一种胃癌预后诊断生物标记物及其诊断试剂盒
阅读：130发布：2020-05-17
专利汇可以提供一种胃癌预后诊断生物标记物及其诊断试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种胃癌 预后 诊断 生物 标志物及其检测 试剂 盒 ，所述生物标志物为 肿瘤 微环境相关因子RGS1。本发明通过预后标记物及检测标记物RGS1的应用，可以迅速、准确、方便地预测胃癌预后，从分子 水 平实现胃癌危险高低的分级分层，显著地将不同预后程度的患者分类 治疗 ，从而指导个体化精准治疗，同时节约了医疗成本，具有较高的临床应用价值。，下面是一种胃癌预后诊断生物标记物及其诊断试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种胃癌预后诊断生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为肿瘤微环境相关因子RGS1。
2.一种肿瘤微环境相关因子RGS1作为胃癌预后标记物及检测标记物的应用。
3.一种特异性扩增权利要求1所述的生物标志物的引物对，其特征在于，所述引物对如SEQ ID No.1和2所示。
4.一种胃癌预后诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反转录反应体系和qPCR反应体系。
5.根据权利要求4所述的胃癌预后诊断试剂盒，其特征在于，所述qPCR反应体系中，包括权利要求3所述的引物对，以及内参基因引物对。
6.根据权利要求5所述的胃癌预后诊断试剂盒，其特征在于，所述内参基因引物对如SEQ ID No.3和4所示。
7.一种根据权利要求4所述的试剂盒非诊断目的检测胃癌预后生物标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取来自胃癌患者的癌组织样本；
步骤2：采用上述用于胃癌预后评估的诊断试剂盒，确定步骤1中胃癌患者的癌组织样本中RGS1的表达水平；
步骤3：通过计算得到胃癌预后诊断生物标志物RGS1的相对表达量。
一种胃癌预后诊断生物标记物及其诊断试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于生物医学领域，具体涉及一种胃癌预后诊断生物标记物及其诊断试剂盒，以及使用该标记物预测胃癌预后的方法及诊断试剂盒的应用，特别是涉及RGS1作为胃癌预后评估生物标记物及诊断试剂盒的应用。
背景技术
[0002] 胃癌是一种全球范围内常见的恶性肿瘤，预后相对较差，严重威胁着人类健康。中国是胃癌高发国家，胃癌的发病例数和死亡例数分别占全球胃癌发病和死亡的42.6％和45.0％，是严重危害中国居民健康的主要疾病。近年来，胃癌临床诊断和治疗方面取得很大的进步，但是由于原发性胃癌切除后易局部复发或转移，导致患者整体5年存活率相对较低，这也是胃癌临床治疗面临的重大挑战。研究表明，胃癌组织具有很高的异质性，加之个体差异的影响，不同患者之间的预后有很大差异。为了及时判断胃癌患者的病情，依据每个患者的预后个体化的治疗方案，寻找简便有效的生物标志物用于胃癌患者的预后诊断对于临床治疗有着十分重要的指导意义。
[0003] RGS1蛋白编码一类G蛋白信号家族调控因子，通过与活化的GTP结合的Gα亚基结合，充当GTPase活化蛋白(GAP)，从而降低G蛋白的信号活性，提高GTP向GDP的转化率。研究表明，在人黑色素瘤细胞中RGS1可能通过MAPK通路和PI3K/Akt通路调节PD-L1分子的表达。PD1(programmed death protein 1，细胞程序性死亡受体1)是T细胞表面的负性免疫检测点，特定因子与肿瘤细胞表面的PD-L1(Programmed death-ligand 1，细胞程序性死亡配体
1)结合后可抑制T细胞活性，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。研究证实，免疫和炎症介质主导的微环境在胃癌的发生和进展中起关键作用。在肿瘤组织中，CD3+T细胞数量越少预示着生存率越低并且预后有更强的可变性，甚至会使淋巴结转移数量增多；此外，约15％的肿瘤相关死亡与慢性炎症或不可控的感染密切相关，长期炎症可导致胃癌、肝细胞癌、结肠直肠癌等恶性肿瘤的发生且与预后相关。RGS1在胃癌中的作用及其表达水平对胃癌患者预后质量的影响尚未见报道。
1)结合后可抑制T细胞活性，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。研究证实，免疫和炎症介质主导的微环境在胃癌的发生和进展中起关键作用。在肿瘤组织中，CD3+T细胞数量越少预示着生存率越低并且预后有更强的可变性，甚至会使淋巴结转移数量增多；此外，约15％的肿瘤相关死亡与慢性炎症或不可控的感染密切相关，长期炎症可导致胃癌、肝细胞癌、结肠直肠癌等恶性肿瘤的发生且与预后相关。RGS1在胃癌中的作用及其表达水平对胃癌患者预后质量的影响尚未见报道。
[0004] 目前关于胃癌的预后诊断标志物包括：申请号为201210337178.6的授权专利公开了提供了通过检测BCL6B基因的抑制表达来诊断个体的胃癌和确定个体的胃癌预后的方法。申请号为201510092010.7的已授权专利公开了Netrin-4在制备检测胃癌及预后标志物的制剂中的用途，等。但RGS1作为胃癌预后诊断标志物的应用尚未见报道。为了实现更加精准和个体化的临床治疗，亟需发现更多可用于胃癌预后诊断和评估的生物标志物，寻找更多高特异性和敏感性的分子标志物对胃癌辅助诊断和预后分析具有重要意义。
发明内容
[0005] 针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种胃癌预后诊断生物标记物及其诊断试剂盒。提供RGS1作为胃癌预后诊断标志物及其应用，其在人临床胃癌组织中呈现特异性高表达现象，且胃癌组织中RGS1高表达的患者预后显著差于RGS1低表达的患者预后，且具有统计学差异，表明RGS1能够明确清楚地表征胃癌患者的预后。
[0006] 本发明通过预后标记物及检测标记物RGS1的应用，可以迅速、准确、方便地预测胃癌预后，从分子水平实现胃癌危险高低的分级分层，显著地区分不同预后程度的患者，从而指导个体化精准治疗，同时节约了医疗成本，具有较高的临床应用价值。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0008] 第一方面，本发明提供了一种胃癌预后诊断生物标志物，所述生物标志物为肿瘤微环境相关因子RGS1。
[0009] 第二方面，本发明提供了一种肿瘤微环境相关因子RGS1作为胃癌预后标记物及检测标记物的应用。
[0010] 第三方面，本发明提供了一种特异性扩增前述的生物标志物的引物对，所述引物对如SEQ ID No.1和2所示。
[0011] 第四方面，本发明提供了一种胃癌预后诊断试剂盒，所述试剂盒包括反转录反应体系和qPCR反应体系。
[0012] 优选地，所述qPCR反应体系中，包括前述的引物对，以及内参基因引物对。
[0013] 优选地，所述内参基因引物对如SEQ ID No.3和4所示。
[0014] 第五方面，本发明提供了一种根据前述的试剂盒非诊断目的检测胃癌预后生物标志物的方法，包括以下步骤：
[0015] 步骤1：提取来自胃癌患者的癌组织样本；
[0016] 步骤2：采用上述用于胃癌预后评估的诊断试剂盒，确定步骤1中胃癌患者的癌组织样本中RGS1的表达水平；
[0017] 步骤3：通过计算得到胃癌预后诊断生物标志物RGS1的相对表达量。
[0018] 当步骤3中得到的RGS1高表达，则预后胃癌患者为高死亡率；当步骤3中得到的RGS1低表达，则预后胃癌患者为低死亡率；
[0019] 利用Kaplan-Meier生存曲线法分析法，以RGS1表达为变量，以RGS1基因相对表达值的中位数作为阈值。若步骤3中得到的RGS1的表达水平小于等于阈值，则胃癌患者术后生存时间大于5年；若步骤3中得到的RGS1的表达水平高于阈值，则胃癌患者术后生存时间小于5年。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0021] 1、首次发现肿瘤微环境相关因子RGS1可作为胃癌预后诊断标志物，相对于正常组织，其在胃癌肿瘤中呈特异性高表达现象，其表达量高低指示患者预后生存期；
[0022] 2、通过检测胃癌患者活检样品的RGS1的表达，可以快速、准确及清楚的判断胃癌病人的预后状况，为患者治疗方案的确定提供指导。
[0023] 3、本发明首次公开了RGS1作为胃癌预后标记物及检测标记物的应用，该标记物能够迅速、准确、方便地预测胃癌预后，从分子水平实现胃癌危险度的分级分期，大大提高胃癌预后检测及评估的敏感性和特异性。将不同预后程度的患者进行分类治疗，不仅指导了个体化精准治疗，而且节约了医疗成本，具有较高的临床应用价值。附图说明
[0024] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0025] 图1为qPCR法对胃癌组织样本和对照组正常样本中的RGS1表达量差异分析结果；
[0026] 图2为Kaplan-Meier生存曲线法分析胃癌患者RGS1表达量与生存期之间的关系图。
具体实施方式
[0027] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0028] 实施例1：
[0029] 荧光定量qPCR法检测RGS1在人胃癌组织及癌旁样本中的表达量：
[0030] 1、RNA提取
[0032] 将组织研磨所需用到的研钵、研磨杵、剪刀、手术刀、镊子、勺子清洗干净，于60℃烘箱烘烤3h后包好锡箔纸，在180℃烘箱内烘烤过夜；进行组织研磨前上述用品均需要经过液氮预冷；取出保存于液氮的临床样品，切取黄豆大小的组织块放入预冷好的研钵中，研磨，同时不断的少量多次地补充液氮，直至研磨至粉状，这个过程一般需要10min-15min；研磨至粉状后，加入适量的预冷TRIzoI继续进行研磨，使得组织粉末和TRIzol充分混匀；待TRIzol完全融化后转移至做好标记的1.7mL DNase/RNase Free的离心管中，开始进行RNA抽提，若不立即提取则冻于-80℃超低温冰箱内。
[0033] (2)总RNA的抽提与质检：
[0035] 将装有经过TRIzol裂解的组织的离心管置于室温平衡5min；按每毫升TRIzol加0.2mL氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，上下剧烈震荡15sec，之后静置5min，4℃条件下
12000×g离心15min；离心过后可看见明显的分层现象，小心吸取上清的无色水相，转移至新的1.7mL DNase/RNase Free离心管中，按0.5mL异丙醇/mL TRIzol的比例加入异丙醇，上下颠倒混匀，在室温条件下静置10min，4℃条件下12000×g离心10min，可见管底有白色总RNA沉淀；小心弃去上清，按每毫升TRIzol加1mL 75％乙醇的比例加入75％乙醇洗涤沉淀，4℃条件下7 500×g离心5min；吸去上清，空气干燥5min-10min，加入适量的无RNA酶水溶解RNA沉淀，之后若不立即使用就保存于-80℃。
12000×g离心15min；离心过后可看见明显的分层现象，小心吸取上清的无色水相，转移至新的1.7mL DNase/RNase Free离心管中，按0.5mL异丙醇/mL TRIzol的比例加入异丙醇，上下颠倒混匀，在室温条件下静置10min，4℃条件下12000×g离心10min，可见管底有白色总RNA沉淀；小心弃去上清，按每毫升TRIzol加1mL 75％乙醇的比例加入75％乙醇洗涤沉淀，4℃条件下7 500×g离心5min；吸去上清，空气干燥5min-10min，加入适量的无RNA酶水溶解RNA沉淀，之后若不立即使用就保存于-80℃。
[0037] 取2μL提取好的总RNA经过适当的稀释后用Nanodrop 2000定量，使用无RNA酶水作为校准时的溶液。质量较好的总RNA A260/280的比值应该在2.0-2.2之间。配制0.8％的琼脂糖凝胶，电泳缓冲液为0.5×TBE，120V恒压电泳15min，之后在凝胶成像仪上观察。完整的RNA样品在电泳图中应该呈现出3条清晰的条带，由上至下分别代表了28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA。
[0038] 2、总RNA的反转录
[0039] 使用Takara公司的PrimeScriptTM反转录试剂盒进行反转录，包括去除基因组DNA和反转录两个过程，具体步骤如下所示：
[0040] 1)去除总RNA样品中的基因组DNA，体系配方如下所示：
[0041]5×基因组DNA去除缓冲液 2μL
基因组DNA去除剂 1μL
总RNA 1μg
无RNA酶水 补足至10μL
总体积 10μL
基因组DNA去除剂 1μL
总RNA 1μg
无RNA酶水 补足至10μL
总体积 10μL
[0042] 置于PCR仪中进行反应，42℃反应2min。
[0043] 2)反转录反应
[0044] 将去除基因组DNA(gDNA)后的总RNA样品均分至两个pcr管中，在冰上配置mRNA反转录体系，体系配方如下所示：
[0045]
[0046]
[0047] 上述寡核苷酸引物和核苷酸随机引物为PrimeScriptTM反转录试剂盒中所带有的。
[0048] 轻柔混匀后立即置于PCR仪中进行反转录反应，反应条件为:
[0049] 45℃ 15min
[0050] 85℃ 5sec
[0051] 4℃ 5min
[0052] 3、荧光定量qPCR反应
[0053] 取0.5μL反转录产物，加至19.5μL无RNA酶水中，稀释40倍。配置qPCR反应体系，体系如下所示：
[0055] 充分混匀后瞬离，轻轻弹击管壁以除去气泡，再次离心。之后置于StepOne Plus Real-Time PCR System中，设定程序并进行qPCR反应，反应程序如下：
[0056]
[0057] 胃癌样本与对照组正常样本每个均做RGS1和内参基因GAPDH两组qPCR(分别采用的引物对如SEQ ID No.1和2、SEQ ID No.3和4所示)，每组3个平行重复。
[0058] 4、qPCR数据分析
[0059] qPCR反应完成之后对获得的原始数据(Ct值)进行相对表达量分析，具体计算过程如下：
[0060] ΔCt(胃癌样本)＝Ct(胃癌样本中的RGS1)-Ct(胃癌样本中的内参基因GAPDH)[0061] ΔCt(对照组正常样本)＝Ct(对照组正常样本中的RGS1)-Ct(对照组正常样本中的内参基因GAPDH)
[0062] ΔΔCt＝ΔCt(胃癌样本)-ΔCt(对照组正常样本)
[0063] RGS1的相对表达量＝2的(-ΔΔCt)次幂
[0064] 5、结果
[0065] 结果如图1所示，胃癌样本中RGS1的表达量(ΔCt(胃癌样本))显着高于对照组正常样本(ΔCt(对照组正常样本))，其差异具有统计学差异(p＜0.01)。结合胃癌患者临床生存信息分析癌症组织中RGS1高表达的临床意义。
[0066] 实施例2：RGS1高表达的临床意义
[0067] 利用R语言软件(更新版3.5.2)，对上述qPCR实验中得出的RGS1的相对表达量值作为参考标准，依据RGS1基因相对表达量值的中位数，将407例胃癌患者分为RGS1高表达组和RGS1低表达组。当检测结果中RGS1表达数据为表达值中位数以上，则为RGS1高表达；检测结果中RGS1表达数据为表达值中位数以下，则为RGS1低表达。利用GraphPad Prism 7.0软件，结合其生存期资料，绘制Kaplan-Meier生存曲线分析结果见图2。
[0068] 若实施例1中得到的RGS1的表达水平小于等于阈值，即RGS1基因相对表达值的中位数，则胃癌患者术后生存时间大于5年；若实施例1中得到的RGS1的表达水平高于阈值，则胃癌患者术后生存时间小于5年。
[0069] 由图2可知，RGS1高表达胃癌患者的生存期明显低于RGS1低表达胃癌患者的生存期，其差异具有统计学意义(p＜0.01)。RGS1高表达与胃癌患者总生存率的降低显着相关，预后为高死亡率，术后复发、转移几率高，建议患者后续进行积极检查和治疗。RGS1低表达与胃癌患者总生存率的升高显着相关，预后为低死亡率，术后复发、转移几率低，预后较为乐观，建议患者后续进行定期回访、必要时进行检查和治疗。可见，胃癌组织中RGS1基因相对于正常组织显著性高表达可作为判定较差预后的依据。这表明RGS1在胃癌预后评估中具有重要意义，可作为胃癌患者预后标志物。
[0070] 实施例3：胃癌预后诊断试剂盒的制备
[0071] 根据RGS1与胃癌预后的相关性，可以通过检测RGS1的表达情况来预测胃癌预后，据此本发明提供了一种用于胃癌预后评估的诊断试剂盒。所述试剂盒中不但包括实施例1中反应体系及用到的试剂，还包括荧光定量检测RGS1的mRNA表达量的正反向引物及内参GAPDH引物序列。
[0072] 下表为实验中用到的qPCR引物序列：
[0073]
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种自动化仓储货架 | 2020-05-11 | 766 |
| 一种基于深部位移变形监测的边坡下滑推力计算方法 | 2020-05-13 | 469 |
| 照明之智慧调控系统与方法 | 2020-05-14 | 370 |
| 危险废物熔炼装置、系统及物料处理方法 | 2020-05-12 | 399 |
| 一种预测急性肺栓塞患者不良事件的生物标志物及其应用 | 2020-05-13 | 364 |
| 多发性骨髓瘤生物标志物hsa_circ_0007841的应用 | 2020-05-12 | 633 |
| 一种适用于岩体条件地下洞室群变形分级预警指标的确定方法 | 2020-05-13 | 519 |
| 基于系统理论危害分析的列车自动防护系统安全分析方法 | 2020-05-13 | 179 |
| 危险品存放柜 | 2020-05-16 | 669 |
| 一种具有分层结构的高压电柜 | 2020-05-16 | 878 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
危险分层热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈