[1994]](流程图9)。在Corey及Reichand所用的条件下[Corey E.J.等人(1992a)]，A-53化合物通过氧化成酸并和L1偶连(均以标准法制得)转化成A-54a类似物。使用Lawesson试剂[Cava，M.P.等人“四面体通讯”(Tetrahedron)(1985)41：5061]对这些化合物行硫化作用，可得硫羰类似物A-55a。A-54b化合物是通过与L2相应的亲核试剂(如三氟化碳)[Francese，C，等人，J.Chem，Soc.Chem.Commun，(1987)642]，加成到醛A-54b上然后用Dess-Martin过碘化剂氧化醇来制备。[Linderman，R.J.等人“四面体通讯”(Tet，Lett)，(1987)28：4259]。用Lawesson试剂硫化这些化合物可得硫羰类似物A-55b(Cava，M.P.等人

[1985])。A-55C型的过氧化物可从A-53或A54b通过Johnson的方法制备(Johnson，C.R.，Acc.Chem.Res.(1973)6：341)。因此完成了此部分所有类似物的合成。流程图8a)H2，Pd/C，H+或HS(CH2)3SH，HCl，CF3CH2OH，b)TBS-Cl，咪唑，DMF，c)NaH，相当于Ra的亲电剂，DMF，e)硫化双(三环己基锡)，BCl3，f)RcRb(H)(MgBr)；H+，g)LiAlH4，Et2O，h)雷氏镍流程图9a)TBAF，THF，HF，CH3CN，HCl，MeOH，b)(COCl)2，DMSO，Et3N，CH2Cl2，c)NaClO2，pH7，THF，d)L1-H，BOP-Cl，e)Lawesson’s试剂，f)相当于L2的亲核剂，g)Dess-Matin高碘烷，h)Me2(S+)(O)CH2-权利要求4和31所涉及的化合物制备的方法是主要依赖于Seebach和Corey的方法。因此，如在流程图10中所示，A-58型的过氧化物是依据Corey等人的方法[Corey，E.J.等人(1992b)]从61到62化合物制备。在步骤a中选用适当的用于醛醇反应的醛类来配置R2。Corey[Corey，E.J.等人(1992b)]指出A-58过氧化物被立体专一地打开生成A-59。因此，通过用相当于Z1的亲核试剂处理A-58来配置Z1。(PZ指用于Z1的保护基)。Z2的配置是通过将A-59的羟基转化成离去基，如，例如甲苯磺酸盐，并用相当于Z2的亲核试剂取代离开基来完成。(Pz’指用于Z2的保护基)流程图10
a)Et3N，b)RfCHO，c)K2CO3，d)MeOH，H2O，d)相当于Z1的亲核试剂，如果有必要，保护Z1，e)TsCl，吡啶，f)相当于Z2的亲核试剂，如果有必要，保护Z2，g)如果有必要，去保护PZ和PZl，h)MeSO3H，甲苯，i)CH2N2，j)(CH3)3CCHO，酸，k)LiHMDS，相当于A1的亲电试剂，1)LiAlH4，m)TBS-Cl3，咪唑，DMF，n)酸性水，o)HCHO，酸，p)CDlSeebach的结果[Seebach，D.等人，Helv，“化学学报”(Chim，Acta.)(1987)70：1194]被用于合成的另一部分。A60转变成A-61使得可以烯醇化并用相当于A1的亲电试剂进行烷基化作用产生A-62。Seebach证实该烷基化主要产生所示的非对映体。
酯类的还原和保护产生作为TBS醚的伯醇之后，去除叔丁基亚甲基保护基使得可以转变成A-63型(例如，通过用甲醛和一种酸催化剂处理)或A-64型(例如通过用CDI处理)。
在完成权利要求4和31的化合物的合成中，化合物是关键的中间产物(流程图11)。A-65型的化合物是从A-64型化合物在Tebbe烯化条件下[Pine，S.H.等人(1985)]制备的。A-66型化合物是从A-64以硫化双(三环己基锡)和三氯化硼处理而制备的[Steliou，K.等人(1982)]。A-67型的化合物是以将适当的Grigard试剂或烷基锂加至A-64或A-66，随后再酸水解及分离E和Z烯烃异构体而制得的。[Aguerro，A.等人(1986)和Schroch R.R.(1976)，和Hansen，C.等人(1973)]流程图10中制备的A-63型化合物也是通过用氢化锂铝还原A-64来制备的[March，J.(1992)和Gaylord，J(1956)，或者通过用雷氏镍还原A-66而生成[Belen′kiiW.，(1990)。A-63、A-64、A-65、A-66和A-67一起属于A-68总类，其是转化的乳胱氨酸类，是通过下列方法得到的：TBS醚的氟化物去保护作用，通过醛醇类似物(例如，所示的二步法中的)把得到的伯醇氧化成羧酸，通过用Corey and Reichand的方法与L1偶连[Corey E.J.等人(1992a)]并(如需要)去除Z1和Z2的保护基(如果有必要)，而转化成乳胱氨酸的类似物A-69化合物。乳半胱氨的类似物A-71是通过把A-69用Lawesson’s试剂处理而制得的[Cava，M.P.等人(1985)]，A-70类似物同样由A-68通过3-丁基-二甲硅烷基醚的氟化物去保护作用，得到的伯醇氧化成醛，亲核试剂(如三氟化碳)的加成[Francese，C.等人1987，见上面]，Dess-Martin高碘烷的氧化作用，用Lawesson′s试剂的硫化作用(如需要)[Cava，M.P.，91985]，及Z2和Z2的去保护作用(如需要)而制成。A-72型的过氧化物也从A-68以3-丁基-二甲硅烷醚的氟化物去保护作用，得到的伯醇氧化成醛，与L2相应的亲核试剂的加成，Dess-Martin高碘烷氧化，dimethyloxosulfonium methylide的加成，和Z1和Z2的去保护作用(如需要)而制得。此以上面方法制备权利要求4及31所有化合物。
流程图11
a)Tebbe烯醇化，b)硫化双(三环己基锡)，三氯化硼，c)RcRbC(H)(MgBr)；H+，d)LiAlH4，Et2O，e)雷氏镍，f)TBAF，THF，g)Swern氧化作用，h)NaClO2，Na2HPO4，i)L1-H，BOP-Cl，j)如需要去保护，k)Lawessons试剂，l)相当于L2的亲核试剂，m)Dess-Matin高碘烷，n)如需要，步骤k，o)Me2(S+)(O)CH2-权利要求1项所涉及的化合物主要依据Evans和Corey的方法。因此，如流程图12所显示，A-73型手性噁唑烷酮的烯醇化，再以苄氧基溴甲烷进行烷基化，然后配置R1。[Evans，D.A.等人“美国化学学会杂志”(J.Am.Chem.Soc.)(1982)104：1737](只有一种构型的R1在此反应中获得。其他构型的R1是使用手性噁唑烷酮的相反的对映体。A-74转变成A-75型的醛，手性的、硼介导的和叔-丁基溴乙酸酯(用A-76)[Corey，E.J.等人，(199b)]的醛醇缩合产生仲醇，其以3-丁基-二甲基甲硅烷基(TBS)醚而被保护而产生A-77型的化合物。用相当于Z1的亲核试剂[Corey，E.J.等人(1992)]置换溴化物产生A-78化合物，A-78能转化成A-79化合物。如上针对权利要求4所讨论的所述化合物可以被烯醇化并用与A1相应的亲电子试剂立体特异性地烷基化而产生A-80。标准官能基的控制产生A-81型的甲苯磺酸盐。以与R2相应的亲核试剂置换甲苯磺酸盐[Hanessian，S.等人，J.Org.Chem.(1989)54：5831]得到A-82型化合物。其伯醇经由如催化氢解并在伯醇氧化成羧酸以后环化成A-83化合物。
如流程图13所表示，A-84型的化合物，其中R1是(R)或(S)构型，被转变成多种X1变体。A-85型的化合物由A-84型在Tebbe烯化条件下制备[Pine，等人(1985)]。A-86型的化合物是将A-84型用硫化双(三环己基锡)和三氯化硼处理而制成的[Stelious，K.等人(1982)]。A-87型的化合物是以向A-84或A-86加入适当的Grignard试剂或烷基锂，然后以酸性水解，并分离E和Z烯异构体而制成的[Aguerro A，等人，(1986)，Schrock.R.R.，(1976)及Hansen C.等人(1973)]。A-88型的化合物是将A-84用氢化锂铝还原制成的[March，J(1992)及Gaylord，J.(1956)]或用雷氏镍还原A-86而生成[Belen′kii W.，(1990)]。当在A-88中Z1是硫时，例如用KHSO5可实施氧化成环状砜变体的氧化作用。[Trost，B.M.，等人，“四面体通讯”(Tet，Lett.)(1981)22：1287]。
流程图12a)LDA，BnOCH2Br，b)LiAlH4，c)Swern氧化作用，d)Et3N，甲苯，e)A-75，f)TBS-Cl，咪唑，DMF，g)相当于Z1的亲核试剂，h)MeSO3H，i)CH2N2，j)TBAF，THF，k)(CH3)3CCHO，酸催化剂，l)LiHMDS，相当于A1的亲电试剂，m)LiAlH4，n)TBS-Cl，咪唑，DMF，o)去保护，p)TsCl，吡啶，q)与R2相应的亲核试剂，r)H2，Pd/C，s)氧化物，t)如有必要，Z1去保护，u)环化(例如，以二环己基碳化亚胺为例)。
流程图13aa)Tebbe烯醇化，b)硫化双(三环己基锡)，BCl3，c)RbRcC(H)(MgBr)；H+，d)LiAlH4，ET2O，e)雷氏镍，f)KHSO5，g)TBAF，THF，h)Swern氧化作用，i)NaClO2，NaH2PO4，j)L1-H，BOP-Cl，k)Lawesson’s试剂。
a)TBAF，THF或HF，CH3CN或1％HCl，MeOH，b)(COCl)2，DMSO，Et3N，CH2Cl2，c)NaClO2，pH7，THF，d)L1-H，BOP-Cl，e)Lawesson′s试剂，f)NaClO2，相当于L2的亲核剂，G)Dess-Matin高碘烷h)Me2(S+)(O)CH2-化合物A-84、A-85、A-86、A-87、A-88及A-89一起属于A-90型总类，其被转变成A-91类似物，如依据Uno等人的方法[Uno，H.等人(1994)](流程图13b)。A-91化合物被转变成A-92类似物是经由氧化成酸，在Corey and Reichard使用的条件下，与L1偶连(均以标准方法制备)[Corey E.J.等人，(1992a)]。以Lawesson′s试剂硫化，这些化合物产生A-93的硫羰类似物。A-94化合物可经由相应于L2的亲核试剂(如三氟化碳)[Francese，C.等人，(1987)]加成至A-91醛上，再以Dess-Martin高碘烷氧化醇而制得。用Lawesson试剂对这些化合物行硫化，可得A-95硫羰类似物。A-96型的过氧化物由A-91或A-94以Johnson的方法来制得。由此，完成在此部分详述的所有类似物的合成。注意：如上面与权利要求6有相关的所有流程图中，当用直线将A2(或任何和A2相当的部分)连结至分子的其余部分时，要假定是虚线，用直线只为了说明清楚。所有A2在α面(底面)上连至分子的其余部分。
列在权利要求17中的所有化合物的合成都依赖于流程图9的关键性中间代谢物。如流程图14所示，B-1型化合物和A-53化合物亚型是相类似的，其各种制备描述于流程图1、2及5至8，并描述于附上的文本中。
为了制备B-2类似物，使用了Corey等人的方法[Corey E.J.等人，“四面体通讯”(Tet，Lett)，(1993)34：6977]。例如以Lawesson试剂对B-2进行硫化得到B-3类似物[Cava，M.P.等人(1985)]。
流程图14a)BOP-Cl，b)Lawesson’s试剂流程图15
a)OsO4，NMO，水，丙酮，b)TCDl，c)BU3SnH，AlBN，d)分离非对映体，e)DEAD，PPh3，醋酸，f)醋酸酯转变成离去基，g)相当于Z3的亲核试剂，h)见流程图8和9B-1型化合物的制备总结于流程图15。用与流程图1、2、5、6和8中所用的相同方法把如流程图1中所使用的相同的起始物质(A-1)加工成所有B-2化合物。然后用两种可能的一般方法将这些中间物转变成B-2。第一种和流程图1、2、5、6、8和9详述的方法相类似，其中在有关反应中Z5(适当活化或保护的)充当亲核试剂。
基于流程图7中如示的另一方法，在流程图15中也有说明。B-4的二羟化得到B-5，其接着如前进行脱氧得B-6。非对映体的分离，仲羟基的Mitsunobu转变，及置换从Mitsunobu产物衍生的离去基，得到B-7型化合物，其再如流程图8和9所述被加工成B-1型化合物。
列举在权利要求17的所有合成物的所建议的合成法，都依赖从流程图12而来的中间物A-81。如流程图16所示，B-11型的化合物和A-81化合物的亚型是相类似的，其不同的制配法在流程图12图中说明，详述在附上的文本中。B-11型化合物转变成B-12，是如流程图12进行的。B-13型化合物由B-12型依据流程图13a和13b的有关步骤来制得。
为了制得B-14类似物，使用Corey的方法[Corey，E.J.等人(1993)]，例如用Lawesson′s试剂[Cava，M.P.等人(1985)]对B-14进行硫化，产生B-15类似物。
流程图16
a)见流程图12，b)见流程图13b，c)BOP-Cl，d)Lawesson′s试剂权利要求17所涉及的化合物的制备依赖从流程图7而来的关键性中间物，如流程图17所示，C-1化合物和A-41相类似，其制备在流程图7中说明并在附上的文本描述。根据Fuchs的工作[Hutchinson D.K.等人“美国化学学会杂志”(J.Am.Chem.Soc.)(1987)]，C-1化合物顺序以双(苯基氧甲基)铜酸锂和酸性水处理，而得C-2型化合物。可得到两种构型的R7。详述参见流程图1和2。如流程图8，弱酸水解，伯羟基的保护，及氮的烷基化或保护，得到C-2化合物。
通过用例如催化氢解反应及随后用与Z7相应的亲核试剂取代甲苯磺酸盐的衍生物对苄基行去保护化，得到C-3化合物，其中如需要，Z7是被保护的。在与流程图8和9的相同的一组反应加工羧酸C-4使得可制备所有xa变体，Z7的去保护作用(如需要)，随着用例二环己基羰化亚a胺环化产生双环C-5结构，若有必要，其用Lawesson′s试剂[Cava，M.P.等人(1985)]行硫化产生C-6。
权利要求7的右手结构所涉及的化合物的装备是依赖于流程图9的关键中间物。如流程图18所示，C-11化合物和以Z7限定的A-25型化合物亚型是相类似的，其制备于流程图1-8中说明并在附上的文本中进行描述。例如通过在Swern氧化条件下，用例如于四氢呋喃中TBAF进行伯羟基去保护，产生C-12醛。此醛用例如由三苯基甲氧基甲基氯化鏻衍生的膦内鎓盐[Jamion，T.F.，等人“美国化学学会杂志”(J.Am，Chem，Soc)(1994)116：5505]生成C-13型的烯醇醚，其然后用酸水解和用例如NaClO2缓冲液氧化得到的醛，转化为羧酸C-14[Corey，E.J.等人(1992a)]。
a)(BnOCH2)2CuLi，酸性水，b)其中A1是H的情况也参见流程图1，c)HCl，HS(CH2)3SH，CF3，CH2OH，d)见流程图8，e)H2，PdC/，f)TsCl，吡啶，g)相当于Z2的亲核试剂；h)Z2去保护，如需要，i)见流程图8和9，j)Z2去保护(如需要)，k)DCC，l)Lawesson’s试剂。
流程图18
a)TBAF，THF，b)Swern氧化，c)Ph3P＝C(H(OCH3)，d)HCl，H2O，THF，e)NaClO2，NaH2PO4，f)去除PZ(如需要)，g)DCC，h)Lawesson′s试剂Z7的去保护(如需要)，接着用例如二环己基羰化亚胺进行环化[KlausnerY.S等人“合成”(Synthesis)(1972)453]产生双环的C-15结构，如果需要，其用Lawesson′s试剂[Cava，M.P.(1985)]进行硫化。
权利要求8和39所涉及的化合物的制备主要依赖于Evans的硼烯醇盐介导的不对称性醛醇方法[Euans，D.A.等人“美国化学学会杂志”(J.Am.Chem.Soc.)(1981)103：2127]和对分子内基团环化的研究结果[Curran，D.P.“综合有机合成”(Comprehensive Organic Synthesis)，(1991)4：779-831]。
标准方法制备的C-21酯(流程图19)被去质子化，然后用苯甲氧基溴甲烷进行烷基化，并用DIBAL-H还原得到醛C-22的外消旋混合物。
将C-22加至由手性噁唑烷酮亚胺C-23衍生的硼烯醇盐[Evans，D.A.等人(1981)]C-24的A3非对映异构体的混合物。在此反应中建立了构型相同的另两个新的立体中心，其不受A3的构型影响。
流程图19a)LDA，BnOCH2Br，b)DIBAL-H，c)Bu2BOTf，Et3N，d)C-22，e)TSCl，吡啶，f)相当于Z1的亲核试剂，g)H2，Pd/C，h)Swern试剂，i)NaClO2，NaH2PO4，j)CH2N2，k)LiAlH4，Swern氧化剂，l)Base，Gilbert试剂m)LDA，TMS-Cl，n)LiOH，THF，水，o)BOP-Cl，p)(Bu3Sn)2，hv，q)(Ph3P)4Pd，R2-M，r)Lawesson’s试剂。
在6步法中(例如，仲羟基的甲苯磺酰化，以与Z7相应的亲核试剂置换，苯甲基的催化氢解，醇氧化成羧酸及酯化转化成C-25醛使得可以制备分子内基团环加成的底物。因此，用Gilbert试剂[Gilbert，J.C.等人，“有机化学杂志”(J Org.Chem.)(1982)47：1837]处理此醛，再用碘置换可烯醇化的氢产生乙炔C-26，在Z7的去保护(如需要)后，用例如BOP-Cl将其环化得C-27化合物。
将C-27暴露在原子转移，分子内基团的环化的条件下[Curran，D.P.等人“四面体通讯”(Tet.Lett.)(1987)28：2477和Curran，D.P.等人“有机化学杂志”(J.Org.Chem.)(1989)54：3140]得到C-28化合物。这一反应需进一步说明，A1和碘原子的立体化学并不重要，因为从碘产生的自由基在反应条件下能够互变。此外，仅有一种基的非对映体能够环化，产生所述的顺式-4，5环的体系，因为反式-4，5体系受到较大的环张力。
由于另外两个原因，该环化作用是有利的。首先，其为5-内-插型(5-endo-dig type)，因此依据Baldwin′s环化法则(Baldwin’s J.E.，J.Chem.soc.Chem.Commun.)(1976)734)，其是有利的。其二，使用的原子转移条件是理想的，因为生成的乙烯非常易反应且可被碘自由基迅速地停止[Curran，D.P.等人“美国化学学会杂志”(J.Am，Chem.Soc.)(1986)108：2489]。
将C-28加工成C-29是用，如标准的Stille[Stille，J.K.Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.(1986)24：504]或Heck[Heck.R.F.，“综合有机合成”(Compehensive，Organic Synthesis)(1991)4：833-863]型偶连条件来完成，其使用合适的R9的金属衍生物(例如M为三丁基甲锡烷基以Lawesson′试剂进行硫化[Cava，M.P.，等人，(1985)]得C-30化合物，由此完成权利要求8和39中的所有化合物的制备。
a)LiHMDS，PhN(Tf)2，b)(Ph3P)4Pd，R2-M，c)Lawesson′s试剂。
权利要求9和40所涉及的化合物的制备，主要依赖B-2的中间物，其制备已描述于流程图13a、13b和14，并在附上的文本中进行讨论。如流程图20所示，C-31是以合适的碱行去质子化，所成的烯醇盐再用，例如三氟甲基磺酸酯来源的PhN(Tf)2[McMnrry，J.E.等人“四面体通讯”(Tet，Lett)(1983)24：979]处理而得。乙烯基三氟甲基磺酸酯C-32以例如催化剂量的联三苯磷钯(Ph3P)4Pd)和合适的R9的金属衍生物(M为例如三丁基甲锡烷基)(stille J.K.(1986)和Hech，R.F.(1991)]处理产生C-33类似物，其用Lawesson′s试剂[Cava，M.P.等人(1985)]处理产生C-34，由此完成这部分的所有化合物的制备。
权利要求10和41所涉及的化合物的制备主要依赖于A-38中间物，其制备在流程图1，5和6中说明，并在附上的文本中讨论。由此C-41型化合物(流程图21)可用(R)或(S)构型的Z7通过依照流程图1至6中说明的方法来制备，其在所附文本中加以讨论。C-41的弱酸水解[Corey，E.J.等人(1992a)]，紧接着伯羟基的保护[Corey E.J.等人(1972)]使得可以经由标准的烷基化方法[Challis，N.(1970)]配置A4得到C-42。这些中间物加工成C-43是如流程图8中对类似化合物所述的来进行。伯羟基的去保护使得可以氧化成羧酸C-44，其用例如双(2-羰-3-唑啶膦)-氯(BOP-Cl)环化得到C-45类似物，该类似物用Lawesson’s试剂处理[Cava，M.P等人(1985)]得到C-46化合物，由此完成权利要求10和41中所有化合物的制备。
流程图21
a)HCl，HS(CH2)3SH′.3，CF3CH2OH，b)TBS-Cl，吡啶，DMF，c)碱，相当于A2的亲电试剂，d)见流程图8，e)TBAF，THF，f)Swem氧化，g)NaClO2，NaCH2PO4，h)BOP-Cl，i)Lawesson′s试剂。
权利要求11和42所涉及的化合物的制备是依据流程图1，3，4，5，8和9所述的方法，并在所附文本中进行描述。因此，流程图22所示，和A-2相似的C-51被加工成C-52化合物，其是按照与流程图1中所用的相同方法通过使用含A5的醛和被护的(R)或(S)构型的Z7来进行的。仲羟基的保护，得到C-52化合物[Corey E.J.等人(1972)]。其以与R9相应的亲核试剂处理并接着用酸性水行淬火而得C-53。决定亲核加成及立体选择性和液体淬火的原因已在流程图的所附文本中讨论。
仲羟基的去保护和随后的转化成甲苯磺酸盐使得可以用与A3相应的亲核试剂取代甲苯磺酰盐来导入A3，产生C-54型化合物。[HanessianS.(1980)]。以流程图8所示及所附文本所述的及原文方法将这些化合物加工成C-55。伯羟基的去保护使得可以在Z7去保护(如需要)后氧化成羧酸C-50，其用例如二环己基碳化亚胺[Klausner，Y.S.等人(1972)]进行环化，得到C-57的类似物。用Lawesson′s试剂[Cava M.P(1985)]进行硫化得到C-58，由此完成权利要求11和24中的所有化合物的制备。
权利要求13和43所涉及的化合物的制备主要依据Lubell等人“有机化学杂志”(J.Org.Chem.)1990 55：3511的结果。因此，如流程图23所示，L-丝氨酸(C-61)以熟知的方法转变成C-62酮(PhF1是9-苯基-9芴基的缩写)。C-62的标准Wadsworth-Emmons烯化作用产生C-63或C-64的化合物，或其混合物。此混合产物的组成并不重要，因为两种烯类异构体在下一反应中将生成相同的非对映体。
流程图22a)TBS-OTf，2，6-二甲基吡啶，b)[(A2)(Z2-PZ)]CHCHO，SnCl4，Et2O，c)TBS-Cl，咪唑，DMF，d)相当于R2的亲核试剂，酸性水e)TBAF，THF，f)TsCl，吡啶，g)相当于A1的亲核试剂，h)见流程图8，i)TBAF，k)NaClO2，NacH2PO4，l)Z2去保护(如需要)，m)DCC，n)Lawesson′s试剂。
a-c)见Lubel等人，d)A2MgBr，THF，酸性水，e)(MeO)2PCH2CO2Me，NaH，f)(A1)2CuLi，g)DIBAL-H，h)MeOH，TsOH，i)KOH，EtOH，j)Swern氧化，k)NaClO2，NaCH2PO4。
因此源自A1的铜酸盐试剂从C-63或C-64的背面接近，因为巨大d9-苯基-9芴基(PhF1)完全封闭了另一面，得到主要的非对映体C-65。用5步法(把甲基酯还原成醛，以二甲基醛缩醇保护，噁唑烷酮的去保护，及伯羟基氧化成羧酸)将C-65转化成C-66。
如流程图24所述，二环己基碳化亚an介导的偶连，如C-66和胺的偶连生成C-67酰胺。C-66和C-67一起构成C-88型化合物这一总类。9-苯基-9芴基(PhF1)以催化氢解除去，游离的胺用与R12相应的亲电试剂烷基化(以醛或酮进行还原性氨基化，且NaCNBH3是另一种选择)得到C-69化合物。二甲基缩醛的酸性水解产生中间物C-70醛，其环化成C-73类似物。
C-71的Tebbe烯化产生C-73化合物。用Lawesson′s试剂处理C-71产生C-72化合物。其可用雷氏镍去硫化得到C-74化合物。由此完成权利要求12和43中所有化合物的合成。权利要求14和44所涉及的化合物的制备主要依据Dener等人[“有机化学杂志”(J.Org.Chem.)1993，58：1159]及Evans等人[“美国化学学会杂志”(J.Am，Chem，SOc.)，1981，103：2127]的结果。如流程图25所示，D-天门冬氨酸(C-81)被保护且用与A6相应的亲电试剂进行烷基化，得到C-82化合物，主要的是那些所示的非对映体。Dener等人，[“有机化学杂志”(J.Org.Chem.)1993，58：1159]。(PhF1是9-苯基-9芴基的缩写)，位点特异的二异丁氢氧化铝氢(DIBAL-H)的还原(由于PhF1基太大)产生C-83醛。
非对映体选择性的硼介导的醛醇加成是下一个步骤。按照Evans等人的方法，“美国化学学会杂志”(J.Am.Chem.Soc.)(1981)103：2127，以叔-丁基二甲酸烷基(TBS)保护仲羟基之后可得到C-85。用过氧化氢锂去除唑烷酮，用催化氢解去除PhF1基，并在例如二环己基碳化亚胺条件下完成内酰胺化得到C-86。以四丁基氟化铵(TBAF)去除叔-丁基-二甲基甲矽烷基，形成内酯(用氢氧化锂对甲基酯行皂化作用，随后如果需要，通过二环己基碳化亚胺偶连)产生C-87，再以与Rd相应的亲核试剂对酰胺氮进行烷基化，加工成C-88化合物。用1，8＝吖双环-[5，4，0]十一-7-烯(DBU)进行差向异构化，得C-89化合物，用Lawesson′s试剂处理C-89，(Cava等人，“四面体通讯”(Tetrahedron)1985，41：5061)得到C-90化合物，由此完成这部分的所有化合物的制备。以下13-21的例子是个别合成。
流程图24a)H2NR3，DCC，b)H2，Pd/C，c)碱，相当于R12的亲电试剂，d)TsOH，e)Tebbe烯醇化，f)Lawesson’s试剂，g)雷氏镍。
a-c)见Dener等人，d)DIBAL-H，e)Bu2OTt，f)C-83，g)TBS-Cl，咪唑，DMF，h)LiOOH，THF，H2O，i)H2，Pd/C，j)DCC，k)TBAF，THF，l)环化，m)碱，相当于Ra的亲电试剂，n)DBU，o)Lawesson′s试剂。
用途所公开的化合物是用于治疗由蛋白酶体的蛋白酶解功能直接介导的症状。(如肌肉萎缩)或者经如NF-KB的由蛋白酶体加工的蛋白质间接介导的症状。蛋白酶体参与涉及细胞调节(如细胞周期，基因转录，及代谢途径)、细胞间信息传送和免疫应答(如抗原表达)等的蛋白质的迅速去除和翻译后加工。下面讨论特定的例子，包括β-淀粉样蛋白质及调节性蛋白质(如细胞周期蛋白)及转录因子NF-kB。在此使用的治疗包含逆转、减弱或阻止症状、临床征兆并以某种方式破坏某一病症的病理，以改善或稳定病人状况。
Alzheimer’s症(早老性痴呆)的特性是β-淀粉样蛋白质(β-AP)在老年斑及大脑血管的细胞外沉积。β-AP是从淀粉样蛋白质前体(APP)衍生的39至42个氨基酸的肽片段，已知的淀粉样蛋白质至少有三种异构体(695、751及770个氨基酸)。不同mRNA的剪接，产生异构体。正常的加工过程影响一部分β-淀粉样蛋白的序列，因此阻止β-淀粉样蛋白的产生。据认为由蛋白酶体加工的不正常的蛋白加工促成了早老性痴呆的大脑内的β-淀粉样蛋白质的丰富。在鼠β-淀粉样蛋白加工酶含有约10种不同的亚基(22KDa-32 KDa)。该25 KDa亚基的N，末端顺序为X-Gln-Asn-Pro-Met-X-Thr-Gly-Thr-Scr，其和人类macropain的β-亚基相同，参见Kojima.S.等人，Fed.Eur.Biochem.Soc.(1992)304：57-60。淀粉样蛋白质加工酶在Gln15-Lys16处裂解，在钙离子存在下，此酶也在Met-1-Asp1键和Asp1-Ala2键裂解以释放β-淀粉样蛋白质的细胞外结构域。
因此一个实施方案是一种治疗早老性痴呆的方法，其包括向受治疗者给药有效剂量的具有文中公开的结构式的化合物(如药物组合物)。所述治疗包括降低β-淀粉样蛋白加工速率，降低β-淀粉样蛋白斑的形成速率，及降低β-淀粉样蛋白形成的速率及减少早老性痴呆的临床征兆。
本发明的其他实施方案涉及恶病质和肌肉消瘦。蛋白酶体可分解许多网织红细胞和正生长的纤维细胞的蛋白质。丧失胰岛素或血清的细胞中，蛋白质分解速率几乎加倍。蛋白酶体的抑制作用降低蛋白分解。因此可减少肌肉蛋白质损失和肾及肝脏对含氮物质的负担。蛋白酶体的抑制剂可用于治疗像癌症、慢性感染疾病、发热、肌肉疾病(萎缩)，及去神经化、神经损伤害、禁食、酸中毒有关的肾衰竭和肝衰竭者，参见如GoldbergU.S.Pat.No 5,340,736(1994)。本发明的实施方案包括用于下列目的方法：降低细胞中肌肉蛋白质的分解速率，降低细胞内蛋白质的分解速率、降低细胞中p53蛋白质的分解速率，及抑制有关p53蛋白质的癌的生长。这些方法的每一种都包括将细胞(体内或体外，如受治疗者的肌肉)和有效剂量的文中公开的结构式的化合物(如药物组合物)接触。
另一被蛋白酶体加工的蛋白是NF-kB，其是Rel蛋白质家庭的一员。Rel家族转录激活蛋白可分成两种类型。第一种类型需要蛋白酶解加工，包括p50(NF-kBl，105KDa)及p52(NF-K2，100KDa)。第二种类型是不需要蛋白酶解加工，包括p65(RclA，Rel(C-Rel)和RelB)。Rel族的成员中可以形成同型二聚体和杂二聚体；如NF-kB，是p50-p65杂二聚体。IKB和p105经磷酸化及遍在蛋白化后，这两种蛋白质分别被分解及加工以便产生活化型的NF-kB，其被由细胞质转移至核中。遍在蛋白化的p105也被纯化后的蛋白酶体加工(参见Palombella等人“细胞”(Cell)(1994)78：773-785)，活化型的NF-kB与其他转录激活子例如HMG I(Y)形成立体特异性的增强因子复合体，诱导特定基因的选择性表达。
NF-kB调节涉及免疫及炎性反应的基因和有丝分裂事件。免疫球蛋白轻链K基因，白细胞介素-2(IL-2)受体的α-链基因，I型主要组织相容性复合体基因和一些编码例如IL-2、IL-6、和粒性白细胞集落刺激因子和β-干扰素(IFN-β)细胞分裂素基因的表达需要NF-kB，[参见Palombella等人(1994)]。本发明的一些实施方案包括影响IL-2及IL-2，主要组织相容性复合体-I，IL-6，β-干扰素及任何其他先前提到的蛋白质的表达水平的方法。而每一方法都包括向受治疗者给药有效剂量的文中公开的结构式的化合物。
NF-kB也参与编码E-选择蛋白，P-选择蛋白，ICAM，VCAM-1细胞固着性的基因的表达，参见Collins T.，Lab Invest(1993)68：499-508。本发明的一个实施方案是一种提供抑制细胞粘附的方法(如由E-选择蛋白，P-.选择蛋白[CAM或VCAM-1所介导的细胞粘附)，包括将细胞和(或向受治疗者给药)有效剂量的文中公开的结构式化合物(如药物组合物)接触。
NF-kB也可特异地结合至HIV-增强子/启动子上，与mac239的Nef相比较，pbj14的HIV调节蛋白Nef的不同在于控制蛋白质激酶结合处的2个氨基酸是不同的，据认为蛋白质激酶报告I-kB的磷酸化，经由遍在蛋白-蛋白酶体途径引发IKB的分解。NF-kB分解后，被释放至核内，因此加强HIV病毒的转录。参见Cohen“科学杂志”(J.Science)(1995)267：960。本发明的两个实施方案是用于抑制或减少HIV病毒感染的方法，及降低病毒基因表达水平的方法。每一方法都包括受治疗者给药有效剂量的文中所公开的结构式的化合物。
含p50的复合体是急性炎症及免疫应答的快速递质。参见Thanos D.和Maniatis T.“细胞”(Cell)(1995)80：529-532。胞内蛋白酶解作用产生用于呈递到T-淋巴细胞以便诱导主要组织相容性复合体I型介导的免疫反应的小肽。经免疫系统筛选出的自身细胞，该细胞经病毒感染或已经受致癌性转化。本发明的两个实施方案是一种用于抑制细胞中抗原呈递的方法(其包含将细胞暴露给文中所述结构式的化合物)，及用于抑制受治疗者的免疫系统的方法、(如抑制移植排斥)，该方法包括向受治疗者给药有效剂量的文中所述结构式的化合物)。
另外，本发明也提供对治疗炎症的方法，其中该方法包含向受治疗者给药抗炎有效量的药物组合物，该药物组合物包含有文中所述结构式的化合物。炎症是与下列情况有关的初次应答和二次应答：a)诸如切伤、裂伤、刺伤的损伤；b)被一或多种病毒、细菌、霉菌、微生物、寄生虫及真菌感染(c)变态反应(d)一种病症(e)外科手术(如移植)或(f)其组合。
变态反应是对抗原及变态反应原的初次应答。变态反应原的来源有植物(如草或树的花粉)，动物(如毛发皮肤、动物毒素、尿，及狗，猫，昆虫及毒蛇的排泄物)及真菌。除诸如黑麦草、豚草及柳杉花粉的变态反应原外，某些食物或食物成分(如蛋、奶、贝类、草莓及巧克力)，疫苗和药物(如青霉素)也会在某个体内诱发变态反应。
病症包括有风湿性关节炎、硬皮病、风湿性发热、炎性肠疾，(如节段性回肠炎和溃疡性结肠炎)、糖尿病、重症肌无力、多发性硬化、急性热病性多神经炎、眼结膜炎、系统性红斑性狼疮、脑炎、成人呼呼窘迫症候、牛皮癣、气肿、早老性痴呆症和肌肉营养不良。
本发明提供一种治疗由器官或组织移植所诱发的炎症的方法。此方法包含给已经或即将移植的病人给药包括文中所公开的结构式的化合物的药物组合物。移植包含有骨髓、实体器官(如肾、肺、心、胰、肝及皮肤)或组织。
一些蛋白酶体抑制剂在体外和体内阻断遍在蛋白化的NF-kB的分解及加工。蛋白酶体抑制剂也可阻断IkB-α分解和NF-kB活化，参见Palombella等人及Traenckner等人“欧洲分子生物学联合会杂志”(EMBO.J)(1994)13：5433-5441。本发明的一个实施方案是用于抑制IkB-α的分解的方法，包括将细胞和文中所述结构式的化合物接触。另一实施方案是用于降低细胞、肌肉、器官或受治疗者的NF-kB的细胞含量的方法，其包括将细胞、肌肉、器官或受治疗者与文中所述结构式的化合物接触。
其他需要蛋白酶解加工的真核细胞的转录因子，包含一般性的转录因子TFIIA，单纯疱疹病毒VP16辅助蛋白(宿主细胞因子)，病毒诱导干扰素调节因子2蛋白，和膜结合的固醇类调节元件-结合蛋白1。
本发明其他实施方案是用于影响依赖于细胞周期蛋白的真核细胞周期的方法，包括把细胞(体外或体内)暴露给文中公开的结构式的化合物。细胞周期蛋白是涉及细胞周期控制的蛋白质，蛋白酶体参与细胞周期蛋白的分解。细胞周期蛋白的分解能使细胞退出细胞周期的一个阶段(如，有丝分裂)并进入另一个阶段(如分裂)。据认为所有细胞周期蛋白都和p34cdc2蛋白激酶或相关的激酶有关。蛋白酶解导向讯号于氨基酸42-精氨酰-丙氨酰-丙氨酰-亮氨酰-甘氨酰-天门冬氨酰-异亮氨酰-丝氨酰-谷氨酰-天门冬酰氨50(破坏框)。有证据说明，在有丝分裂期间，细胞周期蛋白被转化成易被遍在蛋白连接酶破坏的形式，或者，细胞周期蛋白专一性的连接酶在有丝分裂中被激活。参见Ciechanover，A.“细胞”(Cell)(1994)79：13-21。蛋白酶体的抑制作用抑制细胞周期蛋白分解，并因此抑制细胞增殖(如与细胞周期蛋白相关的癌症)参见Kumatori等人，“美国国家科学院院刊”Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1990)87：7071-7075。本发明的一个实施方案是一种治疗受治疗者增殖性疾病(如癌症、牛皮癣或再狭窄)的方法。包含对病人给药有效剂量的文中所公开的结构式的化合物。慢性或急性炎症可能起因于移植排斥、关节炎、风湿性关节炎、感染、皮肤病、发炎性肠疾、哮喘、骨质疏松和自体免疫疾病等。排斥或发炎可能在任何类型的移植组织或器官(例如心、肺、肾、肝、皮肤移植物，和组织移植物中发生)。本发明也包括用于治疗者体内与细胞周期蛋白有关的炎症的方法，向受治疗者给药有效剂量的文中所述结构式的化合物。
其他的实施方案是用于影响依赖于蛋白酶体的癌蛋白调节的方法及治疗或抑制癌生长的方法，每一方法包含将细胞(体内，如受治疗者体内，或体外)暴露给文中所公开的结构式的化合物。HPV-16和HPV-18衍生的E6蛋白质可刺激网织红细胞的粗裂解物中p53的依赖于ATP和依赖于遍在蛋白的缀合和分解。已证明隐性致癌基因p53在具突变热不稳定E1蛋白的细胞株中，在一非允许温度下累积。高浓度的p53可能导致细胞程序死亡。被遍在蛋白系统分解的原癌蛋白的例子包含c-Mos，c-Fos和c-Jun。一个实施方案是用于治疗与p53有关的细胞程序死亡的方法，包括向受治疗者给药有效量的文中公开的结构式的化合物。
癌症治疗阻止、减轻或改善一或多种与肿瘤(特别是恶性肿瘤，如细胞繁殖不受控制的组织生长)的发生、发展和转移有关的原发或继发现象。肿瘤细胞和良性癌细胞相比显示更大程度退行发育。本发明提供一治疗癌症的方法，包括向受治疗者给药抗癌有效剂量的文中所述的药物组合物，其中癌症是选自癌，淋巴瘤，肉瘤和骨髓瘤。癌症的例子包括有腺癌、腺泡细胞腺癌、肾上腺皮质癌、牙槽细胞癌、退行发育性的癌、类基底细胞癌、基底细胞癌、细支气管癌、支气管原癌、肾腺癌、胚胎性癌、畸异性癌、纤维层肝细胞癌、滤泡癌、巨细胞癌、肝细胞癌、表皮内癌、上皮内癌、leptomanigio、髓样癌、黑色素癌、脑膜癌、mesometonephric、燕麦细胞癌、鳞状细胞癌汗腺癌、移行细胞癌和管状细胞癌。肉瘤的例子包含有成釉细胞肉瘤、血管结石性肉瘤、葡萄簇状瘤、子宫内膜肉瘤、内皮细胞性骨髓瘤、筋膜肉瘤、巨细胞瘤、绿色肉瘤(granulocytic sarcoma)、免疫母细胞瘤、近心脏成骨瘤、Coppices瘤、白血病性瘤(血癌)、淋巴肉瘤、髓样瘤、骨髓瘤(绿色肉瘤)、austiogenci、骨膜瘤、网状细胞肉瘤(也称组织细胞淋巴瘤)、球形细胞瘤、纺缍细胞瘤、滑液瘤和毛细管扩张音原性瘤。淋巴瘤的例子包括Hodgkin′s疾病和淋巴细胞淋巴瘤，如Burkitt′s、结状分化不良淋巴细胞(NPDL)、结状混合淋巴细胞(NML)、NH(结状组织细胞的)及扩散性淋巴癌等。另外的癌尚包括有神经癌、成胶质细胞癌、星形细胞瘤、黑素癌、平滑肌瘤、多骨髓瘤和血管瘤。
三肽醛蛋白酶抑制剂(苄氧羰基(Z)-亮氨酰-亮氨酰-亮氨醛)在30nM的最适浓度下诱导PC12细胞轴突的长出。参见(Tsubuki等人，“生物化学和生物物理研究通讯”(Biochem and Biophys.Res.Comm.)(1993)196：1195-1201。已证实肽醛抑制蛋白体的胰凝乳蛋白酶的活性。参见Vinitsky等人，1992，Tsubuki等人，1993。本发明的一个实施方案是一种促进轴突长出的方法，该方法包括向受治疗者给药文中公开的结构式的化合物。
最后，所公开的化合物可用作诊断试剂。(如用诊断试剂盒或用于临床实验)，来筛选蛋白酶体加工的蛋白质(如酶，转录因子)。所公开的化合物也可用于研究，用于特异性结合X/MB1亚基或α-链及抑制性与之相关的蛋白酶解活性的抑制上。例如可以测定蛋白酶体的其他亚基的活性(和特异性抑制剂)。
在成熟或活化期间，大部分细胞蛋白质易受蛋白酶解加工作用。乳胱胺酸能用来测定细胞，发育或生理的过程和产物是否由蛋白酶体的蛋白分解活性所调节。一种所述方法包括得到生物体，完整细胞制剂，或细胞提取物；把生物体细胞制剂，或细胞提取物暴露给在此公开的结构式的化合物；把暴露给化合物的生物体，细胞制剂，或细胞提取物暴露给信号并监测过程或产物。在此所揭示的化合物具有高度的选择性允许快速及准确地去除或推断特定的细胞发育或生理过程中的蛋白酶体。
本发明的化合物和组合物可用于几种方法，这几种方法包括治疗炎症的方法，其包括向受治疗者给药抗炎症有效量的在此描述的药物组合物。(如，乳胱氨酸硫酯、环内脂、或内酰胺)，其中炎症是伴随损伤或感染而产生的；其中的炎症是伴随变态反应和过敏或哮喘而产生的；其中的炎症涉及选自风湿性关节炎、硬皮病、风湿性发热、发炎性肠炎、糖尿病、重症肌无力、多发性硬化症、急性感染性多神经炎、结膜炎、系统性红斑狼疮、脑炎、成人呼吸窘迫症、气肿、早老性痴呆、肌肉营养不良；其中的炎症是伴随骨髓或选自肾、肺、心、胰、肝及皮肤的实体器官的移植而产生的，并且此组合物是在移植之前，中和之后给药，其中口服该药物组合物，或其组合。
本发明也提供一治疗癌症的方法，包括向受治者给药在此所描述的抗癌有效剂量的药物组合物；治疗牛皮癣的方法，包括向受治疗者给药有效剂量的在此所描述的的药物组合物；以及一治疗再狭窄的方法，包括向受治者给药有效剂量在此所描述的药物组合物。优选的化合物和组合物包括各种乳胱氨酸-硫酯类、和乳胱氨酸β-内酯类似物，也包括β-内酯本身。
配方与给药考虑将本发明的方法用来治疗动物受治者，如哺乳动物(例如高等灵长类，尤其是人)。本发明包括包含在此所描述的一种新颖的化合物的药物组合物，以及包含文中所述的并且首先被认为是蛋白酶体抑制剂的化合物(像乳胱氨酸)的药物组合物。
可制成可药用的盐，例如用1，2，3或更大当量的氯化氢，溴化氢，三氟醋酸和其他在药物配制领域的技术人员所知的其他物质。本发明的化合物可通过和药学上可接受的无毒性的辅药和载体混合而配制成药物组合物。本发明的药物组合物可以包含一种以上的发明的化合物，和/或也可以包含本发明不涉及的其他治疗化合物，如抗发炎、抗癌或其他药剂等。受治者可以有一种以上的炎症，或一种以上的癌症，不同组合的变态反应，或能使用所公开的化合物的上述状况的组合。本发明的化合物可以单剂量的方式给药，且可以制药领域熟知的任何方法配制。该方法如在Remington’s PharmaceuticalSciences所描述的(Mack出版公司出版，Easton PA.1980)。本发明也包括一种包装药物，其含有配制成各剂量的药物组合物，并为自己用药印刷有使用说明书。
可以制备作为蛋白酶体抑制剂的在此所公开的化合物用于以下目的：以溶液或液体悬剂的形式不经肠给药；以片剂或胶囊形式口服(优选)；特别是可以以粉剂或凝胶油状溶液、滴鼻剂、气雾剂或合剂的形式用于鼻内给药。用于不经肠给药的制剂可以含有普通赋形剂，无菌水或无菌生理食盐水，聚二醇，如聚乙二醇，植物来源的油，氢化萘等。通过使用生物适应性，生物可分解的丙交酯聚合物和丙交酯/乙交酯或聚氧化乙烯/聚氧化丙烯的共聚物可使本发明的化合物达到部分缓释。另外的非肠道的输送系统，包含亚乙基乙烯基乙酸酯共聚合物颗粒，渗透唧筒，不能植入的灌注系统及脂质体。用于吸入给药的制剂含有乳糖，聚氧化乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐或去氧胆酸盐。口腔给药的制剂包括甘胆酸盐，阴道给药的制剂含有柠檬酸。
所揭示化合物在药用混合物中的浓度可依据一些因素而变化，这些因素包含要给药的化合物的剂量、使用的化合物的药物动力学特性、和用药的路径等。一般而言，本发明的化合物可以以包含约0.1-10％(重量/体积)的化合物的含水生理缓冲液的形式用于非肠道给药。典型剂量范围为约0.1-约5.0mg/kg(体重)/天，以1至4个分份剂量来给药。每一分份剂量可以含相同或不同的本发明的化合物。该剂量是依据包括病人的健康状况，被选用化合物的剂型和给药途径在内的一些因素的有效剂量。
用于实施本发明来治疗直接或间接由蛋白酶体介导的症状的活性化合物的有效剂量依据下列因素而变化：用药的方式，受治疗者的年龄和体重及要治疗的受治疗者的状况。最后由值班医生或兽医来决定。文中将这些由值班医生或兽医决定的活性物质的所述剂量称为有效量。
无需进一步详细说明，相信本领域熟练技术人员会依据文中所述来最大程度地使用本发明。因而以下特定的实施例应被理解为只是为了说明。而不是以任何方式限制所揭示的本发明的其余部分。所有在此所引述的出版物都一并收作参考文献。
实施例1
[3H]乳胱氨酸的合成乳胱氨酸由氧化-还原顺序反应氚化的β-内酯制备。未标记的β-内酯在碳9的位置以Dess-Martin高碘烷在二氯甲烷中氧化成酮。再用1，2-二甲氧基乙烷/1％H2O中的[3H]NaBH4(NEN，13.5Ci/mmol)还原，产生氚化的β-内酯以及C9-的差相异构体(2∶3比率)。异构化的β-内酯以高效液相层析仪来分离(Rainin Microsorb二氧化硅柱，4.6×100毫米，10％正溶于己烷中的异丙醇)，再单独与N-乙酰胱氨酸(0.5M)及三乙胺(1.5M)在CH3CN以产生乳胱氨酸(9S)及其C9-的差相异构物(9R)，然后反应的混合物再分别以反相高效液相层析纯化。(TSK ODS-80Tm柱4.6×250毫米，10％CH3CN/0.1％CF3CO2H水溶液)。
实施例2细胞和组织粗提液的荧光显影Neuro 2A粗提物(～11μg总蛋白质/泳道)和牛脑粗提物(～54μg总蛋白质/泳道)以下列方式处理：(1)10μM[3H]乳胱氨酸，(2)10μM[3H]乳胱氨酸和1mM未标记乳胱氨酸(3)10μM[3H]乳胱氨酸(4)10μM[3H]乳胱氨酸和1mM未标记乳胱氨酸(5)10μM[3H]乳胱氨酸和1mM未标识β-内酯，(6)10μM[3H]乳胱氨酸和1mM未标记苯乙酰乳胱氨酸，(7)10μM[3H]乳胱氨酸和1mM未标记乳胱氨酰胺，(8)10μM[3H]乳胱氨酸和1mM未标记二羟酸，(9)10μM[3H]乳胱氨酸和1mM未标记6-去氧乳胱氨酸，(10)10μM[3H]乳胱氨酸和1mM未标记(6R，7S)-乳胱氨酸(6-差相，7-差相)，(11)10μM[3H]乳胱氨酸和1mM未标记去(羟异丁基)-乳胱氨酸。从Neuro 2A成神经细胞瘤或牛脑而来的粗提物，在有10μM[3H]乳半胱氨酸存在下，有或没有1mM未标记的竞争剂(同时加入)存在下，于室温培养24小时，随着进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(0.75毫米厚，12％聚丙烯酰胺凝胶)，胶体在0.1％考马斯亮蓝(Coomassie brillicrt blue)R-250，12％醋酸，50％甲醇中染色，接着以EN3HANCE(NEN)浸泡，然后用水沉淀荧光剂。
胶体放在Whatman滤纸上以凝胶干燥机在65℃下干燥30分钟，然后在-78℃下对柯达SB底片曝光。
实施例3纯化的蛋白质复合物(20S蛋白酶体)的分离牛脑于液氮中冷冻，总重2kg的脑以Waring捣碎机中干式匀浆1分钟。除非有说明，所有操作在4℃下进行。然后加入下面的缓冲液(总共6升)(pH7.7)：18.25mM磷酸一氢钾，6.75mM磷酸二氢钾，0.27mM蔗糖，2mMEDTA(乙二胺钠)，2mMEGTA(乙二醇双(2-氨基乙醚四乙酸))，25mM氟化钠，5mM焦磷酸四钠，亮抑蛋白酶肽和胃蛋白酶抑制剂A各5μg/mL及5mm β-巯基乙醇。再于Waring捣碎机中把组织湿式匀浆2分钟，匀浆液在5,000g离心15分钟后再于12,000g离心30分钟。硫酸铵加至上清液至50％饱和度，样品再于10,000g离心20分钟，50-60％饱和度的硫酸铵部分，其有乳胱氨酸结合活性，该活性以对和放射性化合物温育的样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光显影来测定。然后对20mMMES-NaOH，pH5.6，5mM β-巯基乙醇透析过夜。再进行SP-琼脂糖凝胶层析(Pharmacia SP-sepharose，快流型：120毫升管柱床体积)，该层析是用20mM MES-NaOH，pH5.6，5mM β-巯基乙醇和0至0.3M氯化钠梯度(500毫升梯度，流速＝2毫升/分钟)。
收集稀释有关部分后，用1M Tris-HCl将pH调至8，再进行Q-琼脂糖凝胶层析(Pharmacia，Q-Sepharose，快流型，16毫升柱床体积)，以20mM Tris-HCl，pH8，5mM β-巯基乙醇以0至0.5M氯化钠梯度进行(120毫升梯度，流速＝1毫升/分钟)。收集有关部分，浓缩，加至Pharmacia Superose6胶体过滤柱(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8，5mMβ-巯基乙醇，流速＝0.5毫升/分钟)，乳胱氨酸结合活性与高分子量的单一峰一致。此峰的部分被分离出且以10μM[3H]乳胱氧酸或10μM[3H]β-内酯在25℃下处理24小时。加入三氟醋酸(TFA)至浓度为0.1％，然后样品在室温下静置20分钟，用Vydac C4管柱(300 A/4.6×150毫米)以20至40％乙腈/0.1％三氟醋酸在室温下进行反相高效液相层析10分钟，再以40-55％氰甲烷/0.1％三氟醋酸进行30分钟(流速为0.8毫升/分钟)。以[N/US β-RAM的直读闪烁监测器监测放射性。
乳胱氨酸结合蛋白质从牛脑纯化，通过凝胶过滤，发现两者均在相同的高分子量复合体中。用[3H]乳胱氨酸处理此复合体不会导致其解离，且此放射性只和此复合物一起移动。
复合体的分子量测定为700KDa，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示出其由许多分子量～24到32KDa的蛋白质组成。印迹EP蛋白质的Edman分解显示出排列，24KDa带中的蛋白酶体的几个亚基的氨基酸顺序，使得可以初步鉴定20S蛋白酶体的复合体。用[3H]乳胱氨酸处理复合体并进行反相高效液相层析仪来分离蛋白酶体亚基，可鉴别出11至12个不同的波峰。但放射性活性只和头两个峰有关，主要与第二个峰有关。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶以考马斯蓝(Coomassie blue)染色和胰蛋白酶片段的测序证明头两个峰是均一的。虽然后来的一些洗脱，即较大的峰，然是不均一的。
结合到第1峰和第2峰中的计数比值会随每批蛋白质，温育时间和配体而有变化。第一峰标记的速度较慢，在任何时刻时，使用[3H]乳胱氨酸比用[3H]β-内酯时第一峰和第二峰的标记程度比例都要高。第一峰和[3H]β-内酯一起反应1或2小时，只产生痕量标记；但是以[3H]β-内酯或[3H]乳胱氨酸反应24小时，会使这一峰被显著标记。选择性与这两种化合物的有关化学反应活性相反，这一发现意味着乳胱氨酸的N-乙酰半乳氨酸部分可能有利于被第2种蛋白质识别。
由反相高效液相层析柱洗脱的第一个峰只含有～32KD的蛋白质，其和先前鉴定的32KDa的第二种乳胱氨酸结合蛋白一致。
实施例4纯化的牛乳胱氨酸-结合蛋白质的氨基酸顺序将纯化的20S蛋白酶体(如同实例3所述来纯化的)和10μM乳胱氨酸在10mM Tris-HCl，1mM EDTA(pH8)温育24小时。然后将溶液用含0.1％三氟醋酸(TFA)的20％含水乙腈稀释10倍，并使在室温静置5分钟，使用Vydac C4柱(100A/4.6×150毫米)进行反相高效液相层析，层析在室温下进行，用20-40％乙腈/0.1％三氟乙酸洗脱10分钟，再以40-50％乙腈/0.1％三氟乙酸洗脱30分钟，将蛋白酶体亚基洗脱(流速为0.8毫升/分钟)。根据210和280mM处紫外吸收来收集峰，主要的乳胱氨酸修饰的蛋白质是第二个由柱洗脱下来的，而其次的乳胱氨酸结合蛋白质是最先被洗脱的，合并重复注入的蛋白，冷冻干燥，胰蛋白酶水解并以反相高效液相层析分离这些胰蛋白酶解片段后进行Edman分解。推断的乳胱氨酸修饰的残基的鉴定是通过将从[3H]-乳胱氨酸处理蛋白酶体而分离的X/MB1亚基加至已用未标记的乳胱氨酸处理过的样品，然后分离并测序有放射性活性的胰蛋白酶水解的片段。在某一位置苯基硫代乙内酰脲-氨基酸(phenylthiohydantoin-amino acid)衍生物无法测定，意味着此残基可能被修饰。
直接从N-末端测序和由主要的牛乳胱氨酸-结合蛋白的而来的胰蛋白酶水解片段的顺序和人类蛋白酶体亚基X的顺序(从cDNA克隆预测)，人类LMP7-E2(从含外显子-2的cDNA克隆预测)一致。序列1(直接由N-末端测序而来)也和Saccharomyces cerevisiae Pre-2(由基因组克隆预测的)及Thermoplasma acidophilum β-亚基(由克隆的基因预测)相一致。N-末端七肽与似乎具有乳胱氨酸-修饰的N-末端苏氨酸残基的胰蛋白酶水解片段相似。在此位置的苏氨酸也和列举的所有成熟、加工形式的同系物推断的N-末端一致。大写字母表示高信赖度顺序，而小写字母代表低信赖度排布。
表1直接N-末端序列1.主要牛乳胱氨酸-结合蛋白质的直接N-末端序列蛋白质TTTLAFKFRHggIIA                序列1人类X/MB1亚基      5TTTLAFKFRGVIA19                序列2人类LMP7-E2        74TTTLAFKFQHGVIAA88             序列3S.cerevisiae Pre-2 76TTTLAFRFQGGIVA90              序列4T.acidopholum      β-9TTTVGITLKDAVIMA23           序列5亚基2.主要牛乳胱氨酸-结合蛋白质DAYSGGSVSLY    序列6人类X亚基          171DAYSGGAVNLYHVR184            序列7人类LMP7-E2        239DSYSGGVVNMYHMK252            序列83.主要牛乳胱氨酸-结合蛋白质VIEINPYLLGTMAGGAADCSF           序列9人类X亚基          38VIEINPYLLGTLAGGAADCQFWER61    序列10人类LMP7-E2        106VIEINPYLLGTMSGCAADCQYWER129  序列114.主要牛乳胱氨酸-结合蛋白质GYSYDLEVEEAYDLAR                序列12人类X亚基          146GYSDLEVEQAYDLAR161           序列13人类LMP7-E2        214GYRPNLSPEEAYDLGR229          序列14次要乳胱氨酸-结合蛋白质的胰蛋白酶水解片段的顺序和人类红细胞蛋白酶体的α链和鼠肝蛋白酶体α链的N-末端片段的顺序一致。
表2胰蛋白酶水解片段序列次要牛乳乳胱氨酸-结合活性TTIAGVVYK DGI VLGADTR       序列15人类红细胞蛋白酶体α链IXXIAGVVYK DG IVLGADTR19    序列16鼠肝蛋白酶体链1ITTIAGVVYK DGI12            序列17对该蛋白的胰蛋白酶水解片段的序列分析证明其和蛋白酶体α链(一种由纯化的人红细胞蛋白酶体和鼠肝蛋白酶体纯化的-30KDa蛋白，其反有N-末端片端序列存在)同源。洗脱的第二个峰仅含～24KDa的蛋白质，即主要乳胱氨酸-结合蛋白质。蛋白质的N-末端的顺序和得到的胰蛋白酶水解片段的顺序显示出和最近发现的20S蛋白酶体X亚基(也称做MB1，主要组织相容性复合体(MHC)编码的LMP7蛋白酶体亚基的同系物)的序列有高度的同一性。
实施例520S蛋白酶体肽酶活性的抑制动力学涉及蛋白酶体的实验如下进行：20S蛋白酶体(～5ng/μl)溶在10mM Tris-HCl，pH7.5，1mM EDTA中，其在25℃下、有溶于二甲基亚砜或甲醇的乳胱氨酸或乳胱氨酸类似物[不超过5％(V/V)]存在时温育。加入化合物后于不同时间取出用于荧光测定的部分样本并以含产生荧光的肽底物(100μM终浓度)的10mM Tris-HCl，pH7.5，1mm EDTA稀释，来用于测定荧光测量。分别用Suc-LLVY-AMC，Cbz-Ile-βNA和Cbz-GGR-βNA(AMC＝7-酰氨基-4-甲基香豆酸；βNA＝β-赖酰氨)来测定类胰凝乳蛋白酶，类胰蛋白酶和肽基谷氨酰-肽的水解活性。
化合物生物活性是指该化合物诱导Neuro 2A成神经细胞瘤细胞的轴突长出和抑制MG-63骨肉瘤细胞的细胞周期增进的能力。
表3
抑制作用的动力学
实施例6蛋白酶抑制的选择性涉及其它蛋白酶的实验与实施例5类似，除了和乳胱氨酸温育的缓冲液如下：α-胰凝乳蛋白酶：10mM Tris-HCl，pH8，1mM EDTA(加100μMSuc-LLVY-AMC用于荧光测试)；胰蛋白酶：10mM Tris-HCl，pH8，20mM氯化钙(加100μM Cbz-GGR-βNA用于测试)；需钙蛋白酶I：20mMTris-HCl，pH8，1mM氯化钙，1mM二硫苏糖醇(加100μM Suc-LLVY-AMC用于测试)；需钙蛋白酶[I：20mM Tris-HCl，pH8，10mM氯化钙，1mm二硫苏糖醇(加100μM Suc-LLYY-AMC用于测试)；木瓜蛋白酶：50mM MES-NaOH，pH6.4，1mM二硫苏糖醇(加100μM Cbz-RR-AMC用于测试)；组织蛋白酶B：100μM磷酸二氢钾，pH5.5，2mM EDTA，1mM二硫苏糖醇加100μM Cbz-RR-AMC用于测试)。对于含7-酰氨基-4-甲基香豆酸的底物，是在380nm激发，在460nm测量荧光放射，对于含β萘酰胺的底物，是在335nm激发，在410nm测量荧光发射。荧光测量在25℃下进行，每一次实验至少做三次，且以平均值±标准差表示所测的值。
表4其他蛋白酶的抑制
使用产生荧光的肽底物来测评乳胱氨酸和β-内酯对蛋白酶体的肽酶活性的作用。3种肽酶活性都被抑制，类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性抑制是不可逆的，而PGPH活性抑制是可逆的。对于每种活性，测定每一抑制剂和酶的结合的表观二级速率常数Kassoc、(表1A)。乳胱氨酸抑制类胰凝乳蛋白酶的活性最快(Kassoc＝194±15M-M-S-1)，抑制类胰蛋白酶的活性则慢20倍，而抑制PGPH活性则慢50倍。三种活性的抑制动力学不同的事实，进一步支持活性是由于各自的活性位点。β-内酯表现出有相同的数量级，但其对每种活性的抑制比乳胱氨酸本身快了15-20倍，这与预计的β-内酯有更大的化学反应活性一致。也有可能是因为在最初结合到靶蛋白上时，在一限速步骤中乳胱氨酸被环化成β-内酯，后者充当一个激发的中间体来被亲核试剂攻击。
以在大量连续稀释/超滤来去除过量抑制剂后，通过测量残留肽酶活性来评估抑制作用的可逆性。类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性稀释/超滤后依然被乳胱氨酸处理的样品完全抑制，暗示抑制剂有非常低的Koff值，而未用抑制剂处理的对照仍然有活性(资料未列出)。在测评PGPH的活性时，除去抑制剂伴随着催化活性的恢复。PGPH的抑制性可能是由于乳胱氨酸非共价地结合到PGPH位点或共价地与转化位点结合。
先前，我们已指出类似物致使Neuro 2A细胞的轴突长出的能力反映在其抑制MG-63骨肉瘤细胞的细胞周期增进的能力，并且分子的γ-内酰胺部分的修饰有损于这两种活性：然而N-乙酰半胱氨酸部分的修饰几乎没有影响。[Fenteany 1944，3135]，因此我们测试了类似物对20S蛋白酶体的抑制能力。但由于所提供的物质，不足以测试三种活性。我们集中测试类胰凝乳蛋白酶的活性，其被乳胱氨酸的抑制最快。
生物研究中发现显然有相同的趋势：生物活性化合物抑制类胰凝乳蛋白酶的活性以及乳胱氨酸本身。而没有生物活性的化合物则不会有抑制性(表3)。乳胱氨酸核心α-内酰胺的修饰减弱了其效果，但N-乙酰乳胱氨酸部分的修饰则不会。
实施例7测定乳胱氨酸(β-内酯型)可阻断体内IkB-α的依赖于TNF-α的降解能力。
Hela细胞用DME加10％牛血清蛋白平铺在6-孔板中(3毫升/孔)，细胞先以0.125％DMSO，40μM G132(苄氧羰基-亮氨酰-亮氨酰-亮氨酸)(40μM，泳道103)或5μMβ-内酯，处理1小时，接着用1,000活性单位/毫升TNF-α或磷酸盐缓冲液(PBS)处理。在37℃下再温育0，20分钟或40分钟后收集细胞，用含有NP-40和蛋白酶抑制剂的缓冲液裂解细胞，蛋白质在10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离，蛋白质再转至硝酸纤维素膜，再用人IkB-α的C端20个氨基酸的抗体探测。
先前的报导指出IkB的可诱导分解之前是蛋白质的磷酸化[参见Beg等人1993，“分子细胞生物学”(Mol.Cell.Biol.)，13：3301；Traenckner等人，1994，“欧洲分子生物学学会杂志”(EMBO J.)13：5433；Miyamoto等人1994，PNAS 91：12740；Lin等人，1995，PNAS，92：552；DiDonato等人，1995，“分子细胞生物学”(Mol.Cell.Biol)15：1302，及Alkalay等人，1995，“分子细胞生物学”(Mol.Cell.Biol.)15：1294]。该磷酸化的IkB显然被蛋白酶体优先讲解(Palombella等人，1994，”细胞”(Cell)78：773)。该磷酸化作用为IkB的电泳迁移率稍稍变大而证实。由于肿瘤坏死因子诱导的细胞显示磷酸化作用的必要类型，并且随时间而降解。
TNF诱导的细胞的IkB证实磷酸化作用是必要的，且在时间内被分解。只用磷酸缓冲液处理的细胞未表现出IkB的浓度和修饰有变化。就如先前所报告的(Palombella等人，1994)，肽醛蛋白酶体抑制剂MG132可阻断IkB的分解并稳定其磷酸化形式。β-内酯也可阻断降解和稳定磷酸化的IkB。这些结果表明，乳胱氨酸不影响导致IkB磷酸化的依赖于TNF的讯号途径，但确实阻断蛋白质的降解。在Hela细胞的TNF诱导后，乳胱氨酸抑制IkB的分解，其最可能是通过特异阻断蛋白酶体的作用。
实施例8乳胱氨酸(β-内酯型)对体内依赖于蛋白酶体的p105加工成p50的效果的测定COS细胞被平铺在100毫米培养皿上，然后以DEAE-葡聚糖模拟转染或用3μg包含人p105 cDNA的pcDNA质粒转染。转染48小时后，用0.5％DMSO，50μM需钙蛋白酶抑制剂II，50μM MG132或10μM β-内酯将细胞先处理1小时。然后将细胞以35S甲硫氨酸/半胱氨酸脉冲标记，每一培养皿250μ Ci，标记15分钟，立即收集细胞或在用过量未标记的甲硫氨酸及半胱氨酸追踪标记2小时后收集。然后用十二烷基硫酸钠/Tris裂解细胞，蛋白质用抗-p50抗体(识别p105蛋白质N末端半部分)免疫沉降。这些蛋白质于10％十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶体上分离后，再固定，干燥再对放射自显影底片曝光。
在脉冲标记之后立即对分离的蛋白质进行分析显示有大量的标记的有意义p105蛋白和极少的p50蛋白，二小时追踪期之后，p105的浓度降低，而出现了另一和p50蛋白相应的新带，这正是如所预期的那样(参见Fan和Maniaatis，1991；“自然”(Nature)354：395；Palombella等人，1994“细胞”(Cell)78：773)。细胞用需钙蛋白酶II抑制剂预处理对p105加工成p50不起作用(第四泳道)，然而，用肽醛蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞完全阻断p50的出现(第5泳道)，如先前所报告的那样(Palombella等人1994)。低浓度β-内酯(10μM)对p50的浓度只有小的效果，但较高浓度(50μM)导致完全抑制p105加工成p50。乳胱氨酸有效阻断体内依赖于蛋白酶体的p105加工成p50。
实施例9轴突长出测定把化合物溶于增溶所需的少量甲醇(MeOH)或二甲基亚砜(DMSO)。在任何测定中存在的溶剂都不超过0.1％。当需要时，蒸干溶液，且在使用之前重悬于细胞培养基质中至终浓度。
Neuro 2A，IMR-32，PC12，和MG-63细胞从美国典型培养物收集所获得。把Neuro 2A和IMR-32细胞培养在含有10％(体积/体积)小牛血清(FBS)的Eagle′s基础培养基(MEM)中。PC12细胞生长在含10％(体积/体积)马血清和5％FBS的RPMI 1640培养基中，并将MG-63细胞培养在含10％FBS的RPMI 1640培养基中。
Neuro 2A细胞平铺在12-孔聚苯乙烯培养皿中(22-毫米直径，平底)，培养密度为每孔每毫升1×104细胞，且在任何处理之前在含10％FBS的MEM培养基中培养24小时。在一些相关的实验中，在加乳胱氨酸之前3小时时，加入nocodazole、细胞松弛素B和环己酰亚胺。在去除血清的实验中，平铺24小时之后，细胞转至无血清的MEM中，在添加乳胱氨酸之前再培养24小时，且接着保持在无血清条件下。
实施例10细胞周期分析MG-63细胞以每瓶每3毫升合7.5×104细胞平铺在25cm2的瓶中，在含10％FBS的RPM1培养基中生长24小时。通过将培养基转换成含0.2％FBS的RPMI的培养基，将再混合的MG-63细胞同步在Go/G1期，且培养64小时，接着以2毫升含10％FBS的RPMI刺激细胞并加入化合物。Neuro 2A在175cm2的瓶中含10％FBS的MEM培养基中生长至2×107。有丝分裂的细胞以100rpm旋转速度振荡5分钟收集。将脱附的细胞再以每瓶每2毫升合1.5×105细胞再平铺在25cm2的瓶中，培养30分钟，使在加入乳胱氨酸之前能再附着。收集细胞用于生长周期分析，在MG-63细胞的情况下是刺激21小时后收集，而在Neu 2A细胞的情况下是在再平铺20小时后收集。然后进行流式细胞计数器操作。
DNA直方图通过Becton Dickinson FACScan流式细胞仪获得。
实施例1120S蛋白酶体和蛋白酶体激活剂PA28的纯化20S蛋白酶体是根据改进Hough等人和Ganoth等人的方法[参考Hough等人(1987)“生物化学杂志”(J.Biol Chem.)8303-8313]和[Ganoth D.等人“生物化学杂志”J.Biol Chem.)263 12412-12419]来纯化的。PA28激活剂是通过改进Chu-Ping等人的方法来纯化的[Chu Ping M.等人(1992)“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)267 10515-10523]。兔网织红细胞从Green Hectares获得(Oregon，WI)，通过悬浮在冰冷的PBS中并于2000×g离心15分钟将网织红细胞清洗三次。最后一次清洗后，于1.5倍体积的含1mM二硫苏糖醇的冷的蒸馏水裂解细胞。然后将混合物于250psi之下经过Glas-Co Bio-雾化器(Nebulizer)以确保细胞完全裂解。于100,000g将裂解液离心1小时以去除细胞碎屑。上清液(提取物)加至20mM HEPES pH7.6，1mM二硫苏糖醇(缓冲液A)中，以0.2μM滤膜过滤并加至用A缓冲液平衡的DE52阴离子交换柱上。以5倍体积的A缓冲液冲洗，吸附的蛋白质用2.5倍体积含500mM NaCl的A缓冲液洗脱。洗脱液(第II部分)用硫酸铵调节至38％饱和，于10,000×g离心20分钟。上清液用硫酸铵调节至85％饱和，于10,000×g离心20分钟，得到的沉淀重悬于少量的A缓冲液中并以4L缓冲液A透析过夜。透析液(第IIB部分)含有20S蛋白酶体和PA28激活剂，其加至Mono Q阴离子交换柱，用40倍柱体积的0至500mM NaCl梯度进行洗脱。
20S蛋白酶体对柱组分测试十二烷基硫酸钠刺激Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC水解活性。收集活性组分，稀释至50mM[NaCl]浓度，加至1毫升肝素琼脂糖凝胶Hi-Trap柱上，用20倍柱体积的50mM至500mM NaCl梯度进行洗脱，收集活性组分，再用30,000 MWCO Centricon离心浓缩器来浓缩。将浓缩液加至Superose 6大小排阻层析柱，以含10mM NaCl的缓冲液A洗脱。收集通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析鉴定为纯的活性组分并于-80℃下贮存以备后用。
PA28对柱组分(Vide supra)测定其对外源20S蛋白酶体水解SUC-亮氨酰-亮氨酰-缬氨酰-酪氨酰-AMC的活性的刺激能力。收集活性组分并稀释至10mM NaCl中。将该物质于1毫升Resource Q阴离子交换柱上用40倍柱体积的10-500mM NaCl梯度进一步纯化和浓缩。收集活性组分，用10,000MWCOCentricon离心浓缩器来浓缩。浓缩液再通入Superdex 200大小排阻层析柱，以含100mM NaCl的缓冲液A洗脱。活性组分以十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳鉴定其纯度，收集纯的活性组分并贮存于-80℃下备用。
实施例12乳胱氨酸对蛋白酶体活性的灭活2毫升的测试缓冲液(20mM HEPES，0.5mM EDTA，pH8.0)和溶在DMSO的Suc-Leu-Leu-Val-Tvr-AMC加入3毫升的荧光样品池中，将样品池置入日立F-2000型荧光分光光度计的套管室夹中。以循环水浴将温度保持在37℃。加入0.3μg的蛋白酶体和3.5μg的PA28，随着游离AMC的产生，在440nm处(发射波长380nm)荧光增加，由荧光的增加来监测反应的进行。由于受20S-PA28复合体形成缓慢，反应进行的曲线表现出有持续1-2分钟的滞后期。在达到底物水解的稳态后，加入乳胱氨酸至1μM的终浓度，对反应监测1小时。由LAB CALC(Galactic)软件于微电脑上收集荧光(F)对时间(t)的数据。灭活常数值(Kinact)是以该数据对下列一级方程式的非线性least-squares-fit(最小平方适合度)来估计的：F＝A(1-ekt)+C其中C＝Ft＝0，A＝Ft-xFt＝0由于乳半胱氨酸水解的动力学复杂和蛋白酶体灭活机制的复杂，蛋白酶体灭活的动力学也是复杂的这一事实反应在曲线的调适上。所测反应进行曲线与由把所述数据适合于以上方程式而产生的“最佳适合度”，最佳调适曲线有一个小的系统偏差。对灭活常数的评估是由这一简单动力学模式达到的。
实施例13在C2C12细胞中的蛋白质分解的抑制C2C12细胞(鼠成肌细胞株)用35硫，甲硫氨酸标记48小时。用添加含2mM未标记的甲硫氨酸的相同的培养基洗涤并预先培养2小时。除去培养基，并以新鲜的含50％血清和某种浓度待测化合物的预先培养基取代该培养基。然后除去培养基，再补加入10％三氯醋酸、离心。对三氯醋酸可溶性部分做放射性活性计数。蛋白酶解的抑制是以三氯醋酸可溶性部分放射性活性减少的百分比来计算。据此数据，每一化合物的IC50就可计算出。
化合物可以定性分成++、十和0几个等级，其中++表示比十大，而0表示很小或没有活性，可能是因不溶解、不稳定或其他原因造成。例如，在乳胱氨酸类中，化合物I-1、I-2和I-3属于++等级，化合物I-4属+等级，而I-5是0。对于类似于内酯的P系列化合物，P-1至P-4属++等级，化合物P-5和P-6属+等级，而化合物P-7则属0类。
实施例14化合物I-1的合成(3R，4S，5R，1′S)-4-羟基-5(1′-羟基-2′-甲基丙基)-3-甲基吡咯烷-2-酮-5-羧酸[10毫克，43.2毫摩尔：依照Corey等人所描述的途径制备(Corey.E.J.and Reichard G.A.“美国化学学会杂志”(J.Am.Chem.Soc.)1992.114，10677]溶在0.4毫升无水二氯甲烷中，然后按顺序用3-乙胺(18.0毫升，0.13毫摩尔、3.0当量)和13.0毫克双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯(51.1毫克，12当量)和苄硫醇(8.0毫升，6.8毫摩尔，1.58当量)处理。
在室温下将溶液搅拌5小时，然后用二氯甲烷稀释，再用水清洗。水层再用乙酸乙酯萃取，合并有机层，用硫酸镁干燥。过滤除去溶剂得到的粗的固体，用19∶1己烷/乙酸乙酯研制，过滤收集。所得的白色固体再溶于少量乙腈，此清澈的溶液再用水稀释，然后冷冻及冷冻干燥，过夜。可得8.0毫克想要的硫酯I-1(55％)，其是松散的白色固体。1H NMR(DMSO-d6300MHz)d.8.34(S，1H，NH)、71.9、728(m，5H)、5.40(d，1H，3J＝6.4Hz，OH)、5.11(d，1H，3J＝7.4Hz，OH)、4.39(t，3J＝6.4Hz)、4.04(S，2H)、3.76(t，1H，3J＝7.4Hz)、2.62(m，1H)、1.55(m，1H)、0.90(d，3H，3J＝7.5Hz)、0.85(d，3H，3J＝6.6Hz)、0.66(d，3H3J＝6.8Hz)。
实施例15化合物I-2的合成向谷胱甘肽(360毫克，1.17毫摩尔)溶在11毫升水的溶液中加入1.35毫升1.004N氢氧化钠水溶液溶液。然后将此溶液再加入新制的clasto-乳胱氨酸-β-内酯[49.0毫克，0.23毫摩尔，依据Corey等人所描述的途径制备(1992，“化学学会杂志”(J.Chem.Soc.)114，10677]溶在10毫升的乙腈中的溶液中，室温下搅拌4小时后，通过缓慢加入1N盐酸水溶液将pH调至约4左右，抽真空除去乙腈，把水层冰冻并冷冻干燥，所得的固体再溶于水中，过滤再行冷冻干燥。所得白色固体以反相高效液相层析来纯化。(Waters PrepDelta-Pak，19×300mm C18柱，用98％-0.05％三氟醋酸/水和2％-0.05三氟醋酸/甲醇-80％0.05％三氟醋酸/水和20％0.05％三氟醋酸/甲醇洗脱，以5毫升/每分钟洗脱65分钟)。纯的组分冷冻干燥后可得谷胱甘肽硫酯加合物I-2。(48毫克，40％)其是松散的白色固体。1H NMR(DMSO-d6.300MHz)、d7.73-8.26(m，4H)、5.28(bs，1H，OH)、5.09(bs，1H，OH)、4.44(m，1H)、4.37(bd，1H，3J＝5.9Hz)、3.74(m，2H)、3.23(dd，1H，J＝13.3，4.6Hz)、2.95(dd，1H，J＝13.3，8.8Hz)、2.62(m，1H)、2.29-2.32(m，2H)、1.98-2.08(m，2H)、1.51-1.63(m，1H)、0.92(d，3H，3J＝7.5Hz)、0.86(d，3H，3J＝6.6H)、0.71(d，3H3J＝6.7Hz)。
实施例16化合物I-4的合成(3R，4S，5R，1′s)-4-羟基-5(1′-羟基-2′-甲基丙基)-3-甲基-吡咯烷-2-酮-5-羧酸[20.0毫克，86.5毫摩尔，依据Corey等人，E.J.：rEICHARD，G.A.所描述的途径制备(1992，“美国化学学会杂志”(J.Am.Chem.Soc.)114，10677]溶于1.0毫升乙腈，然后在0℃下用1，8-二氮二杂环[5，4，0]十一碳-7-烯(14.0毫升，93.6毫摩尔，1.08当量)处理后再用苄基溴(12.0毫升，101毫摩尔，1.17当量)处理。室温下搅拌过夜，在乙酸乙酯和水之间分配。水层用乙酸乙酯萃取三次，再合并有机层，再用硫酸镁干燥，过滤，然后去除溶剂得到粗的固体，用己烷研制，过滤并收集。所得的白色固形物以少量的乙腈溶解，此清澈的溶液再用水稀释、冷冻并冷冻干燥过夜。可得6.7毫克想要的酯1-4(24％)，其是松散的白色固体。1HNMR(DMSO-d6300MHz)d8.02(s，1H，NH)、7.31-7.44(m，5H)、5.45(d，1H，3J＝6.4Hz，OH)、5.11(d，1H，2J＝12.5Hz)、5.03(d，1H，3J＝7.2Hz，OH)、5.00(d，1H，2J＝12.5Hz)、4.31(t，3J＝6.4Hz)、3.76(t，1H，3J＝7.2Hz)、2.68(m，1H)、1.52(m，1H)、0.89(d，3H，3J＝7.4Hz)、0.85(d，3H，3J＝6.6Hz)、0.67(d，3H，3J＝6.7Hz)。
实施例17化合物P-2的合成
(3S，7aR)-3-苯基-5、6、7、7a-四氢-1H-吡咯并[1，2-C]噁唑-5-酮是由已知的方法(Thottathil J.K.等人“有机化学杂志”(J.Org.Chem.)1986，51，3140)从D-焦谷氨酸经三个步骤制备并被转化成(3S，7aR)-3-苯基-1氢-吡咯并[1，2-C]噁唑-5-酮，该转化是以Hamadn等人报导的方法[“美国化学学会杂志”(J.Am.Chem Soc.)，1989.111，1524]通过2个步骤进行(硒基化及氧化脱去法)。然后将(3S，7aR)-3-苯基-1H-吡咯并[1，2-C]噁唑-5-酮转变成(3S，7S，7aS，1′S)-7a-(1′-乙酰氧基-2′-甲基丙基)-7-羟基-3-苯基-5、6、7、7a-四羟基-1氢-吡咯并[1，2-C]噁唑-5-酮，以类似于Uno等人报导的方法(“美国化学学会杂志”(J.Am.Chem Soc.)1994，116.2139)用6个步骤进行转化。(3S，7S，7aS，1′S)-7a-(1′-乙酰氧基-2′-甲基丙基)-7-羟基-3-苯基-5、6、7、7a-四氢-1H-吡咯并[1，2-C]噁唑-5-酮(70毫克，0.21毫摩尔)溶在1毫升吡啶中，再用32毫升乙酸酐(0.34毫摩尔，1.6当量)于室温下处理。混合物在室温下搅拌过夜，于真空中除去溶剂可得77毫克想要的(3S，7S，7aS，1′S)-7a-(1′-乙酰氧基-2′甲基丙基)-7-乙酰氧基-3-苯基-5、6、7、7a-四氢-1H-吡咯并[1，2-C]噁唑-5-酮(97％)，其是一黄色油状物质，用于如下步骤。
粗的(3S，7S，7aS，1′S)-7a-(1′-乙酰氧基-2′-甲基丙基)-7-乙酰氧基-3-苯基-5、6、7、7a-四氢-1H-吡咯并[1，2-C]噁唑-5-酮(75毫克，0.2毫摩尔)，溶在5毫升甲醇中，在有置于碳上的50毫克20％的氢氧化钯存在下，将其置于1大气压的氢气下。在薄层层析法分析(1∶1己烷/乙酸乙酯)显示反应已结束时，把混合物过滤并在真空中浓缩，可得55毫克(97％)想要的伯醇。不进行任何纯化，以类似于Uno等人报导的方法(“美国化学学会杂志”(J.Am.Chem Soc.)1994，116，2139)用2个步骤(Jone′s氧化，皂化作用)转变成(4S，5R，1′S)-4-羟基-5-(1′-羟基-2′-甲基丙基)-吡咯烷-2-酮-5-羧酸。(4S，5R，1′S)-4-羟基-5-(1′-羟基-2′-甲基丙基)-吡咯烷-2-酮-5-羧酸(7.0毫克32毫摩尔)溶于2毫升1∶1-乙腈/四氢呋喃，在室温下和2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1，1，3，3，-tetrafluoroborate)(11.0毫克，34毫摩尔，1.1当量)反应，接着以三乙胺(0.36毫摩尔，11当量)处理。在室温下把混合物搅拌30分钟，于真空中浓缩。急聚层析(230-400目SiO，用乙酸乙酯洗脱)最后可得3毫克的纯内酯P-2(47％)，其是一白色固体。1H NMR(DMSO-d6，300MHz)d 8.95(bs，1H，NH)、5.64(d，1H，3J＝6.7Hz，OH)、5.26(d，1H，3J＝6.0Hz，OH)、3.78(dd，1H，3J＝6.7、3.5Hz)、2.81(dd，1H，2J＝19.2Hz，3J＝6.0Hz)、2.60(d，1H，2J＝19.2Hz)、17.4(m，1H)、0.90(d，3H，3J＝6.9Hz)、0.68(d，3H，3J＝6.8Hz)。
实施例18化合物P-3的合成Clasto-乳胱氨酸-β内酯(5.0毫克，23.4毫摩尔；以Corey，E.J.Reichard，G.A.)等人描述的途径制备(“美国化学学会杂志”(J.Am.Chem.Soc.)1992，114，10677)溶于1.5毫升吡啶中，于室温下再用乙酸酐(40毫升，0.42毫摩尔，18当量)处理。于室温下将溶液搅拌过夜，于真空中除去吡啶，加入2毫升甲苯，可得淡棕色固体。用己烷清洗固体三次，过滤，可得5.5毫克的纯的乙酯P-3(93％)，其是白色固体。1H NMR(DMSO-d6，300MHz)d9.11(bs，1H，NH)、5.33(d，1H，3J＝6.1Hz)、5.21(d，1H，3J＝5.0Hz)、2.84(m，1H)、2.06(s，3H)、1.90(m，1H)、1.08(d，3H，3J＝7.5Hz)、0.87(d，3H，3J＝6.9Hz)、0.78(d，3H，3J＝6.8Hz)。
实施例19化合物P-4的合成(3S，7aR)-3-苯基-5、6、7、7a-四氢-1H-吡咯并[1，2-C]噁唑-5-酮是由已知的方法(Thottathil，J.K.等人“有机化学杂志”(J.OrgChem)1986，51，3140)从D-焦谷氨酸经三个步骤制备并可转化成(3S，7aR)-3-苯基-1氢-吡咯并[1.2-C]噁唑-5-酮，该转化是以Hamad等人报导的方法(“美国化学学会杂志”(J.Am.Chem Soc.)1989，111.1524)用2个步骤(硒基化及氧化脱去法)进行，然后将(3S，7aR)-3-苯基-1H-吡咯并[1，2-C]噁唑-5-酮转化成(3S，6R，7S，7aS，1′S)-7a-(1′-乙酰氧基-2′-甲基丙基)-6-羟基-7-羟基-3-苯基-5、6、7、7a-四氢-1氢-吡咯并[1，2-C]噁唑-5-酮，该转化是以类似于Uno等人报告的方法(J.Am.Chem Soc，1994，116，2139)用4个步骤进行。
以所述的用于制备P-2的相同的方法将(3S，6R，7S，7aS，1′S)-7a-(1′-乙酰氧基-2′-甲基丙基)-6-羟基-7-羟基-3-苯基-5、6、7、7a-四氢-1H-吡咯并[1，2-C]噁唑-5-酮经4个步骤(乙酰化、氢解、氧化及皂化)转化成(3R，4S，5R，1′S)-4-羟基-5-(1′-羟基-2′-甲基丙基)-3-羟基吡咯烷-2-酮-5-羧酸。
用所述的用于制备P-2的方去将(3R，4S，5R，1′S)-4羟基-5-(1′-羟基-2′-甲基丙基)-3-羟基吡咯烷-2-酮-5-羧酸(20毫克，86毫摩尔)转化成相应的β-内酯。产生3毫克纯的内酯P-4(16％)，其是白色固体，1H NMR(DMSO-d6，300MHz)d8.96(s，1H，NH)、6.08(bs，1H，OH)、5.63(d，1H，3J＝6.6Hz，OH)、5.12(d，1H，3J＝5.7Hz)、4.31(d，1H，3J＝5.7Hz)、3.72(bt，1H)、1.70(m，1H)、0.88(d，3H，3J＝6.9Hz)、0.72(d，3H，3J＝6.8Hz)。
实施例20化合物P-6的合成Clasto-乳胱氨酸-β-内酯(11.8毫克，55-3毫摩尔；以Corey，E.J.；Reichard，G.A.等人描述的途径制备，“美国化学学会杂志”(J.Am.Chem.Soc.)1992，114，10677)溶于0.4毫升新蒸馏的吡啶中，于室温下用甲磺酰氯(6.0毫升，77.5毫摩尔，1.4当量)处理。于室温下把溶液搅拌2小时，再以更多的甲磺酰氯清洗(10.0毫升，129毫摩尔，2.3当量)，于室温下搅拌过夜，以3×2毫升的甲苯于真空中浓缩暗黑色的溶液可得黄色固体。急聚层析(230-400目SiO2，1∶1己烷/乙酸乙酯洗脱)，最后可得12.6毫克的纯的甲磺酸盐P-6(78％)，其是松散的白色固体。1H NMR(CDCl3，300MHz)d6.28(bs，1H，NH)、5.27(d，1H，3J＝6.1Hz)、5.06(d，1H，3J＝4.0Hz)、3.11(s，3H)、2.80  2.89(m，1H)、2.24-2.34(m，1H)、1.33(d，3H，3J＝7.5Hz)、1.14(d，3H，3J＝7.0Hz)、1.05(d，3H，3J＝6.8Hz)。
其他实施方案从上述说明，本领域熟练技术人员可以容易地知道本发明的必要特性，并在不违背本发明的精神及范围下可对本发明进行各种改变和修改以适于各种用途和情况。因此，其他实施方案也在权利要求的范围之内。
序列表(1)一般资料：(i)申请人：President and Fellows of Harvard College(ii)发明名称：乳胱氨酸类似物(iii)序列数：17(iv)联系地址：
(A)住址：Fish & Richardson P.C(B)街：225 Frankin Street(C)城市：波士顿(D)州：MA(E)国家：美国(F)邮政编码：021110-2804(v)电脑可读形式：(A)媒介型式：软盘(B)电脑：IBM PC兼容(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：Patent In release # 1.0 1.30版(vi)目前申请资料：(A)申请号码(B)填写日期：1996年4月12日(C)分类(viii)在先申请资料：(A)申请号码：美国08/421,583(B)填写日期：1995.4.12(viii)代理人/代理人资料：(A)名字：Freeman，John W.
(B)注册号码：29,066(C)参考资料/判决记录号码：00246/97W 01(ix)电话联系资料：(A)电话：617/542 5070(B)传真：617/542/8900(C)电报：200154(2)序列1的资料：(i)序列特征(A)长度：15个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关
(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：序列1Thr Thr Thr Leu Ala Phe Lys Phe Arg His Gly Gly Ile Ile Ala1               5                   10                  15(2)序列2的资料(i)序列特征(A)长度：15个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：序列2Thr Thr Thr Leu Ala Phe Lys Phe Arg His Gly Val Ile Val Ala1               5                   10                  15(2)序列3的资料(i)序列特征(A)长度：15个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：序列3Thr Thr Thr Leu Ala Phe Lys Phe Gln His Gly Val Ile Ala Ala1               5                   10                  15(2)序列4的资料(i)序列特征(A)长度：15个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：序列4Thr Thr Thr Leu Ala Phe Arg Phe Gln Gly Gly Ile Ile Val Ala1               5                   10                  15(2)序列5的资料(i)序列特征(A)长度：15个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：序列5Thr Thr Thr Val Gly Ile Thr Leu Lys Asp Ala Val Ile Met Ala1                5                  10                  15(2)序列6的资料(i)序列特征(A)长度：11个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子种类：蛋白质(xi)序列描述：序列6Asp Ala Tyr Ser Gly Gly Ser Val Ser Leu Tyr1               5                   10(2)序列7的资料(i)序列特征(A)长度：14个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子种类：蛋白质
(xi)序列描述：序列7Asp Ala Tyr Ser Gly Gly Ala Val Asn Leu Tyr His Val Arg1               5                   10(2)序列8的资料(i)序列特征(A)长度：14个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子种类：蛋白质(xi)序列描述：序列8Asp Ser Tyr Ser Gly Gly Val Val Asn Met Tyr His Met Lys1               5                   10(2)序列9的资料(i)序列特征(A)长度：21个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子种类：蛋白质(xi)序列描述：序列9Val Ile Glu Ile Asn Pro Tyr Leu Leu Gly Thr Met Ala Gly Gly Ala1               5                   10                  15Ala Asp Cys Ser phe20(2)序列10的资料(i)序列特征(A)长度：24个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性
(ii)分子种类：蛋白质(xi)序列描述：序列10Val Ile Glu Ile Asn Pro Tyr Leu Leu Gly Thr Leu Ala Gly Gly Ala1               5                   l0                  15Ala Asp Cys Gln Phe Trp Glu Arg20(2)序列11的资料(i)序列特征(A)长度：25个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子种类：蛋白质(xi)序列描述：序列11Val Ile Glu Ile Asn Pro Pro Tyr Leu Leu Gly Thr Met Ser Gly Cys1               5                   10                  15Ala Ala Asp Cys Gln Tyr Trp Glu Arg20                  25(2)序列12的资料(i)序列特征(A)长度：16个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子种类：蛋白质(xi)序列描述：序列12Gly Tyr Ser Tyr Asp Leu Glu Val Glu Glu Ala Tyr Asp Leu Ala Arg1               5                   10                  15(2)序列13的资料(i)序列特征(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子种类：蛋白质(xi)序列描述：序列13Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Val Glu Aln Ala Tyr Asp Leu Ala Arg1               5                   10                  15(2)序列14的资料(i)序列特征(A)长度：16个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子种类：蛋白质(xi)序列描述：序列14Gly Tyr Arg Pro Asn Leu Ser Pro Glu Glu Ala Tyr Asp Leu Gly Arg1               5                   10                  15(2)序列15的资料(i)序列特征(A)长度：19个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子种类：蛋白质(xi)序列描述：序列15Thr Thr Ile Ala Gly Val Val Tyr Lys Asp Gly Ile Val Leu GLy Ala1               5                   10                  15Asp Thr Arg(2)序列16的资料(i)序列特征
(i)序列特征(A)长度：19个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子种类：蛋白质(xi)序列描述：序列16Xaa Xaa Ila Ala Gly Val Val Tyr Lys Asp Gly Ile Val Leu Gly Ala1               5                   10                      15Asp Thr Arg(2)序列17的资料(i)序列特征(A)长度：9个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：无关(D)拓朴结构：线性(ii)分子种类：蛋白质(xi)序列描述：序列17Thr Thr Ile Ala Gly Val Val Tyr Lys1               5附录：AcO-：    乙酰氧基-Me-：     甲基-NHAc-：   亚氨基乙酰基-OTBS-：   叔丁基二甲硅烷基-OTf：     三氟甲基磺酸酯Tf-：     三氟甲基-