本发明涉及通过给予儿茶酚丁烷(catecholic butane)或其药学上可接 受的盐治疗流感病毒感染的方法。虽然希望不受任何特定理论的约束， 但是可以认为本发明的方法既可以用于降低宿主中的流感病毒的复制或 生长也可以降低附随于流感病毒感染的各种疾病或紊乱的出现和/或严重 性。
本发明的一个实施方案包括一种治疗受试对象中流感病毒感染的方 法。所述方法包括给受试对象施用有效治疗量的通式(I)的儿茶酚丁烷或 其药学上可接受的盐：

其中R1和R2分别独立地表示氢、低级烷基、低级酰基、或亚烃基，或-OR1 和-OR2分别独立地表示未取代的或取代的氨基酸残基或其药学上可接受 的盐；R3、R4、R5、R6、R10、R11、R12和R13分别独立地表示氢或低级烷 基；以及R7、R8和R9分别独立地表示氢、-OH、低级烷氧基、低级酰氧 基、未取代的或取代的氨基酸残基或其盐，或一起可以形成烷撑二氧基 的任何两个相邻的基团；条件是当R7、R8和R9之一表示氢时，那么-OR1、 -OR2与R7、R8和R9中的其它两者不同时表示-OH。取代的或未取代的氨 基酸残基和其药学上可接受的盐优选为在其羧基末端与芳环相连。
本发明的另一实施方案包括一种治疗受试对象中流感病毒感染的方 法。所述方法包括给受试对象给药治疗有效量的通式(II)的去甲二氢愈创 木酸衍生物或其药学上可接受的盐：

其中R14、R15、R16和R17分别独立地表示-OH、-OCH3、-O(C＝O)CH3， 或未取代的或取代的氨基酸残基或其药学上可接受的盐；R18和R19分别 独立地表示-H或低级烷基；条件是R14、R15、R16和R17不同时为-OH。取 代的或未取代的氨基酸残基和其药学上可接受的盐优选为在其羧基末端 与芳环相连。
本发明的另一实施方案包括一种治疗受试对象中流感病毒感染的方 法，所述方法包括给受试对象施用有效治疗量的通式(III)的去甲二氢愈创 木酸(NDGA)衍生物或其药学上可接受的盐：

其中R20、R21、R22和R23分别独立地表示-OH、-OCH3、-O(C＝O)CH3或 未取代的或取代的氨基酸残基或其药学上可接受的盐，条件是R20、R21、 R22和R23不同时为-OH。取代的或未取代的氨基酸残基和其药学上可接 受的盐优选为在其羧基末端与芳环相连。
本发明的另一实施方案包括一种治疗受试对象中流感病毒感染的方 法。所述方法包括给受试对象给药治疗有效量的下述组合物，所述组合 物含有选自由三-O-甲基去甲二氢愈创木酸(NDGA)、四-O-甲基NDGA、 四-甘氨酰NDGA、四-二甲基甘氨酰NDGA，或其药学上可接受的盐组 成的组的儿茶酚丁烷，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的另一实施方案包括一种治疗人受试对象中H5N1亚型流感 病毒感染的方法。所述方法包括对人受试对象口服给药通式(III)的去甲二 氢愈创木酸衍生物或其药学上可接受的盐，使用的量为约10mg/kg至约 375mg/kg每剂量：

其中R20、R21、R22和R23分别表示-OCH3。
本发明的另一实施方案包括一种抑制由于流感病毒感染而诱导细胞 中的促炎细胞因子的方法。所述方法包括对细胞给药有效量的通式I的儿 茶酚丁烷或其药学上可接受的盐：

其中R1和R2分别独立地表示氢、低级烷基、低级酰基、亚烃基，或-OR1 和-OR2分别独立地表示未取代的或取代的氨基酸残基或其药学上可接受 的盐；R3、R4、R5、R6、R10、R11、R12和R13分别独立地表示氢或低级烷 基；以及R7、R8和R9分别独立地表示氢、-OH、低级烷氧基、低级酰氧 基、未取代的或取代的氨基酸残基或其盐，或一起可以形成烷撑二氧基 的任何两个相邻的基团。
本发明的另一实施方案包括一种抑制由于流感病毒感染而诱导细胞 中的促炎脂质介质的方法。所述方法包括对细胞给药有效量的通式I的儿 茶酚丁烷或其药学上可接受的盐：

其中R1和R2分别独立地表示氢、低级烷基、低级酰基、亚烃基，或-OR1 和-OR2分别独立地表示未取代的或取代的氨基酸残基或其药学上可接受 的盐；R3、R4、R5、R6、R10、R11、R12和R13分别独立地表示氢或低级烷 基；以及R7、R8和R9分别独立地表示氢、-OH、低级烷氧基、低级酰氧 基、未取代的或取代的氨基酸残基或其盐，或一起可以形成烷撑二氧基 的任何两个相邻的基团。
本发明的另一实施方案包括一种抑制由于H5N1亚型流感病毒感染 而诱导巨噬细胞中的瘤肿坏死因子α(TNF-α)的方法。所述方法包括 对巨噬细胞给药有效量的通式(III)的去甲二氢愈创木酸衍生物或其药学 上可接受的盐：

其中R20、R21、R22和R23分别表示-OCH3。
此外，本发明的另一实施方案包括一种抑制由于H5N1亚型流感病 毒感染而诱导巨噬细胞中的前列腺素E2(PGE2)的方法。所述方法包括给 巨噬细胞给药有效量的通式(III)的去甲二氢愈创木酸衍生物或其药学上 可接受的盐：

其中R20、R21、R22和R23分别表示-OCH3。
本发明的另一实施方案包括一种含有通式I的儿茶酚丁烷或其药学 上可接受的盐，以及通过使用儿茶酚丁烷或其药学上可接受的盐治疗受 试对象流感病毒感染的说明书的试剂盒。
根据下面所公开的内容，本发明的其他方面、特征和优点将会是显 而易见的，所公开的内容包括本发明的详细描述以及其优选实施方案和 所附权利要求。
附图说明
当结合附图阅读时，可以更好地理解上述发明内容以及下述本发明 的详细的描述。为了举例说明本发明，在附图中示出了目前优选的实施 方案。然而，应该理解，本发明不限于所示出的精确安排和手段。
在附图中：
图1为在各种条件下使用RAW 264.7鼠巨噬细胞由脂多糖(LPS)诱 导在不同时间产生TNF-不的图示。
图2为在各种条件下在C3HA成纤维细胞中TNF-胞诱导的细胞凋亡 的图示。
图3为在各种条件下使用RAW 264.7巨噬细胞由脂多糖诱导产生 PGE2的图示。
图4为在各种条件下使用RAW 264.7巨噬细胞由脂多糖诱导产生 PGE2α的图示。
图5为在各种条件下使用RAW 264.7巨噬细胞由脂多糖诱导产生 PGE1α的图示。
图6A和6B为根据抗体芯片研究在各种条件下使用RAW 264.7巨噬 细胞由脂多糖诱导产生细胞因子的图示。
图7包括EM-1421对MDCK细胞中的流感病毒A/WS/33的复制的作 用的图示，其中组A和组B显示了同样的数据，但是分别具有线性和对 数y轴(linear and log y-axes)。
图8包括EM-1421对RAW 264.7巨噬细胞中的流感病毒A/WS/33的复 制的作用的图示，其中组A和组B显示了同样的数据，但是分别具有线 性和对数y轴。
图9包括EM-1421对在病毒感染之前使用EM-1421处理的RAW 264.7巨噬细胞中的流感病毒A/WS/33的复制的作用的图示，其中组A和 组B显示了同样的数据，但是分别具有线性和对数y轴。
图10为根据低感染复数(MOI)模型系统由RAW264.7鼠巨噬细胞感 染病毒时和/或使用EM-1421处理产生的TNF-α的图示。
图11为根据低感染复数(MOI)模型系统使用RAW264.7鼠巨噬细胞 对产生TNF-α的剂量反应实验的图示。
图12为根据低感染复数(MOI)模型系统使用RAW 264.7鼠巨噬细胞 对产生TNF-α的时程实验的图示。
图13为根据高感染复数(MOI)模型系统由RAW 264.7鼠巨噬细胞感 染病毒时和/或使用EM-1421处理产生的TNF-α的图示。
图14为根据高感染复数(MOI)模型系统使用RAW 264.7鼠巨噬细胞 对产生TNF-α的剂量反应实验的图示。
图15为根据高感染复数(MOI)模型系统使用RAW 264.7鼠巨噬细胞 对产生TNF-α的时程实验的图示。
图16为根据低感染复数(MOI)模型系统在各种条件下使用RAW 264.7巨噬细胞由病毒感染诱导产生PGE2的图示。
图17为根据高感染复数(MOI)模型系统在各种条件下使用RAW 264.7巨噬细胞由病毒感染诱导产生PGE2的图示。
图18为根据抗体芯片研究在各种条件下使用RAW 264.7巨噬细胞由 病毒感染诱导产生细胞因子的图示。

发明人在本发明中已经发现儿茶酚丁烷可用于治疗流感病毒感染。 所述儿茶酚丁烷具有通式(I)或其药学上可接受的盐：

其中R1和R2分别独立地表示氢、低级烷基、低级酰基或亚烃基，或-OR1 和OR2分别独立地表示未取代的或取代的氨基酸残基或其盐；R3、R4、 R5、R6、R10、R11、R12和R13分别独立地表示氢或低级烷基；R7、R8和 R9分别独立地表示氢、-OH、低级烷氧基、未取代的或取代的氨基酸残 基或其药学上可接受的盐，或一起可以形成烷撑二氧基的任何两个相邻 的基团；条件是当R7、R8和R9之一表示氢时，那么-OR1、-OR2与R7、 R8和R9中的其它两者不同时表示-OH。优选地，取代的或未取代的氨基 酸残基或其药学上可接受的盐在其羧基末端与芳环相连。此类儿茶酚丁 烷可以与药学上可接受的载体或赋形剂结合以生产可以被制成多种释放 途径的药物组合物。
在本发明的另一实施方案中，儿茶酚丁烷具有通式(I)，其中R1和 R2独立地表示-H、低级烷基、低级酰基，或-OR1和-OR2分别独立地表示 未取代的或取代的氨基酸残基或其药学上可接受的盐；R3、R4独立地为 低级烷基；R5、R6、R10、R11、R12和R13独立地为-H；R7、R8和R9独立 地为-H、-OH、低级烷氧基、低级酰氧基、或未取代的或取代的氨基酸残 基或其药学上可接受的盐；条件是所述儿茶酚丁烷不是NDGA。
在本发明的又一实施方案中，儿茶酚丁烷具有通式(I)，其中R1和 R2独立地表示-H、低级烷基、低级酰基，或-OR1和-OR2分别独立地表示 未取代的或取代的氨基酸残基或其药学上可接受的盐；R3、R4独立地为 低级烷基；R5、R6、R7、R10、R11、R12和R13独立地为-H；R8和R9独立 地为-OH、低级烷氧基、低级酰氧基、或未取代的或取代的氨基酸残基或 其药学上可接受的盐；条件是所述儿茶酚丁烷不是NDGA。
在本发明的还一实施方案中，儿茶酚丁烷具有通式(I)，其中R1和 R2独立地为-CH3或-(C＝O)CH2N(CH3)2或其盐。
在本发明的另一实施方案中，儿茶酚丁烷具有通式(I)，其中R8和 R9独立地为-OCH3或-O(C＝O)CH2N(CH3)2或其盐。
在本发明的又一实施方案中，儿茶酚丁烷具有通式(I)，其中R1和 R2独立地为-CH3、-(C＝O)CH2N(CH3)2或-(C＝O)CH2N+H(CH3)2·Cl-以及 R8和R9独立地为-OCH3、-O(C＝O)CH2N(CH3)2或 -(C＝O)CH2N+H(CH3)2·Cl-。
在本发明的还一实施方案中，儿茶酚丁烷具有通式(I)，其中R1和 R2独立地表示-H或-CH3，R8和R9独立地为-OH或-OCH3，条件是所述儿 茶酚丁烷不是NDGA。
在本发明的一不同的实施方案中，儿茶酚丁烷具有通式(I)，其中 R1和R2各自为-CH3，R8和R9各自为-OCH3。
在一可选实施方案中，用于根据本发明的实施方案的方法中的儿茶 酚丁烷为具有下述通式(II)的NDGA衍生物或其药学上可接受的盐：

其中R14、R15、R16和R17分别独立地表示-OH、-OCH3、-O(C＝O)CH3或 未取代的或取代的氨基酸残基或其药学上可接受的盐，R18和R19分别独 立地表示-H或诸如低级烷基的烷基，例如-CH3或-CH2CH3；条件是R14、 R15、R16和R17不同时为-OH。优选地，取代的或未取代的氨基酸残基和 其药学上可接受的盐在其羧基末端与芳环相连。
本发明的发明人已经出乎意料地发现含有至少一种NDGA衍生物的 基本上为纯制剂的组合物可有效地用于治疗流感病毒感染。由于NDGA 衍生物最初是用于其它目的给药，并且治疗流感是一种意外的认识，该 发现是偶然发现的并且是出乎意料的。
优选地，使用于本发明的实施方案的NDGA衍生物具有如上所述的 通式(II)，其中R14、R15、R16和R17分别独立地表示-OH、低级烷氧基， 例如，-OCH3、低级酰氧基，例如，-O(C＝O)CH3、或未取代的或取代的 氨基酸残基或其药学上可接受的盐，但是不能分别同时为-OH；R18和R19 独立地表示-H或诸如低级烷基的烷基，例如，-CH3或-CH2CH3。在一实 施方案中，R18和R19可以都为-H、-CH3或-CH2CH3。优选地，当R14、 R15、R16和R17中的一个或多个表示未取代的或取代的氨基酸残基或其盐 时，所述残基在羧基末端与芳环相连。
适当制剂形式的本发明的儿茶酚丁烷，需要时与药学上可接受的载 体或赋形剂一起，可以通过选自包括下述组的一种或多种途径安全地给 药至一个或多个需要这种治疗的受试对象：鼻内给药；口服给药；吸入 给药；皮下给药；透皮给药；静脉给药；口腔给药；腹膜内给药；眼内给药； 眼周给药；肌肉内给药；植入给药；输注以及中央静脉给药。
此外，所述儿茶酚丁烷可以以适当的溶液、悬浮液、半固体或固体 形式，或通过上述一种或多种途径以脂质体制剂、纳米颗粒制剂或胶束 制剂安全地对一个或多个需要这种治疗的患者给药。
此外，脂质体制剂、纳米颗粒制剂或胶束制剂的儿茶酚丁烷可以埋 入可生物降解的聚合物制剂中并可安全地给药，例如通过皮下植入。
在本发明的一个实施方案中，用于本发明的给药途径不是通过肠胃 外给药，本发明中的肠胃外给药指的是静脉给药、肌肉内给药、皮下给 药、透皮给药和腹膜内给药。
本发明还描述了含有用于治疗流感的儿茶酚丁烷的特征的一种药物 组合物，所述组合物被制成如上所述地释放或给药，例如，以药片、胶 囊、亲水或疏水的液体、诸如由冻干产生的粉末、气溶胶形式或以含水 水溶性组合物、疏水组合物、脂质体组合物、诸如基于聚山梨醇酯80或 二嵌段共聚物的胶束组合物、纳米颗粒组合物、聚合物组合物、环糊精 包合组合物、乳状液或基于被称为“脂质核(lipocores)”的纳米颗粒的 脂质形式。
此外，本发明还提供了一种含有用于治疗流感的儿茶酚丁烷的药物 组合物，所述组合物被制成用于与药学上可接受的载体一起口服或注射 释放，所述载体包括选自由下述物质组成的组的增溶剂和赋形剂的至少 一种：(a)水溶性有机溶剂；(b)环糊精(包括改性环糊精)；(c)离子、非离子或 两性表面活性剂；(d)改性纤维素；(e)不溶于水的脂质；以及载体(a)-(e)的 任意组合。
根据本发明的实施方案，儿茶酚丁烷可以结合一种或多种其它的药 剂或药物用药。其可以与其它药剂或药物同时、在其它药剂或药物用药 之前或之后用药。在特定的实施方案中，儿茶酚丁烷可以结合一种或多 种另外的消炎剂用药。所述另外的消炎剂选自下述组，包括：(1)血清素 受体拮抗剂；(2)血清素受体激动剂；(3)组胺受体拮抗剂；(4)缓激肽受体拮 抗剂；(5)激肽释放酶抑制剂；(6)速激肽受体拮抗剂，包括神经激肽1和神 经激肽2受体亚型拮抗剂；(7)降血钙素基因相关肽(CGRP)受体拮抗剂；(8) 白细胞介素受体拮抗剂；(9)作用于花生四烯酸代谢物合成通路的酶抑制 剂，包括(a)磷脂酶抑制剂，包括PLA2异形体抑制剂和PLC和异形体抑 制剂(b)环氧合酶抑制剂，以及(c)脂氧化酶抑制剂；(10)前列腺素受体拮抗 剂，包括类二十烷酸EP-1和EP-4受体亚型拮抗剂和血栓素受体亚型拮 抗剂；(11)白三烯受体拮抗剂，包括白三烯B4受体亚型拮抗剂和白三烯D4 受体亚型拮抗剂；(12)阿片受体激动剂，包括μ阿片、片阿片和κ阿片受体 亚型激动剂；(13)嘌呤受体激动剂和拮抗剂，包括P2X受体拮抗剂和P2Y受 体激动剂；(14)三磷酸腺苷(ATP)-敏感性钾通道开放剂。
在其它实施方案中，儿茶酚丁烷可以结合一种或多种其它的抗流感 药剂用药，例如通式I的第二种儿茶酚丁烷或其药学上可接受的盐、金刚 烷胺、奥斯米韦、帕拉米韦、金刚乙胺、扎那米韦或阿比多尔。
本发明还描述了一种制备本发明的药物组合物的方法的特征，所述 方法包括制备或提供基本上为纯化形式的儿茶酚丁烷，将所述成分与药 学上可接受的载体或赋形剂结合，以可与希望的给药方式相符的方式制 备组合物。
另外，本发明还涉及包括用于治疗流感的如上所述的组合物或制剂 的试剂盒，所述组合物被制成如上所述释放，包括但不限于鼻内给药、 吸入、口服给药、局部给药、静脉给药、腹膜内给药以及其它肠胃外给 药，可选地，包括用于此类给药的给药装置以及用于此类给药的使用说 明。
定义：
除非本申请另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语具有与 本发明所属技术领域人员一般地理解的含义相同的含义。根据下述特定 的含义可以更好地理解本发明。
本发明中使用的术语“活性剂”、“化合物”以及“药物”指的是 一种或多种儿茶酚丁烷，包括NDGA衍生物，以及其药学上可接受的盐 的。
本发明中使用的术语“烷撑二氧基”指的是亚甲基(或被取代的亚 甲基)二氧基或乙烯基(或被取代的乙烯基)二氧基。
适合用于本发明的“缓冲剂”包括本技术领域的任何常规的缓冲剂， 例如Tris、磷酸盐、咪唑和重碳酸盐。
本发明中使用的“载体”指的是一种无毒的固体、半固体或液体填 料、稀释剂、介质、赋形剂、增溶剂、胶囊材料或任何常规类型的制剂 助剂，并且包括组合物中活性药物成分之外的所有组分。所述载体可以 含有另外的药剂，例如润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。需要时，可以加 入其它物质，例如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定剂以及类似的药剂。
本发明中使用的“环糊精”指的是一种未经改性的环糊精或改性的 环糊精，包括但不限于α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精以及含有其改 性部分的任何改性环糊精，例如羟丙基-β-环糊精(“HP-β-CD”)或磺丁 基醚β-环糊精(“SBE-β-CD”)。环糊精通常具有6(α-环糊精)、7(β-环 糊精)和8(γ-环糊精)糖，每个糖具有最多三个取代基，因此可能具有0-24 个一级取代基(一级取代基定义为与环糊精环直接相连的取代基)。本 发明中使用的改性的或未经改性的环糊精可以具有任何适当数目和位置 的一级取代基或其它改性部分。
本发明中使用的术语“细胞因子”指的是由各种类型细胞分泌的许 多类激素的、低分子量的任何蛋白质，所述蛋白质在免疫调节和炎症反 应过程中调节免疫反应的强度和持续时间以及介导细胞至细胞的通信。 细胞因子的示例包括趋化因子、白细胞介素、淋巴因子以及其它信号分 子，例如肿瘤坏死因子和干扰素等。
本发明中使用的术语“趋化因子”指的是一组小的、最基本的、结 构上相关的分子，所述分子通过与一组7-跨膜、G蛋白偶联受体相互作 用调节各种类型白细胞的细胞运输。趋化因子在免疫系统的发育、动态 平衡以及功能方面也起根本性的作用，并且其对中枢神经系统的细胞以 及涉及血管生成或血管生长抑制的内皮细胞具有影响。
本发明中使用的术语“白细胞介素”或“IL”指的是由淋巴细胞、单 核细胞、巨噬细胞和某些其它细胞合成的一组多功能的细胞因子。
本发明中使用的术语“淋巴因子”指的是由活化淋巴细胞释放的一 组细胞因子，其介导免疫反应。
本发明中使用的术语“干扰素”指的是由通过诸如病毒、细菌、寄 生物以及肿瘤细胞的外来的药剂对多种攻击做出反应的脊椎动物细胞分 泌的一组糖蛋白。干扰素促进免疫反应并赋予对抗外来药剂的抗性，例 如，通过抑制正常细胞和恶性细胞的增殖、阻碍胞内寄生物的繁殖、增 强巨噬细胞和粒细胞的噬菌作用、提高自然杀伤细胞活性以及具有几种 其它免疫调节功能。
本发明中使用的术语“肿瘤坏死因子”或“TNF”指的是一种主要地 由巨噬细胞分泌的细胞因子。TNF可以与其受体TNFRSF1 A/TNFR1和 TNFRSF 1B/TNFBR结合并通过该受体起作用。该细胞因子参与多种生物 过程的调节，包括细胞增殖、分化、细胞凋亡、脂类代谢和凝聚。该细 胞因子涉及多种疾病，包括自身免疫疾病、胰岛素抗性以及癌症。在流 感病毒感染时产生的增多的TNF也涉及与病毒感染(参见下文定义)相 关的疾病、失调或综合症的表现。
本发明中使用的术语“未取代的或取代的氨基酸残基或其盐”指的 是-OR1、-OR2或合适的其它R基团之一，用于本发明的儿茶酚丁烷的配 方中的为氨基酸残基或取代的氨基酸残基或氨基酸残基的盐或取代的氨 基酸残基的盐，包括但不限于：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、 半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨 酸、缬氨酸、5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸、甲状腺氨酸、3-甲基组氨酸、ε -N-甲基赖氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、氨基己二酸、γ-羧基谷氨酸、 磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、N-甲基精氨酸、N-乙酰赖氨酸， 和N，N-二甲基-取代的氨基酸残基，或其药学上可接受的盐。
本发明中使用的术语“低级烷基”指的是C1-C6烷基，其可以是直链 或带支链的，并且可选地包括一个或多个不饱和碳-碳键。
本发明中使用的术语“低级酰基”指的是C1-C6酰基，其可以是直链 或带支链的，并且可选地包括一个或多个不饱和碳-碳键。
本发明中使用的术语“NDGA使指的是去甲二氢愈创木酸。
本发明中使用的术语“NDGA衍生物”指的是分别具有通式(II)的一 种或多种化合物，或其药学上可接受的盐：

其中R14、R15、R16和R17独立地表示-OH、低级烷氧基、低级酰氧基，或 未取代的或取代的氨基酸残基，或其药学上可接受的盐，但是不能各自 同时为-OH；R18和R19独立地为-H或诸如低级烷基的烷基。例如，所述 术语包括其中R14、R15、R16和R17各自为-OCH3，或各自为-O(C＝O)CH3； 以及R18和R19各自为-H或各自为低级烷基的化合物。在本发明的一实施 方案中，R18和R19各自为-CH3或-CH2CH3。
本发明中使用的“药学上可接受的载体”指的是一种无毒的固体、 半固体或液体的填料、稀释剂、胶囊材料或任何常规类型的制剂助剂。 “药学上可接受的载体”在使用的剂量和浓度对受者是无毒的，并且与制 剂中的其它成分是可以共存的。例如，优选地，用于含有本发明的儿茶 酚丁烷的制剂的载体不含有氧化剂和其它已知的会损害所含儿茶酚丁烷 的化合物。合适的载体包括但不限于水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇、 缓冲剂、二甲亚砜、聚氧乙烯蓖麻油(Cremaphor EL)及其组合物。载 体可以含有另外的药剂，例如增溶剂、润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。 需要时，可以加入其它物质，例如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定剂以及 类似的药剂。
本发明中使用的药学上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽的游离氨 基形成)，其与诸如盐酸或磷酸的无机酸或诸如醋酸、扁桃酸、草酸和 酒石酸的有机酸一起形成。与游离的羧基形成的盐也可以由诸如钠、钾、 铵、钙或铁的氢氧化物的无机碱和诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇和 组氨酸的有机碱获得。
本发明中使用的术语“药学上可接受的赋形剂”包括载体、佐剂或 稀释剂或其它辅助物质，例如那些公众可容易地获得的本技术领域中的 常规的物质。例如，药学上可接受的辅助物质包括pH调节和缓冲剂、浸 透压调节剂、稳定剂、润湿剂等。
本发明中使用的术语“受试对象”、“宿主”以及“患者”是可互 换使用的，指的是使用本发明的组合物治疗的动物，包括但不限于类人 猿、人、禽、猫、犬、马、啮齿类动物、牛、猪、绵羊、山羊、哺乳类 农场动物、哺乳类运动动物以及哺乳类宠物。
本发明中使用的涉及儿茶酚丁烷“基本上为纯的”化合物指的是基 本上不含非本发明的儿茶酚丁烷的化合物(下文简称“非NDGA物质”)。 基本上不含指的是至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，甚至更 优选至少90％不含非NDGA物质。
本发明中使用的术语“治疗”、“处理”等指的是获得希望的药理 和/或生理效果。所述效果就完全地或部分地防止一种状况或疾病或其症 状而言可以是预防性的，和/或就部分地或完全地治疗一种状况或疾病和/ 或可归于所述状况或疾病的副作用而言可以是治疗性的。因此，例如“治 疗”包括哺乳动物，尤其是人的状况或疾病的任何治疗，包括：(a)防止 受试对象的一种状况或疾病或其症状出现，所述受试对象可能有所述状 况或疾病的倾向但是尚未诊断具有所述状况或疾病；(b)抑制所述状况或 疾病或其症状，例如，阻止其发展；以及(c)解除、减轻或改善所述状况 或疾病或其症状，例如，使所述状况或疾病或其症状消退。
本发明中使用的术语“治疗有效量”或“有效量”指的是由研究者、 兽医、医师或其它临床医生探寻的、对受试对象的组织系统或受试对象 引起希望的生物学或医学反应的活性剂、化合物或药物的量。希望的反 应包括阻断、防止、减轻或缓解存在于被治疗的受试对象的病毒感染。 在某些实施方案中，希望的反应包括治疗中的受试对象的流感病毒感染 的至少一种或多种症状、失调或疾病的减轻。在其它某些实施方案中， 希望的反应包括治疗中的受试对象的流感病毒的计数的减少或复制或生 长的抑制。
本领域技术人员可以认识到用于本发明的活性剂的“治疗有效量” 可以随着多种因素变化，例如特定的受试对象，例如年龄、体重、日常 饮食、健康状况等，所寻求治疗或预防的病毒感染状况的严重性和并发 症，活性剂的给药方式，使用的特定的活性剂等。可以执行标准的程序 以评估给受试对象以活性剂的给药效果，从而使本领域的技术人员确定 给予受试对象的活性剂的有效的量。例如，可以从受试对象在给予活性 剂之前或之后测试病毒感染的综合症，例如发烧或炎症等，或病毒计数。 此外，也可以使用诸如调查或动物模型的技术以评价用于治疗或预防病 毒感染的活性剂的疗效。
当提供一数值范围时，除非上下文另外清楚地指出，可以理解在所 述范围的上限和下限之间的各个中间值，到下限单位的1/10(to the tenth of the unit of the lower limit)，以及其它任何陈述的或在所述范围中的中间 值都包括在本发明内。除了在所述范围中明确排除的界限外，这些更小 范围的上限和下限可以独立地包括在所述更小的范围中，并且也包括在 本发明内。当所述范围包括所述界限的一个或两个时，排除了那些被包 括的界限的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
本发明中提及的所有出版物，包括专利、专利申请以及期刊文章， 都整体地通过引用的方式并入本发明中，包括其引用的参考文件也通过 引用的方式并入本发明中。本发明中所讨论的出版物仅提供其在本发明 的申请日之前公开的内容。本发明中没有内容被解释成根据在先的发明 承认本发明不具有先于此类出版物的权利。此外，所提供的出版物的日 期可能不同于实际的出版日期，其可能需要被独立地确认。
必须注意，除非上下文另外清楚地指出，本发明中使用的单数形式 “a”、“an”和the”的词包含复数的指代对象。因此，例如，提及“一 种化合物”包括多种此类化合物，提及“所述儿茶酚丁烷”包括指代一 种或多种儿茶酚丁烷以及其本领域技术人员已知的衍生物。
在本发明的下文中描述的实施方案仅以示例的方式给出，无论如何 都不应解释成对本发明的限制。
儿茶酚丁烷的制备：
可以通过任何常规的方法制备本发明的儿茶酚丁烷。例如，可以如 下所述制备此类化合物：美国专利5,008,294(Jordan等人，1991年4月16 日颁发)；美国专利6,291,524(Huang等人，2001年9月18日颁发)；Hwu 等人(Hwu等人，“甲基化甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acids)的抗 病毒活性。1.泰特调节(Tat-regulated)的HIV反式激活的合成、结构 识别和抑制。药物化学杂志(J.Med.Chem)4/(16)：2994-3000＂(1998))；或 McDonald等人，(McDonald，R.W.等人，甲二氢愈创木酸(NDGA)以及类似 物的合成和抗癌活性。”抗癌药物设计(Anti-Cancer Drug Des.)，16： 261-270(2001))。
在本发明的一个实施方案中，一种儿茶酚丁烷，四-O-甲基NDGA，也 称为内消旋-1，4-双(3，4-二甲氧基苯基)-2，3-二甲基丁烷、特莱梅普科尔 (terameprocol)、EM-1421或M4N(如下式所示)通过如下方法制备：在 反应烧瓶中制备一种含有NDGA和氢氧化钾的甲醇溶液。然后添加硫酸 二甲酯至反应烧瓶，使反应继续进行。最后用水将反应物急速冷却，使 产物沉淀。通过过滤并在真空炉中干燥分离所述沉淀。然后将化合物溶 解在二氯甲烷和甲苯溶液中，随后通过氧化铝柱纯化。通过旋转蒸发除 去溶剂，在异丙醇中将沉淀物打散并通过过滤分离。在真空炉中干燥滤 饼。通过在异丙醇中回流所述滤饼使四-O-甲基NDGA(M4N)结晶并通过 过滤重新分离晶体。

在本发明的某些实施方案中，本发明的某些儿茶酚丁烷，例如G4N， 也称为内消旋-1，4-双[3，4-(二甲基氨基乙酰氧基)苯基]-(2R，3S)-二甲基丁 烷或四-二甲基甘氨酰NDGA(如下式所示)，或其盐酸盐以及具有氨基酸 取代基的类似化合物，也可以根据常规的方法制备，例如，如美国专利 6,417,234所述。

组合物：
本发明还提供了包括药物组分的组合物，所述组合物包括儿茶酚丁 烷和药学上可接受的载体或赋形剂。这些组合物可以包含根据儿茶酚丁 烷的希望的用途选择的缓冲剂，也可以包含适合用于所希望的用途的其 它物质。本领域技术人员可以容易地选择一种适合用于所希望的用途的 合适的缓冲剂，其中多种缓冲剂是本技术领域中已知的。在某些情况下， 所述组合物可以包含药学上可接受的赋形剂，其中多种赋形剂是本技术 领域中已知的。适合用于本发明的药学上可接受的赋形剂在多种出版物 中进行了描述，包括，例如Gennaro(Gennaro，A.，“雷明顿：制药科学与 实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)”“第19版，利 普平科特，威廉&威尔金斯出版社(Lippincott，Williams，& Wilkins) (1995))；Ansel等人(Ansel，H.C.等人，“药物剂型以及药物释放系统 (Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems eds.)”，第7版， 利普平科特，威廉&威尔金斯出版社(Lippincott，Williams，& Wilkins) (1995))；以及Kibbe(Kibbe，A.H.，药物赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)，第3版。美国制药协会(Amer.Pharmaceutical Assoc))。
根据可能的给药方式制备本发明的组合物。因此，如果所述组合物 意欲通过鼻内或吸入给药，例如，为此目的，所述组合物可以转换为本 技术领域中通常的粉末或气溶胶形式。其它制剂，例如用于口服或胃肠 道的释放，也通常在本技术领域中使用。
用于本发明给药的组合物可以形成溶液、悬浮液、药片、药丸、胶 囊、可持续释放的制剂或粉末。
适合用于口服或注射释放的组合物或制剂另外地包括含有用于治疗 流感的儿茶酚丁烷的药物组合物，其中所述组合物与药学上可接受的载 体一起制成，其中所述载体包括至少一种选自下述组的溶剂和赋形剂， 所述组包括：(a)水溶性有机溶剂；(b)环糊精(包括改性环糊精)；(c)离子、非 离子或两性表面活性剂；(d)改性纤维素；(e)不溶于水的脂质；以及(a)-(e)中 任何载体的结合物。
水溶性有机溶剂可以优选地但并非必然地地为二甲基亚砜。非限制 的示例性的水溶性有机溶剂包括聚乙二醇(“PEG”)，例如，PEG 300、PEG 400或PEG 400单月桂酸酯、丙二醇(“PG”)、聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)、 乙醇、苯甲醇或二甲基乙酰胺。优选地，对于某些实施方案，当水溶性 有机溶剂为PG时，PG在不存在白凡士林、黄原胶(也称为汉生胶和三 仙胶)、甘油或甘氨酸的至少一种时存在。当水溶性有机溶剂为PEG时， 对于某些实施方案，PEG优选为在不存在抗坏血酸或丁基羟基甲苯(“不 存在”)时存在，对于某些实施方案，当PEG为聚乙二醇400时，优选地， 聚乙二醇400在不存在聚乙二醇8000时存在。
环糊精或改性环糊精可以非限制性地为α-环糊精、β-环糊精、γ- 环糊精、HP-β-CD或SBE-β-CD。
离子、非离子或两性表面活性剂可以包括，例如非限制性地为诸如 聚氧化乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(也称为聚山梨醇酯)的表面活性剂，其 为一种非离子表面活性剂，例如，聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80，商业 上可获得的为20或80、D-α生育酚聚二乙烯1000琥珀 酸(“TPGS”)、甘油单油酸酯(也称为甘油基单油酸酯(glyceryl monooleate))， 其为一种酯化了的脂肪酸或一种乙撑氧与蓖麻油以摩尔比为35∶1的反 应产物，商业上可获得的为EL。优选地，对于某些实施方案， 当表面活性剂为非离子表面活性剂时，非离子表面活性剂在不存在黄原 胶时存在。
改性环糊精的非限制性示例包括乙基纤维素(“EC”)、羟丙基甲基纤维 素(“HPMC”)、甲基纤维素(“MC”)、或羧甲基纤维素(“CMC”)。在本发明 的一个实施方案中，儿茶酚丁烷可以在改性纤维素中溶解，改性纤维素 在使用前可以在乙醇(“EtOH”)中稀释。
不溶于水的脂质包括，例如，油或油类，例如蓖麻油、芝麻油或薄 荷油，蜡或蜡类，例如蜂蜡或棕榈蜡(carnuba wax)，以及混合的脂肪乳 化剂组合物，例如(Pharmacia & Upjohn公司，现为Pfizer公司)， 根据制造者的推荐使用。例如，推荐的成人剂量为不超过2g脂肪/kg体 重/天(10％、20％以及30％的分别为20mL/kg、10mL/kg以及 6.7mL/kg)。认为10％的1,000mL含有：纯豆油100g、纯卵 磷脂12g、无水甘油22g、用于注射的水补足至1,000mL。使用氢氧化 钠调节pH值至约8。20％1,000mL含有：纯豆油200g、纯卵 磷脂12g、无水甘油22g、用于注射的水补足至1,000mL。使用氢氧化 钠调节pH值至约8。30％1,000mL含有：纯豆油300g、纯卵 磷脂12g、无水甘油16.7g、用于注射的水补足至1,000mL。使用氢氧 化钠调节pH值至约7.5。这些产品被贮存在低于25℃的控制 的室温，并不应冷冻。对于某些注射制剂的实施方案，油为一种非蓖麻 油的油，对于某些口服制剂的实施方案，蓖麻油在不存在蜂蜡或棕榈蜡 时存在。
在本发明的一个实施方案中，儿茶酚丁烷在不同的载体中溶解或在 不同的载体中溶解并且稀释以形成一种用于动物，包括人口服的液体组 合物。例如，在该实施方案的一个方面，儿茶酚丁烷溶解在水溶性有机 溶剂中，例如PEG 300、PEG 400或PEG 400月桂酸酯(“PEG化合物”) 或溶解在PG中。在另一实施方案中，本发明的化合物溶解在改性环糊精 中，例如HP-β-CD或SBE-β-CD。在另一实施方案中，本发明的化合 物溶解和/或稀释在一种含有PEG化合物和HP-β-CD的组合制剂中。在 又一实施方案中，本发明的化合物溶解在诸如HPMC、CMC或EC的改 性纤维素中。在还一实施方案中，本发明的化合物溶解在另一种既含有 改性环糊精也含有改性纤维素的组合制剂中，例如，HP-β-CD和HPMC 或HP-β-CD和CMC。
在本发明的还一实施方案中，本发明的化合物溶解在离子、非离子 或两性表面活性剂中，例如20、80、TPGS或酯化脂肪酸。 例如，本发明的化合物可以仅溶解在TPGS或20中，或溶解在 诸如TPGS和PEG 400或20和PEG 400的组合物中。
在另一实施方案中，本发明的化合物溶解在不溶于水的脂质中，例 如蜡、脂肪乳化剂，例如或油。例如，本发明的化合物可以仅 溶解在薄荷油中，或溶解在薄荷油与和PEG 400的组合物中，或 薄荷油与PEG 400的组合物中，或薄荷油与的组合物中，或薄荷 油与蓖麻油的组合物中。
当然，EC可以取代或加入以替换上述示例中的HPMC或CMC；PEG 300或PEG 400单月桂酸酯可以取代或加入以替换上述示例中的PEG 400；80可以取代或加入以替换上述示例中的20，诸如玉 米油、橄榄油、豆油、矿物油或甘油的其它油可以取代或加入以替换上 述示例中的薄荷油或蓖麻油。
此外，可以进行加热，例如，在制备任何这些组合物的过程中加热 至约30℃到约90℃的温度以使本发明的化合物溶解或获得本发明化合物 的均匀地分散的悬浮液。
在另一实施方案中，儿茶酚丁烷可以不伴随任何载体或与载体一起 使用以固体形式口服。在一实施方案中，本发明的化合物首先溶解在一 种如上述示例的液体载体中，随后制成一种作为口服组合物给药的固体 组合物。例如，本发明的化合物溶解在诸如HP-β-CD的改性环糊精中， 冻干所述组合物以生产一种适合口服的粉末。
在又一实施方案中，本发明的化合物溶解或悬浮在TPGS溶液中， 适当地加热以获得均匀分散的溶液或悬浮液。
当冷却时，所述组合物变得似奶油，适合口服。在另一实施方案中， 本发明的化合物溶解在油中，加入蜂蜡以制备蜡状固体组合物。
一般而言，在制备口服制剂的过程中，在加入其它赋形剂之前，首 先溶解本发明的化合物以生产更高稳定性的组合物。不稳定的制剂是不 希望的。不稳定的液体制剂通常形成晶状沉淀或两相溶液。不稳定的固 体制剂通常显现为粒状或块状，有时含有流动的液体。最佳的固体制剂 显现为光滑的、均匀的，并且具有小的熔化温度范围。一般而言，制剂 中的赋形剂的比例可以影响稳定性。例如，太少的硬化剂，例如蜂蜡对 于精致的口服制剂过于松软(runny)。
因此，一般而言，对于本发明的液体制剂而言，使用的赋形剂应该 是本发明的儿茶酚丁烷化合物的好的溶剂，例如M4N。换而言之，赋形 剂应该未经加热就能溶解儿茶酚丁烷。赋形剂也应与儿茶酚丁烷彼此互 相独立地共存以便其可以形成一种稳定的溶液、悬浮液或乳化液。此外， 一般而言，就本发明的固体制剂而言，使用的赋形剂应该是儿茶酚丁烷 的好的溶剂以避免结块和不均匀的制剂。为了避免不希望的固体制剂质 地太松软或不均匀，赋形剂应该彼此可以共存以使其即使在不存在儿茶 酚丁烷时也可以形成光滑的均匀固体。
治疗方法：
发现儿茶酚丁烷以及本主题发明的组合物在希望为受到流感病毒感 染的患者提供治疗时可以用作治疗剂。
当关注从鸟至广义的哺乳动物尤其是人的跨物种感染时，根据本发 明的主题方法，可治疗多种动物宿主，包括人类和非人类动物，例如在 禽流感时的鸟。当这些术语被广泛地使用以描述包括食肉目动物(例如 狗和猫)、啮齿目动物(例如豚鼠和兔)以及包括牛、山羊、马、绵羊、 兔、猪和灵长类动物(例如人、黑猩猩和猴)的其它动物的哺乳类有机 体时，通常此类宿主为“哺乳动物”或“哺乳类动物(mammalian)”。 在许多实施方案中，宿主为人。动物模型对于实验研究具有影响，例如 提供用于治疗人类疾病的模型。此外，本发明也适用于动物治疗。
给药的制剂、剂量和途径：
如上所述，有效量的活性剂被给予宿主或受试对象。通常，本发明 的组合物可以含有低于约1％至约99％的活性剂，即本发明的儿茶酚丁 烷；可选地，本发明可以含有约5％至约90％的活性剂。此外，本发明还 提供组合物，在所述组合物中，诸如含有NDGA衍生物，例如M4N的儿 茶酚丁烷的活性剂以根据动物，例如人的体重以约低于0.1mg/kg至约 400mg/kg或更高的口服剂量给予受试对象，例如人。更具体而言，仅作 为非限制性的示例，可以使用从约0.01至约400mg/kg体重的范围的剂 量通过任何合适的给药途径治疗受试对象，例如低于约0.01mg/kg、0.05 mg/kg、0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、 15mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg、250 mg/kg、300mg/kg、350mg/kg或400mg/kg或更高。
给药的合适的剂量取决于待治疗的受试对象，例如受试对象的总体 键康状况、受试对象的年龄、疾病或状况的状态、受试对象的体重。一 般而言，约0.1mg至约500mg可以给予儿童，约0.1mg至约5g可以给 予成人。所述活性剂可以单一剂量或更通常地以多种剂量给药。对于给 定的药剂，本领域技术人员可以容易地通过多种方式确定优选的剂量。 本领域技术人员通过常规的试验建立剂量反应曲线可以容易地确定其它 有效的剂量。当然，药剂的量将根据使用的具体药剂而变化。
如同剂量一样，护理者将根据年龄、体重、疾病状况、键康状况以 及患者反应确定活性剂的给药频率。因此，只要如常规地确定的需要， 所述药剂可以连续地、间歇地、每日一次或多次或在其它合适的期间给 药。
本发明的儿茶酚丁烷或活性剂可以被结合至多种制剂中以用于治疗 给药。更具体而言，本发明的儿茶酚丁烷可以通过结合适当的、药学上 可接受的载体或稀释剂制成药物组合物，并且可以制成固体、半固体、 液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉末、气溶胶、脂质体、纳 米颗粒、微粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂以及气溶胶。
同样地，可以通过多种方式实现活性剂的给药，例如口服、口腔给 药、直肠给药、鼻内给药、静脉给药、皮下给药、肌肉内给药、气管内 给药、局部给药、间质给药、透皮给药等，或通过吸入或植入。尤其是， 纳米颗粒、胶囊和脂质制剂可以系统地给药，包括非口服和经鼻内，以 及经间质、口服、局部给药、透皮给药，通过吸入或植入，例如用于药 物靶向、增强药物生物利用度以及保护药物的生物活性和稳定性。本发 明的结合了纳米颗粒的药物可以预期会获得延长的体内药物保留时间。
在药物剂型方面，活性剂可以其药学上可接受的盐形式给药，或其 也可以单独地或适当地联合，以及与其它药物活性化合物结合使用。下 述方法和赋形剂只是示例性的，绝不具有限制性。
对于口服制剂，活性剂可以单独或与适当的添加剂结合以溶液或悬 浮液形式作为液体使用，或以片剂、粉末、微粒或胶囊的形式作为固体 使用，例如，与常规的添加剂一起使用，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉 或马铃薯淀粉；与粘合剂一起使用，例如晶状纤维素、纤维素衍生物、 阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；与崩解剂一起，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉 或羧甲基纤维素钠；与润滑剂一起，例如滑石粉或硬脂酸镁；并且如果需 要，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂一起使用。
药学上可接受的赋形剂，例如介质、佐剂、载体或稀释剂是本技术 领域中通用的。合适的赋形剂介质为，例如水、盐水、葡萄糖、甘油、 乙醇等以及其组合物。此外，如果需要，所述介质可以包括微量的辅助 物质，例如pH调节和缓冲剂、渗透压调节剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂。 制备此类剂型的实际方法对于本领域技术人员而言是已知的或将是显而 易见的。例如，参见雷明顿药物科学，麦克出版公司，伊斯顿，宾夕法 尼亚州(Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company， Easton，Pennsylvania)，第17版，1985。在任何情况下，给药的组合物或 制剂都将含有足够量的药剂以在接受治疗的受试对象中获得希望的状 态。
所述活性剂可以通过在水溶液中或非水溶剂例如在植物油或其它类 似的油中，包括玉米油、蓖麻油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或 丙二醇中将其溶解、悬浮或乳化制成注射液；如果需要，与常规的添加 剂一起使用，例如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。 用于胃肠道递送根据本发明的儿茶酚丁烷的合适的治疗制剂还包括下述 文献中公开的各种可注射的载体/赋形剂制剂：2005年1月27日提交的 美国临时专利申请，以及2006年1月27日提交的国际申请 PCT/US2006/000287，其名称为“用于将含有NDGA化合物的儿茶酚丁 烷注射入动物中的制剂”，国际公布号为WO2006/081364A2，公布日期 为2006年8月3日，其全部内容通过引用并入本发明中。
活性剂可以以气溶胶形式使用通过吸入给药。本发明的化合物可以 被制入加压的可接受的推进剂，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
此外，所述活性剂可以与诸如乳化碱或水溶性碱的多种碱混合制成 栓剂。本发明的化合物可以通过栓剂经由直肠给药。所述栓剂可以包括 介质，例如可可脂、卡波蜡(carbowaxes)以及聚乙二醇，所述栓剂可以 在体温时熔化，而在室温时固化。
可以提供用于口服或直肠给药的单位剂型，例如糖浆剂、酏剂以及 悬浮液，其中各剂量单位，例如一茶匙的量、一大汤匙的量、药片或栓 剂包括含有一种或多种活性剂的预定量的组合物。类似地，用于注射或 静脉给药的单位剂型可以包括作为无菌水溶液的组合物中的活性剂、生 理盐水或其它药学上可接受的载体。
本发明中使用的术语“单位剂型”指的是适合作为单一剂量用于人 和动物的受试对象的物理性的离散单元(physically discrete units)，各单 元含有预定量的本发明的化合物，所计算的量足以与药学上可接受的稀 释剂、载体或介质一起产生希望的效果。用于本发明的新的单位剂型的 规格取决于使用的特定化合物和欲获得的效果，以及与宿主中的各化合 物相关的药效学。
本发明包括具有多倍或单位剂量的活性剂的试剂盒。在此类试剂盒 中，除了装有多倍或单位剂量的含有NDGA衍生物的组合物的容器外， 其可以是一种带有用法说明的信息性的药品说明书，所述说明书描述了 药物在治疗有关病理状况方面的使用以及伴随的益处，在本发明中，病 理状况为流感，并且尤其为流感H5N1亚型。
纳米颗粒(“NP”)的制备：
本发明包括儿茶酚丁烷NP制剂的制备。适合用于本发明的许多不同 的NP制剂可以根据释放方法制备。通过控制分子量、共聚物比率、载药 量、微粒粒径以及孔隙率和制作条件，NP制剂根据希望的药物释放曲线 可以不同。NP制剂也可以根据使用在生产工艺中的聚合物、稳定剂和表 面活性剂而不同。不同的赋形剂对药物摄取、药物在体内的分布以及药 物在血浆中的持久性也具有不同的效果。本领域普通技术人员可以确定 希望的特性或特征，因此确定使用的合适的NP制剂。
NP的聚合物基质必须满足生物相容性、生物利用度、机械强度和容 易处理的标准。用于此目的的最有名的聚合物为可生物降解的聚(丙交 酯-乙交酯)共聚物(“PLGAs”)。
本发明中的NP可以通过本技术领域的任何常规的方法制备。在一实 施方案中，例如，可以如下述文献所述制备：Lockman等人(Lockman，P.R. 等人，用于通过血脑屏障释放药物的纳米技术”药物开发制药学工业(Drug Development Indus.Pharmacy)，28(1):1-13，(2002))。此种类型的制造工艺 包括，例如乳液聚合、界面聚合、脱溶剂化蒸发以及溶剂沉积。
在本发明的制备NP的乳液聚合过程中，所述聚合过程包括从单一的 单体单元构造一条聚合物链，例如，如下述文献所述：Kreuter(Kreuter，J.， 纳米颗粒”，制药技术百科全书(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)，Swarbick，J.；Boylan，J.C.Eds.；马赛尔德克公司(Marcel Dekker)(纽约，1994)，165-190页，(1994))。在由自由基或离子形成物触发 后，例如通过使用高能射线、紫外线或氢氧根离子，聚合在室温会自动 地发生。一旦聚合完成，过滤并中和溶液。聚合物形成包括从约100至 107个聚合物分子的胶束和液滴。在该过程中通常不需要表面活性剂和稳 定剂。此外，该过程可以在有机相而非水相中完成。
本发明的NP也可以通过界面聚合过程制备，例如，如下述文献所述： Khouri(Khouri，A.I.等人，用于制造聚异丁基氰丙烯酸酯纳米颗粒的新工艺 的开发”，国际药物杂志(Int.J.Pharm.)，28：125(1986))。在该过程中， 当水相和有机相通过在大力矩的机械搅拌下均质、乳化或微流化而融合 在一起时，单体被用于产生聚合物并发生聚合。例如，通过将亲脂性的 儿茶酚丁烷与单体在有机相中混合、在油中溶解混合物并将混合物通过 一小管缓慢地在不断搅拌时加入水相而制备含有儿茶酚丁烷的聚氰基丙 烯酸纳米颗粒。然后通过阴离子聚合可以自动地形成200-300nm的胶囊。 该过程的变化包括将苯甲酸苄酯、丙酮以及磷脂加入含有单体和药物的 有机相中，例如，如下述文献所述：Fessi等人(Fessi，H.等人，“在溶剂置换 后通过界面沉积制备纳米胶囊”国际药物杂志(Int.J.Pharm.)，55：R1-R4， (1989))。这产生一种制剂，在该制剂中所述药物通过装入胶囊而保护其 到达靶组织前不降解。
诸如白蛋白和明胶的大分子可以在制备NPs时油变性和去溶剂化的 过程中使用。在油乳化变性过程中，可以通过均质化使大分子截留在有 机相中。一旦被截留，所述大分子通过持续地搅拌而缓慢地被诱导至水 相中。然后，可以通过交联，例如与乙醛或通过热变性使通过引入两种 不混溶相形成的纳米颗粒硬化。
可选地，大分子可以通过“解溶剂化”形成NPs。在解溶剂化过程 中，大分子溶解在一种溶剂中，所述大分子以膨胀的、卷曲的构造存在 于溶剂中。然后，通过改变环境，例如pH、电荷或使用诸如乙醇的去溶 剂使膨胀的大分子被诱导以紧密地卷曲。然后，所述大分子可以通过与 乙醛交联而固定与硬化。在交联前，NDGA化合物可以被吸附或束缚至 大分子，从而衍生物被陷入新形成的微粒中。
通过高压均质可以处理固体脂质NP。固体脂质NP具有可以被灭菌 以及被蒸压的优点并且其具有提供控制释放的固体基质。
本发明还包括具有不同载药方法的NP。NP可以为药物在其中分散 均匀的固体胶状NP。NP可以为固体的NP，药物与NP的外部相连，例 如通过吸附。NP可以为使药物陷入其中的纳米胶囊。NP还可以为固体 胶状NP，在其中具有分散均匀的药物以及用于靶向给药至适当组织的细 胞表面配体。
NP的大小可以与用于给定释放模式的疗效相关。NP通常为约10nm 至约1000nm；可选地，NP可以为约30nm至约800nm；更进一步地通常 为约60nm至约270nm；甚至更进一步地为约80nm至约260nm；或约90 nm至约230nm，或约100nm至约195nm。几种因素影响NP的大小，所 有因素都可以由本领域普通技术人员调整，例如，在聚合过程中使用的 溶液的pH，起始触发的量(例如加热或辐射等)以及单体单元的浓度。通 过使用光散射由光子相关光谱可以进行NP的大小测量。
可选地，本发明中的NP，例如多糖NP或清蛋白NP可以涂覆一层脂 质涂层。例如，多糖NP可以与磷酸盐(阴离子的)和季铵盐(阳离子的) 配体交联，有或没有脂质双分子层，例如一种含有二棕榈酰磷脂酰胆碱 和胆固醇涂层的脂质双分子层。其它聚合物/稳定剂包括但不限于：豆油； 麦芽糊精；聚丁基氰丙烯酸酯；丁基氰丙烯酸酯/右旋糖苷70kDa，聚山 梨醇酯-85；聚丁基氰丙烯酸酯/右旋糖苷70kDa，聚山梨醇酯-85；硬脂酸； 聚甲基丙烯酸甲酯。
例如通过吸附至NP使含有儿茶酚丁烷的NP制剂可以静脉给药用于 治疗流感。为了避免这些NP制剂不希望地被网状内皮组织的细胞摄入， NP可以涂覆有表面活性剂或使用磁反应物质制备。
因此，可选地，表面活性剂可以与NP结合使用。例如，聚丁基氰丙 烯酸酯NP可以与右旋糖苷-70,000稳定剂以及作为表面活性剂的聚山梨 醇酯-80一起使用。其它表面活性剂包括但不限于：聚山梨醇酯-20、40 或60；泊洛沙姆(Poloxamer)188；脂质涂层-二棕榈酰磷脂酰胆碱； Epikuron 200；泊洛沙姆(Poloxamer)338；Polaxamine 908；Polaxamer 407。 例如，Polyaxamine 908可以作为一种表面活性剂使用以减少肝脏、脾、 肺以及骨髓中的RES对NP的摄入。
所述磁反应物质可以为磁铁(Fe3O4)，其可以被结合至用于制备NP 的组合物中。这些磁反应NP可以由磁体在外部引导。
在另一实施方案中，可以如Mu和Feng所描述的使用聚丙交酯-乙交 酯共聚物(“PLGAs”)和d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐(维生素E TPGS或TPGS)的混合物制备本发明的NP(Mu，L和Feng，S.S.，“一种用 于抗癌药物紫杉醇()药物的新的控制释放剂：含有维生素E TPGS 的PLGA纳米颗粒。”控制释放杂志(J.Control.Rel.)86：33-48(2003))。 后者除了作为基质材料外，还可以用作乳化剂。
胶囊形成载体的制备：
本发明包括在胶束载体中形成的儿茶酚丁烷，其中所述胶束由本技 术领域中的常规方法制备。此类制备方法的示例如下述文献中所描述的： 例如Liggins(Liggins，R.T.和Burt，H.M.，g“用于制备紫杉醇聚合物胶束给 药系统的聚醚-聚酯二嵌段共聚物。”药物释放研究进展(Adv.Drug Del. Rev.54：191-202，(2002))；Zhang等人(Zhang等人，“作为紫杉醇的胶束载体 的两亲性二嵌段共聚物的进展。”国际药物杂志(Int.J.Pharm.)132： 195-206，(1996))；以及Churchill(Churchill，J.R.以及Hutchinson，F.G.，“生 物可降解两亲性共聚物。”美国专利4,745,160，(1988))。在一此类方法中， 聚醚-聚酯嵌段共聚物为具有亲水(聚醚)部分和疏水部分(聚酯)的两 亲性共聚物，其用作形成胶束的载体。
另一种类型的胶束为，例如由既具有亲水部分也具有疏水部分的AB- 型嵌段共聚物形成，由于其两亲性特性，在水介质中形成胶束结构是已 知的，例如如下述文献描述的：Tuzar(Tuzar，Z.和Kratochvil，P.，“溶液中 的嵌段和接枝共聚物胶束。”，胶体表面科学进展(Adv.Colloid Interface Sci.)5：201-232.(1976))；以及Wilhelm等人(Wilhelm，M.等人，“水中的聚(苯 乙烯-乙撑氧)嵌段共聚物胶束形成：荧光探针研究。”，高分子24： 1033-1040(1991))。不考虑高含量的疏水药物被结合至胶束内核内，这些 聚合物胶束可以保持令人满意的水稳定性。这些在大小上约<200nm的范 围的胶束可有效地降低非选择性RES净化并显示出增强的渗透性和保持 力。
此外，例如，可以使用MePEG 1900和5000制备聚(D，L-丙交酯)-6- 甲氧基聚乙二醇(MePEG:PDLLA)二嵌段共聚物。使用辛酸亚锡(0.25％) 作为催化剂，反应在160℃可以允许进行3小时。然而，如果反应允许进 行约6小时，可以使用低如130℃的温度，或如果反应仅允许进行约2 小时，可以使用高如190℃的温度。
在一实施方案中，使用Kohori，F.等人(1998)的方法(Kohori，F.等人，“含 有聚(N-异丙基丙烯酰胺-b-D，L-丙交酯)的热敏性嵌段共聚物胶束的制备 和特性。”，控制释放杂志(J.Control.Rel.)55：87-98，(1998))通过自由 基聚合过程，可以使用N-异丙基丙烯酰胺(“IPAAm”)(兴人(Kohjin)， 东京，日本)和二甲基丙烯酰胺(“DMAAm”)(和光纯化学品公司(Wako Pure Chemicals)，东京，日本)制备端羟基聚(IPAAm-DMAAm)共聚物。制得的 共聚物可以溶解在冷水中，通过两种超滤膜过滤，分离(cut-off)分子量 为10,000和20,000的共聚物。聚合物溶液首先通过分子量为20,000的分 离膜过滤。然后，再通过分子量为10,000的分离膜过滤滤液。结果可获 得三种分子量的馏分，低分子量馏分、中分子量馏分以及高分子量馏分。 然后由中分子量馏分的聚IPAAm-co-DMAAm共聚物的端羟基通过D，L- 丙交酯的开环聚合可以合成嵌段共聚物。制得的聚IPAAm-co-DMAAm -b-聚(D，L-丙交酯)共聚物可以如Kohori，F.等人(1999)所描述的方法 (Kohori，F.等人，“使用由聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-N，N-二甲基丙烯酰胺) -b-聚(D，L-丙交酯)组成的热敏性聚合物胶束控制阿霉素细胞毒活性。”， 胶体表面化学：生物界面(Colloids Surfaces B：Biointerfaces)16：195-205， (1999))制备。
儿茶酚丁烷可以被装载于胶束的内核中，并且通过透析法同时制备 胶束。例如，儿茶酚丁烷的盐酸盐可以溶解在N，N-二甲基乙酰胺 (“DMAC”)中并添加三乙胺(“TEA”)。聚(IPAAm-co-DMAAm)-b-聚(D，L- 丙交酯)嵌段共聚物可以溶解在DMAC中，并可添加蒸馏水。儿茶酚丁烷 的溶液和嵌段共聚物溶液可以在室温混合，然后使用分离分子量为 12,000-14,000的透析膜(2的光谱医疗工业公司(spectrum Medical Indus.)，加利福尼亚，美国)在25℃通过蒸馏水透析。见上文，如 Kohori，F.等人(1999)所描述的，可以通过使用20nm孔径的微滤膜 (ANODISCTM沃华国际(Whatman International))过滤纯化结合了儿茶酚 丁烷的聚(IPAAm-co-DMAAm)共聚物-b-聚(D，L-丙交酯)胶束。
含有儿茶酚丁烷的多囊脂质体的制备：
可以通过本技术领域中的任何常规方法制备多囊脂质体(“MVL”)， 例如如Mantriprgada描述的复乳化法(Mantriprgada，S.，“制用于缓释给药 的脂质体(技术)。”脂质体研究进展(Prog Lipid Res.)41： 392-406，(2002))。简而言之，在复乳化法中，首先通过溶解两亲性脂质体 制备“油包水”乳化液，例如含有至少一种中性脂质体的磷脂，例如一种 或多种挥发有机溶剂中的甘油三酸酯，将第一种不混溶的水溶液成分以及 疏水儿茶酚丁烷，例如疏水儿茶酚丁烷加入该脂质体成分。然后乳化混 合物以形成油包水的乳化液，然后与第二种不混溶的水溶液成分混合， 然后通过机械混合以形成悬浮在第二种水溶液成分中的溶剂球粒。所述 溶剂球粒将包含在其中溶解了儿茶酚丁烷的多种液滴。然后从球粒除去 有机溶剂，通常通过蒸发，通过减压或在悬浮液上方或其中通入气流。 当溶剂被完全除去后，球粒变成MVL，例如DepoFoam微粒。当该方法中 不包括中性脂质体时，将形成通常的多层囊泡或单层囊泡而非MVL。
用于口服给药的儿茶酚丁烷制剂：
一些儿茶酚丁烷为水溶性、亲水性化合物，例如G4N。本发明包括药 学上可接受的载体或赋形剂中的亲水化合物的制剂以及诸如口服制剂的 给药方式，例如化合物的水溶液形式，或者化合物可以被冻干而作为粉 末给药，或者制成药片，或者将化合物装入胶囊。
本发明中的化合物可以为肠衣片。本发明中的制剂可以被缓释和/或 控制释放，包括减速释放或加速释放。
可以根据给受试对象给药的希望的剂量调整包括在口服制剂中的儿 茶酚丁烷的量。此种调整在本领域普通技术人员的技术水平内。
一些儿茶酚丁烷是疏水的或亲水的化合物，例如M4N。通过使用可 以促进化合物在肠道水溶液流体中的溶解速度或范围的药学上可接受的 载体可以促进肠内亲脂性化合物的吸收。脂质载体在本技术领域中是已 知的，例如，如Stuchlik所描述的(Stuchlik，M.和Zak，S.，k“用于口服给药 的脂质介质。”，生物医学论文(Biomed.Papers)145(2)：17-26，(2001))。 本发明的制剂可以作为口服液体给药或可以装入各种类型的胶囊中。
在一实施方案中，本发明包括一种含有亲脂性的儿茶酚丁烷的制剂， 通过将此类化合物溶解在三酰基甘油中所述儿茶酚丁烷被制成口服给 药，然后所述制剂被装入胶囊以供口服。三酰基甘油为带有与甘油分子 相连的长链和/或中链脂肪酸分子。长链脂肪酸的范围为从约C14至C24， 可以在普通的脂肪中发现。中链脂肪酸的范围为从约C6至C12，可以在椰 子油或棕榈仁油中发现。适合用于本发明的三酰基甘油包括结构脂质， 所述结构脂质含有短链脂肪酸或中链脂肪酸或两者都含有的混合物，所 述短链脂肪酸或中链脂肪酸在相同的甘油分子上酯化。
在本发明的另一个实施方案中，可以将一种或多种表面活性剂加入 到儿茶酚丁烷和脂质载体的混合物中，以使药物以油/表面活性剂混合物 精细液滴存在。表面活性剂可以促进油性制剂分散稀释于胃肠道液体中。
本发明还包括含有亲水表面活性剂和油的微乳液形式的儿茶酚丁烷 的用于口服的制剂。所述微乳液微粒可以为含有溶解的油和药物的表面 活性剂胶束。
固体脂质纳米颗粒制剂中的儿茶酚丁烷制剂也适合用于口服给药。 可以使用本技术领域中任何常规的方式制备固体脂质纳米颗粒，例如， 见上文，如Stuchlik，M.和Zak，S.(2001)所描述的。
在一实施方案中，通过在高温均质熔化的脂质可以在热的均质过程 中制备固体脂质纳米颗粒。在该过程中，固体脂质被熔化，儿茶酚丁烷 溶解在熔化的脂质中。然后预热过的分散介质与装载药物的脂质熔体混 合，混合物与均质剂(homogenisator)混合以形成粗制的预乳化液。然 后在高于脂质熔点的温度进行高压均质以产生油/水-纳米乳。冷却纳米乳 至室温以形成固体脂质纳米颗粒。
在本发明的另一实施方案中，可以在冷的均质过程中制备固体脂质 纳米颗粒。在该过程中，脂质溶解，儿茶酚丁烷溶解在熔化的脂质中。 然后在液氮或干冰中固化装载药物的脂质。在粉磨厂研磨固体药物脂质 以形成50-100μm的微粒。然后在冷的水溶液分散介质中分散脂质微粒， 在室温或低于室温的温度均质以形成固体脂质纳米颗粒。
本发明还包括用于口服给药的脂质体或胶束中的亲脂性儿茶酚丁烷 的制剂。可以使用本技术领域中任何常规的方式制备这些制剂。胶束通 常为脂质单层囊泡，在所述囊泡中疏水的药物与单层上的疏水区域结合。 脂质体通常为磷脂双层囊泡。亲脂性的儿茶酚丁烷通常将位于这些囊泡 的中央。
另外的根据本发明的合适的用于口服给药的儿茶酚丁烷的制剂在下 述文献中进行了描述：2005年1月27日提交的序列号为60/647,495的美 国临时专利申请，以及2006年1月27日提交的，名称为“用于包括NDGA 化合物的儿茶酚丁烷给药的口服制剂”的国际申请，代理人案号为 682714-9WO，其全部内容通过引用并入本发明。
用于鼻内给药的儿茶酚丁烷制剂：
本发明包括用于鼻内给药的儿茶酚丁烷制剂以及其鼻内给药方式。 有利地，鼻内给药可以比通过静脉给药在脑中积聚更高浓度的活性剂。 此外，该给药方式避免了在接受药物的受试对象的肝和肠内首过代谢的 问题。
可以被吸收的活性剂的量部分地取决于粘液中的药物的溶解度，所 述粘液为一种含有约95％的血清蛋白、糖蛋白、脂质以及电解质的水溶 液的组合物。一般而言，随着本发明的活性剂的亲脂性增强，CSF中的 药物浓度也增加。例如，见(Minn，A.等人，“药物转移至哺乳动物脑中：鼻 内途径以及其特定代谢障碍。”，药物靶向杂志(J.Drug Target)，10： 285-296，(2002))。
亲水的儿茶酚丁烷可以溶解在药学上可接受的载体中，例如盐水、 磷酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲盐。在一实施方案中，如所描述的，pH7.4 的0.05M磷酸盐缓冲液可以用作载体，例如，Kao等人(Kao，H.D.等人， “通过左旋多巴(L-Dopa)的水溶性前体药物的鼻内给药促进其全身性 给药以及CNS特定给药。”，药物研究(Pharmaceut.Res.)，17(8)：978-984， (2000))。
当施用药剂时，通过调整受试对象的位置可以使本发明药剂的鼻内 给药最优化。例如，患者的头部可以不同地定位为垂直-90、仰卧-90°、 仰卧-45°或仰卧-70°以获得最佳效果。
儿茶酚丁烷组合物的载体可以为药学上可接受的任何物质并可以与 组合物中的活性剂共存。当载体为液体时，其可以相比于鼻分泌液为低 渗的或等渗的，并且pH在约4.5至约7.5的范围内。当载体为粉末形式 时，其也在可接受的pH范围内。
用于鼻内给药的载体成分可以可选择地包括可以促进活性剂通过鼻 粘膜并由嗅觉神经途径进入脑中而吸收的亲脂性物质。此类亲脂性物质 的示例包括但不限于神经节苷脂和磷脂酰丝氨酸。在所述组合物中可以 包括一种或几种亲脂佐剂，例如以胶束形式。
用于治疗流感的鼻内给受试对象给药的活性剂药物组合物可以通过 本技术领域中的常规方式制备，例如，如美国专利6,180,603中所描述的。 例如，本发明的组合物可以制成粉末、微粒、溶液、气溶胶、滴剂、纳 米颗粒或脂质体。除了活性剂外，所述组合物可以含有合适的佐剂、缓 冲剂、防腐剂、盐。诸如鼻内滴剂的溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂等。
通过植入给药：
本发明的儿茶酚丁烷可以通过外科手术植入给药给受试对象用于治 疗，例如含有儿茶酚丁烷的生物可降解聚合物的皮下植入。除了外科手 术外，该治疗可以与其它常规的治疗结合。
因此，本发明的生物可降解聚合物可以为可溶解在组织液中、对宿 主组织没有任何毒性或不利效果的聚合物或共聚物。优选地，聚合物或 由其合成聚合物的单体是由食品与药品管理局准予人体服用的。具有不 同溶解特性单体的共聚物是优选的以控制降解的动力学，例如提高一种 单体相对于其它单体的比例以控制溶解速度。
在一实施方案中，聚合物为1，3-双-(对羧基苯氧基)丙烷与癸二酸 [p(CPP:SA)]的共聚物，如下述文献所描述的：Fleming A.B.和Saltzman， 卡莫司汀植入剂的药物动力学(Pharmacokinetics of the Carmustine Implant)，临床药物动力学(Clin.Pharmacokinet)，41(6):403-419(2002)； 以及Brem，H.和Gabikian，P.，“用于治疗脑部肿瘤的生物可降解聚合物植 入物。”控制释放杂志(J.Control.Rel.)74:63-67，(2001))。在另一实 施方案中，聚合物为聚乙二醇(“PEG”)与癸二酸的共聚物，如Fu等人所描 述的(Fu，J.等人，“用于在吸入或注射后控制药物释放的新的聚合物载体。” 生物材料(Biomaterials)，23:4425-4433，(2002))。
聚合物给药系统既可适用于本发明的疏水的儿茶酚丁烷也可适用于 本发明的亲水的儿茶酚丁烷。儿茶酚丁烷可以与生物可降解聚合物结合 以及通过外科手术植入。一些聚合物组合物也可用于本发明的静脉或吸 入疗法。
通过吸入给药
本发明的儿茶酚丁烷可以通过吸入全身性地和/或局部地给药至肺。 药物的吸入给药作为一种在肺的组织内获得高的药物浓度而基本上不引 起全身性毒性的方法，以及作为一种实现药物的全身性循还的方法已经 被广泛地接受。用于制备此类制剂的技术在本技术领域中是已知的。通 过该方式给药疏水儿茶酚丁烷或亲水儿茶酚丁烷可以看到治疗肺病的功 效。
对于通过吸入肺部给药，本发明的儿茶酚丁烷可以被制成干粉、水 溶液、脂质体、纳米颗粒或聚合物，以及例如作为气溶胶给药。亲水性 制剂可以通过肺泡表面吸收并进入血管供全身性利用。
在一实施方案中，见上文如Fu，J.等人(2002)所描述的制备和使用含 有本发明的活性剂的聚合物。例如，本发明的聚合物可以为癸二酸和聚 乙二醇(“PEG”)的聚合物，或聚(乳酸-co-乙二醇)酸(“PLGA”)或聚乙 烯亚胺(“PEI”)和多聚-L-赖氨酸(“PLL”)的共聚物。
在另一实施方案中，如Choi等人所描述的(Choi，W.S.等人，“由乙醇 悬浮液的蛋白质的吸入给药。”，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci. USA)，98(20)：11103-11107，(2001))，用于吸入给药的儿茶酚丁烷在雾化 吸入和服用前可以溶解在盐或乙醇中。
在另一实施方案中，当以本技术领域常规的方式制备、作为干粉给 药时，本发明的药剂也有效，例如，如Patton等人所描述的(Patton，J.S. 等人，“吸入胰岛素，”药物释放研究进展(Adv.Drug Deliv.Rev.)，35： 235-247(1999)(2001))。
本发明包括在嵌入药物释放装置中的微处理器的协助下释放儿茶酚 丁烷，例如，SmartMistTM物和AERxTM例如如Gonda，I.等人(1998)所描述 的，“具有顺应性和疾病管理能力的吸入释放系统。”控制释放杂质(J. Control.Rel.)53:269-274。
本发明的儿茶酚丁烷和组合物被给药用于治疗任何流感病毒。在某 些优选实施方案中，待治疗的流感流行株为禽株。在一些优选的实施方 案中，待治疗的流感感染为基于H5N1禽株。在本发明的某些优选实施 方案中，儿茶酚丁烷和组合物被给药给感染了禽流感流行株的人受试对 象。此外，在某些优选的实施方案中，儿茶酚丁烷和组合物被给药给遭 受人流感和禽流感复合感染的人受试对象。在阅读本发明所公开的内容 后，本领域技术人员可以认识到通过服用本发明的制剂可以治疗和/或减 轻其它疾病状况和/或症状。
虽然不受限于任何特定的流感发病机制或症状反应的理论，但是可 以认为人体中的流感病毒感染引起促炎细胞因子调节异常。严重的人 H5N1疾病的临床特征与病毒引起的细胞因子调节异常一致。虽然认为所 有的流感病毒感染引起促炎细胞因子，但是H5N1/97病毒比人流感A病毒 亚型H3N2或H1N1引起促炎细胞因子高得多的转录(Cheung CY，Poon LL， Lau AS等人，“由流感A(H5N1)病毒引起的人体巨噬细胞的促炎细胞因 子：一种罕见严重的人疾病的机理？”柳叶刀(Lancet)，2002360(9348)： 1831-7)。产生的特定的细胞因子为TNF-α(在本发明中以及附图中也称 为“TNF”)和人主要的单核细胞体外衍生的巨噬细胞中的干扰素β(Id.)。
流感病毒感染通常呈现严重的类似感冒的症状，并且通常引起呼吸 失调和/或致命的肺炎。感染了H5N1流感亚型的患者已经由于急性呼吸 窘迫和多器官功能障碍综合症的症状使原发性病毒肺炎变复杂。淋巴细 胞减少和噬红细胞作用在一些这类患者中已经成为显著性的表现。噬红 细胞作用以及急性呼吸窘迫和多器官功能障碍综合症的症状通常与细胞 因子调节异常有关。1997年的与H5N1相关的死亡的死后报告描述了伴 以促炎细胞因子IL-6、IFN-γ以及TNF-α浓度的升高的反应性噬红细胞 作用症状。存在许多与流感感染相关的疾病或紊乱，包括但不限于气喘、 肺炎、流感后脑炎、细菌性肌炎、心脏心电图的变化、支气管炎、肺结 核、癌、风湿性关节炎、骨关节炎、硬皮病、系统性红斑性狼疮、囊性 纤维化、恶病质、整体肌无力失调、心力衰竭、帕金森病、肌萎缩侧索 硬化或格林-巴利综合症。
2003年的人H5N1病毒，类似于人H5N1/97分离株，其在体外显示通 过人单核细胞衍生的巨噬细胞引起促炎细胞因子的过量生成。通过与人 病毒类似基因型的源自禽的H5N1病毒在原发性人巨噬细胞中诱导产生 大量的TNF-α(Guan Y，Poon LL，Cheung CY等人，“H5N1流感：变形蛋 白大流行威胁。”美国国家科学院学报(Proc Natl Acad Sci U S A)，2004 101(21):8156-61)。因此，认为源自巨噬细胞的TNF-α和其它细胞因子的 水平的增加与感染了流感A的患者的疾病的严重性相关，尤其是与携带 H5N1疾禽流感”的患者的不寻常的临床表现和疾病的严重度相关。系统 性炎症反应、多器官功能障碍、急性呼吸窘迫综合症、反应性噬红细胞 作用以及淋巴细胞减少为具有严重的H5N1疾病的患者的突出特征。
TNF-α引起细胞凋亡的能力是公知的。由于细胞凋亡对于有效的流 感病毒复制而言是关键性的，因此引起细胞凋亡的活动也是流感的致病 原因。人流感病毒和禽流感病毒的有效复制都与TNF超家族成员TRAIL 和FasL的上调相关(Wurzer WJ，Ehrhardt C，Pleschka S等人“肿瘤坏死因 子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和Fas/FasL的NF-/F-依赖诱导 (NF-kappaB-dependent induction)对于有效的流感病毒繁殖是关键性 的。”生物化学杂志(J Biol Chem)，2004279(30):30931-7)。
此外，虽然不受限于任何特定的理论，但是已经建议且认为相应于 流感病毒基因组RNA的促炎细胞因子的产生增多由免疫系统的细胞膜上 的Toll样受体发出信号(Diebold SS，Kaisho T，Hemmi H等人，“依靠单 链RNA的TLR7介导识别的先天抗病毒反应。”科学(Science)，2004 303(5663)：1529-31)。使用一种细菌内毒素的脂多糖(“LPS”)刺激巨 噬细胞也导致产生促炎细胞因子，例如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10和诸 如前列腺素、白三烯的促炎脂质介质以及血小板活化因子。已经表明响 应于LPS产生的细胞因子是通过Toll样受体途径起作用，类似于流感病 毒反应(Takeda K，Kaisho T和Akira S.“Toll样受体。”“免疫学年度评 论(Annu Rev Immunol)”，200321:335-76)。
诸如通式(I)、(II)和(III)的儿茶酚丁烷，例如，M4N或G4N，以及含 有根据本发明的一种或多种儿茶酚丁烷的组合物在响应鼠单核细胞衍生 的巨噬细胞的LPS或病毒感染时会抑制TNF-α和其它促炎生物因子、前 列腺素E2以及其它促炎脂质介质的产生。由于鼠单核细胞衍生的巨噬细 胞细胞系(RAW 264.7)与原发性人巨噬细胞相比响应于LPS会诱导产生 大量TNF-α，因此其代表了一种预测TNF系统中的人药物效果的合适的 模式。
现参照下述非限制性的实施例更详细地描述本发明。
实施例1
研究使用通式(I)的儿茶酚丁烷，即M4N对由LPS诱导的RAW 264.7 巨噬细胞产生TNF-α的效果以测定M4N抑制TNF-α诱导的能力。可以 使用与该实施例的方法类似的方法测定通式(I)的任何儿茶酚丁烷对在 任何LPS刺激的巨噬细胞中产生任何促炎细胞因子的效果。
如图1所示以及下文所描述的，M4N抑制RAW 264.7巨噬细胞中的 LPS诱导的TNF-α过表达，在诱导后10小时最大抑制量为57％。
更具体而言，关于用于测定M4N通过LPS抑制TNF-α诱导的方法， 或者留下1.5 x 105个巨噬细胞不处理(对照)或使用LPS(1μg/ml)，M4N(25 μM)或两种化合物一起在不同时间点培养。RAW 264.7细胞为鼠单核巨 噬细胞。使用的LPS源自明尼苏达沙门氏菌R595(Salmonella minnesota R595)，其可从立斯特生物技术实验室股份公司(List Biological Laboratories，Inc.)(坎贝尔，加利福尼亚(Campbell，CA))获得。然后使 用鼠TNF-α特异免疫检测通过源自标准曲线的插值测定培养上清液中的 TNF-α水平。所有的测试都进行两次，并且在每种情形下，误差图(error bars)小于符号大小(symbol size)。
从ATCC购买RAW264.7巨噬细胞，在添加了10％的胎牛血清(FBS) 的DMEM(Dulbecco′s modified Eagles medium)中培养并在8％的二氧化 碳中保持在37℃。FBS购自亚特兰大生物制品公司(Atlanta Biologicals) (亚特兰大，乔治亚州(Atlanta，GA))，而所有其它培养基成分购自希 格玛爱尔克公司(Sigma Aldrich)(圣路易丝，密苏里州(St.Louis，MO))。 对于TNF的制备，通过胰酶消化采集细胞，离心、计数，在24孔组织 培养板中放置1.5 x 105个细胞并过夜培养。然后在不存在/存在25μM M4N，使用每毫升1克的脂多糖(LPS)如图1中示出的时间点刺激细胞。 在添加至孔之前，在组织培养基中溶解LPS并超声粉碎。在DMSO中制 备M4N储存液，然后在添加至孔之前，在培养基中稀释。收集产生的上 清液，在8,000rpm离心两分钟以除去细胞和碎片，在-20℃贮存。使用从 研发系统股份公司(R&D Systems Inc.)(明尼阿波利斯，明尼苏达州 (Minneapolis，MN))购买的康尼提凯(Quantikine)鼠TNF-α/TNFSF1A， 免疫检测剂测定培养上清液中的TNF-α水平。所述检测剂为夹层类型的 捕获ELISA。孔提供有预包被的用于鼠TNF-α的特定亲和纯化的多克隆 抗体。添加上清液至孔，孵育，存在的任何TNF-α由固定抗体捕获。清 洗后，加入与抗-TNF-α捕获抗体的酶，然后进行第二孵育步骤。再次清 洗孔，然后加入底物溶液。底物的分裂产生蓝色溶液，然后在加入终止 液时所述溶液变黄。使用BMG POLARstar星系微孔板读数器(galaxy microplate reader)在450nm测定光密度。由制造商提供标准的重组鼠 TNF-α溶液以产生标准曲线，由源自标准曲线的插值测定培养上清液中 TNF-α的水平。图1中示出的所有点都进行两次，平均值用于定量。
在使用佛波醇十四烷基乙酸酯(phorbol myristyl acetate)(PMA)或 A23187(钙离子载体)，而非LPS诱导后，在RAW 264.7巨噬细胞中没有 观察到通过M4N对产生TNF-α的抑制。认为PMA和A23187是非特异 性地发挥作用，独立于细胞表面受体和大多数信号传递过程。因此，虽 然不受限于任何特定理论，但是M4N抑制LPS诱导产生TNF-生的能力 可以来源于对TNF反应的上游信号和激活阶段的影响，而不是对负责 TNF-α的合成和释放的下游过程的影响。因此，可以确信M4N对治疗 H5N1感染的有益效果而不引起对产生TNF-α的潜在的有害的非特异性 下降。
该实施例的结果表明通式(I)的儿茶酚丁烷可以抑制过多地产生响应 LPS诱导的TNF-α，说明在流感感染时通过提高TNF-α的水平，所述 化合物和相关的儿茶酚丁烷以及NDGA衍生物可以用于治疗疾病或在流 感感染时由增高的TNF-α介导的紊乱。
实施例2
研究使用通式(I)的儿茶酚丁烷，即M4N对鼠成纤维细胞中TNF- α诱导的凋亡的效果以测定M4N抑制TNF-α诱导凋亡的能力。可以使 用与该实施例的方法类似的方法测定通式(I)的任何儿茶酚丁烷对任何 类型的细胞中TNF-α诱导凋亡的的效果。
流感感染诱导产生TNF-α，TNF-α促凋亡活性是公知的。流感病毒 需要凋亡以有效的复制，阻断TNF-α诱导的凋亡可以减少流感病毒复制 和疾病。
如图2所示以及下文所描述的，M4N通过放线菌酮强烈地抑制对TNF 敏感的TNF-α诱导的细胞凋亡。C3HA鼠成纤维细胞在不存在/存在 NDGA(25μM)或M4N(50μM)与人重组TNF-α(20ng/ml)、放线菌酮 (CHI)(10ng/ml)或两者一起孵育。同时加入所有化合物并处理6小时。 在最后的半个小时期间加入若丹明(Rhodamine)123，使用BMG POLARstar星系荧光分析仪(galaxy flourimeter)测量荧光。
更具体而言，C3HA细胞在添加了10％的胎牛血清(FBS)的DMEM (Dulbecco′s modified Eagles medium)中培养并在8％的二氧化碳中保持 在37℃。C3HA细胞系为由C3H鼠衍生的3T3样的鼠成纤维细胞细胞系。 FBS购自亚特兰大生物制品公司(亚特兰大，乔治亚州)，而所有其它培养 基成分购自希格玛爱尔克公司。对于凋亡检测，通过胰酶消化采集细胞， 离心、计数，在培养基的平底96孔酶标板的各孔添加1.5 x 104个细胞。 在不存在/存在去甲二氢愈创木酸(25μM)或M4N(50μM)时，在添加 TNF(20ng/ml)、CHI(10g/ml)或两者之前允许细胞粘附至少六(6)小时。 人重组TNF-α购自培普特克(Peprotech)(石丘，新泽西州(Rocky Hill， NJ))，而CHI购自EMD生物科学股份公司(EMD Biosciences Inc.)(圣 地亚哥，加利福尼亚州(San Diego，CA))。两者都溶解在培养基中。NDGA 也溶解在培养基中，而M4N储存液在DMSO中制备，然后在培养基中稀 释，然后在添加至孔之前，在培养基中稀释。同时添加总量为200微升 的所有化合物，允许孵育六(6)小时。在孵育的最后三十(30)分钟期 间添加50μL的若丹明123至最终浓度为2μg/ml的各孔。若丹明123 购自分子探针股份公司(Molecular Probes Inc.)(尤金，俄勒冈州(Eugene， OR))并在培养基中稀释。若丹明123被有活力的线粒体隐蔽，活的键康 细胞呈现强的线粒体荧光性。相反，由于凋亡的细胞通常会经历线粒体 通透性转换，从而线粒体失去其膜电位，因此荧光在经历了凋亡的细胞 中会减弱。结果，若丹明123荧光在凋亡的细胞中急剧地减弱。然后使 用BMG POLARstar星系微板读数器在分别设定激发波长492纳米以及发 射波长538纳米时测定荧光强度。所有的点都进行三次，根据下述方程 式计算细胞死亡百分比：
[(对照值-实验值)/对照值]*100
该实施例的结果表明通式(I)的儿茶酚丁烷可以抑制TNF-α诱导的细 胞凋亡，说明所述化合物和相关的儿茶酚丁烷以及NDGA衍生物可以用 于减少流感病毒在宿主细胞中的复制，而有效复制需要凋亡。
实施例3
研究使用通式(I)的儿茶酚丁烷，即M4N对由LPS诱导的RAW 264.7 巨噬细胞产生前列腺素E2(“PGE2”)、前列腺素F1α(“PGF1G”)以及前列 腺素F2α(“PGF2α”)的效果以测定M4N在响应流感病毒感染时抑制过量 产生前列腺素的能力。可以使用与该实施例的方法类似的方法测定通式 (I)的任何儿茶酚丁烷对在任何LPS刺激的巨噬细胞中产生任何促炎脂 质介质的效果。
事实上，前列腺素是在所有组织和器官中发现的自分泌和旁分泌脂 质介质。其在细胞中由必需脂肪酸合成，例如γ-亚麻酸、花生四烯酸和二 十碳五烯酸。其作用于多种细胞，例如除了内皮细胞、子宫细胞和肥大 细胞外，引起聚合或解聚的血小板细胞，引起收缩或扩张的血管平滑肌 细胞，引起疼通的脊髓神经元。前列腺素具有多种作用，包括但不限于肌 肉收缩和诱导炎症。其它效果包括钙流动和细胞生长调控。
前列腺素E2由前列腺素E合成酶作用于前列腺素H2(PGH2)产生， 前列腺素H2通过环氧化酶(COX-1和COX-2)的作用由脂肪酸获得。在流 感感染发生期间，PGE2被诱导。感染人流感病毒亚型H3N2会增加支气 管上皮细胞中PGE2的释放(MizumuraK，Hashimoto S，Maruoka S等人， “流感病毒中的丝裂原活化蛋白激酶从支气管上皮细胞中的花生四烯酸 诱导前列腺素E2的作用。”临床和实验性过敏(Clin Exp Allergy)，2003 33(9):1244-51)。
可以由包括PGH2、PGE2或PGD2的三种不同的底物通过三种途径产 生PGF2G。PGF2G引起平滑肌收缩，其活性与气喘和分娩相关。
环前列腺素，也称为PGI2，其通过PGI合酶的作用由PGH2产生，其广 泛地由许多细胞类型表达。环前列腺素在诸如炎症和分娩的多种生物反 应中是一种重要的有效的血管扩张剂和平滑肌松驰剂。然而，环前列腺 素不稳定，通常通过测量被称为PGF1α(6-keto-PGF1α)的环前列腺素 的稳定衍生物而获得可靠的测量结果。
如图3所示以及下文所描述的，M4N对LPS诱导的PGE2的产生具 有强的抑制作用。在图3中，M4N(25μM)呈现了在RAW 246.7巨噬细胞 中对LPS诱导PGE2产生的强的抑制。在示出的时间段单独使用LPS(1 μg/ml)，或与25μM M4N组合使用处理巨噬细胞。然后使用前列腺素 E2免疫检测(R&D系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州)由上清液检测 PGE2。示出的数据为在各个时间点2-4个测定值的平均+/-SEM。在6、 10和16小时，抑制水平分别为72、64和80％。M4N的抑制作用在整个 16小时期间内都在培养液中持续。
如图4所示以及下文所描述的，M4N对LPS诱导的PGF2α的产生也 具有强的抑制作用。在图4中，用LPS(1μg/ml)刺激16小时后，从RAW 264.7巨噬细胞培养上清液检测出15ng/ml的PGF2α。当同时使用LPS(1 μg/ml)和M4N(25μM)处理RAW 264.7巨噬细胞16小时时，PGF2α的产 生被抑制。根据两次实验由M4N(25μM)抑制的平均值％为82％。使用 PGF2αELISA试剂盒(检测设计公司，安珏伯，密西根州(Assay Designs， Ann Arbor，MI))通过ELISA测定RAW 264.7巨噬细胞培养上清液中PGF 2α的值。示出的数据为两次独立实验的平均+/-SEM。
如图5所示以及下文所描述的，M4N对LPS诱导的PGF1α的产生也 具有一些抑制作用，在图5中，使用LPS(1μg/ml)刺激16小时后，从 RAW 264.7巨噬细胞培养上清液中检测出5-6ng/ml的PGF1α。当使用LPS (1μg/ml)和M4N(25μM)同时处理RAW 264.7巨噬细胞16小时时，PGF1α 的产生被抑制。根据两次试验的抑制平均值％为41％。使用PGF1α ELISA 试剂盒(R&D系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州)通过ELISA测定 RAW 264.7巨噬细胞培养上清液中PGF1α的水平。示出的数据为根据独立 的RAW 264.7试验的平均值+/-SEM。
为了确认图5中示出的对产生PGF1α(一种PGI2/前列环素的指标)的 相对适中的抑制率不是归因于一些试验误差，也测量了这些RAW 264.7 巨噬细胞培养上清液中产生PGE2的抑制％。与图3中的结果一致，检测 出这些上清液中PGE2的抑制超过90％，这表明所观察的对产生PGF1α的 适中的抑制率不可能归因于与细胞、LPS和M4N相关的试验误差。
因为也称为EM-1421的M4N对前列腺素和白三烯的产生具有强的抑 制作用，其可以特别好地适于治疗肺中的炎症状况，例如由流感感染引起 的哮喘，其倾向依赖于脂质介质。与PGE合酶和PGF合酶不同，PGI合 酶对EM-1421可以相对地具有抗性，在存在EM-1421时其说明了大量产 生PGF1α的原因。
更具体而言，关于用于测定M4N对PGE2产生的效应的方法，购买 RAW264.7巨噬细胞，并根据实施例1中描述的程序培养和维持。通过胰 酶消化采集细胞而完成细胞中前列腺素E2的产生并离心。对细胞计数， 在24孔组织培养板中放置1.5 x 105个细胞并过夜培养。然后在不存在/ 存在25μM时使用1μg/mi LPS如图5中示出的时间点刺激细胞。在添 加至孔之前，在组织培养基中溶解LPS并超声处理。在DMSO中制备 M4N终止液，然后在添加至孔之前，在培养基中稀释。收集产生的上清 液，在8,000rpm离心两分钟以除去细胞和碎片，在-20℃贮存。使用从研 发系统股份公司购买的前列腺素E2免疫检测测定培养上清液中的前列腺 素E2水平。所述检测为竞争型的ELISA。上清液中存在的前列腺素E2 与固定量的碱磷酶标记的前列腺素E2竞争结合鼠单克隆抗前列腺素E2 抗体。产生的复合物被与微量滴定孔结合的山羊抗鼠抗体结合。清洗后， 加入产生颜色的底物以对结合酶的量进行定量。使用BMG POLARstar 星系微孔板读数器在405nm测定光密度。由制造商提供标准的前列腺素 E2溶液以产生标准曲线，由源自标准曲线的插值测定培养上清液中前列 腺素E2的水平。所有点都进行两次，平均值用于定量。
使用类似的方法测定M4N对PGF1α和PGF2α产生的效应。
该实施例的结果表明通式(I)的儿茶酚丁烷可以抑制响应LPS刺激的 过多的前列腺素产生，说明在所述化合物和相关的儿茶酚丁烷以及 NDGA衍生物可以用于治疗在流感感染时由高水平前列腺素介导的疾病 或紊乱。
实施例4
研究应用通式(I)的儿茶酚丁烷，即M4N对由RAW 264.7巨噬细 胞产生的一组细胞因子的效应以测定通过LPS刺激的细胞因子的诱导以 及M4N抑制诱导的能力。
在该研究中使用了抗体(“Ab”)芯片技术。如图6所示以及下文所 描述的，M4N对LPS诱导的几种细胞因子的产生具有抑制作用。虽然细 胞因子的产生水平总体上低，但是未经LPS刺激或EM-1421处理(图6A 中的“控制”组)在来源于RAW264.7巨噬细胞的上清液中检测出许多细 胞因子。虽然几种细胞因子的产生减少(KC、BLC、IL-4、IL-9、MIP-1α、 M1P-1γ和IL-12p40p70)且两种细胞因子的产生增加(IL-1α和MIG)， 但是在使用EM-1421以终浓度25μM(图6A中的“EM-1421”组)处理后， 此种细胞因子的产生模式总体上被维持。这加强了EM-1421是安全的临 床证据。
LPS引起许多细胞因子(图6B中的“LPS”组)的大量增加(>20％)， 包括RANTES、IL-1α、IL-2、TIMP-1、TIMP-2、TNF-α、IL-6、MCP-1、 sTNFRI、sTNFRII、IL-12p40、MIP-1α和G-CSF。在几种情形下，这些 增加被EM-1421(图6B中的“LPS+EM-1421”组)部分地或完全地抵消。 在高水平产生的细胞因子中，EM-421抑制LPS诱导的IL-1α约 20％，TNF-α约24％，MCP-I约33％，sTNFRI约63％以及sTNFRII约20％。 在低水平产生的细胞因子中，EM-421抑制LPS诱导的I-TAC约100％， IL-2约100％，TIMP-1约30％，TIMP-2约100％，BLC约100％以及IL-3 约100％。然而，由于这些细胞因子以低水平产生，因此预测这些观察结 果的意义是困难的。有趣地，EM-1421不抑制LPS诱导的RANTES、IL-6、 IL-12p70、MIP1-α以及G-CSF的产生，并且增加LPS诱导的IL-12p40p70 的产生约43％。
更具体而言，关于用于测定M4N对细胞因子产生的效应的方法，在 所述方法中使用了“鼠炎症芯片-1”(阵光生物技术股份公司，亚特兰大， 乔治亚州(RayBiotech，Inc.，Atlanta，GA))。购买RAW264.7巨噬细胞， 培养，使用LPS(1μg/ml)刺激，使用EM-1421(25μM)处理，根据实施例 1中描述的采集细胞。根据制造商的说明书使用鼠炎症芯片-1，使用或未 使用LPS(1μg/ml)刺激和使用或未使用EM-1421(25μM)处理，测量 RAW264.7巨噬细胞的培养上清液中的细胞因子。简而言之，使用硝化纤 维素Ab芯片孵育培养上清液约2h，清洗，与第二种Ab溶液接触，使用 ECL溶液培养，并与X光胶卷接触。扫描芯片放射自显影。使用Photoshop (Adobe)分析并测定各阵列位置的平均像素灰度。在图6A和图6B中标出 了复制点(duplicate spots)的平均值。在各个芯片上阳性对照点为约100 单位，对于所有复制点而言SEM低于10％，对于大多数复制点而言SEM 低于1％。
该实施例的结果表明通式(I)的儿茶酚丁烷可以抑制响应LPS刺激 的，除了TNF-α外还有其它几种细胞因子的过多地产生，说明所述化合 物和相关的儿茶酚丁烷以及NDGA衍生物可以用于治疗在流感感染时由 高水平细胞因子介导的疾病或紊乱。
实施例5
研究应用通式(I)的儿茶酚丁烷，即M4N对由MDCK细胞和RAW 264.7巨噬细胞产生的流感株A/WS/33的作用以测定M4N在这些细胞中 抑制流感病毒生长的能力。与该实施例的方法类似的方法可以用于测定 通式(I)的任何儿茶酚丁烷在任何类型的细胞中对流感病毒的任何株的生 长或复制的效应。
A/WS/33是一种可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(马纳萨斯，弗吉尼亚洲(Manassas，VA))商 业获得的流感病毒A毒株。其从患有流感的患者分离。推荐的A/WS/33 的宿主包括鸡胚、雪貂和鼠。
MDCK细胞为衍生于外表正常的成年雌性考克斯班尼犬的肾脏的上 皮样细胞。其显示出支持各种类型的病毒，包括流感A病毒的生长。使 用MDCK细胞产生高滴度储备(stocks)的A/WS/33并且用于定量测定 以测量试验中的培养上清液中的感染病毒的数量。确定可以用于MDCK 细胞中而不引起毒性作用的EM-1421的最高浓度为25μM。确定了多种 定量分析法以监测A/WS/33复制，包括但不限于细胞病变(TCID50)、斑 块、免疫聚焦(immunofocus)和荧光免疫检测法。
如图7所示，组A和组B显示了同样的数据，但是分别具有线性和 对数y轴，浓度为25μM的EM-1421抑制MDCK细胞中的A/WS/33复制 约75％。通常用于使病毒滴定巨大差异可视化的对数坐标图表明 EM-1421的抑制作用低于1对数单位。
如图8所示，组A和组B显示了同样的数据，但是分别具有线性和 对数y轴，在不同测试浓度(3μM、6μM、12μM和25μM)的EM-1421 没有抑制RAW 264.7巨噬细胞中A/WS/33的复制。相反，EM-1421促进 了由RAW 264.7产生A/WS/33。然而，此外，该效应相对适度地，即低 于1对数增长(图8B)。使用EM-1421预处理RAW 264.7细胞还促进了 A/WS/33的生长。如图9中的组A和组B所示，EM-1421的浓度在25 μM时所述促进作用尤其显著，在36小时的时间点测得1个对数增量。
EM-1421抑制MDCK细胞流感毒株A/WS/33的生长，但是促进RAW 264.7巨噬细胞的生长。在两种情形下，这些作用都相对地适度，即病毒 滴度约1个对数的变化。为完全地确定EM-1421对流感病毒复制的效应， 需要检查其它的病毒和细胞类型。此外，为确定这些效应是否显著地影 响病毒装载，体内试验是必需的。
更具体而言，关于用于测定M4N对由MDCK细胞或RAW 264.7巨 噬细胞产生的A/WS/33的效应的方法，MDCK细胞或RAW 264.7巨噬细 胞分别以0.001或0.002的感染复数(MOI)进行预防注射。除了对照样本 没有添加药物外，在发生流感感染30分钟后，EM-1421以希望的浓度被 添加至细胞，并且在整个试验期间保持该浓度。在希望的时间点收集培 养上清液。
然后使用基于MDCK的免疫聚焦检测法定量分析这些上清液中的感 染病毒。在24孔板中平铺MDCK细胞(5 x 105/孔)，并在病毒培养基中过 夜培养，所述培养基含有：含有10％的胎牛血清(亚特兰大生物制品公司， 乔治亚州亚特兰大)的DME基础培养基(#10-013-CV，(梅地亚技术公 司，弗吉尼亚州赫恩登(MediaTech，Hemdon VA))，25mM HEPES缓冲 液(#25-060-CL，梅地亚技术公司)，1：100抗生素/抗真菌的溶液 (#A5955-Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯(St.Louis Mo))，1.8μg/ml胎 牛血清(#A7906 Sigma-Aldrich)以及2mg/ml胰蛋白酶(#3740，沃辛顿公司 (Worthington)，新泽西州莱克伍德(Lakewood NJ))。然后在没有胎牛 血清的同样的培养基中清洗两次细胞。然后在30分钟内添加含有病毒的 上清液的系列稀释液，然后使用含有0.6％的黄蓍胶(#104792，MP生物医 药股份公司，俄亥俄州索伦(MP Biomedicals Inc.，Solon OH))覆盖病毒 培养基。在孵育24和48小时后，抽出覆盖物，使用PBS清洗细胞并使 用50:50的丙酮/甲醇固定。然后使用抗HA抗体染色细胞以聚焦检测。
为测定M4N对由EM-1421预处理的RAW 264.7巨噬细胞产生 A/WS/33的效应，首先使用希望浓度的EM-1421孵育RAW 264.7巨噬细 胞2小时。然后在MOI为0.002时使用A/WS/33孵育细胞。在整个试验 期间EM-1421都存在于细胞培养液中并维持同样的浓度。在希望的时间 点收集培养上清液。然后使用上述基于MDCK的免疫聚焦检测法定量分 析这些上清液中的感染病毒。
该实施例的结果表明通式(I)的儿茶酚丁烷可以抑制一些宿主细胞中 流感病毒的复制，说明所述化合物和相关的儿茶酚丁烷以及NDGA衍生 物可以用于抑制宿主中流感病毒的复制或生长。
实施例6
研究应用通式(I)的儿茶酚丁烷，即M4N对由感染流感毒株A/WS/33 的RAW264.7巨噬细胞产生TNF-α的效果以测定M4N抑制由于流感感 染引起的TNF-α诱导的能力。可以使用与该实施例的方法类似的方法测 定通式(I)的任何儿茶酚丁烷对在感染了任何流感病毒的巨噬细胞中产 生任何促炎细胞因子的作用。
在该研究中使用了两种模型系统，低复数感染模型和高复数感染模 型。在低复数感染模型中，使用非常低剂量的流感病毒(MOI＝0.002)启动 RAW 264.7巨噬细胞的感染，然后所述流感病毒在接下来的24-48小时 期间分布在整个培养液中。该模型试图接近在自然感染期间体内观察到 的状况。然而，在该模型中，感染必需在包括2μg/ml胰蛋白酶的不含 血清的感染培养基中进行。发现当RAW 264.7细胞从其生长培养基(含 有10％FCS的DEM)转换至不含血清的感染培养基时，感染培养基自身 刺激巨噬细胞并提高细胞因子和脂质介质的产生的背景值。胰蛋白酶包 括在感染培养基中，由于流感病毒从细胞传播至细胞(体内或体外)， 其必须通过胞外蛋白酶起作用。
在高MOI模型中，使用高剂量的流感病毒(MOI＝5)启动感染，确保 所有的细胞实际上迅速地且同时地感染所述流感病毒。在启动这些感染 后，观察强的病毒血凝素染色8小时。在细胞因子和脂质介质的背景值 保持为低值的通常的培养基中进行感染。然而，在这些条件下，不产生 有感染性的病毒粒子。缺乏病毒离子的产生以及高的流感病毒启动剂量 意味着该模型不接近于体内的流感病毒感染。
因此，低MOI和高MOI模型都被用于获得流感病毒和EM-1421对 RAW 264.7的新陈代谢的效应的更完整的视角。
图10-12描述了低MOI检测模型的结果。在图10中，当RAW 264.7 细胞从其生长培养基变换至不含血清的感染培养基时，细胞产生约750 pg/ml的TNF-α(“培养基”条)，其高于当细胞保持在生长培养基中时通 常测得的100pg/ml。EM-1421(25μM)单独降低该值约67％，明显地抵消 与培养基(“EM-1421”条)变换相关的“应激”或“激活”信号。如已 经报道的，发现流感病毒感染导致TNF-α的值增加(“流感”条)。在该 研究中，在感染流感病毒(毒株A/WS/33)后测得的TNF-α的值通常增 加约80-85％。EM-1421(25μM)毒株完全地阻断了该流感病毒诱导的 TNF-α产生的增加(“流感/EM-1421”条)。
图11描述了在不同浓度的EM-1421时剂量反应试验的结果。 EM-1421培养基单独或培养基和最终浓度低如0.1μM的流感病毒感染一 起都抑制TNF-α的产生的增加。增加EM-1421的浓度引起抑制增加。
图12示出了时程实验的结果。在接种或不接种流感毒株A/WS/33 (“流感”)，以及使用或不使用EM-1421(“EM-1421”)孵育细胞。在 图中示出的时间点测定培养上清液中的TNF-α的量。发现EM-1421的抑 制作用似乎紧接TNF-α的诱导，TNF-α的诱导在整个24小时期间都保 持抑制。
图13-15描述了高MOI检测模型的结果。RAW 264.7细胞在不存在 病毒感染和使用EM-1421(“培养基”条)处理时产生约100pg/ml的 TNF-α。EM-1421(25μM)单独降低该值约35％(“EM-1421”条)。此外， 发现流感感染引起TNF-α值增加，图示约135％(“流感”条)。EM-1421 (25μM)也完全地阻断了流感病毒诱导的TNF-α产生的增加(“流感 /EM-1421”条)。图14描述了剂量响应试验的结果。最终浓度约10μM 和25μM的EM-1421通过流感病毒感染分别抑制TNF-α产量增加约 34％和60％。图15示出了时程试验的结果。EM-1421的抑制作用似乎紧 接TNF-α的诱导，TNF-α的诱导在12小时和24小时分别抑制51％和 55％。
如上所述，M4N在低和高MOI模型系统中都强烈地抑制RAW264.7 巨噬细胞中流感病毒诱导的TNF-α的过表达。因此，M4N可能类似地抑 制感染了流感病毒，尤其是感染了H5N1流感病毒亚型的人巨噬细胞中 的TNF-α响应。TNF-α是在感染有高致命的H5N1亚型流感的肺中通常 致命的炎症反应中的关键作用者之一。因此，通过控制细胞因子的失调， EM-1421可以显著地减少与致命性流感病毒感染相关的肺部炎症和死 亡，以及降低人H5N1疾病的严重性。时程试验表明EM-1421在感染早 期抑制TNF-α的诱导，表明EM-1421可能起作用以抑制TNF-α的合成 和/或释放，而非引起TNF-α的降解。
更具体而言，关于使用的低MOI模型，1.5 x 105个RAW 264.7巨噬 细胞/孔平铺于含有10％的FCS的DME培养基中(#D5648，Sigma Aldrich， 圣路易丝，密苏里州)过夜。移去培养基，在病毒生长培养基中(含有2 μg/ml的胰蛋白酶、2.5％HEPES缓冲剂和0.2％BSA的DME基)使用 MOI为0.002的200μl的接种病毒(毒株A/WS/33)替换，并允许病毒 吸附30分钟。然后增加培养基的体积至1ml。当体积增加至1ml时， EM-1421的最终浓度增加至25μM。不含有病毒和EM-1421(“培养基”) 的孔或仅含有EM-1421(“EM-1421”)被作为“模拟感染”孔，其与感染 的孔受到相同的处理但没有病毒。在孵育约24小时后，收集培养上清液， 通过ELISA检测TNF-α。示出的数据为两个独立试验的平均+/-SEM， 每个试验进行两次重复的感染。所有的ELISA点检测两次。
在使用的高MOI模型中，1.5 x 105个RAW 264.7巨噬细胞/孔平铺于 含有10％的FCS的DME培养基中过夜。移去培养基，在含有10％的FCS 的DME培养基中使用MOI为5的200μl的接种病毒(毒株A/WS/33) 替换，并允许病毒吸附30分钟。然后增加培养基的体积至1ml。当体积 增加至1ml时，EM-1421的最终浓度增加至25μM。不含有病毒和 EM-1421(“培养基”)的孔或仅含有EM-1421(“EM-1421”)的孔被作为 “模拟感染”孔，其与感染的孔受到相同的处理但没有病毒。在孵育约 24小时后，收集培养上清液，通过ELISA检测TNF-α。示出的数据为 两个独立试验的平均+/-SEM，每个试验进行两次重复的感染。所有的 ELISA点检测两次。
在剂量响应试验中，当培养基的体积增至1ml时，添加至培养基的 EM-1421的最终浓度为0.1、1、10或25μM。
在时程试验中，在细胞培养液接种流感病毒后孵育约4、12或24小 时后，收集培养上清液，通过ELISA检测TNF-α。
该实施例的结果表明通式(I)的儿茶酚丁烷可以抑制响应于流感病毒 感染的过多的TNF-α产生，说明所述化合物和相关的儿茶酚丁烷以及 NDGA衍生物可以用于治疗在流感感染时由高水平TNF-α介导的疾病或 紊乱。
实施例7
研究应用通式(I)的儿茶酚丁烷，即M4N对感染流感毒株A/WS/33 的RAW 264.7巨噬细胞产生PGE2的效果以测定M4N抑制由流感病毒感 染诱导PGE2的能力。可以使用与该实施例的方法类似的方法测定通式(I) 的任何儿茶酚丁烷对在感染了任何流感病毒的巨噬细胞中产生任何促炎 脂质介质的效应。
如图16和17以及下文所述，M4N抑制RAW 264.7巨噬细胞中流感 诱导的PGE2的过表达。因此，M4N可能类似地抑制感染了流感病毒， 尤其是感染了H5N1流感病毒亚型的人巨噬细胞中的TNF-α响应。此外， 通过控制细胞因子的失调，M4N可以用于降低人的H5N1疾病的严重性。
还没有广泛地研究在流感感染期间的PGE2的产生。在该研究中既使 用了低MOI模型也使用了高MOI模型。
图16描述了低MOI检测模型的结果。当RAW264.7细胞从其生长 培养基转换至不含血清的感染培养基时，细胞产生约1ng/ml的PGE2(“培 养基”条)。EM-1421(25μM)单独地强烈诱导出该值(“EM-1421”条)。 流感病毒感染可重复地导致PGE2的值增加约30％(“流感”条)。EM-1421 (25μM)也强烈地阻断了该流感病毒诱导的PGE2产生的增加(“流感 /EM-1421”条)。
图17描述了高MOI检测模型的结果。RAW 264.7细胞在不存在病 毒感染和使用EM-1421(“培养基”条)处理时产生非常低的PGE2值(约 75pg/ml)。EM-1421(25μM)单独增加PGE2的值约两倍(“EM-1421” 条)。然而，由于PGE2在“培养基”和“EM-1421”孔中低水平地产生， 因此预测这些观察结果的意义是困难的。流感病毒感染导致PGE2水平显 剧增加，图中示出增加约1,300％至约1,100pg/ml(“流感”条)。EM-1421 (25μM)减少流感病毒诱导的PGE2的产生增长的约32％(“流感/EM-1421” 条)。
脂质介质在流感病毒诱导的肺部炎症中所起的作用尚未很好地被表 征。在该研究中获得的结果揭示了新的信息。在低MOI的模型中(图16)， 不含血清的感染培养基导致高背景值的PGE2的产生；流感病毒感染引起 PGE2的值的额外的小的且可重复的增加；EM-1421既通过培养基感染也 通过流感感染完全地抑制PGE2的产生的增加。低MOI模型的结果与观 察到的通过EM-1421对LPS诱导的PGE2产生的强烈抑制相一致。相反， 高MOI模型(图17)揭示了流感病毒感染对PGE2的强的诱导(低背景)，但 EM-1421对该诱导仅有中等的抑制。进行了另外的试验以说明由低MOI 模型系统和高MOI模型系统观察到的不同的结果。
更具体而言，关于使用的低MOI模型，1.5 x 105个RAW264.7巨噬 细胞/孔平铺在含有10％的FCS的DME培养基中过夜。移去培养基，在 病毒生长培养基中(含有2μg/ml胰蛋白酶、2.5％HEPES缓冲液和0.2％ BSA的基础DME)使用MOI为0.002的200μl的接种病毒(菌株 A/WS/33)替换，并允许病毒吸附30分钟。然后增加培养基的体积至1ml。 当体积增加至1ml时，EM-1421的最终浓度增加至25μM。不含有病毒 和EM-1421(“培养基”)的孔或仅含有EM-1421(“EM-1421”)的孔被作 为“模拟感染”孔，其与感染的孔受到相同的处理但没有病毒。在孵育 约24小时后，收集培养上清液，通过ELISA检测PGE2。示出的数据为 两个独立试验的平均+/-SEM，每个试验进行两次重复的感染。所有的 ELISA点检测两次。
在使用的高MOI模型中，1.5x105个RAW 264.7巨噬细胞/孔平铺于 含有10％的FCS的DME培养基中过夜。移去培养基，在含有10％的FCS 的DME培养基中使用MOI为5的200μl的接种病毒(菌株A/WS/33) 替换，并允许病毒吸附30分钟。然后增加培养基的体积至1ml。当体积 增加至1ml时，EM-1421的最终浓度增加至25μM。不含有病毒和 EM-1421(“培养基”)的孔或仅含有EM-1421(“EM-1421”)的孔被作为 “模拟感染”孔，其与感染的孔受到相同的处理但没有病毒。在孵育约 24小时后，收集培养上清液，通过ELISA检测PGE2。示出的数据为两 个独立试验的平均+/-SEM，每个试验进行两次重复的感染。所有的ELISA 点检测两次。
该实施例的结果表明通式(I)的儿茶酚丁烷可以抑制响应于流感病毒 感染的PGE2的过多产生，说明通过提高PGE2的水平所述化合物和相关 的儿茶酚丁烷以及NDGA衍生物可以用于治疗在流感病毒感染时由高水 平PGE2介导的疾病或紊乱。
实施例8
研究应用通式(I)的儿茶酚丁烷，即M4N对RAW 264.7巨噬细胞 的细胞因子产生的作用以测定流感病毒诱导的除了TNF-α外的细胞因子 的产生以及M4N对诱导产生的抑制能力。
在该研究中使用了抗体(“Ab”)芯片技术。如图18所示，在芯片 上的40种细胞因子、趋化因子、受体和蛋白酶中，在该试验中检测出了 8种。此外，在低MOI条件下，RAW264.7细胞从生长培养基转换至含 有胰蛋白酶的不含血清的感染培养基诱导产生高水平的TNF-α、高水平 的MIP-1γ，以及sTNFRII和趋化因子MIP-1水平的相对适中的增加。流 感感染也诱导细胞因子G-CSF的产生，在对照样本培养基中未检测出细 胞因子G-CSF。EM-1421(25μM)阻断了这些效应中的许多种。如流感病 毒诱导的TNF-α的产生一样，EM-1421完全地阻断了培养基诱导的TNF- α和MIP-1γ的产生。流感病毒诱导的M1P-1γ的产生被阻断约60％， G-CSF的产生被完全地阻断。相反，EM-1421不抑制流感病毒诱导的sTNF RII或MCP-1的产生。
进行ELISA检测细胞因子β干扰素(IFN-β)和IL-6。在芯片上不包 括IFN-β，感染流感病毒A可以诱导该细胞因子。然而，在低(A)和高 (B)MOI两种条件下，在接种病毒24小时后从感染细胞的培养上清液中 未检测出显著量的IFN-β(数据未示出)。流感病毒A诱导β干扰素的能 力是呈高度毒株依赖的(Hayman等人2006，病毒学(Virology)，347：52)， 显然毒株A/WS/33是非诱导剂。EM-1421也不诱导IFN-β的产生。
虽然已经报告某些流感毒株诱导IL-6，但是如上文所描述的没有从芯 片分析检测出IL-6诱导，这表明毒株A/WS/33也不是该细胞因子的诱导 剂。在感染毒株A/WS/33后，在低(A)或高(B)MOI都没有由ELISA检测 法检测出高的IL-6值，这确认了芯片分析的结果。在低MOI条件下，在 使用EM-1421后，检测出低的IL-6值。然而，由于IL-6的值非常低(10 pg/ml)，预测该观察结果的意义是困难的。
除了TNF-α外，我们进行的芯片分析还揭示EM-1421也阻断流感病 毒诱导的MIP-1γ和G-CSF的产生。MIP1-γ也称为CCL9是一种趋化因 子，其活性与包括肺部炎症在内的许多细胞过程相关 (Rosenblum-Lichtenstein等人，2006，美国呼吸系统细胞和分子生物学杂志 (Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.)35：415)。G-CSF在调节中性粒细胞的产 生方面是关键的，缺少这种基因的鼠表现出进入肺中的中性粒细胞浸润 水平的降低(Gregory等人，2006，血液(Blood)，早于印刷刊物的电子版)。 EM-1421对这两种分子的抑制进一步增加了对EM-1421可以预防肺部与 流感相关的炎症的支持。在这些试验中使用的流感A/WS/33株不诱导已 经报告的附随流感感染的几种细胞因子和趋化因子，包括IFN-β、IL-6 和RANTES。流感病毒A毒株在其诱导细胞因子和趋化因子方面的能力 变化广泛。试验与其它流感毒株一起进行，例如A/PR/8/34，已经报告其除 了诱导TNF-α外还诱导许多导细胞因子和趋化因子(Wareing等人，2004， 白血球生物学杂志(J.Leukoc.Biol.)76：886)。
更具体而言，关于用于测定M4N对细胞因子的产生的方法，在所述 方法中使用了“鼠炎症芯片-1”，阵光生物技术股份公司，亚特兰大，乔 治亚州)。根据实施例1中描述的程序，购买RAW264.7巨噬细胞，培养， 使用LPS(1μg/ml)刺激，使用EM-1421(25μM)处理，采集细胞。在与培养 基(含有2mg/ml胰蛋白酶、2.5％HEPES缓冲液和0.2％BSA的基础 DME)、0.002 MOI的A/WS/33流感病毒A或流感病毒和EM-1421一 起孵育24小时后从RAW264.7巨噬细胞培养液(1.5 x 105细胞/孔)收集上 清液。根据制造商的说明书使用鼠炎症芯片-1测量上清液中的细胞因子。 简而言之，使用硝化纤维素Ab芯片孵育培养上清液约2h，清洗，与第二 种Ab溶液接触，使用ECL溶液培养，并与X光胶卷接触。扫描芯片放 射自显影。使用Photoshop(Adobe)分析并测定各芯片位置的平均像素灰 度。对8种检测产品的两个重复点的平均值进行作图。芯片上未检测的 其它32种产品未示出。在各个芯片上阳性对照点为约100-110单位，在 重复点之间SEM低于5％。淋巴(Lymph.)＝淋巴细胞趋化因子 (lymphotactin)。
更具体而言，关于使用的用于由RAW 264.7巨噬细胞检测产生IFN- β或IL-6的ELISA法，1.5 x 105个RAW 264.7巨噬细胞/孔平铺于含有 10％的FCS的DME培养基的24孔板中过夜。在低MOI检测条件下，移 去培养基，在病毒生长培养基中(含有2μg/ml的胰蛋白酶、2.5％HEPES 缓冲液和0.2％ BSA的基础DME)使用MOI为0.002的200μl的接种病 毒(毒株A/WS/33)替换，并允许病毒吸附30分钟。在使用的高MOI 检测条件下，1.5 x 105个RAW 264.7巨噬细胞/孔平铺于含有10％的FCS 的DME培养基的24孔板中过夜。移去培养基，在含有10％的FCS的 DME培养基中使用MOI为5的200μl的接种病毒(毒株A/WS/33)替 换，并允许病毒吸附30分钟。然后增加培养基的体积至1ml。当体积增 加至1ml时，EM-1421的最终浓度增加至25μM。不含有病毒和 EM-1421(“培养基”)的孔或仅含有EM-1421(“EM-1421”)的孔被作为 “模拟感染”孔，其与感染的孔受到相同的处理但没有病毒。在孵育约 24小时后，收集培养上清液，通过ELISA检测IFN-β或IL-6。示出的数 据为两个独立试验的平均值，每个试验进行两次重复的感染。未示出之 处，SEM低于标志大小。ELISA点检测两次。
该实施例的结果表明通式(I)的儿茶酚丁烷可以抑制响应于流感病毒 感染除TNF-α其它几种细胞因子的过多产生，说明所述化合物和相关的 儿茶酚丁烷以及NDGA衍生物可以用于治疗在流感感染时由高水平的所 述细胞因子介导的疾病或紊乱。
本发明的实施例说明通式(I)的儿茶酚丁烷可以抑制由流感病毒感染 的引起的促炎细胞因子，例如TNF-α的过量产生，以及促炎脂质介质， PGE2的过量产生，例如，且说明式(I)的儿茶酚丁烷也可以减少TNF-α介 导的细胞凋亡，从而减少宿主细胞中流感病毒的复制。这些结果说明儿 茶酚丁烷可用于治疗流感病毒感染和相关的疾病和失调。
可以理解本领域技术人员可以对上述实施方案进行改变而不偏离本 发明的宽泛的发明构思。因此，可以理解本发明不限于所公开的特定的 实施方案，而是意欲包括在所附权利要求限定的本发明的主旨和范围内 的修改。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2006年2月23日提交的60/775,869号美国临时申请 以及于2006年2月23日提交的60/776,043号美国临时申请的权益，其 所公开的内容在此全部通过引用并入本申请中。