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双特异性Fc分子

阅读：209发布：2020-10-14

专利汇可以提供双特异性Fc分子专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种含有Fc多肽链和免疫球蛋白可变区的双特异性分子。本文还提供包含所述分子的药物制剂、编码所述分子的核酸、包含所述核酸的宿主细胞、制备所述分子的方法以及使用所述分子的方法。，下面是双特异性Fc分子专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种Bi-Fc，所述Bi-Fc包含：
(a)包含具有下式的氨基酸序列的多肽链：V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc；其中Fc是人IgG Fc多肽链；其中V1、V2、V3和V4中的两个为免疫球蛋白重链(VH)可变区，另外两个为免疫球蛋白轻链(VL)可变区；其中L1、L2、L3和L4为连接子；并且其中L2和/或L4能够存在或缺失；或
(b)包含具有下式的氨基酸序列的多肽链：Fc-L4-V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4；其中Fc是人IgG Fc多肽链；其中V1、V2、V3和V4中的两个为VH区，另外两个为VL区；其中L1、L2、L3和L4为连接子；并且其中L2和/或L4能够存在或缺失；
其中所述Bi-Fc结合至靶细胞和免疫效应细胞和/或通过免疫效应细胞介导靶细胞的细胞裂解，并且
其中所述Bi-Fc为单体。
2.根据权利要求1所述的Bi-Fc，其中(a)或(b)中的所述Fc多肽链包含一个或多个以下改变：K392D、K392E、N392D、N392E、R409D、R409E、K409D、K409E、D399K、D399R、E356R、E356K、D356R、D356K、Y349T、L351T、L368T、L398T、F405T、Y407T和Y407R。
3.根据权利要求2所述的Bi-Fc，其中(a)或(b)中的所述Fc多肽链为IgG1、IgG2或IgG4Fc多肽链，并且包含改变K392D、K409D和Y349T。
4.根据权利要求1、2或3所述的Bi-Fc，其中(a)或(b)中的所述多肽链的Fc多肽链包含改变L234A和/或L235A。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc为权利要求1(a)中所述的Bi-Fc。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc为权利要求1(b)中所述的Bi-Fc。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的Bi-Fc，其中所述免疫效应细胞为人T细胞和/或食蟹猕猴T细胞。
8.根据权利要求7所述的Bi-Fc，其中所述效应细胞蛋白是所述人和/或食蟹猕猴T细胞受体(TCR)-CD3复合物的一部分。
9.根据权利要求7或8所述的Bi-Fc，其中所述效应细胞蛋白是人和/或食蟹猕猴
TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3β、CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ。
10.根据权利要求9所述的Bi-Fc，其中所述效应细胞蛋白是人或食蟹猕猴CD3ε。
11.根据权利要求10所述的Bi-Fc，其中如通过丙氨酸扫描确定的，所述Bi-Fc结合至人或食蟹猕猴CD3ε的前27个氨基酸内的氨基酸序列。
12.根据权利要求11所述的Bi-Fc，其中如通过丙氨酸扫描确定的，所述Bi-Fc所结合的氨基酸序列包含Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(SEQ ID NO:24)。
13.根据权利要求10所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含
包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链CDR1；
包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链CDR2；
包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的重链CDR3；
包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链CDR1；
包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链CDR2；和
包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的轻链CDR3。
14.根据权利要求10所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含
包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链CDR1；
包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的重链CDR2；
包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的重链CDR3；
包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链CDR1；
包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的轻链CDR2；和
包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列的轻链CDR3。
15.根据权利要求10或13所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含VH区和VL区，所述VH区包含与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述VL区包含与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述同一性区为至少80个氨基酸长。
16.根据权利要求15所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
17.根据权利要求10或14所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含VH区和VL区，所述VH区包含与SEQ ID NO:29具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述VL区包含与SEQ ID NO:31具有至少95％同一性的氨基酸序列的VL区，其中所述同一性区为至少80个氨基酸长。
18.根据权利要求17所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc结合至表达人HER2的细胞。
20.根据权利要求19所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含
包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链CDR1；
包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链CDR2；
包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链CDR3；
包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链CDR1；
包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链CDR2；和
包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的轻链CDR3。
21.根据权利要求19或20所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含VH区和VL区，所述VH区包含与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述VL区包含与SEQ ID NO:6具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述同一性区为至少80个氨基酸长。
22.根据权利要求21所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
23.根据权利要求1至18中任一项所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc结合至表达人FOLR1的细胞。
24.根据权利要求23所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含
包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR1；
包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的重链CDR2；
包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的重链CDR3；
包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR1；
包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2；和
包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3。
25.根据权利要求23或24所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含VH区和VL区，所述VH区包含与SEQ ID NO:15的第1-118位氨基酸具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述VL区包含与SEQ ID NO:15的第134-244位氨基酸具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述同一性区为至少80个氨基酸长。
26.根据权利要求25所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含SEQ ID NO:15的第1-118和
134-244位氨基酸的氨基酸序列。
27.根据权利要求1至18中任一项所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc结合至表达人CD33的细胞。
28.根据权利要求27所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含
包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链CDR1；
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2；
包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链CDR3；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链CDR1；
包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链CDR2；和
包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链CDR3。
29.根据权利要求27或28所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含VH区和VL区，所述VH区包含与SEQ ID NO:34的第1-121或1-122位氨基酸具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述VL区包含与SEQ ID NO:34的第138-251位具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述同一性区为至少80个氨基酸长。
30.根据权利要求29所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含SEQ ID NO:34的第1-121和
138-251位氨基酸的氨基酸序列。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的Bi-Fc，其中所述Bi-Fc的Fc多肽链包含
SEQ ID NO:36-47中任一个的氨基酸序列的在第384位和385位之间的插入，其中这些位置编号是根据EU编号方案分配的。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的Bi-Fc，其中L2存在且其中L2不超过约12个氨基酸长。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的Bi-Fc，其中L1和L3各自为至少约14个氨基酸长。
34.根据权利要求33所述的Bi-Fc，其中L1和L3各自为至少约15个氨基酸长。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的Bi-Fc，其中
V1为VH区且V2为VL区，或V1为VL区且V2为VH区，和
V3为VH区且V4为VL区，或V3为VL区且V4为VH区。
36.一种Bi-Fc，所述Bi-Fc包含：
(a)(i)包含具有式V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc的氨基酸序列的第一多肽链；其中Fc为人IgG Fc多肽链；其中V1、V2、V3和V4各自为免疫球蛋白可变区；其中L1、L2、L3和L4为连接子；并且其中L2和/L4能够存在或不存在；和
(ii)包含人IgG Fc多肽链的第二多肽链；或
(b)(i)具有式Fc-L4-V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4的第一多肽链；其中Fc为人IgG Fc多肽链；其中V1、V2、V3和V4各自为免疫球蛋白可变区；其中L1、L2、L3和L4为连接子；并且其中L2和/L4能够存在或缺失，和
(ii)包含人IgG Fc多肽链的第二多肽链；
其中所述Bi-Fc结合至靶细胞和免疫效应细胞和/或通过免疫效应细胞介导靶细胞的细胞裂解，
其中L1和L3为至少15个氨基酸长，
其中若L2存在，则其少于12个氨基酸长，
其中V1为VH区且V2为VL区，或V1为VL区且V2为VH区，
其中V3为VH区且V4为VL区，或V3为VL区且V4为VH区，
其中所述Bi-Fc结合至人CD3ε，并且
其中所述Bi-Fc包含(1)VH区和VL区，所述VH区包含分别包含SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，所述VL区包含分别包含SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或(2)VH区和VL区，所述VH区包含分别包含SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，所述VL区包含分别包含SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3。
37.根据权利要求36所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含VH区和VL区，所述VH区包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:29具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述VL区包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:31具有至少95％同一性的氨基酸序列。
38.根据权利要求37所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:29的氨基酸序列，所述VL区包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc结合至表达人CD33、人FOLR1或人HER2的细胞。
40.根据权利要求39所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含：
(a)包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链CDR1；
包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的重链CDR2；
包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链CDR3；
包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链CDR1；
包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的轻链CDR2；和
包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的轻链CDR3；
(b)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链CDR1；
包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的重链CDR2；
包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的重链CDR3；
包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列的轻链CDR1；
包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的轻链CDR2；和
包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的轻链CDR3；或
(c)包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的重链CDR1；
包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链CDR2；
包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链CDR3；
包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的轻链CDR1；
包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列的轻链CDR2；和
包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的轻链CDR3。
41.根据权利要求39或40所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含VH区和VL区，所述VH区包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15的第1-118位氨基酸或SEQ ID NO:34的第1-121位氨基酸具有至少95％同一性的氨基酸序列，所述VL区包含与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:15的第
134-244位氨基酸或SEQ ID NO:34的第138-251位氨基酸具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述同一性区为至少80个氨基酸长。
42.根据权利要求41所述的Bi-Fc，所述Bi-Fc包含以下氨基酸序列对中的一个：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:15的第1-118位和134-224位氨基酸；或SEQ ID NO:34的第1-121位和138-251位氨基酸。
43.根据权利要求36至42中任一项所述的Bi-Fc，其中所述第一多肽链中的Fc多肽链包含异源二聚化改变，且其中所述第二多肽链中的Fc多肽链包含另一个异源二聚化改变。
44.根据权利要求43所述的Bi-Fc，其中所述第一多肽链中的异源二聚化改变为电荷对置换，且所述第二多肽链中的异源二聚化改变为电荷对置换。
45.根据权利要求44所述的Bi-Fc，其中：
所述第一多肽链包含电荷对置换R409D、R409E、K409D或K409E和N392D、N392E、K392D或K392E，且所述第二多肽链包含电荷对置换D399K或D399R和E356K、E356E、D356K或D356R；或
所述第二多肽链包含电荷对置换R409D、R409E、K409D或K409E和N392D、N392E、K392D或K392E，且所述第一多肽链包含电荷对置换D399K或D399R和E356K、E356E、D356K或D356R。
46.根据权利要求36至45中任一项所述的Bi-Fc，其中所述第一多肽链和第二多肽链的Fc多肽链包含选自以下的一个或多个抑制FcγR结合的改变：L234A、L235A和在N297处的任意置换。
47.根据权利要求36至46中任一项所述的Bi-Fc，其中所述Fc多肽链包含SEQ ID NO:36-47中任一个的氨基酸序列的每一个Fc多肽链的在第384位和385位之间的插入，其中第384和385位是根据EU编号方案分配的位置。
48.根据权利要求36至47中任一项所述的Bi-Fc，其中所述Bi-Fc为权利要求31(a)中所述的Bi-Fc。
49.根据权利要求36至47中任一项所述的Bi-Fc，其中所述Bi-Fc为权利要求31(b)中所述的Bi-Fc。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的Bi-Fc，其中当V1和V2是IgG和/或scFv
抗体的一部分时，V1和V2结合至靶细胞，并且当V3和V4是IgG和/或scFv抗体的一部分时，V3和V4结合至免疫效应细胞。
51.根据权利要求1至49中任一项所述的Bi-Fc，其中当V1和V2是IgG和/或scFv
抗体的一部分时，V1和V2结合至免疫效应细胞，并且当V3和V4是IgG和/或scFv抗体的一部分时，V3和V4结合至靶细胞。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的Bi-Fc，其中所述Fc多肽链为人IgG1Fc多肽链。
53.根据权利要求1至51中任一项所述的Bi-Fc，其中所述Fc多肽链为人IgG2Fc多肽链。
54.根据权利要求1至51中任一项所述的Bi-Fc，其中所述Fc多肽链为人IgG4Fc多肽链。
55.一种Bi-Fc，所述Bi-Fc包含：
(i)具有以式的第一多肽链V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc；其中所述Fc为人IgG Fc多肽链，其中V1、V2、V3和V4各自为具有不同氨基酸序列的免疫球蛋白可变区，其中L1、L2、L3和L4为连接子，并且其中L2和/或L4能够存在或缺失；和
(ii)包含人IgG Fc多肽链的第二多肽链；
其中所述Bi-Fc结合至靶细胞和免疫效应细胞和/或通过免疫效应细胞介导靶细胞的细胞裂解，
其中L1和L3为至少15个氨基酸长，且若存在L2，则其少于12个氨基酸长，
其中V1和V3为VH区且V2和V4为VL区，
其中所述第一多肽链和第二多肽链中每一个的Fc多肽链含有异源二聚化改变，
其中所述Bi-Fc包含(1)VH区和VL区，所述VH区包含分别包含SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，所述VL区包含分别包含SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3；或(2)VH区和VL区，所述VH区包含分别包含SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，所述VL区包含分别包含SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR1、CDR2和CDR3，并且
其中所述第一多肽链包含电荷对置换K409D、K409E、R409D或R409E和K392D、K392E、N392D或N392E，且所述第二多肽链包含电荷对置换D399K或D399R和D356K、D356R、E356K或E356R；或所述第二多肽链包含电荷对置换K409D、K409E、R409D或R409E和K392D、K392E、N392D或N392E，且所述第一多肽链包含电荷对置换D399K或D399R和D356K、D356R、E356K或E356R。
56.一种Bi-Fc，所述Bi-Fc包含：
(a)包含具有下式的氨基酸序列的多肽链：V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc；其中Fc是人IgG Fc多肽链；其中V1和V3为VH区且V2和V4为VL区；其中L1、L2、L3和L4为连接子；并且其中L2和/或L4能够存在或缺失；或
(b)包含具有下式的氨基酸序列的多肽链：Fc-L4-V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4；其中Fc是人IgG Fc多肽链；其中V1和V3为VH区且V2和V4为VL区；其中L1、L2、L3和L4为连接子；并且其中L2和/或L4能够存在或缺失；
其中所述Bi-Fc结合至靶细胞和免疫效应细胞和/或通过免疫效应细胞介导靶细胞的细胞裂解，
其中当V1和V2为IgG和/或scFv抗体的一部分时，V1和V2结合至癌细胞抗原，
其中当V3和V4为IgG和/或scFv抗体的一部分时，V3和V4结合至人CD3ε，
其中V3包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:29具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述同一性区为至少80个氨基酸长，
其中V4包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:31具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中所述同一性区为至少80个氨基酸长，并且
其中所述Bi-Fc为单体。
57.根据权利要求55或56所述的Bi-Fc，其中V3包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:29的氨基酸序列，且V4包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的Bi-Fc，其中所述靶细胞为癌细胞。
59.根据权利要求58所述的Bi-Fc，其中所述癌细胞来自血液系统恶性肿瘤或实体瘤恶性肿瘤。
60.根据权利要求1-18、36-38和55-57中任一项所述的Bi-Fc，其中所述靶细胞为由病原体感染的细胞。
61.根据权利要求60所述的Bi-Fc，其中所述病原体为包括人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、人类乳头状瘤病毒或巨细胞病毒的病毒，或李斯特菌属、分支杆菌属、葡萄球菌属或链球菌属的细菌。
62.根据权利要求1-18、36-38和55-57中任一项所述的Bi-Fc，其中所述靶细胞为介导疾病的细胞。
63.根据权利要求62所述的Bi-Fc，其中所述靶细胞为介导纤维化疾病的纤维化细胞。
64.一种包含权利要求1至63中任一项所述的Bi-Fc和生理上可接受的赋形剂的药物制剂。
65.一种或多种编码权利要求1至63中任一项所述的Bi-Fc的核酸。
66.一种或多种包含权利要求65所述的核酸的载体。
67.含有权利要求65所述的核酸和/或权利要求66所述的载体的宿主细胞。
68.一种制备Bi-Fc的方法，所述方法包括：
在使得核酸表达的条件下培养权利要求67所述的宿主细胞，和
从细胞群或培养基中回收所述Bi-Fc。
69.一种用于治疗癌症患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效剂量的权利要求1至59中任一项所述的Bi-Fc。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述方法进一步包括在施用所述Bi-Fc之前、之后或同时施用放射、化疗剂或非化疗的抗肿瘤剂。
71.根据权利要求69或70所述的方法，其中所述患者患有血液系统恶性肿瘤或实体瘤恶性肿瘤。
72.一种用于治疗患有纤维化疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效剂量的权利要求63所述的Bi-Fc。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述纤维化疾病为动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝硬化、硬皮病、肾移植纤维化、肾同种异体移植肾病或肺纤维化，包括特发性肺纤维化。
74.一种用于治疗患有由病原体介导的疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效剂量的权利要求60所述的Bi-Fc。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述病原体为病毒、细菌或原生动物。
76.一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至59中任一项所述的Bi-Fc。
77.一种用于治疗感染性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求60所述的Bi-Fc。
78.一种用于治疗自身免疫性疾病或炎性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-18、36-38和55-57中任一项所述的Bi-Fc。
79.一种用于治疗纤维化疾病的药物组合物，所述药物组合物包含权利要求63所述的Bi-Fc。

说明书全文

双特异性Fc分子

[0001] 相关专利申请的交叉引用

[0002] 本专利申请要求于2013年3月15日提交的美国临时专利申请61/791,424的权益，该申请以引用的方式全文并入本文。

技术领域

[0003] 本发明属于蛋白质工程领域。

背景技术

[0004] 双特异性抗体有希望作为多种适应症的治疗剂。由于具有标准IgG形式的双特异性抗体包含四个不同的多肽链，因此该种抗体的生产可能是具有挑战性的。一种较小且更易生产的双特异性分子的功效已经在非霍奇金淋巴瘤中得到临床证明。参见，例如，Bargou等.(2008),Science 321(5891):974-977。由于这种小单链分子的体内半衰期短，因此，采用通过连续静脉输注的长时间给药来得到上述结果。Id.因此，本领域需要保留类似治疗功效的双特异性治疗剂，该治疗剂能直接被生产并具有有利的药物动力学性质，包括更长的半衰期。

发明内容

[0005] 本文所述双特异性Fc(Bi-Fc)能结合至两种不同的蛋白质，并且Bi-Fc包含抗体的Fc区或其一部分。相对于不含Fc区的双特异性单链分子，Bi-Fc可具有有利的药代动力学性质。一种由Bi-Fc结合的蛋白质能在免疫效应细胞如T细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞或巨噬细胞上表达，另一种蛋白质能在靶细胞上表达，所述靶细胞例如癌细胞、病原体感染的细胞或介导疾病的细胞，如引起纤维化的成纤维细胞。本文所述Bi-Fc分子在靶细胞存在下能引起免疫效应细胞的活化，和/或在免疫效应细胞存在下杀死靶细胞。

[0006] 一方面，本文提供一种 Bi-Fc，所述Bi-Fc 可包含：(a)(i)具有式V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc的第一多肽链，其中Fc为Fc多肽链，其中V1、V2、V3和V4各自为具有不同氨基酸序列的免疫球蛋白可变区，其中L1、L2、L3和L4为连接子，并且其中L2和/或L4可以存在或缺失，和(ii)包含Fc多肽链的第二多肽链；或(b)(i)具有式Fc-L4-V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4的第一多肽链，其中Fc是Fc多肽链，其中V1、V2、V3和V4各自为具有不同氨基酸序列的免疫球蛋白可变区，其中L1、L2、L3和L4为连接子，并且其中L2和/或L4可以存在或缺失，和(ii)包含Fc多肽链的第二多肽链；其中所述Bi-Fc通过免疫效应细胞介导显示靶细胞蛋白的靶细胞的细胞裂解，而不通过免疫效应细胞介导不显示靶细胞蛋白的细胞的细胞裂解，和/或其中Bi-Fc能结合至靶细胞和免疫效应细胞。第一和第二多肽链中的Fc多肽链可以是人IgG Fc多肽链。V1可以是重链可变区(VH)，V2可以是轻链可变区(VL)。在一个可选的实施方案中，V1可以是VL区且V2可以是VH区。V3和V4可以分别是VH区和VL区，或V3和V4可以分别是VL区和VH区。L1和L3可以为至少15个氨基酸长，且若L2存在，则其可以小于12个氨基酸长。当V1和V2为IgG和/或
scFv抗体的一部分时，它们能结合至靶细胞或免疫效应细胞，且当V3和V4为IgG和/或scFv抗体的一部分时，它们能结合至靶细胞或免疫效应细胞。第一多肽链中的Fc多肽链可包含异源二聚化改变，且第二多肽链中的Fc多肽链可包含另一个异源二聚化改变。所述第一多肽链中的异源二聚化改变可以是电荷对置换，且第二多肽链中的异源二聚化改变可以是电荷对置换。第一多肽链可包含电荷对置换R409D、R409E、K409D或K409E和N392D、N392E、K392D或K392E，且第二多肽链可包含电荷对置换D399K或D399R和E356K、E356R、D356K或D356R；或第二多肽链可包含电荷对置换R409D、R409E、K409D或K409E和N392D、N392E、K392D或K392E，且第一多肽链可包含电荷对置换D399K或D399R和E356K、E356R、D356K或D356R。第一和第二多肽链中的Fc多肽链可以是人IgG Fc多肽链，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc多肽链。第一和第二多肽链的Fc多肽链可包含一个或多个抑制Fcγ受体(FcγR)结合或增强ADCC的改变。第一和第二多肽链的Fc多肽链包含，例如，L234A、L235A和在N297处的任意置换。

[0007] 另一方面，本文所述Bi-Fc可包含：(i)具有式V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc的第一多肽链，其中Fc为Fc多肽链，其中V1、V2、V3和V4各自为具有不同氨基酸序列的免疫球蛋白可变区，其中L1、L2、L3和L4为连接子，并且其中L2和/或L4可以存在或缺失，和(ii)包含Fc多肽链的第二多肽链；其中L1和L3为至少15个氨基酸长且L2小于12个氨基酸长；其中V1为VH区且V2为VL区，或V1为VL区且V2为VH区；其中V3为VH区且V4
为VL区，或V3为VL区且V4为VH；其中第一和第二多肽链中每一个的Fc多肽链各自包含异源二聚化改变；并且其中所述Bi-Fc通过免疫效应细胞介导显示靶细胞蛋白的靶细胞的细胞裂解，而不通过免疫效应细胞介导不显示靶细胞蛋白的细胞的细胞裂解，和/或所述Bi-Fc能结合至靶细胞和免疫效应细胞。所述Fc多肽链可以是人IgG Fc多肽链，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc多肽链。所述第一和第二多肽链的Fc多肽链可包含一个或多个抑制FcγR结合的改变，如L234A、L235A和在N297处的任意置换中的一个或多个。

[0008] 再一方面，Bi-Fc可以包含：(a)具有式V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4-L4-Fc的第一多肽链，其中Fc为Fc多肽链，其中V1、V2、V3和V4各自为具有不同氨基酸序列的免疫球蛋白可变区，其中L1、L2、L3和L4为连接子，并且其中L2和/或L4可以存在或缺失；或(b)具有式Fc-L4-V1-L1-V2-L2-V3-L3-V4的第一多肽链，其中Fc为Fc多肽链，其中V1、V2、V3和V4各自为具有不同氨基酸序列的免疫球蛋白可变区，其中L1、L2、L3和L4为连接子，并且其中L2和/L4可以存在或缺失；其中所述Bi-Fc为单体；并且其中所述Bi-Fc通过免疫效应细胞介导显示靶细胞蛋白的靶细胞的细胞裂解，而不通过免疫效应细胞介导不显示靶细胞蛋白的细胞的细胞裂解，和/或所述Bi-Fc能结合至靶细胞和免疫效应细胞。所述Fc多肽链可以是人IgG Fc多肽链，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc多肽链。(a)或(b)中所述的Fc多肽链可包含一个或多个如下改变：K392D、K392E、N392D、N392E、R409E、R409E、K409D、K409E、Y349T、L351T、L368T、L398T、F405T、Y407T、Y407R、D399K、D399R、D356K和/或D356R。(a)或(b)中所述的Fc多肽链可包含一个或多个抑制FcγR结合的改变，如L234A、L235A和在N297处的任意置换中的一个或多个。

[0009] 本文所述任何Bi-Fc的免疫效应细胞都可以是人T细胞和/或食蟹猕猴(cynomolgus monkey)T细胞。本文所述任何Bi-Fc的效应细胞蛋白都可以是人和/或食蟹猕猴TCR-CD3复合物的一部分。本文所述任何Bi-Fc的效应细胞蛋白都可以是人和/或食蟹猕猴TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、CD3β链、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链或CD3ζ链。在一些实施方案中，所述效应细胞蛋白为CD3ε。在这些实施方案中，所述Bi-Fc的一个VH区可含有具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的CDR3，且所述Bi-Fc的VL区可含有具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的CDR3。在另一个这样的实施方案中，所述Bi-Fc的一个VH区可含有具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR3，且所述Bi-Fc的一个VL区可含有具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的CDR1，具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR2，和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的CDR3。

[0010] 若所述效应细胞蛋白为CD3ε链，则Bi-Fc可包含分别包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VH区和VL区，或分别包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH区和VL区。可选地，所述Bi-Fc可包含VH区，所述VH区包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:29具有至少95％同一性的氨基酸序列，且包含VL区，所述VL区包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:31具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中同一性区为至少50、60、70、80、90或100个氨基酸长。

[0011] 任何Bi-Fc的靶细胞都可以是癌细胞、病原体感染的细胞或介导疾病的细胞。若所述靶细胞为癌细胞，则所述癌症可以是血液系统恶性肿瘤或实体瘤恶性肿瘤。若所述靶细胞为癌细胞，则所述Bi-Fc能结合至癌细胞抗原，如表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII(EGFR的突变体形式)、黑色素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、间皮素
(MSLN)、叶酸受体1(FOLR1)、CD133、CDH19和人表皮生长因子2(HER2)等等。若靶细胞为病原体感染的细胞，则所述病原体可为包括人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、人类乳头状瘤病毒或巨细胞病毒的病毒，或李斯特菌属、分支杆菌属、葡萄球菌属或链球菌属的细菌。若靶细胞是介导疾病的细胞，则所述靶细胞可以是介导纤维化疾病或自身免疫性疾病或炎性疾病的细胞。

[0012] 本文提供包含本文所述任何Bi-Fc分子和生理上可接受的赋形剂的药物制剂。

[0013] 本文进一步提供编码本文所述任意Bi-Fc的核酸和含有所述核酸的载体，以及包含所述核酸和/或载体的宿主细胞。另一方面，本文提供一种用于制备Bi-Fc的方法，所述方法包括在使得所述核酸表达的条件下培养含有所述核酸或载体的宿主细胞和从细胞群或培养基中回收Bi-Fc。

[0014] 另一方面，本文提供一种用于治疗癌症患者的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效剂量的本文所述的任意Bi-Fc分子，其中所述Bi-Fc的靶细胞为癌细胞。所述方法进一步包括在施用Bi-Fc之前、之后或同时施用放射、化疗剂或非化疗的抗肿瘤剂。所述患者可患有血液系统恶性肿瘤或实体瘤恶性肿瘤。

[0015] 在进一步的实施方案中，本文描述一种用于治疗患有纤维化疾病的患者的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效剂量的本文所述的任意Bi-Fc分子，其中所述Bi-Fc的靶细胞为纤维化细胞。所述Bi-Fc可以在施用其它用于治疗所述疾病的疗法同时、之前或之后施用。所述纤维化疾病可以是动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝硬化、硬皮病、肾移植纤维化、肾同种异体移植肾病或肺纤维化，包括特发性肺纤维化。

[0016] 又一方面，本文描述一种用于治疗患有由病原体介导的疾病的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效剂量的本文所述的任意Bi-Fc分子。所述病原体可以是病毒、细菌或原生动物。所述Bi-Fc可以在施用其它用于治疗由病原体介导的疾病的疗法同时、之前或之后施用。

[0017] 本文还提供一种包含本文所述任意Bi-Fc分子和生理上可接受的赋形剂的药物组合物。这种组合物可用于癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病或纤维化疾病。附图说明

[0018] 图1：示例性异源二体的和单体的Bi-Fc分子的图解。四种免疫球蛋白可变区用椭圆形表示并标记为V1、V2、V3和V4。CH2和CH3区标记为CH2和CH3并图解为细长的六边形。这些区之间的线表示连接子或铰链区。示例性二硫键用横线表示。小图(panel)A和C表示异源二聚体的Bi-Fc分子，小图B和D表示单体的Be-Fc分子。

[0019] 图2：异源二聚体的Bi-Fc与靶细胞和免疫效应细胞的结合。方法描述于实施例2。x轴表示平均荧光强度(MFI)，y轴表示细胞数量。未填充的曲线代表不存在双特异性分子之一时来自细胞的数据，完全填充的曲线代表存在双特异性分子之一时来自细胞的数据。如图所示，左侧的小图代表来自含有异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc的样品的数据，右侧的小图代表来自含有单链抗-HER2/CD3ε的样品的数据。上方两幅小图代表来自包含JIMT-1细胞(该细胞表达靶细胞蛋白HER2)的样品的数据，下方两幅代表来自包含T细胞(该细胞表达效应细胞蛋白CD3ε)的样品的数据。

[0020] 图3：异源二聚体的抗-FOLR1/CD3εBi-Fc和单链抗-FOLR1/CD3ε分子的细胞裂解活性。方法描述于实施例3。每幅小图中的x轴表示每一样品中Bi-Fc或单链分子的浓度(pM)。每幅小图中的y轴表示按照实施例3所述方法计算的特异性裂解的百分比。由虚线连接的空心圆表示来自包含单链分子的样品的数据，由实线连接的实心圆表示来自Bi-Fc分子的数据。如图中顶部、中部和底部的小图分别表示来自Cal-51细胞(该细胞表达FOLR1)、T47D细胞(该细胞表达FOLR1)和BT474细胞(该细胞不表达FOLR1)的数据。

[0021] 图4：异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc和单链抗-HER2/CD3ε分子的细胞裂解活性。方法描述于实施例3。每幅小图中的x轴表示每一样品中Bi-Fc或单链分子的浓度(pM)。每幅小图中的y轴表示按照实施例3所述方法计算的特异性裂解的百分比。由虚线连接的空心圆表示来自包含单链分子的样品的数据，由实线连接的实心圆表示来自Bi-Fc分子的数据。如图中顶部、中部和底部的小图分别表示来自JIMT-1细胞(该细胞表达HER2)、T47D细胞(该细胞表达HER2)和SHP77细胞(该细胞不表达HER2)的数据。

[0022] 图5：在异源二聚体的抗-FOLR1/CD3εBi-Fc或单链分子存在下由T细胞生产细胞因子。方法描述于实施例4。由虚线连接的空心圆表示来自包含异源二聚体的抗-FOLR1/CD3εBi-Fc的实验的数据，由实线连接的实心圆表示来自单链抗-FOLR1/CD3ε分子的数据。每幅小图中的x轴表示每一试验中Bi-Fc或单链分子的浓度(pM)。y轴表示检测到的细胞因子的浓度(pg/mL)和类型。图5A显示了干扰素γ(IFNγ，顶部)、肿瘤坏死因子α(TNFα，中部)和白细胞介素-10(IL-10，底部)的数据；如图所示，图5B显示了白细胞介素-2(IL-2，顶部)和白细胞介素-13(IL-13，底部)的数据。如图所示，左侧的小图显示了来自包含T47D细胞(该细胞表达FOLR1)的样品的数据，右侧的小图显示了来自包含BT474细胞(该细胞不表达FOLR1)的样品的数据。

[0023] 图6：在抗-HER2/CD3ε异源二聚体的Bi-Fc或单链分子存在下由T细胞生产细胞因子。方法描述于实施例4。由虚线连接的空心圆表示来自包含异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc的实验的数据，由实线连接的实心圆表示来自单链抗-HER2/CD3ε分子的数据。每幅小图中的x轴表示每一试验中Bi-Fc或单链分子的浓度(pM)。y轴表示检测到的细胞因子的浓度(pg/mL)和类型。如图所示，图6A为IFNγ(顶部)、TNFα(中部)和IL-10(底部)的数据；图6B显示了IL-2(顶部)和IL-13(底部)的数据。如图所示，左侧小图显示了来自包含JIMT-1细胞(该细胞表达HER2)的样品的数据，右侧小图显示了来自包含SHP77细胞(该细胞不表达HER2)的样品的数据。

[0024] 图7：在抗-HER2/CD3ε异源二聚体的Bi-Fc或单链分子存在下CD25+和CD69+细胞的百分比。方法描述于实施例5。x轴表示抗-HER2/CD3ε异源二聚体的Bi-Fc或单链+ + +分子的浓度(pM)。y轴表示CD3T细胞，也是CD25(左侧小图)或CD69(右侧小图)细胞
的百分比。符号说明如下：由虚线连接的空心方块：单链分子和JIMT-1靶细胞；由实线连接实心向下的三角形：Bi-Fc分子和JIMT-1靶细胞；由虚线连接的空心圆：单链分子，不存在JIMT-1靶细胞；及由实线连接实心向上的三角形：Bi-Fc，不存在JIMT-1靶细胞。

[0025] 图8：小鼠中异源二聚体的Bi-Fc和单链双特异性分子的药代动力学性质。方法描述于实施例6。在顶部的小图中，显示了静脉注射后的药代动力学曲线，底部的小图中显示了皮下注射后的药代动力学曲线。由实线连接的实心圆表示抗-HER2/CD3ε单链分子的数据，由实线连接的星号表示异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc分子的数据。

[0026] 图9：抗-CD33/CD3ε分子与各种细胞类型的结合。实验程序描述于实施例8。由虚线连接的空心圆代表来自包含单链抗-CD33/CD3ε的培养物的数据，由实线连接的实心圆代表来自包含单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc的培养物的数据。如图所示，小图A、B、C、D和E显示了抗-CD33/CD3ε分子分别与Molm-13细胞、Namalwa细胞、人pan T细胞、人外周血单核细胞(PBMC)和食蟹猕猴PBMC结合的数据。

[0027] 图10：在来自食蟹猕猴的PBMC和双特异性抗-CD33/CD3ε分子存在下Molm-13细胞而非Namalwa细胞的裂解。实验程序描述于实施例9。由虚线连接的空心圆代表来自含有单链抗-CD33/CD3ε的培养物的数据，由实线连接的实心圆代表来自包含单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc的培养物的数据。所述培养物包含PBMC、双特异性抗-CD33/CD3ε分子和Molm-13细胞(小图A)或Namalwa细胞(小图B)。

[0028] 图11：在pan T细胞和双特异性抗-CD33/CD3ε分子存在下Molm-13细胞而非Namalwa细胞的裂解。实验程序描述于实施例9。由虚线连接的空心圆代表来自含有单链抗-CD33/CD3ε的培养物的数据，由实线连接的实心圆代表来自包含单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc的培养物的数据。培养物包含pan T细胞、双特异性抗-CD33/CD3ε分子和Molm-13细胞(小图A)或Namalwa细胞(小图B)。

[0029] 图12：在PBMC和单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc或单链抗-CD33/CD3ε存在下表达CD33的肿瘤细胞的裂解。实验程序描述于实施例10。图中显示了来自包含抗-CD33/CD3ε分子和表达CD33的Molm-13细胞以及人PBMC(小图A)或食蟹猕猴PBMC(小图B)的培养物的数据。由虚线连接的空心圆代表来自包含单链抗-CD33/CD3ε的培养物的数据，由实线连接的实心圆代表来自包含单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc的培养物的数据。

[0030] 图13：在单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc和表达CD33的肿瘤细胞存在下，由PBMC释放干扰素γ(IFN-γ)。实验程序描述于实施例10。图中显示了来自包含抗-CD33/CD3ε分子及表达CD33的Molm-13细胞及人PBMC(小图A)或食蟹猕猴PBMC(小图B)的培养物的数据。由虚线连接的空心圆代表来自包含单链抗-CD33/CD3ε的培养物的数据，由实线连接的实心圆代表来自包含单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc的培养物的数据。

[0031] 图14：由T细胞的增殖和CD25表达。实验程序描述于实施例11。如图所示，左列的图代表来自包含Molm-13细胞(该细胞表达CD33)和pan T细胞的细胞培养物的数据，右列的图代表来自包含Namalwa细胞(该细胞不表达CD33)和pan T细胞的细胞培养物的数据。如图所示，小图A显示了培养物中增殖的T细胞的百分比，小图B显示了培养物中CD25阳性T细胞的百分比。由虚线连接的空心圆代表来自包含单链抗-CD33/CD3ε的培养物的数据，由实线连接的实心圆代表来自包含单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc的培养物的数据。

[0032] 图15：在单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc和表达CD33的肿瘤细胞存在下，T细胞的细胞因子的释放。实验程序描述于实施例11。如图所示，左列的图代表来自包含Molm-13细胞(该细胞表达CD33)和pan T细胞的细胞培养物的数据，右列的图代表来自包含Namalwa细胞(该细胞不表达CD33)和pan T细胞的细胞培养物的数据。由虚线连接的空心圆代表来自包含单链抗-CD33/CD3ε的培养物的数据，由实线连接的实心圆代表来自包含单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc的培养物的数据。检测到的细胞因子示于每幅小图的左侧。

[0033] 图16：通过异源二聚体的抗-FOLR1/CD3εBi-Fc的体内肿瘤生长抑制。方法描述于实施例13。x轴显示了自三百万表达FOLR1的NCI-N87-luc肿瘤细胞植入小鼠体内后经3
历的时间(天)。y轴显示了肿瘤体积(mm)。用于每组小鼠的治疗的符号表示如下：溶剂(25mM赖氨酸盐酸盐，0.9％NaCl中的0.002％吐温80，pH7.0)，实心三角形；单链抗-FLR1/CD3ε双特异性，实心圆；和异源二聚体的抗-FOLR1/CD3εBi-Fc，空心圆。

[0034] 图17：通过异源二聚体的抗-CD33/CD3εBi-Fc和单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc的体内肿瘤生长抑制。方法描述于实施例14。x轴显示了自一百万肿瘤细胞经皮下植入每只小鼠右侧(right flank)后经历的时间(天)。y轴显示了反映存在的肿瘤细胞数量的生6
物发光。垂直的虚线表示20×10个人T细胞注射入小鼠体内的时间。用于每组小鼠的治疗的符号表示如下：溶剂(25mM赖氨酸盐酸盐，0.9％NaCl中的0.002％吐温80，pH7.0)，实心三角形；单链抗-MEC/CD3ε双特异性，空心三角形；单链抗-CD33/CD3ε双特异性，空心正方形；异源二聚体的抗-CD33/CD3εBi-Fc，空心圆；单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc，实心正方形；和原初动物，实心圆。

[0035] 图18：通过单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc的体内肿瘤生长抑制。方法描述于实施例15。x轴显示了自一百万肿瘤细胞经皮下植入每只小鼠右侧后经历的时间(天)。y轴显示
6
了肿瘤生物发光。垂直的虚线表示20×10个人T细胞注射入小鼠体内的时间。用于每组小鼠的治疗的符号表示如下：溶剂(25mM赖氨酸盐酸盐，0.9％NaCl中的0.002％吐温80，pH7.0)，实心三角形；单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc(N297G)，实心正方形；单体的抗-CD33/CD3εBi-Fc(N297野生型)，空心正方形；和原初动物，实心圆。

[0036] 序列的简要说明

[0037]

[0038]

[0039]

[0040]具体实施方案

[0041] 本文所称的Bi-Fc是一种新型双特异性抗体，该抗体包含一个多肽链或两个不同的多肽链。一个链包含两个重链可变(VH)区、两个轻链可变(VL)区和Fc多肽链，及可选的包含Fc多肽链的第二多肽链。在一些实施方案中，Bi-Fc结合的一种蛋白质在免疫效应细胞，如T细胞、NK细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞的表面表达，Bi-Fc结合的其它蛋白质在靶细胞，例如癌细胞、由病原体感染的细胞或介导疾病(如，例如纤维化疾病)的细胞的表面表达。由于Bi-Fc针对上述每一蛋白质仅具有一个结合位点(即，本文是指Bi-Fc“单价地”与每一蛋白结合)，其自身的结合不会使其结合的蛋白在细胞表面寡聚化。例如，若Bi-Fc在T细胞表面结合至CD3，则在不存在靶细胞时，CD3不会在T细胞表面寡聚化。CD3的寡聚化能导致T细胞的广义活化或T细胞上CD3的下行性调节，这种活化或调节可能是不被希望的。Bi-Fc将免疫效应细胞连接至靶细胞，从而引发针对靶细胞的特异性细胞裂解活性，而不是广义的炎症反应。另外，Bi-Fc分子具有有利的药代动力学性质，且由于其仅包含一个或两个不同的多肽链，其制备也不会过于复杂。

[0042] 定义

[0043] 本文所述“抗体”是指含有至少一个VH或VL区的蛋白质，并且在多数情况下，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区二者。因此，术语“抗体”涵盖具有多种形式的分子，包括单链Fv抗体(scFv，其包含由连接子连接的VH和VL区)、Fab、F(ab)2’、Fab’、scFv:Fc 抗体 ( 如 Carayannopoulos 和 Capra,Ch.9in FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY,3rd ed.,Paul,ed.,Raven Press,New York,1993,pp.284-286中所述)或含有两个全长重链和两个全长轻链的全长抗体，如在哺乳动物中发现的天然存在的IgG抗体。Id.该种IgG抗体可以具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，且可以是人或人源化抗体。Carayannopoulos和Capra描述抗体结构的部分以引用的方式并入本文。另外，术语“抗体”包括含有两个重链且不含轻链的二聚体抗体，如在骆驼和其他单峰骆驼物种及鲨鱼中发现的天然存在的抗体。参见，如Muldermans等,2001,J.Biotechnol.74:277-302；Desmyter等,2001,J.Biol.Chem.276:26285-90；Streltsov等(2005),Protein Science 14:2901-2909。抗体可以是“单特异性”(即，仅结合至一种抗原)、“双特异性”(即，结合至两种不同的抗原)或“多特异性”(即，结合至多于一种的不同的抗原)。此外，抗体可以是单价、二价或多价，其含义分别是抗体可以一次结合至一个、两个或多个抗原分子。当一分子的抗体仅结合至一分子的特定蛋白质时，该抗体为“单价地”结合至该蛋白质，即使该抗体还可以也结合到不同的蛋白质。即本文意指当抗体仅结合至一分子的两种不同的蛋白质，该抗体为“单价地”结合至每一种蛋白质。这种抗体是“双特异性的”且“单价地”结合至两种不同蛋白质的每一种。抗体可以是“单体的”，即其包含单个多肽链。抗体可包含多个多肽链(“多聚体的”)或可包含两个(“二聚体的”)、三个(“三聚体的”)或四个(“四聚体的”)多肽链。若抗体为多聚体的，则该抗体可以是同源多聚体(homomulitmer)，即抗体包含多于一分子的仅一种多肽链，包括同源二聚体、同源三聚体或同源四聚体。可选的，多聚体抗体可以是异源多聚体，即抗体包含多于一种不同的多肽链，包括异源二聚体、异源三聚体或异源四聚体。抗体可具有多种可能的形式，包括，例如，可抑制或活化其所结合至的分子的单特异性单价抗体(如描述于国际申请WO 2009/089004和美国公开文本2007/0105199中，其中相关的部分以引用的方式并入本文)、二价单特异性抗体或双特异性二聚体Fv-Fc、scFv-Fc或双抗体Fc、单特异性单价scFv-Fc/Fc、多特异性结合蛋白和描述于美国公开文本2009/0311253(其中相关的部分以引用的方式并入本文)中的双可变域免疫球蛋白、本文所述的异源二聚体的双特异性抗体以及描述在BISPECIFIC ANTIBODIES,Kontermann,ed.,Springer,2011的第
1、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14章中的双特异性抗体的多种形式以及其它可能的抗体形式。

[0044] 本文所述“Bi-Fc”包含第一多肽链和可选的第二多肽链。在多个实施方案中，Bi-Fc包含第一和第二多肽链二者。在一些实施方案中，Bi-Fc是仅包含第一多肽链的单体。所述第一多肽链包含能够被连接子和Fc多肽链隔开的两个VH区和两个VL区。相对于四个免疫球蛋白可变区，所述Fc多肽链可以是C-末端的或N-末端的，且能通过连接子连接至所述可变区。该连接子可以存在或缺失。若第二多肽链存在，则其包含Fc多肽链。因此，Bi-Fc可以是单体或异源二聚体。Bi-Fc能通过效应细胞蛋白结合至免疫效应细胞且通过靶细胞蛋白结合至靶细胞，且能通过免疫效应细胞介导靶细胞的细胞裂解。

[0045] 美国专利申请公开文本2012/244578详细描述了单体Fc多肽，其相关部分以引用的方式并入本文。单体Bi-Fc可包含改变的Fc多肽链，该多肽链作为单体比天然存在的Fc多肽链更稳定。简言之，所述单体可包含改变的人IgG Fc多肽，其包含以下改变：(1)K409D、K409E、R409D或R409E；(2)K392D、K392E、N392D或N392E；和(3)F405T或Y349T。在可选择的实施方案中，第409和392位未被改变，且存在其它改变，所述其它改变可包括一个或多个描述在“异源二聚化的改变”的定义下的改变，包括如D399K、D399R、E356K、E356R、D356K和/或D356R。上述“异源二聚化的改变”描述于下文和美国专利8,592,562中，其相关部分以引用的方式并入本文。Fc多肽链中的氨基酸改变表示如下。通常存在于给定位点的氨基酸以一个字母代码命名，之后是根据EU编号表(如下文表2所示)编号的位点，之后是替换通常存在于该位点的氨基酸的氨基酸。例如，命名“N297G”的含义是通常存在于第297位的天冬氨酸变为甘氨酸。此外，单体的Bi-Fc的Fc多肽链部分可能不含铰链区(如下文表2所定义)或在其铰链区中半胱氨酸残基可能缺失或被改变。

[0046] 本文所述“癌细胞抗原”是指在癌细胞表面表达的蛋白质。一些癌细胞抗原也在一些正常细胞表面表达，而一些癌细胞抗原对癌细胞是特异性的。癌细胞抗原能在癌细胞表面高度表达。存在多种癌细胞抗原。癌细胞抗原的实例包括，但不限于以下人蛋白质：表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII(EGFR的一种突变形式)、黑色素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、间皮素(MSLN)、叶酸受体1(FOLR1)、CD33、CDH19和人表皮生长因子2(HER2)等等。

[0047] 本文所使用的“化疗”是指采用对癌细胞具有细胞毒性或细胞抑制效应的“化疗剂”对癌症患者的治疗。“化疗剂”特异性地靶向参与细胞分裂的细胞，而不靶向未参与细胞分裂的细胞。化疗剂直接干扰与细胞分裂密切相关的过程，例如DNA复制、RNA合成、蛋白质合成、或有丝分裂纺锤体的组装、分解或功能，和/或在这些过程中发挥作用的分子(如核苷酸或氨基酸)的合成或稳定性。因此，化疗剂对癌细胞和其它参与细胞分裂的细胞都具有细胞毒性或细胞抑制效应。化疗剂是本领域公知的，包括，例如：烷基化剂(如白消安、替莫唑胺、环磷酰胺、洛莫司汀(CCNU)、甲基洛莫司汀、链脲霉素、顺铂(cis-diamminedi-chloroplatinum)、苯醌吖啶(aziridinylbenzo-quinone)和塞替派)；无机离子(如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin))；氮芥(如盐酸美法仑、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥和盐酸氮芥)；亚硝基脲(如卡莫司汀(BCNU))；抗肿瘤抗生素(如阿霉素(多柔比星)、柔毛霉素(daunomycin)、丝裂霉素C、正定霉素(daunorubicin)、去甲氧柔红霉素、普卡霉素和博来霉素)；植物衍生物(如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛、长春地辛、VP-16和VM26)；抗代谢药物(如含有或不含甲酰四氢叶酸的甲氨蝶呤、含有或不含甲酰四氢叶酸的5-氟尿嘧啶、5-氟脱氧尿苷、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧助间型霉素、吉西他滨和氟达拉滨)；鬼臼毒素(如依托泊苷、伊立替康和托泊替康)；以及放线菌素D、达卡巴嗪(DTIC)、mAMSA、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、L-天冬酰胺酶和米托蒽醌；以及本领域公知的其他化疗剂。参见例如Cancer:Principles and Practice of Oncology,4th Edition,DeVita等,eds.,J.B.Lippincott Co.,Philadelphia,PA(1993)，其中相关的部分以引用的方式并入本文。烷基化剂和氮芥通过烷基化DNA发挥作用，其限制链的展开和复制。甲氨蝶呤、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶和吉西他滨干扰核苷酸的合成。如紫杉醇和长春碱的植物衍生物为有丝分裂纺锤体毒物。鬼臼毒素抑制拓朴异构酶，从而干扰DNA复制。抗生素多柔比星、博莱霉素和丝裂霉素通过嵌入DNA碱基之间(抑制展开)，从而分别导致链断裂和DNA烷基化来干扰DNA的合成。其它作用机制包括氨基酸的甲氨酰化(洛
莫司汀、卡莫司汀)，和天冬酰胺池耗竭(天冬酰胺酶)。Merck Manual of Diagnosis th
and Therapy,17 Edition,Section 11,Hematology and Oncology,144.Principles of Cancer Therapy,Table 144-2(1999)。化疗剂中具体包括直接作用于上述所列化疗剂直接作用的相同细胞过程的药物。

[0048] 若药物或治疗与Bi-Fc在大致相同的时间框内施用，可选地不间断地施用，则该药物或治疗与Bi-Fc为“同时”施用。例如，若患者在不间断地每周服用一次药物A且不间断地每六个月服用一次Bi-Fc，则无论两种药物是否在同一天施用，药物A和Bi-Fc为同时施用。同样，若Bi-Fc不间断地每周服用一次，药物A每天仅服用一次或多次，则按照本文含义药物A和Bi-Fc为“同时”施用。同样地，若药物A和Bi-Fc都在一个月的时间内一次或多次被施用了较短的时间，按照本文含义只要两种药物是在同一个月内施用的，它们就是同时施用。

[0049] 本文所述“保守性氨基酸置换”是指一种氨基酸被另一种具有相似性质的氨基酸置换。考虑的性质包括化学性质，如电荷和疏水性。下表1列出了按照本文含义认为是保守性置换的每一种氨基酸的置换。

[0050] 表1：保守性氨基酸置换

[0051]

[0052]

[0053] 本文所述“Fc区”是由一个或多个二硫键连接的两个多肽链组成的二聚体，每一条链包含铰链结构域的部分或全部及CH2和CH3结构域。所述多肽链中的每一条都称为“Fc多肽链”。在一些实施方案中，“Fc多肽链”可缺少铰链区，特别是当该Fc多肽链旨在为如单体Bi-Fc中的单体时。为了区分Fc区中的两条Fc多肽链，在一些情况下，本文中将其中一条链称为“A链”，另一条链称为“B链”。更具体地，本发明预期使用的Fc区(或单体Bi-Fc中的Fc多肽链)是IgG Fc区(或Fc多肽链)，所述IgG Fc区可以是哺乳动物(如人)IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在人IgG1 Fc区中，至少两个等位基因类型是已知的。
在其它实施方案中，两条Fc多肽链的氨基酸序列可与哺乳动物Fc多肽的序列不同，相对于哺乳动物Fc多肽氨基酸序列的序列，两条Fc多肽链的氨基酸序列中每100个氨基酸中具有不超过10个氨基酸的单一氨基酸的置换、插入和/或缺失。在一些实施方案中，上述不同可以是促使异源二聚体的形成高于同源二聚体的形成和/或抑制同源二聚体的形成的“异源二聚化改变”、延长半衰期的Fc改变、抑制Fcγ受体(FcγR)结合的改变和/或增强ADCC的改变。

[0054] 本文所述“延长半衰期的Fc改变”是指与包含相同Fc多肽、但其不包含改变的相似Fc蛋白质的半衰期相比，Fc多肽链中延长包含改变的Fc多肽链的蛋白质的体内半衰期的改变。所述改变可包含在作为Bi-Fc一部分的Fc多肽链中。改变M252Y、S254T和T256E(第252位的甲硫氨酸变为酪氨酸；第254位的丝氨酸变为苏氨酸；和第256位的苏氨酸变为谷氨酸；根据表2所示EU编号进行编号)为延长半衰期的Fc改变并能联合、单独或任意组合使用。这些改变及其它一些改变详细描述于美国专利7,083,784中。
美国专利7,083,784中描述这种改变的部分以引用的方式并入本文。同样地，M428L和N434S为延长半衰期的Fc改变并能联合、单独或任意组合使用。这些改变及其它一些改变详细描述于美国专利申请公开文本2010/0234575和美国专利7,670,600中。美国专利申请公开文本2010/0234575和美国专利7,670,600中描述这种改变的部分以引用的方式并入本文。此外，按照本文含义，在以下位点之一处的任何置换都可被认为是延长半衰期的Fc改变：250、251、252、259、307、308、332、378、380、428、430、434、436。这些改变中的每一个或者这些改变的组合可用于延长本文所述异源二聚体的或单体的Bi-Fc抗体的半衰期。其它可用于延长半衰期的改变详细描述于2012年12月17日提交的国际申请
PCT/US2012/070146(公开号：WO 2013/096221)中。这一申请中描述上述改变的部分以引用的形式并入本文。本申请中描述的一些具体实施方案包括延长半衰期的在第384和
385位之间的插入(EU编号示于表2)，所述插入包含如下氨基酸序列：GGCVFNMFNCGG(SEQ ID NO:36)、GGCHLPFAVCGG(SEQ ID NO:37)、GGCGHEYMWCGG(SEQ ID NO:38)、
GGCWPLQDYCGG(SEQ ID NO:39)、GGCMQMNKWCGG(SEQ ID NO:40)、GGCDGRTKYCGG(SEQ ID NO:41)、GGCALYPTNCGG(SEQ ID NO:42)、GGCGKHWHQCGG(SEQ ID NO:43)、GGCHSFKHFCGG(SEQ ID NO:44)、GGCQGMWTWCGG(SEQ ID NO:45)、GGCAQQWHHEYCGG(SEQ ID NO:46)、和
GGCERFHHACGG(SEQ ID NO:47)等。包含这种插入的异源二聚体Bi-Fc抗体或单体Bi-Fc抗体是被预期的。

[0055] “不利于同源二聚体形成的Fc改变”包含在Fc多肽链中的任意改变，其使得与野生型Fc多肽链相比，所述Fc多肽链具有降低的形成同源二聚体的能力。这种改变详细描述于美国专利申请公开文本US2012/0244578中。这一公开文本中描述所述改变的部分以引用的方式并入本文。所述改变的实例包括但不限于以下改变：R409D、R409E、D399K、D399R、N392D、N392E、K392D、K392E、K439D、K439E、D356K、D356R、E356K、E356R、K370D、K370E、E357K和E357R，这些改变可单独或任意组合使用。这些改变可包含在作为Bi-Fc一部分的Fc多肽链中，特别是在其中Bi-Fc为单体的实施方案中。在一些实施方案中，此类改变发生在Fc多肽链的CH3区，并包括如下的改变：所述改变使得野生型氨基酸序列中的一个或多个带电氨基酸被静电地不利于CH3同源二聚体形成的氨基酸替代，和/或一个或多个疏水界面残基被小极性氨基酸(如，例如天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸或苏氨酸)替代。更具体地，例如，带电氨基酸(如在第392位和/或第409位的赖氨酸)可被中性或带相反电荷的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)替代。上述替代也可发生在Fc多肽链中的其它任意带电氨基酸处。可选择地或除此之外，选自Y349、L351、L368、V397、L398、F405和Y407的一个或多个疏水界面残基可被小极性氨基酸替代。进一步，Fc多肽链可具有一个或多个突变的半胱氨酸残基，从而阻止二硫键的形成。在这方面特别有用的半胱氨酸突变是在Fc多肽链的铰链区中的那些突变。所述半胱氨酸可以缺失或被其他氨基酸置换。对于单体的Bi-Fc而言，铰链区可全部缺失。

[0056] “异源二聚化的改变”通常是指Fc区的A链和B链中的促进异源二聚体Fc区形成的改变，所述异源二聚体Fc区即其中Fc区的A链和B链具有不同的氨基酸序列的Fc区。这些改变可包含在作为Bi-Fc一部分的Fc多肽链中。异源二聚化的改变可以是不对称的，即具有某改变的A链可与具有不同改变的B链配对。这些改变促进异源二聚化并不利于同源二聚化。无论形成的是异源二聚体还是同源二聚体，其都可通过尺寸差异进行评估，如在一些情况下采用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，或在尺寸不是区别特征的情况下采用其他合适的手段(如分子标签或被识别异源二聚体某些部分的抗体结合)进行评估。这种配对的异源二聚化改变的一个实例称为“旋钮和洞”置换。参见，如美国专利7,695,936和美国专利申请公开文本2003/0078385，其中描述这种突变的部分以引用的方式并入本文。包含一对“旋钮和洞”置换的Fc区在本文中的含义是，其在A链种包含一种置换且在B链中包含另一种置换。例如，与已发现的具有未修饰的A链和B链的IgG1 Fc区相比，已经发现IgG1 Fc区的A链和B链中具有以下“旋钮和洞”置换时增加异源二聚体的形成：1)一条链中的Y407T，和另一条链中的T366Y；2)一条链中的Y407A，和另一条链中的T366W；3)一条链中的F405A，和另一条链中的T394W；4)一条链中的F405W，和另一条链中的T394S；5)一条链中的Y407T，和另一条链中的T366Y；6)一条链中的T366Y和F405A，和另一条链中的T394W和Y407T；7)一条链中的T366W和F405W，和另一条链中的T394S和Y407A；8)一条链中的F405W和Y407A，和另一条链中的T366W和T394S；及9)Fc的一条多肽中的T366W和另一条中的T366S、L368A和Y407V。按照上文的释义，这种表示突变的方式可以解释如下。正常存在于CH3区给定位点并用EU编号系统(所述系统记载于Edelman等.(1969),Proc.Natl.Acad.Sci.63:78-85中；还可参见下文表2)编号的氨基酸(用一个字母代码表示)之后是EU位置，EU位置之后是存在于该位点的替换的氨基酸。例如，Y407T的含义是正常存在于EU位置407处的酪氨酸被苏氨酸替代。对于这些改变可选择地或除这些改变之外的，建立新的二硫桥的置换能促进异源二聚体的形成。参见，如美国专利申请公开文本2003/0078385，其中描述这种突变的部分以引用的方式并入本文。在IgG1 Fc区中的这种改变包括，例如，以下置换：一条Fc多肽链中的Y394C和另一条Fc多肽链中的S354C；一条Fc多肽链中的Y394C和另一条Fc多肽链中的E356C；一条Fc多肽链中的Y394C和另一条Fc多肽链中
的E357C；一条Fc多肽链中的L351C和另一条Fc多肽链中的S354C；一条Fc多肽链中的T394C和另一条Fc多肽链中的E397C；或一条Fc多肽链中的D399C和另一条Fc多肽链中的K392C。同样地，改变一个或多个残基(如在CH3-CH3界面中)的电荷的置换能增强异源二聚体的形成，如WO2009/089004中阐述的，其中描述这种置换的部分以引用的方式并入本文。
这种置换本文称为“电荷对置换”，并且含有一对电荷对置换的Fc区包含一个在A链中的置换和一个在B链中的不同置换。电荷对置换的一般实例包括如下：1)一条链中的K409D或K409E和另一条链中的D399K或D399R；2)一条链中的K392D或K392E和另一条链中的D399K或D399R；3)一条链中的K439D或K439E和另一条链中的E356K或E356R；和4)一条链中的K370D或K370E和另一条链中的E357K或E357R。此外，当两条链中的置换R355D、R355E、K360D或K360R与其他异源二聚化的改变一起使用时，这些置换能稳定异源二聚体。
特定的电荷对置换能单独使用或与其他电荷对置换一起使用。电荷对置换及其组合的单独对的具体实例包括如下：1)一条链中的K409E和另一条链中的D399K；2)一条链中的K409E和另一条链中的D399R；3)一条链中的K409D和另一条链中的D399K；4)一条链中的K409D和另一条链中的D399R；5)一条链中的K392E和另一条链中的D399R；6)一条链中的K392E和另一条链中的D399K；7)一条链中的K392D和另一条链中的D399R；8)一条链中的K392D和另一条链中的D399K；9)一条链中的K409D和K360D及另一条链中的D399K和E356K；
10)一条链中的K409D和K370D及另一条链中的D399K和E357K；11)一条链中的K409D和K392D及另一条链中的D399K、E356K和E357K；12)一条链中的K409D和K392D及另一条链中的D399K；13)一条链中的K409D和K392D及另一条链中的D399K和E356K；14)一条链中的K409D和K392D及另一条链中的D399K和D357K；15)一条链中的K409D和K370D及另一条链中的D399K和D357K；16)一条链中的D399K及另一条链中的K409D和K360D；和17)一条链中的K409D和K439D及另一条链中的D399K和E356K。上述异源二聚化的改变的任意一种都可用于本文所述异源二聚体双特异性抗体的Fc区中。

[0057] 本文所述“抑制FcγR结合的改变”是指Fc多肽链中抑制FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合的一个或多个插入、缺失或置换，所述结合如通过例如基于的竞争结合实验(PerkinElmer,Waltham,MA)测定。这些改变可包含在作
为Bi-Fc一部分的Fc多肽链中。更具体地，抑制Fcγ受体(FcγR)结合的改变包括L234A、L235A或抑制N297位糖基化的任意改变，包括在N297的任意置换。此外，连同抑制N297位糖基化的改变一起，通过建立另外的二硫桥来稳定二聚体Fc区的另外的改变也被预期。抑制FcγR结合的改变的进一步实例包括在一条Fc多肽链中的D265A改变和在另一条Fc多肽链中的A327Q改变。上述一些突变描述于，如Xu等(2000),Cellular Immunol.200:16-26中，其中描述上述突变及其活性评估的部分以引用的方式并入本文。

[0058] 本文所述“增强ADCC的改变”是指Fc多肽链中增强抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)的一个或多个插入、缺失或置换。这些改变可包含在作为Bi-Fc一部分的Fc多肽链中。许多这些改变描述于国际专利申请公开文本WO2012/125850中。这一申请中描述这些改变的部分以引用的方式并入本文。这些改变可包含在作为本文所述异源二聚体双特异性抗体一部分的Fc多肽链中。ADCC实验可按照如下实施。在细胞表面表达高和较低量的癌细胞抗原的细胞系可作为靶细胞。这些靶细胞可被羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，之后存入具有V-型孔的96-孔微量滴定板。可向每个孔中添加纯化的免疫效应细胞，例如T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞。可以将结合至癌抗原且包含待测定改变的单特异性抗体和同种型匹配对照抗体以1:3系列稀释，然后添加至孔中。将细胞在37℃、5％CO2下培养3.5小时。可以将细胞旋转沉淀并重新悬浮于具有将死细胞染色的染料碘化物(Molecular Probes,Inc.Corporation,Oregon,USA)的1 x FACS缓冲液(包含0.5％胎牛血清(FBS)的1x磷酸盐
缓冲盐水(PBS))中，然后进行流式细胞术(FACS)分析。细胞杀死的百分比可按照如下公式计算：

[0059] (存在双特异性分子时肿瘤细胞裂解百分数-不存在双特异性分子时肿瘤细胞裂解百分数)/(总的细胞裂解百分数-不存在双特异性分子时肿瘤细胞裂解百分数)

[0060] 总的细胞裂解是通过裂解样品测定的，该样品包含效应细胞和不含双特异性分子并具有80％冰甲醇的标记的靶细胞。增强ADCC的示例性改变包括在Fc区的A链和B链中的以下改变：(a)A链包括Q311M和K334V置换及B链包括L234Y、E294L和Y296W置换，或反之亦然；(b)A链包括E233L、Q311M和K334V置换及B链包括L234Y、E294L和Y296W置换，或反之亦然；(c)A链包括L234I、Q311M和K334V置换及B链包括L234Y、E294L和Y296W置换，或反之亦然；(d)A链包括S298T和K334V置换及B链包括L234Y、K290Y和Y296W置换，或反之亦然；(e)A链包括A330M和K334V置换及B链包括L234Y、K290Y和Y296W置换，或反之亦然；(f)A链包括A330F和K334V置换及B链包括L234Y、K290Y和Y296W置换，或反之亦然；(g)A链包括Q311M、A330M和K334V置换及B链包括L234Y、E294L和Y296W置换，或反之亦然；(h)A链包括Q311M、A330F和K334V置换及B链包括L234Y、E294L和Y296W置换，或反之亦然；(i)A链包括S298T、A330M和K334V置换及B链包括L234Y、K290Y和Y296W置换，或反之亦然；(j)A链包括S298T、A330F和K334V置换及B链包括L234Y、K290Y和Y296W置换，或反之亦然；(k)A链包括S239D、A330M和K334V置换及B链包括L234Y、K290Y和Y296W置换，或反之亦然；(l)A链包括S239D、S298T和K334V置换及B链包括L234Y、K290Y和Y296W置换，或反之亦然；(m)A链包括K334V置换及B链包括Y296W和S298C置换，或反之亦然；(n)A链包括K334V置换及B链包括L234Y、Y296W和S298C置换，或反之亦然；(o)A链包括L235S、S239D和K334V置换及B链包括L234Y、K290Y和Y296W置换，或反之亦然；(p)A链包括L235S、S239D和K334V置换及B链包括L234Y、Y296W和S298C置换，或反之亦然；(q)A链包括Q311M和K334V置换及B链包括L234Y、F243V和Y296W置换，或反之亦然；(r)A链包括Q311M和K334V置换及B链包括L234Y、K296W和S298C置换，或反之亦然；(s)A链包括S239D和K334V置换及B链包括L234Y、K290Y和Y296W置换，或反之亦然；(t)A链包括S239D和K334V置换及B链包括L234Y、Y296W和S298C置换，或反之亦然；(u)A链包括F243V和K334V置换及B链包括L234Y、K290Y和Y296W置换，或反之亦然；
(v)A链包括F243V和K334V置换及B链包括L234Y、Y296W和S298C置换，或反之亦然；(w)A链包括E294L和K334V置换及B链包括L234Y、K290Y和Y296W置换，或反之亦然；(x)A链包括E294L和K334V置换及B链包括L234Y、Y296W和S298C置换，或反之亦然；(y)A链包括A330M和K334V置换及B链包括L234Y和Y296W置换，或反之亦然；或(z)A链包括A330M和K334V置换及B链包括K290Y和Y296W置换，或反之亦然；

[0061] 本文所述“IgG抗体”是指本质上由两个免疫球蛋白IgG重链和两个免疫球蛋白轻链组成的抗体，所述轻链可以是κ或λ轻链。更具体地，所述重链依次包含VH区、CH1区、铰链区、CH2区和CH3区，而所述轻链包含在CL区后的VL区。这种免疫球蛋白区的许多序列都是本领域已知的。参见，如Kabat等.SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD,1991。描述于Kabat等中的IgG抗体的区的序列以引用的方式并入本文。已知的和/或天然存在的IgG抗体的接近变体(close variants)被涵盖在本文IgG抗体的定义中，其中相对于已知的或天然存在的免疫球蛋白IgG重链和/或轻链的序列，所述接近变体每100个氨基酸中包含不超过10个氨基酸的单一氨基酸的置换、插入和/或缺失。

[0062] 本文所述“免疫效应细胞”是指涉及细胞裂解免疫反应的介导的细胞，包括，例如T细胞，NK细胞，巨噬细胞或嗜中性粒细胞。本文所述异源二聚体的或单体的Bi-Fc抗体结合至抗原，该抗原为在免疫效应细胞表面表达的蛋白质的一部分。所述蛋白质在本文中称为“效应细胞蛋白”。

[0063] 本文所述“免疫球蛋白重链”是指本质上依次由VH区、CH1区、铰链区、CH2区、CH3区和可选的一些同种型中CH3区的下游区组成。免疫球蛋白重链的接近变体被涵盖在本文免疫球蛋白重链的定义中，其中相对于已知的或天然存在的免疫球蛋白重链氨基酸序列，所述接近变体每100个氨基酸中包含不超过10个氨基酸的单一氨基酸的置换、插入和/或缺失。

[0064] 本文所述“免疫球蛋白轻链”是指本质上由轻链可变区(VL)和轻链恒定结构域(CL)组成。免疫球蛋白轻链的接近变体被涵盖在本文免疫球蛋白轻链的定义中，其中相对于已知的或天然存在的免疫球蛋白轻链氨基酸序列，所述接近变体每100个氨基酸中包含不超过10个氨基酸的单一氨基酸的置换、插入和/或缺失。

[0065] 本文所述“免疫球蛋白可变区”是指VH区、VL区或其变体。免疫球蛋白可变区的接近变体被涵盖在本文免疫球蛋白可变区的定义中，其中相对于已知的或天然存在的免疫球蛋白可变区氨基酸序列，所述接近变体每100个氨基酸中包含不超过10个氨基酸的单一氨基酸的置换、插入和/或缺失。VH区和VL区的许多实例都是本领域已知的，如，例如由Kabat等在SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD,1991中描述的VH区和VL区。基于VH区和VL区的较低可变部分中广泛的序列共性、较高可变区的序列中的位点和预测的三级结构，本领域技术人员可以通过其序列来识别免疫球蛋白可变区。参见，如Honegger和Plückthun(2001),J.Mol.Biol.309:657-670。

[0066] 免疫球蛋白可变区包含三个高变区，称为互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)。所述三个高变区形成了抗体的抗原结合位点。所述CDR嵌入在较低可变的框架区(FR1-FR4)中。这些亚区在免疫球蛋白可变区中的顺序如下：
FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变区的许多序列都是本领域已知的。参见，如Kabat等.SEQUENCES OF PROTEINS OF I MMUNOLOGICAL INTEREST,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD,1991。

[0067] CDR可按以下方式位于VH区序列中。CDR1开始于成熟VH区的大约第31位残基，且通常为约5-7个氨基酸长，并且CDR1之前几乎总是Cys-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx-Xxx(SEQ ID NO:1)(其中“Xxx”为任意氨基酸)。重链CDR1之后的残基几乎总是色氨酸，通常为Trp-Val、Trp-Ile或Trp-Ala。在CDR1中的最后一个残基与CDR2中的第一个残基之间几乎总是有十四个氨基酸，且CDR2通常包含16个至19个氨基酸。CDR2可以紧连在Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(SEQ ID NO:2)之后且之后紧接着Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。其它氨基酸可在CDR2之前或之后。在CDR2中的最后一个残基与CDR3中的第一个残基之间几乎总是有三十二个氨基酸，且CDR3可以是约3个至25个残基长。Cys-Xxx-Xxx几乎总是紧连接在CDR3之前，且Trp-Gly-Xxx-Gly(SEQ ID NO:3)几乎总是在CDR3之后。

[0068] 轻链CDR可按以下方式位于VL区中。CDR1开始于成熟抗体的大约第24位残基，且通常为约10个至17个残基长。CDR1之前几乎总是Cys。CDR1中最后一个残基与CDR2中第一个残基之间几乎总是有15个氨基酸，且CDR2几乎总是7个残基长。CDR2通常在Ile-Tyr、Val-Tyr、Ile-Lys或Ile-Phe之后。CDR2与CDR3之间几乎总是有32个残基，且CDR3通常为约7个至10个氨基酸长。CDR3之前几乎总是Cys且通常之后为Phe-Gly-Xxx-Gly(SEQ ID NO:4)。

[0069] 本文所述“连接子”是指连接两个多肽的肽，其中所述连接子可以是两个免疫球蛋白可变区或一个可变区，在Bi-Fc抗体的上下文中，可以是Fc多肽链。连接子的长度可以是2-30个氨基酸或2-40个氨基酸。在一些实施方案中，连接子可以是2-25、2-20或3-18个氨基酸长。在一些实施方案中，连接子可以是不多于14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸长的肽。在其它实施方案中，连接子可以是5-25、5-15、4-11、10-20、20-30或30-40个氨基酸长。在其它实施方案中，连接子可以是约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸长。示例性连接子包括，例如氨基酸序列TVAAP(SEQ ID NO:17)、ASTKGP(SEQ ID NO:18)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGGSAAA(SEQ ID NO:20)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:21)和AAA等等。

[0070] 本文所述Bi-Fc“通过免疫效应细胞介导靶细胞的细胞裂解”是指当添加0.001pM至20000pM的Bi-Fc至如描述于下面标题为“靶细胞细胞裂解实验”的部分中的细胞裂解实验中和在实施例3中有效引起靶细胞的细胞裂解。

[0071] “非化疗的抗肿瘤剂”为除化疗剂之外的对癌细胞具有细胞毒性或细胞抑制效应的化学剂、化合物或分子。然而，非化疗的抗肿瘤剂可以被靶向为直接与间接影响细胞分裂(如包括激素受体或生长因子的细胞表面受体)的分子相互作用。然而，非化疗的抗肿瘤剂不直接干扰与细胞分裂密切相关的过程，如DNA复制、RNA合成、蛋白质合成或有丝分裂纺锤体的功能、装配或拆卸。非化疗的抗肿瘤剂的实例包括Bcl2抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、抗雌激素剂如它莫西芬(tamoxifen)、抗雄激素化合物、干扰素、砷、视黄酸、视黄酸衍生物、针对肿瘤特异性抗原的抗体和Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂(如由Novartis,New TMYork and New Jersey,USA and Basel,Switzerland以商品名“GLEEVEC ”销售的小分子STI-571)及许多可能的非化疗的抗肿瘤剂等。

[0072] 一个氨基酸或核酸序列与另一个氨基酸或核酸序列的“同一性百分比”可采用计算机程序测定。示例性计算机程序是遗传学计算机组(Genetics Computer Group)(GCG；Madison,WI)威斯康辛包版本10.0 软件,GAP(Devereu等 .(1984),Nucleic Acids Res.12:387-95)。GAP程序优选的默认参数包括：(1)该GCG实现核苷酸的一元比较矩阵(包括相同时为1不同时为0的值)和如描述于Atlas of Polypeptide
Sequence and Structure,Schwartz 和 Dayhoff,eds.,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979) 中 Gribskov 和 Burgess((1986)Nucleic Acids
Res.14:6745)的加权氨基酸比较矩阵或其他类似的比较矩阵；(2)每个缺口罚分为8且氨基酸序列每个缺口中的每个符号额外罚分2，或每个缺口罚分为50且核苷酸序列每个缺口中的每个符号额外罚分3；(3)末端缺口无罚分；和(4)长缺口无最高罚分。也可以采用本领域技术人员所使用的序列比较的其它程序。

[0073] 基于比较从而测定多核苷酸或多肽的序列同一性，“同一性区”是采用下文所述参数，通过计算机程序GAP(Devereux等.(1984),Nucleic Acids Res.12:387-95)与另一多核苷酸或多肽部分地或完全地匹配的多核苷酸或多肽序列的部分。例如，当20个氨基酸的多肽与较长的蛋白质对齐，前10个氨基酸与较长蛋白质完全匹配，而后10个氨基酸与较长蛋白质完全不匹配，则同一性区为10个氨基酸。另一方面，若20个氨基酸的多肽的第一个和最后一个氨基酸与较长蛋白匹配，且第一个氨基酸与最后一个氨基酸之间分散有8个其它匹配，则同一性区为20个氨基酸长。然而，本文所指，在至少例如20个氨基酸或60个核苷酸的不含相同或保守性置换氨基酸或相同核苷酸的对齐链中的长伸展区构成同一性区的端点。

[0074] “靶细胞”是与Bi-Fc结合的并参与介导疾病的细胞。在一些情况下，靶细胞可以是通常参与介导免疫反应，还参与疾病的介导的细胞。例如在B细胞淋巴瘤中，通常参与介导免疫反应的B细胞可以是靶细胞。在一些实施方案中，靶细胞为癌细胞、病原体感染的细胞或参与介导自身免疫性疾病或炎性疾病(例如纤维化疾病)的细胞。所述Bi-Fc可通过结合至“靶细胞蛋白”上的抗原而结合至靶细胞，所述靶细胞蛋白是在靶细胞表面显示的蛋白质，且可能为高度表达的蛋白质。

[0075] “肿瘤负荷”是指癌症患者体内存活的癌细胞的数量、肿瘤位点的数量和/或肿瘤的尺寸。肿瘤负荷的下降可例如观察为，患者血液或尿液中肿瘤相关抗原或蛋白质的量的降、肿瘤细胞或肿瘤位点数量的下降和/或一个或多个肿瘤的尺寸的降低。

[0076] Bi-Fc或任意其它药物的“治疗有效量”是具有例如降低或消除癌症患者肿瘤负荷或降低或消除蛋白质用于治疗的任一疾病病症的症状的效果的量。治疗有效量无需完全消除所述病症的所有症状，但是可降低一种或多种症状的严重程度或延迟多种严重症状或可能在所治疗病症之后以一定频率出现的更严重疾病的发作。

[0077] 本文提及的任意疾病的“治疗”涵盖疾病的至少一种症状的减轻、疾病严重程度的降低或疾病发展成更多严重症状的延迟或预防，所述更多严重症状可在一些情况下伴随该疾病或导致至少一种其它疾病。治疗不必意味着疾病完全治愈。有效的治疗剂只需降低疾病的严重程度、降低与疾病或其治疗相关的一种或多种症状的严重程度或延迟更多严重症状或可能在所治疗症状之后以一定频率出现的更严重疾病的发作。

[0078] 当提及命名的免疫球蛋白可变区的VH/VL对“为IgG和/或scFv抗体的一部分时”，其能结合至靶细胞或和/或免疫效应细胞时，其含义是在两条重链中含有所命名的VH区且在两条轻链中含有所命名的VL区的IgG抗体和/或含有这些VH和VL区的scFv抗体能结合至靶细胞和/或免疫效应细胞。描述于实施例2中的结合实验可用于评估结合。

[0079] Bi-Fc分子

[0080] 就最一般意义而言，Bi-Fc能单价地结合至两个不同的抗原且包含一个多肽链或具有不同氨基酸序列的两个不同的多肽链。此外，在弱酸性pH(pH约为5.5-6.0)下，Bi-Fc能通过其Fc区结合至新生Fc受体(FcRn)。这种与FcRn的相互作用能延长体内分子的半衰期。第一条多肽链(在一些情况下，其是唯一的一条多肽链)包含Fc多肽链和可被连接子分隔的两个VH区和两个VL区。相对于四个免疫球蛋白可变区，所述Fc多肽链可以是N-末端的或C-末端的，且能通过连接子连接至所述可变区。若第二多肽链存在，则其包含Fc多肽链。Bi-Fc能结合至免疫效应细胞和靶细胞和/或能通过免疫效应细胞介导靶细胞的细胞裂解。Bi-Fc的一般结构绘制在图1中，图中显示了其中Fc多肽链为C-末端(小图A和B)的实施方案和其中Fc多肽链为N-末端(小图C和D)的实施方案。

[0081] 更具体的实施方案用来详细说明免疫球蛋白可变区的顺序和连接子的长度，并详细说明哪些免疫球蛋白可变区能连接起来从而形成效应细胞蛋白或靶细胞蛋白的结合位点。通常情况下，抗体的抗原结合蛋白包括VH区和VL区，本文中称为“VH/VL对”，尽管在一些情况下，VH或VL能结合至不具有配偶体的抗原。参见，如美国专利申请公开文本2003/0114659。

[0082] 在一组实施方案中，所述四个可变区可以按照以下顺序排列：VH1-连接子1-VL1-连接子2-VH2-连接子3-VL2，其中VH1/VL1是一个抗原结合对，且VH2/VL2为另一抗原结合对。在这一组实施方案中，连接子1和连接子3可以是至少15个氨基酸长，而连接子2可以少于12个氨基酸长，或者在一些情况下缺失。在一些实施方案中，所述VH1/VL1对能结合至靶细胞蛋白，且所述VH2/VL2对能结合至效应细胞蛋白。在其它实施方案中，所述VH1/VL1对能结合至效应细胞蛋白，且所述VH2/VL2对能结合至靶细胞蛋白。

[0083] 在另一组实施方案中，所述四个可变区可以按照以下顺序排列：VL1-连接子1-VH1-连接子2-VL2-连接子3-VH2，其中VH1/VL1是一个抗原结合对，且VH2/VL2是一个抗原结合对。在这些实施方案中，连接子2可以少于12个氨基酸长或者缺失，且连接子1和连接子3可以是至少15个氨基酸长。在一些实施方案中，所述VH1/VL1对能结合至靶细胞蛋白，且所述VH2/VL2对能结合至效应细胞蛋白。在另外一些实施方案中，所述VH1/VL1对能结合至效应细胞蛋白，且所述VH2/VL2对能结合至靶细胞蛋白。

[0084] 在另一组实施方案中，所述四个可变区可以按照以下顺序排列：VH1-连接子1-VL1-连接子2-VL2-连接子3-VH2，其中VH1/VL1是一个抗原结合对，且VH2/VL2是一个抗原结合对。在这些实施方案中，连接子2可以少于12个氨基酸长或者缺失，且连接子1和连接子3可以是至少15个氨基酸长。在一些实施方案中，所述VH1/VL1对能结合至靶细胞蛋白，且所述VH2/VL2对能结合至效应细胞蛋白。在另外的实施方案中，所述VH1/VL1对能结合至效应细胞蛋白，且所述VH2/VL2对能结合至靶细胞蛋白。

[0085] 在另外一组实施方案中，所述四个可变区可以按照以下顺序排列：VL1-连接子1-VH1-连接子2-VH2-连接子3-VL2，其中VH1/VL1是一个抗原结合对，且VH2/VL2是一个抗原结合对。在这些实施方案中，连接子2可以少于12个氨基酸长或者缺失，且连接子1和连接子3可以是至少15个氨基酸长。在一些实施方案中，所述VH1/VL1对能结合至靶细胞蛋白，且所述VH2/VL2对能结合至效应细胞蛋白。在另外的实施方案中，所述VH1/VL1对能结合至效应细胞蛋白，且所述VH2/VL2对能结合至靶细胞蛋白。

[0086] Bi-Fc可包含抗体的Fc多肽链。该Fc多肽链可以源自哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、兔、单峰骆驼或新世界猴或旧世界猴)、禽类或鲨鱼。例如，Fc多肽链可以是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc多肽链。此外，如上文所述，Fc多肽链可包含有限数量的改变。更特别地，相对于已知的或天然存在的序列，Fc多肽链中每100个氨基酸可包含不多于10个单一氨基酸的插入、缺失和/或置换。在一些实施方案中，异源二聚体的Bi-Fc的两条Fc多肽链包含异源二聚化改变，所述改变例如可以是电荷对置换。例如Bi-Fc的第一多肽链可包含置换R409D、R409E、K409D或K409E和N392D、N392E、K392D或K392E，且Bi-Fc的第二多肽链可包含D399K或D399R和E356K、E356R、D356K或D356R。可选地，Bi-Fc的第一多肽链可包含D399K或D399R和E356K、E356R、D356K或D356R，且Bi-Fc的第二多肽链可包含R409E、R409E、K409D或K409E和N392E、N392D、K392D或K392E。如本文所定义，Fc多肽链还可包含一个或多个“不利于同源二聚体形成的Fc改变”和/或一个或多个“延长半衰期的Fc改变”。

[0087] 在Bi-Fc的单体的实施方案中，Bi-Fc可包含一个或多个如上文定义的“不利于同源二聚体形成的Fc改变”。

[0088] 其它种类的改变也可成为作为Bi-Fc一部分的Fc多肽链的一部分。一方面，如上文定义，包含在Bi-Fc中的Fc区可包括一个或多个“抑制Fcγ受体(FcγR)与Fc区结合的改变”。另一方面，如上文定义，包含在Bi-Fc中的Fc区可包括一个或多个“延长半衰期的Fc改变”。又一方面，在作为Bi-Fc一部分的Fc区中可包含一个或多个“增强ADCC的改变”。

[0089] 在一些实施方案中，Fc多肽的氨基酸序列可以是哺乳动物(如人)的氨基酸序列或其变体，相对于人氨基酸序列，所述变体序列的每100个氨基酸中包含不超过10个单一氨基酸的缺失、插入和/或置换。可选地，作为Bi-Fc一部分的Fc多肽与人IgG Fc多肽链的同一性可以是90％或95％，且同一性区可以是至少约50、60、70、80、90或100个氨基酸长。Fc多肽的同种型可以是IgA、IgD、IgE、IgM或IgG(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。下表2中显示了人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4Fc多肽链序列的氨基酸序列的比对。

[0090] 表2：人IgG Fc区的氨基酸序列

[0091]

[0092] 示于表2中的编号根据基于人IgG1抗体的恒定区的顺序编号的EU编号系统。Edelman等.(1969),Proc.Natl.Acad.Sci.63:78-85。因此，该编号系统并不良好适应IgG3铰链的附加长度。尽管如此，由于在本领域中该编号系统通常用于指定Fc区的位置，本文仍采用其来指定Fc区中的位置。IgG1、IgG2、和IgG4Fc多肽的铰链区从约第216位延长至约第230位。通过比对可明显看出，IgG2和IgG4铰链区与IgG1铰链相比各自短3个氨基酸。IgG3铰链更长，在上游延长另外47个氨基酸。CH2区从约第231位延长至第340位，而CH3区从约第341位延长至第447位。

[0093] Fc多肽的天然存在的氨基酸序列可以被轻微改变。所述改变可在Fc多肽的已知或天然存在的氨基酸序列中每100个序列氨基酸中包含不超过10个单一氨基酸的插入、缺失和/或置换。若其中存在置换，则所述置换可以是如上文所定义的保守性氨基酸置换。异源二聚体的Bi-Fc的第一和第二多肽链上的Fc多肽的氨基酸序列可以不同。在一些实施方案中，所述Fc多肽可包括如上文所定义的一种或多种“异源二聚化改变”、“增强ADCC的改变”、“抑制FcγR结合的改变”、“不利于同源二聚体形成的Fc改变”和/或“延长半衰期的Fc改变”。

[0094] Bi-Fc可通过作为效应细胞蛋白一部分的抗原结合至免疫效应细胞，且可通过作为靶细胞蛋白一部分的抗原结合至靶细胞。下文详细描述了一些可能的效应细胞蛋白。同样，下文还详细描述了一些可能的靶细胞蛋白。Bi-Fc可结合至效应细胞蛋白和靶细胞蛋白的任意组合。

[0095] Bi-Fc的示例性氨基酸序列包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:12(异源二聚体的Bi-Fc)；SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:12(异源二聚体的Bi-Fc)；和SEQ ID NO:34(在其Fc多肽链蛋白中包含改变Y349T、K392D和K409D(EU编码)的单体的Bi-Fc)。

[0096] 编码Bi-Fc分子的核酸

[0097] 本文提供编码Bi-Fc的核酸。本领域已知许多编码包含VH、VL、铰链、CH1、CH2、CH3和CH4区的免疫球蛋白区的核酸序列。参见，如，Kabat等.,SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD,1991。根据本文提供的教导，本领域技术人员可将所述核酸序列和/或本领域已知的其它核酸序列结合，以构建编码Bi-Fc的核酸序列。编码Bi-Fc的示例性核酸包括(1)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13，(2)SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:13，和(3)SEQ ID NO:35。

[0098] 此外，基于本文和其它地方提供的氨基酸序列及本领域常识，本领域技术人员可以确定编码Bi-Fc的核酸序列。除较传统的生产编码特定氨基酸序列的克隆DNA片段的方法外，现今如DNA2.0(Menlo Park,CA,USA)和BlueHeron(Bothell,WA,USA)等公司通常采用化学合成来生产任意期望顺序排序的基因大小的DNA，从而简化生产所述DNA的过程。

[0099] 制备Bi-Fc分子的方法

[0100] 采用本领域公知的方法可制备Bi-Fc。例如，将编码Bi-Fc的一条或两条多肽链的核酸可通过多种已知的方法(如转化、转染、电穿孔、用核酸包被的微粒轰击等)引入培养的宿主细胞。在一些实施方案中，编码Bi-Fc的核酸在被引入宿主细胞前可先插入至适于在宿主细胞中表达的载体中。典型的所述载体可包含使插入的核酸能够在RNA和蛋白质水平上表达的序列元件。所述载体是本领域公知的，并且许多是商购可获得的。含有所述核酸的宿主细胞可在能够使细胞表达该核酸的条件下培养，且得到的Bi-Fc可从细胞群或培养基中收集。可选地，Bi-Fc可在体内生产，例如，在植物叶片中(参见，如Scheller等.(2001),Nature Biotechnol.19:573-577和其中引用的参考文献)，鸟蛋中(参见，如Zhu等.(2005),Nature Biotechnol.23:1159-1169和其中引用的参考文献)，或哺乳动物的奶中(参见，如Laible等.(2012),Reprod.Fertil.Dev.25(1):315)。

[0101] 可以使用的多种培养的宿主细胞包括，例如，细菌细胞(如大肠杆菌或嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacilis stearothermophilus))、真菌细胞(如酿酒酵母或毕赤酵母)、昆虫细胞(如包括草地夜蛾细胞在内的鳞翅目昆虫细胞)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞、Hela细胞、人肝细胞癌细胞或293细胞等等)。

[0102] 免疫效应细胞和效应细胞蛋白

[0103] Bi-Fc可结合至在免疫效应细胞表面表达的分子(本文称为“效应细胞蛋白”)和在靶细胞表面表达的另一分子(本文称为“靶细胞蛋白”)。所述免疫效应细胞可以是T细胞、NK细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，所述效应细胞蛋白为包含在T细胞受体(TCR)-CD3复合物中的蛋白。所述TCR-CD3复合物是包含异源二聚体的异源多聚体，所述异源二聚体包含TCRα和TCRβ或TCRγ和TCRδ及来自CD3ζ(CD3ζ)链、CD3ε(CD3ε)链、CD3γ(CD3γ)链和CD3δ(CD3δ)链等的多种CD3链。在一些实施方案中，所述效应细胞蛋白可以是人CD3ε(CD3ε)链(该链的成熟氨基酸序列公开于SEQ ID NO:22)，该链可以是多聚体蛋白的一部分。可选地，所述效应细胞蛋白可以是人和/或食蟹猕猴TCRα、TCRβ、TCRδ、TCRγ、CD3β、CD3γ、CD3δ或CD3ζ。

[0104] 此外，在一些实施方案中，Bi-Fc还可结合至非人物种(如小鼠、大鼠、兔、新世界猴和/或旧世界猴物种)的CD3ε链。所述物种包括但不限于以下哺乳动物物种：小家鼠(Mus musculus)；黑家鼠(Rattus rattus)；褐家鼠(Rattus norvegicus)；食蟹猕猴，食蟹猴(Macaca fascicularis)；阿拉伯狒狒(hamadryas baboon)，埃及狒狒(Papio hamadryas)；大狒狒(Guinea baboon)，几内亚狒狒(Papio papio)；橄榄狒狒(olive baboon)，东非狒狒(Papio anubis)；黄狒狒(yellow baboon)，草原狒狒(Papio cynocephalus)；南非大狒狒(Chacma baboon)，豚尾狒狒(Papio ursinus)；普通狨(Callithrix jacchus)；绒顶柽柳猴(Saguinus Oedipus)和松鼠猴(Saimiri sciureus)。
食蟹猕猴的CD3ε链的成熟氨基酸酸序列提供于SEQ ID NO:23。由蛋白质治疗剂发展领域已知，在通常用于临床前研究的人和物种(如小鼠和猴)中具有相似活性的治疗剂能简化和加快药物的开发。在将药物推向市场的漫长且昂贵的过程中，上述优势可以是至关重要的。

[0105] 在更特别的实施方案中，所述异源二聚体的双特异性抗体可结合至CD3链的前27个氨基酸中的表位，所述CD3可以是人CD3ε链或源自不同物种的CD3ε链，优选为源自上文所列哺乳动物物种中的一种。该表位可包含氨基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(SEQ ID NO:24)。结合该种表位的抗体的优点详细说明于美国专利申请公开文本2010/183615中，其中相关的部分以引用的方式并入本文。抗体所结合的表位可以通过丙氨酸扫描确定，所述丙氨酸扫描描述于，如美国专利申请公开文本2010/183615中，其中相关的部分以引用的方式并入本文。

[0106] 简言之，丙氨酸扫描可如下进行。在一个对照中，将编码野生型CD3ε的DNA插入至适合宿主细胞(优选地为哺乳动物T细胞系)的表达载体中，并转染至宿主细胞中，该DNA能够在该宿主细胞中表达为TCR-CD3复合物的一部分。在实验样品中，DNA编码CD3ε，其中CD3ε氨基酸中的一个变为丙氨酸。创建DNA构建体用于产生一系列分子，这些分子中的一个氨基酸在某一时间变为丙氨酸。构建体之间仅一个氨基酸不同，从而扫描在涉及结合至Bi-Fc的CD3ε的胞外结构域中全部可能的氨基酸位点。通过用编码Bi-Fc的DNA转染哺乳动物宿主细胞并从细胞培养物中回收抗体，制备要测试的Bi-Fc。Bi-Fc与表达CD3ε(无论是野生型的还是具有丙氨酸替换的)的细胞的结合可以采用标准荧光活化细胞分选(FACS)法进行评估。其中CD3ε在特定位点具有丙氨酸替换且测得的结合与用野生型CD3ε测得的结合相比降低或消除的样品表明在该改变的位点上的氨基酸通常参与Bi-Fc与CD3的结合。

[0107] 当T细胞为免疫效应细胞时，Bi-Fc可结合的效应细胞蛋白包括但不限于，CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD3ζ、TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ。当NK细胞或细胞毒性T细胞为免疫+效应细胞时，则例如NKG2D、CD352、NKp46或CD16a可以为效应细胞蛋白。当CD8T细胞为免疫效应细胞时，则例如4-1BB或NKG2D可以是效应细胞蛋白。可选地，Bi-Fc可结合至在T细胞、NK细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞上表达的其它效应细胞蛋白。

[0108] 靶细胞和在靶细胞上表达的靶细胞蛋白

[0109] 如上文所述，Bi-Fc可结合至效应细胞蛋白和靶细胞蛋白。例如，所述靶细胞蛋白可以在癌细胞、病原体感染的细胞或介导疾病(例如炎性、自身免疫性和/或纤维化病症疾病)的细胞表面表达。在一些实施方案中，该靶细胞蛋白能在靶细胞表面高度表达，尽管高水平的表达不是必需的。

[0110] 当靶细胞为癌细胞时，如本文所述的异源二聚体的双特异性抗体可结合至如上文所述的癌细胞抗原。癌细胞抗原可以是人蛋白或源自其它物种的蛋白。例如异源二聚体的双特异性抗体可结合至来自小鼠、大鼠、兔、新世界猴和/或旧世界猴物种等的靶细胞蛋白。所述物种包括但不限于以下物种：小家鼠(Mus musculus)；黑家鼠(Rattus rattus)；褐家鼠(Rattus norvegicus)；食蟹猕猴，食蟹猴(Macaca fascicularis)；阿拉伯狒狒(hamadryas baboon)，埃及狒狒(Papio hamadryas)；大狒狒(Guinea baboon)，几内亚狒狒(Papio papio)；橄榄狒狒(olive baboon)，东非狒狒(Papio anubis)；黄狒狒(yellow baboon)，草原狒狒(Papio cynocephalus)；南非大狒狒(Chacma baboon)，豚尾狒狒(Papio ursinus)，普通狨(Callithrix jacchus)，绒顶柽柳猴(Saguinus Oedipus)和松鼠猴(Saimiri sciureus)。

[0111] 在一些实施例中，所述靶细胞蛋白可以是在感染的细胞表面选择性地表达的蛋白。例如，在乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染的情况下，所述靶细胞蛋白可以是在感染的细胞表面表达的HBV或HCV的包膜蛋白。在其他实施方案中，所述靶细胞蛋白可以是由人免疫缺陷病毒(HIV)在HIV感染的细胞上编码的gp120。

[0112] 在其他方面，靶细胞可以是介导自身免疫性疾病或炎性疾病的细胞。例如，哮喘中的人嗜酸性粒细胞可以是靶细胞，在这种情况下，如含EGF样模体粘液样激素受体(EMR1)可作为靶细胞蛋白。可选地，在全身性红斑狼疮患者中过量人B细胞可作为靶细胞，在这种情况下，如CD19或CD20可作为靶细胞蛋白。在其它自身免疫性疾病中，过量人Th2T细胞可作为靶细胞，在这种情况下，如CCR4可作为靶细胞蛋白。同样地，靶细胞可以是介导如动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝硬化、硬皮病、肾移植纤维化、肾同种异体移植肾病或肺纤维化(包括特发性肺纤维化和/或独特型肺动脉高压)的纤维化细胞。对于所述纤维化病症，如成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)可以是靶细胞蛋白。

[0113] 靶细胞的细胞裂解实验

[0114] 在下文的实施例中，描述了用于测定如本文所述的Bi-Fc抗体在体外是否可通过免疫效应细胞诱导靶细胞的细胞裂解的实验。在该实验中，所述免疫效应细胞为T细胞。当免疫效应细胞为NK细胞时，可采用下述非常相似的实验。

[0115] 可用2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺脂(CFSE)在37℃下标记表达目的靶细胞蛋白的靶细胞系15分钟，然后洗涤。然后可将适当数量的标记的靶细胞于4℃下在一个或多个96孔平底培养板中培养40分钟，所述培养板含有或不含双特异性蛋白、对照蛋白或无不同浓度的添加蛋白。分离自健康人供体的NK细胞可采用Miltenyi NK细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)分离，然后以效应物与靶物比为10:1的比例添加至靶细胞。在这一实验中作为免疫效应细胞的NK细胞可在分离后立即使用或在37℃下培养过夜后使用。含有肿瘤靶细胞、双特异性蛋白和免疫效应细胞的培养板可于37℃/5％CO2下培养18-24小时。还可设置适当的对照孔。在18-24小时的实验期过后，将所有细胞从孔中移出。将相当于孔内容物体积的7-ADD溶液添加至每一样品中。然后可测定样品，通过下文实施例中所述的流式细胞术确定存活靶细胞相对于死亡靶细胞的百分比。

[0116] 治疗方法和组合物

[0117] Bi-Fc可用于治疗包括例如多种形式的癌症、感染、自身免疫性或炎性病症、和/或纤维化病症的各种各样的病症。

[0118] 本发明提供一种包含Bi-Fc的药物组合物。该种药物组合物包含治疗有效量的Bi-Fc及一种或多种另外的组分(如赋形剂、生理上可接受的载体或稀释剂)。所述另外的组分可包括缓冲液、碳水化合物、多元醇、氨基酸、螯合剂、稳定剂和/或防腐剂等许多可能性。

[0119] 在一些实施方案中，Bi-Fc可用于治疗细胞增殖性疾病(包括癌症)，所述疾病涉及细胞的无调节和/或不适当增殖，有时伴随有临近组织和新血管生长的破坏，这可能使得癌细胞可向新的区域入侵，即转移。包含在采用Bi-Fc治疗的病症中的为涉及不适当细胞增长的非恶性病症，包括大肠息肉、脑缺血、巨囊性病、多囊性肾病、良性前列腺增生和子宫内膜异位。Bi-Fc可用于治疗血液的或实体瘤恶性肿瘤。更具体地说，可采用Bi-Fc治疗的细胞增殖性疾病例如是癌症，所述癌症包括间皮瘤、鳞状细胞瘤、骨髓瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、恶性上皮肿瘤、腺癌、黑色素瘤、肉瘤、急性和慢性白血病、淋巴瘤和脑膜瘤、霍奇金病、塞扎莱综合征、多发性骨髓瘤，和肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、喉癌、乳腺癌、头颈癌、膀胱癌、子宫癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、阴道癌、胃癌、肾细胞癌、肾癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、肝胆癌、骨癌、皮肤癌和血液癌，以及鼻腔鼻窦癌、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、喉头癌、喉下部癌(hypolarynx cancer)、唾液腺癌、纵隔膜癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、直肠和肛门区域的癌症、输尿管癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、外阴癌、内分泌系统癌症、中枢神经系统癌症和浆细胞癌。

[0120] 为癌症治疗提供指导的文章包括Cancer,Principles and Practice ofOncology,4th Edition,DeVita等,Eds.J.B.Lippincott Co.,Philadelphia,PA(1993)。根据癌症的特定类型和其它相关领域公知的因素(如患者的一般状况)来选择合适的治疗方法。Bi-Fc可单独使用或可添加至使用其它抗肿瘤剂的治疗方案中来治疗癌症患者。

[0121] 在一些实施方案中，Bi-Fc可以在癌症治疗中广泛应用的多种药物和疗法的同时、之前或之后施用，所述多种药物和疗法例如，化疗剂、非化疗的抗肿瘤剂和/或放射。例如，化疗和/或放疗可在本文所述任意疗法之前、之中和/或之后进行。化疗剂的实例已在上文讨论过，包括但不限于，顺铂、紫杉酚、依托泊苷、米托蒽醌( )、放线菌素D、放线菌酮、喜树碱(或其水溶性衍生物)、甲氨蝶呤、丝裂霉素(如丝裂霉素C)、达卡巴嗪(DTIC)、抗肿瘤抗生素(如阿霉素(多柔比星)和柔毛霉素(daunomycin))及上文提到的所有化疗剂。

[0122] Bi-Fc还可用于治疗感染性疾病，例如慢性HBV感染、HCV感染、HIV感染、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)感染或巨细胞病毒(CMV)感染等等。Bi-Fc可单独施用或可在施用用于治疗所述感染性疾病的其它治疗剂的同时、之前或之后施用。

[0123] 当Bi-Fc有利于耗竭某些细胞类型时，其可进一步用于其它类型病症。例如，对哮喘中的人嗜酸性粒细胞、全身性红斑狼疮中的过量人B细胞、自身免疫性病症中的过量人Th2 T细胞或感染性疾病中的病原体感染的细胞的耗竭是有利的。在纤维化病症中，耗竭形成纤维化组织的细胞是有利的。Bi-Fc可单独施用或可在施用用于治疗所述疾病的其它治疗剂的同时、之前或之后施用。

[0124] 可施用治疗有效剂量的Bi-Fc。构成治疗有效剂量的Bi-Fc的量可根据所治疗的适应症、患者的体重、计算得到的患者的皮肤表面积而变化。可调节Bi-Fc的给药从而达到预期效果。在许多情况下，可能需要重复给药。例如，Bi-Fc可每周两次给药，每周一次给药，每两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周、九周或十周一次给药，或每两个月、三个月、四个月、五个月或六个月一次给药。每天施用的Bi-Fc的量可以为约0.0036mg至约450mg。2
可选地，所述剂量可根据患者的估计皮肤表面积进行调整，每一剂量可以为约0.002mg/m
2
至约250mg/m。另一种选择是，所述剂量可根据患者的体重进行调整，每一剂量可以为约
0.000051mg/kg至约6.4mg/kg。

[0125] Bi-Fc或包含这种分子的药物组合物可以通过任意可行的方法施用。由于在缺乏一些特殊制剂或环境的情况下，口服施用将导致蛋白质在胃内酸性环境中破碎和/或水解，因此蛋白质治疗剂通常通过非肠道途径(例如通过注射)施用。施用的可能途径有皮下注射、肌内注射、静脉内注射、动脉内注射、病灶内注射、或腹膜推注。Bi-Fc还可通过输注(例如静脉内输注或皮下输注)施用。也可能局部施用，特别是针对与皮肤有关的疾病。可选地，Bi-Fc可通过与粘膜接触施用，例如通过鼻内、舌下、阴道或直肠施用或作为吸入剂施用。可选地，包含Bi-Fc的某些合适的药物组合物可以口服施用。

[0126] 上文已概括性地描述了本发明，提供下列实施例是为了说明本发明而非限制本发明。

[0127] 实施例

[0128] 实施例1：抗-HER2CD3ε和抗-FOLR1/CD3εBi-Fc分子及单链双特异性分子的构建

[0129] 采用上文基本描述的方法生成Bi-Fc分子。等.(2000),Blood95(6):2098-2103。更详细地，编码异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc的构建体按照如下方法制备。将编码抗-HER2IgG抗体的VH区(SEQ ID NO:5)和VL区(SEQ ID NO:6)及
抗-人CD3εIgG抗体的VH区(SEQ ID NO:7)和VL区(SEQ ID NO:8)的DNA片段采用正
向和反向引物通过PCR扩增，并通过柔性接头拼接在一起。所得的编码线性融合DNA的DNA片段在本文称为单链抗-HER2/CD3ε(SEQ ID NO:9)，所述线性融合DNA编码由连接子连接的两个scFv。将该构建体亚克隆至哺乳动物表达载体中用于抗体的生产。

[0130] 通过将编码单链抗-HER2/CD3ε的DNA融合至编码经改造人IgG1 Fc区的两条链中一条的DNA来构建异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc(SEQ ID NO:10)。具体地，编码Fc多肽链的DNA在3’端融合至编码单链抗-HER2/CD3ε的DNA，所述Fc多肽链包含两个带正电荷的突变(D356K/D399K，EU编号)和抑制FcγR结合的改变(L234A和L235A)。这一抗-HER/CD3εBi-Fc的氨基酸序列和编码其的核酸序列分别示于SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11。作为抗-HER2/CD3εBi-Fc一部分的第二多肽链为包含两个带负电荷的突变(K392D/K409D，EU编号)及L234和L235A的人IgG1 Fc多肽链，其示于SEQ ID NO:12。将编码该多肽的DNA(SEQ ID NO:13)扩增并插入至合适的载体中用于表达。采用类似的方法，通过用编码源自抗-人FOLR1IgG抗体的scFv片段的DNA替换编码抗-HER2 scFv片段的DNA来构建单链抗-FOLR1/CD3ε(SEQ ID NO:14)和异源二聚体的抗-FOLR1/CD3εBi-Fc(SEQ ID NO:15)。

[0131] 上述所有单链和异源二聚体Bi-Fc分子都通过瞬时转染的人HEK293-6E细胞生成。6天后收获培养基。通过镍 (GE Healthcare Bio-Sciences,L.
L.C.,Uppsala,瑞典)柱层析法纯化单链抗-HER2/CD3ε和抗-FOLR1/CDε分子，并用25至
30mM咪唑梯度洗脱。洗脱合并液进一步通过采用制备 200(GE Healthcare
Bio-Sciences,L.L.C.,Uppsala,瑞典)柱的尺寸交换色谱(SEC)纯化，并浓缩至＞1mg/TM
mL，然后在-70℃下贮存。采用MABSELECT SURE (GE Healthcare Bio-Sciences,L.
L.C.,Uppsala,瑞典)亲和色谱纯化异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc和抗-FOLR1/
CD3εBi-Fc分子，用50mM柠檬酸、1M L-精氨酸、pH 3.5洗脱。该洗脱液经缓冲液交换至制剂缓冲液中，通过制备SEC用10mM磷酸钾、161mM L-精氨酸、pH 7.6或用包含醋酸盐和蔗糖与150mM NaCl、161mM L-精氨酸，pH5.2的溶液进行。

[0132] 实施例2：BiTE:Fc分子与靶细胞和免疫效应细胞的结合的测定

[0133] 异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc和单链抗-HER2/CD3ε与表达CD3的T细胞和表达HER2的JIMT-1细胞的结合按如下方法评定。人pan-T细胞(采用人的Pan T细胞分离试剂盒II纯化，Miltenyi Biotec,Auburn,CA)或纯化的JIMT-1细胞在不存在或存在10μg/mL异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc或单链抗-HER2/CD3ε的情况下于4℃下培养16小时。采用别藻蓝蛋白(APC)标记的抗-人Fc二级抗体检测异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc的细胞结合。在采用小鼠抗抗体之后用APC标记的小鼠Ig-特异性
抗体检测含标签的单链抗-HER2/CD3ε。

[0134] 在示于图2的荧光活化细胞分选(FACS)直方图中，未填充的曲线代表不存在双特异性分子之一时来自细胞的数据，均匀填充的曲线代表存在双特异性分子之一时来自细胞的数据，如图2及其说明中所示。这些结果表明，异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc以及单链抗-HER2/CD3ε结合至T细胞(表达CD3)和表达HER2的JIMT-1细胞。

[0135] 实施例3：在Bi-Fc和T细胞存在下的肿瘤细胞系的裂解

[0136] 检测上述异源二聚体的抗-HER2/CD3ε和抗-FOLR1/CD3εBi-Fc和单链抗-HER2/CD3ε和抗-FOLR1/CD3ε分子，从而确定它们在采用表达HER2或FOLR1的肿瘤细胞作为靶细胞的T细胞依赖的细胞裂解(TDCC)实验中的活性。简言之，采用人的Pan T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)自健康人供体中分离pan T细胞。该T细胞与CFSE标记的肿瘤靶细胞以10:1的比例一起培养，培养时存在或不存在如图3和图4中所指示的变化浓度的描述于实施例1的异源二聚体抗-HER2/CD3ε或抗-FOLR1/CD3εBi-Fc或单链抗-HER2/CD3ε或抗-FOLR1/CD3ε。作为对照，一些样品含有T细胞和肿瘤靶细胞，但是不含Bi-Fc或单链分子。

[0137] 用于抗-FOLR1/CD3ε异源二聚体Bi-Fc和单链分子的靶细胞是Cal-51细胞(每个细胞表达约148,000个FOLR1分子)、T47D细胞(每个细胞表达约101,000个FOLR1分子)或对照细胞系BT474(该种细胞不表达可检测水平的FOLR1)。

[0138] 用于抗-HER2/CD3ε异源二聚体Bi-Fc和单链分子的靶细胞是JIMT-1细胞(每个细胞表达约181,000个HER2分子)、T47D细胞(每个细胞表达约61,000个HER2分子)或对照细胞系SHP77(该种细胞不表达可检测数量的HER2)。

[0139] 39至48小时的培养后，收获细胞，然后肿瘤细胞裂解的百分比通过7-氨基放线菌素D(7-ADD)的摄取来监测，该7-氨基放线菌素D将双链核酸染色。完整细胞排除7-ADD，但7-ADD可穿透已死亡或正在死亡的细胞的细胞膜并且将这些细胞中的双链核酸染色。根据下列公式计算特异性裂解的百分比：

[0140] ％特异性裂解＝[％存在Bi-Fc时肿瘤裂解—％不存在双特异性分子时肿瘤细胞裂解/％总细胞裂解—％不存在双特异性分子时肿瘤细胞裂解]×100

[0141] 为了确定总细胞裂解的百分比，将含有免疫效应细胞和不具有Bi-Fc或单链分子的标记的靶细胞的样品用80％冷甲醇裂解。

[0142] 抗-FOLR1/CD3ε异源二聚体的Bi-Fc和单链分子的结果示于图3。抗-FOLR1/CD3ε异源二聚体的Bi-Fc和单链分子两者都表现出了Cal-51和T47D靶细胞的剂量依赖性裂解。这些分子中每一个在这些细胞系中每一分子的EC50值示于下表3中。

[0143] 表3：Bi-Fc和单链抗-FOLR1/CD3ε分子的EC50值

[0144]

[0145] *NA的含义是没有检测到或检测到很少的细胞裂解。

[0146] 这些数据表明抗-FOLR1/CD3ε异源二聚体的Bi-Fc和单链分子在T细胞存在下都能介导表达FOLR1的细胞的裂解，但是不介导不表达FOLR1的细胞的裂解。Bi-Fc的EC50值是单链分子的EC50值的约7至15倍高，但是Bi-Fc的EC50值仍然在pM范围内。因此在这一实验中Bi-Fc和单链分子都是高度有效的。

[0147] 抗-HER2/CD3ε异源二聚体的Bi-Fc和单链分子的结果示于图4。抗-HER2/CD3ε异源二聚体Bi-Fc和单链分子两者都表现出了JIMT-1和T47D靶细胞的剂量依赖性裂解，但是对照SHP77细胞系(该细胞不表达HER2)无裂解。这些分子中每一个在这些细胞系中每一个的EC50值示于下表4中。

[0148] 表4：Bi-Fc和单链抗-HER2/CD3ε分子的EC50值

[0149]

[0150] *NA的含义是没有检测到或检测到很少的细胞裂解。

[0151] 这些数据表明抗-HER2/CD3ε异源二聚体的Bi-Fc和单链分子在T细胞存在下都能介导表达HER2的细胞的裂解，但是不介导不表达HER2的细胞的裂解。Bi-Fc的EC50值是单链分子的EC50值的约8.6至10.3倍高。

[0152] 实施例4：在Bi-Fc和靶细胞存在下T细胞释放细胞因子

[0153] 检测上述抗-HER2/CD3ε单链和异源二聚体的Bi-Fc和抗-FOLR1/CD3ε单链和异源二聚体Bi-Fc，以确定它们是否能激发T细胞炎性细胞因子的产生。简言之，将源自如实施例3中所述的TDCC实验的24小时细胞培养物上清液用于细胞因子浓度的评定，该评定采用Meso Scale Diagnostics有限公司的人TH1/TH27-Plex和人促炎14-Plex超灵敏试剂盒。该实验根据制造商的说明书实施。

[0154] 这些结果示于图5A、5B、6A和6B。如图5A和5B所示，在抗-FOLR1/CD3ε异源二聚体Bi-Fc或单链存在下T细胞在表达FOLR1的细胞(T47D，左侧小图)存在下分泌细胞因子，但是在不表达FOLR1的细胞(BT474)存在下不分泌细胞因子(BT474，右侧小图)。同样地，如图6A和6B所示，在抗-HER2/CD3ε异源二聚体Bi-Fc或单链存在下T细胞在表达HER2的细胞(JIMT-1，左侧小图)存在下分泌细胞因子，但是在不表达HER2的细胞(SHP77)存在下不分泌细胞因子。因此，在异源二聚体Bi-Fc或单链分子存在下T细胞的干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-13(IL-13)的分泌依赖于表达靶细胞蛋白的细胞的存在。因此，通过Bi-Fc和单链分子的T细胞的活化是特异性的，因为其只有在表达靶细胞蛋白的靶细胞存在的情况下才能发生。

[0155] 此外，在该实验中Bi-Fc具有非常有效的活性，如下表所示，其表现出的EC50值在pM范围。

[0156] 表5：诱发细胞因子分泌的EC50值

[0157]

[0158] 因此，尽管异源二聚体Bi-Fc是单链分子的近两倍大，其在靶细胞存在下仍然是T细胞分泌细胞因子的非常有效的活化剂，而在靶细胞不存在时则不是有效的激活剂。此外，异源二聚体Bi-Fc进而单链分子表现出了非常相似的细胞因子概况。由抗-HER2/CD3ε异源二聚体的Bi-Fc诱导的细胞因子分泌的EC50值是由抗-HER2/CD3ε单链诱导的细胞因子分泌的EC50值的约9至19倍高。由抗-FOLR1/CD3εBi-Fc诱导的细胞因子分泌的EC50值是由抗-FOLR1/CD3ε单链诱导的细胞因子分泌的EC50值的约4.5至6.5倍高。

[0159] 实施例5：在Bi-Fc和靶细胞存在下T细胞活化标记物的上调

[0160] 实施以下实验，以确定在靶细胞存在或不存在的情况下，在外周血单核细胞(PBMC)存在下异源二聚体的Bi-Fc能否活化T细胞。源自健康供体的PBMC在购于宾夕法尼亚州科尔生物专业公司(Biological Specialty Corporation of Colmar)的FICOLLTM梯度上从人白细胞中纯化。在存在或不存在JIMT-1细胞的情况下，所述PBMC与上述异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc或单链抗-HER2/CD3ε双特异性分子以10:1的比例一起培养。培养48小时后，将非贴壁细胞自孔中移出，然后分为两等份样品。用缀合异硫氰酸荧光素(FITC)的抗-人CD3抗体和缀合别藻蓝蛋白(APC)的抗-CD25或抗-CD69抗体将全部样品染色。CD25和CD69作为T细胞活化的标记物。

[0161] 采用异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc和抗-HER2/CD3ε单链，在存在表达HER2的JIMT-1肿瘤靶细胞的情况下，观察到了通过CD3+外周T细胞的CD25和CD69(图7)活化标记物的上调，而在不存在表达HER2的JIMT-1肿瘤靶细胞的情况下未观察到标记物的上调。这些观察结果表明，通过Bi-Fc的T细胞活化依赖于表达靶细胞蛋白的肿瘤靶细胞的存在。T细胞活化的另一可选的潜在途径，即在Bi-Fc(如抗-HER2/CD3εBi-Fc)存在下通过FcγR的交联，可能并不负责所观察到的效果，其原因是抗-HER2/CD3εBi-Fc的Fc区含有抑制与FcgR结合的改变，并且在不存在表达HER2的靶细胞的情况下未观察到T细胞活化。

[0162] 实施例6：Bi-Fc的药代动力学性质

[0163] 在以下的实验中，异源二聚体的抗-HER2/CD3εBi-Fc(包含SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的氨基酸序列)和抗-HER2/CD3ε单链(包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列)的单剂量药代动力学曲线通过在雄性NOD.SCID小鼠(Harlan,Livermore,CA)中静脉推注和皮下推注施用来测定。这些实验分子以1mg/kg经由侧尾静脉静脉推注注入一些小鼠体内或经肩上皮下推注注入另外一些小鼠体内。通过眶内窦穿刺在每一时间点收集全血的大约0.1mL的串行出血(serial bleed)。全血凝血后处理样品从而获得血清(每一样品～
0.040mL)。采用Gytos AB技术通过免疫测定分析血清样品，以确定抗-HER2/CD3ε单链和Bi-Fc的血清浓度。在0、0.5、2、8、24、72、120、168、240、312、384和480小时时收集血清样品。血清样品在分析前保存在-70℃(±10℃)下。根据血清浓度采用非房室模型分析和
6.3 软件(Pharsight,Sunnyvale,CA)来推算药代动力学参数。

[0164] 异源二聚体Bi-Fc和单链分子的单剂量药代动力学曲线示于图8。与快速被消除且仅有5个小时半衰期的单链分子相比，Bi-Fc表现出了延长的血清半衰期(219个小时)。Bi-Fc的暴露是以524hr*μg/mL曲线下面积(AUC)为特征，相比较地，单链分子以19hr*μg/mL曲线下面积为特征。Bi-Fc的皮下生物利用度为83％，而单链分子则为29％。
因此，与单链分子相比，异源二聚体的Bi-Fc表现出了良好的单剂量药代动力学性质。

[0165] 实施例7：单体抗-CD33/CDεBi-Fc的构建

[0166] 构建单体抗-CD33/CDεBi-Fc，其整体结构由图1中左侧第二图代表。相对于天然存在的Fc多肽链，包含特异性改变的单体的Fc多肽链描述于美国专利申请公开文本2012/0244578中，其中相关的部分以引用的方式并入本文。以编码人单体IgG1 Fc多肽链(该多肽链无铰链区，即其从EU编码系统中的第231位开始，且具有羧基末端六组氨酸标签及改变Y349T、K392D和K409D)的载体开始，然后采用Agilent的Quikchange定点突变试剂盒(目录号200518-5)引入指定改变N297G的其他突变。因此，最终的Fc多肽链以第231位的丙氨酸开始，之后持续至第447位的赖氨酸，再之后是六组氨酸标签(SEQ ID NO:92)。
该多肽链包含以下改变：N297G、Y349T、K392D和K409D。

[0167] 编码抗-CD33/CD3ε单链分子的DNA自编码单链分子的第二载体中通过PCR扩增，所述单链分子包含结合至CD33的重链和轻链可变区和之后的结合至CD3ε的重链和轻链可变区。这一抗-CD33/CD3ε单链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:33，并详细描述于美国专利申请2012/244162中，其中相关的部分以引用的方式并入本文。采用拼接重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)将该DNA连接到编码上述改变的Fc多肽链的DNA上。参见，如Warrens等.(1997),Gene 186:29-35，其中描述此方法的部分以引用的方式并入本文。

[0168] 所得到的单体抗-CD33/CD3εBi-Fc的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:34，且编码该单体抗-CD33/CD3εBi-Fc的核酸序列提供于SEQ ID NO:35。将编码单体抗-CD33/CD3εBi-Fc的DNA引入至在适于表达的条件下培养的哺乳动物细胞中。自细胞上清液中回收蛋白。

[0169] 实施例8：抗-CD33/CD3εBi-Fc与表达CD3ε或CD33的细胞的结合

[0170] 测定单体抗-CD33/CD3εBi-Fc和抗-CD33/CD3ε单链与表达CD3ε、CD33或二者都不表达的细胞的结合。测定Molm-13细胞(表达CD33)、Namalwa细胞(既不表达CD33也不表达CD3ε)、纯化的人pan-T细胞(表达CD3ε)、人PBMC(表达CD3ε)和食蟹猕猴PBMC(表达CD3ε)。在双特异性分子不存在或存在下于4℃中培养细胞2小时。通过将细胞10μg/mL的与结合至双特异性分子CD3结合区的小鼠抗体在4℃下一起培养过夜，然后与5μg/mL APC标记的抗-小鼠Fc二级抗体(Jackson 115-136-071)在4℃下一起培养2小时，测定单体抗-CD33/CD3εBi-Fc和抗-CD33/CD3ε单链的细胞结合。通过FACS分析细胞并测定信号的平均荧光强度(MFI)。

[0171] 图9显示了在双特异性分子的多种浓度存在下所测定的如下各种细胞类型的MFI：小图A：Molm-13细胞(表达CD33)；小图B：Namalwa细胞(既不表达CD33也不表达CD3ε)；小图C：人pan-T细胞(表达CD3ε)；小图D：人PBMC(表达CD3ε)；和小图E：食蟹猕猴PBMC(表达CD3ε)。通过该实验测得的结果证明，两种双特异性分子以相似的方式结合至上述细胞类型，这表明向抗-CD33/CD3ε单链中添加Fc多肽链未可检测地影响其与CD33和CD3ε的结合的能力。

[0172] 实施例9：在单体抗-CD33/CD3εBi-Fc存在下表达CD33的肿瘤细胞的裂解

[0173] 实施以下实验以确定上述单体抗-CD33/CD3εBi-Fc是否能够在外周血单核细胞(PBMC)存在下诱导表达CD33的肿瘤细胞的裂解。从SNBL USA(新日本生物医学实验室(Shin Nippon Biomedical Laboratories)的子公司)获得来自食蟹猕猴的PBMC效应细+胞。在这一PBMC制备物中，有61％为CD3T细胞(数据未给出)。在以图10中所示浓度的单体抗-CD33/CD3εBi-Fc或抗-CD33/CD3ε单链存在或不存在情况下，将这些PBMC与用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的肿瘤靶细胞以10:1的比例一起培养。经在37℃下
40-48小时的培养，收获细胞并用流式细胞术通过7ADD摄取来监测存活的和死亡的肿瘤细胞。根据下列公式计算特异性裂解的百分比：

[0174] ％特异性裂解＝1-(存活细胞数(存在双特异性分子时)/存活细胞数(不存在双特异性分子时))×100

[0175] 这些结果示于图10。图10小图A中所示数据表明在单体抗-CD33/CD3εBi-Fc和抗-CD33/CD3ε单链存在下，每一细胞表达约33,000分子的CD33的Molm-13细胞裂解。半数最大裂解浓度(EC50)在pM范围内，即单体抗-CD33/CD3εBi-Fc和抗-CD33/CD3ε单链的半数最大裂解浓度分别为1.45pM和0.96pM。因此，单体Bi-Fc的EC50值低于单链分子的EC50值的两倍高。图10小图B中所示数据表明无Namalwa细胞的裂解，该细胞不表达可检测水平的CD33。这些观察结果表明，单体抗-CD33/CD3εBi-Fc是高度特异性的且是能够通过食蟹猕猴PBMC诱导肿瘤细胞裂解的有效试剂。

[0176] 在第二个实验中，在以图11中所示浓度的单体抗-CD33/CD3εBi-Fc或抗-CD33/CD3ε单链存在或不存在的情况下，自健康人供体中分离的pan T效应细胞与CFSE标记的Molm-13或Namalwa细胞以10:1的比例一起培养。在37℃下40-48小时的培养后，收获细胞并用流式细胞术通过7ADD摄取来监测存活的和死亡的肿瘤细胞。根据本实施例中上述的公式计算特异性裂解的百分比。结果示于图11。

[0177] 在单体抗-CD33/CD3εBi-Fc和抗-CD33/CD3ε单链存在下观察到了Molm-13细胞的特异性裂解。如图11小图A。其EC50在pM范围内，即单体抗-CD33/CD3εBi-Fc和抗-CD33/CD3ε单链的EC50分别为0.65pM和0.12pM。因此，Bi-Fc的EC50是单链分子EC50的5至6倍高。除了测试的单体抗-CD33/CD3εBi-Fc浓度最高时检测到了少量裂解外，采用任一双特异性分子均未检测到Namalwa细胞的裂解。图11，小图B。当不存在T细胞时，未有Molm-13细胞的裂解发生(数据未给出)。这些观察结果表明，单体抗-CD33/CD3εBi-Fc，如同上文所述异源二聚体的Bi-Fc，是能够通过T细胞诱导肿瘤细胞裂解的高度特异性且有效的试剂。

[0178] 实施例10：表达CD33的肿瘤细胞的裂解和在单体抗-CD33/CD3εBi-Fc存在下自PBMC中释放干扰素γ

[0179] 在另一实验中，测定自健康人供体或食蟹猕猴(从SNBL USA获得)分离的PBMC裂+解表达CD33的肿瘤细胞的能力。在这些制备物中，PBMC中有42％CD3T细胞(人)和30％+
CD3T细胞(食蟹猕猴)。在以图12中所示浓度的单体抗-CD33/CD3εBi-Fc或抗-CD33/
CD3ε单链存在或不存在的情况下，将PBMC与CFSE标记的肿瘤靶细胞以5:1的比例于37℃下一起培养。在37℃下67小时的培养后，收获细胞并用流式细胞术通过7ADD摄取来监测存活的和死亡的肿瘤细胞。根据上文所述的公式计算特异性裂解的百分比。结果示于图
12。

[0180] 采用人PBMC(图12，小图A)或食蟹猕猴PBMC(图12，小图B)，在单体抗-CD33/CD3εBi-Fc和抗-CD33/CD3ε单链存在下观察到了Molm-13细胞的特异性裂解。如下表6所示，半数最大裂解浓度(EC50值)在pM范围内。

[0181] 表6：在抗-CD33/CD3ε双特异性分子存在下，通过PBMC的Molm-13细胞的裂解的EC50值

[0182]

[0183] 在双特异性分子之一存在且不存在T细胞的情况下，无Molm-13细胞裂解(数据未给出)。这些数据表明，单体Bi-Fc的EC50值在亚皮摩尔至低皮摩尔范围内，并且非常接近采用人和食蟹猕猴PBMC作为效应细胞的单链分子的EC50值。

[0184] 采用商购可获得的BD OptEIATM人IFN-γ酶联免疫吸附试剂盒II(BDBiosciences)和猴干扰素γ酶联免疫吸附试剂盒(Cell Sciences)测定来自上文所述细胞裂解实验的24小时细胞培养物上清液的细胞因子浓度。该实验根据制造商的说明书实施。在Molm-13细胞存在下，经单体抗-CD33/CD3εBi-Fc或抗-CD33/CD3ε单链处理的人PBMC(图13，小图A)和食蟹猕猴PBMC(图13，小图B)释放IFN-γ。这些结果表明，单体抗-CD33/CD3εBi-Fc，如同抗-CD33/CD3ε单链，是介导干扰素γ自PBMC中释放的高度特异性且有效的试剂。

[0185] 实施例11：由单体抗-CD33/CD3εBi-Fc诱导的细胞增殖、CD25表达和细胞因子释放

[0186] 自健康人供体中分离的pan T效应细胞被CFSE标记，并在以图14和图15中所示浓度的单体抗-CD33/CD3εBi-Fc或抗-CD33/CD3ε单链存在或不存在的情况下，与肿瘤靶细胞(Molm-13或Namalwa细胞)以10:1的比例一起培养。在37℃下72小时的培养后，收获细胞并通过流式细胞术分析T细胞增殖和CD25(一种活化标记物)的表达。

[0187] 用CFSE染料的降低的荧光信号监测细胞数量从而测定增殖。通过CFSE标记T细胞后每个细胞的细胞分裂，每一单独分裂的细胞的CFSE的荧光信号强度降低。通过门控CFSE标记的T细胞并将有丝分裂的T细胞(即具有降低荧光信号的细胞)数量与T细胞的总数量比较确定增殖的T细胞的百分比。通过用别藻蓝蛋白(APC)标记的抗-人CD25抗体染色共培养物中的细胞并采用双色流式细胞术测定CFSE标记的细胞的APC水平，来确定CD25阳性T细胞的百分比。

[0188] 在表达CD33的肿瘤细胞系Molm-13和单体抗-CD33/CD3εBi-Fc或抗-CD33/CD3ε单链存在的情况下观察到了T细胞的增殖。图14，小图A。EC50值在个位数pM范围内，即在单体抗-CD33/CD3εBi-Fc存在时为4.27pM，在抗-CD33/CD3ε单链存在时为1.09pM。
在不表达可检测水平的CD33的Namalwa细胞存在下未观察到T细胞增殖。图14，小图A。

[0189] 在Molm-13细胞和单体抗-CD33/CD3εBi-Fc或抗-CD33/CD3ε单链存在的情况下，T细胞表达活化标记物CD25。图14，小图B。在Namalwa细胞(该细胞不表达可检测水平的CD33)和单体抗-CD33/CD3εBi-Fc或抗-CD33/CD3ε单链存在的情况下，T细胞不表达CD25。图14，小图B。这些观察结果表明，单体抗-CD33/CD3εBi-Fc能够特异性地诱导T细胞的活化和增殖。

[0190] 采用商购可获得的Meso Scale Diagnostics有限公司的人TH1/TH2 7-Plex和人促炎14-Plex超灵敏试剂盒测定来自上文所述实验的24小时细胞培养物上清液的细胞因子浓度。该实验根据制造商的说明书实施。结果示于图15。

[0191] 在表达CD33的Molm-13肿瘤细胞系的存在下，如图15中小图A、B、C、D和E分别所示，由用单体抗-CD33/CD3εBi-Fc或抗-CD33/CD3ε单链处理的T细胞释放干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-13(IL-13)。最高的细胞因子浓度见于IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-10(大于400pg/mL)。还观察到了IL-13的中等水平。在CD33-阴性细胞系Namalwa存在下，未观察到细胞因子的分泌。在下表7中显示了，在单体抗-CD33/CD3εBi-Fc或单链抗-CD33/CD3ε存在下，通过Molm-13细胞的各种细胞因子的产生的EC50值。

[0192] 表7：细胞因子产生的EC50值

[0193]

[0194] 这些结果表明，单体抗-CD33/CD3εBi-Fc是能够介导T细胞释放细胞因子的高度特异性且有效的支架。

[0195] 实施例12：在抗-HER2/CD3ε单链双特异性分子或抗-HER2/CD3εBi-Fc存在下细胞裂解突触(cytolytic synapse)的形成

[0196] 分析实施例1中所述的抗-HER2/CD3ε单链双特异性分子和抗-HER2/CD3εBi-Fc，以确定它们诱导T细胞与表达HER2的JIMT-1肿瘤细胞之间细胞裂解突触形成的能力。将JIMT-1细胞分配至涂布聚-L-赖氨酸的24孔玻璃底培养板中(在含1％FCS
6
和2g/L 葡萄糖的RPMI培养基中0.5×10个细胞/孔)。在37℃下培养1小时后，采用温热的DPBS轻轻洗涤粘附于玻璃孔上的JIMT-1细胞。将含有或不含1nM抗-HER2/CD3ε单链+ 6
双特异性分子或抗-HER2/CD3εBi-Fc的新鲜分离的CD8T细胞(分离自健康供体，1×10个细胞/孔)添加至肿瘤细胞，然后在37℃下另外培养20分钟以产生细胞裂解突触。粘附于培养板上的细胞用预先温热的DPBS洗涤，然后迅速用3.7％多聚甲醛固定10分钟。然后将细胞用DPBS洗涤并在室温下用0.1％titron X-100使细胞渗透5分钟。将一级抗体的混合物(5μg/mL抗-PKCθ和0.4μg/mL抗-CD45)与细胞于4℃下培养过夜，然后洗涤三次。然后加入8μg/mL二级抗体的混合物(绿色为抗-CD45，红色为抗-PKCθ)，于室温下培养3小时，然后用DPBS洗涤培养板两次。已知PKCθ定位于免疫突触，而CD45在T细胞表面表达。将含DAPI的 Gold抗淬灭剂(核染色剂)(生命技术公司(Life
Technologies)#536939)直接加入至玻璃孔中并将培养板在-70℃下避光保存。

[0197] 免疫荧光共焦显微镜显示CD45(绿色染色)出现在T细胞表面(用绿色CD45染色认定为较小细胞类型)，而PKCθ(红色染色)在肿瘤细胞(认定为较大细胞类型)与T细胞之间突触形成的位置显示了聚焦的信号。在含抗-HER2/CD3ε单链双特异性分子和抗-HER2/CD3εBi-Fc时，观察到了T细胞与肿瘤靶细胞之间的细胞裂解突触，但是在不含双特异性分子时未观察到细胞裂解突触(数据未给出)。这些观察结果表明，细胞裂解突触的形成依赖于双特异性分子的存在，且Bi-Fc可形成与采用单链双特异性分子观察到的突触类似的突触。

[0198] 实施例13：异源二聚体的抗-FOLR1/CD3εBi-Fc对于肿瘤生长的体内作用

[0199] 下文所述的实验证明了异源二聚体的Bi-Fc双特异性抗体在体内癌症模型系统中的活性，该模型系统采用表达FOLR1的NCI-N87-luc，人胃癌细胞。尽管这些细胞确实表达可使得能通过发光进行肿瘤检测的荧光素酶，但是本实验中肿瘤生长通过肿瘤的物理6
测量来监测。将50％基质胶中的NCI-N87-luc细胞(3×10个)经皮下植入8周大雌性
6
NOD SCIDγ(NSG)小鼠(第0天)。第10天时，将20×10个活化的人Pan-T细胞通过腹
腔注射施用入每一只小鼠。植入到小鼠体内的人Pan-T细胞在18天培养的第0天和第14天用抗-CD3/CD28/CD2抗体预先活化和扩增，所述活化和扩增采用Miltenyi T细胞活化/扩增试剂盒并根据制造商的说明书进行。在第11天和第18天，经腹腔施用由10mg/小鼠GAMMAGARD[免疫球蛋白输液(人)]10％(Baxter)和0.2mg/小鼠抗-mu FcγRII/III(克隆2.4G2)组成的FcγR封闭液。第一次FcγR封闭后1小时，动物(N＝10只/组)接
受：(1)每天腹腔注射0.05mg/kg的抗-FOLR1/抗-CD3ε单链分子(该分子包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列)；或(2)间隔5天的两次腹腔注射1mg/kg异源二聚体的抗-FOLR1/抗-CD3εBi-Fc(该分子包含SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:88的氨基酸序列)，或25mM赖氨酸盐酸盐，0.9％NaCl中0.002％吐温80，pH7.0(溶剂对照)。测量肿瘤体积，并且当动物
3
的肿瘤达到2000mm或研究结束时(第27天)，对其实施安乐死。

[0200] 在溶剂治疗的小鼠中，测定了所有动物的肿瘤生长，参见图16。相比之下，采用单链抗-FOLR1/抗-CD3ε双特异性分子或异源二聚体的抗-FOLR1/抗-CD3εBi-Fc治疗的小鼠中的肿瘤生长被显著抑制(与溶剂治疗的小鼠相比，p<0.0001)。在整个实验中，无论是治疗的小鼠还是未治疗的小鼠，其体重都无显著变化(数据未给出)。这些数据表明，抗-FOLR1/抗-CD3ε异源二聚体Bi-Fc可诱导体内T细胞介导的靶细胞的杀死。

[0201] 实施例14：单体的和异源二聚体的抗-FOLR1/CD3εBi-Fc对于肿瘤生长的体内作用的比较

[0202] 以下的实验旨在确定单体Bi-Fc在体内能否杀死肿瘤细胞。在18天培养期中的第0天和第14天，通过加入抗-CD3/CD28/CD2抗体预先活化且扩增在培养物中使用的人pan-T细胞，所述活化和扩增采用Miltenyi T细胞活化/扩增试剂盒并根据制造商的说明6
书进行。Molm-13-luc细胞(1×10个)，即在D-荧光素存在下发荧光的表达CD33的肿瘤细胞，经皮下注射(SC)至10周大雌性NSG小鼠右侧(第0天)。肿瘤细胞接种之后的第3
6
天，通过腹腔注射向每一只小鼠施用20×10个活化的人pan-T细胞。在第4天和第11天，通过腹腔注射施用如实施例13中所述的FcγR封闭液。在第4天的FcγR封闭一小时后，小鼠(N＝8只/组)接受以下治疗之一：(1)每天腹腔注射0.05mg/kg的抗-CD33/CD3ε
单链双特异性分子(该分子具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列)、0.05mg/kg的抗-MEC/CD3单链双特异性分子(该分子具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列；作为阴性对照)、0.05mg/kg单体抗-CD33/CD3εBi-Fc(该分子具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列)，或25mM赖氨酸盐酸盐，0.9％NaCl中0.002％吐温80，pH7.0(溶剂对照)，共10天；或(2)间隔5天的两次腹腔注射1mg/kg的抗-CD33/CD3ε异源二聚体的Bi-Fc(该分子包含SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:82的氨基酸序列)。

[0203] 开始给药后，采用体内成像系统(Perkin Elmer公司)在周一、周三和周五进行生物发光成像，共进行两周。在成像前的九分钟，通过腹腔注射向小鼠给予
150mg/kg D-荧光素。采集图像并用LIVING 软件2.5(Caliper Life Sciences)
进行分析。采用原初动物(未用Molm-13-luc或人pan-T细胞接种的动物)测定基线生物发光。

[0204] 接受溶剂或抗-MEC/CD3ε单链的小鼠在整个研究期间内都经历了肿瘤生长，而未接受肿瘤细胞的原初对照小鼠未表现出明显的肿瘤细胞生长。图17。接受抗-CD33/CD3ε异源二聚体Bi-Fc或单链分子的小鼠最初经历了肿瘤生长，但是研究结束时在这些组中观察到的肿瘤细胞发光接近等于在天然小鼠中观察到的水平。接受单体抗-CD33/CD3εBi-Fc的小鼠也经历了最初肿瘤生长，然后在研究结束时肿瘤细胞发光介于在溶剂治疗小鼠中观察到的发光和在原初小鼠中观察到的发光中间。图17。在用溶剂治疗的小鼠相对于用单体Bi-Fc治疗的小鼠之间肿瘤生长的区别是统计上显著的(p<-.0001)。因此，单体Bi-Fc确实引发体内肿瘤细胞的杀死。

[0205] 实施例15：Fc改变N297G对于单体抗-CD33/CD3Bi-Fc的体内抗-肿瘤功效的作用

[0206] 以下的实验将在Bi-Fc的Fc多肽链部分中具有N297G改变的单体抗-CD33/CD3εBi-Fc的体内活性与在Bi-Fc的Fc多肽链部分中具有野生型N297的单体抗-CD33/CD3εBi-Fc的活性进行了比较。方法基本与实施例14所述方法相同。Molm-13-luc细胞
6
(1×10个)经皮下注射(SC)至10周大雌性NSG小鼠右侧(第0天)，并且在第3天，通
6
过腹腔注射向每一只小鼠施用20×10个预先活化的人pan-T细胞。在第4天和第11天，施用如实施例13中所述的FcγR封闭液。在第4天的FcγR封闭一小时后，小鼠(N＝10只/组)每天接受腹腔注射的以下之一：溶剂(25mM赖氨酸盐酸盐，0.9％NaCl中0.002％吐温80，pH7.0)；包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的单体抗-CD33/CD3εBi-Fc(该分子具有N297G改变)；或包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的单体抗-CD33/CD3εBi-Fc(该分子具有野生型N297)。原初对照小鼠未接受肿瘤细胞的注射且未接受治疗注射。结果示于图
18。

[0207] 溶剂治疗小鼠表现出肿瘤生长。溶剂治疗小鼠与用具有N297G改变的单体抗-CD33/CD3εBi-Fc治疗的小鼠之间存在的肿瘤生长差异小但是显著(p<0.0005)。图18。
在研究结束时，与溶剂治疗小鼠相比，用具有野生型N297的单体抗-CD33/CD3εBi-Fc治疗的小鼠具有显著(p<0.0005)较低水平的肿瘤生物发光。如所预期的，原初小鼠具有低水平的生物发光。图18。至少，这些结果表明，在体内肿瘤细胞杀死实验中，具有野生型N297的单体Bi-Fc的活性与具有N297G的单体Bi-Fc的活性相同(即使不高于)。

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基于深度学习的人类乳头状瘤病毒自动分型检测装置	2020-05-16	535
人类乳头瘤病毒(HPV)衣壳蛋白L1多肽及其制备与应用	2020-05-17	412
用于高通量检测人类乳头瘤病毒的DNA分子标签	2020-05-13	55
人类乳头瘤病毒空衣壳粒子的制备方法及其产品	2020-05-17	864
人类乳头瘤病毒构建体	2020-05-11	266
人类乳头瘤病毒空衣壳粒子的制备方法及其产品	2020-05-20	929
人类乳头瘤病毒(HPV)衣壳蛋白L1多肽及其制备与应用	2020-05-21	230
人类乳头瘤病毒（HPV）抗原、疫苗组合物和相关方法	2020-05-18	153
一种检测人类乳头瘤病毒基因型的方法	2020-05-15	15
抑制人类乳头瘤病毒11型的小干扰RNA分子及其应用	2020-05-19	733

双特异性Fc分子

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