实时数字PCR方法及其装置
阅读：244发布：2020-05-15
专利汇可以提供实时数字PCR方法及其装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 实施方式涉及实时数字PCR方法及装置，实时数字PCR方法包括:将含有待扩增样品的PCR 试剂 加入到载体芯片中，PCR试剂在所述载体芯片中被分割为相互独立的微液滴；对待扩增样品进行扩增反应，待扩增样品完成预设次数的扩增反应之后，暂停扩增反应，对载体芯片进行拍摄，并识别载体芯片中独立反应单元的光 信号 ，然后再次进行扩增，拍照，信号识别的循环步骤，直到扩增终点；最后生成所有独立反应单元的扩增曲线，通过比对每次获取的各个反应单元图像信号以及扩增曲线的差异，判断并识别出有效反应单元，或判断独立反应单元内靶核酸分子数；通过扩增终点的有效反应单元的 光信号 ，判断阳性扩增反应单元或阴性扩增反应单元个数。，下面是实时数字PCR方法及其装置专利的具体信息内容。
1.一种实时数字PCR方法，其特征在于，具体步骤包括：
a)将含有待扩增样品的PCR试剂加入到载体芯片中，所述PCR试剂在所述载体芯片中被分割为相互独立的微液滴，其中，每一个所述微液滴作为一个独立反应单元；
b)重复执行以下步骤，直至扩增终点：
将加入所述待扩增样品后的所述载体芯片转移到扩增区进行扩增反应，所述扩增反应为热循环反应，
所述待扩增样品完成预设次数的扩增反应之后，暂停所述扩增反应，并将所述载体芯片转移到成像区，
对所述载体芯片进行拍摄，并识别所述载体芯片中每一个所述独立反应单元的光信号；
c)根据每次识别的所述载体芯片中的所述每一个独立反应单元的光信号，生成所述每一个独立反应单元的扩增曲线；
d)通过比对每次拍摄的所述每一个独立反应单元的光信号，或/和，所述每一个独立反应单元的所述扩增曲线的差异，判断并识别所述独立反应单元中的有效反应单元；
e)通过所述扩增终点的每一个所述有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数。
2.根据权利要求1所述的实时数字PCR方法，其特征在于，所述载体芯片为具有多于
100、1000或10000个微腔室的微流板，和/或使油包水液滴单层排列的微流板；其中，每一个所述微腔室或所述油包水液滴都作为一个所述独立反应单元。
3.根据权利要求1或2所述的实时数字PCR方法，其特征在于，所述待扩增样品加入到载体芯片中后，对加入所述待扩增样品后的所述载体芯片进行扩增反应前，还包括：
对所述载体芯片进行拍摄，并识别所述载体芯片中所述每一个独立反应单元的光信号。
4.根据权利要求1所述的实时数字PCR方法，其特征在于，所述通过所述扩增终点的每一个所述有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数之后，还包括：
根据所述扩增曲线生成每一个所述有效反应单元的阈值循环数；根据所述阈值循环数判断每一个所述有效反应单元的模版个数并进行模版定量。
5.一种实时数字PCR装置，其特征在于，包括：
扩增模块，载体芯片位于所述扩增模块内时，所述载体芯片中携带的待扩增样品进行扩增反应；
成像模块，用于拍摄所述载体芯片；
获取模块，基于所述成像模块的拍摄结果，获取所述载体芯片中每一个独立反应单元的光信号；
判断模块，通过所述获取模块获取的所述载体芯片所述每一个独立反应单元的光信号，判断并识别所述载体芯片中的假阳性或假阴性扩增反应单元；
处理模块，用于根据所述获取模块获取的所述载体芯片中所述每一个独立反应单元的光信号生成所述每一个独立反应单元的扩增曲线，依据所述扩增曲线再次判断所述每一个独立反应单元是否为有效反应单元；并根据每一个所述有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数；
控制模块，用于重复执行下述步骤，直至扩增终点：
所述载体芯片位于所述扩增模块内完成预设次数的扩增循环之后，扩增暂停；
所述控制模块控制所述载体芯片转移到所述成像模块，所述成像模块对所述载体芯片进行拍摄；
所述成像模块对所述载体芯片完成拍摄之后，所述控制模块控制所述载体芯片转移到所述扩增模块继续进行扩增。
6.根据权利要求5所述的实时数字PCR装置，其特征在于，还包括：
进样模块，所述进样模块用于将所述待扩增样品加入所述载体芯片中；
所述载体芯片在进样模块完成待扩增样品的加入后，所述控制模块控制所述载体芯片转移到所述扩增模块进行扩增。
7.根据权利要求5所述的实时数字PCR装置，其特征在于，还包括：
承载模块，所述承载模块用于承载不少于一个的所述载体芯片。
8.根据权利要求5所述的实时数字PCR装置，其特征在于，所述载体芯片在进样模块完成待扩增样品的加入后，所述控制模块控制所述载体芯片转移到所述扩增模块进行扩增之前，还包括：
所述控制模块控制所述载体芯片转移到所述成像模块进行拍摄，所述成像模块对所述载体芯片完成拍摄之后，所述控制模块控制所述载体芯片转移到所述扩增模块进行扩增。
9.根据权利要求5-8任一所述的实时数字PCR装置，其特征在于，所述成像模块顶部还具有用于遮光的第一盖板，当所述成像模块用于对所述载体芯片进行拍摄时，所述载体芯片位于所述第一盖板与所述成像模块之间。
10.根据权利要求5-8任一所述的实时数字PCR装置，其特征在于，所述扩增模块顶部还具有用于隔热的第二盖板。
11.根据权利要求5任一所述的实时数字PCR装置，其特征在于，所述成像模块至少包括以下光通道中的其中两种：
可见光通道、FAM通道、CY5通道、ROX通道、HEX通道、AF700通道。
12.根据权利要求5所述的实时数字PCR装置，其特征在于，还包括：
分析模块，用于根据所述处理模块生成的扩增曲线，通过所述扩增曲线生成每一个所述有效反应单元的阈值循环数；并根据所述阈值循环数确定每一个所述有效反应单元的模版个数进行模版定量。
实时数字PCR方法及其装置
技术领域
[0001] 本发明实施方式涉及基因扩增监测领域，特别涉及一种实时数字PCR方法及其装置。
背景技术
[0002] 数字PCR，是将含有核酸模板的PCR反应溶液分割成千上万甚至百万、千万个独立反应单元中，最后依据扩增反应后的阳性反应单元个数或阴性反应单元个数，再通过泊松分布统计出靶核酸分子的绝对浓度。由于靶核酸的定量不像传统的实时定量PCR(qPCR)需要借助标准曲线，所以数字PCR定量精度和检测灵敏度更高。然而，本发明的发明人发现现有技术中至少存在如下问题：由于各种因素(独立反应单元内进入杂质等)的干扰，个别的独立反应单元会有产生假阳性信号或假阴性信号的可能，导致数字PCR定量精度受损。
发明内容
[0003] 本发明实施方式的目的在于提供一种实时数字PCR方法及其装置，可以对进样后的载体芯片进行评估，同时还可以排除假阳性或假阴性信号的干扰，解决了由于各种因素(独立反应单元内进入杂质等)的干扰而导致的数字PCR定量精度受损的问题，并且可以实现实时的数字PCR监测，生成所有独立反应单元的扩增曲线。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种实时数字PCR方法，具体步骤包括：将含有待扩增样品的PCR试剂加入到载体芯片中，PCR试剂在载体芯片中被分割为相互独立的微液滴，其中，每一个微液滴作为一个独立反应单元；重复执行以下步骤，直至扩增终点：将加入待扩增样品后的载体芯片转移到扩增区进行扩增反应，扩增反应为热循环反应，待扩增样品完成预设次数的扩增反应之后，暂停扩增反应，并将载体芯片转移到成像区，对载体芯片进行拍摄，并识别载体芯片中每一个独立反应单元的光信号；根据每次识别的载体芯片中的每一个独立反应单元的光信号，生成每一个独立反应单元的扩增曲线；通过比对每次拍摄的每一个独立反应单元的光信号，或/和，每一个独立反应单元的扩增曲线的差异，判断并识别独立反应单元中的有效反应单元；通过扩增终点的每一个有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数。
[0005] 本发明实施方式相对于现有技术而言，通过控制载体芯片进行预设次数的扩增循环后进行拍摄并识别每一个独立反应单元的光信号，直至扩增终点；排除载体芯片中出现的假阳性或假阴性扩增反应单元，解决了由于各种因素(独立反应单元内进入杂质等)的干扰而导致的数字PCR定量精度受损的问题。
[0007] 另外，待扩增样品加入到载体芯片中后，对加入待扩增样品后的载体芯片进行扩增反应前，还包括：对载体芯片进行拍摄，并识别载体芯片中每一个独立反应单元的光信号。
[0008] 另外，通过扩增终点的每一个有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数之后，还包括：根据扩增曲线生成每一个有效反应单元的阈值循环数；根据阈值循环数判断每一个有效反应单元的模版个数并进行模版定量。
[0009] 本发明实施方式还提供一种实时数字PCR装置，包括：扩增模块，载体芯片位于扩增模块内时，载体芯片中携带的待扩增样品进行扩增反应；成像模块，用于拍摄载体芯片；获取模块，基于成像模块的拍摄结果，获取载体芯片中每一个独立反应单元的光信号；判断模块，通过获取模块获取的载体芯片每一个独立反应单元的光信号，判断并识别载体芯片中的假阳性或假阴性扩增反应单元；处理模块，用于根据获取模块获取的载体芯片中每一个独立反应单元的光信号生成每一个独立反应单元的扩增曲线，依据扩增曲线再次判断每一个独立反应单元是否为有效反应单元；并根据每一个有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数。控制模块，用于重复执行下述步骤，直至扩增终点：载体芯片位于扩增模块内完成预设次数的扩增循环之后，扩增暂停；控制模块控制载体芯片转移到成像模块，成像模块对载体芯片进行拍摄；成像模块对载体芯片完成拍摄之后，控制模块控制载体芯片转移到扩增模块继续进行扩增。
[0010] 另外，实时数字PCR装置还包括：进样模块，进样模块用于将待扩增样品加入载体芯片中；载体芯片在进样模块完成待扩增样品的加入后，控制模块控制载体芯片转移到扩增模块进行扩增。将进样模块接入实时数字PCR装置中，待扩增样品通过进样模块加入载体芯片，实现了实时数字PCR装置的待扩增样品的进样自动化。
[0011] 另外，实时数字PCR装置还包括：承载模块，承载模块用于承载不少于一个的载体芯片。
[0012] 另外，载体芯片在进样模块完成待扩增样品的加入后，控制模块控制载体芯片转移到扩增模块进行扩增之前，还包括：控制模块控制载体芯片转移到成像模块进行拍摄，成像模块对载体芯片完成拍摄之后，控制模块控制载体芯片转移到扩增模块进行扩增。
[0014] 另外，扩增模块顶部还具有用于隔热的第二盖板。通过第二盖板进行隔热，防止扩增模块中的热量外溢或外界热量对扩增模块造成影响。
[0015] 另外，成像模块至少包括以下光通道中的其中两种：可见光通道、FAM通道、CY5通道、ROX通道、HEX通道、AF700通道。
[0016] 另外，实时数字PCR装置还包括：分析模块，用于根据处理模块生成的扩增曲线，通过扩增曲线生成每一个有效反应单元的阈值循环数；并根据Ct值确定每一个有效反应单元的模版个数进行模版定量。通过对扩增曲线的阈值循环数进行判断，依据泊松分布统计靶核酸分子数，并用依据扩增曲线分析所得的结果做进一步验证。
[0017] 相对于现有技术而言，本发明实施方式提供一种实时数字PCR方法及其装置，解决了由于各种因素(独立反应单元内进入杂质等)的干扰而导致的定量精度受损的问题，并实现实时的数字PCR监测，生成所有反应单元的扩增曲线。附图说明
[0018] 一个或多个实施方式通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施方式的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。
[0019] 图1是本发明第一实施方式所涉及的实时数字PCR方法的流程图；
[0020] 图2是本发明第二实施方式所涉及的实时数字PCR方法的流程图；
[0021] 图3是本发明第三实施方式所涉及的实时数字PCR装置的虚拟模块示意图；
[0022] 图4-图6是本发明第三实施方式所涉及的实时数字PCR装置的结构示意图；
[0023] 图7是本发明第四实施方式所涉及的实时数字PCR装置的结构示意图；
[0024] 图8-图9是本发明第五实施方式所涉及的实时数字PCR装置的结构示意图；
[0025] 图10是本发明第六实施方式所涉及的实时数字PCR装置的虚拟模块示意图。
具体实施方式
[0026] 目前，由于各种因素(独立反应单元内进入杂质等)的干扰，个别的独立反应单元会有产生假阳性信号或假阴性信号的可能，导致数字PCR定量精度受损。
[0027] 为解决上述问题，本发明实施方式提供一种实时数字PCR方法，通过控制载体芯片每进行预设次数的扩增循环后进行拍摄并识别每一个独立反应单元的光信号，直至扩增终点；排除载体芯片中出现假阳性或假阴性扩增反应单元，解决了由于各种因素(独立反应单元内进入杂质等)的干扰而导致的数字PCR定量精度受损的问题，并且可以实现实时的数字PCR监测，生成所有独立反应单元的扩增曲线。
[0028] 为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。以下各个实施方式的划分是为了描述方便，不应对本发明的具体实现方式构成任何限定，各个实施方式在不矛盾的前提下可以相互结合，相互引用。
[0029] 本发明的第一实施方式涉及一种实时数字PCR方法，包括：将含有待扩增样品的PCR试剂加入到载体芯片中，PCR试剂在载体芯片中被分割为相互独立的微液滴，其中，每一个微液滴作为一个独立反应单元；重复执行以下步骤，直至扩增终点：将加入待扩增样品后的载体芯片转移到扩增区进行扩增反应，扩增反应为热循环反应，待扩增样品完成预设次数的扩增反应之后，暂停扩增反应，并将载体芯片转移到成像区，对载体芯片进行拍摄，并识别载体芯片中每一个独立反应单元的光信号；根据每次识别的载体芯片中的每一个独立反应单元的光信号，生成每一个独立反应单元的扩增曲线；通过比对每次拍摄的每一个独立反应单元的光信号，或/和，每一个独立反应单元的扩增曲线的差异，判断并识别独立反应单元中的有效反应单元；通过扩增终点的每一个有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数。
[0030] 下面对本实施方式的实时数字PCR方法的实现细节进行具体说明，本实施方式中所涉及的实时数字PCR方法的流程图如图1所示，具体包括：
[0031] 步骤101，将含有待扩增样品的PCR试剂加入载体芯片中，形成独立反应单元。
[0032] 将含有待扩增样品的PCR试剂加入到载体芯片中，PCR试剂在载体芯片中被分割为相互独立的微液滴，每一个微液滴之间互不干扰，形成独立反应单元。
[0033] 需要说明的是，在本发明实施方式的说明中，含有待扩增样品的独立反应单元作为阳性扩增反应单元；不含有待扩增样品的独立反应单元作为阴性扩增反应单元。在拍摄识别过程中，光亮部分的独立反应单元为阳性扩增反应单元，阴暗部分的独立反应单元为阴性扩增反应单元。若独立反应单元中进入荧光杂质，导致原本应识别为阴暗部分的独立反应单元变亮，即为假阳性扩增反应单元；若独立反应单元中含有其他杂质，导致原本应识别为光亮部分的独立反应单元变暗，即为假阴性扩增反应单元。
[0034] 载体芯片为具有多于100个微腔室的微流板；具体地，微流板的微腔室数量可以为多于100个、多于1000个、多于10000个或多于100000个。在其他实施例中，载体芯片还可以为使油包水液滴单层排列的微流板。
[0035] 需要说明的是，若载体芯片为具有微腔室的微流板，每一个微腔室都作为一个独立反应单元；若载体芯片为使油包水液滴单层排列的微流板，每一个形成的油包水液滴都作为一个独立反应单元。
[0036] 在本实施方式中，载体芯片中的待扩增样品为人工加入；需要说明的是，待扩增样品还可以通过实时数字PCR装置加入到载体芯片中。
[0037] 步骤102，对载体芯片中的待扩增样品进行扩增反应。
[0038] 具体地，将待扩增样品加入到载体芯片后或对载体芯片进行拍摄后，将载体芯片转移到扩增区，对载体芯片中的待扩增样品进行扩增反应。
[0039] 需要说明的是，在其他实施方式中，在执行步骤102之后，执行步骤103之前，还包括：对载体芯片进行拍摄，并识别载体芯片中每一个独立反应单元的光信号。
[0040] 步骤103，扩增预设次数的扩增循环后，对载体芯片进行拍摄，并识别每一个独立反应单元的光信号。步骤104，根据每一个独立反应单元的光信号判断独立反应单元中的有效单元。
[0041] 具体地，待扩增样品完成预设次数的扩增循环之后，暂停所扩增反应，并将载体芯片转移到成像区；对载体芯片进行拍摄，并识别载体芯片中每一个独立反应单元的光信号。根据步骤103中对载体芯片的拍摄结果，识别载体芯片中每一个独立反应单元的光信号，通过每一个独立反应单元的光信号，判断每一个独立反应单元是否为有效反应单元。其中，有效反应单元为非假阳性扩增反应单元和非假阴性扩增反应单元的独立反应单元。
[0042] 在本实施的方式中，预设次数的扩增循环可以包括以下两种方式：
[0043] 方式一：载体芯片每完成N次扩增循环之后，对载体芯片进行拍摄，N为大于0的自然数。
[0044] 方式二：载体芯片完成M次扩增循环之后，对载体芯片进行拍摄，之后载体芯片每完成N次扩增循环之后，对载体芯片进行拍摄，M为大于0的自然数。
[0045] 需要说明的是，通过设置N的数量，可以达到不同的效果，具体地，若N设置为1，则载体芯片中的待扩增样品每进行一次扩增循环就要进行一次拍照，其监测效果好，能识别每次扩增中产生的不良反应单元；若N设置为大于等于2的自然数，在起到监测作用的情况下，提高扩增监测的效率，节约时间。
[0046] 步骤105，是否到达扩增终点？
[0047] 判断载体芯片中的待扩增样品是否到达扩增终点，若达到扩增终点，则继续执行步骤106，识别达到扩增终点的每一个独立反应单元的光信号；若并没有到达扩增终点，返回继续执行步骤102。
[0048] 步骤106，识别达到扩增终点的每一个独立反应单元的光信号。步骤107，生成每一个独立反应单元的扩增曲线。
[0049] 对达到扩增终点后的载体芯片进行拍摄，并识别载体芯片中每一个独立反应单元的光信号。根据每次识别的载体芯片中的每一个独立反应单元的光信号，生成每一个独立反应单元的扩增曲线。
[0050] 具体地，载体芯片中的待扩增样品扩增完成后，识别载体芯片中每一个独立反应单元的光信号，并根据每一个独立反应单元每次记录的光信号，生成其对应的扩增曲线。
[0051] 步骤108，通过比对扩增曲线的差异，判断独立反应单元中的有效单元或靶核酸分子数目。
[0052] 通过步骤107中生成的扩增曲线进一步判断前期并未识别出的假阳性扩增反应单元和假阴性扩增反应单元。
[0053] 具体地，根据每一个独立反应单元对应的扩增曲线进行对比分析，判断并识别出该独立反应单元是有效反应单元，还是假阳性扩增反应单元或假阴性扩增反应单元。
[0054] 步骤109，通过扩增终点的有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数。
[0055] 具体地，综合步骤104和步骤108的判断结果，得到扩增终点的载体芯片中的有效反应单元，再根据有效反应单元的光信号，判断每一个有效反应单元是阳性扩增反应单元还是阴性扩增反应单元，并计数。
[0056] 上面各种方法的步骤划分，只是为了描述清楚，实现时可以合并为一个步骤或者对某些步骤进行拆分，分解为多个步骤，只要包括相同的逻辑关系，都在本专利的保护范围内；对流程中添加无关紧要的修改或者引入无关紧要的设计，但不改变流程的核心设计都在该专利的保护范围内。
[0057] 本实施方式通过对载体芯片每进行一定次数的扩增反应后进行拍摄，排除当前扩增流程中出现的假阳性和假阴性扩增反应单元，直至扩增终点；对进样后的载体芯片进行评估同时还可以排除不良反应单元的干扰，解决了由于各种因素(独立反应单元内进入杂质等)的干扰而导致的数字PCR定量精度受损的问题。
[0058] 本发明的第二实施方式涉及一种实时数字PCR方法。第二实施方式与第一实施方式大致相同，主要区别之处在于：本实施方式还根据扩增曲线生成每一个独立反应单元的阈值循环数(Ct值)；根据阈值循环数判断每一个独立反应单元的模版个数并进行模版定量。本实施方式中所涉及的扩增监测方法的流程图如图2所示，具体包括：
[0059] 步骤201，将含有待扩增样品的PCR试剂加入载体芯片中，形成独立反应单元；步骤202，使载体芯片中的待扩增样品进行扩增反应；步骤203，扩增预设次数的扩增循环后，对载体芯片进行拍摄，并识别每一个独立反应单元的光信号；步骤204，根据每一个独立反应单元的光信号判断独立反应单元中的有效单元；步骤205，是否到达扩增终点？步骤206，识别达到扩增终点的每一个独立反应单元的光信号；步骤207，生成每一个独立反应单元的扩增曲线；步骤208，根据扩增反应曲线判断独立反应单元中的有效反应单元；步骤209，通过扩增终点的有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数。
[0060] 步骤201-步骤209，其具体细节同步骤101-步骤109，在此不再过多赘述。
[0061] 在本实施方式中，在执行步骤202之后，执行步骤203之前，还包括：对载体芯片进行拍摄，并识别载体芯片中每一个独立反应单元的光信号。对载体芯片完成拍摄之后，对载体芯片中的待扩增样品进行扩增反应。
[0062] 步骤217，根据扩增曲线生成每一个独立反应单元的阈值循环数(Ct值)。步骤218，根据Ct值判断每一个独立反应单元的模版个数进行模版定量。
[0063] 具体地，根据步骤207中生成的扩增曲线，通过扩增曲线生成每一个独立反应单元的阈值循环数(Ct值)；并通过步骤209中判别的扩增终点时载体芯片中的有效反应单元，根据Ct值确定每一个有效反应单元的模版个数进行模版定量，通过模版定量验证扩增终点数据是否正确。
[0064] 在一个例子中，通过对扩增曲线的Ct值进行判断，依据泊松分布统计靶核酸分子数，并用依据扩增曲线分析所得的结果做进一步验证。
[0065] 上面各种方法的步骤划分，只是为了描述清楚，实现时可以合并为一个步骤或者对某些步骤进行拆分，分解为多个步骤，只要包括相同的逻辑关系，都在本专利的保护范围内；对流程中添加无关紧要的修改或者引入无关紧要的设计，但不改变流程的核心设计都在该专利的保护范围内。
[0066] 本发明第三实施方式涉及一种实时数字PCR装置，包括：扩增模块，载体芯片位于扩增模块内时，载体芯片中携带的待扩增样品进行扩增反应；成像模块，用于拍摄载体芯片；获取模块，基于成像模块的拍摄结果，获取载体芯片中每一个独立反应单元的光信号；判断模块，通过获取模块获取的载体芯片每一个独立反应单元的光信号，判断并识别载体芯片中的假阳性或假阴性扩增反应单元；处理模块，用于根据获取模块获取的载体芯片中每一个独立反应单元的光信号生成每一个独立反应单元的扩增曲线，依据扩增曲线再次判断每一个独立反应单元是否为有效反应单元；并根据每一个有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数；控制模块，用于重复执行下述步骤，直至扩增终点：载体芯片位于扩增模块内完成预设次数的扩增循环之后，扩增暂停，控制模块控制载体芯片转移到成像模块，成像模块对载体芯片进行拍摄；成像模块对载体芯片完成拍摄之后，控制模块控制载体芯片转移到扩增模块继续进行扩增。
[0067] 下面对本实施方式的实时数字PCR装置的实现细节进行具体说明，本实施方式中所涉及的实时数字PCR装置300的虚拟模块示意图如图3所示，具体包括：
[0068] 扩增模块305，载体芯片位于扩增模块305内时，载体芯片中携带的待扩增样品进行扩增反应。
[0069] 参考图4，扩增模块包括平板PCR扩增平台315，在载体芯片置于平板PCR扩增平台315上时，载体芯片中携带的待扩增样品进行PCR扩增反应。
[0070] 需要说明的是，平板PCR扩增平台315具有多个独立加热单元，加热单元之间的加热方式互不冲突，可以同时对多种不同的载体芯片进行扩增反应，提高扩增多样性；具体地，平板PCR扩增平台315可以包括两个或三个独立的加热单元。每一个加热单元可以容纳多个载体芯片，用于同时对同一种类的多个载体芯片进行扩增反应，提高扩增效率；具体地，每一个加热可以容纳三个、六个、九个或十二个载体芯片。可以理解的是，上述对加热单元的数量举例以及对加热单元可以容纳的载体芯片的数量的举例是便于让本领域技术人员理解本方案，并不构成对本方案的限定，其独立的加热单元的个数以及加热单元可以容纳的载体芯片的数目根据实际的需求所设置。
[0071] 在一个例子中，参考图5，扩增模块顶部还具有用于隔热的第二盖板501。第二盖板501用于隔绝平板PCR扩增平台315与外界之间的热量交换，防止扩增模块中的热量外溢或外界热量对扩增模块造成影响。进一步地，第二盖板501可以通过电机控制在平面内进行移动，或翻转式设计，实现自动化隔热的效果。
[0072] 成像模块303，用于拍摄载体芯片。
[0073] 具体地，成像模块303至少包括以下光通道的其中两种：可见光通道、FAM通道、CY5通道、ROX通道、HEX通道、AF700通道。通过不同光通道，即不同的判断方式来对载体芯片中独立反应单元是否为不良反应单元进行判断，其判断结果更具准确性。
[0074] 参考图4，成像模块包括荧光显微成像单元313和成像芯片座323。
[0075] 荧光显微成像单元313固定在实时数字PCR装置的平台310上，成像芯片座323通过支撑部支撑，位于荧光显微成像单元313上方。
[0076] 成像芯片座323用于放置从扩增模块转移来的载体芯片，成像芯片座323为镂空设计，依靠承载载体芯片的边缘用于支撑，镂空区域和载体芯片上的反应单元区域对应，以便于拍摄时的光通过。
[0077] 需要说明的是，成像芯片座323具有可移动的功能，由于荧光显微成像单元313进行拍摄时并不能一次拍摄一个载体芯片的所有独立反应单元，只能一部分一部分进行拍照，所以在拍照的过程中需要使成像芯片座323在平面内进行移动，其操作原理类似于显微镜载物台。
[0078] 还需要说明是的，在其他实施方式中，参考图6，可以将成像芯片座423和荧光显微成像单元413的位置进行调换，将成像芯片座423固定在扩增监测装置的平台310上，由于此时成像芯片座423固定在扩增监测装置的平台310上，其并不需要镂空设计。荧光显微成像单元413通过支撑部支撑，位于成像芯片座423上方。同理，由于荧光显微成像单元413进行拍摄时并不能一次拍摄一个载体芯片的所有独立反应单元，只能一部分一部分进行拍照，所以荧光显微成像单元413具有可移动的功能，在拍照的过程中需要荧光显微成像单元413在平面内进行移动。
[0079] 在一个具体的例子中，参考图5，成像模块顶部还具有用于遮光的第一盖板502，当成像模块用于对载体芯片进行拍摄时，载体芯片位于第一盖板502与成像模块之间。通过第一盖板502对外界光源进行遮挡，避免了外界光源对成像模块的拍摄光源造成影响。进一步地，第一盖板502可以通过电机控制在平面内进行移动，或翻转式设计，实现自动化遮光的效果。
[0080] 获取模块304，连接成像模块303，用于根据成像模块303的拍摄结果，获取载体芯片中每一个独立反应单元的光信号。
[0081] 判断模块307，通过获取模块304获取的载体芯片所述每一个独立反应单元的光信号，判断并识别载体芯片中的假阳性或假阴性扩增反应单元；
[0082] 具体地，判断模块307连接获取模块304，通过获取模块304获取的每一个独立反应单元的光信号，判断模块307对每一个独立反应单元的光信号进行判断，判断载体芯片中的假阳性或假阴性扩增反应单元。
[0083] 在一个例子中，根据获取模块304的获取的光信号，通过各个像素点灰度信号值以及相对位置和独立反应单元的尺寸以及位置信息可以得到各个独立反应单元的光信号，根据各个独立反应单元的光信号判断各个独立反应单元是否为假阳性或假阴性扩增反应单元。
[0084] 控制模块301，用于控制载体芯片在成像模块303和扩增模块305之间进行转移。
[0085] 具体地，控制模块301，用于重复执行下述步骤，直至扩增终点：载体芯片位于扩增模块305内完成预设次数的扩增循环之后，控制模块301控制载体芯片转移到成像模块303进行拍摄；成像模块303对载体芯片完成拍摄之后，控制模块301控制载体芯片转移到扩增模块305继续进行扩增。
[0086] 预设次数的扩增循环可以包括以下两种方式：
[0087] 方式一：载体芯片每完成N次扩增循环之后，对载体芯片进行拍摄，N为大于0的自然数。
[0088] 方式二：载体芯片完成M次扩增循环之后，对载体芯片进行拍摄，之后载体芯片每完成N次扩增循环之后，对载体芯片进行拍摄，M为大于0的自然数。
[0089] 通过设置N的数量，可以达到不同的效果。具体地，若N设置为1，则载体芯片中的待扩增样品每进行一次扩增循环就要进行一次荧光拍照，其监测效果好，能识别每次扩增中产生的不良独立反应单元；若N设置为大于等于2的自然数，在起到监测作用的情况下，提高扩增监测的效率，节约成本。
[0090] 在一个例子中，若设置载体芯片每完成2次扩增，需要进行1次拍摄，则具体流程如下：
[0091] S1，载体芯片位于扩增模块305，载体芯片中的待扩增样品进行扩增。
[0092] S2，当待扩增样品进行了2次扩增循环之后，控制模块301控制载体芯片转移到成像模块303。
[0093] S3，成像模块303对载体芯片进行拍摄，排除其中的假阳性或假阴性扩增反应单元。
[0094] S4，拍摄完成后，控制模块301控制载体芯片转移到扩增模块305。
[0095] S5，执行S1，直至扩增终点。
[0096] 本实施方式给出了三类具体的控制方法，具体如下：
[0098] 方式二：控制模块还包括监测单元；监测单元用于实时获取载体芯片的位置；控制模块301根据监测到的载体芯片的实时位置，控制载体芯片进行转移。
[0099] 方式三：控制模块301内存储有预设时间，且基于存储的预设时间，控制载体芯片进行转移；预设时间为载体芯片在相应的模块中进行相应操作所需花费的时间。
[0100] 具体地，预先获取载体芯片在成像模块303内进行荧光拍照所需花费的时间T1和载体芯片在扩增模块305内进行N次扩增循环所需花费的时间T2。控制模块301存储上述T1和T2，控制模块301控制载体芯片转移到扩增模块305，使载体芯片内的待扩增样品进行扩增；经过时间T2后，控制模块301控制载体芯片转移到成像模块303，使成像模块303对载体芯片进行荧光拍照；经过时间T1后，控制模块301再次控制载体芯片转移到扩增模块305，重复上述操作直至扩增终点。例如，若载体芯片在成像模块303内进行荧光拍照需要花费3秒，载体芯片在扩增模块305内进行2次扩增循环需要花费10秒。控制模块301控制载体芯片转移到扩增模块305，使载体芯片内的待扩增样品进行扩增；经过10秒后，控制模块301控制载体芯片转移到成像模块303，使成像模块303对载体芯片进行荧光拍照；经过3秒后，重复上述操作直至扩增终点。
[0101] 本发明实施方式通过移动抓手322的方式实现载体芯片的转移，具体如下：参考图4，机械臂312通过支撑部固定在实时数字PCR装置的平台310上方，机械臂312可以左右移动，且机械臂312上设置有可以上下移动的移动抓手322；移动抓手322抓取载体芯片在成像模块和扩增模块之间移动。
[0102] 载体芯片为具有至少多于100个微腔室的微流板；具体地，微流板的微腔室数量可以为多于100个、多于1000个、多于10000个或多于100000个。需要说明的是，在其他实施方式中，载体芯片还可以为使油包水液滴单层排列的微流板。
[0103] 在本实施方式中，实时数字PCR装置还包括：进样模块306，进样模块306用于将待扩增样品加入载体芯片中，载体芯片在进样模块306完成待扩增样品的加入后，控制模块301控制载体芯片转移到扩增模块305进行扩增。
[0104] 具体地，参考图4-图6，图中虚线框所标示出的装置即为进样模块，具体包括：进样控制模块326和进样芯片固定底座316；进样芯片固定底座316固定在扩增监测装置的平台310上，用于承载载体芯片；进样控制模块326用于向进样芯片固定底座316上的载体芯片中加入待扩增样品。
[0105] 需要说明的是，在其他实施例中，实时数字PCR承载模块，用于承载不少于一个载体芯片。
[0106] 具体地，承载模块承载的载体芯片数量并不限于一个，可以为三个、六个、九个或十二个等，本领域技术人员可以理解的是，单次承载的载体芯片数量根据具体需求进行设定，本实施方式的举例仅为方便本领域技术人员进行理解，并不构成对本方案的限定。
[0107] 处理模块308，连接获取模块304，用于根据获取模块304获取的每一个独立反应单元的光信号，生成每一个独立反应单元的扩增曲线，依据判断再次判断每一个所述反应单元是否为有效反应单元；并根据每一个所述有效反应单元的光信号，判断阳性扩增反应单元和阴性扩增反应单元个数。
[0108] 具体地，基于获取模块304在每次拍摄中记录的光信号，生成每一个独立反应单元的扩增曲线，基于判断模块307的判断结果，并分析扩增曲线，分析有效反应单元中是否存在前期成像模块303并没识别的假阳性或假阴性扩增反应单元。通过对有效独立反应单元的扩增曲线进行确认，确认此时的有效独立反应单元中是否存在前期并未识别的假阳性或假阴性扩增反应单元，进一步排除假阳性或假阴性扩增反应单元带来的定量影响。
[0109] 为了突出本发明的创新部分，本实施方式中并没有将与解决本发明所提出的技术问题关系不太密切的单元引入，但这并不表明本实施方式中不存在其它的单元。
[0110] 上面各种虚拟模块的划分，只是为了描述清楚，实现时可以合并为一个虚拟模块或者对某些虚拟模块进行拆分，分解为多个虚拟模块，只要包括相同的应用关系，都在本专利的保护范围内；对整体装置中添加无关紧要的修改或者引入无关紧要的虚拟模块，但不改变监测流程的模块设计都在该专利的保护范围内。
[0111] 由于第一实施方式与本实施方式相互对应，因此本实施方式可与第一实施方式互相配合实施。第一实施方式中提到的相关技术细节在本实施方式中依然有效，在第一实施方式中所能达到的技术效果在本实施方式中也同样可以实现，为了减少重复，这里不再赘述。相应地，本实施方式中提到的相关技术细节也可应用在第一实施方式中。
[0112] 本实施方式通过控制模块控制载体芯片在扩增模块与成像模块之间来回移动，对载体芯片每进行预设次数的扩增反应后进行拍摄，排除当前扩增流程中出现的假阳性或假阴性扩增反应单元，直至扩增终点；对进样后的载体芯片进行评估同时还可以排除假阳性或假阴性扩增反应单元的干扰，解决了由于各种因素(独立反应单元内进入杂质等)的干扰而导致的数字PCR定量精度受损的问题，并且可以实现实时的数字PCR监测，生成所有独立反应单元的扩增曲线。
[0113] 本发明的第四实施方式涉及一种实时数字PCR装置。第四实施方式与第三实施方式大致相同，主要区别之处在于：本发明第四实施方式中，进样模块独立于扩增监测装置之外，可以通过人工进样的方式进行进样。
[0114] 下面对本实施方式的实时数字PCR装置的实现细节进行具体说明，本实施方式中所涉及的实时数字PCR装置的虚拟模块示意图如图7所示。
[0115] 进样模块具体包括：进样控制模块426和进样芯片底座416；进样模块406独立于扩增监测装置之外，用于承载载体芯片；进样控制模块426用于向进样芯片固定底座416上的载体芯片中加入待扩增样品。
[0116] 进样模块用于将待扩增样品加入载体芯片中，载体芯片在进样模块完成待扩增样品的加入后，控制模块控制载体芯片转移到扩增模块进行扩增。
[0117] 为了突出本发明的创新部分，本实施方式中并没有将与解决本发明所提出的技术问题关系不太密切的单元引入，但这并不表明本实施方式中不存在其它的单元。
[0118] 本实施方式通过将进样模块独立于实时数字PCR装置外，待扩增样品通过外部进样模块加入载体芯片，可以通过人工进样的方式来实现待扩增样品的进样，采用人工进样的方式更加具有针对性。
[0119] 本发明的第五实施方式涉及一种实时数字PCR装置。第五实施方式与第三实施方式大致相同，主要区别之处在于：本发明第五实施方式中，通过承载台来进行实现载体芯片的转移。
[0120] 下面对本实施方式的实时数字PCR装置的实现细节进行具体说明，本实施方式中所涉及的实时数字PCR装置的虚拟模块示意图如图8所示。
[0121] 机械臂412通过支撑部固定在实时数字PCR装置的平台310上方，机械臂412可以左右移动，且机械臂412上设置有可以上下移动的承载台422；承载台422承载载体芯片在成像模块和扩增模块之间移动，承载台422用于承载芯片的底座为镂空设置的网格底座，并可以作为成像芯片座。
[0122] 需要说明的是，在本实施方式中还包括第一盖板501和第二盖板502。
[0123] 参考图9，成像模块顶部还具有用于遮光的第一盖板502，当成像模块用于对载体芯片进行拍摄时，载体芯片位于第一盖板502与成像模块之间。通过第一盖板502对外界光源进行遮挡，避免了外界光源对成像模块的拍摄光源造成影响。进一步地，第一盖板502可以通过电机控制在平面内进行移动，或翻转式设计，实现自动化遮光的效果。
[0124] 继续参考图9，扩增模块顶部还具有用于隔热的第二盖板501。第二盖板501用于隔绝平板PCR扩增平台315与外界之间的热量交换，防止扩增模块中的热量外溢或外界热量对扩增模块造成影响。进一步地，第二盖板501可以通过电机控制在平面内进行移动，或翻转式设计，实现自动化隔热的效果。
[0125] 为了突出本发明的创新部分，本实施方式中并没有将与解决本发明所提出的技术问题关系不太密切的单元引入，但这并不表明本实施方式中不存在其它的单元。
[0126] 本发明的第六实施方式涉及一种实时数字PCR装置。第六实施方式与第三实施方式大致相同，主要区别之处在于：本发明第六实施方式中，还通过根据所述处理模块生成的扩增曲线，通过所述扩增曲线生成每一个有效反应单元的阈值循环数(Ct值)；并根据所述Ct值确定每一个有效反应单元的模版个数进行模版定量。
[0127] 下面对本实施方式的实时数字PCR装置的实现细节进行具体说明，本实施方式中所涉及的实时数字PCR装置600的虚拟模块示意图如图10所示，具体包括：
[0128] 控制模块601、成像模块603、获取模块604、扩增模块605、进样模块606、判断模块607和处理模块608，其具体描述同第一实施方式，在此不再过多赘述。
[0129] 在本实施方式中，载体芯片在进样模块606完成待扩增样品的加入后，控制模块601控制载体芯片转移到扩增模块605进行扩增之前，还包括：控制模块601控制载体芯片转移到成像模块603进行拍摄，成像模块603对载体芯片完成拍摄之后，控制模块601控制载体芯片转移到扩增模块605进行扩增。即在对载体芯片中的待扩增样品进行扩增前，先对载体芯片进行拍摄，识别在进行扩增反应前，载体芯片中已经存在的假阳性或假阴性扩增反应单元。
[0130] 本实施方式中，实时数字PCR装置600还包括：
[0131] 分析模块609，连接处理模块608，用于根据处理模块生成的扩增曲线，通过所述扩增曲线生成每一个有效反应单元的阈值循环数(Ct值)；并根据所述Ct值确定每一个有效反应单元的模版个数进行模版定量，通过所述模版定量验证所述扩增终点数据是否正确。
[0132] 具体地，基于处理模块608的处理结果，对有效反应单元的扩增曲线进行分析，获取每一个有效反应单元对应的阈值循环数(Ct值)，通过每一个有效反应单元的Ct值，对每一个有效反应单元进行模版定量，通过模版定量的数据验证每一个有效反应单元的扩增终点的数据是否准确。
[0133] 在一个例子中，通过对扩增曲线的Ct值进行判断，依据泊松分布统计靶核酸分子数，并用依据扩增曲线分析所得的结果做进一步验证。
[0134] 为了突出本发明的创新部分，本实施方式中并没有将与解决本发明所提出的技术问题关系不太密切的单元引入，但这并不表明本实施方式中不存在其它的单元。
[0135] 上面各种虚拟模块的划分，只是为了描述清楚，实现时可以合并为一个虚拟模块或者对某些虚拟模块进行拆分，分解为多个虚拟模块，只要包括相同的应用关系，都在本专利的保护范围内；对整体装置中添加无关紧要的修改或者引入无关紧要的虚拟模块，但不改变监测流程的模块设计都在该专利的保护范围内。
[0136] 本实施方式通过对扩增曲线的Ct值进行判断，确定有效反应单元的模版个数，得到模版定量，再通过模版定量来验证扩增终点的数据是否准确，使扩增终点的数据更具准确性。
[0137] 由于第二实施方式与本实施方式相互对应，因此本实施方式可与第二实施方式互相配合实施。第二实施方式中提到的相关技术细节在本实施方式中依然有效，在第二实施方式中所能达到的技术效果在本实施方式中也同样可以实现，为了减少重复，这里不再赘述。相应地，本实施方式中提到的相关技术细节也可应用在第二实施方式中。
[0138] 本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施方式，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
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