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快速定量分析动物骨骼肌 纤维的方法

阅读：41发布：2020-05-11

专利汇可以提供快速定量分析动物骨骼肌纤维的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种快速定量分析动物骨骼肌纤维的方法。该方法包括如下步骤：1)取离体动物的骨骼肌，制成冰冻切片；2)对步骤1)中的冰冻切片进行琥珀酸脱氢酶染色；3)对步骤2)染色后的切片拍照，保存图片，然后用计算机图像处理分析软件对图片进行定量分析。所述琥珀酸脱氢酶染色在目前的琥珀酸脱氢酶染色技术上进行了改进。所述计算机图像处理分析软件为Image Pro-plus 5.02版本软件。本发明的快速定量分析动物骨骼肌纤维的方法可以从肌纤维分类的角度筛选肉质优良的个体。，下面是快速定量分析动物骨骼肌纤维的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种定量分析动物骨骼肌纤维的方法，包括如下步骤：
1)取离体动物的骨骼肌，制成冰冻切片；
2)对步骤1)中的冰冻切片进行琥珀酸脱氢酶染色；
3)对步骤2)染色后的切片拍照，保存图片，然后用计算机图像处理分析软件对图片进行定量分析；
所述方法中的琥珀酸脱氢酶染色包括如下步骤：
a)将所述冰冻切片在琥珀酸脱氢酶染色液中，37℃孵育40min；
b)将步骤a)中染色后的切片在10％中性甲醛中固定10min；
c)将步骤b)中固定后的切片用75％、85％、95％和100％梯度浓度的乙醇逐级脱水；
d)用体积比为1∶2至2∶1的乙醇和二甲苯混合液透明步骤c)中乙醇脱水后的切片；
e)用100％二甲苯透明经过步骤d)处理的切片。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述计算机图像处理分析软件为Image Pro-plus 5.02版本软件。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述动物为鸡。
4.权利要求1或2所述的方法在畜或禽的肉质鉴定中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述禽为鸡。

说明书全文

快速定量分析动物骨骼肌纤维的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及快速定量分析动物骨骼肌纤维的方法。

背景技术

[0002] 动物肌肉品质实际上是一个复杂而多变的概念，肉质涉及到感观指标(肉色、大理石纹、口感等)、物理指标(剪切力、失水率、熟肉率)、生化指标(pH值、肌间脂肪含量、肌苷酸含量、磷脂、肌纤维类型、肌纤维密度、肌纤维面积、肌纤维直径等)等多个方面。越来越多的研究表明，嫩度是主导肉质的决定因素和最重要的感官特征，是评定肌肉品质优劣的重要指标。

[0003] 动物骨骼肌肌肉质地也是影响嫩度的重要因素之一，不论屠宰活重大小或日龄早晚，都是肌纤维愈细者肉质愈嫩，肌束内的肌纤维数越多，肌纤维越细，相应地肉品质也就越细嫩。有关研究也报道，肌纤维直径越细，单位肌肉横断面积内肌纤维的数量越多，切断肌肉所需的剪切力也就越小。肌纤维比例也影响肉的嫩度，肌纤维可根据其代谢方式的不同分为红肌纤维、白肌纤维和中间型纤维。红肌纤维直径较细，单位面积的纤维数量多，肌红蛋白含量丰富，代谢和贮存脂肪的能力较强，含有较多脂类物质，主要以有氧氧化形式供能，具有较高的ATP酶活性；白肌纤维直径较大，单位面积的数量较少，含糖原较多，主要以糖原酵解形式供能。因此，两种肌纤维可以根据ATP酶活性、NADH酶活性(Y.ONO，1993)或琥珀酸脱氢酶的活性区分开来。快速生长的畜禽可能因为过快的生长速度导致肌肉形态学的改变，较粗的纤维直径和糖酵解纤维(白肌纤维)数目增多，导致较低的蛋白质水解潜能，屠宰后这些特点会引起肌肉较快地变得僵硬，形成颜色苍白、系水力低、嫩度差的肉类产品，不利于深加工。

[0004] 为了在性能测定过程中快速测得肌纤维指标以达到肉质评定的目的，必须对肌纤维进行分型、染色和纤维测量。对肌纤维的分型，一般都是利用琥珀酸脱氢酶(SDH)染色，琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的重要的脱氢酶，可以将糖代谢的中间产物氧化脱氢。硝基蓝四唑(NBT)是无色染料，能被还原为蓝色甲能促使具有吞噬、杀菌能力的嗜中性粒细胞糖代谢能力增强。琥珀酸脱氢酶在糖代谢中的脱掉的氢可以将NBT还原，呈现蓝色反应颗粒二甲沉淀于胞质内。因此通过SDH染色，可以根据不同纤维的琥珀酸脱氢酶的酶活性的高低，还原NBT程度的不同，形成不同量的蓝色颗粒沉积于肌纤维中。这样，可根据蓝色反应的深浅程度区分不同肌纤维类型。红肌纤维含有较高的琥珀酸脱氢酶活性，显示蓝紫色；白肌纤维琥珀酸脱氢酶酶活性很低，显示为不着色或者很淡的着色；而琥珀酸脱氢酶酶活性一般的肌纤维，着色程度处于这两者颜色之间，即为中间型纤维。

[0005] 目前的琥珀酸脱氢酶(SDH)染色技术流程中，在组织与含有硝基蓝四唑(NBT)的染色液反应之前，需要与中性甲醛作用2个小时以上，使组织的形态固定。染色之后要经历梯度乙醇脱水，二甲苯透明等一系列过程。

[0006] 在对肌纤维分析方面以往的方法大多主观性太强，其主要体现在显微拍摄后人工计数，或者人为测量纤维横截面(近似于椭圆)的长轴与短轴在大致估计其面积，这种方法不但费时费力，而且主观性强，准确性低。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供快速定量分析动物骨骼肌纤维的方法。

[0008] 本发明所提供的快速定量分析动物骨骼肌纤维的方法，包括如下步骤：

[0009] 1)取离体动物的骨骼肌，制成冰冻切片；

[0010] 2)对步骤1)中的冰冻切片进行琥珀酸脱氢酶染色；

[0011] 3)对步骤2)染色后的切片拍照，保存图片，然后用计算机图像处理分析软件对图片进行定量分析。

[0012] 其中，所述方法中的琥珀酸脱氢酶染色包括如下步骤：

[0013] a)将所述冰冻切片在琥珀酸脱氢酶染色液中，37℃孵育40min；

[0014] b)将步骤a)中染色后的切片在10％中性甲醛中固定10min；

[0015] c)将步骤b)中固定后的切片用梯度浓度(75％、85％、95％和100％)的乙醇逐级脱水；

[0016] d)用体积比为1∶2至2∶1的乙醇和二甲苯混合液透明步骤c)中乙醇脱水后的切片；

[0017] e)用100％二甲苯透明经过步骤d)处理的切片。

[0018] 所述方法中，采用Image Pro-plus 5.02版本软件对所述图片进行定量分析。

[0019] 上述动物具体可为鸡。

[0020] 本发明所述的方法可在畜或禽的肉质鉴定中应用。

[0021] 所述禽具体可为鸡。

[0022] 本发明的快速定量分析动物骨骼肌纤维的方法，首先采取液氮冷冻处理骨骼肌样品，液氮冷冻处理一方面能保持肌肉内部完整的原始形态，令其不会因时间、受力等因素而变形从而影响测定，另一方面避免使肌肉内部的水分流失，导致肌肉萎缩，同时避免肌肉内部的水分成核形成冰晶，冰晶对肌纤维形态破坏较大，直接影响肌纤维直径和密度的测量；然后采用冰冻切片技术制备切片，冰冻切片技术能保持组织原始形态，切片上肌纤维的测定指标几乎与其在动物体内的指标相同，另外冰冻切片速度快，组织在切片时受力小，利于后期的定量分析，并且采用统一标准的连续切片，使切片之间具有很高的相似性，利于大量的样本统计和彼此间的相关分析；再次采用改进的琥珀酸脱氢酶染色方法对切片进行染色，目前的琥珀酸脱氢酶(SDH)染色技术流程中，在染色之前，切片需要长时间的甲醛固定，染色时间较长，而改进的琥珀酸脱氢酶染色方法将原来长达2个小时的染色前固定这一步骤改为染色后的固定，并且将其时间控制在10分钟以内，另外与含有硝基蓝四唑(NBT)的染色液反应着色这一步的时间也由原来的1个多小时缩短到现在的40分钟，并且在染色之后的梯度乙醇脱水这一步骤中，去掉50％和60％这两个梯度对于整体效果并无影响，这样在整体染色效果不变的情况下染色时间大大缩短，并且对染色效果并无影响；最后，在染色后采用ImagePro-Plus软件定量分析图片，这一方法取代了繁琐的人工手动测量，使得测量速度大大提高，同时也避免了人工操作所带来的误差，利用加载了新的宏命令的软件，可以在一次操作中完成一张切片图像的肌纤维的分类、计数、直径、面积和密度等多个指标的分析，分析后得到数据，可以与剪切力、失水率等常规肉质指标相结合分析，使肉质评定数据更加完整准确。

[0023] 通过本发明的快速定量分析动物骨骼肌纤维的方法，一方面，可快速得到详细的肌纤维特性分型和测量记录，这些数据可以更详细、准确地描述肌纤维特性，反映肉质的优劣水平，从而客观地对测定样品的肌肉品质作出评价，以指导品种的继代选育和杂交利用。另一方面，避免随机误差。本发明的快速定量分析动物骨骼肌纤维的方法，解决了快速制片和自动分析两大关键问题，使得肌纤维数据的获得更为简便。红肌纤维丰富就意味着肌纤维更纤细，它也更有利于保持肌纤维内的水分，使肌肉更为细腻多汁。因此，本发明的快速定量分析动物骨骼肌纤维的方法可以从肌纤维分类的角度筛选肉质优良的个体。
附图说明

[0024] 图1为肌纤维的分型标准

[0025] RF：红肌纤维，MF：中间型，WF：白肌纤维

[0026] 图2为肌纤维类型的划分

[0027] a：白肌纤维，b：红肌纤维

[0028] 图3为鲁西斗鸡和清远麻鸡不同类型胸浅肌组织类型百分比

[0029] 图4为RMW型的鲁西斗鸡和清远麻鸡的胸浅肌肌纤维类型比例

[0030] 图5为RMW型的鲁西斗鸡和清远麻鸡的胸浅肌肌纤维直径

[0031] 图6为不同类型的鲁西斗鸡和清远麻鸡的体重

[0032] 1：所有鲁西斗鸡的体重；2：所有清远麻鸡的体重；3：所有鲁西斗鸡和清远麻鸡中的母鸡的体重；4：所有鲁西斗鸡和清远麻鸡中的公鸡的体重；5：所有鲁西斗鸡和清远麻鸡中RMW型鸡的体重；6：所有鲁西斗鸡和清远麻鸡中MW型鸡的体重；7：所有鲁西斗鸡和清远麻鸡中W型鸡的体重。

[0033] 图7为不同类型的鲁西斗鸡和清远麻鸡的胸浅肌组织的剪切力

[0034] 1：所有鲁西斗鸡的胸浅肌组织的剪切力；2：所有清远麻鸡的胸浅肌组织的剪切力；3：所有鲁西斗鸡和清远麻鸡中RMW型鸡的胸浅肌组织的剪切力；4：所有鲁西斗鸡和清远麻鸡中MW型鸡的胸浅肌组织的剪切力；5：所有鲁西斗鸡和清远麻鸡中W型鸡的胸浅肌组织的剪切力。

[0035] 图8为不同类型的鲁西斗鸡和清远麻鸡的胸浅肌组织的失水率

[0036] 1：所有鲁西斗鸡的胸浅肌组织的失水率；2：所有清远麻鸡的胸浅肌组织的失水率；3：所有鲁西斗鸡和清远麻鸡中RMW型鸡的胸浅肌组织的失水率；4：所有鲁西斗鸡和清远麻鸡中MW型鸡的胸浅肌组织的失水率；5：所有鲁西斗鸡和清远麻鸡中W型鸡的胸浅肌组织的失水率。

具体实施方式

[0037] 实施例1、定量分析骨骼肌肌纤维

[0038] 一、定量分析鲁西斗鸡和清远麻鸡的骨骼肌肌纤维

[0039] 鲁西斗鸡是一种中国的土著鸡种，属玩赏型，但是体型高达魁梧，体质健壮，体躯长，胸腿肌发达，肌肉形态较有特点，清远麻鸡是一种中国的土著鸡种，以其体型小、皮下和肌间脂肪发达、皮薄骨软而著名，现在已经成为我国活鸡出口的小型肉用名产鸡之一。

[0040] 选取处于生长曲线拐点处(210至260日龄)的鲁西斗鸡10只，8母2公，清远麻鸡19只，13母6公，上述实验用鸡的饲养管理条件完全一致。

[0041] 分别定量分析鲁西斗鸡和清远麻鸡的骨骼肌肌纤维。实验方法如下：

[0042] 1)取样：

[0043] 鲁西斗鸡和清远麻鸡停饲24个小时(饮用水正常供应)后口腔放血屠宰；将屠宰放血后的鲁西斗鸡和清远麻鸡浸入冷水中，充分打湿羽毛，然后沥水放在手术台上，喷撒双氧水于禽体，沿龙骨突剪开皮肤，在左侧胸浅肌上1/3处沿肌纤维反向，采集2cm×0.5cm×0.5cm长方体肌肉块，液氮浸泡保存。

[0044] 2)制备冰冻切片：

[0045] 启动Leica CM1900冰冻切片机，设置切片室温度-25℃，冰冻头温度为-20℃，切片厚度为10um，预冷1h；将样品从液氮中取出，放入到冰冻切片室中平衡0.5h；取出样品，修剪成厚0.5cm的组织薄片，在预冷的冰冻头上滴一滴OCT冰冻切片包埋剂，迅速将组织粘上，顺时针沿组织的边缘涂抹OCT冰冻切片包埋剂直到完全覆盖为止，静置直至OCT冰冻切片包埋剂全部变为白色；将冰冻头连同组织一起固定在冰冻头架上，旋紧螺丝，放下展片板，缓慢旋转手柄，直到切到组织样，一旦有完整的组织切片出现，迅速用处理过的载玻片粘去组织切片，标记好，放入切片室中预冷的载玻片盒中。

[0046] 3)琥珀酸脱氢酶(SDH)染色：

[0047] 染色前1h，将事先配好的染色液放入到37℃培养箱中预热；染色液的组分如下：0.2M琥珀酸钠溶液100ml，0.2M NaH2PO46.5ml，0.2M Na2HPO4 43.5ml，0.1％硝基蓝四唑(NBT)200ml，去离子水50ml；从载玻片盒中取出粘有组织切片的载玻片，室温下，自然凉干至切片发白；将载玻片放入到预热的染色液中，37℃孵育40min；取出载玻片后，在去离子水中缓慢冲洗30s，放入到10％中性甲醛中固定10min；固定后的切片再用去离子水缓慢冲洗30s，然后使用梯度浓度(75％、85％、95％和100％)的乙醇逐级脱水；再用体积比为
2∶1-1∶2的乙醇、二甲苯混合液过渡透明脱水后的切片；最后用100％二甲苯透明组织切片，甘油明胶封片。

[0048] 4)观察与拍照：

[0049] 静置2h后，在Olympus BX51研究级生物学正置显微镜，目镜10X，物镜10X下观察染色切片，拍摄目标区域，选择显微镜自带拍摄软件中“Show Scale(显示标尺)”一项，这时图片右下角出现长度为500微米的标尺，保存。

[0050] 5)计算机分析图片：

[0051] 冰冻切片图片的分析处理均采用Image Pro-plus 5.02版本软件完成。

[0052] Image-Pro Plus(IPP)软件是Media Cybernetics公司著名的图像处理分析软件，支持图像采集，增强，标定，彩色图像处理，计数，测量，分析，图像标注，图像数据库，报表生成器，宏纪录，VBA宏编程进行功能扩展，全面的Internet支持。同时，支持用C++，Vb等扩展专对自己应用的特定功能。支持各种输入源，各种图像格式，特别支持大尺寸图像.特有荧光，材料分析模块，以及显微镜控制模块(用于自动显微镜控制)，适用于生物医学，生命科学，工业应用等多个领域的图像分析和处理。

[0053] Image-Pro Plus 5.02可以运行于 Windows 32位操作系统：2000(service pack 4)，and XP Professional(service pack 1及以后版本)。

[0054] 按照软件要求，将Image-Pro Plus安装在电脑的“C:\IpWin5\”目录下；“个性化设置文件”(主要是标尺设置和自定义宏命令)安装在“D:\根目录下。

[0055] 在批量图片处理前，选取形态保持完整、染色较好的肌纤维图片作为模板图片，然后根据软件自身的标尺和图片采集时的标尺大小调整，使得两个标尺代表的长度一致，随后设定IPP的灰度值，使之符合要求。其它图片均以此标准进行目标纤维的捕捉和相关参数的统计分析。在选定的图片里面，设定好测定的参数——面积(Area)、平均直径(Diameter-mean)、平均灰度值(Density-mean)、累积灰度值(IOD)。在肌束内随机选择具有代表性的红肌纤维和白肌纤维，用IPP分析其灰度值，此时会测定出一个红肌纤维和白肌纤维的灰度值的范围，选取红肌纤维范围的下限和白肌纤维的上限作为三种肌纤维类型的评定界限，位于两个界限值之间的肌纤维类型，判定为中间型纤维，如图1所示。

[0056] 具体操作步骤如下：

[0057] 1.打开软件

[0058] 双击“Image-Pro Plus”，打开进入界面，点击左上角的file按键，打开一张肌纤维轮廓清晰的图片；

[0059] 2.更改光密度值

[0060] 在组化染色中，肌纤维类型之间的鉴别是通过肌纤维染色程度的深浅程度不同而区分的，表现在IPP中，就是intensity(光密度值)的不同。在IPP软件中，默认的intensity格式，代表的是灰度值，即颜色越深值越小，颜色越浅值越大。这显然与目标不符，而实际上测量的染色程度是光密度值，染色越深，光密度值越大。

[0061] 具体操作如下：点击“measure-＞calibration-＞intensity”，然后在窗口中点“new”按钮，再点一下“std optical density”，此时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线，再点最上方的“system”按钮，使得以后所有的操作都是按照统一标准来操作，最后点击“close”关闭窗口。

[0062] 3.校正标尺

[0063] 软件中的标尺和实际拍摄图片中的标尺往往不一致，为了统一两者之间的尺度，需要在IPP里面校正标尺，使得软件和拍摄图片的尺度一致。具体操作是：点击“measure-＞calibration-＞spatial”，在弹出的标尺标定菜单中，然后点击“new”，在最上方的“name”项下的“spatial cal 0”处点一下，改成英文字符“500um”，在“UNIT”项下填入“um”，给“um”下方的“Convert when change unit”选项打勾。随后点击“pixels/unit”框里的“image”，弹出“scaling”对话框，同时在标尺图片左上角显出一个标尺，将鼠标移到这个标尺的横杠上，点一下左键，光标就立即变成小手，拖动光标到图片的标尺处，用左键拖动软件标尺的两端使之与图片上标尺的两端对齐。如照片是在10倍物镜、10倍目镜条件下拍摄，拍摄单位填写“500”，点击“OK”关闭“scaling”窗口，回到“spatial calibration”窗口，点击“close”结束。若标尺作的不对，可以直接点击“delete”；

[0064] 4、肌纤维参数的选定

[0065] 根据需要，选定常用的测量参数，其中，常用的参数有“Area”、“Density(mean)”、“Diameter(mean)”、“IOD(Integrated Optical Density)”。测量肌纤维的目的是测量其表观指标，所以选择前三者参数指标。具体操作步骤：点“measure-＞count/size-＞measure-＞select measure”，点击目标参数，选定参数，点击“OK”，回到“count/size”界面，完成参数选择。

[0066] 5、目标区域(AOI)选择

[0067] AOI是Image-Pro Plus中最有用、最重要的概念，这也是Image-Pro Plus使用过程中的关键操作。肌纤维的横截面积并不是理想的圆形，而是各种不规则的闭合图形。为了更加真实地再现肌纤维的实际参数，本方法中可以借助界面最上方的的“Irregular”工具来完成。具体操作步骤如下：点击界面上方的会出现一个工具条，点击“Trace”寻迹工具，在右侧的“Auto”前打勾，同时将“Speed”的值调整为“1”(慢速可以随时修正寻迹方向)。

[0068] 这个工具的标题叫Magic wand。将鼠标移至图中一个肌纤维的内膜，光标就变成魔棒了，在一个位置左键点一下，就选中了这个位置及其周围灰度相似的区域。这里″相似″的定量范围由Range的值来决定。较大的range值为较大的灰度范围，点一下能选中一大片区域。较小的range值则为较小的灰度范围。在一个区域上多点几下，就能选中这个区域的整个边界了。最后点一下右键，就确定了一个不规则形状的选定区域。smooth值是用来平滑区域边界的。一般不需要平滑，因此默认值为零。选中一个区域后如果还要在同一张图片上再选另一个区域，不能直接点选，要先点击一下工具栏上的Multiple AOI按纽，再点击add，接下去就可以到另一个选择区域点选。选好一个新的区域后再回去点Multiple AOI--add确认，再继续下一个，直到选取完所有的AOI。最后在图片上任一处点一下右键结束选择操作。结束后如果又想再增加选择区域，只要再点一下“new AOI”按纽，就可以调出工具条继续增加选择区域。如果肌纤维轮廓不是太清晰，可将“Auto”前的对勾去掉，手动辅助选择AOI。

[0069] 6、自定义宏

[0070] “宏”实际上不过是把一连串的操作组合到一个操作的有效工具，可有效的客观的保证判断多张图片之间的一致性。操作的前提是，在所有待处理照片中，选择一张具有形态保持完整、染色较好的典型图片，进行仔细的选色及分析测量。得到满意的结果后，就可以按照这个既定的操作程式进行宏的编制了。

[0071] 编制宏操作前的准备：把“count/size”窗口中各项选择完成后，包括各种参数选择，点击file菜单中的“save setting”保存到另一个磁盘分区，命名为英文名。打开“statistics”窗口，获取测量值后，点“file”菜单中的“DDE Option”窗口，设置一下测量数据传往Excel的规则。在DDEOption窗口中从上到下，在“Append next date set to the bottom”前打勾。设定了“DDE option”后，不要关闭“statistics”窗口，打开一个空白“Excel”表格。

[0072] 录制宏：打开一张典型的照片，打开“count/size”窗口，还有空着的“statistics”窗口，点击“Macro-＞Record Macro”，就调出来录制宏的开始窗口。

[0073] 录制宏的步骤：点“Count/size”窗口的“file-load settings”，从弹出的文件夹选在菜单中调出刚才保存的“count设定文件”，点击“Count”，计数，统计数据会马上显示在“Statistics”窗口中，点击“Statistics”窗口中的“file-DDEto Excel”，点“Shop recording”结束录制宏。为了精准，以后每个肌纤维进行寻迹后，都可以使用宏快捷键，将测定数据保存在一个文件夹内。

[0074] 7.肌纤维类型的区分

[0075] 选择3~5张典型的图片，依据组化图谱限定红肌纤维和白肌纤维，并使用IPP软件对其光密度值进行测定，随后将白肌纤维和红肌纤维的光密度值按照从小到大的顺序排列，假定白肌纤维的光密度值最小值为IW1，最大值为IW2；红肌纤维的光密度值的最小值IR1，最大值是IR2。在此，人为地认为三种肌纤维的光密度值分别为：白肌纤维＜IW2，中间型纤维IW2~IR1，红肌纤维＞IR1，所有的肌纤维的数据汇总后，根据如上规则，进行对比，分析出肌纤维类型。

[0076] 在本实验中，白肌纤维的光密度值最小值为0.1483最大值为0.1821；红肌纤维的光密度值的最小值0.2644，最大值是0.4735。＜0.1821的为白肌纤维，0.1821~0.2644的为中间型纤维，＞0.2644的为红肌纤维。

[0077] 实验重复3次，每一次重复的图片上选取3个视野，计算平均值。

[0078] 在单一组织的肌纤维分型上，又将骨骼肌组织划分为三个类型：RMW(混合有红肌纤维、中间型纤维和白肌纤维的骨骼肌纤维组成类型)、MW(混合有中间型纤维和白肌纤维的骨骼肌纤维组成类型)、W(完全由白肌纤维构成的骨骼肌纤维组成类型)，如图2所示。进一步分析得到各种肌纤维的平均灰度值、平均直径、肌束内的肌纤维数目、每种类型肌纤维的数目以及所占的比例等等。所采集的定量化描述的测定数据用于Duncan多重比较分析。

[0079] 二、定量分析鲁西斗鸡和清远麻鸡的骨骼肌肌纤维的结果

[0080] 1)三种类型肌纤维在不同骨骼肌组织中的分布

[0081] 从切片染色观察和平均灰度值测定两个方面分析表明，SDH染色可以用来成功地将骨骼肌中的肌纤维分为三种类型。又根据每个研究对象所含纤维类型的情况，将骨骼肌分成三种类型，即：1)RMW型：含有红肌纤维、中间型纤维和白肌纤维；2)MW型：含有中间型纤维和白肌纤维；3)W型：只含有白肌纤维。

[0082] 鲁西斗鸡和清远麻鸡中不同胸浅肌组织类型的百分比(不同胸浅肌组织类型的百分比＝各个肌纤维类型的鸡的只数/测试鸡的只数，如RMW型百分比＝RMW型鸡的只数/测试鸡总数)的分析结果表明，在鲁西斗鸡和清远麻鸡中都出现了胸浅肌中含有不同比例的红肌纤维和中间型肌纤维的个体，拥有不同类型胸浅肌的个体在鲁西斗鸡和清远麻鸡两个品种中的分布比例见图3，在检测样本中鲁西斗鸡有30％的个体为RMW型，而在清远麻鸡中，只有1例出现了RMW型胸浅肌，接近95％的清远麻鸡均为单纯含有白肌纤维的W型个体。

[0083] 鲁西斗鸡和清远麻鸡中的RMW型的胸浅肌也表现出了明显的差异。

[0084] 总体来讲，虽然清远麻鸡和鲁西斗鸡中都有个体的胸浅肌被定义为RMW类型，但二者在肌纤维类型比例(肌纤维类型比例＝各个肌纤维的数目/RMW类型鸡的肌纤维的总数，)上仍然有所不同(图4)。清远麻鸡的白肌纤维比例高，中间型纤维的比例低，而二者的红肌纤维比例差异不明显。鲁西斗鸡的肌纤维直径总体大于清远麻鸡，但不论对于哪个鸡种来说，同一部位的红肌纤维直径总是明显小于白肌纤维直径，而中间型纤维的直径则介于二者之间，但更接近于白肌纤维，如图5所示。

[0085] 2)生长性状及胸浅肌肉质性状的分析

[0086] 本实验所用的两个鸡种，在胸浅肌取材时间都选取了生长曲线拐点处所对应的生长阶段。两个品种在体重上稍有差别，但是差别不显著。将三种不同胸肌组织类型个体进行比较，可以看出，RMW型个体生长较慢，体重较轻，MW型和W型个体体重依次提高，如图6所示。胫骨长结果也类似体重结果，RMW型个体的胫骨长显著小于MW型个体的胫骨长(P＜0.05)。

[0087] 剪切力和系水力(失水率)是反映肉质好坏的最常用指标。从剪切力的角度来看，鲁西斗鸡与清远麻鸡的差异不显著，同一品种内三种类型胸浅肌之间的差异也不显著，如图7所示。失水率方面，两个品种的差异不显著，但是RMW型胸浅肌的失水率明显低于其他类型，如图8所示。说明红肌纤维的存在对保持肌肉水分有一定帮助，从而可以使肌肉更加鲜嫩多汁。

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快速定量分析动物骨骼肌纤维的方法

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