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一种人类尿液中TMPRSS2-ERG基因检测方法和引物

阅读：480发布：2020-05-18

专利汇可以提供一种人类尿液中TMPRSS2-ERG基因检测方法和引物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及基因检测技术领域，是提供一种从受试者尿液中提取总RNA，并检测TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA的方法，以及提供特异性扩增TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA的引物，引物包含2组检测TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA的PCR扩增核酸引物，长度为17-24bp，且分别特异性地扩增出TMPRSS2-ERG mRNA 片段和PSA mRNA片段。通过扩增结果，测定TMPRSS2-ERG mRNA/PSA mRNA比值，计算TMPRSS2-ERG评分，以达到早期诊断前列腺癌，并对预后作出评估的目的。，下面是一种人类尿液中TMPRSS2-ERG基因检测方法和引物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一组特异性扩增TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA的引物，其特征在于：包含2组检测TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA的PCR扩增核酸引物，长度为17-24bp，且分别特异性地扩增出如SEQ ID NO:1所示的TMPRSS2-ERG mRNA部分序列中第9位到125位核苷酸，和如SEQ ID NO:2所示的PSA mRNA部分序列中第101位到第165位核苷酸；
用于扩增TMPRSS2-ERG mRNA的核苷酸扩增引物如下：
正向引物：如SEQ ID NO:3所示；
反向引物：如SEQ ID NO:4所示；
荧光探针：如SEQ ID NO:5所示；
用于扩增PSA mRNA的核苷酸扩增引物如下：
正向引物：如SEQ ID NO:6所示；
反向引物：如SEQ ID NO:7所示；
荧光探针：如SEQ ID NO:8所示；
其中所述TMPRSS2-ERG mRNA部分序列如SEQ ID NO:1所示，PSA mRNA部分序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种人类尿液中TMPRSS2-ERG基因检测方法，其特征在于：使用权利要求1所述的引物对人类尿液细胞总RNA进行荧光定量PCR反应，通过反应Ct值测定TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA表达水平。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：包括步骤：尿液采集、保存、总RNA提取、TMPRSS2-ERG荧光定量PCR反应和结果分析。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：包括步骤：
(1)在初段尿液收集前列腺细胞；
(2)离心收集尿沉渣，并加入Trizol 试剂保存；
(3)用氯仿，异丙醇方法提取前列腺细胞中总RNA，经乙醇洗涤，弃上清后干燥、溶解并测定浓度；
(4)经过37℃逆转录反应1小时，合成cDNA；
(5)用权利要求1所述的引物进行荧光定量PCR反应，通过反应Ct值测定TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA表达水平；根据公式TMPRSS2-ERG评分＝(TMPRSS2-ERG mRNA/PSA mRNA)×100,000计算测试样品中尿TMPRSS2-ERG分数。
5.一种用于前列腺癌诊断的试剂盒，其特征在于：包含：
(1)收集含有前列腺细胞的尿沉渣的试剂；
(2)尿液中总RNA提取试剂；
(3)检测TMPRSS2-ERG和PSA基因表达的试剂，其中含有权利要求1所述的引物；
(4)样品中尿TMPRSS2-ERG分数的计算公式：TMPRSS2-ERG评分＝(TMPRSS2-ERG mRNA/PSA mRNA)×100,000。

说明书全文

一种人类尿液中TMPRSS2-ERG基因检测方法和引物

技术领域

[0001] 本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及一种人类尿液中总RNA提取和TMPRSS2-ERG基因检测的方法和引物。

背景技术

[0002] 前列腺癌是一种最为常见的男性生殖系统恶性肿瘤，严重威胁男性健康，随着中国老龄化社会的到来，前列腺癌的发生率会进一步增加，因此进行前列腺癌预防、诊断和治疗的研究具有十分重要的意义。肿瘤发生常伴发染色体结构异常，其中染色体易位导致的融合基因最为常见。TMPRSS2-EST类型的基因融合在前列腺癌中最为常见，并表现出融合类[1]型的多样性，其中TMPRSS2-ERG发生最为频繁。

[0003] 跨膜丝氨酸蛋白酶2(Transmembrane protease serine 2，TMPRSS2)属于Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶家族，拥有单跨膜结构域，其N端在胞内而C端在胞外，胞外主要由低密度脂蛋白A类受体(Low density lipoprotein receptor class A，LDLa)结构域、清道夫受体富含半胱氨酸(Scavenger receptor cys-rich，SRCR)结构域和丝氨酸蛋白酶结构域构成。人的TMPRSS2基因定位于21号染色体(21q22.3)，由14个外显子构成，最终表达3.8kb[2]的转录本，该基因在前列腺中表达量最高，同时还可被雄激素受体调节，而且在前列腺癌[3]
中存在过表达现象。ETS家族是最大的转录因子家族之一，所有ETS成员都包含一个高度保守的DNA结合结构域(ETS结构域)，其中ETS转录因子家族成员相关基因(ERG)是与[4]
TMPRSS2基因形成染色体易位的最主要基因。TMPRSS2-ETS基因融合在前列腺癌中的频[5]
繁发生(超过50％)提示其与肿瘤发生有着密切的联系。

[0004] ERG在正常前列腺上皮细胞中表达较少甚至无法检测，然而在前列腺癌细胞中由于基因融合的原因而导致ERG过表达被认为是造成肿瘤发生的一个重要原因，ERG是[6,7]TMPRSS2-ERG基因融合后表达变化最为显著的一个基因。前列腺上皮细胞腺瘤中过量表达ERG可增加细胞的侵袭能力，临床上对正常组织、前列腺癌和PIN中的TMPRSS2-ERG基因融合检测表明，前列腺癌中基因融合频繁发生(39/80)，而PIN也存在低频基因融合[8]
(2/14)，正常组织则不存在这种现象。TMPRSS2-ERG基因融合造成的ERG过表达还可影[9]
响染色体的结构，如染色体拷贝数的变化，这被认为是造成肿瘤发生的又一个重要原因。
ERG基因还可促进组蛋白去乙酰化酶1(Histone deacetylase 1，HDAC1)表达的增加而改[10]
变细胞的表观遗传学状态。ERG过表达还可直接激活H3K27甲基转移酶EZH2而抑制雄[11]
激素受体基因表达，达到破坏雄激素受体信号转导的作用。TMPRSS2-EST基因融合表现出多样性，至今已发现T1-E4、T1-E2、T4-E4、T4-E5、T1-E3a4和T2-E5等是多种亚型，其中[1,4]
以T1-E4亚型最为主要，约占全部融合基因的70％。

[0005] TMPRSS2-ERG融合基因在前列腺癌患者中的特异性和多发性，使其可以作为一种前列腺癌诊断的特征分子生物标志物。传统前列腺癌诊断是通过检测血清中前列腺特异性抗原(Prostate-specific antigen，PSA)来实现，但该检测的特异性不太理想，因此需要寻找新的标志物来补充或代替。检测尿液沉渣中前列腺癌抗原3(Prostate cancer antigen3，PCA3)的mRNA表达情况具有重要的参考价值，若再联合TMPRSS2-ERG融合基因检测则可[12]
极大增强前列腺癌诊断的特异性。并且尿液检测基本无损伤，因此更适合临床应用。更为重要的是TMPRSS2-ERG融合基因与前列腺癌的多种临床症状密切相关，TMPRSS2-ERG基因融合是前列腺癌复发最为重要的关联因子，它的存在可使复发危险性增加8.6倍，这也使该融合基因检测具有更为重要的应用价值，该项诊断结果可作为前列腺癌预后评价的重[13]
要指标。

[0006] 目前临床已开始尝试通过转录介导的核酸扩增实验(a prototype transcription-mediated amplification assay,APTIMA)方法，测定直肠指诊后收集的尿液中TMPRSS2-ERG mRNA/PSA mRNA的比值来计算TMPRSS2-ERG SCORE，以早期检测前列腺癌。这种将TMPRSS2-ERG mRNA/PSA mRNA比值用于诊断前列腺癌的方法较血清PSA检测方法具有更高的敏感性和特异性(AUC：0.71vs 0.61)，可有效提高前列腺癌的诊断准确性[14]，并能对前列腺癌根治术后的前列腺癌复发作出评估。但目前该方法检测过程中使用的检测试剂和扩增引物具有很大的随意性，造成检测效率和可靠性参差不齐。

发明内容

[0007] 本发明解决的技术问题就是，提供一种从受试者尿液中提取总RNA，并检测TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA的方法。通过测定TMPRSS2-ERG mRNA/PSA mRNA比值，计算TMPRSS2-ERG评分，以达到早期诊断前列腺癌，尽量减少前列腺穿刺，并对预后作出评估的技术目的。

[0008] 本发明的第一个目的是提供一组特异性扩增TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA的引物，包含2组检测TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA的PCR扩增核酸引物，长度为17-24bp，且分别特异性地扩增出如SEQID:1所示的TMPRSS2-ERG mRNA序列(部分)中第9位到125位核苷酸；如SEQID:2所示的PSA mRNA序列(部分)中第101位到第165位核苷酸；

[0009] 用于扩增TMPRSS2-ERG mRNA的核苷酸扩增引物如下：

[0010] 正向引物：5’-GCGAGCTAAGCAGGAGG-3’，如SEQ ID NO:3所示；

[0011] 反向引物：5’-GCACACTCAAACAACGACTG-3’，如SEQ ID NO:4所示；

[0012] 荧光探针：5’-AGCGCGGCAGGAAGCCTTATCAGT-3’，如SEQ ID NO:5所示；

[0013] 用于扩增PSA mRNA的核苷酸扩增引物如下：

[0014] 正向引物：5’-CTGCACCCCTCATCCTGTCT-3’，如SEQ ID NO:6所示；

[0015] 反向引物：5’-CCAGGGTTGGGAATGCTTCT-3’，如SEQ ID NO:7所示；

[0016] 荧光探针：5’-ATTGTGGGAGGCTGGGAGTGC-3’，如SEQ ID NO:8所示；

[0017] 其中所述TMPRSS2-ERG mRNA序列(部分)如SEQ ID NO:1所示，PSA mRNA序列(部分)如SEQ ID NO:2所示。

[0018] 本发明的第二个目的是提供一种人类尿液中TMPRSS2-ERG基因检测方法，使用上述的引物对人类尿液细胞总RNA进行荧光定量PCR反应，通过反应Ct值测定TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA表达水平。可以包括步骤：尿液采集、保存、总RNA提取、TMPRSS2-ERG荧光定量PCR反应和结果分析。

[0019] 优选地，具体包括步骤：

[0020] (1)在初段尿液收集前列腺细胞；

[0021] (2)离心收集尿沉渣，并加入Trizol试剂保存；

[0022] (3)用氯仿，异丙醇方法提取前列腺细胞中总RNA，经乙醇洗涤，弃上清后干燥、溶解并测定浓度；

[0023] (4)经过37℃逆转录反应1小时，合成cDNA；

[0024] (5)用权利要求1所述的引物进行荧光定量PCR反应，通过反应Ct值测定TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA表达水平；根据公式TMPRSS2-ERG评分＝(TMPRSS2-ERG mRNA/PSA mRNA)×100,000计算测试样品中尿TMPRSS2-ERG分数。

[0025] 本发明的第三个目的是提供一种用于前列腺癌诊断的试剂盒，包含：

[0026] (1)收集含有前列腺细胞的尿沉渣的试剂；

[0027] (2)尿液中总RNA提取试剂；

[0028] (3)检测TMPRSS2-ERG和PSA基因表达的试剂，其中含有权利要求1所述的引物；

[0029] (4)样品中尿TMPRSS2-ERG分数的计算公式：TMPRSS2-ERG评分＝(TMPRSS2-ERG mRNA/PSA mRNA)×100,000。

[0030] 本发明的特异性引物扩增效果高，可靠性好；利用所述引物的检测方法有较高的重复稳定性，不需重复实验。利用本方法提供的TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA扩增核酸序列，构建测定尿液TMPRSS2-ERG评分的诊断试剂盒，可达到无创诊断前列腺癌的目的，将提高前列腺癌的诊断准确性，并能对前列腺癌根治术后的前列腺癌复发作出评估。

具体实施方式

[0031] 下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

[0032] 实施例1：

[0033] 一种人类尿液中TMPRSS2-ERG基因检测方法：

[0034] 1.尿液标本的采集和处理

[0035] 采用传统前列腺按摩方法，即检查者作直肠指诊，在直肠前壁触及前列腺，从左右两侧对称性向中央沟方向按摩三次，再从前列腺底部向尖部按摩中央沟三次，然后嘱患者排尿收集初始尿液50ml，立即放入冷水中冷却。于4℃2500r/min离心5分钟，收集尿沉渣，加适量预冷PBS洗涤液2次。将尿沉渣收集于1.5ml离心管中，加入Trizol试剂反复吹打混匀，放入－80℃冰箱备用。

[0036] 2.总RNA提取

[0037] 将上述已加Trizonl的尿沉渣标本在4℃解冻。

[0038] 加入氯仿200μl，颠倒20次，充分混匀，在室温放置3分钟后，于4℃12000r/min离心15分钟。

[0039] 转移上清至另一离心管中，加入异丙醇500μl混匀，沉淀5分钟后，与4℃12000r/min离心15分钟。

[0040] 弃去上清，加入600μl 75％的乙醇，混匀。于4℃12000r/min离心5分钟。

[0041] 弃去上清，加入800μl无水乙醇，混匀。于4℃12000r/min离心5分钟。

[0042] 弃去上清，自然干燥，加入DEPC水完全溶解RNA沉淀。取4μl稀释50倍，紫外分光光度计测定A260、A280吸光值，RNA样品A260/A280应在1.8-2.0之间。

[0043] 计算RNA含量，稀释RNA到0.5μg/μl，取2μg总RNA逆转录，其余样品－80℃保存。

[0044] 3.逆转录(mRNA至cDNA)

[0045] (1)管1：

[0046]

[0047] (2)管2：

[0048]5×Bμffer 8μl
MMLV 1.5μl
RNAsin 0.5μl
dNTP 0.5μl
DEPC水 14.5μl

[0049] (3)将管2加入管1中，共40μl体系，37℃1小时

[0050] 反应体系：

[0051]5×Buffer 5.0μl
250Mm Mg 0.3μl
10MmdNTP 0.75μl
250U/50μlTaqMen 0.25μl
引物1 0.5μl
引物2 0.5μl
探针 0.3μl
dH2O 10.4μl
cDNA 4.0μl

[0052] 其中，反应引物和探针序列如SEQID NO:3-8所示：

[0053] TMPRSS2-ERG-F 5’-GCGAGCTAAGCAGGAGG-3’(SEQ ID NO:3)

[0054] TMPRSS2-ERG-R 5’-GCACACTCAAACAACGACTG-3’(SEQ ID NO:4)[0055] TMPRSS2-ERG-TaqMan 5’-AGCGCGGCAGGAAGCCTTATCAGT-3’(SEQ ID NO:5)[0056] PSA-F 5’-CTGCACCCCTCATCCTGTCT-3’(SEQ ID NO:6)

[0057] PSA-R 5’-CCAGGGTTGGGAATGCTTCT-3’(SEQ ID NO:7)

[0058] PSA-TaqMan 5’-ATTGTGGGAGGCTGGGAGTGC-3’(SEQ ID NO:8)

[0059] 按检测人份数配置各个样品TMPRSS2-ERG和PSA的检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：

[0060] X＝18μl反应液X(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)[0061] n为检测标本数。

[0062] 将4μl步骤(3)中获得的cDNA加入到检测体系PCR反应液中；对阳性对照实验而言，直接加4μl阳性对照品；对阴性对照实验而言，直接加4μl阴性对照品；对空白对照实验而言，加4μl生理盐水。

[0063] TMPRSS2-ERG和PSA扩增反应条件：每个基因扩增3个反应；95℃预变性10分钟；95℃20秒，60℃60秒，检测荧光信号，共45个循环；4℃保存。

[0064] 判断结果：

[0065] 反应结束后计算机显示样品扩增曲线，根据每个基因3个反应的Ct值计算每个样品的TMPRSS2-ERG和PSA扩增平均Ct值，根据PCR仪标准曲线计算出待测标本TMPRSS2-ERG mRNA和PSA mRNA初始浓度。尿TMPRSS2-ERG评分＝(TMPRSS2-ERG mRNA/PSA mRNA)×100,000。

[0066] 本方法诊断前列腺癌的阈值为40，当TMPRSS2-ERG评分高于或等于40时，结果判断为阳性，患者为前列腺癌患者；当TMPRSS2-ERG评分低于40时，结果判断为阴性，不支持患者为前列腺癌患者。

[0067] 实施例2：

[0068] 用于前列腺癌诊断的试剂盒，包含：

[0069] (1)收集含有前列腺细胞的尿沉渣试剂盒，包括：直肠指诊尿液收集管、PBS洗涤液、1.5ml离心管、Trizol试剂；

[0070] (2)尿液中总RNA提取试剂盒，包括：氯仿、异丙醇、75％的乙醇、无水乙醇、DEPC水；

[0071] (3)检测TMPRSS2-ERG和PSA基因表达的试剂盒，包括逆转录反应液、荧光PCR反应液。其中逆转录反应液包括5×Buffer、逆转录酶、dNTP和DEPC水；荧光PCR反应液包括5×Buffer、dNTP、TaqMen酶、如SEQ ID NO:3-8所示的引物和DEPC水；

[0072] (4)样品中尿TMPRSS2-ERG分数的计算公式：TMPRSS2-ERG评分＝(TMPRSS2-ERG mRNA/PSA mRNA)×100,000。

[0073] 实施例3：

[0074] 利用实施例2的试剂盒检测临床样本：

[0075] 取送检泌尿外科男性患者前列腺按摩后初始尿液，其中52例前列腺癌，年龄49-78岁，平均为65.6岁；27例无前列腺疾患的泌尿系结石的患者作正常对照，年龄37-46岁，平均41.3岁。

[0076] 按实施例1所述方法提取尿液总RNA，并用荧光PCR方法检测尿TMPRSS2-ERG评分。每份样品重复3次，并同时做阳性，阴性，空白对照。根据评分结果进行判断。

[0077] 对照组TMPRSS2-ERG评分为4.0±1.9，前列腺癌组为40.2±11.5。TMPRSS2-ERG评分在2组之间有显著性差异，P＜0.001。

[0078] 本试剂盒以TMPRSS2-ERG评分40.0作为诊断前列腺癌的临界值，52例前列腺癌患者有43例阳性，9例阴性；27例非前列腺癌患者未检出阳性结果。本试剂盒敏感性和特异性分别为82.7％和75.0％，本结果证明本试剂盒所检测TMPRSS2-ERG评分可作为前列腺癌的早期筛查指标。

[0079] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[0080] 【参考文献】

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一种人类尿液中TMPRSS2-ERG基因检测方法和引物

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