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放射性药物配合物

阅读：408发布：2020-05-11

专利汇可以提供放射性药物配合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种形成组织靶向钍配合物的方法，所述方法包括：a)形成包含四个在N- 位置被甲基取代的羟基吡啶酮（HOPO）部分和端基为羧酸基团的偶联部分的八齿螯合剂；b)将所述八齿螯合剂偶联到至少一个靶向脯氨酰内肽酶FAP的组织靶向部分；和c)使所述组织靶向螯合剂与包含至少一种发射α的钍同位素的离子的水溶液接触。还提供一种治疗肿瘤性或增生性疾病的方法，其包括给药这样的组织靶向钍配合物，以及所述配合物和相应的药物制剂。，下面是放射性药物配合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种形成组织靶向钍配合物的方法，所述方法包括：
a) 形成式(I)或(II)的八齿螯合剂：
其中Rc是端基为羧酸基团的连接部分，如
[-CH2-Ph-N(H)-C(=O)-CH2-CH2-C(=O)OH]、
[-CH2-CH2-N(H)-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-3-CH2-CH2-C(=O)OH]或
[-(CH2)1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH]，其中Ph是亚苯基，优选对亚苯基，b) 将所述八齿螯合剂偶联到组织靶向部分，
该组织靶向部分包含与序列1、11或21之一具有序列一致性或相似性的肽链；
和与序列5、15或25之一具有序列一致性或相似性的肽链；
由此生成组织靶向螯合剂；和
c) 使所述组织靶向螯合剂与包含发射α的钍同位素227Th的4+离子的水溶液接触。
2.权利要求1的方法，其中步骤b)在水溶液中进行。
3.前述权利要求任一项的方法，其中所述酰胺偶联试剂是碳二亚胺偶联试剂，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）、N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）或N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）。
4.前述权利要求任一项的方法，其中步骤b)在水溶液中在4至9的pH下进行。
5.前述权利要求任一项的方法，其中步骤b)在15至50℃之间进行5至120分钟。
6.前述权利要求任一项的方法，其中步骤c)在15至50℃之间进行1至60分钟。
7.前述权利要求任一项的方法，其中RC是
[-(CH2)1-3-对亚苯基-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH]，
优选[-(CH2)-对亚苯基-N(H)-C(=O)-(CH2)2-C(=O)OH]。
8.通过权利要求1至7任一项的方法形成或能够形成的组织靶向钍配合物。
9.一种药物制剂，其包含至少一种如权利要求1至8任一项中所限定的组织靶向钍配合物。
10.权利要求9的药物制剂，其进一步包含柠檬酸盐缓冲液。
11.权利要求9或权利要求10的药物制剂，其进一步包含对氨基丁酸（PABA）和任选EDTA和/或至少一种聚山梨酸酯。
12.如权利要求1至8任一项中所限定的组织靶向钍配合物或如权利要求9至11任一项中所述的药物制剂在用于治疗增生性或肿瘤性疾病的药剂制造中的用途。
13.如权利要求12中所述的用途，其中所述疾病选自：结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮肤癌、腹膜癌、女性生殖器官癌症、膀胱癌、胃癌、头颈癌和肉瘤。
14.一种治疗人类或非人类动物（特别是需要其的人类或非人类动物）的方法，其包括给药至少一种如权利要求1至8任一项中所限定的组织靶向钍配合物或至少一种如权利要求9至11任一项中所述的药物制剂。
15.权利要求14的方法，其用于治疗结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮肤癌、腹膜癌、女性生殖器官癌症、膀胱癌、胃癌、头颈癌和肉瘤。
16.如权利要求1至8任一项中所限定的组织靶向钍配合物或如权利要求9至10任一项中所述的药物制剂，其用于治疗结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮肤癌、腹膜癌、女性生殖器官癌症、膀胱癌、胃癌、头颈癌和肉瘤。
17.一种试剂盒，其包含：
i) 如权利要求1或7中所限定的八齿螯合剂；
ii) 至少一种如权利要求1中所限定的组织靶向部分；
iii) 至少一种酰胺偶联试剂；和
iv) 任选和优选地，发射α的钍放射性核素，如227Th。

说明书全文

放射性药物配合物

发明领域

[0001] 本发明涉及钍-227与缀合到靶向脯氨酰内肽酶FAP抗原的组织靶向部分（tissue targeting moiety）的某些八齿配体的配合物的形成方法。本发明还涉及所述配合物，并涉及包括给药此类配合物的疾病治疗，特别是肿瘤疾病的治疗。

[0002] 发明背景特异性细胞杀伤对成功治疗哺乳动物对象的各种疾病是必要的。其典型实例是恶性疾病如肉瘤和癌的治疗。但是某些细胞类型的选择性清除在其它疾病，尤其是增生性和肿瘤性疾病的治疗中也起到关键作用。

[0003] 最常用的选择性治疗方法目前是外科手术、化疗和外束照射。但是，靶向放射性核素疗法是具有特异性地向疾病相关的细胞类型递送高细胞毒性辐射的潜力的有前途和发展中的领域。目前批准用于人类的最常见形式的放射性药物使用发射β和/或发射γ的放射性核素。但是由于它们用于更特异性细胞杀伤的潜力，对在治疗中使用发射α的放射性核素有一些兴趣。

[0004] 典型的α发射体在生理环境中的辐射范围通常小于100微米，相当于仅几个细胞直径。这使这些来源非常适用于治疗肿瘤，包括微转移，因为它们具有到达肿瘤内的相邻细胞的范围，但如果它们靶向良好，则辐射能量极少越过靶细胞。因此，不需要靶向每一细胞，而是可将对周围健康组织的损伤减至最低（参见Feinendegen等人, Radiat Res 148:195-201 (1997)）。相反，β粒子在水中具有1 mm或更大的范围（参见Wilbur, Antibody Immunocon Radiopharm 4: 85-96 (1991)）。

[0005] α-粒子辐射的能量比β粒子、γ射线和X-射线携带的能量高，通常为5-8 MeV，或β粒子的5至10倍和γ射线的能量的20或更多倍。因此，与γ和β辐射相比，在极短距离上如此沉积大量能量给予α-辐射极高的线性能量传递（LET）、高的相对生物效能（RBE）和低氧增强比（OER）（参见Hall, "Radiobiology for the radiologist", 第5版, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia PA, USA, 2000）。这解释了发射α的放射性核素的异常细胞毒性，也对此类同位素的生物靶向和对发射α的放射性核素分布的控制和研究水平提出严格的要求，为了避免不可接受的副作用，这是必须的。

[0006] 迄今，关于在放射免疫疗法中的应用，主要的关注集中于211At、213Bi和225Ac并且已在临床免疫疗法试验中考察了这三种核素。

[0007] 已经提出的几种放射性核素是短寿命的，即具有小于12小时的半衰期。如此短的半衰期使得难以以商业方式生产和分销基于这些放射性核素的放射性药物。短寿命核素的给药也提高在到达靶点前在体内发射的辐射剂量的比例。

[0008] 来自α-发射的反冲能在许多情况下导致从母体的衰变位置释放子体核素。这种反冲能足以使许多子核脱离已固定住（held）母体的化学环境，例如在母体与配体如螯合剂配合的情况下。这甚至在子体与相同的配体化学相容，即可配合时也会发生。同样地，如果子体核素是气体，特别是稀有气体，如氡，或与配体化学不相容，这种释放效应更高。当子体核素具有多于几秒的半衰期时，它们可扩散到血液系统中，不受固定住母体的配位剂的约束。这些游离的放射性子体随后可造成不想要的全身毒性。

[0009] 几年前提出在保持223Ra子体同位素的控制的条件下使用钍-227（T1/2 = 18.7天）（参见WO 01/60417和WO 02/05859）。这是在使用允许子体核素被封闭环境留住的载体系统的情况下。在一种情况下，将放射性核素设置在脂质体内并且脂质体的较大尺寸（与反冲距离相比）有助于将子体核素保留在脂质体内。在第二种情况下，使用放射性核素的趋骨性配合物，其并入骨基质中并因此限制子体核素释放。这些是可能非常有利的方法，但脂质体的给药在一些情况下不合意并且在许多软组织疾病中，放射性核素无法被矿化基质包围以留住子体同位素。

[0010] 更最近，已经确定，在哺乳动物身体中可在比由先前对相当的核的试验预测的程度高得多的程度上耐受在227Th衰变时释放的223Ra子核的毒性。在不存在上文论述的保留钍-227的镭子体的具体手段的情况下，公开可得的关于镭毒性的信息表明不可能使用钍-227作为治疗剂，因为实现来自钍-227衰变的治疗效果所需的剂量会导致来自镭子体的衰变的高毒性和可能致命的辐射剂量，即没有治疗窗口。

[0011] WO 04/091668描述了出乎意料的发现，即确实存在治疗窗口，其中可给药于对象（通常哺乳动物）治疗有效量的靶向钍-227放射性核素而不生成足以造成不可接受的骨髓毒性的量的镭-223。这因此可用于治疗和预防在骨和软组织位点的所有类型的疾病。

[0012] 考虑到上述发展，现在有可能在内部放射性核素疗法中使用发射α的钍-227核而没有由生成的223Ra造成的致命骨髓毒性。但是，治疗窗口仍然相对较窄并且在所有情况下最好给药于对象不超过绝对必要的发射α的放射性同位素。因此如果可以高度可靠地配合和靶向发射α的钍-227核，会极大增强这一新治疗窗口的开发利用。

[0013] 由于放射性核素不断衰变，在分离和给药于对象之间花在处理材料上的时间非常重要。如果发射α的钍核可以以在制备上快速和方便的形式配合、靶向和/或给药（优选需要很少的步骤、短培养时间和/或不会不可逆地影响该靶向体的性质的温度），也具有相当大的价值。此外，可在不需要在给药前脱除的溶剂中（基本在水溶液中）进行的方法具有避免溶剂蒸发或渗析步骤的显著优点。

[0014] 如果可以开发表现出显著增强的稳定性的钍标记药物产品制剂，也被认为具有重大价值。这对确保在能用物流路径运送患者剂量的同时坚持稳健的产品质量标准至关重要。因此在1-4天的时期内具有最低辐射分解的制剂是优选的。

[0015] 含羟基吡啶酮基团的八齿螯合剂之前已显示适用于配位α发射体钍-277，以随后连接到靶向部分（WO2011098611）。描述了八齿螯合剂，其含有通过连接基团（linker groups）连接到胺基支架上的四个3,2-羟基吡啶酮基团、具有用于与靶向分子缀合的单独反应性基团。前述发明的优选结构含有3,2-羟基吡啶酮基团并使用异硫氰酸酯部分作为连向抗体组分的优选偶联化学，如化合物ALG-DD-NCS中所示。异硫氰酸酯广泛用于经由胺基将标签附着到蛋白质上。异硫氰酸酯基团与蛋白质中的氨基端基和伯胺反应并已用于标记许多蛋白质，包括抗体。尽管在这些缀合物中形成的硫脲键相当稳定，但已经报道了由荧光异硫氰酸酯制备的抗体缀合物随时间退化。[Banks PR, Paquette DM., Bioconjug Chem (1995) 6:447-458]。通过异硫氰酸荧光素与胺的反应形成的硫脲在碱性条件下也易于转化成胍 [Dubey I, Pratviel G, Meunier BJournal: Bioconjug Chem (1998) 9:627-632]。由于钍-227的长衰变半衰期（18.7天）与单克隆抗体的长生物半衰期结合，需要使用更稳定的连接部分以生成在体内和对于储存都更化学稳定的缀合物。

[0016] 关于羟基吡啶酮配体缀合的最相关的先前研究公开在WO2013/167754中，并公开了具有包含羟烷基官能团的水增溶部分的配体。由于这一螯合物类型的羟基的反应性，作为活化酯活化是不可能的，因为接着发生多个竞争反应，以通过酯化反应产生产物的复杂混合物。WO2013/167754的配体因此必须经由替代性的化学，如产生如上所述的较不稳定的硫脲缀合物的异硫氰酸酯偶联到组织靶向蛋白。此外，WO2013167755和WO2013167756分别公开了用于CD33和CD22靶向抗体的羟烷基/异硫氰酸酯缀合物。

[0017] 脯氨酰内肽酶FAP（也被称为成纤维细胞活化蛋白，或FAP α）在癌症生理学中具有多重作用（Jiang等人, Oncotarget. 2016年3月15日）。FAP在癌症相关成纤维细胞上高度表达并也可存在于癌细胞上。除在一些炎性状况，如肝硬化下，还已经报道了在超过90%的上皮癌（例如乳腺、肺、结肠、胰腺、头颈）的基质和骨与软组织肉瘤的恶性细胞中的丰富表达。

[0018] FAP是最初参与细胞外基质重构的II型跨膜丝氨酸蛋白酶。其直接和间接促成癌症引发、进展和转移。最近，已经描述了FAP-阳性癌症相关成纤维细胞的免疫抑制作用，表明FAP是适应性肿瘤相关抗原和因此有吸引力的治疗靶。

[0019] FAP是ESC11抗体的靶，其已描述在WO2011040972中。ESC11是识别人和小鼠FAP抗原的高亲和力抗体。ESC11 IgG1诱发表面FAP的下调和内化。

[0020] 本发明人现在已经确定，通过将特定螯合剂偶联到作为靶向部分的脯氨酰内肽酶FAP的单克隆抗体上、随后加入发射α的钍离子以形成组织靶向配合物，可在温和条件下和借助对配合物的储存和给药保持更稳定的连接部分快速生成配合物。

[0021] 发明概述在第一方面中，本发明因此提供一种形成组织靶向钍配合物的方法，所述方法包括：
a) 形成式(I)或(II)的八齿螯合剂：
其中Rc是端基为羧酸基团的连接部分（linker moiety），如
[-CH2-Ph-N(H)-C(=O)-CH2-CH2-C(=O)OH]、
[-CH2-CH2-N(H)-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-3-CH2-CH2-C(=O)OH]或
[-(CH2)1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH]，其中Ph是亚苯基，优选对亚苯基；
b) 将所述八齿螯合剂偶联到组织靶向部分，
其包含与序列1、11或21之一具有序列一致性或相似性的肽链；
和与序列5、15或25之一具有序列一致性或相似性的肽链；
由此生成组织靶向螯合剂；和
c) 使所述组织靶向螯合剂与包含发射α的钍同位素227Th的4+离子的水溶液接触。

[0022] 在这样的配合物中（和优选在本发明的所有方面中），钍离子通常与八齿的含羟基吡啶酮配体配合，所述配体又经由酰胺键连接到组织靶向部分。

[0023] 通常，该方法是合成包含可通过原位活化或通过活性酯本身的合成和分离而以活性酯（如N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS酯））的形式活化的反应性羧酸酯官能的3,2-羟基吡啶酮基八齿螯合物的方法。

[0024] 所得NHS酯可在简单缀合步骤中使用以产生宽范围的螯合物修饰蛋白形式。此外，高度稳定的抗体缀合物容易用钍-227标记。这可在环境温度或接近环境温度下，通常以高放射化学产量和纯度发生。

[0025] 本发明的方法优选在水溶液中进行，和在一个实施方案中可在不存在或基本不存在（小于1体积%）任何有机溶剂的情况下进行。

[0026] 本发明的组织靶向配合物可配制到适合给药于人类或非人类动物对象的药剂中。

[0027] 在第二方面中，本发明因此提供生成药物制剂的方法，其包括形成如本文所述的组织靶向配合物，随后加入至少一种药物载体和/或赋形剂。合适的载体和赋形剂包括缓冲剂、螯合剂、稳定剂和本领域中已知和本文任一方面中描述的其它合适组分。

[0028] 在另一方面中，本发明另外提供一种组织靶向钍配合物。这样的配合物具有本文通篇描述的特征，特别是本文中描述的优选特征。该配合物通过本文中描述的任一方法形成或能够形成。此类方法因此可产生至少一种如本文的任一方面或实施方案中描述的组织靶向钍配合物。

[0029] 在还另一方面中，本发明提供一种药物制剂，其包含本文中描述的任一配合物。该制剂通过本文中描述的任一方法形成或能够形成，并可含有至少一种缓冲剂、稳定剂和/或赋形剂。缓冲剂和稳定剂的选择可一起有助于防止组织靶向配合物辐射分解。在一个实施方案中，甚至在制剂制造后几天之后，制剂中的配合物的辐射分解也极小。这是重要的优点，因为其解决了与产品质量和药物供应物流相关的潜在问题，它们对这一技术的实施和实际应用是关键的。

[0030] 发明详述在本发明中，“组织靶向”在本文中用于表示所涉物质（特别是为如本文所述的组织靶向配合物的形式时）用于将自己优先定位（特别是将任何缀合的钍配合物定位）到至少一个希望其存在（例如以提供放射性衰变）的组织位点。因此与没有靶向部分的同等配合物的浓度相比，组织靶向基团或部分有助于在给药于对象后提供向对象体内的至少一个所需位点的更高定位。

[0031] 本情况中的靶向部分对脯氨酰内肽酶FAP具有特异性。

[0032] 如本文所述的本发明的各种方面涉及疾病的治疗，特别用于选择性靶向患病组织，以及涉及可用于这些方法的配合物、缀合物、药剂、制剂、试剂盒等。在所有方面中，患病组织可位于身体中的单个位点（例如在局部实体瘤的情况下）或可位于多个位点（例如在关节炎中影响几个关节的情况下或在分布式或转移式癌性疾病的情况下）。

[0033] 要靶向的患病组织可在软组织位点、在钙化组织位点或多个位点，它们可以都在软组织中、都在钙化组织中或可包括至少一个软组织位点和/或至少一个钙化组织位点。在一个实施方案中，靶向至少一个软组织位点。靶向位点和疾病的起源位点可以相同，但也可不同（如在特异性靶向转移位点的情况下）。如果牵涉多于一个位点，这可包括起源位点或可以是多个继发位点（secondary sites）。

[0034] 术语“软组织”在本文中用于表示没有“硬”矿化基质的组织。特别地，本文所用的软组织可以是非骨骼组织的任何组织。相应地，本文所用的“软组织疾病”是指在如本文所用的“软组织”中发生的疾病。本发明特别适用于治疗癌症且“软组织疾病”因此包括在任何“软”（即非矿化）组织中发生的癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和混合型癌症，以及这种组织的其它非癌性疾病。癌性“软组织疾病”包括在软组织中发生的实体瘤以及转移性和微转移性肿瘤。实际上，软组织疾病可包含同一患者的原发性软组织实体瘤和至少一种转移性软组织肿瘤。或者，“软组织疾病”可仅由原发性肿瘤或仅由原发性肿瘤为骨骼疾病的转移瘤构成。

[0035] 适合使用本发明的脯氨酰内肽酶FAP靶向剂治疗的肿瘤的实例包括结肠、直肠、肺、乳腺、胰腺、皮肤、腹膜、女性生殖器官、膀胱、胃和头颈的上皮癌，以及肉瘤。

[0036] 有助于本发明的成功的一个关键在于，该抗体缀合物在储存时稳定可接受的时间。因此非放射性抗体缀合物和最终钍标记的药物产品的稳定性都必须满足放射性药物产品的制造和分销所要求的严格标准。令人惊讶的发现在于，包含组织靶向配合物的本文所述的制剂在储存时表现出出色的稳定性。这甚至在通常用于加速稳定性研究的升高的温度下也适用。

[0037] 在适用于本发明的所有兼容方面的一个实施方案中，可将组织靶向配合物溶解在合适的缓冲液中。特别地，已经发现，柠檬酸盐缓冲液的使用提供惊人稳定的制剂。这优选是在1-100 mM (pH 4-7)的范围内，特别在10至50 mM的范围内的柠檬酸盐缓冲液，但最优选是20-40 mM柠檬酸盐缓冲液。

[0038] 在适用于本发明的所有兼容方面的另一实施方案中，可将组织靶向配合物溶解在含对氨基丁酸（PABA）的合适缓冲液中。优选组合是与PABA组合的柠檬酸盐缓冲液（优选以本文所述的浓度）。用于本发明的任何方面，包括与其它试剂组合使用的PABA的优选浓度为大约0.005至5 mg/ml，优选0.01至1 mg/ml，更优选0.01至1mg/ml。0.1至0.5 mg/ml的浓度最优选。

[0039] 在适用于本发明的所有兼容方面的另一实施方案中，可将组织靶向配合物溶解在含乙二胺四乙酸（EDTA）的合适缓冲液中。优选组合是与柠檬酸盐缓冲液一起使用EDTA。特别优选组合是在PABA存在下与柠檬酸盐缓冲液一起使用EDTA。在这样的组合中，柠檬酸盐、PABA和EDTA优选酌情在本文中指示的浓度范围和优选浓度范围内存在。用于本发明的任何方面，包括与其它试剂组合使用的EDTA的优选浓度为大约0.02至200 mM，优选0.2至20 mM，最优选0.05至8 mM。

[0040] 在适用于本发明的所有兼容方面的另一实施方案中，可将组织靶向配合物溶解在含至少一种聚山梨酸酯（PEG接枝的失水山梨糖醇脂肪酸酯）的合适缓冲液中。优选的聚山梨酸酯包括Polysorbate 80（聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯）、Polysorbate 60（聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单硬脂酸酯）、Polysorbate 40（聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单棕榈酸酯）、Polysorbate 80（聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯）及其混合物。Polysorbate 80 (P80)是最优选的聚山梨酸酯。用于本发明的任何方面，包括与其它试剂组合使用的聚山梨酸酯（尤其是如本文中指出的优选聚山梨酸酯）的优选浓度为大约0.001至10% w/v，优选0.01至1% w/v，最优选0.02至0.5 w/v。

[0041] 尽管先前已将PABA描述为放射稳定剂（参见US4880615A），但在本发明中在储存中的非放射性缀合物上观察到PABA的积极作用。在不存在辐射分解的情况下的这种稳定作用构成特别令人惊讶的优点，因为组织靶向螯合剂的合成通常在与钍离子接触前显著发生。因此，组织靶向螯合剂可在与钍离子接触前1小时至3年生成，并优选在该时期的至少一部分期间与PABA接触储存。也就是说，本发明的步骤a)和b)可在步骤c)之前1小时至3年发生并且在步骤b)和c)之间，组织靶向螯合剂可与PABA接触储存，特别是在缓冲液中，如柠檬酸盐缓冲液并任选具有EDTA和/或聚山梨酸酯。所有材料优选为本文所示的类型和浓度。PABA因此是本发明制剂的高度优选的组分，并且对于组织靶向螯合剂和/或对于组织靶向钍配合物可带来长期稳定性。

[0042] 如本文所述的柠檬酸盐缓冲液的使用对本发明的制剂中的组织靶向钍配合物的稳定性提供另一令人惊讶的优点。本发明人进行了关于缓冲溶液对过氧化氢生成的影响的辐射研究，结果出乎意料。过氧化氢已知由于水辐射分解而形成，并有助于溶液中的蛋白缀合物的化学修饰。因此，过氧化氢的生成对产物的纯度和稳定性具有不合意的作用。图2显示了令人惊讶的观察结果，即与所有其它受试缓冲液相比，在柠檬酸盐缓冲液中用Co-60(10kGy)辐射的本发明的抗体HOPO缀合物溶液中测得较低量的过氧化氢。因此，本发明的制剂优选包含如本文所述的柠檬酸盐缓冲液。

[0043] 本发明人另外确立了关于本发明的制剂中的某些组分的联合作用的另一令人惊讶的发现。这仍涉及放射性标记的缀合物的稳定性。已经发现柠檬酸盐是最有效的缓冲液，令人惊讶地发现，通过添加PABA进一步改进这一作用。

[0044] 本发明的方法、配合物和制剂的关键组分是八齿螯合剂部分。关于钍离子与羟基吡啶酮配体的配合的最相关的先前研究作为WO2011/098611公开，并公开了与八齿的含HOPO配体配合的钍离子的相对易生成性。

[0045] 先前已知的钍螯合剂还包括多氨基多酸螯合剂，其包含直链、环状或支链的多氮杂烷骨架，具有附着在骨架氮处的酸性（例如羧烷基）基团。此类螯合剂的实例包括DOTA衍生物，如对异硫氰酸根合苄基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（p-SCN-Bz-DOTA），和DTPA衍生物，如对异硫氰酸根合苄基-二亚乙基三胺五乙酸（p-SCN-Bz-DTPA），前者是环状螯合剂，后者是直链螯合剂。

[0046] 先前已经例举了1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸的衍生物，但标准方法不能容易地用于用DOTA衍生物螯合钍。DOTA衍生物与金属一起加热有效地提供螯合物，但通常以低产量。在该程序的过程中存在至少一部分配体不可逆地变性的趋势。此外，由于其对不可逆变性的相对较高敏感性，通常必须避免靶向部分的附着，直到所有加热步骤完成。这增加了额外的化学步骤（包括所有必要的后处理和分离），其必须在发射α的钍同位素的衰变寿命期间进行。显然优选不以这种方式处理发射α的材料或者不以超过必要的程度产生相应的浪费。此外，制备缀合物花费的所有时间浪费一定比例的钍，其在这一制备期间会衰变。

[0047] 在所有方面中本发明的一个关键方面是式(I)或(II)的八齿螯合剂的使用：其中Rc是端基为羧酸基团的连接部分，如
[-CH2-Ph-N(H)-C(=O)-CH2-CH2-C(=O)OH]、
[-CH2-CH2-N(H)-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-3-CH2-CH2-C(=O)OH]或
[-(CH2)1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH]，其中Ph是亚苯基，优选对亚苯基。

[0048] 在某些先前的公开，如WO2013/167756、WO2013/167755和WO2013/167754中，附着到3,2-HOPO部分的N-原子上的甲基主要是增溶基团，如羟基或羟烷基（例如-CH2OH、-CH2-CH2OH、-CH2-CH2-CH2OH等）。这在较高溶解度方面具有某些优点，但是这样的螯合剂难以使用酰胺键连接至靶向部分。

[0049] 螯合部分可通过本领域中已知的方法形成，包括US 5,624,901（例如实施例1和2）和WO2008/063721中描述的方法（两者都经此引用并入本文）。

[0050] RC代表偶联部分。合适的部分包括烃基，如端基为羧酸基团的烷基或烯基。本发明人已经确定，例如通过本发明的方法，使用羧酸连接部分形成酰胺提供螯合剂和组织靶向部分之间的更稳定缀合。

[0051] 在本发明的最优选的实施方案中，将八齿配体连接到靶向部分的偶联部分(RC)选自[-CH2-Ph-N(H)-C(=O)-CH2-CH2-C(=O)OH]、
[-CH2-CH2-N(H)-C(=O)-(CH2-CH2-O)1-3-CH2-CH2-C(=O)OH]或
[-(CH2)1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH]，
其中Ph是亚苯基，优选对亚苯基。

[0052] 在一个优选实施方案中，RC是[-(CH2)1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH2)1-5-C(=O)OH]。在一个更优选的实施方案中，RC是[-(CH2)-对亚苯基-N(H)-C(=O)-(CH2)2-C(=O)OH]。

[0053] 高度优选的八齿螯合剂包括下式(III)和(IV)的那些：化合物(III)的合成描述在下文中并遵循下文描述的合成路线。

[0054] 本发明的方法的步骤a)可通过任何合适的合成路线进行。下文在下列实施例中给出合成方法的一些具体实例。这些方法提供具体实例，但其中例示的合成方法也可由本领域技术人员在一般意义上使用。如果上下文允许，实施例中例示的方法因此也意在作为一般公开内容适用于本发明的所有方面和实施方案。

[0055] 在本发明的所有方面中发射α的钍和八齿配体的配合物优选在不加热到高于60℃（例如不加热到高于50℃），优选不加热到高于38℃，和最优选不加热到高于25℃（如在20至38℃的范围内）的情况下形成或能够形成。典型范围可以是例如15至50℃或20至40℃。本发明的方法中的配合反应（部分c））可进行任何合理的时间，但这优选为1至120分钟，优选1至
60分钟，和更优选5至30分钟。

[0056] 另外优选在加入发射α的钍同位素227Th4+离子之前制备靶向部分和八齿配体的缀合物。因此本发明的产物优选通过用八齿配体和组织靶向部分的缀合物（组织靶向螯合剂）配合发射α的钍同位素（227Th4+离子）形成或能够形成。

[0057] 各种类型的靶向化合物可经由八齿螯合剂（包含如本文所述的偶联部分）与钍（例如钍-227）连接。

[0058] 通常，如本文所用，组织靶向部分是“肽”或“蛋白质”，是主要由在氨基酸组分之间的酰胺骨架形成的结构，其具有或没有二级和三级结构特征。

[0059] 根据本发明，可用通过酰胺键连接或可连接到如本文所述的组织靶向部分的靶向227
配合剂配合 Th。

[0060] 靶向部分通常具有100g/mol至数百万g/mol（特别是100g/mol至1百万g/mol）的分子量，并优选直接对疾病相关受体具有亲和力，和/或包含合适的预施用结合剂（例如生物素或抗生物素蛋白），其结合到在施用227Th前已靶向疾病的分子上。

[0061] 选择本发明的特异性结合剂（组织靶向部分）以靶向脯氨酰内肽酶FAP抗原。

[0062] 本发明的组织靶向部分包含与序列1、11或21之一具有序列一致性或相似性的肽链和与序列5、15或25之一具有序列一致性或相似性的肽链。

[0063] 序列相似性可被认为与提到的序列具有至少80%的序列相似性。优选的序列相似性可为至少90%、92%、95%、97%、98%或99%。序列相似性和/或一致性可使用来自University of Wisconsin的Genetics Computer Group Version 10 软件包的"BestFit"程序测定。该程序使用Smith和Waterman的local had 算法，缺省值为：空位产生罚分（Gap creation penalty）=8、空位延伸罚分（Gap extension penalty）=2、平均匹配=2.912、平均错配2.003。

[0064] 本发明的组织靶向部分代表ESC11及其变体。已经生成更接近人类种系序列并已优化以避免可能对制造至关重要的氨基酸的几种ESC11变体（参见图1和表1）。表1: SEQ ID NO与蛋白质（PRT）的TPP-ID和相关序列特征（抗体的重链和轻链、可变区、互补决定区（CDR））的相关性。

[0065] 图1显示本发明的优选抗FAP抗体的注释序列。提供了IgG1的重链和轻链以及所选抗体的VH和VL区的蛋白质序列。在序列下方注释重要区域（全长IgG中的VH和VL区，和CDR区（H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3））。

[0066] 图2显示如表1中所述的单序列。

[0067] 在一个优选实施方案中，组织靶向部分包含与序列1、11或21的任一种具有98%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链和与序列5、15或25的任一种具有98%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0068] 在一个更优选的实施方案中，组织靶向部分包含与序列1、11或21的任一种具有99%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链和与序列5、15或25的任一种具有99%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0069] 在另一优选实施方案中，组织靶向部分包含与序列1具有序列一致性的肽链和与序列5具有98%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0070] 在一个更优选的实施方案中，组织靶向部分包含与序列1具有序列一致性的肽链和与序列5具有99%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0071] 在另一优选实施方案中，组织靶向部分包含与序列1具有序列一致性的肽链和与序列15具有98%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0072] 在一个更优选的实施方案中，组织靶向部分包含与序列1具有序列一致性的肽链和与序列15具有99%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0073] 在另一优选实施方案中，组织靶向部分包含与序列1具有序列一致性的肽链和与序列25具有98%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0074] 在一个更优选的实施方案中，组织靶向部分包含与序列1具有序列一致性的肽链和与序列25具有99%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0075] 在另一优选实施方案中，组织靶向部分包含与序列11具有序列一致性的肽链和与序列5具有98%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0076] 在一个更优选的实施方案中，组织靶向部分包含与序列11具有序列一致性的肽链和与序列5具有99%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0077] 在另一优选实施方案中，组织靶向部分包含与序列11具有序列一致性的肽链和与序列15具有98%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0078] 在一个更优选的实施方案中，组织靶向部分包含与序列11具有序列一致性的肽链和与序列15具有99%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0079] 在另一优选实施方案中，组织靶向部分包含与序列11具有序列一致性的肽链和与序列25具有98%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0080] 在一个更优选的实施方案中，组织靶向部分包含与序列11具有序列一致性的肽链和与序列25具有99%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0081] 在另一优选实施方案中，组织靶向部分包含与序列21具有序列一致性的肽链和与序列5具有98%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0082] 在一个更优选的实施方案中，组织靶向部分包含与序列21具有序列一致性的肽链和与序列5具有99%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0083] 在另一优选实施方案中，组织靶向部分包含与序列21具有序列一致性的肽链和与序列15具有98%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0084] 在一个更优选的实施方案中，组织靶向部分包含与序列21具有序列一致性的肽链和与序列15具有99%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0085] 在另一优选实施方案中，组织靶向部分包含与序列21具有序列一致性的肽链和与序列25具有98%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0086] 在一个更优选的实施方案中，组织靶向部分包含与序列21具有序列一致性的肽链和与序列25具有99%或更大的序列相似性或具有一致性的肽链。

[0087] 本发明的脯氨酰内肽酶FAP的抗体可通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核酸序列来制备。为了重组表达抗体、抗原结合部分或其变体，可用一种或多种携带编码轻链和/或重链或其部分的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，以在宿主细胞中表达轻链和重链。使用标准的重组DNA方法制备和/或获得编码重链和轻链的核酸、将这些核酸并入重组表达载体中和将载体引入宿主细胞，例如Sambrook, Fritsch和Maniatis (eds.), Molecular Cloning；A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M.等人(eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)和Boss等人的美国专利No. 4,816,397中描述的那些。

[0088] 此外，编码重链和/或轻链的可变区的核酸序列可转化成例如编码全长抗体链、Fab片段的核酸序列，或转化成scFv。编码VL或VH的DNA片段可有效地连接（使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列符合读框）到编码例如抗体恒定区或柔性连接体的另一DNA片段。人重链和轻链恒定区的序列是本领域中已知的（参见例如Kabat, E. A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242），并可通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。

[0089] 为了建立编码scFv的多核苷酸序列，可将编码VH和VL的核酸有效地连接到编码柔性连接体的另一片段，以使VH和VL序列可作为相连的单链蛋白表达，其中通过柔性连接体连接VL和VH区（参见例如Bird等人(1988) Science 242:423-426；Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty等人, Nature (1990) 348:552-554）。

[0090] 为了表达抗体、其抗原结合片段或其变体，可以使用标准重组DNA表达方法（参见，例如，Goeddel；Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)）。例如，可将编码所需多肽的DNA插入表达载体中，然后将其转染到合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞是原核细胞和真核细胞。原核宿主细胞的实例是例如细菌，真核宿主细胞的实例是酵母、昆虫和昆虫细胞、植物和植物细胞、转基因动物或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，将编码重链和轻链的DNA插入分开的载体中。在另一些实施方案中，将编码重链和轻链的DNA插入同一载体中。要理解的是，表达载体的设计，包括调节序列的选择受如下因素影响：例如宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平以及表达是组成型还是诱导型的。

[0091] 通过与合适的翻译起始和终止信号（与功能启动子处于可操作读取阶段（operable reading phase））一起插入编码所需蛋白的DNA序列，构建可用于细菌用途的表达载体。该载体包含一种或多种表型选择性标记和复制起点，以确保载体的维持，和如果需要，提供在宿主内的扩增。用于转化的合适原核宿主包括但不限于大肠杆菌（E. coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），和假单胞菌属（Pseudomonas）、链霉菌属（Streptomyces）和葡萄球菌属（Staphylococcus）内的各种物种。

[0092] 细菌载体可以例如基于噬菌体、基于质粒或基于噬菌粒。这些载体可含有选择性标记和源自通常含有公知的克隆载体pBR322（ATCC 37017）的单元（elements）的市售质粒的细菌复制起点。在合适的宿主菌株转化和宿主菌株生长到适当的细胞密度后，通过适当的手段（例如，温度变换或化学诱导）去阻遏/诱导所选启动子，并将细胞培养另一时期。通常通过离心收获细胞，通过物理或化学手段破坏，并保留所得粗提取物以供进一步纯化。

[0093] 在细菌系统中，可有利地选择许多表达载体，取决于表达的蛋白质的预期用途。例如，当要生产大量的这种蛋白时，为了生成抗体或为了筛选肽库，例如，指导容易纯化的融合蛋白产物的高水平表达的载体可能是合意的。

[0094] 本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体包括天然纯化产物、化学合成程序的产物和由原核宿主，包括例如大肠杆菌（E. coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），和假单胞菌属（Pseudomonas）、链霉菌属（Streptomyces）和葡萄球菌属（Staphylococcus）内的各种物种，优选由大肠杆菌细胞通过重组技术制成的产物。

[0095] 用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒单元，如源自下列的启动子和/或增强子：巨细胞病毒（CMV）（如CMV启动子/增强子）、猿猴病毒40（SV40）（如SV40启动子/增强子）、腺病毒（例如腺病毒主要晚期启动子（AdMLP））和多瘤病毒。抗体的表达可以是组成型或调节型的（例如可通过添加或除去小分子诱导物，如与Tet系统结合的四环素诱导）。关于病毒调节单元及其序列的进一步描述，参见例如Stinski的U.S. 5,168,062、Bell等人的U.S. 4,510,245和Schaffner等人的U.S. 4,968,615。重组表达载体还可包括复制起点和可选择性标记（参见例如U.S. 4,399,216、
4,634,665和U.S. 5,179,017）。合适的可选择性标记包括赋予对药物，如G418、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素、zeocin/博来霉素或甲氨蝶呤的抗性的基因，或在已引入载体的宿主细胞上利用营养缺陷型的可选择性标记，如谷氨酰胺合成酶（Bebbington等人,
Biotechnology (N Y).1992年2月；10(2):169-75）。例如，二氢叶酸还原酶（DHFR）基因赋予对甲氨蝶呤的抗性，neo基因赋予对G418的抗性，来自土曲霉（Aspergillus terreus）的bsd基因赋予对杀稻瘟素的抗性，嘌呤霉素N-乙酰转移酶赋予对嘌呤霉素的抗性，Sh ble基因产物赋予对zeocin的抗性，并且大肠杆菌潮霉素抗性基因（hyg或hph）赋予对潮霉素的抗性。可选择性标记如DHFR或谷氨酰胺合成酶也可与MTX和MSX结合用于扩增技术。

[0096] 可以使用标准技术将表达载体转染到宿主细胞中，如电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、脂质转染、基于聚阳离子的转染如基于聚乙烯亚胺（PEI）的转染和DEAE-葡聚糖转染。

[0097] 用于表达本文中提供的抗体、其抗原结合片段或其变体的合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢（CHO细胞），如CHO-K1、CHO-S、CHO-K1SV [包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220和Urlaub等人, Cell. 1983年6月; 33(2):405-12，与例如如R. J. Kaufman和P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621中描述的DHFR可选择性标记；和Fan等人,Biotechnol Bioeng. 2012年4月; 109(4):1007-15中列举的其它敲除细胞一起使用]、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、HEK293细胞、HKB11细胞、BHK21细胞、CAP细胞、EB66细胞和SP2细胞。

[0098] 在表达系统，如HEK293、HEK293T、HEK293-EBNA、HEK293E、HEK293-6E、HEK293-Freestyle、HKB11、Expi293F、293EBNALT75、CHO Freestyle、CHO-S、CHO-K1、CHO-K1SV、CHOEBNALT85、CHOS-XE、CHO-3E7或CAP-T细胞中，表达也可能是瞬时或半稳定的（例如Durocher等人, Nucleic Acids Res. 2002年1月15日；30(2):E9）。

[0099] 在一些实施方案中，设计表达载体以使表达的蛋白质分泌到用于生长宿主细胞的培养基中。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体、其抗原结合片段或其变体。

[0100] 可以通过公知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体，包括但不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A色谱法、蛋白G色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法、混合模式色谱法和凝集素色谱法。高效液相色谱法（“HPLC”）也可用于纯化。参见例如，Colligan, Current Protocols in Immunology, 或Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自全文经此引用并入本文。

[0101] 本发明的抗体或其抗原结合片段或其变体包括天然纯化产物、化学合成程序的产物和由真核宿主，包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞通过重组技术制成的产物。根据重组生产程序中所用的宿主，本发明的抗体可以是糖基化的或可以是非糖基化的。这样的方法描述在许多标准实验室手册中，例如Sambrook，同上，第17.37-17.42节；
Ausubel，同上，第10、12、13、16、18和20章。

[0102] 在优选实施方案中，将抗体纯化(1)至大于95重量%的抗体，例如通过Lowry方法、UV-Vis光谱法或通过SDS-毛细管凝胶电泳（例如在Caliper LabChip GXII，GX 90或Biorad Bioanalyzer装置上）测定，和在进一步优选的实施方案中大于99重量%，(2)至足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)在使用考马斯蓝或优选银染色的还原或非还原条件下通过SDS-PAGE至同质性。分离的天然存在的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。但是，通常通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。

[0103] 关于发射α的钍组分，一个关键的最近发现在于，227Th可以既治疗有效又不产生不可忍受的骨髓毒性的量施用。本文所用的术语“可接受地非骨髓毒性的”用于表明，最重要地，由施用的钍-227放射性同位素的衰变产生的镭-223的量通常不足以将对象直接致死。但是，技术人员清楚的是，作为这种治疗的可接受的副作用的骨髓损伤的量（和致死反应的概率）随所治疗的疾病类型、治疗方案的目标和对象的预后而显著变化。尽管本发明的优选对象是人，但其它哺乳动物，特别是伴侣动物如狗，将受益于本发明的使用，并且可接受的骨髓损伤水平也可反映对象的物种。在恶性疾病的治疗中，可接受的骨髓损伤水平通常高于非恶性疾病。骨髓毒性水平的一种众所周知的测量是嗜中性粒细胞计数，并且在本发明中，可接受地非骨髓毒性的223Ra量通常是受控的量，以使其最低点（lowest point（nadir））
223
的嗜中性粒细胞分数不小于治疗前计数的10%。优选地，可接受地非骨髓毒性的 Ra量是使得嗜中性粒细胞分数在最低点为至少20%、和更优选至少30%的量。至少40%的最低点嗜中性粒细胞分数最优选。

[0104] 此外，当包括干细胞支持或相当的恢复方法时，含放射性227Th的化合物可用于生成的223Ra的骨髓毒性原本通常不可忍受的高剂量方案。在这样的情况下，嗜中性粒细胞计数可降至在最低点低于10%，并且如果采取合适的预防措施并给予随后的干细胞支持，特别降至5%或如果必要低于5%。这些技术是本领域中公知的。

[0105] 钍-227相对容易生产并可间接地由中子辐射的226Ra制备，其含有227Th的母体核素，即227Ac（T1/2 = 22年）。锕-227可以相当容易地与226Ra靶分离并用作227Th的发生剂。如果需要，该过程可规模化至工业规模，因此可避免对被视为用于分子靶向放射疗法的候选者的大多数其它α-发射体所见的供应问题。

[0106] 钍-227可以足以提供合意治疗效果而不产生如此多的镭-223以造成不可忍受的骨髓抑制的量施用。希望将子体同位素保持在靶向区域中，以可从它们的衰变中得到进一步的治疗效果。但是，为了具有有用的治疗效果而不引起不可接受的骨髓毒性，不是必须保持钍衰变产物的控制。

[0107] 假设肿瘤细胞杀伤效应将主要来自钍-227而非来自其子体，可以通过与其它α发射体比较来确定这种同位素的可能治疗剂量。例如，对于砹-211，在动物中的治疗剂量通常为2-10 MBq/kg。通过针对半衰期和能量校正，钍-227的相应剂量为每公斤体重至少36-200 227
kBq。这设定可在对治疗效果的期望下有用地施用的 Th量的下限。这种计算假定砹和钍的保留相当。但是，显然钍的18.7天半衰期最有可能导致在其衰变之前更多地消除这一同位素。因此，这一计算的剂量通常应被认为是最小有效量。以完全保留的227Th表示的治疗剂量（即，未从身体中消除的227Th）通常为至少18或25 kBq/kg，优选至少36 kBq/kg，和更优选至少75 kBq/kg，例如100 kBq/kg或更大。更大量的钍预计具有更大的治疗效果，但如果产生不可忍受的副作用，则不能施用。同样地，如果钍以具有短生物半衰期的形式（即从仍然携带钍的身体中消除前的半衰期）施用，治疗效果需要更大量的放射性同位素，因为大量的钍在其衰变前消除。但是，产生的镭-223的量相应减少。当同位素被完全保留时，要施用的钍-
227的上述量容易与具有较短生物半衰期的等效剂量相关联。这样的计算是本领域中公知的并在WO 04/091668中给出（例如在实施例1和2的描述中）。

[0108] 如果放射性标记的化合物释放子体核素，重要的是知道任何放射性子体核素的命运（fate）（如果适用）。对于227Th，主要子体产物是223Ra，由于其趋骨性质，其正在临床评估中。镭-223非常快速地从血液清除并浓缩在骨骼中或经由肠和肾脏途径排泄（参见Larsen, J Nucl Med 43(5, Supplement): 160P (2002)）。因此在体内由227Th释放的镭-223可在很大程度上不影响健康的软组织。在Müller在Int. J. Radiat. Biol. 20:233-243 (1971)中对227Th作为溶解的柠檬酸盐的分布的研究中，发现由软组织中的227Th生成的223Ra容易重新分布到骨中或被排泄。因此，发射α的镭的已知毒性，特别是对骨髓的毒性，是伴随钍剂量的一个问题。

[0109] 在WO 04/091668中首次确定，实际上，可在人类对象中施用和耐受至少200 kBq/kg的223Ra剂量。这些数据呈现在该公开中。因此，现在可以看出，相当出乎意料地，确实存在治疗窗口，在其中可给药于哺乳动物对象治疗有效量的227Th（如大于36 kBq/kg）并预期该对象不会遭受严重或甚至致命骨髓毒性的不可接受的风险。尽管如此，极其重要的是充分利用这一治疗窗口，因此必须快速且有效地配合放射性钍，并以极高的亲和力保持，以将尽可能最大比例的剂量递送到靶点。

[0110] 由227Th药物生成的223Ra的量取决于放射性标记的化合物的生物半衰期。理想的情况是使用具有快速的肿瘤摄取，包括内化到肿瘤细胞中，强的肿瘤保留和在正常组织中的短生物半衰期的配合物。但是，具有低于理想的生物半衰期的配合物可以是有用的，只要将223Ra的剂量保持在可耐受水平内。体内生成的镭-223的量是施用的钍量和钍配合物的生物保留时间的因素。普通技术人员容易计算在任何特定情况下生成的镭-223的量。227Th的最大可施用量取决于体内生成的镭量，并且必须小于产生不可忍受的副作用水平，特别是骨髓毒性的量。该量通常小于300kBq/kg，特别是小于200kBq/kg，和更优选小于170kBq/kg（例如小于130kBq/kg）。最小有效剂量取决于钍的细胞毒性、患病组织对生成的α辐射的敏感性和钍被靶向配合物（在这种情况下是配体和靶向部分的组合）有效组合、保持和递送的程度。

[0111] 在本发明的方法中，钍配合物理想地以18至400 kBq/kg体重，优选36至200 kBq/kg（如50至200 kBq/kg），更优选75至170 kBq/kg，尤其是100至130 kBq/kg的钍-227剂量施用。相应地，单剂量可包括大约这些范围的任一个乘以合适的体重，如30至150 Kg，优选40至100 Kg（例如每剂540 kBq至4000 KBq的范围等）。此外，钍剂量、配合剂和施用途径理想地使得体内生成的镭-223剂量小于300 kBq/kg，更优选小于200 kBq/kg，再更优选小于150 kBq/kg，尤其是小于100 kBq/kg。这仍提供通过将这些范围乘以指示的任一体重而指示的223Ra暴露。上述剂量水平优选是227Th的完全保留剂量，但考虑到一些227Th在其衰变前从身体中清除，其可为施用剂量。

[0112] 如果227Th配合物的生物半衰期比物理半衰期短（例如小于7天，尤其是小于3天），可能需要显著更大的施用剂量以提供等效的保留剂量。因此，例如，150 kBq/kg的完全保留剂量等效于以711 kBq/kg的剂量施用的具有5天半衰期的配合物。可使用本领域中公知的方法由配合物的生物清除率计算任何适当的保留剂量的等效施用剂量。

[0113] 由于一个227Th核的衰变提供一个223Ra原子，227Th的保留和治疗活性直接与患者遭受的223Ra剂量相关联。可以使用公知的方法计算在任何特定情况下生成的223Ra的量。

[0114] 在一个优选实施方案中，本发明因此提供一种治疗哺乳动物对象的疾病（如本文所述）的方法，所述方法包括给药于所述对象治疗有效量的至少一种如本文所述的组织靶向钍配合物。

[0115] 显然希望使对象最小化暴露于223Ra子体同位素，除非有用地利用其性质。特别地，体内生成的镭-223的量通常大于40 kBq/kg，例如大于60 kBq/Kg。在一些情况下，体内生成的223 Ra必须大于80 kBq/kg，例如大于100或115 kBq/kg。

[0116] 在适当的载体溶液中的钍-227标记的缀合物可作为单次给药或在分次给药（fractionated application）方案中静脉内、腔内（例如腹膜内）、皮下、口服或局部给药。优选地，与靶向部分缀合的配合物作为溶液通过胃肠外（例如经皮）途径，尤其是静脉内或通过腔内途径给药。优选将本发明的组合物配制在无菌溶液中以用于胃肠外给药。

[0117] 本发明的方法和产品中的钍-227可独自使用或与其它治疗方式，包括外壳手术、外束放射疗法、化学疗法、其它放射性核素或组织温度调节等组合使用。这构成本发明的方法的另一优选实施方案，并且制剂/药剂可相应地包含至少一种附加治疗活性剂，如另一放射性试剂或化学治疗剂。

[0118] 在一个特别优选的实施方案中，还向对象施以干细胞治疗和/或其它支持疗法以减少镭-223诱导的骨髓毒性的效应。

[0119] 本发明的钍（例如钍-227）标记的分子可通过靶向疾病相关受体而用于治疗癌性或非癌性疾病。通常，227Th的这种医学应用通过放射免疫疗法，其基于通过螯合剂将227Th连接到抗体、抗体片段、或抗体或抗体片段的构建体以治疗癌性或非癌性疾病。227Th在根据本发明的方法和制剂中的使用特别适合治疗乳腺癌、胃癌、卵巢癌、非小细胞肺癌（NSCLC）和子宫癌。

[0120] 在本发明的另一实施方案中，可通过227Th和由施用的钍在体内生成的223Ra治疗既有软组织疾病又有骨骼疾病的患者。在这一特别有利的方面中，该治疗的额外治疗组分源自通过靶向骨骼疾病的可接受地非骨髓毒性量的223Ra。在这一治疗方法中，通常利用227Th通过适当靶向它们来治疗软组织的原发性和/或转移性癌症，并且利用由227Th衰变生成的223Ra治疗同一对象的相关骨骼疾病。这种骨骼疾病可以是由原发性软组织癌症引起的向骨骼的转移，或可以是原发性疾病，其中软组织治疗是要对抗转移性癌症。有时，软组织疾病和骨骼疾病可能不相关（例如另外治疗具有风湿病软组织疾病的患者中的骨骼疾病）。

[0121] 下面提供一些示例性合成。这些合成中所示的步骤适用于本发明的许多实施方案。在本文中描述的许多或所有实施方案中，步骤a)例如可经由下示中间体AGC0021进行。

[0122] AGC0020关键中间体的合成N,N,N',N'-四(2-氨基乙基)-2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二胺
a) 丙二酸二甲酯，氢化钠，THF，b) DIBAL-H，THF，c) MsCl，NEt3，CH2Cl2 ，d) 咪唑，Boc2O，CH2Cl2，甲苯，e) DIPEA，乙腈，f) MeOH，水，AcCl。

[0123] AGC0021关键中间体的合成3-(苄氧基)-1-甲基-4-[(2-硫代-1,3-噻唑烷-3-基)羰基]吡啶-2(1H)-酮
a) 草酸二乙酯，乙醇钾、甲苯，EtOH，b) Pd/C，对二甲苯，c) Mel，K2CO3，DMSO，丙酮，d) i)BBr3，DCM，ii) BnBr，K2CO3，Kl，丙酮，e) NaOH，水，MeOH，f) ，DCC，DMAP，DCM。

[0124] 式(VIII)的化合物的螯合物的合成4-{[4-(3-[双(2-{[(3-羟基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)羰基]氨基}乙基)氨基]-2-{[双(2-{[(3-羟基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-基)羰基]氨基}乙基)氨基]甲基}丙基)苯基]氨基}-4-氧代丁酸
在本发明的配合物的形成方法中，优选在水溶液中进行八齿螯合剂和组织靶向部分之间的偶联反应。这具有几个优点。首先，其消除了制造商脱除所有溶剂到低于可接受的水平并证明该脱除的负担。其次，减少浪费，最重要地，通过避免分离或脱除步骤而加速生产。在本发明的放射性药物的背景下，重要的是尽可能快地进行合成，因为放射性同位素会一直衰变，并且在制备中花费的时间浪费有价值的材料并引入污染性的子体同位素。

[0125] 合适的水溶液包括纯净水和缓冲液，如本领域中公知的许多缓冲液的任一种。乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐（例如PBS）和磺酸盐缓冲液（如MES）是公知的水性缓冲液的典型实例。

[0126] 在一个实施方案中，该方法包括形成八齿的含羟基吡啶酮配体的第一水溶液（如本文通篇所述）和组织靶向部分的第二水溶液（如本文通篇所述），并使所述第一和所述第二水溶液接触。

[0127] 上文详细论述了合适的偶联部分，并且在本文中作为偶联和/或连接基团论述的所有基团和部分可适当地用于将靶向部分偶联到配体。一些优选的偶联基团包括酰胺、酯、醚和胺偶联基团。可方便地通过由羧酸生成活化酯基团而形成酯和酰胺。这样的羧酸可存在于靶向部分上、偶联部分上和/或配体部分上，并通常与醇或胺反应形成酯或酰胺。这些方法是本领域中公知的，并且可利用公知的活化试剂，包括N-羟基马来酰亚胺、碳二亚胺和/或偶氮二甲酸酯活化试剂，如DCC、DIC、EDC、DEAD、DIAD等。

[0128] 在一个优选实施方案中，包含四个在N-位置被甲基烷基取代的羟基吡啶酮部分和端基为羧酸基团的偶联部分的八齿螯合剂可使用至少一种偶联试剂（如本文中描述的那些的任一种）和活化剂如N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化，由此形成八齿螯合剂的NHS酯。这种活化的（例如NHS）酯可以分离或无分离地用于偶联到具有游离胺基团（如在赖氨酸侧链上）的任何组织靶向部分。另一些活化的酯是本领域中公知的，并且可以是有效离去基团如氟化基团、甲苯磺酸酯基（tosylates）、甲磺酸酯基（mesylates）、碘（iodide）等的任何酯。但是NHS酯是优选的。

[0129] 偶联反应优选经过较短的时期和在大约环境温度下进行。用于1步或2步偶联反应的典型时间为大约1至240分钟，优选5至120分钟，更优选10至60分钟。用于偶联反应的典型温度为0至90℃，优选15至50℃，更优选20至40℃。大约25℃或大约38℃是适当的。

[0130] 通常在不会不利地（或至少非不可逆地）影响靶向部分的结合能力的条件下将八齿螯合剂偶联到靶向部分。由于结合剂通常是基于肽或蛋白质的部分，这需要比较温和的条件以避免变性或二级/三级结构的损失。水性条件（如本文在所有上下文中讨论）是优选的，并且理想的是避免极端pH和/或氧化还原。因此步骤b)可在3至10之间，优选4至9之间，更优选4.5至8之间的pH下进行。在氧化还原方面是中性的或非常温和地还原以避免在空气中氧化的条件是合意的。

[0131] 适于本发明的所有方面的优选组织靶向螯合剂是如本文所述的AGC0018。AGC0018与227Th的离子的配合物构成本发明的配合物和相应制剂、用途、方法等的一个优选实施方案。可用于本发明的所有这些方面的另一些优选实施方案包括与组织靶向部分（如本文所述）（包括对脯氨酰内肽酶FAP具有结合亲和力的单克隆抗体）缀合的AGC0019的227Th配合物。

[0132] 现在通过下列非限制性实施例例示本发明。实施例中例举的所有化合物构成本发明的优选实施方案（包括优选中间体和前体），并可在上下文允许情况下在任何方面中独立使用或以任何组合使用。

[0133] 实施例1式(III)的化合物的合成
实施例1.1
2-(4-硝基苄基)丙二酸二甲酯的合成
在0℃下将氢化钠（60%分散体，11.55克，289毫摩尔）悬浮在450毫升四氢呋喃（THF）中。
经大约30分钟逐滴加入丙二酸二甲酯（40.0毫升，350毫摩尔）。将反应混合物在0℃下搅拌
30分钟。在0℃下经大约30分钟逐滴加入溶解在150毫升THF中的4-硝基苄基溴（50.0克，231毫摩尔），然后在环境温度下2小时。

[0134] 加入500毫升乙酸乙酯（EtOAc）和250毫升NH4Cl（饱和水溶液），然后过滤溶液。分离各相。水相用2*250 mL EtOAc萃取。合并有机相，用250毫升盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下除去溶剂。

[0135] 将300毫升庚烷和300毫升甲基叔丁基醚（MTBE）添加到残留物中并加热至60℃。过滤该溶液。将滤液置于冰箱中整夜并过滤。滤饼用200毫升庚烷洗涤并减压干燥，产生灰白色固体形式的标题化合物。

[0136] 实施例1.22-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二醇的合成
在0℃下将2-(4-硝基苄基)丙二酸二甲酯（28.0克，104.8毫摩尔）溶解在560毫升THF中。在0℃下经大约30分钟逐滴加入二异丁基氢化铝（DIBAL-H）（1M在己烷中，420毫升，420毫摩尔）。将反应混合物在0℃下搅拌2小时。

[0137] 在0℃下将20毫升水逐滴添加到反应混合物中。在0℃下将20毫升NaOH（aq，15%）逐滴添加到反应混合物中，然后将20毫升水逐滴添加到反应混合物中。该混合物在0℃下搅拌20分钟，然后加入大约150克MgSO4。该混合物在室温下搅拌30分钟，然后在布氏漏斗上过滤。滤饼用500毫升EtOAc洗涤。取出滤饼并用800毫升EtOAc和200毫升MeOH搅拌大约30分钟，然后过滤溶液。合并滤饼并减压干燥。

[0138] 在二氧化硅上使用EtOAc/庚烷的梯度，接着MeOH/EtOAc的梯度的DFC产生浅黄色固体形式的标题化合物。

[0139] 实施例1.32-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基二甲磺酸酯的合成
在0℃下将2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二醇（15.3克，72.4毫摩尔）溶解在150毫升CH2Cl2中。加入三乙胺（23毫升，165毫摩尔），然后经大约15分钟逐滴加入甲磺酰氯（12毫升，
155毫摩尔），然后在环境温度下搅拌1小时。

[0140] 加入500毫升CH2Cl2，该混合物用2*250毫升NaHCO3（饱和水溶液）、125毫升HCl（aq, 0.1 M）和250毫升盐水洗涤。有机相经Na2SO4干燥，过滤并减压干燥，产生橙色固体形式的标题化合物。

[0141] 实施例1.4(氮烷二基双(乙烷-2,1-二基))二氨基甲酸二叔丁酯的合成
在室温下将咪唑（78.3克，1.15摩尔）悬浮在500毫升CH2Cl2中。逐份加入二碳酸二叔丁酯（Boc2O）（262.0克，1.2摩尔）。将反应混合物在室温下搅拌1小时。反应混合物用3*750 mL水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下除去挥发物。

[0142] 将残留物溶解在250毫升甲苯中并加入二亚乙基三胺（59.5毫升，550毫摩尔）。将反应混合物在60℃下搅拌2小时。

[0143] 加入1升CH2Cl2，有机相用2*250毫升水洗涤。有机相经Na2SO4干燥，过滤并在减压下缩减。

[0144] 在二氧化硅上使用含三乙胺的甲醇（MeOH）/CH2Cl2的梯度的DFC产生无色固体形式的标题化合物。

[0145] 实施例1.5(((2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基)双(氮烷三基))四(乙烷-2,1-二基))四氨基甲酸四叔丁酯的合成
将2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基二甲磺酸酯（26.0克，71毫摩尔）和(氮烷二基双(乙烷-2,1-二基))二氨基甲酸二叔丁酯（76.0克，250毫摩尔）溶解在700毫升乙腈中。加入N,N-二异丙基乙基胺（43毫升，250毫摩尔）。将反应混合物在回流下搅拌4天。

[0146] 在减压下除去挥发物。

[0147] 在二氧化硅上使用EtOAc/庚烷的梯度的DFC产生浅黄色固体泡沫形式的标题化合物。

[0148] 实施例1.6N1,N1'-(2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基)双(N1-(2-氨基乙基)乙烷-1,2-二胺), AGC0020的合成
将(((2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基)双(氮烷三基))四(乙烷-2,1-二基))四氨基甲酸四叔丁酯（29.0克，37.1毫摩尔）溶解在950毫升MeOH和50毫升水中。在30℃下经大约20分钟逐滴加入乙酰氯（50毫升，0.7摩尔）。将反应混合物搅拌整夜。

[0149] 在减压下除去挥发物并将残留物溶解在250毫升水中。加入500毫升CH2Cl2，然后175毫升NaOH（aq, 5M, 用NaCl饱和）。分离各相，水相用4*250mL CH2Cl2萃取。合并有机相，经Na2SO4干燥，过滤并减压干燥，产生粘性红棕色油形式的标题化合物。

[0150] 实施例1.75-羟基-6-氧代-1,2,3,6-四氢吡啶-4-甲酸乙酯的合成
在室温下将2-吡咯烷酮（76毫升，1摩尔）和草酸二乙酯（140毫升，1.03摩尔）溶解在1升甲苯中。加入乙醇钾（EtOK）（24%在EtOH中，415毫升，1.06摩尔），并将反应混合物加热至90℃。

[0151] 由于反应混合物变稠，在反应的第一个小时的过程中逐滴加入200毫升EtOH。将反应混合物搅拌整夜并冷却至室温。在搅拌的同时缓慢加入210毫升HCl（5M, aq）。

[0152] 加入200毫升盐水和200毫升甲苯，并分离各相。

[0153] 水相用2x400 mL CHCl3萃取。将合并的有机相干燥（Na2SO4），过滤并在真空中缩减。残留物从EtOAc中重结晶，以产生浅黄色固体形式的标题化合物。

[0154] 实施例1.83-羟基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸乙酯的合成
将{5-羟基-6-氧代-1,2,3,6-四氢吡啶-4-甲酸乙酯}（23.00克，124.2毫摩尔）溶解在
150毫升对二甲苯中并加入碳载钯（10%，5.75克）。将反应混合物在回流下搅拌整夜。在冷却至室温后，该反应混合物用300毫升MeOH稀释并经短Celite®垫过滤。该垫用300毫升MeOH洗涤。在真空中除去溶剂，以产生浅红棕色固体形式的标题化合物。

[0155] 实施例1.93-甲氧基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸乙酯的合成
在室温下将{3-羟基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸乙酯}（119.2克，0.65摩尔）溶解在
600毫升二甲亚砜（DMSO）和1.8升丙酮中。加入K2CO（3 179.7克，1.3摩尔）。在室温下经大约1小时逐滴加入溶解在600毫升丙酮中的碘甲烷（MeI）（162毫升，321毫摩尔）。

[0156] 将反应混合物在室温下搅拌另外2小时，然后加入MeI（162毫升，2.6摩尔）。将反应混合物在回流下搅拌整夜。反应混合物在减压下缩减并加入2.5升EtOAc。

[0157] 过滤该混合物并在减压下缩减。通过在SiO2上使用EtOAc/庚烷的梯度的干柱快速色谱法（dry flash chromatography）（DFC）提纯产生标题化合物。

[0158] 实施例1.103-(苄氧基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸乙酯的合成
在-78℃下将{3-甲氧基-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸乙酯}（5.93克，28.1毫摩尔）溶解在80毫升二氯甲烷（DCM）中并逐滴加入溶解在20毫升DCM中的BBr3（5.3毫升，
56.2毫摩尔）。将反应混合物在-78℃下搅拌1小时，然后将该反应加热至0℃。通过逐滴加入
25毫升叔丁基甲基醚（tert-BuOMe）和25毫升MeOH猝灭反应。在真空中除去挥发物。将残留物溶解在90毫升DCM和10毫升MeOH中并经短SiO2垫过滤。该垫用200毫升10% MeOH/DCM洗涤。在真空中除去挥发物。将残留物溶解在400毫升丙酮中。加入K2CO3（11.65克，84.3毫摩尔）、KI（1.39克，8.4毫摩尔）和苄基溴（BnBr）（9.2毫升，84.3毫摩尔）。将反应混合物在回流下搅拌整夜。反应混合物用200毫升EtOAc稀释并用3x50毫升水和50毫升盐水洗涤。合并的水相用2x50毫升EtOAc萃取。将合并的有机相干燥（Na2SO4），过滤并在真空中除去挥发物，并通过在SiO2上使用在庚烷中的EtOAc（40 – 70%）作为洗脱剂的干柱快速色谱法提纯以产生标题化合物。

[0159] 实施例1.113-(苄氧基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸的合成
将{3-(苄氧基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸乙酯}（27.90克，97.1毫摩尔）溶解在250毫升MeOH中并加入60毫升NaOH（5M, aq）。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后将反应混合物在真空中浓缩至大约1/3。残留物用150毫升水稀释并用氯化氢（HCl）（5M, aq）酸化至pH 2。过滤沉淀物并在真空中干燥，以产生无色固体形式的标题化合物。

[0160] 实施例1.123-(苄氧基)-1-甲基-4-(2-硫代噻唑烷-3-羰基)吡啶-2(1H)-酮（AGC0021）的合成将{3-(苄氧基)-1-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-4-甲酸}（3.84克，14.8毫摩尔）、4-二甲基氨基吡啶（DMAP）（196毫克，1.6毫摩尔）和2-噻唑啉-2-硫醇（1.94克，16.3毫摩尔）溶解在50毫升DCM中。加入N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC）（3.36克，16.3毫摩尔）。将反应混合物搅拌整夜。过滤该反应，固体用DCM洗涤，滤液在真空中缩减。所得黄色固体从异丙醇/DCM中重结晶，以产生AGC0021。

[0161] 实施例1.13AGC0023的合成
将AGC0020（8.98克；23.5毫摩尔）溶解在CH2Cl2（600毫升）中。加入AGC0021（37.43克；
103.8毫摩尔）。将反应在室温下搅拌20小时。将反应混合物减压浓缩。

[0162] 在SiO2上使用在EtOAc和CH2Cl2的1:1混合物中的甲醇梯度的DFC产生固体泡沫形式的AGC0023。

[0163] 实施例1.14AGC0024的合成
将AGC0023（26.95克；20.0毫摩尔）溶解在乙醇（EtOH）（675毫升）中。加入铁（20.76克；
0.37摩尔）和NH4Cl（26.99克；0.50摩尔），接着加入水（67毫升）。将反应混合物在70℃下搅拌2小时。加入更多铁（6.75克；121毫摩尔）并将反应混合物在74℃下搅拌1小时。加入更多铁（6.76克；121毫摩尔），并将反应混合物在74℃下搅拌1小时。将反应混合物冷却，然后在减压下缩减反应混合物。

[0164] 在SiO2上使用甲醇/CH2Cl2梯度的DFC产生固体泡沫形式的AGC0024。

[0165] 实施例1.15AGC0025的合成
将AGC0024（18.64克；14.2毫摩尔）溶解在CH2Cl（2 750毫升）中并冷却至0℃。加入BBr3（50克；0.20摩尔）并将反应混合物搅拌75分钟。通过在0℃下搅拌的同时小心加入甲醇（MeOH）（130毫升）来猝灭反应。在减压下除去挥发物。将HCl（1.25M在EtOH中，320毫升）加入到残留物中。然后使用旋转蒸发器在大气压和环境温度下旋转烧瓶15分钟，然后在减压下除去挥发物。

[0166] 在无端盖的C18二氧化硅上使用乙腈（ACN）/水梯度的DFC产生浅橙色玻璃质固体形式的AGC0025。

[0167] 实施例1.16AGC0019的合成
在室温下将AGC0025（10.63克；11.1毫摩尔）溶解在ACN（204毫升）和水（61毫升）中。加入琥珀酸酐（2.17克；21.7毫摩尔）并将反应混合物搅拌2小时。反应混合物在减压下缩减。
在无端盖的C18二氧化硅上使用ACN/水梯度的DFC产生浅绿色玻璃质固体。

[0168] 在40℃下将该固体溶解在MeOH（62毫升）和水（10.6毫升）中。在声处理下将该溶液逐滴添加到EtOAc（750毫升）中。过滤沉淀物，用EtOAc洗涤并在减压下干燥，以产生具有浅绿色调的灰白色固体形式的AGC0019。

[0169] 实施例2纯钍-227的分离
从锕-227发生器中分离钍-227。通过镭-226的热中子辐射、随后镭-227（t1/2=42.2m）衰变成锕-227，产生锕-227。通过阴离子交换色谱法从在8 M HNO3 溶液中的锕-227衰变混®
合物中选择性保留钍-227。使用2 mm内径、长度30 mm的柱，其含有70毫克AG 1-X8树脂（200-400目，硝酸盐/酯形式（nitrate form））。在锕-227、镭-223和子体已从柱中洗脱后，用12 M HCl从柱中提取钍-227。将含有钍-227的洗脱液蒸发至干，并在标记步骤前将残留物再悬浮在0.01 M HCl中。

[0170] 实施例3实施例3.1
脯氨酰内肽酶FAP的单克隆抗体（AGC3200）的生成
在Geneart/Life Technologies（Regensburg，德国）合成含有本发明的IgG的氨基酸序列的DNA序列，并克隆到合适的表达载体中。所有基因都被密码子优化以用于CHO表达。使用NRC Canada的表达系统（Durocher等人, Nucleic Acids Res. 2002年1月15日; 30(2):
E9）在HEK293 6E细胞中瞬时表达IgG，或在稳定转染CHO-K1细胞后表达IgG。如上所述经由蛋白质A亲和色谱法和随后的尺寸排阻色谱法纯化抗体（Hristodorov等人, Mol Biotechnol (2013) 53:326–335）。

[0171] 实施例3.2 mAb AGC3200与螯合剂AGC0019（式(VIII)的化合物）偶联以产生缀合物AGC3218在缀合前，将磷酸盐缓冲液pH 7.5添加到抗体溶液（AGC3200）中以提高该溶液的缓冲能力。测定容器中的AGC3200（mAb）的量。

[0172] 向在PBS中的AGC3200中加入11% 1 M磷酸盐缓冲液pH 7.4。

[0173] 将螯合剂AGC0019溶解在1:1 DMA : 0.1 M MES缓冲液pH 5.4中。将NHS和EDC溶解在0.1 M MES缓冲液pH 5.4中。

[0174] 制备螯合剂 / N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) / 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的1 / 1 / 3摩尔当量溶液以活化螯合剂。

[0175] 为了缀合到抗体上，将8/8/25/1（螯合剂/NHS/EDC/mAb）摩尔比的活化螯合剂装载到mAb中。在20-40分钟后，用12% v/v 0.3M柠檬酸将pH调节至5.5以猝灭该缀合反应。

[0176] 通过在连向ÄKTA系统（GE Healthcare）的Superdex 200（GE Healthcare）柱上凝胶过滤，实施AGC3218缀合物的纯化和缓冲液交换到30 mM柠檬酸盐pH5.5，154mM NaCl中。测量Abs 280 nm处的蛋白质浓度，然后用缓冲液配制产物（以获得在30 mM柠檬酸盐、154 mM NaCl、2 mM EDTA、2 mg/ml pABA、pH 5.5中的2.5mg/mL AGC0118）。最后，在储存前将溶液经0.2 μm 过滤器过滤到无菌瓶中。

[0177] 实施例3.3用于227Th-AGC3218注射的剂量的制备
如上所述进行标记：
将一管瓶20 MBq钍-227氯化物膜溶解在2毫升8M HNO3溶液中并静置15分钟，然后取出溶液以施加到阴离子交换柱，以除去随时间已经产生的镭-223。用3毫升8M HNO3和1毫升水洗涤柱，然后用3毫升3M HCl洗脱钍-227。测量钍-227的洗脱活性，并将10 MBq的剂量转移到空的10毫升玻璃管瓶中。然后使用真空泵并使管瓶在加热块（设为120℃）中30-60分钟而蒸发酸。在达到室温后，加入用于放射性标记的6毫升AGC3218缀合物2.5mg/ml。将管瓶轻轻混合并在室温下静置15分钟。然后将溶液无菌过滤到无菌管瓶中，并取出样品以供iTLC分析，以在使用前测定RCP。

[0178] 实施例3.4227Th-AGC3218对FAP阳性细胞系、Hs68和U87-MG的细胞毒性和IC50测定
227
通过制备添加到细胞中5天培养时间的总活性的滴定曲线，测定 Th-AGC3218的细胞毒性。在实验前一天，在96孔板中每孔接种2000个Hs68或U87-MG细胞。向细胞中加入在三倍步骤（threefold steps）中稀释的螯合227Th-AGC3218，比活性40 kBq/µg，总活性的滴定为
1.1 x 10-4至20 kBq/ml。Hs68或U87-MG细胞分别在含有10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM和EMEM培养基中培养。在第5天，使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega)测量细胞活力。在GraphPad Prism 6软件中拟合该滴定曲线并测定IC50值。

[0179] 实施例4酰胺和异硫氰酸酯连接的缀合物的稳定性的比较
将AGC3218和具有异硫氰酸酯偶联部分的相应缀合物（AGC3215）在40℃下在水溶液中储存11天。定期取样。

[0180] 由此可以看出，对于酰胺偶联的缀合物，没有见到缀合物浓度的可测得的降低。相反地，异硫氰酸酯缀合物减少。

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治疗放射性肺炎的药物	2020-05-13	311
放射性药物的稳定化	2020-05-13	716
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