[0002] 本文根据35U.S.C.§119(e)要求2017年4月28日提交的美国临时
专利申请号62/492,056的权益，且其披露内容通过引用特此并入本文。
[0004] 通过引用以其整体并入的是计算机可读核苷酸/
氨基酸
序列表，该序列表与本文同时提交且鉴定如下：名称为“51689A_Seqlisting.txt”的49千字节ASCII(本文)文件；于2018年4月20日创建。
背景技术
技术领域
[0005] 本
发明涉及人类抗RANKL单克隆抗体，包括迪诺苏单抗(denosumab)的高浓度
水性配制品及其
生物类似物(biosimilar)。
[0006] 相关技术
[0007] 可以商购呈60mg/mL及70mg/mL强度的溶液形式的迪诺苏单抗。
[0008]
蛋白质配制品浓度增加可引起
稳定性问题，例如会导致形成高分子量物质(HMWS)的聚集。在一些蛋白质配制品中，可能特别关注HMWS，尤其是保留
单体对应物的大部分天然构型的那些HMWS。聚集也可能影响
治疗蛋白质的皮下生物利用度及药代动
力学。
[0009] 填充及精加工操作以及给予可涉及使蛋白质溶液流过
活塞泵、
蠕动泵或注射针的步骤。这种过程可能赋予剪切
应力及机械应力，由此可能致使蛋白质变性且造成聚集。在蛋白质溶液较浓时，此现象可能加重。
发明内容
[0010] 根据本发明提供的是如下披露内容，其首次证明向包含高浓度抗RANKL抗体的水溶液中添加氨基酸聚集
抑制剂可导致一定时间内形成的抗体聚集物的量减少以及这种聚集物的形成速率减缓。本披露内容也提供pH值对抗RANKL抗体的浓水溶液中的聚集物形成的影响，其中当该水溶液的pH值处于约5.0至低于5.2的范围内时，观测到聚集物形成减少。本文中所提供的披露内容进一步暗示通过氨基酸聚集抑制剂与抗RANKL抗体之间的相互作用来稳定该抗体。不受任何特定理论束缚，设想氨基酸聚集抑制剂与抗RANKL抗体之间的疏水性相互作用以及其他类型分子间相互作用对浓抗体溶液具有稳定作用。因此，本发明的披露内容涉及包含高浓度的抗RANKL抗体的稳定水性药物配制品，这些配制品包含低量(例如，少于约2％)的聚集物。
[0011] 因此，本披露内容的一个方面为一种水性药物配制品，其包含浓度高于70mg/mL的人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其
抗原结合部分且具有处于约5.0至低于5.2的范围内的pH值。
[0012] 本披露内容的另一方面为一种水性药物配制品，其包含人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其抗原结合部分与氨基酸聚集抑制剂的混合物。在示例性方面中，该氨基酸聚集抑制剂包含含有带电
侧链的氨基酸、芳族氨基酸或疏水性氨基酸。在示例性情况下，该包含带电侧链的氨基酸为包含带正电侧链的氨基酸，例如，诸如精氨酸和赖氨酸。在示例性方面中，该芳族氨基酸包含苯基或吲哚。任选地，该芳族氨基酸进一步包含处于α
碳与苯基或吲哚之间的C1-C6烷基链。氨基酸，包括例如苯丙氨酸及
色氨酸，为示例性氨基酸聚集抑制剂。在示例性情况下，该氨基酸聚集抑制剂为在凯特-杜立特疏水性标度(Kyte and Doolittle hydrophobicity scale)上具有超过约2.5的评分的疏水性氨基酸。任选地，该疏水性氨基酸为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。设想如本文中所描述的其他氨基酸聚集抑制剂。
[0013] 在示例性情况下，该水性药物配制品进一步包含
张力改良剂、
表面活性剂、缓冲剂或其任何组合。
[0014] 本披露内容的另一方面为供储存或使用的配制品的呈现形式，例如，于单次使用小瓶，单次使用
注射器，或者玻璃、玻璃
内衬或玻璃涂覆容器中。本披露内容的示例性方面为包含本文中所描述的任何水性药物配制品的容器，任选地为小瓶、预填充注射器(PFS)或玻璃容器。在示例性情况下，该容器包含约1mL或更少(例如约0.5mL)的该水性药物配制品。
[0015] 本披露内容的另一方面提供制造包含人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其抗原结合部分的稳定水性药物配制品的方法，其包括将该抗RANKL单克隆抗体或其抗原结合部分以高于70mg/mL的浓度与氨基酸聚集抑制剂、缓冲剂、表面活性剂及任选地张力改良剂组合。本披露内容的方面包括根据本文中所描述的制造稳定水性药物配制品的方法中的任一种制造的稳定水性药物配制品。
[0016] 本披露内容的另一方面提供使用如本文中所描述的配制品来
预防或治疗对人类抗RANKL单克隆抗体或其抗原结合部分有应答的
疾病的方法。在示例性方面中，该使用涵盖对受试者进行治疗性治疗，该治疗性治疗涵盖在受试者中治疗或预防骨骼相关事件(SRE)、治疗或预防骨巨细胞瘤、治疗或预防恶性高
钙血症、治疗或预防骨质疏松症或者增加骨
质量。举例而言，该治疗性治疗涵盖(a)治疗或预防存在实体
肿瘤骨转移的受试者的SRE；(b)治疗或预防患有不可
切除或手术切除有可能引起严重发病的骨巨细胞瘤的成年或骨骼成熟青少年受试者的SRE；(c)治疗受试者的双膦酸盐疗法难治性恶性高钙血症；(d)治疗或预防患有多发性骨髓瘤或实体肿瘤骨转移的受试者的SRE；(e)治疗处于高骨折
风险下的绝经后女性的骨质疏松症；(f)使因
乳腺癌而接受辅助芳香酶抑制剂疗法的处于高骨折风险下的女性的骨质量增加的治疗；(g)使因非转移性
前列腺癌而接受雄性素剥夺疗法的处于高骨折风险下的男性的骨质量增加的治疗；(h)使处于高骨折风险下的患有骨质疏松症的男性的骨质量增加的治疗；(i)利用钙或维生素D的疗法。
[0017] 本披露内容的其他方面包括预防有需要的患者的骨骼相关事件(SRE)的方法、治疗有需要的患者的骨巨细胞瘤的方法、治疗有需要的患者的恶性高钙血症的方法、治疗有需要的患者的骨质疏松症的方法及增加有需要的患者的骨质量的方法。这些方法包括向该患者给予有效量的本文中所描述的配制品中的任一种。在示例性情况下，该配制品经皮下递送至该患者。
[0018] 本披露内容的另一方面提供迪诺苏单抗或另一人类抗RANKL单克隆抗体或其抗原结合部分用于制造如本文中所描述的用以治疗需要人类抗RANKL单克隆抗体的患者的药物的用途。
[0019] 本披露内容的另一方面为一种
试剂盒，其包括本文中所描述的组合物或制品，以及
包装插页、包装标签、
说明书或者指导或披露本文中所披露的任何方法或
实施例的其他标记。
[0020] 本披露内容的另一方面为改良包括浓度高于70mg/mL的人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其抗原结合部分的水性药物配制品的稳定性的方法，该方法包括制备pH值处于约5.0至低于5.2的范围内的包括该人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其抗原结合部分的水性药物配制品的步骤，其中与不在约5.0至低于5.2范围内的pH值下的等效水性药物配制品相比，该水性药物配制品在约5.0至低于5.2范围内的pH值下显示改良的稳定性。
[0021] 本披露内容的另一方面为改良包括人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其抗原结合部分的水性药物配制品的稳定性的方法，该方法包括制备包含该人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其抗原结合部分与氨基酸聚集抑制剂的混合物的水性药物配制品的步骤，其中与不含该氨基酸聚集抑制剂的等效水性药物配制品相比，该水性药物配制品在存在该氨基酸聚集抑制剂的情况下显示改良的稳定性。
[0022] 本披露内容的另一方面为降低迪诺苏单抗或另一人类抗RANKL单克隆抗体的溶液中的HMWS聚集物水平的方法。
[0023] 根据以下详细描述的综述，结合
附图，其他方面及优势对本领域普通技术人员将显而易见。尽管这些组合物、制品及方法易于应用于各种形式的实施例，但在理解本披露内容为说明性的而非意欲本发明受限于本文中所描述的特定实施例的情况下，以下描述包括特定实施例。关于本文中所描述的组合物、制品及方法，设想任选的特征，包括但不限于组分、其组成范围、取代基、条件及步骤，选自本文中所提供得各个方面、实施例及实例。
附图说明
[0024] 图1、图2及图8显示各种高浓度迪诺苏单抗配制品在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随配制品及时间而变化。图1的图例与具有表1中所示的缩写的配制品一致。图8的图例与表5中所示的字母一致。
[0025] 图3显示各种高浓度迪诺苏单抗配制品在37℃下储存1个月后的粒径排阻色谱图。图3的图例与具有表2中所示的缩写的配制品一致。
[0026] 图4为具有表3A中所示的对应F#的各配制品的通过SE-UHPLC监测的％HMWS随时间而变化的图。
[0027] 图5为表3A中所列出的配制品的一对粒径排阻色谱图。图5的图例与表3B中所提及的配制品名称一致。
[0028] 图6为具有表4A中所示的对应F#的各配制品在37℃下通过SE-UHPLC监测的％HMWS随储存时间而变化的图。
[0029] 图7A显示具有表4A中所列出的迪诺苏单抗浓度的配制品在pH 4.8下的粒径排阻色谱图。
[0030] 图7B显示具有表4A中所列出的迪诺苏单抗浓度的配制品在pH 5.1下的粒径排阻色谱图。
[0031] 图9为具有表6B中所示的对应F#的各配制品在37℃下通过SE-UHPLC监测的％HMWS随储存时间而变化的图。
[0032] 图10显示具有表6B中所指示的名称的配制品在37℃下储存1个月后粒径排阻色谱图随配制品而变化。
[0033] 图11A为具有表7B中所指示的字母的配制品在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随时间而变化的图。
[0034] 图11B为具有表7C中所指示的字母的配制品在40℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随时间而变化的图。
[0035] 图12A显示表7B的配制品的粒径排阻色谱图。
[0036] 图12B显示表7C的配制品的粒径排阻色谱图。
[0037] 图13、图14及图15为具有表8A中所示的对应配制品字母的各配制品在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随储存时间而变化的图。图16、图17及图18为表8A中所列出的配制品在37℃下储存1个月后的色谱重叠图。图13及图16涉及包含芳族氨基酸的配制品，图14及图17涉及包含极性/带电氨基酸的配制品，且图15及图18涉及包含疏水性氨基酸的配制品。
[0038] 图19至图24为配制品35至38中的每一者的轻链氨基酸28-33(图19)、轻链氨基酸108-116(图20)、轻链氨基酸125-132(图21)、重链氨基酸47-59(图22)、重链氨基酸243-253(图23)及重链氨基酸392-399(图24)在4℃下的氘并入％随时间(log(sec))而变化的图。
[0039] 图25至图30为配制品35至38中的每一者的轻链氨基酸28-33(图25)、轻链氨基酸108-117(图26)、轻链氨基酸124-131(图27)、重链氨基酸47-59(图28)、重链氨基酸242-253(图29)及重链氨基酸392-399(图30)在37℃下的氘并入％随时间(log(sec))而变化的图。
[0040] 图31为具有表10中所指示的配制品名称的配制品在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随配制品及时间而变化的图。
[0041] 图32为具有表11中所指示的配制品名称的配制品在37℃下如通过SE-UHPLC监测的LMWS百分比随配制品及时间而变化的图。
[0042] 图33为具有表12中所指示的配制品名称的配制品在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随配制品及时间而变化的图。
[0043] 图34为具有表13中所指示的配制品名称的配制品在37℃下如通过SE-UHPLC监测的LMWS百分比随配制品及时间而变化的图。
[0044] 图35为具有表14中所指示的配制品名称的配制品在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随配制品及时间而变化的图。
[0045] 图36为具有表15中所指示的配制品名称的配制品在37℃下如通过SE-UHPLC监测的LMWS百分比随配制品及时间而变化的图。
[0046] 图37为具有表10中所指示的配制品名称的各配制品的粒径排阻色谱重叠图。
[0047] 图38为具有表12中所指示的配制品名称的各配制品的粒径排阻色谱重叠图。
[0048] 图39为具有表14中所指示的配制品名称的各配制品的粒径排阻色谱重叠图。
[0049] 图40A及图40B为含有迪诺苏单抗在不存在精氨酸时在pH 4.5、pH 4.8和pH 5.0下的等温化学变性曲线的图。图40A为变性迪诺苏单抗分数随变性剂浓度而变化的图。图40B为绘制dF/d[变性剂]随变性剂浓度而变化的图。
[0050] 图41A及图41B为含有迪诺苏单抗在存在75mM精氨酸
盐酸盐时在pH 4.5、pH 4.8和pH 5.2下的等温化学变性曲线的图。图41A为变性迪诺苏单抗分数随变性剂浓度而变化的图。图41B为绘制dF/d[变性剂]随变性剂浓度而变化的图。
[0051] 图42及图43分别为具有表17中的配制品名称的配制品在25℃下历经3个月及在37℃下历经2个月时通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随时间而变化的图。
具体实施方式
[0052] 希望提供迪诺苏单抗及其他人类抗RANKL抗体及其抗原结合部分的与稀溶液同样稳定或比稀溶液更稳定的较浓水溶液。较浓溶液可给患者提供便利性，例如通过允许给予较小体积，诸如1mL注射液来递送120mg活性剂(诸如迪诺苏单抗)，而非较稀活性配制品的1.7mL或2mL注射液。此外，将允许甚至更小体积的注射溶液来递送较低剂量的活性剂，例如
0.5mL的120mg/mL浓度迪诺苏单抗来递送60mg剂量。也希望提供迪诺苏单抗及其他人类抗RANKL抗体及其抗原结合部分的比先前已知溶液更稳定的水溶液。该稳定浓配制品也将具有其他益处，诸如允许处理及运输更小体积的产品，以及允许更久的产品货架寿命。
[0053] 生物产品中的聚集物可在来源、大小及类型方面不同。特别关注的是可能影响生物产品的效力或安全性的聚集物，例如可增强免疫应答及造成不利临床影响的聚集物。可能特别关注的是高分子量聚集物，又名高分子量物质(HMWS)，尤其是保留单体对应物的大部分天然构型的那些高分子量聚集物。聚集也可能影响治疗蛋白质的皮下生物利用度及药代动力学。
[0054] 聚集物形成可能有各种原因。一般而言，蛋白质聚集导致构型不稳定性(此为蛋白质结构变化的结果)及胶体不稳定性(受分子间力控制)。在需要临界成核事件来诱导沉淀的情况下，蛋白质聚集动力学的特征在于包括时滞阶段。
[0055] 由于构型不稳定性所致的聚集包括解折叠及缔合步骤。蛋白质分子解折叠暴露疏水性氨基酸残基。解折叠分子的疏水性残基随后可经历缔合，由此导致聚集(例如，呈二聚物、三聚物、其他多聚物及高级聚集物形式)。这种缔合具有浓度依赖性。水性
溶剂中的蛋白质浓度增加一般会增加聚集，包括热诱导的聚集的速率及程度。因而，溶液中影响蛋白质解折叠的自由能的添加剂可能影响构型稳定性。
[0056] 胶体不稳定性经由蛋白质-蛋白质分子内缔合力而产生聚集物。这种力可受一或多种因素影响，包括离子强度、溶液pH值及缓冲剂类型。
[0057] 可以商购呈60mg/mL及70mg/mL强度的溶液形式的迪诺苏单抗。试图使用相同赋形剂来配制较高浓度迪诺苏单抗溶液显示该较高浓度经由HMWS的伴随及成比例增加而影响产品的稳定性。例如，120mg/mL迪诺苏单抗的浓度具有比70mg/mL迪诺苏单抗高出70％的浓度，并且是60mg/mL浓度的双倍。
[0058] 因此，根据本披露内容的稳定水性配制品将在比先前已知的配制品更大的程度上抵抗聚集物形成。本披露内容的一个方面为以5.0至小于5.2的pH值为特征的稳定水性配制品。本披露内容的另一非排他性方面为包括氨基酸聚集抑制剂的稳定水性配制品。也提供了相关剂量呈现形式(例如呈单次使用小瓶、注射器及玻璃容器形式)及相关治疗方法。另外提供制造稳定水性药物配制品的方法。
[0059] 如以下所描述，pH值及氨基酸聚集抑制剂(例如，精氨酸、精氨酸-精氨酸二肽、精氨酸-苯丙氨酸二肽)为已证明可降低迪诺苏单抗在120mg/mL下的HMWS水平及HMWS形成速率的两种途径。HMWS可描述为不可逆(例如共价)或可逆(例如非共价自缔合相互作用)的分子间蛋白质相互作用。对于可能导致黏度及HMWS增加的蛋白质自缔合反应，存在四种广泛接受的原因：疏水性相互作用、带电相互作用、极性相互作用及偶极子相互作用。配制品pH值与精氨酸(在中性至酸性pH值下高度带电的
碱性氨基酸)可干扰带电蛋白质分子间力。不意欲受任何特定理论束缚，可设想迪诺苏单抗在120mg/mL下的HMWS形成是基于蛋白质电荷，并且这些配制品变化正在破坏HMWS形成机制所涉及的电荷力。此外不意欲受任何特定理论束缚，可设想HMWS形成中也可能存在疏水性蛋白质自缔合相互作用，因为精氨酸在侧链中含有短脂族链。此脂族链可能破坏蛋白质之间的疏水性相互作用。配制品中包括苯丙氨酸以额外降低HMWS水平进一步支持此构想。不受任何特定理论束缚，精氨酸以不同于苯丙氨酸的方式使抗RANKL抗体稳定，使得若精氨酸经由疏水性相互作用与抗体相互作用，则精氨酸可以一或多种其他方式与该抗体相互作用。
[0060] 当与精氨酸相比时，可能对降低HMWS水平及形成速率具有可能
正面影响的其他赋形剂可在中性至酸性pH值下具有类似的带正电基团，和/或在性质上与苯丙氨酸类似，可为疏水性的。这些赋形剂的实例可包括赖氨酸、N-乙酰基精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、酪氨酸、色氨酸以及亮氨酸。
[0061] 除非另有说明，否则设想这些配制品、剂量呈现形式以及方法包括含有以下进一步描述的其他任选的要素、特征及步骤(包括附图中所示的那些)中的一或多种的任何组合的实施例。
[0062] 在禁止对人体实施的方法赋予专利的管辖权方面，向人类受试者“给予”组合物的含义应局限于规定人类受试者将通过任何技术(例如经口、吸入、局部给予、注射、插入等)自我给予的受控物质。意欲最广泛的合理解释，其与限定可获得专利的主题的法律或法规一致。在不禁止对人体实施的方法赋予专利的管辖权方面，“给予”组合物包括对人体实施的方法和上述活动二者。
[0063] 如本文中所使用，术语“包含”指示除规定物以外也可能包括其他试剂、要素、步骤或特征。
[0064] 应理解，贯穿本说明书提供的每个最大数值限制包括与每个对应较低数值限制形成的范围作为替代方面，如同明确书写这种范围。贯穿本说明书提供的每个最小数值限制将包括与每个较高数值限制形成的范围作为替代方面，如同明确书写这种范围。贯穿本说明书提供的每个数值范围将包括属于这种较宽数值范围内的每个较窄数值范围，如同本文中明确书写所有这种较窄数值范围。本文中所披露的尺寸和值应理解为包括披露所叙述的值以及对应准确数值，例如，描述为“约10mM”的值应理解为包括“10mM”作为替代披露内容。
[0065] 如本文中所使用的术语“
治疗有效量”是指足以治疗、改善或预防所鉴定的疾病或病状，或者展现可检测的治疗、预防或抑制效果的化合物的量。该效果可通过例如临床病状的改良或症状的减少加以检测。受试者的精确有效量将视该受试者的体重、体型以及健康状况、病状的性质及程度以及选择给予的治疗剂或治疗剂组合而定。在药物已经美国食品与药物管理局(FDA)批准的情况下，“治疗有效量”是指经FDA或其境外代理机构批准用于治疗所鉴定的疾病或病状的剂量。
[0066] 本披露内容提供经稳定的(或稳定的)水性药物配制品，如储存后聚集物的量减少和/或聚集物形成速率降低所显示。如本文中所描述，这种配制品的稳定性由在各种时段内以及在各种
温度下储存后HMWS的量减少和/或HMWS形成速率降低来证明。一般而言，较高稳定性配制品与较高储存温度下相对于较低温度下存在较低量的HMWS、较低HMWS形成速率和/或较高抗体主峰相关。如本文中所使用，术语“高分子量物质”或“HMWS”是指配制品的抗体的高级聚集物以及配制品的抗体的低级聚集物。低级聚集物包括例如二聚物物质。可通过诸多技术来测量或监测聚集物量和形成速率，诸如SE-UHPLC。在一些情况下，抗体的SE-UHPLC色谱图显示处于约5.8分钟处表示水性药物配制品的HMWS的量的峰、处于约6.7分钟处表示二聚物物质的峰以及处于约8.0分钟处表示抗体的完整未聚集形式的量的峰。相对于4℃储存，37℃储存允许稳定性分析
加速，从而可在相对于4℃储存时段较短的时段内测定特定配制品的稳定性。例如，在37℃下储存1个月、2个月或3个月可指示或预示在4℃下储存36个月。
[0067] 在一种类型之实施例中，与由作为赋形剂的10mM乙酸盐、5％(w/v)山梨醇、0.01％(w/v)聚山梨醇酯20组成且具有溶液pH值5.2的等浓度对照配制品相比，如本文中所描述的经稳定的配制品在37℃下储存3个月后将显示降低的HMWS形成程度和速率。
[0068] 在另一类型的实施例中，与不含氨基酸聚集抑制剂的等效对照配制品相比，如本文中所描述且包括氨基酸聚集抑制剂的经稳定的配制品在37℃下储存1个月后将显示降低的HWMS形成程度。例如，与对照配制品相比，在37℃下储存1个月后，形成程度可降低至使得通过SE-UPHLC测量的HMWS的量％降低至少约0.1％、或约0.2％、或约0.3％、或约0.4％、或约0.5％、或约0.6％、或约0.7％，例如在约0.1％至约2％或约0.1％至约1％的范围内。
[0069] 在另一类型的实施例中，如本文中所描述的经稳定的配制品在37℃下储存1个月后将具有较低量的HMWS(通过SE-UHPLC测量)。例如，HMWS的量可不超过2％或低于2％、或者不超过1.9％或低于1.9％、或者不超过1.8％或低于1.8％、或者不超过1.7％或低于1.7％、或者不超过1.6％或低于1.6％、或者不超过1.5％或低于1.5％、或者不超过1.4％或低于1.4％、或者不超过1.3％或低于1.3％、或者不超过1.2％或低于1.2％，例如在约0.01％至约2％、或约0.01％至约1.9％、或约0.01％至约1.8％、或约0.01％至约1.7％、或约0.01％至约1.6％、或约0.01％至约1.5％、或约0.01％至约1.4％、或约0.01％至约1.3％、或约
0.01％至约1.2％的范围内。在另一类型的实施例中，在37℃下储存1个月后通过SE-UHPLC监测的HMWS的量可超过2％，例如超过2％且多达3％，而由氨基酸聚集抑制剂提供的降低的聚集速率将允许适合的产品货架寿命，例如多达三年或多达两年。
[0070] 在另一类型的实施例中，如本文中所描述的经稳定的配制品在37℃下储存3个月后将具有较低量的HMWS(通过SE-UHPLC测量)。例如，HMWS的量可不超过2％或低于2％、或者不超过1.9％或低于1.9％、或者不超过1.8％或低于1.8％、或者不超过1.7％或低于1.7％、或者不超过1.6％或低于1.6％、或者不超过1.5％或低于1.5％、或者不超过1.4％或低于1.4％、或者不超过1.3％或低于1.3％、或者不超过1.2％或低于1.2％，例如在约0.01％至约2％、或约0.01％至约1.9％、或约0.01％至约1.8％、或约0.01％至约1.7％、或约0.01％至约1.6％、或约0.01％至约1.5％、或约0.01％至约1.4％、或约0.01％至约1.3％、或约
0.01％至约1.2％的范围内。
[0071] 在另一类型的实施例中，如本文中所描述的经稳定的配制品在4℃下储存36个月后将具有较低量的HMWS(通过SE-UHPLC测量)。例如，HMWS的量可不超过2％或低于2％、或者不超过1.9％或低于1.9％、或者不超过1.8％或低于1.8％、或者不超过1.7％或低于1.7％、或者不超过1.6％或低于1.6％、或者不超过1.5％或低于1.5％、或者不超过1.4％或低于1.4％、或者不超过1.3％或低于1.3％、或者不超过1.2％或低于1.2％，例如在约0.01％至约2％、或约0.01％至约1.9％、或约0.01％至约1.8％、或约0.01％至约1.7％、或约0.01％至约1.6％、或约0.01％至约1.5％、或约0.01％至约1.4％、或约0.01％至约1.3％、或约
0.01％至约1.2％的范围内。
[0072] 在另一类型之实施例中，如本文中所描述的经稳定的配制品在37℃下储存1个月后将具有较高量的迪诺苏单抗或其他抗体(或其抗原结合部分)主峰(通过SE-UHPLC测量)。例如，主峰的量可为至少95％或超过95％、或者至少96％或超过96％、或者至少97％或超过
97％、或者至少97.5％或超过97.5％、或者至少98％或超过98％、或者至少98.1％或超过
98.1％、或者至少98.2％或超过98.2％、或者至少98.3％或超过98.3％、或者至少98.4％或超过98.4％、或者至少98.5％或超过98.5％、或者至少98.6％或超过98.6％，例如在约95％至约99.9％、或约96％至约99.9％、或约97％至约99.9％、或约97.5％至约99.9％、或约
98％至约99.9％、或约98.1％至约99.9％、或约98.2％至约99.9％、或约98.3％至约
99.9％、或约98.4％至约99.9％、或约98.5％至约99.9％、或约98.6％至约99.9％的范围内。
[0073] 在另一类型之实施例中，如本文中所描述的经稳定的配制品在37℃下储存3个月后将具有较高量的迪诺苏单抗或其他抗体(或其抗原结合部分)主峰(通过SE-UHPLC测量)。例如，主峰的量可为至少95％或超过95％、或者至少96％或超过96％、或者至少97％或超过
97％、或者至少97.5％或超过97.5％、或者至少98％或超过98％、或者至少98.1％或超过
98.1％、或者至少98.2％或超过98.2％、或者至少98.3％或超过98.3％、或者至少98.4％或超过98.4％、或者至少98.5％或超过98.5％、或者至少98.6％或超过98.6％，例如在约95％至约99.9％、或约96％至约99.9％、或约97％至约99.9％、或约97.5％至约99.9％、或约
98％至约99.9％、或约98.1％至约99.9％、或约98.2％至约99.9％、或约98.3％至约
99.9％、或约98.4％至约99.9％、或约98.5％至约99.9％、或约98.6％至约99.9％的范围内。
[0074] 在另一类型之实施例中，如本文中所描述的经稳定的配制品在4℃下储存36个月后将具有较高量的迪诺苏单抗或其他抗体(或其抗原结合部分)主峰(通过SE-UHPLC测量)。例如，主峰的量可为至少95％或超过95％、或者至少96％或超过96％、或者至少97％或超过
97％、或者至少97.5％或超过97.5％、或者至少98％或超过98％、或者至少98.1％或超过
98.1％、或者至少98.2％或超过98.2％、或者至少98.3％或超过98.3％、或者至少98.4％或超过98.4％、或者至少98.5％或超过98.5％、或者至少98.6％或超过98.6％，例如在约95％至约99.9％、或约96％至约99.9％、或约97％至约99.9％、或约97.5％至约99.9％、或约
98％至约99.9％、或约98.1％至约99.9％、或约98.2％至约99.9％、或约98.3％至约
99.9％、或约98.4％至约99.9％、或约98.5％至约99.9％、或约98.6％至约99.9％的范围内。
[0075] 在其他实施例中，设想经稳定的配制品在根据以上所描述的规定进行储存后将具有较低量的HMWS及较高量的主峰。
[0076] 在示例性方面中，水性药物配制品在储存后包含不超过约4％高分子量物质(HMWS)和/或包含超过约96％的抗体主峰，如通过SE-UHPLC所测量。在示例性方面中，水性药物配制品在储存后包含不超过约3％高分子量物质(HMWS)和/或包含超过约97％的抗体主峰，如通过SE-UHPLC所测量。在示例性方面中，水性药物配制品在储存后包含少于约2％HMWS和/或超过约98％的抗体主峰，如通过SE-UHPLC所测量。在示例性方面中，储存在约2℃至约8℃(例如，约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃)的温度下持续至少12个月、24个月或36个月(例如，至少或约12个月、至少或约16个月、至少或约20个月、至少或约24个月、至少或约28个月、至少或约32个月、至少或约36个月，任选地更久)。在示例性方面中，储存在约20℃至约30℃(例如，约21℃至约30℃、约22℃至约30℃、约23℃至约30℃、约
24℃至约30℃、约25℃至约30℃、约26℃至约30℃、约27℃至约30℃、约28℃至约30℃、约28℃至约30℃、约20℃至约29℃、约20℃至约28℃、约20℃至约27℃、约20℃至约26℃、约20℃至约25℃、约20℃至约24℃、约20℃至约23℃、约20℃至约22℃)下持续约1个月(例如，约26天、约27天、约28天、约29天、约30天、约31天、约32天、约33天、约34天、约35天、约36天)。在示例性方面中，该储存包括第一储存和随后进行的第二储存，并且该第一储存为在约2℃至约8℃下持续至少12个月、24个月或36个月，且该第二储存为在约20℃至约30℃下持续约1个月。在示例性情况下，该水性药物配制品包含不超过2％HMWS或少于2％HMWS、或者不超过
1.9％HMWS或少于1.9％HMWS、或者不超过1.8％HMWS或少于1.8％HMWS、或者不超过1.7％HMWS或少于1.7％HMWS、或者不超过1.6％HMWS或少于1.6％HMWS、或者不超过1.5％HMWS或少于1.5％HMWS、或者不超过1.4％HMWS或少于1.4％HMWS、或者不超过1.3％HMWS或少于
1.3％HMWS、或者不超过1.2％HMWS或少于1.2％HMWS，例如，任选地在约0.01％至约2％HMWS、或约0.01％至约1.9％HMWS、或约0.01％至约1.8％HMWS、或约0.01％至约1.7％HMWS、或约0.01％至约1.6％HMWS、或约0.01％至约1.5％HMWS、或约0.01％至约1.4％HMWS、或约
0.01％至约1.3％HMWS、或约0.01％至约1.2％HMWS的范围内，如通过SE-UHPLC所测量。在可替代或其他方面中，该水性药物配制品包含超过98％的抗体主峰、或者至少95％抗体主峰或超过95％抗体主峰、或者至少96％抗体主峰或超过96％抗体主峰、或者至少97％抗体主峰或超过97％抗体主峰、或者至少97.5％抗体主峰或超过97.5％抗体主峰、或者至少98％抗体主峰或超过98％抗体主峰、或者至少98.1％抗体主峰或超过98.1％抗体主峰、或者至少98.2％抗体主峰或超过98.2％抗体主峰、或者至少98.3％抗体主峰或超过98.3％抗体主峰、或者至少98.4％抗体主峰或超过98.4％抗体主峰、或者至少98.5％抗体主峰或超过
98.5％抗体主峰、或者至少98.6％抗体主峰或超过98.6％抗体主峰，例如任选地在约95％至约99.9％抗体主峰、或约96％至约99.9％抗体主峰、或约97％至约99.9％抗体主峰、或约
97.5％至约99.9％抗体主峰、或约98％至约99.9％抗体主峰、或约98.1％至约99.9％抗体主峰、或约98.2％至约99.9％抗体主峰、或约98.3％至约99.9％抗体主峰、或约98.4％至约
99.9％抗体主峰、或约98.5％至约99.9％抗体主峰、或约98.6％至约99.9％抗体主峰的范围内，如通过SE-UHPLC所测量。
[0077] 如本文中所使用，术语“抗体”是指具有常规免疫球蛋白形式、包含重链及轻链且包含可变区及恒定区的蛋白质。例如，抗体可以是IgG，其是两对相同多肽链的“Y形”结构，每对具有一条“轻”链(典型地具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(典型地具有约50-70kDa的分子量)。抗体具有可变区和恒定区。在IgG形式中，可变区通常为约100-110或更多个氨基酸，包含三个互补决定区(CDR)，主要负责抗原识别，并且与结合不同抗原的其他抗体差异很大。参见，例如Janeway等人,“Structure ofthe Antibody Molecule and the Immunoglobulin Genes”[抗体分子和免疫球蛋白基因的结构],Immunobiology:The Immune System in Health and Disease[免疫生物学：健康与疾病的免疫系统],第4版.爱思唯尔科学有限公司(Elsevier Science Ltd.)/加兰出版社(GarlandPublishing),(1999)。
[0078] 简而言之，在抗体
支架中，CDR嵌埋于重链及轻链可变区中的
框架内，其中，其构成主要负责抗原结合及识别的区域。可变区包含至少三个重链CDR或三个轻链CDR(Kabat等人,1991,Sequences ofProteins ofImmunological Interest[免疫相关蛋白质序列],Public Health Service[公共卫生署]N.I.H.,贝塞斯达,
马里兰州；还参见Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917；Chothia等人,1989,Nature[自然]342:877-883)，位于框架区内(由Kabat等人,1991
指定框架区1-4、FR1、FR2、FR3、和FR4；还参见Chothia和Lesk,1987,同上)。
[0079] 人类轻链分类为κ轻链及λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。本披露内容的实施例包括所有这种抗体类别或同种型。轻链恒定区可为例如κ型或λ型轻链恒定区，例如人类κ型或λ型轻链恒定区。重链恒定区可为例如α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区，例如人类α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区。因此，在示例性实施例中，该抗体为同种型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一种。在示例性方面中，该抗RANKL抗体为IgG1、IgG2或IgG4抗体。
[0080] 在各种方面中，该抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。在一些方面中，该抗体包含实质上与由
哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、猪、人类等产生的天然存在抗体类似的序列。就此而言，抗体可视为哺乳动物抗体，例如小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、鸡抗体、仓鼠抗体、猪抗体、人类抗体等。在某些方面中，抗RANKL抗体为单克隆人类抗体。在某些方面中，重组蛋白质为
嵌合抗体或人源化抗体。术语“嵌合抗体”在本文中用于指含有来自一个物种的恒定结构域和来自第二物种的可变结构域，或更一般而言，含有来自至少两个物种的氨基酸序列区段的抗体。术语“人源化”在关于抗体使用时是指至少具有来自经工程改造以具有比原始来源抗体更类似于真人类抗体的结构和免疫学功能的非人类来源CDR区的抗体。例如，人源化可涉及将来自非人类抗体(例如小鼠抗体)的CDR接枝到人类抗体中。人源化也可涉及选择氨基酸取代以使非人类序列看起来更类似人类序列。
[0081] 在各种方面中，抗体被酶，诸如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶裂解成
片段。木瓜蛋白酶裂解抗体而产生两个Fab片段和单一Fc片段。胃蛋白酶裂解抗体从而产生F(ab’)2片段和pFc’片段。在示例性方面中，水性药物配制品包含保留至少一个抗原(RANKL)结合位点的抗体片段，例如Fab、Fc、F(ab’)2或pFc’。关于本披露内容的水性药物配制品和方法，抗体可能缺乏抗体的某些部分，并且可能为结合至RANKL的抗体片段。在示例性方面中，抗体片段为抗RANKL抗体的抗原结合部分。
[0082] 抗体蛋白产物可为基于保留完全抗原结合能力的抗体片段，例如scFv、Fab和VHH/VH的抗原结合形式。保留其完整抗原结合位点的最小抗原结合片段为Fv片段，后者完全由可变(V)区组成。使用可溶性柔性氨基酸肽接头将V区连接至scFv片段(可变单链片段)以使该分子稳定，或将恒定(C)结构域添加至V区以产生Fab片段[抗原结合片段]。scFv与Fab皆为广泛使用的片段，二者皆可在宿主，例如原核宿主中容易地产生。其他抗体蛋白产物包括经二硫键稳定的scFv(ds-scFv)、单链Fab(scFab)以及二聚及多聚抗体形式，如双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体，或包含由与寡聚结构域连接的scFv组成的不同形式的迷你抗体(miniAb)。最小片段为骆驼重链Ab以及单结构域Ab(sdAb)的VHH/VH。最常用于建造新颖抗体形式的构件为单链可变(V)结构域抗体片段(scFv)，其包含由具有约15个氨基酸残基的肽接头连接的来自重链和轻链的V结构域(VH结构域和VL结构域)。肽抗体或肽-Fc融合物为另一抗体蛋白产物。肽抗体的结构由移植至Fc结构域上的生物学活性肽组成。此项技术中已充分描述了肽抗体。参见例如Shimamoto等人,mAbs 4(5):586-591(2012)。
[0083] 其他抗体蛋白产物包括单链抗体(SCA)、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、双特异性或三特异性抗体等。双特异性抗体可分成五个主要类别：BsIgG、附加IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白以及BsAb缀合物。参见例如Spiess等人,Molecular Immunology[分子免疫学]67(2)A部分:97-106(2015)。
[0084] 在示例性方面中，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含这些抗体蛋白产物(例如，scFv、Fab VHH/VH、Fv片段、ds-scFv、scFab、二聚抗体、多聚抗体(例如，双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体)、迷你抗体、骆驼重链抗体的肽抗体VHH/VH、sdAb、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、双特异性或三特异性抗体、BsIgG、附加IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白以及BsAb缀合物)，基本上由其组成或由其组成。
[0085] 在示例性方面中，抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含呈单体形式或者聚合、寡聚或多聚形式的抗体蛋白产物，基本上由其组成或由其组成。在抗体包含两个或更多个独特抗原结合区片段的某些实施例中，该抗体被视为双特异性、三特异性或多特异性的，或者二价、三价或多价的，视该抗体所识别并结合的独特抗原决定基的数目而定。
[0086] 用于该配制品中的人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)抗体或其抗原结合部分为特异性结合人类RANKL蛋白或人类骨保护素(OPGL)蛋白或其片段并且抑制或中和RANKL或OPGL蛋白的活性和/或抑制RANK/RANKL
信号转导途径的抗体或其抗原结合部分，且在本文中称为人类抗RANKL单克隆抗体或其抗原结合部分。例如，本文中所描述的配制品可包含特异性结合人类RANKL(SEQ ID NO:12)或其部分的氨基酸序列的人类抗RANKL单克隆抗体。人类RANKL蛋白为由SEQ ID NO:11的多核苷酸序列编码的跨膜或可溶性蛋白，已知其对于破骨细胞的形成、功能及存活而言是必需的。例如，人类抗RANKL抗体抑制RANKL与其受体RANK的相互作用。
[0087] 人类抗RANKL单克隆抗体的实例为迪诺苏单抗，其作为 及 以可商购形式出售。 为单次使用小瓶中1.7mL溶液(70mg/mL)中的120mg剂量的迪诺苏
单抗配制品，其含有120mg迪诺苏单抗、乙酸盐(18mM)、山梨醇(4.6％)、注射用水(USP)以及氢
氧化钠(至pH 5.2)。 可作为1mL溶液(60mg/mL)中的60mg剂量的迪诺苏单抗配制品获得。 的各1mL单次使用预填充注射器含有60mg迪诺苏单抗(60mg/mL溶液)、
4.7％山梨醇、17mM乙酸盐、0.01％聚山梨醇酯20、注射用水(USP)以及氢氧化钠(至pH
5.2)。具体设想如本文中所描述且包括迪诺苏单抗或其部分的配制品。迪诺苏单抗为结合至人类RANKL的完全人类IgG2单克隆抗体。迪诺苏单抗具有147kDa的近似分子量且在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中表达。迪诺苏单抗可变轻链(LC)和可变重链(HC)的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和2中，且全长LC及HC分别示为SEQ ID NO:3和4。在一些方面中，包含编码SEQ ID NO:1(迪诺苏单抗可变LC)的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸为SEQ ID NO:19的核酸。在一些方面中，包含编码SEQ ID NO:2(迪诺苏单抗可变HC)的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸为SEQ ID NO:20的核酸。在一些方面中，包含编码SEQ ID NO:3(全长迪诺苏单抗LC)的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸为SEQ ID NO:21的核酸。在一些方面中，包含编码SEQ ID NO:4(全长迪诺苏单抗HC)的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸为SEQ ID NO:23的核酸。表示为全长LC的氨基酸21-235的成熟形式LC示为SEQ ID NO:13，而表示为全长HC的氨基酸20-467的成熟形式HC示为SEQ ID NO:14。在一些方面中，包含编码SEQ ID NO:13(成熟形式LC)的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸为SEQ ID NO:22的核酸。在一些方面中，包含编码SEQ ID NO:14(成熟形式HC)的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸为SEQ ID NO:24的核酸。
另外，迪诺苏单抗LC CDR示为SEQ ID NO:5(LC CDR1)、SEQ ID NO:6(LC CDR2)以及SEQ ID NO:7(LC CDR3)。迪诺苏单抗HC CDR示为SEQ ID NO:8(HC CDR1)、SEQ ID NO:9(HC CDR2)以及SEQ ID NO:10(HC CDR3)。国际专利申请号WO 03/002713和美国专利号7,364,736中已描述了迪诺苏单抗和对其
请求保护，二者的披露内容通过引用以其整体并入本文。
[0088] 如本文中所使用，术语“迪诺苏单抗”包括迪诺苏单抗的生物类似物。如本文中所使用，(经批准的参考产品/生物药物，诸如蛋白质治疗剂、抗体等的)“生物类似物”是指基于来源于以下研究的数据与参考产品类似的生物产品：(a)显示生物产品高度类似于参考产品但在临床无活性组分方面存在微小差异的分析研究；(b)动物研究(包括毒性的评定)；和/或(c)足以在参考产品经
许可且意欲使用并且生物产品寻求许可的一或多种适当使用条件下显示安全性、纯度以及效能的临床研究(包括免疫原性和药代动力学或药效学的评定)。在一个实施例中，生物类似生物产品和参考产品利用提议标记中规定、推荐或建议的一或多种使用条件下的一或多种相同的作用机制，但仅在已知参考产品的一或多种作用机制的程度上。在一个实施例中，提议用于生物产品的标记中规定、推荐或建议的一或多种使用条件先前已批准用于参考产品。在一个实施例中，生物产品的给予途径、剂型和/或强度与参考产品相同。在一个实施例中，制造、加工、包装或容纳生物产品的机构满足确保生物产品继续安全、纯并且有效的设计标准。参考产品可能在美国、欧洲或日本中的至少一者内经批准。生物类似物可为例如与上市抗体具有相同主要氨基酸序列但可能在不同的细胞类型中或通过不同的产生、纯化或配制方法制造的抗体。
[0089] 这些配制品可包含含有SEQ ID NO:1-4、13、14的氨基酸序列中的至少一个或其部分的人类抗RANKL抗体。这些配制品可包含含有如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的CDR氨基酸序列中的至少一个、或如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的CDR氨基酸序列中的至少两个、或如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的CDR氨基酸序列中的至少三个、或如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的CDR氨基酸序列中的至少四个、或如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的CDR氨基酸序列中的至少五个、或如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10中所示的CDR氨基酸序列中的至少六个的人类抗RANKL抗体。
[0090] 这些配制品可包含含有至少一个与SEQ ID NO:1-4、13及14中的任一者至少80％相同且抑制RANKL与其受体RANK之间的相互作用的氨基酸序列的人类抗RANKL抗体，或包含至少一个与SEQ ID NO:1-4、13及14中的任一者至少85％相同且抑制RANKL与其受体RANK之间的相互作用的氨基酸序列的人类抗RANKL抗体，或包含至少一个与SEQ ID NO:1-4、13及14中的任一者至少90％相同且抑制RANKL与其受体RANK之间的相互作用的氨基酸序列的人类抗RANKL抗体，或包含至少一个与SEQ ID NO:1-4、13及14中的任一者至少91％相同且抑制RANKL与其受体RANK之间的相互作用的氨基酸序列的人类抗RANKL抗体，或包含至少一个与SEQ ID NO:1-4、13及14中的任一者至少92％相同且抑制RANKL与其受体RANK之间的相互作用的氨基酸序列的人类抗RANKL抗体，或包含至少一个与SEQ ID NO:1-4、13及14中的任一者至少93％相同且抑制RANKL与其受体RANK之间的相互作用的氨基酸序列的人类抗RANKL抗体，或包含至少一个与SEQ ID NO:1-4、13及14中的任一者至少94％相同且抑制RANKL与其受体RANK之间的相互作用的氨基酸序列的人类抗RANKL抗体，或包含至少一个与SEQ ID NO:1-4、13及14中的任一者至少95％相同且抑制RANKL与其受体RANK之间的相互作用的氨基酸序列的人类抗RANKL抗体，或包含至少一个与SEQ ID NO:1-4、13及14中的任一者至少96％相同且抑制RANKL与其受体RANK之间的相互作用的氨基酸序列的人类抗RANKL抗体，或包含至少一个与SEQ ID NO:1-4、13及14中的任一者至少97％相同且抑制RANKL与其受体RANK之间的相互作用的氨基酸序列的人类抗RANKL抗体，或包含至少一个与SEQ ID NO:1-4、13及14中的任一者至少98％相同且抑制RANKL与其受体RANK之间的相互作用的氨基酸序列的人类抗RANKL抗体，或包含至少一个与SEQ ID NO:1-4、13及14中的任一者至少
99％相同且抑制RANKL与其受体RANK之间的相互作用的氨基酸序列的人类抗RANKL抗体。
[0091] 在示例性实施例中，该水性药物配制品包含抗RANKL抗体或其抗原结合部分，包括如本文中所描述的抗体蛋白产物。在示例性方面中，该抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的轻链CDR1序列。在可替代或其他情况下，该抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含含有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的轻链CDR2序列。在可替代或其他方面中，该抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的重链CDR3序列。在一些情况下，该抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10。在示例性方面中，该抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含(i)包含含有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的轻链CDR3序列的轻链可变结构域；(ii)包含含有SEQ ID NO:8、任选地SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的重链CDR1序列的重链可变结构域；(iii)包含含有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链CDR2序列的重链可变结构域；或(iv)其任何组合。在一些方面中，该抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含(A)包含含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链CDR1的轻链可变结构域、包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR2的轻链可变结构域和包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR3的轻链可变结构域；以及(B)包含含有SEQ ID NO:8(任选地SEQ ID N:27)的氨基酸序列的重链CDR1的重链可变结构域、包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链CDR2的重链可变结构域和包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR3的重链可变结构域。在示例性方面中，该抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含：(A)轻链可变结构域，该轻链可变结构域选自由以下组成的组：(i)包含与SEQ ID NO:1至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)相同的氨基酸序列的轻链可变结构域；(ii)包含由包含SEQ ID NO:19的多核苷酸序列编码的氨基酸序列的轻链可变结构域；以及(iii)包含由在严格条件下与由SEQ ID NO:19组成的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列的轻链可变结构域；或(B)重链可变结构域，该重链可变结构域选自由以下组成的组：(i)包含与SEQ ID NO:2至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)相同的氨基酸序列的重链可变结构域；
(ii)包含由包含SEQ ID NO:20的多核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链可变结构域；以及(iii)包含由在严格条件下与由SEQ ID NO:20组成的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列的重链可变结构域；或(C)(A)的轻链可变结构域和(B)的重链可变结构域。在示例性方面中，该抗RANKL抗体为完全人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在示例性情况下，该抗原结合部分为Fab、Fab’、F(ab’)2或单链Fv。在示例性方面中，该抗RANKL抗体为IgG1、IgG2或IgG4抗体，任选地，其中该抗RANKL抗体包含SEQ ID NO:15的序列。在一些方面中，该抗RANKL抗体包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的序列。在示例性方面中，该抗RANKL抗体或其抗原结合部分包含：(A)轻链，该轻链选自由以下组成的组：(i)包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:13至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)相同的氨基酸序列的轻链；(ii)包含由SEQ ID NO:21或23的多核苷酸序列编码的氨基酸序列的轻链；以及(iii)包含由在严格条件下与由SEQ ID NO:21或23组成的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列的轻链；或(B)重链，该重链选自由以下组成的组：(i)包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:14至少80％(例如，至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)相同的氨基酸序列的重链；(ii)包含由SEQ ID NO:22或24的多核苷酸序列编码的氨基酸序列的重链；以及(iii)包含由在严格条件下与由SEQ ID NO:22或24组成的多核苷酸的互补序列杂交的多核苷酸编码的氨基酸序列的重链；或(C)(A)的轻链可变结构域和(B)的重链可变结构域。
[0092] 该水性配制品中的迪诺苏单抗或其他人类抗RANKL抗体或其抗原结合部分的浓度一般可处于任何有用范围内，例如约0.1至约200mg/mL的范围内。随着浓度增加，黏度增加，这可能妨碍该配制品加工成用于制药用途的无菌剂量呈现形式。
[0093] 在一个方面中，通过氨基酸聚集抑制剂具有改良稳定性的配制品可以在任何浓度的迪诺苏单抗或其他人类抗RANKL抗体或其抗原结合部分下存在，包括约10mg/mL至约200mg/mL、或约15mg/mL至约150mg/mL、或约30mg/mL至约200mg/mL、或约60mg/mL至约
200mg/mL、或约60mg/mL至约180mg/mL、或约60mg/mL至约160mg/mL、或约60mg/mL至约
150mg/mL、或约60mg/mL至约140mg/mL、或约60mg/mL至约130mg/mL、或约60mg/mL至约
120mg/mL、或约60mg/mL至约110mg/mL、或约60mg/mL至约100mg/mL、或约60mg/mL至约90mg/mL、或约60mg/mL至约80mg/mL、或约60mg/mL至约70mg/mL、或约70mg/mL至约200mg/mL、或约
70mg/mL至约180mg/mL、或约70mg/mL至约160mg/mL、或约70mg/mL至约150mg/mL、或约70mg/mL至约140mg/mL、或约70mg/mL至约130mg/mL、或约70mg/mL至约120mg/mL、或约70mg/mL至约110mg/mL、或约70mg/mL至约100mg/mL、或约70mg/mL至约90mg/mL、或约70mg/mL至约
80mg/mL，例如120mg/mL。
[0094] 在另一方面中，对于具有约5.0至低于5.2的pH值的配制品，设想迪诺苏单抗或其他人类抗RANKL抗体或其抗原结合部分的浓度包括超过70mg/mL、或至少71mg/mL、或至少约75mg/mL、或至少约80mg/mL、或至少约85mg/mL、或至少约90mg/mL、或至少约95mg/mL、或至少约100mg/mL、或至少约105mg/mL、或至少约110mg/mL、或至少约115mg/mL、或至少约
120mg/mL且高达约200mg/mL的范围。例如，设想范围包括71mg/mL至约200mg/mL、或约75mg/mL至约200mg/mL、或约75mg/mL至约180mg/mL、或约75mg/mL至约160mg/mL、或约75mg/mL至约150mg/mL、或约75mg/mL至约140mg/mL、或约75mg/mL至约130mg/mL、或约75mg/mL至约
120mg/mL、或约75mg/mL至约110mg/mL、或约75mg/mL至约100mg/mL、或约75mg/mL至约90mg/mL、或约120mg/mL至约200mg/mL、或约120mg/mL至约180mg/mL、或约120mg/mL至约160mg/mL、或约120mg/mL至约140mg/mL，例如120mg/mL。
[0095] 在示例性方面中，该水性药物配制品包含浓度高于70mg/mL，例如高于80mg/mL、高于90mg/mL、高于100mg/mL、高于125mg/mL、高于150mg/mL、高于175mg/mL、高于200mg/mL、高于225mg/mL、高于250mg/mL、高于275mg/mL的该抗体或其抗原结合部分。在示例性方面中，该水性药物配制品包含浓度低于约300mg/mL，例如低于约275mg/mL、低于约250mg/mL、低于约225mg/mL、低于约200mg/mL、低于约175mg/mL或低于约150mg/mL的该抗体或其抗原结合部分。在示例性方面中，该配制品中的抗体或其抗原结合部分的浓度处于约10mg/mL至约300mg/mL的范围内，例如约25mg/mL至约300mg/mL、约50mg/mL至约300mg/mL、约75mg/mL至约300mg/mL、约125mg/mL至约300mg/mL、约150mg/mL至约300mg/mL、约175mg/mL至约300mg/mL、约200mg/mL至约300mg/mL、约225mg/mL至约300mg/mL、约250mg/mL至约300mg/mL、约
275mg/mL至约300mg/mL、约10mg/mL至约275mg/mL、约10mg/mL至约250mg/mL、约10mg/mL至约225mg/mL、约10mg/mL至约200mg/mL、约10mg/mL至约175mg/mL、约10mg/mL至约150mg/mL、约10mg/mL至约125mg/mL、约10mg/mL至约100mg/mL、约10mg/mL至约75mg/mL、约10mg/mL至约50mg/mL或约10mg/mL至约25mg/mL的范围内。在示例性方面中，该水性药物配制品包含浓度处于高于70mg/mL至约300mg/mL的范围内，例如高于80mg/mL至约300mg/mL、高于90mg/mL至约300mg/mL、高于100mg/mL至约300mg/mL、高于125mg/mL至约300mg/mL、高于150mg/mL至约300mg/mL、高于175mg/mL至约300mg/mL、高于200mg/mL至约300mg/mL、高于70mg/mL至约
275mg/mL、高于约70mg/mL至约250mg/mL、高于约70mg/mL至约225mg/mL、高于约70mg/mL至约200mg/mL、高于约70mg/mL至约175mg/mL、高于约70mg/mL至约150mg/mL、高于约70mg/mL至约125mg/mL、高于约70mg/mL至约100mg/mL的范围内的该抗体或其抗原结合部分。在示例性方面中，该水性药物配制品包含浓度处于约100至约140mg/mL的范围内，例如约110mg/mL、约120mg/mL、约130mg/mL的该抗体或其抗原结合部分。在一些方面中，该水性药物配制品包含浓度为约120mg/mL±12mg/mL，例如约108mg/mL至约132mg/mL、约115mg/mL至约
125mg/mL、约116mg/mL、约117mg/mL、约118mg/mL、约119mg/mL、约120mg/mL、约121mg/mL、约
122mg/mL、约123mg/mL、约124mg/mL的该抗体或其抗原结合部分。
[0096] 可根据国际专利公开WO 2003002713 A2中所提供的描述来制备迪诺苏单抗及其他人类抗RANKL单克隆抗体及其抗原结合部分。
[0097] 以下所描述的对高浓度迪诺苏单抗溶液(例如120mg/mL)的配制研究显示在pH 5以下且尤其在更低pH值(例如pH 4.5)下，HMWS形成(速率和程度)大大增加。已证明随着pH值增加，二聚物物质的形成增加。平衡该两种作用，设想本文中所描述的配制品将具有处于约5.0至低于5.2、或约5.0至约5.19、或约5.0至约5.15、或约5.0至约5.10范围内，例如约5.0、约5.05、约5.1或约5.15的pH值。
[0098] 本文中所描述的研究也显示通过包括氨基酸聚集抑制剂使得有可能获得独立的稳定性和聚集减少性作用。因此，设想当包括氨基酸聚集抑制剂时，配制品pH值可处于约4.9至约5.4、或约5.0至约5.4、或约5.0至约5.2、或约5.0至低于5.2、或约5.0至5.19、或约
5.0至约5.15、或约5.0至约5.10的范围内，例如约5.0、约5.05、约5.1或约5.15、或约5.2。
[0099] 该水性配制品可经缓冲。当使用时，缓冲剂可为有机缓冲剂。缓冲系统在25℃下可例如以约pH 4至5.5、或4.5至5.5、或4.5至5为中心。例如，该缓冲系统在25℃下可具有处于pH 5.0-5.2的一个pH值单位内的pKa。一种这种缓冲系统为在25℃下具有约4.75的pKa的乙酸/乙酸盐。另一这种缓冲系统为在25℃下具有约4.27的pKa的谷氨酸/谷氨酸盐。所设想的其他可替代的缓冲系统包括基于离子，包括
琥珀酸盐(在25℃下pKa 4.21)、丙酸盐(在25℃下pKa 4.87)、苹果酸盐(在25℃下pKa 5.13)、吡啶(在25℃下pKa 5.23)以及哌嗪(在25℃下pKa 5.33)的系统。设想缓冲剂可提供为钠盐(或二钠盐，视情况而定)或在可替代方案中作为
钾、镁或铵盐。例如，缓冲剂可基于乙酸盐、
柠檬酸盐、琥珀酸盐、
磷酸盐以及羟甲基氨基甲烷(Tris)。尤其设想基于乙酸盐、谷氨酸盐以及琥珀酸盐，例如乙酸盐或谷氨酸盐的缓冲剂。
[0100] 在具有乙酸盐或谷氨酸盐缓冲剂但在其他方面等同的120mg/mL迪诺苏单抗配制品中通过尺寸排阻超高效液相色谱(SE-UHPLC)比较HMWS形成显示当在37℃下储存四周进行评估时，缓冲剂类型之间不存在差异。
[0101] 当使用时，将以足以在储存条件下在产品货架寿命(例如4℃下3年、或25℃下1个月、或25℃下2周、或25℃下7天)内维持该配制品的所选pH值的量包括该缓冲剂。缓冲剂浓度可处于约2mM至约40mM、或约5mM至约20mM、或约10mM至约25mM、或约15mM至约25mM的范围内，例如10mM、或15mM、或18mM、或25mM。例如，与抗RANKL单克隆抗体(例如迪诺苏单抗)和苯丙氨酸一起使用的乙酸盐缓冲剂可处于约2mM至约30mM、或约16mM至约41mM、或约25mM至约39mM、或约30mM至约34mM的范围内。换言之，用于浓缩该抗体至高于70mg/mL(例如120mg/mL)的浓度的渗滤缓冲剂可处于5mM至约30mM或约15mM至约25mM的范围内或处于约20mM。也设想提供一种自缓冲的经氨基酸稳定的配制品。在示例性方面中，以足以在储存条件下在产品货架寿命(例如在约2℃至约8℃下36个月，任选地，随后在约20℃至约30℃下约1个月)内维持该配制品的所选pH值的量包括该缓冲剂。
[0102] 在一些方面中，该水性药物配制品包含缓冲剂，且任选地，该缓冲剂在25℃下以约pH 4.0至约pH 5.5的范围为中心。在一些方面中，该缓冲剂在25℃下具有在pH 5.0-5.2的一个pH值单位内的pKa。在某些方面中，该水性药物配制品包含约5mM至约60mM缓冲剂、约5mM至约50mM缓冲剂、或约9mM至约45mM缓冲剂(例如，约15mM至约30mM缓冲剂，例如，约
20mM、约25mM缓冲剂)。在示例性方面中，该缓冲剂为乙酸盐或谷氨酸盐。
[0103] 该配制品也可包括一或多种针对蛋白质聚集的稳定剂和其他配制品赋形剂。设想这种稳定剂及赋形剂包括但不限于氨基酸聚集抑制剂、张力改良剂、表面活性剂、增溶剂(例如N-甲基-2-吡咯烷
酮)、PEG缀合剂以及环糊精(例如 )。
[0104] 术语“氨基酸聚集抑制剂”是指氨基酸或氨基酸的组合(例如混合物，或二肽，或具有2至10个残基的寡肽)，其中任何给定氨基酸均以其游离碱形式或以其盐形式(例如精氨酸盐酸盐)或者以氨基酸类似物存在，并且减少HMWS或抑制HMWS形成。设想包括钠盐、
钾盐以及盐酸盐的盐。另外，设想精氨酸盐与盐酸盐、谷氨酸盐、丁酸盐以及
乙醇酸盐。在使用氨基酸的组合时，这些氨基酸可全部以其游离碱形式存在，可全部以其盐形式存在，或可能一部分以其游离碱形式存在而其他以其盐形式存在。除二肽和寡肽以外或在二肽和寡肽的替代物中，可使用一或多种氨基酸的混合物，例如精氨酸与苯丙氨酸的混合物。在可替代的实施例中，该水性药物配制品中仅存在一种类型的氨基酸聚集抑制剂。在示例性方面中，该配制品中仅存在一种氨基酸，例如，仅L-精氨酸或仅L-苯丙氨酸。
[0105] 设想使用一或多种带有带电侧链的氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸盐和谷氨酸盐中的一或多种。氨基酸可选自碱性氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸或其组合。尤其设想精氨酸。本发明的方法或配制品中可使用特定氨基酸的任何立体异构体(即，L、D或DL异构体)或这些立体异构体的组合，只要该特定氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在即可。尤其设想L-立体异构体，例如L-精氨酸。任选地，该氨基酸为具有带正电侧链的氨基酸，例如精氨酸。
[0106] 在另一方面中，设想使用一或多种在其侧链中具有芳族环的氨基酸，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或其组合。尤其设想苯丙氨酸。
[0107] 在另一方面中，设想使用一或多种疏水性氨基酸，例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸或甘氨酸。
[0108] 在另一方面中，设想使用一或多种脂族疏水性氨基酸，例如丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。尤其设想亮氨酸。
[0109] 本发明的方法或配制品中也可使用显示聚集减少或抑制效果的氨基酸类似物。术语“氨基酸类似物”是指天然存在氨基酸的衍生物。所设想的类似物包括例如氨基衍生物以及N-单乙基衍生物和n-乙酰基衍生物。其他设想的类似物包括二肽或具有2至10个残基的寡肽，例如精氨酸-精氨酸和苯丙氨酸-精氨酸。在一个类型的实施例中，设想n-乙酰基精氨酸和n-乙酰基赖氨酸不单独使用，而是可与另一氨基酸聚集抑制剂组合使用。如同氨基酸，氨基酸类似物以其游离碱形式或其盐形式用于本发明的方法或配制品中。
[0110] 本发明的方法或配制品中所使用的氨基酸聚集抑制剂保护治疗活性蛋白质免受各种应力影响，从而增加或/和维持蛋白质或含蛋白质的配制品在蛋白质寿命期间(储存前和储存期间、使用前)的稳定性。在本文中，术语“应力”包括但不限于来自任何来源，例如运输的热、冷冻、pH值、光、搅拌、氧化、脱水、表面、剪切、冷冻/解冻、压力、重金属、酚类化合物、变性剂等。尤其设想
热应力。术语应力涵盖调节(即，降低、维持或增加)蛋白质或含蛋白质的配制品的稳定性的任何因素。利用添加氨基酸聚集抑制剂来增加和/或维持稳定性以浓度依赖性方式发生。即，当本发明的蛋白质或含蛋白质的配制品正常地在不存在氨基酸聚集抑制剂的情况下展现聚集物形成时，增加氨基酸聚集抑制剂的浓度增加和/或维持该蛋白质或含该蛋白质的配制品的稳定性。如以下实例中所示，配制品中包括氨基酸聚集抑制剂也可减少已形成的HMWS的量。例如，这种氨基酸聚集抑制剂包括精氨酸及精氨酸-苯丙氨酸二肽。依据本文的披露内容，对于迪诺苏单抗或感兴趣的任何特定人类抗RANKL单克隆抗体，可容易地确定用于本发明方法或配制品中以减少聚集物形成，从而增加蛋白质的稳定性并且因而增加蛋白质的整个寿命期间配制品的稳定性的特定氨基酸聚集抑制剂的量。
[0111] 配制品中存在氨基酸聚集抑制剂已显示可减少二聚物物质的量及其动态形成速率。例如，在37℃下1个月之后，当与pH 5.2下的不含精氨酸的类似配制品相比时，具有pH 5.2的迪诺苏单抗配制品中包括浓度75mM的精氨酸使二聚物物质的量及其动态形成速率分别降低大约0.3％和25％。相比之下，发现通过包括精氨酸未能使并非人类抗RANKL单克隆抗体的单克隆抗体稳定，而是替代地造成HMWS增加。因此，本披露内容的另一方法为通过添加氨基酸聚集抑制剂，例如精氨酸或苯丙氨酸来减少迪诺苏单抗或另一人类抗RANKL单克隆抗体的配制品中的HMWS的方法。
[0112] 因此，在示例性实施例中，该水性药物配制品包含氨基酸聚集抑制剂，后者任选地为氨基酸。在示例性方面中，该氨基酸为L-立体异构体氨基酸(L-氨基酸)，但设想D-立体异构体氨基酸(D-氨基酸)。在一些方面中，该氨基酸聚集抑制剂包含含有带电侧链的氨基酸，在本文中也称为“带电氨基酸”。术语“带电氨基酸”是指包含在具有生理学pH值的水溶液中带负电(即，去质子化)或带正电(即，质子化)的侧链的氨基酸。例如，带负电氨基酸包括例如天冬氨酸和谷氨酸，而带正电氨基酸包括例如精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带电氨基酸包括20个编码氨基酸中的带电氨基酸，以及非典型或非天然存在或非编码氨基酸。因此，在示例性方面中，氨基酸聚集抑制剂为包含带正电侧链的氨基酸。在示例性情况下，该包含带正电侧链的氨基酸包含式I或式II的侧链结构：
[0113]
[0114] 其中n为1至7，其中R1和R2中的每一者独立地选自由以下组成的组：H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、NH、NH2(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R7为H或OH，其中任选地R1和R2之一为游离氨基基团(-NH3+)；
[0115]
[0116] 其中m为1至7，其中R3和R4中的每一者独立地选自由以下组成的组A：H、C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R8和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，其中R8为H或OH，其中R5任选地存在并且当存在时选自组A，任选地，其中R3和R4和R5中的每一者为H。
[0117] 在示例性方面中，该包含带正电侧链的氨基酸包含式I的侧链结构，且n处于2至4的范围内。在可替代或其他方面中，R1为NH或NH2。在示例性方面中，R2为NH2或NH3+。在示例性情况下，该包含带正电侧链的氨基酸为精氨酸。在示例性方面中，该包含带正电侧链的氨基酸包含式II的侧链结构，且m处于3至5的范围内。在一些方面中，R3和R4各自为H。在某些情况下，R5存在且任选地为H。在一些情况下，该包含带正电侧链的氨基酸为赖氨酸。在一些方面中，该包含带正电侧链的氨基酸以盐，任选地以盐酸(HCl)盐形式存在于配制品中。因此，在示例性方面中，该水性药物组合物包含L-精氨酸盐酸盐或L-赖氨酸盐酸盐。
[0118] 在示例性方面中，该氨基酸聚集抑制剂为芳族氨基酸。在一些情况下，该芳族氨基酸包含苯基或吲哚。在示例性方面中，该芳族氨基酸包含处于α碳与苯基或吲哚之间的C1-C6烷基链(例如，C1-C3烷基链)。在示例性情况下，该芳族氨基酸为L-苯丙氨酸。在其他情况下，该芳族氨基酸为L-色氨酸。
[0119] 在示例性方面中，该氨基酸聚集抑制剂为疏水性氨基酸。可根据本领域已知的疏水性标度中的任一种对疏水性进行测量或评分。一般而言，评分的正值愈大，则氨基酸的疏水性愈强。在一些情况下，在凯特-杜立特疏水性标度(Kyte J,Doolittle RF(1982年5月).“A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[一种显示蛋白质亲水特性的简单方法]”.J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]157(1):105-32)上对疏水性进行评分。在一些方面中，该疏水性氨基酸在凯特-杜立特疏水性标度上具有超过约2.5的评分。在某些方面中，该疏水性氨基酸包含含有支链或直链C2-C12烷基或者C4-C8环烷基、包含氮杂
原子的C4-C8杂环的侧链，任选地，其中该杂环为咪唑、吡咯或吲哚。出于本文的目的，术语“环烷基”涵盖任何碳环，包括碳双环或三环。
[0120] 在示例性方面中，该疏水性氨基酸包含C3-C8烷基，任选地，该疏水性氨基酸包含支链C3烷基或支链C4烷基。在某些方面中，该疏水性氨基酸为L-缬氨酸、L-亮氨酸或L-异亮氨酸。
[0121] 该氨基酸聚集抑制剂以可有效提供增加的稳定性的量使用，并且可以处于约10mM至约200mM范围内，例如处于约30mM至约120mM、或约38mM至约150mM、或约38mM至约113mM、或约38mM至约75mM范围内，例如约10mM、约38mM、约75mM、约113mM或约150mM的浓度使用。在示例性方面中，该水性药物配制品包含约5mM至约300mM氨基酸聚集抑制剂，任选地约25mM至约90mM氨基酸聚集抑制剂。在一些方面中，当该氨基酸聚集抑制剂为包含带正电侧链的氨基酸，任选地为L-精氨酸时，水性药物配制品包含约5mM至约150mM(例如，约10mM至约150mM、约15mM至约150mM、约20mM至约150mM、约25mM至约150mM、约5mM至约140mM、约5mM至约130mM、约5mM至约120mM、约5mM至约110mM、约5mM至约100mM、约5mM至约90mM)氨基酸聚集抑制剂。在一些方面中，当该氨基酸聚集抑制剂为包含带正电侧链的氨基酸，任选地为L-精氨酸时，该水性药物配制品包含约30mM至约80mM(例如，约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约
55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM)氨基酸聚集抑制剂。
[0122] 在一些方面中，当该氨基酸聚集抑制剂为芳族氨基酸，任选地为L-苯丙氨酸时，该水性药物配制品包含约5mM至约180mM(例如，约10mM至约180mM、约15mM至约180mM、约20mM至约180mM、约25mM至约180mM、约5mM至约170mM、约5mM至约170mM、约5mM至约160mM、约5mM至约150mM、约5mM至约140mM、约5mM至约130mM、约5mM至约120mM、约5mM至约110mM)氨基酸聚集抑制剂。在示例性情况下，当该氨基酸聚集抑制剂为芳族氨基酸，任选地为L-苯丙氨酸时，该水性药物配制品包含约5mM至约100mM(例如，约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约65mM、约70mM、约75mM、约80mM、约
85mM、约90mM、约95mM)氨基酸聚集抑制剂，任选地约20mM至约50mM氨基酸聚集抑制剂。
[0123] 任选地，当该氨基酸聚集抑制剂为疏水性氨基酸，任选地为L-缬氨酸、L-异亮氨酸或L-亮氨酸时，该水性药物配制品包含约5mM至约300mM氨基酸聚集抑制剂。任选地，当该氨基酸聚集抑制剂为疏水性氨基酸，任选地为L-缬氨酸、L-异亮氨酸或L-亮氨酸时，该水性药物配制品包含约5mM至约200mM(例如，约10mM至约200mM、约20mM至约200mM、约30mM至约200mM、约40mM至约200mM、约50mM至约200mM、约60mM至约200mM、约70mM至约200mM、约80mM至约200mM、约90mM至约200mM、约100mM至约200mM、约5mM至约290mM、约5mM至约280mM、约
5mM至约270mM、约5mM至约260mM、约5mM至约250mM、约5mM至约240mM、约5mM至约230mM、约
5mM至约220mM、约5mM至约210mM)氨基酸聚集抑制剂，任选地约20mM至约50mM氨基酸聚集抑制剂。在示例性方面中，该水性药物组合物包含：约30mM至约80mM L-精氨酸盐酸盐；约20mM至约50mM L-苯丙氨酸；约20mM至约50mM L-色氨酸；约30mM至约80mM L-赖氨酸盐酸盐；约
20mM至约50mM L-亮氨酸；约20mM至约50mM L-异亮氨酸；约20mM至约50mM L-缬氨酸；或其任何组合。
[0124] 在示例性方面中，该氨基酸聚集抑制剂的浓度与该抗体的浓度呈摩尔比。在一些方面中，当该氨基酸聚集抑制剂为芳族氨基酸，任选地为L-苯丙氨酸时，该氨基酸聚集抑制剂与该抗RANKL抗体的摩尔比为约10:约200(例如，约25:约150、约50:约100)。任选地，该摩尔比为约20:约90。在示例性方面中，当该氨基酸聚集抑制剂为包含带正电侧链的氨基酸，任选地为L-精氨酸时，该氨基酸聚集抑制剂与该抗RANKL抗体的摩尔比为约20:300。任选地，该摩尔比为约45:约180。
[0125] 表面活性剂为两性(具有极性头部和疏水性尾部)表面活性剂。表面活性剂优先积聚在界面处，从而减小界面张力。该配制品中可任选地包括表面活性剂。使用表面活性剂也可能有助于缓解大蛋白质颗粒的形成。
[0126] 在一种类型的实施例中，该表面活性剂可为非离子表面活性剂。实例包括聚氧乙烯脱水山梨醇
脂肪酸酯(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)；烷基芳基聚醚，例如氧乙基化烷基酚(例如TritonTM X-100)；泊洛沙姆(例如 如 F68)以及属于一个表面活性剂类别或属于多个表面活性剂类别的上述中的任一者的组合。尤其设想聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80。
[0127] 表面活性剂浓度处于约0.004％(w/v)至约0.1％(w/v)的范围内(例如，对于聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)为适合的，例如约0.004％至约0.05％、或约0.004％至约0.02％、或约0.01％。在示例性方面中，该配制品包含至少约0.004(w/v)％表面活性剂且任选地少于约0.15(w/v)％。在示例性方面中，该配制品中存在约0.005(w/v)％至约0.015(w/v)％表面活性剂，任选地约0.005(w/v)％、约0.006(w/v)％、约0.007(w/v)％、约0.008(w/v)％、约0.009(w/v)％、约0.010(w/v)％、约0.011(w/v)％、约0.012(w/v)％、约0.013(w/v)％或约0.014(w/v)％。
[0128] 经稳定的水性配制品可适合于通过任何可接受的途径，包括肠胃外，并且具体地经皮下给予。例如，皮下给予可给予至上臂、大腿或腹部。其他途径包括例如静脉内、皮内、肌肉内、腹膜内、结节内及脾内。皮下途径较佳。
[0129] 若该溶液呈意欲给予至受试者的形式，则可使其与预期给予部位等渗。例如，渗透压可处于约270至约350mOsm/kG、或约285至约345mOsm/kG、或约300至约315mOsm/kG的范围内。例如，若该溶液呈意欲用于经肠胃外给予的形式，则可使其与血液等渗(约300mOsm/kG渗透压)。在示例性方面中，该水性药物配制品具有处于约200mOsm/kg至约500mOsm/kg、或约225mOsm/kg至约400mOsm/kg、或约250mOsm/kg至约350mOsm/kg的范围内的渗透压。
[0130] 在示例性方面中，该水性药物配制品具有处于约500μS/cm至约5500μS/cm范围内的传导率，任选地，其中该传导率在该配制品包含含有带正电侧链的氨基酸时处于约2500μS/cm至约5500μS/cm的范围内，或在该配制品包含芳族氨基酸或缺乏氨基酸聚集抑制剂时处于约500μS/cm至约2000μS/cm的范围内。如前述
权利要求中任一项所述的水性药物配制品，其在5℃下具有不超过约6cP的黏度，任选地，其中该黏度为约4.5cP至约5.5cP。在某些方面中，该水性药物配制品在25℃下具有小于约13cP，任选地为约2.0cP至约10cP，任选地为约2.5cP至约4cP的黏度。
[0131] 张力改良剂或张力调节剂在本领域中是已知的，并且包括诸如盐(例如，
氯化钠、
氯化钾、
氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、
碳酸氢钠、碳酸钙、乳酸钠)、糖(例如，聚
葡萄糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖)和糖醇(例如，甘露糖醇、山梨醇、木糖醇、甘油、丙二醇)的化合物。在某些方面中，该张力改良剂选自由以下组成的组：山梨醇、甘露糖醇、
蔗糖、海藻糖、甘油及其组合。在示例性情况下，该张力改良剂为山梨醇。山梨醇可例如以处于0.1％(w/v)至5％(w/v)、或
1.2％(w/v)至5％(w/v)的范围内，例如3.6％(w/v)、4.6％(w/v)或4.7％(w/v)的浓度使用。
任选地，该配制品包含约1.0(w/w)％至约5.0(w/w)％张力改良剂。举例而言，该配制品包含约2.0(w/w)％至约5.0(w/w)％山梨醇、或约3.5(w/w)％至约5.0(w/w)％山梨醇、或约4.0％(w/w)至约5.0(w/w)％山梨醇。在一些方面中，该配制品不包含任何山梨醇或不含山梨醇。
在示例性方面中，该配制品不包含任何张力改良剂。
[0132] 本领域中已知的其他赋形剂可用于该配制品中，只要其不会对稳定性造成负面影响即可。可使用糖和聚醇保护蛋白质免于聚集，包括提供冷冻/解冻稳定性。这种化合物包括山梨醇、甘露糖醇、甘油、赤藓醇、辛酸盐、色氨酸盐、肌氨酸盐和甘氨酸。也可使用供制备
冻干制剂的稳定剂，例如稳定性糖，例如
二糖，诸如海藻糖和蔗糖。冻干制剂也可包括增积剂，如本领域中已知的。本领域已知的用于蛋白质稳定的其他赋形剂包括增溶剂(例如N-甲基-2-吡咯烷酮)、聚乙二醇(PEG)及环糊精(例如 )。药学上可接受的酸和碱可用于调节溶液pH值，例如氢氧化钠。
[0133] 对于肠胃外给予，该配制品可呈包含迪诺苏单抗或另一人类抗RANKL单克隆抗体、含或不含其他治疗剂、处于药学上可接受的媒剂中的无热原质肠胃外可接受的无菌水溶液形式。在某些实施例中，供肠胃外注射的媒剂为无菌蒸馏水，其中该迪诺苏单抗或另一人类抗RANKL单克隆抗体(有或无至少一种额外治疗剂)被配制为无菌等渗溶液。该配制品将含有药学上可接受之赋形剂，例如USP(美国药典)级赋形剂。
[0134] “
防腐剂”为可包括在药物配制品中以减少其中的细菌作用，例如因而有助于制造多用途配制品的化合物。防腐剂的实例包括八癸基二甲基苯甲基
氯化铵、六甲氯铵、苯扎氯铵(烷基苯甲基二甲基氯化铵混合物，其中烷基基团为长链化合物)和苄索氯铵。其他类型的防腐剂包括芳族醇，包括
苯酚、丁醇和苯甲醇；对羟基苯
甲酸烷基酯，包括对羟基
苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚、间甲酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚。在可替代方案中，该配制品可不含防腐剂。例如，该配制品当以单次使用剂型存在时可不含防腐剂。
[0135] 尽管本文中已描述该配制品的水溶液形式，但也可随后冻干该经稳定的配制品以制备冻干剂。因此，除非上下文另外规定，否则设想提及配制品及其使用方法包括由该经稳定水溶液获得的冻干剂。
[0136] 用于体内给予的药物配制品典型地为无菌的。在某些实施例中，此可通过通过无菌过滤膜进行过滤来实现。在某些实施例中，一般将肠胃外组合物置于具有无菌接取口的容器，例如静脉内溶液袋，或具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶，或预填充注射器中。在某些实施例中，该配制品可呈即用形式或呈在给予前进行复原或加以稀释的形式(例如冻干)储存。
[0137] 在某些实施例中，本发明针对用于产生单次剂量给予单位的试剂盒。在某些实施例中，这些试剂盒可各自含有具有由本文中所描述的溶液配制品制成的迪诺苏单抗或其他人类抗RANKL单克隆抗体干制剂的第一容器和具有无菌水或水溶液的第二容器。在本发明的某些实施例中，包括含有单腔室及多腔室预填充注射器(例如液体注射器和冻干剂注射器)的试剂盒。
[0138] 本文中所描述的经稳定的配制品可与一或多种其他治疗剂，例如钙和维生素D化合物一起使用。本文中所描述的经稳定的配制品可给予至接受利用额外治疗剂的疗法的患者，或本文中所描述的经稳定配制品可与额外治疗剂共同给予。
[0139] 经稳定的配制品在本文中所描述的其方面和实施例中的任一者中均可用于预防或治疗任何对迪诺苏单抗或另一人类抗RANKL单克隆抗体或其抗原结合部分有应答的疾病。这种用途和相关方法包括但不限于以下所描述的方面及实施例。
[0140] 在一个方面中，该配制品可用于预防有需要的患者的骨骼相关事件(SRE)，包括给予有效量的本文中所描述的经稳定的配制品。例如，该SRE可选自由以下组成的组：病理性骨折、针对骨的放射疗法、针对骨的手术和脊髓压迫。该患者可患有实体肿瘤骨转移。例如，该实体肿瘤可为乳腺癌、前列腺癌、
肺癌、非小细胞肺癌及肾细胞癌中的一或多种。该配制品的量可有效减少骨转换标记物尿肌酐修正N-末端端肽(uNTx/Cr)，任选地减少至少80％。该患者可为多发性骨髓瘤患者。
[0141] 在另一方面中，该配制品可用于治疗骨巨细胞瘤患者，包括给予有效量的本文中所描述的经稳定的配制品。在一种类型的实施例中，该患者患有复发性、不可切除性或手术切除有可能引起严重发病的骨巨细胞瘤。例如，该患者可为成人或骨骼成熟的青少年。
[0142] 在另一方面中，该配制品可用于治疗骨恶性高钙血症患者，包括给予有效量的本文中所描述的经稳定的配制品。在一个方面中，该恶性病为双膦酸盐疗法难治性的。该方法或用途可包括给予可有效减少该患者的血清钙或将其维持在低于或等于约11.5mg/dL的水平的量的该配制品。
[0143] 在另一方面中，该配制品可用于治疗有需要的患者的骨质疏松症，包括给予有效量的本文中所描述的经稳定的配制品。例如，该患者可为处于高骨折风险下的绝经后女性。在另一类型的实施例中，该患者可为处于高骨折风险下的男性。
[0144] 在另一方面中，该配制品用于增加有需要的患者的骨质量，包括给予有效量的本文中所描述的经稳定的配制品。例如，所给予的配制品的量可为有效降低新的脊椎骨折和/或非脊椎骨折的发生率的量。在另一类型的实施例中，所给予的配制品的量可为有效减少骨吸收的量。在另一类型的实施例中，该配制品的量可为有效增加该患者的选自腰椎、全髋及股骨颈的至少一个区域中的骨
密度的量。在另一类型的实施例中，该配制品的量可为有效增加该患者的皮质骨和/或松质骨中的骨质量的量。在另一类型的实施例中，该配制品的量可为有效减少骨吸收标记物血清1型C-端肽(CTX)的量。有需要的患者可任选地患有骨质疏松症。在另一类型的实施例中，该有需要的患者可为因乳腺癌而接受辅助芳香酶抑制剂疗法的处于高骨折风险下的女性。在另一类型的实施例中，该有需要的患者可为因非转移性前列腺癌而接受雄性素剥夺疗法的处于高骨折风险下的男性。在另一类型的实施例中，该有需要的患者可为处于高骨折风险下的患有骨质疏松症的男性。
[0145] 在另一方面中，该配制品可作为辅助疗法用于接受辅助/新辅助癌症疗法的处于高疾病复发风险下的患有早期乳腺癌的绝经后女性。
[0146] 在另一方面中，该配制品可与基于铂的化学疗法组合用作患有转移性非小细胞肺癌的患者的第一线治疗。
[0147] 在另一方面中，该配制品可用于治疗特发性喉下狭窄(ISS)。
[0148] 在另一方面中，该配制品可用于BRCA-1突变健康女性的乳腺癌和卵巢癌预防。
[0149] 任选地，该配制品可与免疫检查点抑制剂组合使用。任选地，该免疫检查点抑制剂对在免疫检查点途径中发挥功能的蛋白质具有特异性，例如CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7H4、BTLA、SLAM、2B4、CD160、KLRG-1或TIM3。任选地，该免疫检查点抑制剂为对CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7H4、BTLA、SLAM、2B4、CD160、KLRG-1或TIM3具有特异性的抗体、其抗原结合片段或抗体蛋白产物。这种免疫检查点抑制剂包括但不限于：阿替珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、曲美目单抗(tremelimumab)、BMS-936558、MK3475、CT-011、AM-224、MDX-1105、IMP321、MGA271。PD-1抑制剂包括例如喷罗珠单抗(pembrolizumab)及尼沃鲁单抗(nivolumab)。PD-L1抑制剂包括例如阿替珠单抗、阿维鲁单抗及度伐鲁单抗(durvalumab)。CTLA4包括例如伊匹单抗。在另一方面中，该配制品可任选地与PD-1抗体(例如，尼沃鲁单抗、喷罗珠单抗)组合用于治疗存在骨转移的黑色素瘤患者。在另一方面中，该配制品可任选地与CTLA4抑制剂，诸如伊匹单抗组合用于治疗乳腺癌患者。
[0150] 在另一方面中，该配制品可用于治疗富巨细胞肿瘤，例如副甲状腺机能亢进症或继发性
动脉瘤性骨囊肿。
[0151] 在另一方面中，该配制品可用于治疗渐进性转移性去势疗法抗性前列腺癌(mCRPC)。在另一方面中，该配制品可用于治疗去势疗法敏感性前列腺癌。在另一方面中，该配制品可用于治疗
激素抗性前列腺癌。
[0152] 在另一方面中，该配制品可用于治疗转移性乳腺癌(mBC)。在另一方面中，该配制品可用于治疗手术前乳腺癌。在另一方面中，该配制品可用于治疗早期乳腺癌。在其他方面中，该配制品可用于治疗激素受体阴性RANK阳性或RANK阴性原发性乳腺癌。在另一方面中，该配制品可用于治疗绝经后HER2阴性乳腺癌。
[0153] 在另一方面中，该配制品可用于治疗例如老年患者的骨髓发育不良综合征。
[0154] 在另一方面中，该配制品可用于治疗
癌症治疗诱导的骨损失(CTIBL)。
[0155] 在另一方面中，该配制品可用于治疗子
宫颈的子宫肿瘤。
[0156] 在另一方面中，该配制品可用于在进行或未进行免疫疗法的患者中诱导免疫调节作用。
[0157] 在另一方面中，该配制品可用于预防或治疗与骨质疏松症、派杰氏病(Paget’s disease)、骨髓炎、高钙血症、骨质减少、骨
坏死及类风湿性关节炎相关的骨损失。在另一方面中，该配制品可用于预防或治疗伴随骨损失的
炎症性病状。在另一方面中，该配制品可用于预防或治疗伴随骨损失的自体免疫性病状。在另一方面中，该配制品可用于预防或治疗与癌症(包括乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾脏癌、肺癌、食道癌、直肠癌、膀胱癌、子
宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌以及胃肠癌)、多发性骨髓瘤、淋巴瘤和霍奇金氏病(Hodgkin’s Disease)相关的骨损失。
[0158] 该配制品可按任何适合的时间表给予。在一个实施例中，该给予按每四周一次的时间表。任选地，该给予可包括在疗法的第一个月的第8天和第15天给予。在另一类型的实施例中，该给予可按每六个月一次的时间表。例如，设想每六个月一次的时间表用于骨质疏松症和增加骨质量。其他设想的维持剂量为每3周、每3个月和每6周。
[0159] 在一些方面中，该水性药物配制品用于治疗患有多发性骨髓瘤或实体肿瘤骨转移的患者。在某些方面中，该配制品以每4周约120mg的剂量呈皮下注射形式给予至上臂、大腿或腹部。
[0160] 在一些方面中，该水性药物配制品用于治疗患有骨巨细胞瘤的患者。在某些方面中，该配制品以每4周约120mg的剂量给予，其中在疗法的第一个月的第8天和第15天给予额外120mg剂量。在一些方面中，该配制品经皮下给予至患者的上臂、大腿或腹部。在一些情况下，向该患者给予钙和维生素D以治疗或预防低钙血症。
[0161] 在一些方面中，该水性药物配制品用于治疗患有恶性高钙血症的患者。在某些方面中，该配制品以每4周约120mg的剂量给予，其中在疗法的第一个月的第8天和第15天给予额外120mg剂量。在一些方面中，该配制品经皮下给予至上臂、大腿或腹部。
[0162] 在一些方面中，该水性药物配制品用于治疗处于高骨折风险下的患有骨质疏松症的绝经后女性，或者用于增加因非转移性前列腺癌而接受雄性素剥夺疗法的处于高骨折风险下的男性或因乳腺癌而接受辅助芳香酶抑制剂疗法的处于高骨折风险下的女性的骨质量。在一些方面中，该水性药物配制品由保健专业人士且以每6个月60mg的剂量呈皮下注射形式给予至上臂、大腿或腹部。在一些方面中，也指导该患者服用1000mg钙/每日和至少400IU维生素D/每日。
[0163] 根据本披露内容的一种类型的配制品将含有迪诺苏单抗、乙酸盐和精氨酸。该精氨酸任选地为L-精氨酸。该精氨酸任选地为L-精氨酸盐酸盐。该配制品可任选地包括山梨醇。该配制品可任选地包括聚山梨醇酯。该聚山梨醇酯可任选地为聚山梨醇酯20。pH值可任选地为约5.0至约5.2、或低于5.2。
[0164] 根据本披露内容的另一类型的配制品将含有迪诺苏单抗、乙酸盐和苯丙氨酸。该配制品可任选地包括山梨醇。该配制品可任选地包括聚山梨醇酯。该聚山梨醇酯可任选地为聚山梨醇酯20。pH值可任选地为约5.0至约5.2、或低于5.2。举例而言，该配制品可包括pH 5.1、浓度为约108mg/mL至约132mg/mL的迪诺苏单抗、约28.8mM至约35.2mM乙酸盐、33.3mM至约40.7mM苯丙氨酸、3.51％(w/v)至约4.29％(w/v)山梨醇以及约0.009％(w/v)至约
0.011％(w/v)聚山梨醇酯20，并且可任选地包括在任选地含有约1mL或少于约1mL(例如，约
0.5mL)配制品的PFS中。例如，该配制品可包括pH 5.1、浓度为120mg/mL的迪诺苏单抗、32mM乙酸盐、37mM苯丙氨酸、3.9％(w/v)山梨醇以及0.01％(w/v)聚山梨醇酯20，并且可任选地包括在任选地含有约1mL或少于约1mL(例如，约0.5mL)配制品的PFS中。可通过使用含有
20mM乙酸盐、4.2％(w/v)山梨醇以及40mM苯丙氨酸的渗滤缓冲剂(pH 4.7)来浓缩迪诺苏单抗而制造该配制品。
[0165] 根据本披露内容的另一类型的配制品将含有迪诺苏单抗、谷氨酸盐以及精氨酸。该精氨酸任选地为L-精氨酸。该精氨酸任选地为L-精氨酸盐酸盐。该配制品可任选地包括山梨醇。该配制品可任选地包括聚山梨醇酯。该聚山梨醇酯可任选地为聚山梨醇酯20。pH值可任选地为约5.0至约5.2、或低于5.2。
[0166] 根据本披露内容的另一类型的配制品将含有迪诺苏单抗、乙酸盐、精氨酸以及苯丙氨酸。该配制品可任选地包括山梨醇。该配制品可任选地包括聚山梨醇酯。该聚山梨醇酯可任选地为聚山梨醇酯20。pH值可任选地为约5.0至约5.2、或低于5.2。
[0167] 根据本披露内容的另一类型的配制品将含有迪诺苏单抗、谷氨酸盐、精氨酸以及苯丙氨酸。该精氨酸任选地为L-精氨酸。该精氨酸任选地为L-精氨酸盐酸盐。该配制品可任选地包括山梨醇。该配制品可任选地包括聚山梨醇酯。该聚山梨醇酯可任选地为聚山梨醇酯20。pH值可任选地为约5.0至约5.2、或低于5.2。
[0168] 可通过任何适合的方法来制造根据本披露内容的配制品。在一种类型的方法中，可制备浓度低于70mg/mL的含有抗RANKL单克隆抗体(例如迪诺苏单抗)的溶液，可向该溶液中添加适量的本文中所描述的氨基酸聚集抑制剂，并且随后可将该溶液浓缩至高于本文中所描述的70mg/mL的量，例如120mg/mL。任选地，可首先过度浓缩该溶液，即，达到抗RANKL单克隆抗体(例如迪诺苏单抗)的浓度高于最终目标浓度，随后可例如用经pH调节的缓冲溶液将该过度浓缩的溶液稀释至最终目标浓度和pH值。例如，过度浓缩可获得处于130mg/mL至300mg/mL或180mg/mL至300mg/mL的范围内的抗RANKL单克隆抗体(例如迪诺苏单抗)的量。
浓缩之前的迪诺苏单抗初始浓度不受特定限制，并且可为例如约1mg/mL、或约2mg/mL、或约
5mg/mL、或约8mg/mL、或约10mg/mL、或约20mg/mL、或约30mg/mL、或约40mg/mL、或约50mg/mL、或约60mg/mL、或约70mg/mL，或处于由任何这种浓度包夹的范围内，例如约1mg/mL至约
70mg/mL或约1mg/mL至约10mg/mL。
[0169] 可通过任何适合的方法对该配制品进行浓缩。在一个方面中，该浓缩方法可包括离心。在另一方面中，该浓缩方法可包括
超滤。
[0170] 可通过任何适合的方法将该氨基酸聚集抑制剂引入至该配制品中。例如，可经由简单添加(掺加)至该配制品中，例如，如以下实例中所描述而将该氨基酸聚集抑制剂引入至该配制品中。在另一方法中，可经由相对于含有该氨基酸聚集抑制剂的缓冲溶液进行渗滤，例如，如以下实例中所描述而将该氨基酸聚集抑制剂引入至该配制品中。可在将该抗RANKL单克隆抗体浓缩至70mg/mL以上之前或之后将该氨基酸聚集抑制剂引入至该配制品中。如以下实例中所示，在浓缩之前将该氨基酸聚集抑制剂添加至该溶液为有益的，因为其可抑制浓缩过程中的聚集。
[0171] 因此，本披露内容提供制造包含人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其抗原结合部分的稳定水性药物配制品的方法。在示例性情况下，该方法包括组合浓度高于70mg/mL的该抗RANKL单克隆抗体或其抗原结合部分与氨基酸聚集抑制剂、缓冲剂、表面活性剂以及任选地张力改良剂。该抗体或抗原结合部分可为本文中所描述的那些中的任一者，且该抗体或其抗原结合部分的浓度可能与本文中的教导一致。该氨基酸聚集抑制剂可为本文中所描述的那些中的任一者。例如，该氨基酸聚集抑制剂可为带正电氨基酸、芳族氨基酸或疏水性氨基酸。该氨基酸聚集抑制剂可与如本文中所描述的抗体呈摩尔比。聚集抑制剂、表面活性剂、张力改良剂和缓冲剂的量以及选择如以上所描述。本披露内容也提供通过本文中所描述的制造方法制造的配制品。
[0172] 根据本文中披露内容的配制品可包括对本文中所描述的抗RANKL单克隆抗体(例如迪诺苏单抗)的高浓度溶液，例如浓度高于70mg/mL或120mg/mL的溶液进行pH值调节。在另一方面中，可通过对抗RANKL单克隆抗体(例如迪诺苏单抗)的低浓度溶液进行pH值调节，随后将该溶液浓缩至所期望的较高最终浓度来制备该配制品。适合的pH值调节剂是本领域已知的。
[0173] 实施例
[0174] 以下为特定设想实施例的清单：
[0175] 1.一种水性药物配制品，其包含浓度高于70mg/mL的人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其抗原结合部分且具有处于约5.0至低于5.2的范围内的pH值。
[0176] 2.如实施例1所述的配制品，其具有处于约5.0至5.19、或约5.0至约5.15、或约5.0至约5.1的范围内的pH值。
[0177] 3.如实施例2所述的配制品，其具有约5.1的pH值。
[0178] 4.如实施例1至实施例3中任一项所述的配制品，其进一步包含氨基酸聚集抑制剂。
[0179] 5.一种水性药物配制品，其包含人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其抗原结合部分与氨基酸聚集抑制剂的混合物。
[0180] 6.如实施例5所述的配制品，其具有处于约5.0至约5.4、或约5.0至约5.2、或约5.0至低于5.2、或约5.0至5.19、或约5.0至约5.15、或约5.0至约5.1的范围内的pH值。
[0181] 7.如实施例6所述的配制品，其具有约5.1的pH值。
[0182] 8.如前述实施例中任一项所述的配制品，其进一步包含pH值缓冲剂。
[0183] 9.如实施例5至实施例8中任一项所述的配制品，其中该抗体或其抗原结合部分的浓度处于约10mg/mL至约200mg/mL的范围内。
[0184] 10.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该抗体或其抗原结合部分的浓度处于高于70mg/mL至约200mg/mL的范围内。
[0185] 11.如实施例10所述的配制品，其中该抗体或其抗原结合部分的浓度处于约100至约140mg/mL的范围内。
[0186] 12.如实施例11所述的配制品，其中该抗体或其抗原结合部分的浓度为约120mg/mL。
[0187] 13.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该抗体为迪诺苏单抗或其生物类似物。
[0188] 14.如实施例13所述的配制品，其中该抗体为迪诺苏单抗。
[0189] 15.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该氨基酸聚集抑制剂选自一或多种氨基酸、其二肽或具有2至10个残基的寡肽。
[0190] 16.如实施例15所述的配制品，其中该氨基酸聚集抑制剂包括至少两种氨基酸的混合物。
[0191] 17.如实施例16所述的配制品，其中该氨基酸包括精氨酸及苯丙氨酸。
[0192] 18.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该氨基酸聚集抑制剂选自一或多种疏水性氨基酸、其二肽或者具有2至10个残基且含有一或多个疏水性氨基酸的寡肽。
[0193] 19.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该氨基酸聚集抑制剂选自一或多种带有带电侧链的氨基酸、其二肽或者具有2至10个残基且含有一或多个带有带电侧链的氨基酸的寡肽。
[0194] 20.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该氨基酸聚集抑制剂选自一或多种碱性氨基酸、其二肽或者具有2至10个残基且含有一或多个碱性氨基酸的寡肽。
[0195] 21.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该氨基酸聚集抑制剂选自一或多种二肽。
[0196] 22.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该氨基酸聚集抑制剂选自一或多种具有2至10个氨基酸残基的寡肽。
[0197] 23.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该氨基酸聚集抑制剂包含精氨酸残基，或该氨基酸聚集抑制剂包含精氨酸。
[0198] 24.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该氨基酸聚集抑制剂包含精氨酸-苯丙氨酸二肽。
[0199] 25.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该氨基酸聚集抑制剂以处于约10mM至约200mM的范围内的浓度存在于该配制品中。
[0200] 26.如前述实施例中任一项所述的配制品，其进一步包含表面活性剂。
[0201] 27.如实施例26所述的配制品，其中该表面活性剂选自由以下组成的组：聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)，或者一或多种烷基芳基聚醚，例如氧乙基化烷基酚(例如 X-100)，或者一或多种泊洛沙姆(例如 如F68)及其组合。
[0202] 28.如实施例26或实施例27所述的配制品，其中该表面活性剂以处于约0.004％(w/v)至约0.1％(w/v)的范围内的浓度存在。
[0203] 29.如实施例28所述的配制品，其中该表面活性剂以约0.01％(w/v)的浓度存在。
[0204] 30.如前述实施例中任一项所述的配制品，其进一步包含缓冲剂。
[0205] 31.如实施例30所述的配制品，其中该缓冲剂在25℃下以约pH 4至约pH 5.5的范围为中心。
[0206] 32.如实施例30或实施例31所述的配制品，其中该缓冲剂在25℃下具有处于pH 5.0-5.2的一个pH值单位内的pKa。
[0207] 33.如实施例30至实施例32中任一项所述的配制品，其中该缓冲剂包含乙酸盐。
[0208] 34.如实施例30至实施例32中任一项所述的配制品，其中该缓冲剂包含谷氨酸盐。
[0209] 35.如前述实施例中任一项所述的配制品，其进一步包含张力改良剂。
[0210] 36.如实施例35所述的配制品，其中该张力改良剂选自山梨醇、甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、甘油及其组合中的一或多种。
[0211] 37.如实施例36所述的配制品，其中该张力改良剂包含山梨醇。
[0212] 38.如前述实施例中任一项所述的配制品，其进一步包含一或多种选自糖、聚醇、增溶剂(例如N-甲基-2-吡咯烷酮)、疏水性稳定剂(例如脯氨酸)、聚乙二醇、环糊精及其组合的其他赋形剂。
[0213] 39.如前述实施例中任一项所述的配制品，依据SE-UHPLC，其在37℃下储存三个月后包含少于2％的该人类抗RANKL单克隆抗体的高分子量物质。
[0214] 40.如前述实施例中任一项所述的配制品，依据SE-UHPLC，其在4℃下储存36个月后包含少于2％的该人类抗RANKL单克隆抗体的高分子量物质。
[0215] 41.如前述实施例中任一项所述的配制品，依据SE-UHPLC，其在37℃下储存三个月后包含至少98％的抗体主峰。
[0216] 42.如前述实施例中任一项所述的配制品，依据SE-UHPLC，其在4℃下储存36个月后包含至少98％的抗体主峰。
[0217] 43.如前述实施例中任一项所述的配制品，其包含迪诺苏单抗；氨基酸聚集抑制剂，该氨基酸聚集抑制剂选自精氨酸、其二肽或具有2至10个残基且包含精氨酸的寡聚物中的一或多种；乙酸盐缓冲剂；山梨醇；以及表面活性剂，并且该配制品具有处于约5.0至低于5.2的范围内的pH值。
[0218] 44.如实施例43所述的配制品，其中该氨基酸聚集抑制剂选自精氨酸、精氨酸-精氨酸或精氨酸-苯丙氨酸。
[0219] 45.如实施例43所述的配制品，其中该氨基酸聚集抑制剂包含精氨酸与苯丙氨酸的混合物。
[0220] 46.如实施例43至实施例45中任一项所述的配制品，其中该乙酸盐缓冲剂以约5mM至约25mM的范围存在。
[0221] 47.如实施例43至实施例46中任一项所述的配制品，其中该山梨醇以0.1％(w/v)至5％(w/v)的范围存在。
[0222] 48.如实施例43至实施例47中任一项所述的配制品，其中该表面活性剂选自聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80中的一或多种。
[0223] 49.如实施例43至实施例48中任一项所述的配制品，其中该pH值处于约5.0至约5.15的范围内。
[0224] 50.如实施例49所述的配制品，其中该pH值为约5.10。
[0225] 51.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该配制品适于皮下注射。
[0226] 52.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该配制品无菌且不含防腐剂。
[0227] 53.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该人类抗RANKL单克隆抗体或其抗原结合部分包含(1)含有SEQ ID NO:2的重链可变区和含有SEQ ID NO:1的轻链可变区；或(2)分别含有SEQ ID NO:8、9及10的重链CDR1、CDR2和CDR3区，以及分别含有SEQ ID NO:5、6及7的轻链CDR1、CDR2和CDR3区。
[0228] 54.如前述实施例中任一项所述的配制品，其中该人类抗RANKL单克隆抗体或其抗原结合部分为抗体。
[0229] 55.如实施例1至53中任一项所述的配制品，其中该人类抗RANKL单克隆抗体或其抗原结合部分为抗原结合部分。
[0230] 56.一种小瓶、预填充注射器或玻璃容器，其含有如实施例1至实施例55中任一项所述的配制品。
[0231] 57.如实施例56所述的小瓶、预填充注射器或玻璃容器，其含有约1mL或更少之该配制品。
[0232] 58.一种预防有需要的患者的骨骼相关事件(SRE)的方法，其包括给予有效量的如实施例1至实施例55中任一项所述的配制品。
[0233] 59.如实施例58所述的方法，其中该SRE选自由以下组成的组：病理性骨折、针对骨得放射疗法、针对骨的手术以及脊髓压迫。
[0234] 60.如实施例58或实施例59所述的方法，其中该患者患有实体肿瘤骨转移。
[0235] 61.如实施例60所述的方法，其中该实体肿瘤选自乳腺癌、前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌以及肾细胞癌。
[0236] 62.如实施例58或实施例59所述的方法，其中该患者患有多发性骨髓瘤。
[0237] 63.如实施例58至实施例62中任一项所述得方法，其包括给予可有效减少骨转换标记物尿肌酸酐修正N-末端端肽(uNTx/Cr)，任选地减少至少80％的量的该配制品。
[0238] 64.一种治疗有需要的患者的骨巨细胞瘤的方法，其包括给予有效量的如实施例1至实施例55中任一项所述的配制品。
[0239] 65.如实施例64所述的方法，其中该患者患有复发性、不可切除性或手术切除有可能引起严重发病得骨巨细胞瘤。
[0240] 66.一种治疗有需要的患者的恶性高钙血症的方法，其包括给予有效量的如实施例1至实施例55中任一项所述的配制品。
[0241] 67.如实施例66所述的方法，其中该恶性病为双膦酸盐疗法难治性的。
[0242] 68.如实施例66或实施例67所述的方法，其包括给予可有效减少该患者得血清钙或将其维持在低于或等于约11.5mg/dL的水平的量的该配制品。
[0243] 69.如实施例58至实施例68中任一项所述的方法，其中该配制品包含浓度为约120mg/mL的该人类抗RANKL抗体。
[0244] 70.如实施例58至实施例69中任一项所述的方法，其包括按每四周一次的时间表给予该配制品。
[0245] 71.如实施例58至实施例70中任一项所述的方法，其包括在疗法的第一个月的第8天和第15天给予该配制品。
[0246] 72.一种治疗有需要的患者的骨质疏松症的方法，其包括给予有效量的如实施例1至实施例55中任一项所述的配制品。
[0247] 73.如实施例72所述的方法，其中该患者为处于高骨折风险下的绝经后女性。
[0248] 74.如实施例72所述的方法，其中该患者为处于高骨折风险下的男性。
[0249] 75.一种增加有需要的患者的骨质量的方法，其包括给予有效量的如实施例1至实施例55中任一项所述的配制品。
[0250] 76.如实施例75所述的方法，其中该患者患有骨质疏松症。
[0251] 77.如实施例75所述的方法，其中该患者为因乳腺癌而接受辅助芳香酶抑制剂疗法的处于高骨折风险下的女性。
[0252] 78.如实施例75所述的方法，其中该患者为因非转移性前列腺癌而接受雄性素剥夺疗法的处于高骨折风险下的男性。
[0253] 79.如实施例75至实施例78中任一项所述的方法，其包括给予可有效降低新的脊椎骨折和/或非脊椎骨折的发生率的量的该配制品。
[0254] 80.如实施例75至实施例79中任一项所述的方法，其包括给予可有效减少骨吸收的量的该配制品。
[0255] 81.如实施例75至实施例80中任一项所述的方法，其包括给予可有效增加该患者的选自腰椎、全髋和股骨颈的至少一个区域中的
骨密度的量的该配制品。
[0256] 82.如实施例75至实施例81中任一项所述的方法，其包括给予可有效增加该患者的皮质骨和/或松质骨中的骨质量的量的该配制品。
[0257] 83.如实施例75至实施例82中任一项所述的方法，其包括给予可有效减少骨吸收标记物血清1型C-端肽(CTX)的量的该配制品。
[0258] 84.如实施例75至实施例83中任一项所述的方法，其包括按每六个月一次的时间表给予该配制品。
[0259] 85.如实施例58至实施例84中任一项所述的方法，其包括以1mL或更小的体积给予该配制品。
[0260] 86.如实施例58至实施例85中任一项所述的方法，其包括经皮下给予该配制品。
[0261] 87.如实施例86所述的方法，其包括将该配制品皮下给予至上臂、大腿或腹部。
[0262] 88.如实施例58至实施例87中任一项所述的方法，其中该患者接受钙和维生素D中的一或二者。
[0263] 89.一种改良包含浓度超过70mg/mL的人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其抗原结合部分的水性药物配制品的稳定性的方法，其包括：
[0264] 制备pH值处于约5.0至低于5.2范围内的包含该人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其抗原结合部分的该水性药物配制品；
[0265] 其中与不在约5.0至低于5.2范围内的pH值下的等效水性药物配制品相比，该水性药物配制品在约5.0至低于5.2范围内的pH值下显示改良的稳定性。
[0266] 90.一种改良包含人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其抗原结合部分的水性药物配制品的稳定性的方法，其包括：
[0267] 制备包含该人类抗人类核因子κ-B受体活化因子配体(抗RANKL)单克隆抗体或其抗原结合部分与氨基酸聚集抑制剂的混合物的该水性药物配制品；
[0268] 其中与不含该氨基酸聚集抑制剂的等效水性药物配制品相比，该水性药物配制品在存在该氨基酸聚集抑制剂的情况下显示改良的稳定性。
[0269] 实例
[0270] 提供以下实例用于说明而不意欲限制本发明的范围。贯穿本文中所提供的实例，使用以下缩写：DF，渗滤；PS20，聚山梨醇酯20；HCl，盐酸盐；UF/DF，超滤/渗滤；F#，配制品编号；HMWS，高分子量物质；SE-UHPLC，粒径排阻超高效液相色谱。另外，贯穿这些实例，提供了用于制造包含迪诺苏单抗的最终配制品的DF缓冲剂或
透析缓冲剂的组成以及最终配制品的组分的估计浓度。储存并且随后分析稳定性的最终配制品的某些组分的最终浓度可与DF或透析缓冲剂的浓度不同，视存在或不存在抗衡离子(例如盐酸盐)而定。不存在抗衡离子时，配制品具有低离子强度。在这种情况下，乙酸盐与迪诺苏单抗共浓缩，使得最终配制品包含相对于DF或透析缓冲剂的浓度而言较高的乙酸盐浓度。例如，当DF缓冲剂或最终配制品皆不包含抗衡离子(例如盐酸盐)且因而具有低离子强度时，使用包含10mM乙酸盐的DF缓冲剂导致最终迪诺苏单抗(120mg/mL)配制品(pH 5.1)中存在约23mM乙酸盐。类似地，不存在抗衡离子(例如盐酸盐)时，包含20mM乙酸盐的DF缓冲剂导致最终迪诺苏单抗(120mg/mL)配制品(pH 5.1)中存在约32mM乙酸盐。当存在抗衡离子(例如精氨酸盐酸盐的盐酸盐)时，乙酸盐不与迪诺苏单抗共浓缩，且因此DF缓冲剂的乙酸盐浓度及最终组合物的乙酸盐浓度一般相等。另外，赋形剂可受到体积排阻，或可受到非特异性相互作用影响。举例而言，在120mg/mL迪诺苏单抗配制品中，苯丙氨酸和山梨醇浓度比DF缓冲剂中所指示的浓度低大约
7％至10％，并且精氨酸浓度低大约10％至15％。根据上文，贯穿以下实例，在考虑以上所描述的赋形剂排阻和乙酸盐共浓缩效应的情况下，提供了最终配制品的组分的浓度。
[0271] 实例1
[0272] 初步评估十二种配制品最小化高浓度液体迪诺苏单抗配制品(120mg/mL)中HMWS的量(％)及其随时间的形成的作用。配制品替代方案包括缓冲剂类型、稳定剂及溶液pH值方面的变化。以下表1中描述所测试的配制品A至L。所有引用的缓冲剂值均关于渗滤抗体所针对的缓冲剂浓度。缓冲剂交换后向该溶液中添加各赋形剂及表面活性剂，达至该表中所指示的水平。尽管未测量本发明配制品中的乙酸盐浓度，但针对10mM乙酸盐渗滤的120mg/mL迪诺苏单抗配制品与山梨醇具有介于25mM与35mM乙酸盐之间的近似最终乙酸盐值。
[0273] 将乙酸盐(pH 5.2)中的迪诺苏单抗(70mg/mL)相对于10mM乙酸盐(pH5.2)进行UF/DF，并且浓缩至160mg/mL。在10mM乙酸盐(pH 5.2)中制备由以下组成的储备溶液：
[0274] 35％山梨醇
[0275] 1％聚山梨醇酯20
[0276] 1％聚山梨醇酯80
[0277] 30％ F-68
[0278] 3％TritonTM X-100
[0279] 250mM L-精氨酸盐酸盐
[0280] 250mM N-乙酰基精氨酸(NAR)
[0281] 250mM N-乙酰基赖氨酸(NAK)
[0282] 250mM脯氨酸
[0283] 250mM聚乙二醇(PEG)3350
[0284] 250mM 环糊精
[0285] 为了获得配制品A至J，将用10mM乙酸盐(pH 5.2)制备的160mg/mL物质用10mM乙酸盐(pH 5.2)稀释至120mg/mL，接着添加对应的山梨醇、赋形剂和/或表面活性剂储备溶液至表1中所列出的目标最终浓度。为了获得配制品K及L，通过离心对来自160mg/mL物质的两份独立等分试样，分别为自缓冲配制品及谷氨酸盐配制品，进行额外缓冲剂交换。随后使用相应的缓冲剂将配制品K和L的物质稀释至120mg/mL，接着添加对应的山梨醇及聚山梨醇酯20储备溶液，至表1中的配制品表中所列出的目标最终浓度。
[0286] 表1
[0287]
[0288] 图1显示在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随配制品和时间而变化。由大约10mM谷氨酸盐缓冲剂、10mM L-精氨酸盐酸盐、2.4％(w/v)作为张力改良剂的山梨醇、0.01％(w/v)作为表面活性剂的聚山梨醇酯20组成且处于5.0的pH值下的配制品L显示在37℃下HMWS的起始量减少(表明已形成的聚集物存在一定程度的减少)与HMWS动态形成减少。
[0289] 实例2
[0290] 在37℃的温度下评估10mM乙酸盐、75mM L-精氨酸、2.4％(w/v)山梨醇、0.01％(w/v)聚山梨醇酯20赋形剂配制品和10mM乙酸盐、5％(w/v)山梨醇、0.01％(w/v)聚山梨醇酯20赋形剂配制品(各自含高浓度(120mg/mL)迪诺苏单抗)多达1个月显示pH值及氨基酸聚集抑制剂对HMWS形成速率及程度的影响。以下表2中描述所测试的配制品。所有引用的缓冲剂和赋形剂值均关于渗滤抗体所针对的缓冲剂和赋形剂浓度。
[0291] 为了制备测试样品M至Q，将乙酸盐(pH 5.2)中的迪诺苏单抗(70mg/mL)的3mL等分试样针对500mL以下所描述的DF缓冲剂进行透析，其中进行总计3次缓冲剂更换以实现先前配制品的100万倍稀释，从而确保完全缓冲剂交换。随后使用离心机-浓缩器对材料进行过度浓缩，接着稀释至120mg/mL，并且添加聚山梨醇酯20至0.01％的最终浓度。
[0292] 表2
[0293]
[0294] 图2显示在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随配制品和时间而变化。图3显示在37℃下储存1个月后粒径排阻色谱图随配制品而变化。
[0295] 随着溶液pH值降低，大聚集物的形成增加。在低于4.8且尤其4.5的pH值下，大聚集物主要是HWMS，其中对于测试配制品而言在pH 4.5下大聚集物显著增加。如图3中所示，配制品P和Q具有最低量的高级HWMS(滞留时间约6分钟)，接着为具有降低的pH值的比较配制品O、N和M。
[0296] 然而，在pH值增加时，一般引起二聚物物质增加。如图3中所示，配制品N具有最低量的二聚物物质(滞留时间约6.8分钟)，接着为配制品M、O、P及Q。
[0297] 在37℃下1个月之后，配制品O中存在浓度为75mM的精氨酸在与具有相同pH值但不含精氨酸的配制品P相比时引起二聚物物质的量及其动态形成速率分别降低大约0.3％及25％。
[0298] 实例3
[0299] 此实例显示pH值对高浓度迪诺苏单抗配制品的影响。
[0300] 将迪诺苏单抗(浓度为120mg/mL)与乙酸盐、山梨醇及聚山梨醇酯20(PS20)在有或无氨基酸聚集抑制剂的情况下以以下三个不同的pH值配制：4.8、5.1及5.4。在此研究中，该氨基酸聚集抑制剂为L-精氨酸盐酸盐。所有配制品均通过交换含有较低浓度的迪诺苏单抗的初始溶液的缓冲剂，接着过度浓缩该迪诺苏单抗材料，随后用所期望量的缓冲剂、赋形剂和表面活性剂稀释该迪诺苏单抗材料来制造。简而言之，将乙酸盐(pH 5.2)中的迪诺苏单抗(70mg/mL)(初始材料)的等分试样针对如表3A中所描述的DF缓冲剂进行透析，其中进行总计3次缓冲剂更换以达成初始材料的100万倍稀释，从而确保完全缓冲剂交换。随后使用离心机-浓缩器将经缓冲剂交换的迪诺苏单抗材料浓缩至高于120mg/mL的迪诺苏单抗浓度，并且随后稀释经浓缩的材料以达到120mg/mL迪诺苏单抗的浓度。添加PS20达到0.01％的最终浓度。
[0301] 基于高浓度蛋白质的电荷状态而认为其有助于溶液pH值。增加配制品1的乙酸盐浓度以达到目标最终pH值，并且使配制品2和3的乙酸盐浓度与配制品1的乙酸盐浓度相匹配。配制品4至6的乙酸盐浓度需要甚至更高量的乙酸盐以便匹配配制品1至3的最终乙酸盐浓度，这是由于乙酸盐在盐酸盐存在下未能共浓缩。配制品7充当对照物以确保配制品4至6中增加的乙酸盐浓度不会妨碍精氨酸盐酸盐配制品中的蛋白质稳定性。
[0302] 表3A中描述此研究中制造并测试的不同的迪诺苏单抗配制品。
[0303] 表3A
[0304]
[0305]
[0306] *最终配制品包含120mg/mL迪诺苏单抗和最终浓度为0.01％(w/v)的PS20，且具有所指示的pH值。山梨醇浓度估计比DF缓冲剂的山梨醇浓度低8.5％。精氨酸浓度估计比DF缓冲剂的精氨酸浓度低12.5％。
[0307] 将各配制品的样品以1mL的填充体积填充至容器中，并且储存在37℃的温度下达4周。使用SE-UHPLC来评定聚集抑制和一定时间内针对聚集抑制的稳定性(如基于HMWS和二聚物物质的形成)。在初始条件下以及在储存时段期间和之后比较这些配制品的聚集抑制概况。
[0308] 在37℃下通过SE-UHPLC监测HMWS百分比随配制品和时间的变化。图4表示配制品1至7的HMWS百分比随时间而变化的图，并且表3B提供该图的数据点。
[0309] 表3B
[0310]
[0311] 左侧纵行中所示的F#与表3A的F#一致。
[0312] 图5显示各配制品在37℃下储存1个月后的粒径排阻色谱图。不含精氨酸的配制品示于左图中，而含精氨酸的配制品示于右图中。
[0313] 如图4中所示，含精氨酸的配制品的效能优于不含精氨酸盐酸盐的对照配制品，并且pH 5.1配制品的效能优于pH 4.8和pH 5.4的相当的配制品。对于不含精氨酸盐酸盐的配制品1至3，在溶液pH值增至5.4时，二聚物物质增加(图5A)。对于含有精氨酸盐酸盐的配制品4至6，在溶液pH值降至4.8时，较大聚集物的形成增加，以及在溶液pH值增至5.4时，二聚物物质增加(图5B)。与不存在精氨酸盐酸盐的配制品2相比，在溶液pH值为5.1时，存在精氨酸盐酸盐的配制品6具有最低量的总HMWS。另外，配制品7表现显示乙酸盐缓冲剂浓度自10mM增至40mM对HMWS形成具有相对较小的影响。
[0314] 实例4
[0315] 此实例显示包含不同迪诺苏单抗浓度的不同迪诺苏单抗配制品的pH值与HMWS形成之间的关系。
[0316] 评估15mg/mL至150mg/mL的迪诺苏单抗蛋白浓度以便评定不同的蛋白质浓度下和75mM精氨酸盐酸盐浓度下的HMWS形成的pH敏感度。在各测试蛋白质浓度(15、60、120和
150mg/mL)下评估两种pH值，即，pH 4.8和5.1。
[0317] 此研究中评估总计8种配制品(配制品8至15；描述于表4A中)。为了制备这些配制品，将乙酸盐(pH 5.2)中的迪诺苏单抗(70mg/mL)的两份等分试样相对于表4A中所描述的相应DF缓冲剂进行透析。第1号与第2号透析方案进行了总计3次缓冲剂更换以达到先前配制品的100万倍稀释，从而确保完全缓冲剂交换。对于配制品8、9、12和13，在透析后，移出表4A中所描述的第1号与第2号透析方案各自的等分试样以制备稀释步骤。随后使用离心机-浓缩器过度浓缩其余材料，接着稀释至表4A中所列出的对应迪诺苏单抗浓度并且添加PS20达到0.01％的最终浓度。
[0318] 表4A
[0319]
[0320]
[0321] *最终配制品包含最终浓度为0.01％(w/v)的PS20，并且具有所指示的pH值。乙酸盐的估计浓度为10mM，山梨醇浓度估计比DF缓冲剂的山梨醇浓度低约8.5％。精氨酸浓度估计为65mM。山梨醇浓度估计为2.2％(w/v)。
[0322] 将这些配制品以1mL的填充体积填充至容器中，并且储存在37℃的温度下达1个月。使用SE-UHPLC来评定聚集抑制和一定时间内针对聚集抑制的稳定性(如基于HMWS和二聚物物质的形成)。在初始条件下以及在储存时段期间和之后比较这些配制品的聚集抑制概况。
[0323] 图6表示各配制品在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随储存时间而变化的图，且表4B提供该图的数据点。
[0324] 表4B
[0325]
[0326]
[0327] 图7A和图7B显示在37℃下储存1个月后粒径排阻色谱图随配制品而变化。如图6中所示，％HMWS随蛋白质浓度增加而增加。pH 4.8的配制品8至11与pH 5.1的对应配制品(配制品12至15)相比一致具有较高水平的HMWS。pH 4.8下的％HMWS增加是由于图7A(上)中所示的约5.75分钟时的大聚集物峰所致。尽管溶液pH 5.1的％HMWS随蛋白质浓度增加而具有增加的二聚物物质，但总HMWS低于溶液pH 4.8的对应蛋白质浓度(图7B(下))。
[0328] pH 5.1相对于pH 4.8的HMWS水平差异随迪诺苏单抗浓度增加而变大，其中迪诺苏单抗浓度愈高，该差异愈大。
[0329] 实例5
[0330] 评估含各种浓度的精氨酸、NAR以及由精氨酸-精氨酸(Arg-Arg)和精氨酸-苯丙氨酸(Arg-Phe)组成的两种二肽的配制品对具有120mg/mL的迪诺苏单抗浓度的溶液的稳定作用。
[0331] 以下表5中描述所测试的配制品。所有引用的乙酸盐和赋形剂(二肽除外)值均关于渗滤抗体所针对的缓冲剂和赋形剂浓度。缓冲剂交换后向该溶液中添加各个二肽至该表中所指示的水平。通过针对以下列出的DF缓冲剂进行UF/DF来获得配制品R至X。通过在单一库中共同针对含有10mM乙酸盐、3.6％山梨醇的DF缓冲剂(pH 4.0)进行UF/DF来获得配制品Y和Z。UF/DF后，将配制品Y和Z的库分成2个，随后掺加来自含有3.6％山梨醇的1M储备溶液(pH 5.1)的Arg-Arg或Arg-Phe二肽。向各配制品中添加聚山梨醇酯20，最终目标浓度为0.01％。在不存在精氨酸的情况下进行乙酸盐共浓缩，使得配制品S至X中的最终乙酸盐浓度为约25mM。浓缩过程中优先排除山梨醇，使得自初始浓度降低约7％至8％(w/v)。
[0332] 将这些配制品以1.0mL的填充体积填充至容器中。将这些配制品储存在2℃至8℃的温度下达12个月并且在25℃、30℃和37℃下达3个月。使用SE-UHPLC来评定稳定性(基于HMWS形成)。将这些二肽配制品在37℃下储存一个月之后的稳定性与37℃下的精氨酸盐酸盐配制品相比较，如图8中所示。
[0333] 表5
[0334]
[0335] 图8显示在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随配制品和时间而变化。结果显示氨基酸聚集抑制剂抑制HMWS的形成。例如，精氨酸-苯丙氨酸二肽显示显著改良，使得与其他配制品相比HMWS减少约0.3％。最低至最高HMWS的等级顺序为Z<
[0336] 实例6
[0337] 此实例显示对迪诺苏单抗的聚集抑制和稳定性随精氨酸和苯丙氨酸的不同浓度以及精氨酸与苯丙氨酸的比较混合物而变化。
[0338] 如以上所描述，鉴定精氨酸盐酸盐(HCl)和精氨酸盐酸盐-苯丙氨酸二肽可减少迪诺苏单抗的初始起始水平和HMWS形成速率。在此研究中，评估含有多种浓度的精氨酸盐酸盐、多种浓度的苯丙氨酸以及精氨酸盐酸盐与苯丙氨酸的组合的配制品对含有迪诺苏单抗(120mg/mL)的溶液的稳定作用。
[0339] 以下表6A中描述测试配制品(配制品16至20)。为了制备这些配制品，将乙酸盐(pH 5.2)中的迪诺苏单抗(70mg/mL)的等分试样针对如表6A中所描述的DF缓冲剂进行透析，其中进行总计3次缓冲剂更换以达到先前配制品的100万倍稀释，从而确保完全缓冲剂交换。
随后使用离心机-浓缩器对材料进行过度浓缩，接着稀释至120mg/mL，并且添加聚山梨醇酯
20至0.01％的最终浓度。配制品16被视为对照配制品。
[0340] 表6A
[0341]
[0342] *最终配制品包含120mg/mL迪诺苏单抗和最终浓度为0.01％(w/v)的PS20，且具有所指示的pH值。山梨醇和苯丙氨酸浓度估计比DF缓冲剂的浓度低约8.5％。精氨酸浓度估计比DF缓冲剂的浓度低约12.5％。
[0343] 将这些配制品以1.0mL的填充体积填充至容器中。将这些配制品储存在37℃的温度下达1个月。使用SE-UHPLC来评定聚集抑制和一定时间内针对聚集抑制的稳定性(如基于HMWS和二聚物物质的形成)。在初始条件下以及在储存时段期间和之后比较这些配制品的聚集抑制概况。
[0344] 图9显示在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随配制品和时间而变化。图10显示在37℃下储存1个月后粒径排阻色谱图随配制品而变化。以下表6B显示在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随配制品和时间而变化。
[0345] 表6B
[0346]
[0347] 所有包含氨基酸聚集抑制剂、精氨酸或苯丙氨酸的配制品(配制品17至20)均优于缺乏任何氨基酸聚集抑制剂的山梨醇对照配制品(配制品16)。当与对照配制品和精氨酸盐酸盐配制品(分别为配制品16和17)相比时，所有含苯丙氨酸的配制品(配制品18、19和20)类似地含有低水平的HMWS(图9)。如图9中所示，含精氨酸盐酸盐和苯丙氨酸的配制品(配制品17至19)的HMWS形成速率类似。包含38mM精氨酸与38mM苯丙氨酸的组合配制品(总计76nM，配制品20)显示比75mM精氨酸配制品(配制品17)更佳的稳定性(图9)，但不比75mM苯丙氨酸配制品(配制品19)更佳(图9)的稳定性。
[0348] 实例7
[0349] 此实例显示对迪诺苏单抗的聚集抑制和稳定性随不同浓度的苯丙氨酸而变化。
[0350] 在先前研究中，鉴定精氨酸盐酸盐和精氨酸盐酸盐-苯丙氨酸二肽可最小化迪诺苏单抗的初始起始水平和HMWS形成速率。评估含有精氨酸盐酸盐、各种浓度的苯丙氨酸以及精氨酸盐酸盐与苯丙氨酸的组合的配制品对含有迪诺苏单抗(120mg/mL)的溶液的稳定作用。
[0351] 以下表7A中描述所测试的配制品。为了制备测试样品A至E，将乙酸盐(pH 5.2)中的迪诺苏单抗(70mg/mL)的等分试样针对以下所描述的DF缓冲剂进行透析，其中进行总计3次缓冲剂更换以达到先前配制品的100万倍稀释，从而确保完全缓冲剂交换。随后使用离心机-浓缩器将材料过度浓缩至大约130mg/mL至150mg/mL，接着稀释至120mg/mL并且添加聚山梨醇酯20至0.01％的最终浓度。配制品A被视为对照配制品。
[0352] 将这些配制品以1.0mL的填充体积填充至容器中。将这些配制品储存在37℃的温度下达1个月。使用SE-UHPLC来评定稳定性(基于HMWS形成)。将这些配制品在37℃下储存一个月之后的稳定性概况与37℃下的山梨醇和精氨酸盐酸盐/山梨醇配制品相比较，如图11A中所示。
[0353] 为了制备测试样品F至K，将乙酸盐(pH 5.2)中的迪诺苏单抗(70mg/mL)的等分试样针对以下所描述的DF缓冲剂进行超滤/渗滤(UF/DF)，总计12倍渗滤体积，以确保完全缓冲剂交换。随后使用超滤将材料过度浓缩至大约200mg/mL，接着稀释至120mg/mL并且添加聚山梨醇酯20至0.01％的最终浓度。这些配制品中的乙酸盐浓度为20mM。配制品F被视为对照配制品。所有引用的乙酸盐和赋形剂值均关于透析抗体所针对的乙酸盐和赋形剂浓度。
[0354] 将这些配制品以1.0mL的填充体积填充至容器中。将这些配制品储存在40℃的温度下达1个月。使用SE-UHPLC来评定稳定性(基于HMWS形成)。将这些配制品在40℃下储存一个月之后的稳定性概况与40℃下的山梨醇和精氨酸盐酸盐/山梨醇配制品相比较，如图11B中所示。
[0355] 表7A
[0356]
[0357]
[0358] *最终配制品包含120mg/mL迪诺苏单抗和最终浓度为0.01％(w/v)的PS20，且具有所指示的pH值。山梨醇和苯丙氨酸浓度估计比DF缓冲剂的浓度低约8.5％。精氨酸浓度估计比DF缓冲剂的浓度低约12.5％。
[0359] 图11A和表7B显示在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随配制品和时间而变化。图11B和表7C显示在40℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随配制品和时间而变化。图12A及图12B分别显示在37℃和40℃下储存1个月后粒径排阻色谱图随配制品而变化。
[0360] 表7B
[0361]
[0362] 表7C
[0363]
[0364]
[0365] 当与山梨醇和精氨酸盐酸盐/山梨醇配制品(分别为配制品A和B)相比时，所有苯丙氨酸配制品(配制品C、D、E、G至K)均含有较低水平的HMWS。当与精氨酸/山梨醇配制品(配制品B)相比时，精氨酸盐酸盐与苯丙氨酸的组合配制品具有类似稳定性。所有配制品均优于山梨醇对照配制品(配制品A和F)。
[0366] 实例8
[0367] 此实例显示对不同的氨基酸聚集抑制剂的评估。
[0368] 通过制备八种含疏水性、芳族或极性/带电氨基酸的配制品来对不同的氨基酸聚集抑制剂进行评估，以确定其对最小化高浓度液体迪诺苏单抗配制品(120mg/mL)中的HMWS的量(％)和一定时间内的HMWS形成的影响。相对于不含任何氨基酸聚集抑制剂和因等渗性而存在的较高量山梨醇的对照配制品(配制品26)，该配制品包括八种L-氨基酸之一和减少量的山梨醇。
[0369] 将所测试的氨基酸聚集抑制剂分组至三个组(第I组至第III组)之一中，并且各组含有如下量的氨基酸聚集抑制剂：
[0370] I.芳族氨基酸：
[0371] (a)38mM苯丙氨酸(配制品27)；
[0372] (b)38mM色氨酸(配制品28)；
[0373] II.极性/带电氨基酸：
[0374] (a)75mM精氨酸盐酸盐(配制品29)；
[0375] (b)75mM赖氨酸(配制品30)；
[0376] (c)75mM组氨酸(配制品31)；
[0377] III.疏水性氨基酸：
[0378] (a)38mM亮氨酸(配制品32)；
[0379] (b)38mM异亮氨酸(配制品33)；
[0380] (c)38mM缬氨酸(配制品34)。
[0381] 为了制备配制品26至34，将乙酸盐(pH 5.2)中的迪诺苏单抗(70mg/mL)的等分试样针对如表8A中所描述的DF缓冲剂进行透析，其中进行总计3次缓冲剂更换以达到先前配制品的100万倍稀释，从而确保完全缓冲剂交换。组氨酸配制品F的透析使用起始pH值为4.0的缓冲剂，并且预计pH值在由于道南效应(Donnan effect)引起的蛋白质浓缩以及乙酸盐共浓缩后将变至目标pH值5.1。然而，在蛋白质浓缩至120mg/mL之后，pH值未变至目标pH值5.1，而是保持在pH 4.0。为了使组氨酸配制品的pH值达至pH 5.1，需要用稀(0.1N)NaOH进行滴定。使用离心机-浓缩器单元对其余配制品进行过度浓缩，接着稀释至124-128mg/mL并且添加聚山梨醇酯20至0.01％(w/v)的最终浓度。
[0382] 表8A
[0383]
[0384]
[0385] *最终配制品包含120mg/mL迪诺苏单抗和最终浓度为0.01％(w/v)的PS20，且具有所指示的pH值。山梨醇和苯丙氨酸浓度估计比DF缓冲剂的山梨醇浓度低约8.5％。精氨酸浓度估计比DF缓冲剂的精氨酸浓度低约12.5％。F#后出现的()中的字母对应于图13至图18。
[0386] 将这些配制品以1.0mL的填充体积填充至容器中。将这些配制品储存在37℃的温度下达4周。使用SE-UHPLC来评定聚集抑制和一定时间内针对聚集抑制的稳定性(如基于HMWS和二聚物物质的形成)。在初始条件下以及在储存时段期间和之后比较这些配制品的聚集抑制概况。
[0387] 图13至图15表示各配制品在37℃下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随储存时间而变化的图，并且表8B提供各个图的数据点。图16至图18显示表8A中所列出的配制品在37℃下储存1个月后的色谱重叠图。图13及图16涉及包含芳族氨基酸的配制品，图14及图17涉及包含极性/带电氨基酸的配制品，且图15及图18涉及包含疏水性氨基酸的配制品。
[0388] 表8B
[0389]
[0390]
[0391] F#提供于左侧纵行中且对应于表8A的F#。
[0392] 如图13至图15中所示，相对于乙酸盐/山梨醇配制品(配制品26)，所有含有氨基酸聚集抑制剂的配制品(配制品27至34)均在稳定性方面显示一定程度的改良。含有芳族氨基酸的配制品(配制品27和28)显示最大程度的％HMWS减少。相对于对照物(配制品26)，含有苯丙氨酸的配制品(配制品27)也显示HMWS大大减少，并且含有色氨酸的配制品显示最大程度的减少。与具有氨基酸稳定剂的其他配制品(图16和图18)相比，含有极性/带电氨基酸的迪诺苏单抗配制品(配制品29至31)一般显示较大量的高级聚集物(图17)，并且当与乙酸盐/山梨醇配制品(配制品26)相比时，此特定组氨酸配制品总体上显示较大量的HWMS(图14)。组氨酸配制品的结果可能因透析过程、在pH 4.0下耗费较久持续时间以及用稀NaOH滴定该配制品而存在偏差。含有疏水性氨基酸的配制品(配制品32至34)均显示在HMWS形成方面一致的改良。
[0393] 实例9
[0394] 此实例显示精氨酸和苯丙氨酸在稳定迪诺苏单抗方面的可能作用机制。氢氘交换质谱(HDX-MS)为一种用于表征蛋白质-蛋白质/配体/赋形剂相互作用的灵敏又稳定的技术。该方法检测由于与赋形剂相互作用所致的骨架酰胺氢键中的变化。
[0395] 利用在10mM乙酸盐缓冲剂(pH 5.2)(“A52”)中的迪诺苏单抗(3mg/mL浓度)在L-精氨酸(配制品35)、L-苯丙氨酸(配制品36)或L-甘氨酸(配制品37)存在下进行氢氘交换质谱(HDX-MS)，并且与缺乏任何氨基酸聚集抑制剂的迪诺苏单抗配制品(配制品38)相比较。在4℃(利用75mM浓度的L-精氨酸、L-苯丙氨酸或L-甘氨酸)和37℃(利用150mM浓度的L-精氨酸、L-苯丙氨酸或L-甘氨酸)下进行实验。在分析超过530种肽之后，鉴定出少量具有显著构型变化的区域。图19至图30中捕获了来自这些区域的若干代表性肽。
[0396] 图19至图24为配制品35至38中的每一者的轻链氨基酸28-33(图19)、轻链氨基酸108-116(图20)、轻链氨基酸125-132(图21)、重链氨基酸47-59(图22)、重链氨基酸243-253(图23)及重链氨基酸392-399(图24)在4℃下的氘并入％随时间(log(sec))而变化的图。
[0397] 图25至图30为配制品35至38中的每一者的轻链氨基酸28-33(图25)、轻链氨基酸108-117(图26)、轻链氨基酸124-131(图27)、重链氨基酸47-59(图28)、重链氨基酸242-253(图29)及重链氨基酸392-399(图30)在37℃下的氘并入％随时间(log(sec))而变化的图。
[0398] 虽然这些数据支持Arg和Gly对迪诺苏单抗具有类似的相互作用效应，但是Arg对迪诺苏单抗具有稍强HDX足迹(构型变化)：在Fab LC 28-33区中具有强稳定作用；在Fab LC 108-132及HC 47-59、Fc CH3 HC 392-399区中具有微弱稳定作用；以及在Fc CH2243-253区中具有微弱去稳定作用。不意欲受任何特定理论束缚，设想精氨酸盐酸盐效应是由于来自迪诺苏单抗表面和弱表面相互作用的组合优先排阻，而甘氨酸通过优先排阻起作用。
[0399] 然而，苯丙氨酸未对迪诺苏单抗显示显著结构扰动。不意欲受任何特定理论束缚，设想苯丙氨酸稳定效应可通过一或多种以下机制来完成：侧链相互作用，因为对肽骨架无影响(无HDX足迹)；和/或不影响骨架氢键网状结构的与精氨酸/赖氨酸侧链的阳离子-π相互作用。
[0400] 实例10
[0401] 此实例显示苯丙氨酸稳定迪诺苏单抗的可能作用机制。
[0402] 为了研究Phe对迪诺苏单抗的具体作用，进行分子动力学模拟。具体地，在模拟盒中使迪诺苏单抗的Fab结构域与过量Phe形成溶剂合物，并且进行两次10ns模拟。总而言之，选择与Fab结合持续超过90％的时间的Phe残基进行进一步分析。鉴定了九个这种案例。在9个长时间滞留观测结果中的5个中，Phe残基结合至VH/VL界面(可变重链/可变轻链)区以及CH/CL(恒定重链/恒定轻链)区。在一个实例中，据信Phe侧链在VH/VL界面处与疏水性残基(例如，重链的V93、Y95和W112，以及轻链的A44和P45)的侧链相互作用。在另一实例中，据信Phe的侧
链环在CH1与CL的界面处与残基(例如，轻链的T165，以及重链的G171、V172和T174)的NH3+和COO(-)基团相互作用。不意欲受任何特定理论束缚，此观测结果产生以下观念：Phe在缓解迪诺苏单抗聚集方面的具体作用是由于苯基基团与形成重恒定1(Hc)链和轻恒定(Lc)链的界面的疏水性残基(例如，轻链的CDR1的R30、G31、R32和Y33，轻链的CDR2的A52，以及重链的CDR3的M106)的相互作用。假设此相互作用以用来自Phe赋形剂的NH3(+)和COO(-)基团的相对更带电(因此具亲水性)表面置换先前疏水性表面。
[0403] 实例11
[0404] 对多种抗RANKL抗体构建体(同种型IgG1、IgG2和IgG4)进行稳定性评定。如以上所描述，当与迪诺苏单抗(其为IgG2免疫球蛋白)的乙酸盐/山梨醇对照配制品相比时，精氨酸盐酸盐与苯丙氨酸均将起始HMWS和一定时间内的HWMS水平最小化。进行此评定以比较Arg-HCl和Phe减少含有不同抗RANKL抗体构建体的配制品中的HMWS的可能性。此研究中所测试的IgG1和IgG4构建体在与迪诺苏单抗相比时含有相同的互补性决定区(CDR)，但含有不同的恒定结构域支架。此研究中所测试的不同的IgG2构建体相对于迪诺苏单抗具有不同的CDR，但含有相同的恒定结构域支架。
[0405] 对各测试抗体构建体进行纯化，并且使用离心机浓缩自8mg/mL浓缩至70mg/mL。将各经浓缩的体积分成三个等分试样，随后针对以山梨醇、山梨醇/苯丙氨酸和山梨醇/精氨酸盐酸盐配制的乙酸盐缓冲剂进行透析，以制备如表9中所描述的配制品39至47。利用离心机浓缩将透析后样品过度浓缩至高于120mg/mL。用相应的缓冲剂将抗体蛋白质稀释至120mg/mL。
[0406] 表9
[0407]
[0408]
[0409] *最终配制品包含最终浓度为0.01％(w/v)的PS20，并且具有所指示的pH值。山梨醇和苯丙氨酸浓度估计比DF缓冲剂的浓度低约8.5％。精氨酸浓度估计比DF缓冲剂的浓度低约12.5％。
[0410] 将这些配制品以1.0mL得填充体积填充至玻璃小瓶容器中。将这些配制品储存在37℃的温度下达1个月。使用SE-UHPLC来评定聚集抑制和一定时间内针对聚集抑制的稳定性(如基于HMWS的形成)。在初始条件下以及在储存时段之后比较这些配制品的聚集抑制概况。储存之后比较该免疫球蛋白类别内的这些配制品的稳定性。
[0411] 图31、图33和图35(以及以下相关表10、表12和表14)显示在37℃下在免疫球蛋白G(分别为IgG1、IgG2和IgG4)的情况下通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随配制品和时间而变化。图32、图34和图36(以及以下相关表11、表13和表15)显示在37℃下在免疫球蛋白G(分别为IgG1、IgG2和IgG4)的情况下通过SE-UHPLC监测的低分子量物质(LMWS，例如蛋白质片段化)百分比随配制品和时间而变化。图37、图38和图39显示在37℃下储存t＝4w后粒径排阻色谱重叠图随配制品而变化。
[0412] 表10：在37℃下持续4周的％HMW、IgG1(A、B、C)比较
[0413]
[0414]
[0415] 表11：在37℃下持续4周的％LMWS、IgG1(A、B、C)比较
[0416]
[0417] 表12：在37℃下持续4周的％HMW、IgG2(D、E、F)比较
[0418]
[0419] 表13：在37℃下持续4周的％LMWS、IgG2(D、E、F)比较
[0420]
[0421] 表14：在37℃下持续4周的％HMW、IgG4(G、H、I)比较
[0422]
[0423] 表15：在37℃下持续4周的％LMWS、IgG4(G、H、I)比较
[0424]
[0425]
[0426] 如图31和图32中所示，具有与先前迪诺苏单抗样品类似的CDR区的IgG1分子显示当与乙酸盐/山梨醇对照配制品相比时，在添加苯丙氨酸的情况下HMWS减少大约0.2％。具有不同的CDR且如图33和图34中所描绘的IgG2样品显示当与对照乙酸盐/山梨醇配制品相比时，乙酸盐/苯丙氨酸/山梨醇配制品中的HMWS有所增加。如图35和图36中所示，对于IgG4样品类型，乙酸盐/山梨醇以及乙酸盐/苯丙氨酸/山梨醇配制品具有类似的稳定性，其中乙酸盐/山梨醇/精氨酸具有较高HMWS形成。在所有利用IgG1、IgG2和IgG4样品类型的案例中，含乙酸盐/山梨醇/精氨酸的配制品显示当与乙酸盐/山梨醇(对照物)以及乙酸盐/苯丙氨酸/山梨醇配制品相比时，HMWS降解有所增加。
[0427] 由于如图37和图38中所描绘的乙酸盐/精氨酸/山梨醇配制品中的蛋白质片段化大大增加，故图32、图34和图36中显示片段与抗体同种型之间的关系。文献中已显示单克隆抗体片段化介导的聚集可能由在37℃下储存的抗体而产生[Perico N.等人,J.Pharm.Sci.[药物科学杂志](2009)98,第3031页至第3042页]。此机制在此评估中为有可能的，因为乙酸盐/精氨酸/山梨醇配制品中的片段化最大。乙酸盐/苯丙氨酸/山梨醇配制品中的片段化最小化，从而可能产生较少HMWS物质。IgG4样品类型未加速片段化或聚集。
[0428] 根据此研究中收集的数据以及先前数据，即利用迪诺苏单抗收集的分子模型化数据，可建立CDR的氨基酸序列与苯丙氨酸减少HMWS的相对效应之间的强相关性。在具有相同CDR氨基酸的迪诺苏单抗(IgG2)和IgG1变异体中观测到HMW物质减少，但在具有不同的CDR结构域的IgG2变异体中未观测到HMWS减少。将发现CDR结构域内所含有的氨基酸序列易受与苯丙氨酸的相互作用以及随后聚集抑制的影响。当与迪诺苏单抗相比时，IgG4分子也具有相同的CDR区，但在研究过程中在聚集方面检测到极小变化。IgG4分子与IgG1和IgG2版本的不同之处主要在于其
铰链氨基酸长度及其功能活性结构。因为IgG1和IgG2抗体同种型具有典型地描述为“Y”形的延伸结构，所以IgG4 Fab CH1结构域与CH2结构域相互作用，从而形成更紧凑的结构[Aalberse R.C.等人,Immunology[免疫学](2002),105,第9页至第19页]。此紧凑结构可抑制IgG1和IgG2模式下通常见到的片段化和聚集反应。
[0429] 实例12
[0430] 进行研究以监测如以下所述配制并且结合表16(配制品51至55)的迪诺苏单抗的稳定性。用于产生浓度为120mg/Ml迪诺苏单抗的Ph 5.1的最终配制品的多种渗滤缓冲剂在乙酸盐浓度和起始pH值方面不同。另外，调节山梨醇水平以维持最终产品的等渗性(约300mOsm/Kg)。将70mg/mL迪诺苏单抗针对各缓冲剂渗滤不超过7倍渗滤体积，随后超滤至约
180gm/mL，并且用渗滤缓冲剂和聚山梨醇酯稀释至120mg/mL迪诺苏单抗浓度和0.01％聚山梨醇酯20。在37℃下储存之后使用SE-UHPLC评定稳定性，并且显示这些配制品中的迪诺苏单抗稳定性高度类似。随着初始乙酸盐浓度增加，初始HMW物质稍微减少。相比之下，含较低水平的乙酸盐的配制品中的聚集速率稍微升高。
[0431] 表16
[0432]
[0433] *最终配制品包含120mg/mL迪诺苏单抗和最终浓度为0.01％(w/v)的PS20，以及pH 5.1。
[0434] 实例13
[0435] 以下实例报导精氨酸在以下三个不同的pH值下对迪诺苏单抗化学变性稳定性的影响的研究结果：4.5、4.8和5(或5.2)。
[0436] 使用具有
荧光检测器的Unchained Labs仪器HUNK进行所有化学变性实验。激发
波长为280nm，并且记录300与500nm之间的发射扫描。对于各变性实验，将蛋白质、缓冲剂和变性剂(盐酸胍)分配至36个孔中，变性剂浓度呈线性增加，从而获得针对各条件的36点曲线。使用由仪器制造商(Unchained Labs公司)提供的曲线拟合
软件来拟合数据点。使用两态模型，因为已证明仅存在单一过渡(native denatured)。使用10mM乙酸盐5.0％(w/v)山梨醇中的0-6M脲进行实验，并且滴定至所期望的pH 4.5、4.8或5(5.2)。在所有实验中，迪诺苏单抗蛋白的浓度为7mg/mL。
[0437] 图40显示迪诺苏单抗在不存在精氨酸的情况下在pH 4.5、4.8和5.0下的等温化学变性曲线。在不存在精氨酸的情况下，三种测试pH值条件下的50％解折叠所需的化学变性剂的C1/2类似。
[0438] 图41显示迪诺苏单抗在存在75mM精氨酸盐酸盐的情况下在pH 4.5、4.8和5.2下的等温化学变性曲线。当与pH 4.8和4.5相比时，在pH 5.2下，化学变性稳定性显著增加。相对于较低pH值，在pH 5.2下，变性剂盐酸胍的C1/2增加1M。因而，精氨酸的保护特性令人惊讶且高度依赖于pH值。
[0439] 实例14
[0440] 以下实例提供精氨酸和苯丙氨酸对注射器中的高浓度迪诺苏单抗配制品在一定时间内的稳定性的影响的研究结果。
[0441] 在先前研究中，鉴定精氨酸盐酸盐和苯丙氨酸可降低迪诺苏单抗的初始起始水平和HMWS形成速率。在此研究中，评估含有精氨酸盐酸盐、苯丙氨酸以及精氨酸盐酸盐与苯丙氨酸的组合的配制品对含有迪诺苏单抗(120mg/mL)的溶液的稳定作用，并且在两个不同的温度下储存于注射器中达三个月。
[0442] 以下表17中描述所测试的配制品。为了制备配制品56至59，将乙酸盐(pH5.2)中的迪诺苏单抗(70mg/mL)针对以下所描述的渗滤(DF)缓冲剂进行渗滤，达到8倍渗滤体积，以确保完全缓冲剂交换。随后将材料超滤至高于180mg/mL，接着稀释至120mg/mL并且添加聚山梨醇酯20至0.01％的最终浓度。配制品56被视为对照配制品。所列出之乙酸盐、精氨酸盐酸盐和苯丙氨酸值针对DF缓冲剂，并且当不存在其他抗衡离子时，在考虑赋形剂排阻和乙酸盐共浓缩的情况下提供120mg/mL迪诺苏单抗的最终组合物中的估计水平。使用Paar模
块化紧凑型流变仪以高达1000s-1(秒的倒数)的
剪切速率测量5℃及25℃下的黏度。将这些配制品以1.0mL的填充体积填充至玻璃预填充注射器(PFS)中。将注射器平行组分别储存在25℃的温度下持续3个月及在37℃下持续2个月。使用SE-UHPLC来评定稳定性(如基于HMWS形成)。
[0443] 表17
[0444]
[0445] *各最终配制品包含120mg/mL迪诺苏单抗和0.01％PS20以及缩写配制品名称中所指示的pH值
[0446] 图42和图43分别显示在25℃下持续3个月以及在37℃下持续2个月通过SE-UHPLC监测的HMWS百分比随配制品和时间而变化。
[0447] 表18至表21以表格形式显示相同数据以及HMWS相对于初始HMWS水平的增加。
[0448] 表18：在25℃下在12周内的％HMWS水平
[0449]
[0450] 表19：在25℃下在12周内的HMWS增加
[0451]
[0452] 表20：在37℃下在8周内的％HMWS水平
[0453]
[0454] 表21：在37℃下在8周内的HMWS增加
[0455]
[0456]
[0457] 此实例显示添加精氨酸、苯丙氨酸及其组合各自降低高浓度迪诺苏单抗配制品中的初始HMWS(t＝0)的水平。在25℃下，与对照配制品56相比，苯丙氨酸配制品59中的HMWS增加有所减少。在37℃下，与对照山梨醇配制品56相比，配制品57和59具有减少的HMWS形成。相对于其他配制品，含有精氨酸盐酸盐和苯丙氨酸的配制品在37℃下以较高速率形成HMWS，表明这些赋形剂的组合在这种较高温度下使此配制品中的迪诺苏单抗去稳定化。
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[0462] 本文中所引用的所有专利、出版物及参考文献均通过引用以其全文并入本文中。在本披露内容与所并入之专利、出版物及参考文献出现矛盾的情况下，应以本披露内容为主。
