用于诊断和治疗犬肾脏病症的组合物和方法
阅读：1发布：2020-12-20
专利汇可以提供用于诊断和治疗犬肾脏病症的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供在犬中诊断肾脏病症、设计和监测肾脏病症 治疗 方案 及监测肾脏病症状态的方法，所述肾脏病症的特征为异常的肾功能丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎，其中所述肾脏病症可通过利用自所述犬采集的 生物 受试样品分离并测量的至少一种相关的生物标志物来检测。本发明另外还涉及用于实施所述特定方法的组合物、 试剂 和 试剂盒 。，下面是用于诊断和治疗犬肾脏病症的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.试剂在制备用于诊断犬中肾脏病症的试剂盒中的用途，所述诊断包括以下步骤：(a)测定来自所述犬生物样品的至少一种生物标志物的表达水平，其中所述至少一种生物标志物是分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)和选自以下的任选生物标志物：胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体
12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)；和(b)鉴定具有肾脏病症的犬，其中所述样品中所述一种或多种生物标志物的表达相对于来自正常动物的样品中表达的对照值有差异，表明存在肾脏病症；并且其中所述试剂能够检测所述至少一种生物标志物。
2.权利要求1的用途，其中所述生物样品为固体肾脏组织样品或体液样品。
3.权利要求1的用途，其中所述步骤(b)中的差异表达用一种或多种杂交探针的阵列来测定。
4.权利要求1的用途，其中所述步骤(b)中的差异表达用一种或多种抗体组来测定，所述抗体与至少一种RNA转录物或其翻译产物特异性结合。
5.权利要求1的用途，其中所述步骤(b)中的差异表达通过检测至少一种RNA转录物或其翻译产物的免疫测定来测定。
6.权利要求5的用途，其中所述免疫测定选自：竞争性结合测定、非竞争性结合测定、放射性免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心式测定、沉淀素反应、凝胶扩散免疫扩散测定、凝集测定、荧光免疫测定、化学发光免疫测定、免疫PCR免疫测定、蛋白A或蛋白G免疫测定、RNA印迹分析、蛋白质印迹分析、Luminex(TM)xMAP(TM)检测和免疫电泳测定。
7.权利要求1的用途，其中所述犬具有正常肾功能，其中正常肾功能由以下一种或多种来确定：肾小球滤过率、尿蛋白水平、血肌酐水平、尿肌酐水平、肌酐清除率和血尿素氮。
8.权利要求1的用途，所述诊断进一步包括使用选自以下的一种或多种常规诊断测量：测定白蛋白、血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、血肌酐、尿肌酐、肌酐清除率、尿蛋白、血尿素氮和肾小球滤过率的水平。
9.权利要求1的用途，其中所述肾脏病症是以异常的肾功能丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎为特征的病症。
10.权利要求1的用途，其中所述肾脏病症由一种或多种生物标志物的表达相对于对照表达值的显著差异来指示，其中显著差异在增加表达的情况下是增加至少两倍，在减少表达的情况下是减少至少50%，其中一种或多种生物标志物是分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)和选自以下的任选生物标志物：胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。
11.权利要求1的用途，其中所述试剂盒还包括使用所述试剂来测量所述一种或多种生物标志物的表达和诊断所述犬的肾脏疾病的说明书。
12.权利要求1的用途，其中所述试剂是抗体。
13.权利要求1的用途，其中所述试剂与可检测的标记连接。
14.权利要求1的用途，其中所述诊断包括使用识别选自以下的犬蛋白质的抗体：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。
15.权利要求14的用途，其中所述抗体包含在试剂盒内。
16.权利要求1-11中任一项的用途，其中所述试剂为能与选自以下的犬基因杂交的核酸探针：分泌型卷曲相关蛋白-2 (SFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。
用于诊断和治疗犬肾脏病症的组合物和方法
发明领域
[0002] 本发明提供在犬中诊断肾脏病症、设计和监测肾脏病症治疗方案及监测肾脏病症状态的方法，所述肾脏病症的特征为异常的肾功能丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎，其中所述肾脏病症可通过利用自所述犬采集的生物受试样品分离并测量的至少一种相关的生物标志物(biomarker)来检测。用于实施本发明组合物和方法的相关生物标志物包含自所述犬的所述生物受试样品获得的RNA转录物或其翻译产物。用于实施本发明方法的生物受试样品包含所述犬的肾组织样品或采集自所述犬的生物学流体试样。
[0003] 本发明亦涉及确定用于在犬中诊断肾脏病症、设计和监测肾脏病症治疗方案及监测肾脏病症状态的新型生物标志物组合，所述肾脏病症特征为异常的肾功能丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎。
[0004] 发明背景
[0005] 肾小球肾炎或肾小球性肾炎(“GN”)是以肾脏中肾小球或毛细血管袢炎症为特征的肾脏疾病。它是与许多不同的潜在的疾病相关的病理学过程。所述病况以急性、亚急性和慢性形式发生，也以感染的继发形式发生。在前一情况下，当未发现并发疾病时，通常是指特发性肾小球肾炎。后一情况通常指继发性GN。无论哪种潜在原因，都会形成免疫复合物并引发一系列事件，从而导致肾小球损伤和肾功能丧失、蛋白尿并最终在某些情况下导致肾衰竭。
[0006] 肾炎是肾脏的炎症，其可能为牵涉肾小球、肾小管或肾脏间质(或结缔)组织的局灶性或弥漫性的增生性或破坏性疾病。肾炎最常见的形式是肾小球肾炎。肾炎可通过许多阶段发展，最终为晚期肾疾病或晚期肾衰竭。
[0008] 急性肾衰竭可因创伤、感染、炎症或暴露于肾毒性物质而突然发生。这种情况可导致脱水、低血压和循环衰竭。急性肾衰竭经常分为三类：(1)肾前性肾衰，其与肾血流量减少有关；(2)肾内性肾衰(intra-renal failure)，其与缺血和毒素有关；和(3)肾后性肾衰，其起因于尿流阻塞。
[0009] 慢性肾衰竭牵涉肾功能逐渐丧失，这可最终发展为晚期肾脏疾病或衰竭。起初，慢性肾衰竭开始于肾功能逐渐减弱，但血液中代谢废物没有可察觉的积累。随着因炎症而起的肾小球滤过率减慢，废物开始积累。由于肾功能弱，疾病发展为尿毒症，高水平的蛋白质终产物开始积累并损害机体功能。慢性肾衰竭的常见原因包括：炎症、感染、尿路梗塞和某些全身性疾病和毒性，包括高血钙症、红斑狼疮、糖尿病和高血压。
[0010] 晚期肾脏疾病以不可逆转的慢性肾衰竭为标志。血清肌酐和血尿素氮水平持续升高，因而发生的尿毒症损害所有机体系统。肾脏可遭受正常肾功能的大约10%或更少的永久性和几乎完全的功能丧失。晚期肾脏疾病的一个原因是肾小球肾炎。其它原因包括对于慢性肾衰竭提到的那些。
[0011] 因为免疫系统的生物损伤而可能出现肾小球肾炎。外源物质可附着基底膜并引起导致抗体产生的免疫应答。这些抗体可与外源物质结合形成免疫复合物，该复合物变得沉积于细小的肾小球毛细血管壁上，导致肾单位的损伤。或者，在一些个体中，免疫系统可产生自身抗体，自身抗体为免疫球蛋白，可攻击肾脏细胞导致所谓的自身免疫反应。如果改变机体中的蛋白质，自身抗体反应可随之发生，因为自身抗体将改变后的蛋白质识别为非己的。这些自身抗体-蛋白质复合物可同样地沉积于肾小球的基底膜上，引起肾单元功能的破坏。
[0012] 肾小球肾炎是狗中蛋白尿的常见原因，并且可为所述病况的特发性或继发性形式中的任一种。在后一种情形下，所述病况可因瘤形成、炎性疾病、内分泌失调、感染或家族性肾病而继发出现。如在人中一样，在狗中GN由免疫来介导，牵涉到动物机体中的免疫球蛋白和补体因子。发生在肾脏中肾小球的损伤导致肾小球的形态变化。最终损伤不可逆转，导致肾单位功能障碍。
[0013] 科学界普遍公认基因表达的调节在影响动物健康和良好状态的一些疾病或病况的发展中起关键作用。同样，基因差异表达是这些疾病和病况发展过程中的一个因素，已广泛认为基因表达模式的评估对在分子水平上了解这些疾病和病况的发展和控制很重要。为促进了解基因及其与疾病的关系，开发了许多方法以研究基因差异表达，例如DNA微阵列、表达序列标签(EST)、基因表达系列分析(SAGE)、差减杂交法、mRNA的差减克隆和差异显示(DD)、RNA随机引物PCR (RAP-PCR)、实时PCR (RT-PCR)、代表性差异分析法(RDA)、双向凝胶电泳、质谱法和基于蛋白微阵列的蛋白质抗体结合。
[0014] 由于肾脏疾病和固有的分子相互作用及细胞间的信号转导过程中牵涉到的生物学途径的复杂性，极其希望在基因水平了解发生的相互作用。在犬中肾功能丧失的早期阶段检测失调基因，有助于在全基因组基础上了解肾脏疾病尤其是肾小球肾炎的生物学。基因失调可在遭受反复缺血性损伤的动物的疾病发展的早期阶段检测到这一事实，有助于设计用于在犬中诊断异常的肾功能丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎、设计并监测其治疗方案的方法。
[0015] 通过基因表达谱更详细了解所涉及的生物途径，将有助于开发对疾病途径的诊断程序、试剂和测试试剂盒以及有益于健康的药物、营养品和营养(饮食)干预。这些方法使得能够早期检测和可能预防或治疗潜在的肾脏病症尤其是肾小球肾炎，以及监测早期肾衰竭和肾小球肾炎的预测(prognosis)，尤其是在犬中。在所述病症的病理学中牵涉的基因失调可作为重要的生物标志物用于诊断和可能预防或治疗所述病症，并优化对适当的药物、营养品和营养(饮食)干预的选择。
[0016] 可将犬中基因表达水平和/或表达的基因产物功能水平的测定用于选择适当的用于治疗或预防用途的试剂。通过基因表达谱，技术人员可使用该数据来选择适当的药物作为用于预防或治疗犬肾脏疾病的试剂。通过利用指示肾功能的健康状态的生物标志物，基因表达数据和分析亦可用于选择对肾脏机能有有益作用的营养组合物、膳食添加剂和营养品。
[0017] 迄今为止，在从犬基因组中筛选与狗疾病诊断相关的基因表达谱方面仅做了非常有限的工作。采用动物模型的某些工作利用了cDNA阵列技术来筛选与肾脏疾病相关的肾脏组织的基因表达。
[0018] 尚未在以下方面开展广泛研究：如本说明书所述的犬健康种群对比具有诸如肾脏疾病和肾功能丧失的疾病种群。几乎没有可得到的关于犬基因组表达谱的数据，尤其是关于犬肾脏疾病随时间发展的数据。本说明书中含有的基因表达数据鉴定了狗中与肾功能有关的基因。所述基因表达数据使得能够开发用于在犬中诊断肾脏病症、设计和监测其治疗方案以及监测肾脏病症状态的组合物和方法，所述肾脏病症特征为异常的肾功能丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎，其中肾脏病症可通过利用自所述犬采集的生物受试样品分离并测量的至少一种相关的生物标志物来检测。
[0019] 本说明书和实施例中含有的基因表达数据，使基于本专利申请的说明书和实施例中所述的基因表达谱的多种所期望的发明得以实现。所述数据允许鉴定和定量作为预防、鉴定和治疗潜在肾脏疾病的疾病生物标志物的基因表达产物。因实施本发明方法所得到的基因表达数据亦允许监测所述肾脏疾病的进程。这些发明进一步包括基因测定，以确定可能患有所述肾脏疾病的动物的易感亚群，以确定预防和治疗所述肾脏疾病的最佳膳食，以确定基于本说明书提出的发现的药物、营养品和营养(饮食)干预来治疗潜在的肾脏疾病。本发明亦包括用于早期疾病检测的生物标志物、靶向疗法、用于分析来自对所述肾脏疾病敏感或患有所述疾病的犬的组织和血液样品的诊断试剂和试剂盒。
[0020] 发明概述
[0021] 本发明涉及在犬中诊断肾脏病症、设计和监测肾脏病症治疗方案及监测肾脏病症状态的方法，所述肾脏病症的特征为异常的肾功能丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎，其中所述肾脏病症可通过利用自所述犬采集的生物受试样品分离并测量的至少一种相关的生物标志物来检测。
[0022] 用于实施本发明组合物和方法的相关生物标志物包含取自所述犬的所述生物受试样品的RNA转录物或其翻译产物。用于实施本发明方法的生物受试样品包括所述犬的组织样品或采取自所述犬的生物学流体试样。
[0023] 具体来说，本发明涉及用于通过使用基因表达分析在犬中诊断肾脏病症、设计和监测其治疗方案以及监测肾脏病症状态的方法，所述肾脏病症的特征为异常的肾功能丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎。
[0024] 本发明亦涉及确定用于在犬中确定诊断肾脏病症、设计和监测肾脏病症治疗方案以及监测肾脏病症状态的新型生物标志物组合，所述肾脏病症特征为异常的肾功能丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎。
[0025] 本发明另外涉及用于实施特定方法的组合物、试剂和试剂盒。
[0026] 本发明部分地基于以下发现：犬中特定基因表达谱与所述动物肾脏中从正常到异常生物学过程的改变相关，所述改变随时间推移可导致肾功能的减弱。可在没有提供基于领域内公认的肾脏疾病临床体征和症状的常规临床诊断的情况下，在犬中预测、检测和诊断特定基因表达谱与正经历肾功能减弱的风险之间的关联。因此，犬中改变的基因表达谱预示着肾功能减弱，而这种减弱可另外地在稍后期由领域内公认的肾功能测量来诊断。所述领域内公认的肾功能测量通常可包括例如以下测量之一：肾小球滤过率、肌酐清除率、尿蛋白水平、血清肌酐水平、尿肌酐水平、血尿素氮(BUN)水平、放射性同位素代谢标记、包括超声波检查、核磁共振成像和/或计算机体层摄影在内的软组织成像。非侵入性测定例如血清肌酐和BUN水平通常显示与肾脏组织病理学弱相关，一般不能预测肾脏中的未来变化。
[0027] 评估犬以诊断肾脏病症的方法涉及评估犬中所述选自以下的基因中的一种或多种基因的基因表达水平或活性或所述基因的表达(翻译)产物：分泌型卷曲相关蛋白2 (secreted frizzle-related protein-2, sFRP2)、胞外基质蛋白-2 (matrilin-2, Matn2)、腔蛋白聚糖(lumican, LUM)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、饰胶蛋白聚糖(decorin , DCN)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。
[0028] 评估犬以诊断肾脏病症的方法涉及评估犬中所述选自以下的基因中的一种或多种基因的基因表达水平或活性或所述基因的表达产物：分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)或胞外基质蛋白-2 (Matn2)；任选第二组：腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。
[0029] 可用于实施本发明的生物标志物为：腔蛋白聚糖(LUM)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)，这在下文和本说明书所附的序列表中将更全面描述。
[0030] 犬腔蛋白聚糖。Affymetrix探针CfaAFFx.10198.1.S1_s_at对应于NCBI参考序列：XP_539716.1，登录XP_539716，预测其类似于腔蛋白聚糖前体(硫酸角质素蛋白聚糖腔蛋白聚糖[KSPG腔蛋白聚糖])[家犬(Canis familiaris)]。犬腔蛋白聚糖是由XM_539716.2以GeneID:482599 [SEQ. ID. NO: 1]编码的含338个氨基酸且富含亮氨酸重复的蛋白质。
[0031] 术语“腔蛋白聚糖”和“LUM”和“Lum”表示基本上具有如SEQ. ID. NO: 1所示氨基酸序列的蛋白质。优选腔蛋白聚糖为基本上由SEQ. ID. NO: 1所示氨基酸序列组成的蛋白质。腔蛋白聚糖亦包括SEQ. ID. NO: 1所示序列的蛋白变体，例如等位基因变体和诸如取代、添加和/或缺失等其它突变。术语腔蛋白聚糖亦指编码所述蛋白的核酸序列。该序列对应于XM_539716.2和所附SEQ. ID. NO: 12。腔蛋白聚糖亦指与SEQ. ID. NO: 12和SEQ. ID. NO: 12的片段杂交的核酸序列。
[0032] 犬胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)。Affymetrix探针CfaAffx.22804.1S1_s_at对应于NCBI参考序列：XP_863148.1，登录XP_863148，预测其类似于胶原α (Ⅲ)链前体同工型12。犬COL3A1是由XM_863148.1以GeneID:478835 [SEQ. ID. NO: 2]编码的含1446个氨基酸的蛋白质。
[0033] 术语“胶原α (Ⅲ)链前体同工型12”、“Col3a1”和“COL3A1”表示基本上具有如SEQ. ID. NO: 2所示氨基酸序列的蛋白质。优选COL3A1为基本上由SEQ. ID. NO: 2所示氨基酸序列组成的蛋白质。COL3A1亦包括SEQ. ID. NO: 2所示序列的蛋白变体，例如等位基因变体和诸如取代、添加和/或缺失等其它突变。术语COL3A1亦指编码所述蛋白的核酸序列。该序列对应于XM_863148.1和所附SEQ. ID. NO: 13。COL3A1亦指与SEQ. ID. NO: 13和SEQ. ID. NO: 13的片段杂交的核酸序列。
[0034] 犬饰胶蛋白聚糖(DCN)。Affymetrix探针Cfa.6065.1.A1_s_at对应于NCBI参考序列：NP_001003228.1，登录NP_001003228，饰胶蛋白聚糖[家犬(Canis lupus familiaris)]。犬饰胶蛋白聚糖是由NM_001003228.1以GeneID:403904 [SEQ.ID. NO: 3]编码的含360个氨基酸且富含亮氨酸重复的蛋白质。
[0035] 术语“饰胶蛋白聚糖”、“Dcn”和“DCN”表示基本上具有如SEQ. ID. NO: 3所示氨基酸序列的蛋白质。优选饰胶蛋白聚糖为基本上由SEQ. ID. NO: 3所示氨基酸序列组成的蛋白质。饰胶蛋白聚糖亦包括SEQ. ID. NO: 3所示序列的蛋白变体，例如等位基因变体和诸如取代、添加和/或缺失等其它突变。术语饰胶蛋白聚糖亦指编码所述蛋白的核酸序列。该序列对应于NM_001003228.1和所附SEQ. ID. NO: 14。饰胶蛋白聚糖亦指与SEQ. ID. NO: 14和SEQ. ID. NO: 14的片段杂交的核酸序列。
[0036] 犬分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)。Affymetrix探针Cfa. 1200.1.S1_s_at对应于NCBI参考序列：NP_001002987.1，登录NP_001002987 XP_532695，分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)[家犬]。犬分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)是由NM_001002987.1以GeneID:475471 [SEQ.ID. NO: 4]编码的含294个氨基酸的蛋白质。
[0037] 术语“分泌型卷曲相关蛋白2”、“SFRP2”和“sFRP2”表示基本上具有如SEQ. ID. NO: 4所示氨基酸序列的蛋白质。优选sFRP2为基本上由SEQ. ID. NO: 4所示氨基酸序列组成的蛋白质。sFRP2亦包括SEQ. ID. NO: 4所示序列的蛋白变体，例如等位基因变体和诸如取代、添加和/或缺失等其它突变。术语sFRP2亦指编码所述蛋白的核酸序列。该序列对应于NM_001002987.1和所附SEQ. ID. NO: 15。sFRP2亦指与SEQ. ID. NO: 15和SEQ. ID. NO: 15的片段杂交的核酸序列。
[0038] 犬胞外基质蛋白-2 (Matn2)。Affymetrix探针Cfa.9487.1A1_at对应于NCBI参考序列：XP_5485552.2，登录NP_5485552，类似于胞外基质蛋白2同工型前体[家犬]。犬胞外基质蛋白-2是由XM_5485552.2以GeneID:491431 [SEQ.ID. NO: 5]编码的含978个氨基酸的蛋白质。
[0039] 术语“胞外基质蛋白2同工型前体”、“胞外基质蛋白2”和“Matn2”表示基本上具有如SEQ. ID. NO: 5所示氨基酸序列的蛋白质。优选Matn2为基本上由SEQ. ID. NO: 5所示氨基酸序列组成的蛋白质。Matn2亦包括SEQ. ID. NO: 5所示序列的蛋白变体，例如等位基因变体和诸如取代、添加和/或缺失等其它突变。术语Matn2亦指编码所述蛋白的核酸序列。该序列对应于XM_5485552.2和所附SEQ. ID. NO: 16。Matn2亦指与SEQ. ID. NO: 16和SEQ. ID. NO: 16的片段杂交的核酸序列。
[0040] 犬视黄醇结合蛋白4 (rbp4)。Affymetrix探针Cfa.15489.1.S1_at对应于NCBI参考序列：XP_534969.2，登录NP_534969，类似于视黄醇结合蛋白4，血浆前体rbp4 [家犬]。犬视黄醇结合蛋白4是由XM_534969.2以GeneID: 477775 [SEQ.ID. NO: 6]编码的含267个氨基酸的蛋白质。
[0041] 术语“视黄醇结合蛋白4”、“血浆前体”，“视黄醇”和“Rbp4”表示基本上具有如SEQ. ID. NO: 6所示氨基酸序列的蛋白质。优选Rbp4为基本上由SEQ. ID. NO: 6所示氨基酸序列组成的蛋白质。Rbp4亦包括SEQ. ID. NO: 6所示序列的蛋白变体，例如等位基因变体和诸如取代、添加和/或缺失等其它突变。术语Rbp4亦指编码所述蛋白的核酸序列。该序列对应于XM_534969.2和所附SEQ. ID. NO: 17。Rbp4亦指与SEQ. ID. NO: 17和SEQ. ID. NO: 17的片段杂交的核酸序列。
[0042] 犬基质金属蛋白酶9 (MMP-9)。Affymetrix探针Cfa.3470.1S1_at对应于NCBI 参考序列：NP_001003219.1，登录NP_001003219，基质金属蛋白酶9 [家犬]。犬基质金属蛋白酶9 (MMP9)是由NM_001003219.1以GeneID:403885 [SEQ.ID. NO: 7]编码的含704个氨基酸的蛋白质。
[0043] 术语“基质金属蛋白酶9”和“MMP9”表示基本上具有如SEQ. ID. NO: 7所示氨基酸序列的蛋白质。优选MMP9为基本上由SEQ. ID. NO: 7所示氨基酸序列组成的蛋白质。MMP9亦包括SEQ. ID. NO: 7所示序列的蛋白变体，例如等位基因变体和诸如取代、添加和/或缺失等其它突变。术语MMP9亦指编码所述蛋白的核酸序列。该序列对应于NM_001003219.1和所附SEQ. ID. NO: 18。MMP9亦指与SEQ. ID. NO: 18和SEQ. ID. NO:18的片段杂交的核酸序列。
[0044] 犬簇蛋白(CLU)。Affymetrix探针Cfa1254.S1_s_at对应于NCBI 参考序列：NM_001003370.1，登录NM_001003370，犬簇蛋白。犬簇蛋白是由NM_001003370.1以GeneID:442971 [SEQ.ID. NO: 8]编码的含445个氨基酸的蛋白质。
[0045] 术语“簇蛋白”和“Clu”表示基本上具有如SEQ. ID. NO: 8所示氨基酸序列的蛋白质。优选簇蛋白为基本上由SEQ. ID. NO: 8所示氨基酸序列组成的蛋白质。簇蛋白亦包括SEQ. ID. NO: 8所示序列的蛋白变体，例如等位基因变体和诸如取代、添加和/或缺失等其它突变。术语簇蛋白亦指编码所述蛋白的核酸序列。该序列对应于NM_001003370.1和所附SEQ. ID. NO: 19。簇蛋白亦指与SEQ. ID. NO: 19和SEQ. ID. NO: 19的片段杂交的核酸序列。
[0046] 犬转铁蛋白(TF)。Affymetrix探针Cfa2217.1.A1_at对应于NCBI 参考序列：XP_534268.2，登录XP_534268，类似于犬血清铁传递蛋白(serotransferrin)前体(转铁蛋白)同工型1。犬转铁蛋白是由XM_534268.2以GeneID:477072 [SEQ.ID. NO: 9]编码的含705个氨基酸的蛋白质。
[0047] 术语“血清铁传递蛋白前体(转铁蛋白)同工型1”、“转铁蛋白”和“TF”表示基本上具有如SEQ. ID. NO: 9所示氨基酸序列的蛋白质。优选转铁蛋白为基本上由SEQ. ID. NO: 9所示氨基酸序列组成的蛋白质。转铁蛋白亦包括SEQ. ID. NO: 9所示序列的蛋白变体，例如等位基因变体和诸如取代、添加和/或缺失等其它突变。术语转铁蛋白亦指编码所述蛋白的核酸序列。该序列对应于XM_534268.2和所附SEQ. ID. NO: 20。转铁蛋白亦指与SEQ. ID. NO: 20和SEQ. ID. NO: 20的片段杂交的核酸序列。
[0048] 犬载脂蛋白C-1 (ApoC1)。Affymetrix探针Cfa1254.S1_s_at对应于NCBI 参考序列：XP_533643.2，登录XP_533643，类似于犬载脂蛋白C-I前体(ApoCI)。犬载脂蛋白C-I (ApoCI)是由NM_533643.2以GeneID:113459 [SEQ.ID. NO: 10]编码的含88个氨基酸的蛋白质。
[0049] 术语“载脂蛋白C-1”和“ApoC1”表示基本上具有如SEQ. ID. NO: 10所示氨基酸序列组成的蛋白质。优选ApoC1为基本上由SEQ. ID. NO: 10所示氨基酸序列组成的蛋白质。ApoC1亦包括SEQ. ID. NO: 10所示序列的蛋白变体，例如等位基因变体和诸如取代、添加和/或缺失等其它突变。术语ApoC1亦指编码所述蛋白的核酸序列。该序列对应于NM_533643.2和所附SEQ. ID. NO: 21。ApoC1亦指与SEQ. ID. NO: 21和SEQ. ID. NO:21的片段杂交的核酸序列。
[0050] 抑制素βA (INHBA)。Affymetrix探针Cfa596.1A1_at对应于NCBI 参考序列：XP_540364，登录XP_540364，类似于抑制素βA链前体(INHBA)(激活蛋白β-A-链)(红细胞分化蛋白，EDF)。犬抑制素βA前体(INHBA)是由XM_540364.2以GeneID:483245 [SEQ.ID. NO: 11]编码的含424个氨基酸的蛋白质。
[0051] 术语“抑制素βA链前体”和“INHBA”表示基本上具有如SEQ. ID. NO: 11所示氨基酸序列的蛋白质。优选抑制素为基本上由SEQ. ID. NO: 11所示氨基酸序列组成的蛋白质。抑制素亦包括SEQ. ID. NO: 11所示序列的蛋白变体，例如等位基因变体和诸如取代、添加和/或缺失等其它突变。术语抑制素亦指编码所述蛋白的核酸序列。该序列对应于XM_540364.2和所附SEQ. ID. NO: 22。抑制素亦指与SEQ. ID. NO: 22和SEQ. ID. NO:22的片段杂交的核酸序列。
[0052] 在本发明优选实施方案中，用于在犬中诊断肾脏病症的方法包括以下步骤：(a)测量来自犬生物样品的至少一种生物标志物的表达水平，其中所述至少一种生物标志物选自分泌型卷曲相关蛋白2 (SFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)；和(b)鉴定具有肾脏病症的犬，其中样品中一种或多种生物标志物的表达相对于正常动物样品中表达的对照值有差异，表明存在肾脏病症。
[0053] 在本发明另一优选实施方案中，由领域内公认的临床测量来确定犬有正常肾功能，所述测量例如肾小球滤过率、肌酐清除率、尿蛋白水平、血肌酐水平、尿肌酐水平和/或血尿素氮水平；本发明方法可用于在所述犬中检测和诊断从正常状态到异常状态的变化，该变化导致特征为肾功能降低、肾衰竭、肾小球滤过率降低和肾小球肾炎的肾脏病症。
[0054] 在另一优选实施方案中，犬中一种或多种基因的活性或表达水平升高与以肾功能异常丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎为特征的肾脏病症相关，所述一种或多种基因选自：腔蛋白聚糖(LUM)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)和胞外基质蛋白-2 (Matn2)。一种或多种基因的活性或表达水平可通过测量所述基因的表达产物来测定，所述表达产物可为多核苷酸或多肽或蛋白质，通常是RNA转录物或其翻译产物。
[0055] 在另一优选实施方案中，犬中选自至少一种RNA转录物或其翻译产物的一种或多种基因的差异表达与肾功能异常丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎相关，所述至少一种RNA转录物或其翻译产物选自：分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。
[0056] 在另一优选实施方案中，犬中选自第一组的至少一种RNA转录物或其翻译产物的一种或多种基因的差异表达与肾功能异常丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎相关，所述第一组的至少一种RNA转录物或其翻译产物选自由分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)或胞外基质蛋白-2 (Matn2)；和任选地第二组的至少一种RNA转录物或其翻译产物选自以下：腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。应该理解，本发明考虑包括基因及其表达产物的生物标志物的组合，其为以下二者：(i)选自第一组的至少一种RNA转录物或其翻译产物和任选第二组的至少一种RNA转录物或其翻译产物，所述第一组的至少一种RNA转录物或其翻译产物选自：分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)或胞外基质蛋白-2(Matn2)，所述第二组的至少一种RNA转录物或其翻译产物选自：腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)；以及(ii) 第一组的至少一种RNA转录物或其翻译产物和第二组的至少一种RNA转录物或其翻译产物，所述第一组的至少一种RNA转录物或其翻译产物选自：分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)或胞外基质蛋白-2(Matn2)，和所述第二组的至少一种RNA转录物或其翻译产物选自：腔蛋白聚糖 (LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA(INHBA)。本发明实施方案考虑从两个基因分组及其表达产物的各种组合构建生物标志物组。
[0057] 在另一优选实施方案中，本发明包括犬中选自至少一种RNA转录物或其翻译产物的一种或多种基因的差异表达的测量及与犬中加速或早期肾功能丧失的相关性，所述至少一种RNA转录物或其翻译产物选自：分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)，且其中加速或早期肾功能丧失由导致肾脏病症的异常过程证实，所述肾脏病症特征为肾功能降低、肾小球滤过率降低、肾小球肾炎或肾衰竭。
[0058] 在一个方面，本发明包括让组织样品或体液试样与检测犬中一种或多种基因或所述一种或多种基因的表达产物的试剂接触，所述一种或多种基因的表达产物选自至少一种RNA转录物或其翻译产物，所述至少一种RNA转录物或其翻译产物选自：分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。试剂可以是抗体或核酸探针，其与诸如在固相、微量滴定孔、试管、测验片(dipstick)上固定等常规测定手段或其它常规手段联合使用。
[0059] 在另一实施方案中，本发明方法包括单独使用常规测定手段或常规测定手段与采用多肽和/或多核苷酸的基因表达微阵列展示联合使用，来测定犬中的基因表达，所述常规测定手段包含以下中的一种或多种：ELISA、RIA、免疫印迹测定、原位杂交、RNA印迹分析、蛋白质印迹分析和Luminex X-Map®分析。
[0060] 本发明另一实施方案包括诊断特征为随时间推移异常的肾功能丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎的肾脏病症，以选择治疗所述犬的疗程，所述诊断通过一种或多种基因或其表达产物的基因表达谱的测定与一种或多种常规诊断测量法相结合来进行，所述一种或多种基因的表达产物选自至少一种RNA转录物或其翻译产物，所述至少一种RNA转录物或其翻译产物选自：分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)，所述一种或多种常规诊断测量选自：白蛋白、血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、血肌酐、尿肌酐、肌酐清除率、尿蛋白、血尿素氮和肾小球滤过率水平的测定。
[0061] 在另一实施方案中，本发明特征是诊断和/或监测犬中随时间推移的肾脏病症的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种能检测一种或多种基因或其表达产物的基因表达谱的试剂，所述一种或多种基因的表达产物选自至少一种RNA转录物或其翻译产物，所述至少一种RNA转录物或其翻译产物选自：分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)；所述试剂盒还包括用所述一种或多种试剂来评估所述犬患的肾脏病症的风险的使用说明书，所述肾脏病症的特征为随时间推移异常的肾功能丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎。
[0062] 在另一方面，本发明包括让组织样品或体液试样与检测一种或多种基因或其表达产物的试剂接触，所述一种或多种基因的表达产物选自至少一种RNA转录物或其翻译产物，所述至少一种RNA转录物或其翻译产物选自：分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。试剂可以是抗体或核酸探针，其与诸如在固相、微量滴定孔、试管、测验片上固定的常规测定手段或其它常规测定手段联合使用。
[0063] 本发明特别优选的实施方案如下。在以下每一个实施方案中，本发明考虑包括来自犬的固体肾脏组织(solid kidney tissue)样品或生物学流体样品的受试样品。所述基因的差异表达考虑按绝对项(absolute terms)计算的显著性差异。在优选实施方案中，差异表达可大于约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5或3.0倍或更大。尤其优选差异表达值大于约2倍或在平均值附近的一个标准差。并且，本发明的实施方案可采用领域内公认的多种检测手段，包括一种或多种杂交探针阵列、一种或多种抗体组和这些技术的联合。当需要免疫测定时，技术人员可从领域内公认的许多技术中选择，包括选自以下的免疫测定：竞争性结合测定、非竞争性结合测定、放射性免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心式测定(sandwich assay)、沉淀素反应、凝胶扩散免疫扩散测定、凝集测定、荧光免疫测定、化学发光免疫测定、免疫PCR免疫测定、蛋白A或蛋白G免疫测定和免疫电泳测定。当指定常规诊断测量时，其可选自：白蛋白、血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、血肌酐、尿肌酐、肌酐清除率、尿蛋白、血尿素氮和肾小球滤过率水平的测定。
[0064] 另外，本发明的方法和组合物考虑利用至少一种RNA转录物或其翻译产物，其有可为基因或其翻译产物的改变形式。
[0065] 本发明更进一步的实施方案包括用于诊断犬中肾脏病症的方法，所述方法包括以下步骤：(a)测量来自犬生物样品的至少一种生物标志物的表达水平，其中所述至少一种生物标志物选自至少一种基因或所述基因的翻译产物，所述至少一种基因或所述基因的翻译产物选自：分泌型卷曲相关蛋白2 (SFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)；和(b)鉴定具有肾脏病症的犬，其中样品中一种或多种生物标志物的表达相对于正常动物样品中表达的对照值有差异，表明存在肾脏病症。
[0066] 另一实施方案包含用于诊断、预测或监测犬肾脏病症的试剂盒，试剂盒包括至少一种或多种能检测至少一种或多种RNA转录物或其翻译产物的试剂，所述至少一种RNA转录物或其翻译产物选自第一组的至少一种基因或所述基因翻译产物，所述第一组的至少一种基因或所述基因翻译产物选自：分泌型卷曲相关蛋白2 (SFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖 (LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4(rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)；试剂盒还包括用所述至少一种或多种试剂来测量一种或多种生物标志物的表达并诊断所述犬中肾脏疾病的使用说明书。
[0067] 在又一方面，本发明涉及包含一种或多种核酸探针的组合物，所述核酸探针与编码选自以下的本发明生物标志物的核酸或其片段特异性杂交：分泌型卷曲相关蛋白2 (SFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、基质金属蛋白酶9 (MMP9)、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。
[0068] 在另外的方面，本发明涉及包含抗体的组合物，所述抗体与由表达选自以下的本发明生物标志物的基因所编码的多肽特异性结合：分泌型卷曲相关蛋白2 (SFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖 (LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、基质金属蛋白酶9 (MMP9)、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。
[0069] 本文还考虑本发明方法可与传统诊断技术联合使用，所述传统诊断技术可检测肾脏病症的物理或形态学特征。因此，例如，从犬组织样品或体液试样获得的细胞中肾脏基因的差异表达表征可与常规诊断(例如放射学的)技术联合，以确证在犬中包括例如肾小球肾炎的肾脏病症的诊断。
[0070] 本发明亦涉及诊断犬中异常肾脏病症的试剂盒，所述试剂盒包括可用于检测本发明生物标志物的表达的组分，所述组分包括但不限于本文所述的组合物和微阵列。
[0071] 本发明的又一方面是用于诊断和/或预测犬肾脏病症的方法，其中所述方法包括以下步骤：从动物获得至少一种组织样品或体液试样；在所述从动物中获得的至少一种样品或试样中测定选自表3的一种或多种生物标志物的量，其中所述生物标志物为多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢物。
[0072] 本发明的又一实施方案是用于诊断和/或预测犬肾脏病症的试剂盒，特别是用于实施诊断和/或预测犬肾小球肾炎的方法的试剂盒，其中所述方法包括以下步骤：从动物中获得至少一种组织样品或体液试样；在所述从动物中获得的至少一种样品或试样中测定选自表3的一种或多种生物标志物的量，其中所述生物标志物为多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢物，和任选还包括与所述生物标志物连接的可检测试剂。
[0073] 本发明再一实施方案是用于诊断和/或预测犬肾小球肾炎的试剂，特别是用于实施诊断和/或预测犬肾小球肾炎的方法的试剂，其中所述方法包括以下步骤：从动物中获得至少一种组织样品或体液试样；在所述从犬中获得的至少一种样品或试样中测定选自表3的一种或多种生物标志物的量，其中所述生物标志物为多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢物，和任选还包括与所述生物标志物连接的可检测试剂。
[0074] 本发明的又一方面是用于诊断和/或预测犬肾脏病症的方法，其中所述方法包括以下步骤：从动物中获得至少一种组织样品或体液试样；在所述从动物中获得的至少一种样品或试样中测定选自表3和4的一种或多种生物标志物的量，其中所述生物标志物为多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢物。
[0075] 本发明的另一实施方案是选自以下的作为生物标志物的一种或多种多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢物在用于诊断和/或预测肾脏病症中的用途，特别是在用于形成用于诊断或预测犬肾脏病症的试剂盒中的用途：分泌型卷曲相关蛋白2 (SFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖 (LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、基质金属蛋白酶9 (MMP9)、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。
[0076] 本发明的另一实施方案是选自以下的作为生物标志物的一种或多种多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢物在用于诊断和/或预测肾脏病症中的用途，特别是在用于形成用于诊断或预测犬肾脏病症的试剂盒中的用途：分泌型卷曲相关蛋白2 (SFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖 (LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、基质金属蛋白酶9 (MMP9)、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。
[0077] 又一实施方案是所述试剂盒，其中的试剂和设备包括DNA微阵列分析材料，所述材料包括寡核苷酸微阵列、c-DNA微阵列和融合的基因芯片或其组合。
[0078] 本发明另一实施方案是评价用于患有肾脏病症的犬的营养管理疗程的进度的方法，所述方法包括：(a)在治疗疗程中的第一时间点测量所述犬组织样品或体液试样中选自以下的一种或多种生物标志物多肽、蛋白质、RNA、DNA、多核苷酸或其代谢物的最初水平：分泌型卷曲相关蛋白2 (SFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、基质金属蛋白酶
9 (MMP9)、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)；(b)在治疗疗程的第二个点测量来自所述犬的所述样品或试样中所述生物标志物的第二水平；和(c)比较在所述第一点和所述第二点生物标志物的测量结果，其中生物标志物的表达与对照动物细胞中的表达比较具有至少约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、
2.5或 3.0 倍的基因表达差异或更多差异。
9 (MMP9)、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)；(b)在治疗疗程的第二个点测量来自所述犬的所述样品或试样中所述生物标志物的第二水平；和(c)比较在所述第一点和所述第二点生物标志物的测量结果，其中生物标志物的表达与对照动物细胞中的表达比较具有至少约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、
2.5或 3.0 倍的基因表达差异或更多差异。
[0079] 本发明再一实施方案是用于鉴定组织样品或体液试样间差异表达的众多基因以在信息阵列中使用的方法，所述方法包括：提供来源于第一组织样品的第一组异质核酸探针；提供来源于第二组织样品的第二组异质核酸探针；将包含来源于生物学过程基因的众多序列的核酸阵列与第一组探针杂交，并测定阵列中序列的第一表达水平；将所述阵列与所述第二组探针杂交，并测定阵列中序列的第二表达水平；通过让杂交的序列的第一表达水平与所述第二表达水平比较来鉴定所述生物学过程中差异表达的众多基因；通过选自下述步骤的步骤建立所鉴定基因的排序：测定第一表达水平和第二表达水平之间差异的绝对值，将具有较高差异性的基因排在具有较低差异性的基因之上；测定第一表达水平和第二表达水平之间差异的标准差，将具有较高标准差的基因排在具有较低标准差的基因之上，其中所述基因选自：分泌型卷曲相关蛋白2 (SFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、基质金属蛋白酶9 (MMP9)、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。
[0080] 本发明的另一实施方案是用于将核酸阵列转化为信息阵列的方法，所述方法包括：提供来源于第一组织样品的第一组异质核酸探针；提供来源于第二组织样品的不同的第二组异质核酸探针；将包含众多序列的核酸阵列与第一组探针杂交，并测定阵列中序列的第一表达水平；将所述阵列与所述第二组探针杂交，并测定阵列中序列的第二表达水平；基于所鉴定基因的第一表达水平和第二表达水平之间的差异来鉴定所述生物学过程中差异表达的众多基因，其通过选自以下步骤的步骤来进行：测定第一表达水平和第二表达水平之间差异的绝对值，将具有较高差异性的基因排在具有较低差异性的基因之上；测定第一表达水平和第二表达水平之间差异的标准差，将具有较高标准差的基因排在具有较低标准差的基因之上；从所鉴定的众多差异表达基因中选择基因以包含在信息阵列中，其中所述基因选自：分泌型卷曲相关蛋白2 (SFRP2)和胞外基质蛋白-2 (Matn2)；和任选选自以下的一种或多种基因：腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、基质金属蛋白酶9 (MMP9)、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。
[0081] 本发明的另一实施方案是测定肾脏病症治疗功效的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供来自患肾脏病症并已接受所述治疗的狗的生物样品；(b)测定所述样品中肾小球肾炎的一种或多种生物标志物水平，以创建所述犬的表达谱；和(c)让所述表达谱与以下表达谱进行比较：i)在开始所述治疗之前从所述受试犬中获得的可比较的表达谱；和/或ii)在所述治疗的早期从所述受试犬中获得的可比较的表达谱，和/或iii)未患肾脏病症的受试者的可比较的表达谱特性，其中肾脏病症的一种或多种生物标志物包含选自以下的一种或多种基因的表达产物：分泌型卷曲相关蛋白2 (SFRP2)和胞外基质蛋白-2 (Matn2)；和任选选自以下的一种或多种基因的表达产物：腔蛋白聚糖(LUM)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、基质金属蛋白酶9 (MMP9)、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)。
[0082] 本发明的其它和更多目的、特征和优点对领域技术人员将随即清楚明了。
[0083] 发明详述
[0084] 本文所用异常犬是具有发展异常的肾功能丧失、肾衰竭、肾小球滤过率降低或肾小球肾炎风险的、具有所述疾病倾向的或患有所述疾病的犬，其中可通过利用自所述犬采集的生物学试样分离和测量的至少一种相关的生物标志物来检测异常性。
[0085] 在整个公开内容中，可以以范围形式呈现本发明的各个方面。应该理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应该解释为对本发明范围的不可改变的限制。因此，应认为对范围的说明是具体地公开了该范围内所有可能的子范围以及各个数值。例如，应该认为例如1-5的范围描述明确地公开了该范围内的子范围，例如1-3、1-4、2-4、2-5、3-5等，以及范围内的各个值，例如1、2、3、4和5。这适用于无论多宽的范围。
[0086] 除非另外指出，否则本发明的实施可采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术及阐述，它们均在本领域技术之内。所述常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接和用标记检测杂交。
[0087] 本发明亦考虑与固相基片(solid substrate)连接的聚合物的许多应用。这些应用包括基因表达的监测、谱分析(profiling)、文库筛选、基因分型和诊断。
[0088] 本领域技术人员将认识到本发明中体现的产品和方法可应用到很多系统中，包括市购基因表达监测系统，其涉及核酸探针阵列、膜印迹、微孔、珠和样品管，用本领域已知的各种方法由各种材料构成。因此，本发明不限于任何具体环境，并且本发明中具体实施方案的以下阐述仅用于阐明性目的。
[0089] 在优选实施方案中，基因表达监测系统可包含核酸探针阵列(包括寡核苷酸阵列、cDNA阵列、斑点阵列(spotted array)等等)、膜印迹(例如用于杂交分析，例如RNA印迹、DNA印迹、斑点印迹等等)或微孔、样品管、珠或纤维(或任何包含有结合的核酸的固相载体(solid support))。基因表达监测系统亦可包含溶液中的核酸探针。
[0090] 本发明亦考虑涉及扩增的样品制备。可通过多种机制扩增基因组样品，其中一些可采用PCR。样品可在阵列上扩增。
[0091] 其它适宜的扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)(例如，Wu和Wallace, Genomics4, 560 (1989)；Landegren等, Science 241, 1077 (1988)；和Barringer等, Gene
89:117 (1990))、转录扩增(Kwoh等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)和WO88/10315)、自我持续序列复制(Guatelli等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990)和WO90/06995)、靶多核苷酸序列的选择性扩增(美国专利号6,410,276)、共有序列引物聚合酶链式反应(CP-PCR)(美国专利号4,437,975)、随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)(美国专利号5,413,909, 5,861,245)和基于核酸的序列扩增(NABSA)。
89:117 (1990))、转录扩增(Kwoh等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)和WO88/10315)、自我持续序列复制(Guatelli等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990)和WO90/06995)、靶多核苷酸序列的选择性扩增(美国专利号6,410,276)、共有序列引物聚合酶链式反应(CP-PCR)(美国专利号4,437,975)、随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)(美国专利号5,413,909, 5,861,245)和基于核酸的序列扩增(NABSA)。
[0092] 可使用将本发明基因表达监测系统，以便于对不同细胞或组织、同一细胞或组织的不同亚群、同一细胞或组织的不同生理状态、同一细胞或组织的不同发育阶段或同一组织的不同细胞群中的表达进行比较性分析。在优选实施方案中，本发明相应的扩增方法可提供可重现的结果(即在统计学显著的误差范围或置信度范围内)，其足以促进受试样品的定量差异的测量以及定性差异的测量。
[0093] 术语“抗体”意为结合特定抗原的任何免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE抗体。该术语包括多克隆抗体、单克隆抗体、单价抗体、人源化抗体、异源缀合抗体、具多表位特异性的抗体组合物、嵌合抗体、双特异性抗体、双抗体、单链抗体和抗体片段例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv或其它抗原结合片段。
[0094] 术语“阵列”意为至少两种探针在基片上的有序排列。至少一种探针是对照或标准品，至少一种探针是诊断探针。基片上约2至约40,000种探针的排列，确保了探针与样品多核苷酸或多肽之间形成的每一种带标记的复合物的大小和信号强度是可单独区分的。可合成制备或生物合成制备阵列上沉积分子的集合。阵列可呈多种形式，包括可溶性分子文库、附着(tether)于树脂珠上的化合物文库、二氧化硅芯片或其它固相载体。核酸阵列可包括核酸文库，其可通过将基本上任何长度(例如从1-约1000个核苷酸长度)的核酸点样(spot)到基片上来制备。核酸探针阵列优选包含在已知位点与基片结合的核酸。在其它实施方案中，系统可包括固相载体或基片，例如膜、滤纸、显微镜载片、微孔、样品管、珠、珠阵列等等。固相载体可用各种材料来制造，包括纸、纤维素、尼龙、聚苯乙烯、聚碳酸酯、塑料、玻璃、陶瓷、不锈钢等等。固相载体可优选具有刚性或半刚性表面，并且可优选球形的(例如珠)或基本上平面的(例如平坦表面)，且带有适宜的孔、隆起区域或蚀刻槽等等。固相载体亦可包括可供核酸植入的凝胶或基质。
[0095] 术语“生物标志物”是指基因和由本发明中的基因编码的基因产物，即其中业已确定所述基因因肾脏病症而差异调控。另外，该术语通常用于指所述基因或蛋白质的任何部分，所述基因或蛋白质的任何部分可例如在本发明的测定或其它方法中鉴定全长基因或蛋白质或与全长基因或蛋白质关联。
[0096] 亦可通过检测生物标志物的翻译(即检测样品中的生物标志物蛋白)来确定生物标志物的表达。适于检测生物标志物蛋白的方法包括用于检测和/或测量来自细胞或细胞提取物的蛋白质的任何合适方法。所述方法包括但不限于免疫印迹(例如蛋白质印迹)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、免疫组织化学和免疫荧光。特别优选的用于检测蛋白质的方法包括任何单细胞测定，其包括免疫组织化学和免疫荧光测定。所述方法为本领域所熟知。此外，本领域已知针对本文所述的某些生物标志物的抗体，其阐述于公开发表的文献中，并且其制备方法为技术人员所熟知。
[0097] 术语“差异的表达”或“差异地表达”意为增加的或未调控的基因表达，或意为减少的或下调的基因表达，其通过样品中转录的信使RNA或翻译的蛋白质的不存在情况、存在情况或其量的变化为至少两倍或为至少2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1或1.0倍来检测。
[0098] 当使用术语“倍”作为差异的基因表达的量度时，意为与对照值的基因表达量相比，犬中基因表达量是多倍或分数的基因表达。例如，动物中基因表达为对照值的2倍，则具有2倍差异的基因表达；动物中基因表达为对照值的三分之一，则具有2倍差异的基因表达。
[0099] 术语“片段”意指(1)为完整序列的一部分并在特定用途中具有与完整多核苷酸序列相同或相似活性的寡核苷酸或多核苷酸序列，或(2) 为完整序列的一部分并在特定用途上具有与完整多肽序列相同或相似活性的肽或多肽序列。所述片段可包含认为适于特定用途的任何数量的核苷酸或氨基酸。通常寡核苷酸或多核苷酸片段含有至少约10、50、100或1000个核苷酸，多肽片段含有至少约4、10、20或50个来自于完整序列的连续的氨基酸。该术语包括片段的多核苷酸和多肽变体。例如，多核苷酸可破碎或碎裂(fragment)为多个区段。
[0100] 用于碎裂核酸的各种方法为本领域所熟知。这些方法可为例如本质是化学的或物理的方法。化学碎裂可包括DNA酶的部分降解；用酸的部分脱嘌呤；限制性酶的使用；内含子编码的内切核酸酶；基于DNA的裂解方法，例如三螺旋和杂交形成法，其依赖于核酸区段的特异性杂交，将裂解剂定位在核酸分子的特定位点；或在已知或未知位点裂解DNA的其它酶或化合物。物理碎裂方法可涉及使DNA遭受高剪切速率。高剪切速率可通过例如以下方法产生：让DNA传过带有凹陷或突起的室或通道而移动；或强迫DNA样品通过限制尺寸的流通道，例如横断面维度在微米或亚微米尺度的孔隙。其它物理方法包括超声法或喷雾法。同样可采用物理和化学碎裂方法组合，例如通过热或离子介导的水解来碎裂。可优化这些方法以将核酸消化为所选择大小范围的片段。有用的大小范围可从100、200、400、700或1000至500、800、1500、2000、4000或10,000个碱基对。然而，较大大小范围例如4000、10,000 或20,000至10,000、20,000或500,000个碱基对亦是有用的。
[0101] 术语“基因”意为在产生多肽中涉及的完整或部分DNA区段，包括编码区的前面和后面的区域(前导和拖尾)及各个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。该术语包括与基因编码序列的互补序列(complement)杂交的任何DNA序列。
[0102] 术语“同源物(homolog)”意为(1)多核苷酸，包括来自相同或不同动物物种的多核苷酸，其与多核苷酸具有大于30%、50%、70%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相似性，其与完整多核苷酸具有相同或基本上相同的特性并执行相同或基本上相同的功能，或在严格条件下具有与多核苷酸特异性杂交的能力；或(2) 多肽，包括来自相同或不同动物物种的多肽，其与通过多核苷酸表达鉴定的多肽具有大于30%、50%、70%、
90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相似性，其与完整多肽具有相同或基本上相同的特性并执行相同或基本上相同的功能，或其具有与通过多核苷酸表达鉴定的多肽特异性结合的能力。用技术人员已知的方法来测定两个多肽序列或两个多核苷酸序列的序列相似性，所述方法例如Karlin和Altschul的算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:2264-2268 (1990))。所述方法被结合到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中(J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))。为获得有缺口的比对用于比较目的，可使用Altschul等(Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))所述的Gapped Blast。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各自程序(例如NBLAST和XBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相似性，其与完整多肽具有相同或基本上相同的特性并执行相同或基本上相同的功能，或其具有与通过多核苷酸表达鉴定的多肽特异性结合的能力。用技术人员已知的方法来测定两个多肽序列或两个多核苷酸序列的序列相似性，所述方法例如Karlin和Altschul的算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:2264-2268 (1990))。所述方法被结合到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中(J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))。为获得有缺口的比对用于比较目的，可使用Altschul等(Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))所述的Gapped Blast。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各自程序(例如NBLAST和XBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
[0103] 术语“杂交”是指其中两条单链多核苷酸非共价结合形成稳定的双链多核苷酸的过程。术语“杂交”亦可指三链杂交。所得(通常)双链多核苷酸是“杂合物(hybrid)”。形成稳定杂合物的多核苷酸群体的比例在本文中称为“杂交度”。
[0104] 杂交反应可以以绝对或差异杂交形式进行。在绝对杂交形式中，将源于一个样品的多核苷酸与核酸阵列中的探针杂交。形成杂交复合物后检测到的信号与样品中的多核苷酸水平相关。在差异杂交形式中，将源于两个样品的多核苷酸用不同的标记部分来标记。将这些带有不同标记的多核苷酸的混合物加入到核酸阵列中。然后在可单独检测来自两种不同标记的发射的条件下检查核酸阵列。在一个实施方案中，使用荧光团Cy3和Cy5 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.)作为差异杂交形式的标记部分。
[0105] 可使用市购的软件来分析自核酸阵列采集的信号，例如由Affymetrix或Agilent Technologies所提供的软件。优选在杂交实验中包括对照，例如用于扫描灵敏度、探针标记和cDNA或cRNA量化。可将杂交信号定标或标准化，然后进行进一步分析。例如，当在相似测试条件下使用多于一个阵列时，可将每一单独探针的杂交信号标准化以考虑杂交强度的变异。亦可使用源于每一阵列含有的内部标准化对照的强度将杂交信号标准化。另外，样品间具有相对一致表达水平的基因可用于其它基因表达水平的标准化。在一个实施方案中，本发明核酸阵列中包含某些维持基因(maintenance gene)的探针。选择这些基因是因为它们在一系列不同组的组织之间显示出稳定的表达水平。可基于这些维持基因的表达水平来标准化和/或标度杂交信号。
[0106] 术语“杂交复合物”意指当一个多核苷酸的嘌呤以氢键和互补多核苷酸的嘧啶结合时，在样品多核苷酸之间形成的复合物，例如，5’-A-G-T-C-3’与3’-T-C-A-G-5’进行碱基配对。互补程度和核苷酸类似物的使用影响杂交反应的效率和严谨性。
[0107] 术语“杂交探针”包括能以碱基特异性方式与互补核酸链结合的核酸(例如寡核苷酸)。
[0108] 术语“肾脏疾病”或“肾脏病症”或类似地“肾的疾病”或“肾的病症”意欲涵盖肾功能急性或慢性异常丧失，例如肾衰竭、肾小球滤过率降低和肾小球肾炎。肾小球肾炎可呈涉及肾小球基底膜变厚的膜性肾小球肾炎形式。或者，肾小球肾炎可呈的增生性或系膜增生性肾小球肾炎(其以小球膜基质细胞增生为特征)形式。另外，肾小球肾炎可为涉及前述变化的组合的膜性增生性肾小球肾炎。肾小球硬化症是严重形式的肾小球肾炎。肾脏疾病或肾脏病症亦包括肾炎、肾病变、超滤、轻度微量白蛋白尿、临床白蛋白尿、晚期临床肾病变、慢性肾功能不全、肾乳头损伤、肾小管坏死和糖尿病肾病，其全部可由本领域普通兽医区别地诊断。本术语并非意欲包括遗传起因的多囊性肾病。
[0109] 术语“多核苷酸”或“寡核苷酸”意为核苷酸的聚合物。该术语包括DNA和RNA (包括cDNA和mRNA)分子，其为单链或双链，如果是单链，则为其线性或环状形式的互补序列。该术语亦包括片段、变体、同源物和等位基因，为具有与原序列相同或基本上相同的特性和执行相同或基本上相同功能的合适片段。比对时所述序列可为完全互补(无错配)或可具有多达约30%的序列错配。对于多核苷酸，优选链含有约50-10,000个核苷酸，更优选约150-3,500个核苷酸。对于寡核苷酸，优选链含有约2-100个核苷酸，更优选约6-30个核苷酸。多核苷酸或寡核苷酸的确切大小将取决于各种因素和具体应用及所述多核苷酸或寡核苷酸的用途。该术语包括合成的和分离纯化自天然来源的核苷酸聚合物。术语“多核苷酸”包含“寡核苷酸”在内。
[0110] 术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”意为氨基酸的聚合物。该术语包括天然存在的和非天然存在的(合成的)聚合物和其中人工化学模拟物被一种或多种氨基酸取代的聚合物。该术语亦包括具有与原序列相同或基本上相同特性并执行与原序列相同或基本上相同功能的片段、变体和同源物。该术语包括任意长度的聚合物，优选含有约2-100个氨基酸，更优选约5-500个氨基酸的聚合物。该术语包括合成的和分离纯化自天然来源的氨基酸聚合物。
[0111] 术语“探针”意为(1)寡核苷酸或多核苷酸，其为RNA或DNA，无论其是天然存在的如纯化的限制性酶消化物还是合成产生，都能与具有与所述探针互补序列的多核苷酸退火或特异性杂交；或(2)能特异性结合特定蛋白质或蛋白质片段以基本上排斥其它蛋白质或蛋白质片段的肽或多肽。寡核苷酸或多核苷酸探针可为单链或双链。探针的确切长度将取决于多种因素包括温度、来源和用途。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸探针通常含有约10-100、15-50或15-25个核苷酸。在某些诊断应用中，多核苷酸探针含有约100-1000、300-600个核苷酸，优选约300个核苷酸。本文所选的探针“基本上”与特定靶序列的不同链互补。这意味着探针必须充分互补以在一组预设条件下与其各自靶序列特异性杂交或退火。因此，探针序列不必反映靶的精确互补序列。例如，非互补核苷酸片段可连接在探针的5’或3’端，探针序列的其余部分与靶序列互补。或者，非互补碱基或更长的序列可散步于探针中，前提是探针序列与靶多核苷酸具有足够的互补性来与靶多核苷酸特异性退火。肽或多肽探针可为蛋白或多肽所特异性结合的任何分子，包括DNA (用于DNA结合蛋白)、抗体、细胞膜受体、肽、辅因子、凝集素、糖、多糖、细胞、细胞膜、细胞器和细胞器膜。
[0112] 术语“样品”和“试样”意为含有例如多核苷酸、多肽、抗体、代谢物等等的任何动物组织或流体，包括含有DNA和RNA的细胞和其它组织。实例包括：血液、软骨、结缔、上皮、淋巴样、肌肉、神经、痰等等。样品可为固态或液态，可为DNA、RNA、cDNA、诸如血液和尿液等体液、细胞、细胞制品或其可溶组分或介质等分试样、染色体、细胞器等等。
[0113] 术语“单个包装”意为试剂盒组分物理上结合在一个或多个容器中或与其相关，其被作为制造、分配、销售或使用的单元。容器包括但不限于袋、盒、瓶、收缩包装包、钉住的或另外附着的组分或其组合。单个包装可为物理上结合的单独的食物组分容器，使得其被作为制造、分配、销售或使用的单元。
[0114] 术语“特异性结合”意为两分子间特异的和精确的相互作用，其取决于它们的结构尤其是它们的分子侧基。例如，调节蛋白插入到DNA分子的大沟中、两单链核酸之间沿主链的氢键结合或蛋白表位与激动剂、拮抗剂或抗体间的结合。
[0115] 术语“特异性杂交”意为两个有足够互补序列使得可在本领域通常使用的预设条件下进行所述杂交的单链多核苷酸间的缔合(有时称为“基本上互补”)。例如，该术语可指多核苷酸探针与本发明一方面的单链DNA或RNA分子内含有的基本上互补的序列杂交，可指基本上排除所述多核苷酸探针与非互补序列的单链多核苷酸杂交。
[0116] 术语“严格条件”意为：(1)在含0.1%牛血清白蛋白、0.1%蔗聚糖(Ficoll)、0.1%聚乙烯吡咯烷酮、50 mM pH为6.5的磷酸钠缓冲液、750 mM NaCl、75 mM柠檬酸钠的50% (vol/vol)甲酰胺中于42℃杂交；(2)在50%甲酰胺、5x SSC (0.75 M NaCl、0.075 M柠檬酸钠)、50 mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1%焦磷酸钠、5x Denhardt's溶液、超声处理的鲑精DNA (50 μg/ml)、0.1% SDS和10%硫酸葡聚糖中于42℃杂交，且于42℃在0.2x SSC和0.1% SDS中洗涤，或用0.015 M NaCl、0.0015 M柠檬酸钠、0.1% Na2SO4于50℃洗涤，或采用类似低离子强度和高温洗涤剂和类似变性剂的类似程序。
[0117] 术语“物质”意为元素、化合物、分子或其混合物，或可能用于诊断、预测或调节动物中肾脏病症的发生或严重性的其它任何材料，包括任何药物、化学实体或生物实体。
[0118] 术语“有用的变异(variation)”意为(1)对于多核苷酸：所述多核苷酸的互补序列；所述多核苷酸的同源物及其互补序列；所述多核苷酸的变体、其互补序列及其同源物；所述多核苷酸的片段、其互补序列、其同源物及其变体；和(2)对于多肽：所述多肽的同源物；所述多肽的变体及其同源物；所述多核苷酸的片段、其同源物及其变体。
[0119] 术语“变体”意为(1)多核苷酸序列，其相对于原始(from or to)多核苷酸序列含有一个或多个核苷酸的任意取代、变异、修饰、取代、缺失或添加，其具有与原序列相同或基本上相同的特性并执行与原序列相同或基本上相同的功能；和(2)多肽序列，其相对于原始(from or to)多肽序列含有一个或多个氨基酸的任意取代、变异、修饰、取代、缺失或添加，其具有与原序列相同或基本上相同的特性并执行与原序列相同或基本上相同的功能。因此，该术语包括单核苷酸多态性(SNP)和等位基因变体，包括多肽中的保守或非保守氨基酸的取代。合适时，该术语亦包括多核苷酸或多肽的化学衍生，及用非天然存在的核苷酸或氨基酸对核苷酸或氨基酸进行的取代。
[0120] 术语“虚拟包装”意为试剂盒组分与关于指导用户如何获得其它组分的一种或多种物理的或虚拟的试剂盒组分的说明书结合，例如在袋中含有一种组分和说明书，所述说明书指导用户上网、获取记载的信息、查看可视信息或联系技术维护人员或指导人员以获取有关如何使用试剂盒的指导。
[0121] 本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂，因为它们可以变化。此外，本文所使用的术语仅仅用于阐述具体实施方案的目的，并非意欲限制本发明的范围。除非上下文中明确另外指出，否则本文和所附权利要求书所用单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数提及物，例如提及“一种变体”包括多种变体。此外，所定义的术语包括在正确语法情景中使用的所述术语变型，例如术语“特异性结合”包括“特异的结合”和该术语的其它形式。类似地，词语 “comprise”、“comprises”和“comprising”，都应理解为包括性的而不是排斥性的。
[0122] 除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语和任何首字母缩写，具有与本发明领域普通技术人员通常理解一样的意思。虽然与本文所述类似或等同的任何组合物、方法、制造品或其它手段或材料可用于实本发明，但本文阐述了优选的组合物、方法、制造品或其它手段或材料。
[0123] 本文引用或提到的所有专利、专利申请、出版物和其它参考文献在法律允许的范围内通过引用并入本文。那些参考文献的讨论仅意欲概述其中所作主张。不构成承认任何所述专利、专利申请、出版物或参考文献及其任何部分是本发明相关的先前技术，并且明确保留对所述专利、专利申请、出版物和其它参考文献的精确性和适当性的质疑权利。
[0124] 在一个实施方案中，本发明包括与从一种或多种正常动物中获得的对照值比较在异常动物中差异表达的一种或多种基因或基因区段(如本文所定义的“基因”)。本发明基于与正常动物相比在异常动物中差异表达的多核苷酸的发现。通过使用Affymetrix GeneChip®技术，将采自诊断为异常的动物的组织样品中的基因表达与诊断为正常的动物的组织样品中的基因进行比较，来鉴定所述基因。
[0125] 通过测量取自诊断为异常并具有肾脏病症的犬的组织样品中的基因表达相对于对照值的差异，来鉴定多核苷酸和基因，其中对照值从来自一种或多种正常动物的样品获得。可通过技术人员所知的任何方法来测定基因表达的变化。通常通过测量转录(测定基因产生的mRNA的量)或测量翻译(测定基因产生的蛋白质的量)来测定基因表达的变化。可用技术人员所知的用于定量多核苷酸和蛋白质的任何方法来测定基因产生的RNA或蛋白质的量。
[0126] 通常用以下方法来测定mRNA表达：聚合酶链式反应(PCR)(包括但不限于反转录PCR (RT-PCR)和实时定量PCR (qPCR))、短或长寡核苷酸阵列、cDNA阵列、EST测序、RNA印迹、SAGE、MPSS、MS、珠阵列和其它杂交方法。通常以mRNA或反转录mRNA形式来测量RNA。
[0127] 用各种比色测定和光谱测定及以下方法来测定蛋白质或多肽的表达：例如定量蛋白质印迹、ELISA、2D凝胶、气或液相色谱、质谱、lowry测定、双缩脲测定、荧光测定、比浊法、双金鸡宁酸测定、蛋白芯片技术、红外吸收、茚三酮、Bradford测定和紫外吸收。
[0128] 在优选方法中，使用自Affymetrix, Inc.获得的Affymetrix犬-1和犬-2基因芯片及使用所述芯片测定基因表达的说明书来测定基因表达的变化。基因芯片允许大规模研究生物过程和在某一时间点测量细胞内的活性。微阵列分析允许人们在大规模遗传基础上解释表型差异。基因表达产物的实际测量是比测定序列本身更为准确的基因功能指示剂。微阵列分析基于特定时间时细胞中基因的mRNA转录物浓度的定量。将DNA固定在介质上，标记的靶mRNA与阵列上的探针杂交。通过激光分析来测量标记的mRNA与探针的结合。该测量为发射的光子的计数。扫描整个芯片并数码成像。处理图片以定位探针并给每一探针指定强度测量。以这种方式可确定上调和下调基因。该分析使技术人员能够找出有类似表达谱的基因群，并确定具有类似表达谱的组织。以这种方式，可鉴定出解释组织样品中观察到的差异的基因。
[0129] Affymetrix基因芯片通常采用25 bp的探针和对应于特定基因或EST的11-20种探针的探针组。该芯片是用各25 bp完全匹配和错配的探针构建，前者与基因的特异区域完全互补，后者第13个bp碱基被取代以造成错配。用探针汇总算法(summarization algorithm)确定背景校正、标准化和探针汇总，其将探针值转换为探针组表达值。RMA是可用于该目的的算法之一。该算法执行最后两步分析，标准化和探针水平强度测量的汇总。因此，完全匹配值经背景校正、标准化和汇总为一组表达测量。
[0130] 用GeneSpring 7.0版(GS)软件(Agilent Corporation)来分析原始数据，并用R-Bioconductor (RB)免费软件确认。两个软件包都用于从由Affymetrix仪器产生的 CEL文件中计算探针强度。分别用R-Bioconductor和GeneSpring软件来计算每一探针的Present/Absent/Marginal调用(call)和P-值。
[0131] 通常通过测量至少一种基因的表达来测定差异基因表达。优选测量两种或更多种差异表达的基因的表达以提供基因表达模式或基因表达谱。更优选测量众多差异表达的基因的表达，为更显著的基因表达模式或表达谱提供信息。
[0132] 本发明提供共同或单独为或可用作肾脏疾病的标志物的众多标志物。在本发明尤其有用的实施方案中，可选择众多这些标志物，可同时测量其mRNA的表达以提供用于本申请所述本发明各个方面的表达谱。在本方法和组合物的优选实施方案中，从以下标志物中至少选择2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种标志物：腔蛋白聚糖(LUM)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、分泌型卷曲相关蛋白2 (sFRP2)、胞外基质蛋白-2 (Matn2)、视黄醇结合蛋白4 (rbp4)、MMP-9、簇蛋白(CLU)、转铁蛋白(TF)、Apo-C-1 (ApoC1)和抑制素βA (INHBA)，并可用于在实施本发明方法中采用的基因表达谱的测定。每种标记都具体与肾脏疾病的某些方面相联系。
[0133] 在本发明另一个实施方案中，或者，可通过检测对应于基因表达产物的蛋白质来测定基因表达水平。优选被命名的基因的分泌蛋白。
[0134] 在另一方面，本发明提供适于检测异常动物中与对照值相比差异表达的众多基因的表达的装置。该装置包括具有本发明的众多寡核苷酸或多核苷酸探针的基片，所述探针在已知位置附着于基片上。该装置本质上是本文所述寡核苷酸或多核苷酸探针的固定化形式。该装置可用于快速和特异检测基因和多核苷酸及其表达模式和表达谱。通常所述探针与基片或类似的固相载体相连，将含有一种或多种多核苷酸(例如基因、PCR产物、连接酶链式反应(LCR)产物、用扩增技术合成的DNA序列或其混合物)的样品暴露于探针中，以使样品多核苷酸可与探针杂交。通常用荧光团或其它标签例如链霉抗生物素来标记探针、样品多核苷酸中的任一种或二者，并用技术人员已知的方法检测。如果标记样品多核苷酸，可通过检测结合的荧光来检测杂交。如果标记探针，通常可通过标记淬灭来检测杂交。如果标记探针和样品多核苷酸二者，通常可通过监测因两个结合标记的靠近引起的色位移来检测杂交。多种标记策略和标记为技术人员所知，尤其是荧光标记。优选探针固定在适于形成类似于本领域已知的阵列(通过几个名字而知，包括DNA微阵列、基因芯片、生物芯片、DNA芯片和基因阵列)的基片上。
[0135] 可根据常规方法制备多肽探针，例如使用为本发明多核苷酸所提供的核苷酸序列数据和本领域已知的方法。所述方法包括但不限于：直接从细胞中分离多肽、分离或合成编码多肽的DNA或RNA并使用该DNA或RNA来产生重组产物、从单个氨基酸化学合成多肽和通过化学裂解现有多肽来产生多肽片段。
[0136] 在另一方面，本发明提供适于检测异常动物中与对照值相比差异表达的众多基因的表达的装置。该装置包括具有本发明的众多肽或多肽探针的的基片，所述探针在已知位置附着于基片上。该装置本质上是本文所述肽或多肽探针的固定化形式。该装置可用于快速和特异检测蛋白质及其表达模式。通常所述探针与基片相连，让含有一种或多种蛋白质的样品暴露于探针中，以使其可与探针杂交。在某些实施方案中，通常用荧光基团或技术人员已知的其它试剂来标记探针、样品蛋白质或二者并检测。通常与读取多核苷酸微阵列相同的方法和仪器适用于蛋白质阵列。优选探针固定在适于形成阵列的基片上。
[0137] 用于测定样品中蛋白质的量或浓度的方法为技术人员所知。所述方法包括放射性免疫测定、竞争性结合测定、蛋白质印迹分析和ELISA测定。对于使用抗体的方法，单克隆和多克隆抗体都适用。所述抗体对于蛋白质、蛋白表位或蛋白片段可为免疫学上特异的。
[0138] 本发明一些实施方案利用抗体检测并定量由本发明多核苷酸表达产生的蛋白质。虽然蛋白质可由免疫沉淀法、亲和分离、蛋白质印迹分析、蛋白阵列等等来检测，但优选方法利用ELISA技术，其中将抗体固定在固相载体上，让靶蛋白或肽暴露于固定化的抗体。用已知方法标记探针或靶标或二者。
[0139] 在一些实施方案中，通过利用检测多核苷酸或多肽的探针阵列来观测异常动物中差异表达的众多基因的表达模式或表达谱。在一个实施方案中，可利用寡核苷酸或多核苷酸探针阵列，而在另一个实施方案中，可利用抗体或与本发明中差异表达的基因产物特异性结合的其它蛋白质阵列。所述阵列可市购，或可用技术人员所知的方法来定制，例如在固相载体上原位合成，或经由微印刷技术(micro-printing technique)将预先合成的探针附着于固相载体上。在多种实施方案中，可定制多核苷酸或多肽探针阵列，以特异性检测由本发明中差异表达的基因产生的转录物或蛋白质。
[0140] 在一个实施方案中，定制多核苷酸或多肽探针阵列，以特异性检测由表2中鉴定的两种或更多种多核苷酸或基因产生的转录物或蛋白质。设计这些探针以检测动物中与脂质和葡萄糖代谢途径相关的基因。在另一个实施方案中，定制多核苷酸或多肽探针阵列，以特异性检测由表3-5中鉴定的两种或更多种多核苷酸或基因产生的转录物或蛋白质。设计这些探针以检测与正常犬相比与异常犬中尤其相关的基因。
[0141] 将这些探针暴露在样品中以形成杂交复合物，检测所述杂交复合物并将之与标准品的杂交复合物进行对比。来自样品和标准品的杂交复合物之间的差异表明多核苷酸的差异表达，因此表明与样品中对照值相比异常犬中基因的差异表达。在优选实施方案中，制备探针以特异性检测由本发明鉴定的一种或多种基因或基因片段产生的多核苷酸或其片段。用于检测杂交复合物的方法为技术人员所知。
[0142] 在另一方面，本发明提供用于检测与样品中正常犬相比异常犬中差异表达的基因的差异表达的方法。所述方法包括：(a)在允许探针和蛋白质发生特异性结合的条件下，让包含众多多肽探针的组合与样品中的蛋白质反应，其中被探针结合的蛋白质在与正常犬相比的异常犬中差异表达；(b)任选在允许探针和蛋白质发生特异性结合的条件下，让包含众多多肽探针的组合与标准品中的蛋白质反应，其中被探针结合的蛋白质在与正常犬相比的异常犬中差异表达；(c)检测样品中的特异性结合，并任选检测来自步骤(b)中的标准品的特异性结合；和(d)比较样品中和标准品中的特异性结合，其中所述标准品和样品中特异结合之间的差异表明与样品中正常犬相比异常犬中差异表达的基因的差异表达。
[0143] 将这些探针暴露在样品中以形成特异性结合，检测所述特异性结合并将其与标准品的特异结合进行对比。来自样品和标准品的特异性结合之间的差异表明蛋白质的差异表达，并因此表明与样品中正常犬相比异常犬中差异表达的基因，尤其是与异常有关的基因。在优选实施方案中，制备探针以特异性检测由本发明鉴定的一种或多种基因或基因片段产生的蛋白质或其片段。
[0144] 在一个实施方案中，所述方法进一步包括将犬或样品暴露给受试物质，然后让多肽与蛋白质反应。然后，比较表明：受试物质是否改变了样品中与正常犬相比异常犬中差异表达的基因(尤其是与异常相关的基因)的表达。
[0145] 实施例1：按照国际肾脏权益协会的指导方针对慢性肾脏疾病的犬进行分类[0146] 在以下实施例中，对比未表现出慢性肾脏疾病体征或症状的动物，测试了表现出慢性肾脏疾病临床体征的犬。基于下表1和2所提出的标准并按照国际肾脏权益协会(International Renal Interest Society, IRIS)的指导方针，对慢性肾脏疾病作了病理诊断。
[0147] 遵循CKD的诊断对慢性肾脏疾病(CKD)分期，以促进对受试动物的适当治疗和监测。分期最先基于空腹血浆肌酐，在稳定的动物中评价至少两个时段。将表现正常肾功能和无CKD临床体征或症状的犬归类为无疾病犬。犬中1期对应于先前分类的早期肾脏疾病，其无肾功能不全的CKD生化证据，其中未检测到氮血症，但是其中肾小球滤过率(GFR)可降低，肾脏的浓缩能力可为弱的。2期对应于先前分类的早期肾衰竭。在2期中，注意到有轻度的氮血症。3期对应于先前分类的尿毒症肾衰竭，其中检测到中度的氮血症。可存在尿毒症肾衰竭的系统性体征，例如骨痛、尿毒症性胃炎、贫血和代谢性酸中毒。4期对应于晚期肾衰竭，其特征为严重氮血症和增加的尿毒症危象(uremic crisis)的系统性临床体征。
[0148] 表1分别确定了所研究犬的五个分类。共研究了诊断为无CKD的42只狗。共14只1期犬表现出极轻的肾小球肾炎(GN)。所研究的表现出晚期CKD的狗的数量为：2期轻度GN = 24；3期中度GN = 8和4期显著GN = 13。表2中将每组狗的血浆肌酐水平表示为每组狗的血浆肌酐水平均值和中值。
[0149] 表1：犬的分期
[0150]
[0151] 表2 肌酐水平
[0152]病理诊断 血浆肌酐均值 mg/dl 血浆肌酐中值 mg/dl
无疾病(n = 42) 0.8 0.7
极轻GN (n = 14) 0.7 0.7
轻度GN (n = 24) 0.9 0.7
中度GN (n = 8) 1.5 1.5
显著GN (n = 13) 6.7 6.2
无疾病(n = 42) 0.8 0.7
极轻GN (n = 14) 0.7 0.7
轻度GN (n = 24) 0.9 0.7
中度GN (n = 8) 1.5 1.5
显著GN (n = 13) 6.7 6.2
[0153] 实施例2：候选者选择标准
[0154] 用GeneSpring 7.0版(GS)软件(Agilent Corporation)分析以下实施例的原始数据，并用R-Bioconductor (RB)免费软件确认。将两个软件包都用于从由Affymetrix仪器产生的CEL文件中计算探针强度。分别用R-Bioconductor和GeneSpring软件来计算每一探针的Present/Absent/Marginal调用和P-值。
[0155] 对任何给定分析确定基因表达数据是“上调”或“下调”。基于倍数变化来确定基因是“上调”还是“下调”，所述倍数变化计算为每一种单独的探针的治疗强度/对照强度。如果其值<1/2，认为倍数变化是下调的；如果其>2.0，则认为是上调的。此外，如果探针被调用为仅在待比较的情况之一(治疗或对照)中存在(present)，在另一种中为“不存在(absent)”或“微小的(marginal)”，并且根据所用软件,倍数变化显著，则认为将探针用于进一步观察有意义。
[0156] 实施例3：RNA分离程序
[0157] 材料和方法。可使用下列通用程序从狗和猫的组织样品中分离RNA用于基因表达谱，其如本说明书实施例进一步所述利用基因芯片。如本领域内所认识到的，对于本领域普通技术人员将清楚明了的是，可将这些程序或其改进用于从组织或体液样品中分离RNA用于进一步的基因表达分析，其使用本领域普通技术人员可获得的多种分析程序，特别是微阵列技术。
[0158] 来自组织的核糖核酸(RNA)的分离。可收集组织样品，在液氮中冷冻，解冻，然后用研钵和研棒磨碎，使其均质化并转移到50 ml锥形瓶中。然后按照厂家说明书(Invitrogen)用TRIzol® RNA分离方法处理均质后的组织样品，以产生高质量的RNA，然后对其进行进一步基因组分析。
[0159] 材料：冰、液氮、冷冻的犬组织、TRIzol®裂解试剂、最低99%的氯仿、异丙醇、70%乙醇(用无水乙醇和去离子的无RNA酶的水制备)、RNA酶Zap®、去离子水、RNA储存液®，其来自Ambio。
[0160] 仪器：Ultra-Turrax T25 Power均质机、Beckman Coulter Allegra 25R离心机、Eppendorf离心机、镊子、解剖刀、硬质切面即刀板、1.5mL无DNA酶和RNA酶/无菌微量离心管、50mL无DNA酶和RNA酶/无菌的一次性聚丙烯管、P1000、P200、P20、P10和P2 Rainin Pipetman移液器、适合于P1000、P200、P20、P10和P2移液器的过滤吸头、无DNA酶和RNA酶/无菌且无棉绒的擦拭物(wipe)。
[0161] 准备：准备含4 mL TRIzol®的50 mL聚丙烯管(每一组织选择一支管用于RNA分离)。
[0162] 组织均质化：向能容纳液氮的容器中装入3-4勺液氮。将冷冻组织立即放入前述容器中(组织应约为豌豆大小)，将组织放入适当标记的50 mL聚丙烯管中(其已含有4 mL TRIzol®)。随即用Ultra-Turrax T25 Power均质机开始均质化。在最高设置(6)下均质化10-15秒。将样品于冰上再冷却10-15秒，然后重复。持续直到组织完全均质化且溶液变浑浊。完全均质化后，盖上50 mL管，返回冰上。让均质化的组织在室温下孵育5分钟，然后用分离程序处理。
[0163] 实施例4：RNA制备程序
[0164] RNA的分离：一般遵照与TRIzol®试剂一起提供的Invitrogen说明书中所给的程序。将均质化的样品分装入4个1.5 mL的微量离心管中，每管1 mL等份试样。每1 mL样品中加入200 μL氯仿。盖上离心管，涡旋15秒，然后上下振荡。结果应为粉红色乳状液体。让离心管在室温下孵育2-3分钟。4℃下以14,000 rpm离心15分钟。将水相(顶层)转移到1.5 mL的无菌微量离心管中。应该转移到新管中的通常水相体积约为500 μL。确保不要转移任何中间相或下相。通过向含有水层的每一微量离心管中加入500 μL异丙醇来从溶液中沉淀RNA。上下振荡管至少20秒。让样品在室温下孵育10分钟。让样品于4℃下以14,000 rpm离心10分钟。通过吸走液体小心移除上清液，确保沉淀物无损失。加入1 mL 70%的乙醇以洗涤沉淀物。轻弹管(或于实验台上叩敲管)以使沉淀物移出，振荡混合。于4℃下以8,200 rpm离心5分钟。通过吸走液体小心移除上清液，确保沉淀物无损失。用无棉绒的擦拭物小心吸去多余的乙醇，以确保沉淀物干燥。将各沉淀物重悬于30 μL RNA储存液中。通过移液器吸取轻轻混合直到RNA回到溶液中，然后于-80℃保存。可能有必要在低速下涡旋样品几秒钟以促进RNA重悬。如果必要，在冷冻之前，可使用微量离心机将样品离心。
[0165] RNA清洁：遵照RNeasy® Mini手册所提供程序。
[0166] 使用Rneasy Mini试剂盒从OptiCell Chambers中培养的细胞中分离RNA。用从哺乳动物细胞系培养的细胞来分离高质量的RNA，然后将其用于之后的下游基因组分析。所有与细胞培养相关的工作都在严格无菌条件下完成。
[0167] 试剂：10X PBS、去离子H2O、无水乙醇、RNA储存液、β-巯基乙醇、RNA酶Zap®、RLT缓冲液和RW1缓冲液及RPE缓冲液(提供RNeasy Mini试剂盒中)。
[0168] 仪器/材料：Rneasy Mini试剂盒、QIAshredder旋转柱、OptiCell刀、20 mL无菌注射器、OptiCell吸头、细胞刮棒、P1000 Pipetman移液器(Rainin)、P200 Pipetman移液器(Rainin)、100-100 μL过滤移液器吸头、1-200 μL过滤移液器吸头、无菌转移移液管、55 mL无菌溶液盆、1.5 mL无菌微量离心管和Eppendorf微量离心机。
[0169] 溶液：RLT缓冲液(母液由Rneasy Mini试剂盒提供)-在开始按实验方案操作之前向每10 mL RLT缓冲液中加入100 μL β-巯基乙醇。70%乙醇：通过加入35 mL无水乙醇到15 mL无RNA酶的去离子水中来制备50 mL 70%的乙醇。1X PBS：无RNA酶的水。用0.22 μm的滤膜过滤溶液。
[0170] 程序：从OptiCell Chamber中移出细胞(一次处理一个OptiCell)。显微镜下检查细胞以确保在分离RNA之前细胞是活的。移除并丢弃细胞培养基。用OptiCell刀切除顶膜使细胞暴露在下层膜上。用1X PBS洗涤附着有细胞的膜三次。移液器吸取600 μL RLT缓冲溶液(含有β-巯基乙醇)到附着有细胞的膜的中央。使用细胞刮棒，在膜的整个表面上轻轻铺开RLT缓冲液，然后在一角收集液体。移液器吸取全部体积的RLT缓冲液，放入到QIAshredder旋转柱中。
[0171] RNA的分离：将QIAshredder旋转柱以14,000 rpm离心2分钟。丢弃旋转柱但保留收集管及其内容物。向收集管中加入600 μL 70%的乙醇，通过移液器吸取来充分混合(此时总体积=1.2 mL)。将600 μL细胞裂解液转移到RNeasy微型柱中，以14,000 rpm离心15秒。丢弃穿流液(flow through)但保留收集管和旋转柱。将剩余体积的细胞裂解液(约600uL)转移到旋转柱中，重复离心。丢弃穿流液但保留收集管和旋转柱。加入700 μL RW1缓冲液到旋转柱中。以14,000 rpm离心15秒以洗涤柱子。丢弃穿流液并收集管。将旋转柱转移到新的2 mL收集管中，并向柱中加入500 μL RPE缓冲液。以14,000 rpm离心15秒。丢弃穿流液，保留收集管/柱。向柱中再加入500 μL RPE缓冲液。以14,000 rpm离心2分钟。将旋转柱转移到1.5 mL收集管中。直接加入30 μL RNA储存液到硅胶膜上，以14,000 rpm离心1分钟来洗脱RNA。于-70℃保存最终的RNA。
[0172] RNA 6000 Nano测定。使用Agilent 2100生物分析仪和RNA 6000 Nano测定，分析分离自培养的哺乳动物细胞、淋巴细胞或组织的RNA的质量。
[0173] 试剂：RNA 6000 Nano凝胶基质、RNA 6000 Nano染料浓缩液、RNA 6000_Nano标记(以上所有试剂包含于RNA 6000_Nano测定试剂盒中，Agilent)、RNA 6000梯带、RNA酶Zap和无RNA酶的水，其来自Ambion。
[0174] 仪器/其它材料：Agilent Chip Priming Station (Agilent)、RNA 6000芯片(Agilent)、电极清洁器、P2、P10、P200和P1000 Rainin Pipetman移液器、无菌无DNA酶/RNA酶的过滤移液器吸头、无菌1.5 mL微量离心管、涡旋仪、IKA涡旋混合器、微量离心管和加热块。
[0175] 程序：程序由Agilent Technologies 的2003年11月版的RNA 6000_Nano测定中的试剂盒指南给出。遵照指南中给出的程序，但有下列改动：第17页凝胶制备-不是将过滤后的凝胶分成每份65 μL的等分，而是将过滤后的母凝胶保留在原来的微量离心管中，当需要时再等分成65 μL；第22页加入RNA 6000_Nano标记-将1 μL无RNA酶的水(而不是RNA 6000_Nano标记)加入到不含有样品的各样品孔中。这不但节约了标记的用量，还可用作阴性对照以查看没有任何试剂被污染，包括无RNA酶的水；第23页加入梯带和样品-让样品和RNA 6000梯带在71℃下再热变性30秒(总共2.5分钟)；第26页启动芯片运行-从测定菜单中选择“真核生物总RNA_Nano”选项。
[0176] 实施例5：Affymetrix基因芯片表达分析
[0177] 用市购自Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA 95051的Affymetrix犬1和犬2 GeneChip ®测定来分析基因表达。将总RNA反转录为cDNA。该cDNA用于产生cRNA，让所述cRNA碎裂，用作基因芯片杂交的探针。洗涤基因芯片，用Affymetrix激光扫描仪测量杂交信号。然后按照厂家的说明书验证杂交数据并使其标准化用于进一步分析。
[0178] 材料：Affymetrix提供大部分试剂和试剂盒。可单独获得Affymetrix手册(详情参考基因芯片表达分析技术手册(701021修订版4))中所列的但试剂盒中未提供的其它试剂、RNA酶Zap®和去离子水。
[0179] 仪器：Eppendorf微量离心机、1.5 mL无DNA酶和RNA酶/无菌微量离心管、50 mL无DNA酶和RNA酶/无菌一次性聚丙烯管、P1000、P200、P20、P10和P2 Rainin Pipetman移液器、用于P1000、P200、P20、P10和P2移液器的无DNA酶和RNA酶/无菌的过滤移液器吸头和Peltier Thermal Cycler PTC-200。
[0180] 程序：严格遵照基因芯片表达分析技术手册(Affymetrix版权1999-2003)中所述的所有程序。使用5微克总RNA用于cDNA的第一链合成。使用Peltier Thermal Cycler PTC-200或加热块控制反应和探针变性的温度。用带生物分析仪2100的RNA NanoDrop芯片实施质量控制。犬基因芯片使用100形式(Midi阵列)。
[0181] 实施例6：慢性肾脏疾病的狗的基因表达
[0182] 按照前面的实施例1-5用具有各期慢性肾脏疾病的狗进行研究，以测定具有正常肾功能的狗与具有对应于表1中所呈现的1-4期的极轻、轻度、中度和显著肾小球肾炎的狗之间的潜在基因表达差异。使用本说明书实施例中所述程序，从42只具有正常肾功能的狗、14只具有极轻肾小球肾炎的狗、24只具有轻度肾小球肾炎的狗、8只具有中度肾小球肾炎的狗和13只具有显著肾小球肾炎的狗中制备组织和体液样品，其通过表2中所呈现的血浆肌酐水平并通过临床观察来确定。
[0183] 基于正常肾功能的狗与具有在前面实施例中所定义的肾小球肾炎的狗的基因表达数据的比较，鉴定出表3所列的五种基因符合实施例2中狗慢性肾脏病症的潜在生物标志物的选择标准。所述基因包括腔蛋白聚糖(LUM)、胶原α1 (Ⅲ)链变体12 (COL3A1)、饰胶蛋白聚糖(DCN)、分泌型卷曲相关蛋白2 (SFRP2)和胞外基质蛋白-2 (Matn2)。每一基因的类似的人同义物(synonym)和mRNA及蛋白登录号列于表3中。每一种蛋白质都是分泌型蛋白。
[0184] 表3 ：潜在的生物标志物列表
[0185]
[0186] 表4：潜在的生物标志物列表
[0187]
[0188] 表5：
[0189] 潜在的生物标志物列表
[0190] 。
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