专利汇可以提供利用高保真聚合酶与UDG的基因克隆与定点突变方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种利用高保真聚合酶与UDG的基因克隆与定点突变方法,包括步骤为:用dU修饰引物和dU耐受型高忠实性DNA聚合酶扩增目标基因和质粒载体;用热 稳定性 尿嘧啶DNA糖苷酶高温处理,得到3’端为单链的目标基因和质粒载体;将二者混合,使目标基因和质粒载体的两端单链区发生 配对 连接起来,形成含目标基因的带缺口环状重组质粒载体;含目标基因的带缺口环状重组质粒载体转化大肠杆菌后,缺口被修复好,得到含目标基因的完整重组质粒载体。采用上述方法显著提高了扩增反应的忠实性,避免了低忠实性的Taq DNA聚合酶导致的额外基因突变,尤其适用于进行蛋白表达为目的的载体构建;dU与dA 碱 基配对,配对结果等同于正常的dT/dA配对,避免了修饰碱基引入额外错误碱基导致的基因突变; 热稳定性 UDG在60-80度仍具有酶活性,使得dU碱基的去除与DNA链的断裂同时进行,省略了加碱热裂解操作。,下面是利用高保真聚合酶与UDG的基因克隆与定点突变方法专利的具体信息内容。
1.利用高保真聚合酶与UDG的基因克隆与定点突变方法,具体步骤如下:
(1)设计合成用于扩增目标基因与质粒载体的引物序列;(2)聚合酶链式反应(PCR)扩增含目标基因/线性化质粒DNA片段;(3)线性化质粒载体DNA片段的限制性内切酶DpnI消化;(4)PCR片段的末端单链化;(5)目标基因与线性化质粒载体DNA片断间的杂交配对;(6)含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌;(7)带目的基因的重组质粒的测序鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法,步骤(1)中引物的序列特征是:1)扩增目标基因与线性化载体的正向引物的5’端前10-25个碱基彼此互补配对,反向引物的5’端前10-25个碱基彼此互补配对;2)5’端前10-25个碱基中的dT碱基替换成dU碱基,且相邻dU碱基间隔5-10个正常碱基;3)引物3’端的18-25个碱基与目标模板DNA互补配对。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(2)具体是将正向引物与反向引物、目标基因DNA模板分子(含目标基因的DNA)/目标质粒DNA、dU耐受型高忠实性DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)加入PCR反应缓冲液中,进行PCR反应。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(3)具体是对扩增的线性化质粒载体PCR产物,用限制性核酸内切酶DpnI消化野生型环状质粒模板,由于质粒模板具有多处GmATC序列,DpnI处理使得质粒模板变成很多段短的DNA双链,这些短的DNA双链转化大肠杆菌不能够产生克隆,从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性克隆。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(4)具体是在目标基因与线性化载体PCR产物中加入热稳定性UDG,在70-80度反应5-30分钟,在dU碱基处形成无碱基位点并热断裂DNA链,断裂的短片段DNA链与互补链分离,从而在双链DNA片段的两端产生长度为10-25个核苷酸的3’突出端。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(5)具体是UDG处理后的目标基因与线性化载体缓慢降温至室温,放置5~15分钟,使二者的3’单链DNA彼此杂交配对,形成含目标基因的带缺口环状重组质粒。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(6)具体是杂交混合物(即含目标基因的带缺口重组质粒、没有发生杂交配对的目标基因与线性化质粒片段)转化大肠杆菌感受态细胞,在固体培养基上37度培养过夜,带缺口重组质粒的缺口会被大肠杆菌修复,形成含目标基因的完整重组质粒。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(7)具体是挑取单菌落,培养后菌落PCR鉴定含有目标基因的阳性克隆,培养克隆后抽提重组质粒DNA,测序鉴定目标基因碱基序列是否正确。
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