状液。在常规乳状液法中，在开始时仅将一 相的小滴滴入另一相中。

基于通过常规方法仅能获得含有大约1％纳米颗粒(固体含量)的混 悬液的事实能够看出其主要缺点之一。相反，本微粒乳状液方法容许含有 甚至15-24％或更高固体含量的纳米颗粒，该含量基于25％w/w单体含量 (基于O/W反应系统的总重)。因此，固体纳米颗粒的产率显著提高，并 且相当于所用单体的大约60-96％。

通过本方法，有可能获得高固体含量(范围：15-24％)以及由此获得 高产率(60-96％)的纳米颗粒混悬液，这在扩大规模的方面是非常重要的。 该过程是可重复的。所产生的纳米颗粒的平均直径是200-300nm(范围<1 μm)(见图2)。

作为实施例，如果O相由6g单体+250mg疏水物组成，W相是24g 0.01 N HCl+稳定剂，则固体的最大含量应是25％w/w(6/24 x 100)，相当于100％ 的产率。那么，20％w/w的含量相当于80％的产率。在这种情形中，剩余 的20％表现为单体，其在聚合作用的过程中，例如通过在器皿表面上或在 均化器等上的聚合损失掉了。

然而，本发明与现有技术方法的主要区别存在于这样的事实中，所述 事实是按照本发明对纳米颗粒没有使用表面活性剂包衣。令人惊讶地证实 了众所周知的表面活性剂包衣如果运送一种或多种药物，则可能对纳米颗 粒的治疗安全性具有有害的影响。特别地，实验结果显示高达40重量-％ 是初始加入的药物(吸附于纳米颗粒)由表面活性剂包衣所替代。然而， 这导致无法接受地变化的和不精确量的药物与纳米颗粒结合，从而降低了 药物包被的纳米颗粒的治疗功效和可靠性。

但是，省去纳米颗粒的表面活性剂包衣导致这些纳米颗粒穿过生理屏 障，例如血脑屏障的能力降低。可以通过这样的事实对其进行解释，所述 事实是表面活性剂包被物质(例如，吐温80)能够分别吸收血液中出现的 ApoE和ApoA，从而容许向血脑屏障的脂蛋白受体呈递纳米颗粒。这依次 引起受体介导的纳米颗粒内吞作用，以及由此引起纳米颗粒通过血脑屏 障。

因此，为了避免吸附于纳米颗粒上的药物的替换，简单地去除表面活 性剂包衣是不利的。

本发明人现在创建了一种溶液，该溶液克服了这两个问题，即避免与 使用表面活性剂包衣相关的缺点并维持包衣对穿过生理屏障，特别是血脑 屏障的积极作用：

与形成现有技术表面活性剂包衣的那些表面活性剂相同或相似的表面 活性剂已经在它们的制备过程中被掺入到纳米颗粒中了。更确切地，发现 如果将表面活性剂或稳定剂以基于可聚合单体总重10-25重量％的量掺入 于纳米颗粒中，它们是有效的。因此，本发明的方法由于在应用于生物体 前不再需要与表面活性剂混合，相当大地简化了加工程序，并促进临床应 用。

因此，在第一方面，按照本发明的制备纳米颗粒的方法包括下列步骤：

a)提供反应系统，其包括O和W型液相，一种或多种稳定剂和可聚 合单体，其中以基于可聚合单体总重10-25重量％的量加入所述一种或多 种稳定剂，

b)形成O/W型微粒乳状液，所述O相小滴含有所述单体，

c)聚合所述单体，从而形成纳米颗粒，其中将一种或多种能够与所述 纳米颗粒结合的药剂加入到所述纳米颗粒中，从而生成由所述一种或多种 药剂包被的纳米颗粒，和/或，其中在步骤a)中加入一种或多种药剂。

一种或多种稳定剂的量是基于可聚合单体总重的10-25重量％，即优 选地不包括10和25重量％的值。还应该注意用于本文的“稳定剂的量” 还包括若干组合的稳定剂的总量。例如，所述10-25重量％的量可以由10％ 十二烷基硫酸钠和10％聚山梨酯80组成(见实施例2)。

术语“稳定剂”用于本发明时应该包括任何能够稳定乳状液的物质。 这些物质优选地是表面活性物质，即表面活性剂。

在另一方面，本发明提供制备纳米颗粒的方法，该方法由上文提及的 步骤组成。

本发明人发现稳定剂或表面活性剂与本发明纳米颗粒相掺入的最宽可 能范围是基于可聚合单体总重的10-25重量％。该范围对于测试的所有稳 定剂(表面活性剂)都是正确的。可以通过这样的实验结果解释该范围， 所述实验结果显示基于可聚合单体总重的10重量％及更少的量不足以容 许足量的纳米颗粒穿过生理屏障。另一方面，如果使用基于可聚合单体总 重的25重量％或更多，则无法接受的大量稳定剂(表面活性剂)会被递送 到患者体内。

此外，证实了超过25重量％的量的稳定剂能够导致不需要的聚合过程 本身的开始。这种不利情形的结果是由于粒子凝聚从而没有明显的纳米颗 粒形成。

将术语“反应系统”在用于本文时定义为任何环境，该环境实现形成 按照上文定义的微粒乳状液的要求。

如上所述，如，例如Landfester等(见上)中所公开地，已知的微粒乳状 液技术能够用于制备微粒乳状液。这能够例如通过首先结合单体，O和W 相和稳定剂(如下定义)完成。注意到W相可以含有更多成分，例如HCl 或H3PO4，从而调整适当的pH值。第二，可以通过例如均化器等混合反 应系统，从而混合全部成分。

通过对反应系统应用高剪切力，例如通过超声波和高压均化器，实现 微粒乳状液自身的制备。此外，依赖于反应系统的尺寸和所使用的均化器， 应用剪切力2-5分钟。基本上，认为3-4分钟的时间范围是充足的。

超声波均化器可以具有大约60-100％的振幅，优选地，大约70-90％。

该方法中所使用的温度优选地为-1-5℃，优选地，0℃。

通常，O对W相的重量比是15-40％w/w，优选地，20-30％w/w，和 更优选地，大约25％w/w。

制备微粒乳状液后，例如通过仅仅升高pH到pH7.0等起始聚合过程。 这只要是在反应系统中使用PBCA单体并例如通过向反应系统加入足量 K2CO3或通过将微粒乳状液倒入基本溶液而实现pH的增高，就能够完成， 所述基本溶液由水性0.5M NH3或水性0.1M tris-碱或水性0.1M NaOH溶 液组成。

本发明的纳米颗粒优选地具有在50-500nm范围内的直径，更优选地， 200-300nm(见图2作为实例)，然而，可以观察到当使用更高摩尔浓度的 水性H3PO4溶液制备微粒乳状液时，粒子尺寸减小。

在本发明中，令人惊讶地证实了通过上述微粒乳状液法制备的纳米颗 粒具有未预料到的特征和优点。首先，如上所述，该制备方法的产率比常 规方法的产率高得多。此外，然而，证实了由本发明的方法制备的纳米颗 粒具有改善的使药剂与其表面结合的能力。令人惊讶地，能够显示该效果 不依赖于所涉及的药剂(或药物)的特性。

在不与任何特殊理论相结合的情况下，认为本发明纳米颗粒的三维结 构容许药物分子与纳米颗粒更稳定的附着。显微镜测定显示出不是平滑一 致的纳米颗粒表面，而是线团状表面结构。我们的理论是该线团状结构不 依赖于它们的物理或化学行为，促进药物分子与纳米颗粒的结合。

然而，还应该提及所述一种或多种药剂不必须必要地包被在纳米颗粒 上。还可能通过已经在步骤a)中加入所述试剂，将它们掺入到纳米颗粒 中。在这种情形中，其依赖于药剂以及其在优选地将其引入的两相中的化 学和/或物理特性。清楚的是优选地将亲脂性试剂掺入到O型液相中，将 亲水性试剂引入到W型液相中。这两种方法的结合也是可能的，即在步 骤a)中添加药剂并在制备后将该药剂包被在纳米颗粒上。

在优选的实施方案中，步骤a)中添加基于可聚合单体总重的12-23 重量％，优选地，15-20重量％的量的稳定剂。

在另外实施方案中，执行了另外的步骤d)，其中向所提供的纳米颗粒 添加媒介物，从而容许所述纳米颗粒在给药后向哺乳动物内或上的靶标传 输。更优选地，步骤d)提供药物组合物形式的纳米颗粒。

所述药物组合物包括生理上可接受的载体和/或稀释剂，从而容许所述 纳米颗粒在给药后向哺乳动物，优选地人体内的靶标传送。优选地，所述 载体和/或稀释剂选自由水、生理上可接受的水性溶液组成的组，所述生理 上可接受的水性溶液包含盐和/或缓冲液以及任何可用于向哺乳动物给药 的其他溶液。所述载体和稀释剂对于本领域中的技术人员是熟知的，并且 包括蒸馏水、去离子水、纯或超纯水、盐水、磷酸盐缓冲液(PBS)，含有 与药物靶向系统等的其他成分相容的常用缓冲液的溶液。

为了在体内使用纳米颗粒，可以在生理pH和同渗浓度(osmolarity)下， 将它们与普通盐水或磷酸盐缓冲水溶液重建到混悬液中。

典型地，纳米颗粒以0.1mg纳米颗粒/ml混悬液流体-100mg纳米颗粒 /ml混悬液流体的浓度存在于可注射的混悬液中。10mg纳米颗粒/ml是优 选的。所使用的纳米颗粒的量强烈依赖于每个纳米颗粒中所包含药剂的 量，并且负责的技术人员或医师能够无困难地使纳米颗粒的剂量适合于特 定的情况。

备选地，药物组合物可以选择传输本发明的递送媒介物到达和穿过其 他生理屏障，例如达到和穿过脑-气屏障，所需要的其他形式。于是它可以， 例如具有气雾剂等的形式，从而通过吸入到有问题的屏障中而递送该组合 物。

药物组合物优选地选择用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、 鼻内、肺或直肠给药，优选地用于口服或静脉内给药的药物形式。

在本发明的方法中，用药剂包被纳米颗粒的步骤优选地包括混合所述 纳米颗粒和所述一种或多种药剂的溶液，并容许充足的时间使足量的所述 一种或多种药剂吸附到纳米颗粒上和/或被纳米颗粒吸收。

本方法中所使用的O相优选地含有疏水物，其选自橄榄油、miglyol、 大豆油和/或十六烷、正-己烷、液体石蜡、维生素E或甘油三酯的脂肪酸 酯。疏水物的量通常相对较少，且应该足以防止奥斯特瓦尔德熟化(基于 O相总重的大约2-20％w/w(进一步含有单体)。

使用了可聚合单体，从而形成多聚物质，所述多聚物质优选地选自由 下列各项组成的组：聚丙烯酸脂，聚甲基丙烯酸酯，聚氰基丙烯酸酯，优 选地，聚烷基氰基丙烯酸酯，聚芳基酰胺，聚乳酸酯，聚乙醇酸酯，聚酸 酐，聚原酸酯，明胶，多糖，清蛋白，聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯醛，聚 戊二醛，及其衍生物、共聚物和混合物。

优选的多聚物质包括固态或薄膜形式的多聚体，优选地，聚烷基氰基 丙烯酸酯，更优选地，聚丁基氰基丙烯酸酯，聚乳酸和聚丁酸，及其混合 物和衍生物。

本发明中所使用(产生)的多聚物质优选地是可生物降解的。这个术 语表示已知适合于在生物体内使用的任何合成的或天然来源的多聚物质， 即是生物学上惰性的和生理学上可接受的，无毒的，并且，在本发明的递 送系统中，在使用环境中是可生物降解的，即能够被身体再吸收。

也能够用于配制纳米颗粒的其他可生物降解的多聚体包括，但不仅限 于，聚酯，诸如聚乙交酯，聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)；聚醚，诸如 羟基末端的聚(ε-己内酯)-聚醚或聚己内酯(PCL)；聚酐；聚丙烯酰胺； 聚(原酸酯)；聚氨基酸；和可生物降解的聚氨基甲酸脂。应该理解应该 将术语多聚体解释为包括共聚物和低聚物。

步骤a)中提供的稳定剂的实施方案包括一种或多种下列物质：

甘油、山梨醇和其他单或多功能醇的脂肪酸酯，优选地苯甲醇，甘油 单硬脂酸酯，失水山梨醇单月桂酸酯，或失水山梨糖醇单油酸酯；多糖， 苯甲酸苄酯，聚乙二醇(PEG200，300，400，500，600)，聚乙二醇羟基 硬脂酸酯，优选地，Solutol HS 15；poloxamines，优选地，poloxamine 904， 908，或1508；聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯；乙氧基化甘油三酯；乙氧基化 苯酚和乙氧基联苯酚；polyoxyl蓖麻油，优选地，ELP；卵磷脂，脂肪酸 的金属盐，脂肪醇硫酸酯的金属盐(metal salts of fatty alcohol sulfates)；和 磺基琥珀酸酯(sulfosuccinates)的金属盐；优选地聚山梨醇酯，更优选地， 聚山梨醇酯20，60和最优选地，聚山梨酯80；优选地，泊洛沙姆，更优 选地，泊洛沙姆188，388或407；优选地，聚乙二醇，更优选地，Lutensol 50或80；阴离子表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠；以及两种或更多种 所述物质的混合物。

应该注意全部这些稳定剂(或表面活性剂)的分子结构显示出相似性， 它们的特性也如此。

用于包被纳米颗粒的一种或多种药剂选自治疗剂和诊断剂。

治疗剂优选地选自在无递送媒介物或载体的情况下不能穿过生理屏障 的物质。生理屏障优选地选择，尽管不限于，由血脑屏障(bbb)，血-气屏 障，血-脑脊髓液屏障和口腔粘膜组成的组。另外，所述一种或多种治疗剂 具有中枢神经系统活性，但在无递送媒介物的情况下不能穿过血脑屏障。

注意到在本文中术语“药物”和“治疗剂”可交替使用。

按照优选的实施方案，本发明的递送媒介物包括一种或多种治疗剂， 所述一种或多种治疗剂选自由下列各项组成的组：在突触位点和神经效应 器连接位点处作用的药物；通用和局部止痛剂；催眠剂和镇静剂；用于治 疗精神病学病症，如忧郁症和精神分裂症的药物；抗癫痫药剂和抗痉挛剂； 用于治疗帕金森氏症和亨廷顿氏症、老化和阿尔茨海默氏症的药物；兴奋 性氨基酸拮抗剂，神经营养因子和神经再生剂；营养因子；针对CNS创 伤或中风治疗的药物；用于治疗上瘾和药物滥用的药物；抗肥胖药； antacoids和消炎药；用于由微生物引起的寄生性感染和疾病的化学治疗 剂；免疫抑制剂和抗癌药；激素和激素拮抗剂；重金属和重金属拮抗剂； 非金属毒性试剂的拮抗剂；用于治疗癌症的细胞生长抑制剂；核医学中使 用的诊断物质；免疫活性和免疫反应性试剂；递质以及它们各自的受体激 动剂和受体拮抗剂，它们各自的前体和代谢物；输送物抑制剂；抗生素； 镇痉药；抗组胺剂；止吐剂；弛缓剂；兴奋剂；有义和反义寡核苷酸； 脑扩张器；神经药物；抗狂躁药；脉管扩张剂和收缩剂；抗高血压药；用 于偏头痛治疗的药物；催眠药；高血糖症和低血糖症试剂；平喘药；抗病 毒剂；优选地，抗HIV试剂；适合于疾病的DNA，si-RNA或反义治疗的 遗传物质；及其混合物。

术语“DNA”用于本说明书时主要指本技术领域中可能的任何DNA。 在优选的实施方案中，术语“DNA”有意包括两种DNA类型，即质粒DNA 和反义寡核苷酸，一方面，所述质粒DNA，更优选地为，包含肿瘤抑制 剂基因信息的质粒DNA，甚至更优选地，包含肿瘤抑制剂基因p53和pRB 信息的质粒DNA，另一方面，所述反义寡核苷酸，更优选地为，针对癌 基因的反义寡核苷酸，甚至更优选地，针对癌基因，如Bcl2的反义寡核 苷酸。本发明可以使用一种DNA类型(和从而负载一种DNA类型的纳米 颗粒)。备选地，可以使用两种或更多种DNA类型，从而导致大量负载了 不同DNA类型并可以按照本发明使用的纳米颗粒类型。

令人惊讶地，DNA且尤其是上述两种类型的DNA能够吸附在纳米颗 粒上，且能够将由此产生的DNA-纳米颗粒复合物接种到生物体中，尤其 是患有癌症(特别地，但不仅限于，脑癌)的生物体中。随后，能够观察 到肿瘤增殖的抑制，且甚至能够诱导肿瘤坏死和程序性细胞死亡。

在本发明优选的而非基本的实施方案中，能够将包含启动子的质粒 DNA，更优选地包含可诱导的启动子的质粒DNA加载到纳米颗粒上。通 过将含有可诱导启动子的DNA加载到纳米颗粒上和在细胞内对其进行表 达的新步骤，能获得可诱导的启动子，以及从而获得相关基因表达的外部 控制，并且能够随意地将基因开启或关闭。作为未预料到的超越现有技术 的优势，能够控制基因/DNA表达的时刻。该控制能够减少连续基因表达 的毒性副作用，和/或能够降低细胞对基因产品产生抗性，及由此产生负选 择的可能性。

在本发明优选的实施方案中，将人乳头状瘤病毒上游调节区域 (HPV-URR)用作可诱导的启动子。施用了地塞米松或其他诱导物或化合物 后，诱导了肿瘤抑制剂的表达。通过该方法，能够实现肿瘤细胞程序性细 胞死亡以及肿瘤的衰退。按照本发明可以使用的其他示范性启动子是巨细 胞病毒(CMV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。

此外，通过组合施用含有一种或超过一种DNA类型的纳米颗粒和含 有一种或超过一种抑制细胞生长的有效物质，能够实现肿瘤衰退的强烈效 果。

在优选的实施方案中，能够在接种含有抑制细胞生长有效化合物的纳 米颗粒复合体前注射肿瘤抑制剂DNA，甚至更优选地在可诱导启动子之 后。在甚至更优选的实施方案中，抑制细胞生长的有效化合物是多柔比星 (doxorubicine)。

在DNA向细胞转染的过程中，以及还有在向人或动物体内的靶器官 施用DNA的过程中，第一步包括以如上定义的方式制备纳米颗粒。

为了获得更多的信息，明确地参考WO 2004/017945，并将其内容作为 整体引入本文。

更多的典型活性成分(例如，药物)可以是任何作用于神经系统或用 于神经系统诊断测试的物质。这些记述在Gilman等(1990)，“古德曼和吉 尔曼—治疗学的药理学基础”(＂Goodman and Gilman′s-The Pharmacological Basis of Therapeutics＂)，Pergamon出版社，纽约，中，并 且包括下列试剂：

乙酰胆碱和合成的胆碱酯，天然存在的拟胆碱生物碱和它们合成的同 类物，抗胆碱脂酶试剂，神经节兴奋剂，阿托品，东莨菪碱和相关的抗毒 蕈碱药物，儿茶酚胺和类交感神经药物，如肾上腺素，去甲肾上腺素和多 巴胺，肾上腺素激动剂，肾上腺素受体拮抗剂，递质诸如GABA，甘氨酸， 谷氨酸盐(酯)，乙酰胆碱，多巴胺，5-羟色胺，和组胺，神经活性肽；止 痛剂和麻醉剂，诸如阿片样止痛剂和拮抗剂；前麻醉剂和麻醉药物，诸如 苯并二氮，巴比妥酸酯，抗组胺剂，吩噻嗪和butylphenones；阿片样物质， 止吐剂；抗胆碱能药物，诸如阿托品，东莨菪碱或格隆溴铵；可卡因；氯 醛衍生物；乙氯维诺；苯乙哌啶酮；甲乙哌酮；氨甲丙二酯；三聚乙醛； 双硫醒；吗啡，芬酞尼和纳洛酮；神经病学药物，诸如吩噻嗪，噻吨和其 他杂环化合物(例如，氟哌啶醇)；三环抗抑郁剂，诸如去丙咪嗪和丙咪 嗪；非典型抗抑郁剂(例如，氟西汀和曲唑酮)，去单胺氧化酶抑制剂， 诸如异唑肼；锂盐；抗焦虑药，诸如氯氮和地西泮；抗癫痫药，包括乙 内酰脲，抗痉挛巴比妥酸酯，iminostilbines(如卡马西平)，琥珀酰亚胺， 丙戊酸，噁唑烷二酮和苯二氮杂类。抗帕金森症药物，诸如左旋多巴/ 卡比多巴，阿朴吗啡，阿马他定(amatadine)，麦角灵，司来吉兰，累匹 利洛，甲磺酸溴隐亭和抗胆碱药；抗痉挛药，诸如巴氯芬，地西泮和达者 伦；神经保护剂，诸如兴奋性氨基酸拮抗剂，神经营养因子，和脑衍生的 神经营养因子，睫状神经营养因子，或神经生长因子；神经营养(NT)3 (NT3)；NT4和NT5；神经节苷脂；神经再生试剂；用于治疗上瘾和药 物滥用的药物，包括阿片样拮抗剂和抗抑郁剂；autocoids和消炎药，诸如 组胺，缓激肽，赖氨酰缓激肽和它们各自的激动剂和拮抗剂；用于寄生性 感染和微生物疾病的化学治疗剂；抗癌药，包括烷化剂(例如，亚硝基脲) 和抗代谢物；氮芥，乙烯胺和甲蜜胺；烷基磺酸酯；叶酸类似物；嘧啶类 似物，嘌呤类似物，长春胺类似物；抗肥胖药，如苯双甲吗啉，苯丁胺， 安非拉酮，西布茶明；和抗生素。

按照优选的实施方案，诊断剂选自由在核医学和发射治疗中用于诊断 的诊断剂组成的组。

实施方案中本发明的方法还优选地包括一个步骤，其中在步骤c)之 后从纳米颗粒中至少部分地去除所述稳定剂。然而，应该遵守本发明的步 骤a)中所指出的10-25重量％的范围。

优选地，通过透析或离心能完成额外的步骤。令人惊讶地证实了尽管 制备方法本身需要稳定剂，在最终纳米颗粒形成后，可以至少部分地去除 稳定剂。换言之，可以去除“过量的”稳定剂，所述“过量的”稳定剂对 于维持纳米颗粒的稳定性是不需要的，但是能够对在体应用引起潜在的风 险。假设将纳米颗粒中稳定剂的最低可能量认为是具有最低的体内风险。 然而，该量不能太低，其原因在于那会妨碍纳米颗粒穿过生理屏障的能力。

在第二方面中，本发明提供通过如上定义的方法所获得的包被的纳米 颗粒或药物组合物。

所述包被的纳米颗粒或药物组合物能够用于制备治疗疾病和病症的药 物，其需要药剂从而穿过一个或多个生理屏障，特别是血脑屏障。

将本文提及的全部出版物、专利申请、专利以及其他参考整体引入作 为参考。在冲突的情形中，以本说明书，包括定义为准。另外，物质、方 法和实施例仅用于进行举例说明，而非意欲进行限制。

现在通过附图进一步举例说明本发明，其中：

图1是显示微粒乳状液聚合作用技术的图表；

图2是按照本发明制备的纳米颗粒的照片；

图3是实施例1中制备的纳米颗粒粒子尺寸分布的图像；

图4显示向由十二烷基硫酸钠(SDS)所稳定的聚丁基氰基丙烯酸酯 纳米颗粒中掺入不同量的聚山梨酯80(1，4％，2，5％，5％，7，5％和10％)。 由此生成的纳米颗粒混悬液的粒子尺寸是通过光子关联能谱法测量的。显 示出所获得的纳米颗粒混悬液的粒子尺寸取决于聚山梨酯80的掺入量；

图5表示静脉注射纯FITC标记的纳米颗粒后的大鼠脑组织恒冷箱切 片(不按照本发明)；

图6显示静脉注射FITC标记的含有掺入的聚山梨酯80的SDS-纳米 颗粒后的大鼠脑组织恒冷箱切片(按照本发明)。

图7显示静脉注射FITC标记的含有掺入的聚山梨酯80的纳米颗粒后 的大鼠脑组织恒冷箱切片(按照本发明)。

实施例

实施例1

利用微粒乳状液法将聚山梨酯80掺入到由SDS稳定的聚丁基氰基丙烯酸 酯纳米颗粒中

制备两种单独的溶液。

溶液1：将2.4ml盐酸(0.1mol·l-1)加入到10ml的烧瓶中(PP)。再向 该溶液中加入0.06g十二烷基硫酸钠(SDS)和30mg聚山梨酯80。搅拌 由此生成的溶液直到形成澄清的溶液。

溶液2：将32.3μL十六烷和545.5μL(0.6g)n-丁基-α-氰基丙烯酸酯 (Indermil)加入到5ml的烧瓶中。转动该烧瓶直到形成均匀的溶液。

将溶液2加入到溶液1中，并且通过超声波处理(振幅70％，0℃)由 此生成的混悬液2分钟立即形成微粒乳状液。然后，通过将该微粒乳状液 加入到2.4ml 0.1mol l-1水性NaOH溶液(10ml烧瓶)中，迅速将pH值从 1改变至7，从而开始单体小滴的聚合作用。再搅拌所获得的混悬液5分 钟。该纳米颗粒混悬液具有固体含量111.8mg/ml和平均粒子尺寸118.4± 0.7nm(光子关联能谱法)。

实施例2

利用微粒乳状液法将聚山梨酯80和FITC-葡聚糖掺入到由SDS稳定的聚 丁基氰基丙烯酸酯纳米颗粒中

制备两种单独的溶液。

溶液1：将2.4ml盐酸(0.1mol·l-1)加入到10ml的烧瓶中(PP)。再向 该溶液中加入0.06g十二烷基硫酸钠(SDS)、60mg聚山梨酯80和9.0mg 荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖77.000(FITC-葡聚糖)。搅拌由此生成的溶液直 到形成澄清的溶液。

溶液2：将32.3μL十六烷和545.5μL(0.6g)n-丁基-α-氰基丙烯酸酯 (Indermil)加入到5ml的烧瓶中。转动该烧瓶直到形成均匀的溶液。

将溶液2加入到溶液1中，并且通过超声波处理(振幅70％，0℃)由 此生成的混悬液2分钟立即形成微粒乳状液。然后，通过将该微粒乳状液 加入到2.4ml的0.1mol l-1水性NaOH溶液(10ml烧瓶)中，迅速将pH 值从1改变至7，从而开始单体小滴的聚合作用。然后搅拌所获得的混悬 液5分钟。再对由此生成的标记的纳米颗粒进行透析(10次)，从而去除 可能未结合的FITC-葡聚糖和过量的稳定剂。该纳米颗粒混悬液具有固体 含量28.9mg/ml和平均粒子尺寸(光子关联能谱法)258.4±7.0nm。

然后用0.9％ NaCl溶液(1：1)稀释所获得的纳米颗粒混悬液，从而 进行体内试验。

实施例3

利用微粒乳状液法将聚山梨酯80和FITC-葡聚糖掺入到聚丁基氰基丙烯 酸酯纳米颗粒中

制备两种单独的溶液。

溶液1：将0.0338g荧光素异硫氰酸酯77.000(FITC-葡聚糖)(1.5％) 和0.513g吐温80(22.75％)加入到50ml的烧瓶中。再加入9ml磷酸(0.8 mol/l)，并搅拌由此生成的溶液30分钟直到形成澄清的溶液。

溶液2：将0.09g大豆油(4％)加入到10ml烧瓶中。再加入2.050ml (2.255g)n-丁基-α-氰基丙烯酸酯(Indermil，冷却至4℃)。通过抽吸混 合由此生成的溶液。

将溶液2加入到溶液1中，并且通过超声波处理(振幅70％，0℃， Titanplate TT 13)由此生成的混悬液4分钟立即形成微粒乳状液。然后， 通过将该微粒乳状液加入到9ml的0.5mol l-1氨水溶液(50ml烧瓶)中， 迅速将pH值从1改变至7，从而开始单体小滴的聚合作用。再搅拌所获 得的混悬液5分钟。利用pH计检查pH值。只要pH值到达7，加入氨水 溶液。该纳米颗粒混悬液具有固体含量97.46mg/ml和平均粒子尺寸(光 子关联能谱法)151nm±1.31(PDI 0.244)。透析(27次)后该纳米颗粒混 悬液具有平均粒子尺寸(光子关联能谱法)143nm±1.0(PDI 0.232)。利 用紫外光谱法确定掺入的FITC-葡聚糖的量为33.98％(11.48mg)。

跟随在实施例3的程序之后的另外的备选说明是：

1.吐温80：20％，大豆油4.2％，0.8M H3PO4，0.5M NH3，粒子尺寸： 120nm；PDI：0，14，固体含量：100mg/ml

2.吐温80：20％，大豆油4.0％，1M H3PO4，0.5M NH3，粒子尺寸： 140nm；PDI：0，19，固体含量：110mg/ml

3.吐温80：22.75％，大豆油4.0％，0.8M H3PO4，0.1M Tris-碱，粒子尺 寸：120nm；PDI：0.15，固体含量：40mg/ml

4.吐温80：20％，大豆油4.2％，1M H3PO4，0，1M Tris-碱，粒子尺寸： 125nm；PDI：0.13，固体含量：45mg/ml

然后用0.9％ NaCl溶液稀释所获得的纳米颗粒混悬液，从而进行体内 试验。

实施例4

利用微粒乳状液法将FITC-葡聚糖掺入到由SDS稳定的聚丁基氰基丙烯酸 酯纳米颗粒中(比较实施例)

制备两种单独的溶液。

溶液1：将2.4ml盐酸(0.1mol·l-1)加入到10ml的烧瓶中(PP)。再向 该溶液中加入0.06g十二烷基硫酸钠(SDS)和9.0mg荧光素异硫氰酸酯- 葡聚糖77.000(FITC-葡聚糖)。搅拌由此生成的溶液直到形成澄清的溶液。

溶液2：将32.3μL十六烷和545.5μL(0.6g)n-丁基-α-氰基丙烯酸酯 (Indermil)加入到5ml的烧瓶中。转动该烧瓶直到形成均匀的溶液。

将溶液2加入到溶液1中，并且通过超声波处理(振幅70％，0℃)由 此生成的混悬液2分钟立即形成微粒乳状液。然后，通过将该微粒乳状液 加入到2.4ml的0.1mol l-1水性NaOH溶液(10ml烧瓶)中，迅速将pH 值从1改变至7，从而开始单体小滴的聚合作用。然后搅拌所获得的混悬 液5分钟。再对由此生成的标记的纳米颗粒进行透析(10次)，从而去除 可能未结合的FITC-葡聚糖和过量的稳定剂。该纳米颗粒混悬液具有固体 含量25.2mg/ml和平均粒子尺寸(光子关联能谱法)230.9±9.8nm。

然后用0.9％ NaCl溶液(1：1)稀释所获得的纳米颗粒混悬液，从而 进行体内试验。

体内试验

实施例5

每组大鼠的数目：2

组1：静脉注射500μl纯FITC标记的SDS-纳米颗粒(实施例4)

组2：静脉注射500μl FITC标记的含有掺入的聚山梨酯80的SDS-纳 米颗粒(实施例2)

静脉注射标记的纳米颗粒后45分钟，利用异氟醚麻醉并通过断颈法杀 死大鼠。摘除脑并将其保存在液氮中。制备恒冷箱切片(15μm)，并通过荧 光显微镜法进行检测(见图5和6)。

结果：

图5显示静脉注射纯FITC标记的SDS-纳米颗粒后的大鼠脑组织。该 脑组织没有显示出任何来自标记的纳米颗粒向脑中传输的荧光。相反，图 6证明在静脉注射了由FITC标记的含有掺入的聚山梨酯80的SDS-纳米颗 粒后大鼠脑组织中的显著荧光。可以得出结论，在纳米颗粒的制备过程中 掺入特定量的稳定剂(在该情形中是聚山梨酯80)导致这些纳米颗粒穿过 血脑屏障进入大鼠脑中的显著传输，其中所述纳米颗粒不需要表面活性剂 包衣。

实施例6

每组大鼠的数目：1

组：静脉注射500μl FITC标记的含有掺入的聚山梨酯80的PBCA- 纳米颗粒(实施例3)

静脉注射标记的纳米颗粒后60分钟，利用异氟醚麻醉并通过断颈法杀 死大鼠。摘除脑并将其保持在液氮中。制备恒冷箱切片(15μm)，并通过荧 光显微镜法进行检测(见图7)。

结果：

图7证明在静脉注射了由FITC标记的含有掺入的聚山梨酯80的 PBCA-纳米颗粒后大鼠脑组织中的显著荧光，其注射量为22.75％。该结 果强调了这样的假设，所述假设是在纳米颗粒的制备过程中掺入聚山梨酯 80导致这些纳米颗粒穿过血脑屏障进入大鼠脑中的显著传输。