放射性药物络合物
阅读：953发布：2020-05-12
专利汇可以提供放射性药物络合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文公开了一种组织靶向络合物，其包含组织靶向部分、包含四个HOPO部分的含羟基吡啶 酮 的八齿配体以及α发射钍 放射性 核素的离子，其中所述四个HOPO部分中的至少一个在N位被羟基烷基增溶基团取代并且其中所述组织靶向部分具有对CD22受体的结合亲和 力 。本文提供了利用此类络合物的 治疗 方法和此类络合物的形成方法。，下面是放射性药物络合物专利的具体信息内容。
1.一种组织靶向络合物，其包含组织靶向部分、包含四个HOPO部分的含羟基吡啶酮的八齿配体以及α发射钍放射性核素的离子，其中所述四个HOPO部分中的至少一个在N位被羟基烷基增溶基团取代并且其中所述组织靶向部分具有对CD22受体的结合亲和力。
2.如权利要求1所述的络合物，其包含至少一个3,2-HOPO部分。
3.如权利要求1或权利要求2所述的络合物，其中全部4个HOPO部分包含在所述N位的羟基烷基增溶部分。
4.如权利要求1或权利要求2所述的络合物，其包含含有四个式I的螯合部分的八齿配体
其中R1为任选的N取代基增溶基团，其将存在于所述四个式I部分中的至少一个中；
基团R2至R6各自独立地选自H、OH、＝O、短烃基、连接子部分和/或偶联部分，其中R2至R6中的一个为OH并且R2至R6中的一个为＝O。
5.如权利要求4所述的络合物，其中基团R1至R6中的至少一个是连接子部分。
6.如权利要求4至5中任一项所述的络合物，其包含四个3,2-羟基吡啶酮部分。
7.如前述权利要求中任一项所述的络合物，其中在所述四个HOPO基团中的每一个上的N取代基各自独立地选自HO-、HOCH2-、HOCH2CH2-、HO-CH2CH2CH2-、HO-CH(CH3)CH2-、HO-CH2CH2CH2CH2-、HO-CH(CH3)CH2CH2-、HO-CH(CH2CH3)CH2-、HO-C(CH3)2CH2-、HO-CH(CH3)CH(CH3)-和HOCH2CH(CH2CH3)-。
8.如权利要求1至7中任一项所述的络合物，其中α发射钍放射性核素的所述离子是
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α发射钍放射性核素诸如 Th的4+离子。
9.一种如权利要求1至8中任一项所述的络合物，其包含式VI的配体部分：
其中RL是任何合适的连接子部分。
10.一种如前述权利要求中任一项所述的络合物，其中所述组织靶向部分是单克隆或多克隆抗体、抗体片段(诸如Fab、F(ab')2、Fab'或scFv)、或此类抗体和/或片段的构建体。
11.一种如前述权利要求中任一项所述的络合物，其中所述组织靶向部分包含与至少一个下列序列具有至少90％序列相似性的至少一条肽链：
轻链：
DIQLTQSPSSLAVSAGENVTMSCKSSQSVLYSANHKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISRVQVEDLAIYYCHQYLSSWTFGGGTKLEIKR(SeqID1)
DIQLTQSPSSLASAAVEDRTMSCKSSQSVLYSANHKNYLAWYQQKPGQKAKLLIYWALTRESGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCHQYLSSWTFGGGTKLEIKR(SeqID2)
重链：
QVQLQESGAELSKPGASVKMSCKASGYTFTSYWLHWIKQRPGQGLEWIGYINPRNDYTEYNQNFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRDITTFYWGQGTTLTVSS(SeqID3)
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWLHWVRQAPGQGLEWIGYINPRNDYTEYN
QNFKDKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAFYFCARRDITTFYWGQGTTVTVSS(SeqID4)QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWLHWVRQAPGQGLEWIGYINPRNDYTEYNQNFKDKATITADESTNTAYMELSSLRSEDTAFYFCARRDITTFYWGQGTTVTVSS(SeqID5)
12.一种组织靶向络合物用于制造供治疗增生性或肿瘤性疾病的药物的用途，所述组织靶向络合物包含组织靶向部分、包含四个HOPO部分的含羟基吡啶酮的八齿配体以及所述α发射钍放射性核素的离子，其中所述四个HOPO部分中的至少一个在所述N位被羟基烷基增溶基团取代并且其中所述组织靶向部分具有对CD22受体的结合亲和力。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述组织靶向络合物是如权利要求1至11中任一项所述的络合物。
14.如权利要求12或权利要求13所述的用途，其中所述疾病是癌瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤或混合型癌症，包括非霍奇金淋巴瘤或B细胞肿瘤。
15.一种治疗人或非人动物(特别是有需要者)的方法，其包括施用至少一种组织靶向络合物，所述组织靶向络合物包含组织靶向部分、包含四个HOPO部分的含羟基吡啶酮的八齿配体以及所述α发射钍放射性核素的离子，其中所述四个HOPO部分中的至少一个在所述N位被羟基烷基增溶基团取代，其中所述组织靶向部分具有对所述CD22受体的结合亲和力。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述组织靶向络合物是如权利要求1至11中任一项所述的络合物。
17.如权利要求15或权利要求16所述的方法，其用于治疗增生性和/或肿瘤性疾病，诸如癌瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤或混合型癌症，包括非霍奇金淋巴瘤或B细胞肿瘤。
18.一种如权利要求1至11中任一项所述的组织靶向络合物，其用于疗法中。
19.一种如权利要求18所述的组织靶向络合物，其用于治疗增生性和/或肿瘤性疾病，例如癌瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤或混合型癌症，包括非霍奇金淋巴瘤或B细胞肿瘤。
20.一种药物组合物，其包含组织靶向络合物以及至少一种药物载体或赋形剂，所述组织靶向络合物包含组织靶向部分、包含四个HOPO部分的含羟基吡啶酮的八齿配体以及所述α发射钍放射性核素的离子，其中所述四个HOPO部分中的至少一个在所述N位被羟基烷基增溶基团取代，其中所述组织靶向部分具有对所述CD22受体的结合亲和力。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其所包含的组织靶向络合物是如权利要求1至
11中任一项所述的络合物。
22.一种用于根据权利要求15至17中任一项所述的方法中的试剂盒，所述试剂盒包含与或可与包含四个HOPO部分的含羟基吡啶酮的八齿配体缀合的组织靶向部分，其中所述四个HOPO部分中的至少一个在所述N位被羟基烷基增溶基团取代并且其中所述组织靶向部分具有对所述CD22受体的结合亲和力，所述试剂盒任选地且优选地包括α发射钍放射
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性核素诸如 Th。
23.一种形成组织靶向络合物的方法，所述方法包括使组织靶向部分与含羟基吡啶酮的八齿配体在水溶液中偶联，所述络合物包含四个HOPO部分和所述α发射钍放射性核素的离子，其中所述四个HOPO部分中的至少一个在所述N位被羟基烷基增溶基团取代并且其中所述组织靶向部分具有对所述CD22受体的结合亲和力。
24.如权利要求23所述的方法，其包括制备含羟基吡啶酮的八齿配体的第一水溶液和所述组织靶向部分的第二水溶液并且使所述第一水溶液与所述第二水溶液接触。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述接触在低于40℃下进行。
26.如权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述接触在基本上不存在任何有机溶剂的情况下进行。
27.如权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所述偶联在所述螯合物与所述抗体之间产生酰胺、酯、醚或胺键。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述酯或酰胺键借助于至少一个活化酯基形成，例如借助于至少一个N-羟基马来酰亚胺、碳化二亚胺或偶氮二羧酸酯偶联试剂形成。
放射性药物络合物
技术领域
背景技术
[0002] 特异性细胞杀伤对于哺乳动物受试者中多种疾病的成功治疗可为必不可少的。这种情形的典型实例是恶性疾病如肉瘤和癌瘤的治疗。然而，选择性消除某些细胞类型在其它疾病，尤其是增生性和肿瘤性疾病的治疗中也可起到关键作用。
[0003] 目前选择性治疗的最常见方法是手术、化疗和外照射。然而，靶向放射性核素疗法是一种有潜力向有害的细胞类型递送高细胞毒性放射的有希望和正在发展中的领域。目前批准用于人的最常见形式的放射性药物使用β发射和/或γ发射放射性核素。然而，由于α发射放射性核素用于更特异性细胞杀伤的潜力，其在疗法中的使用已受到一些关注。
[0004] 典型的α发射体在生理环境中的放射范围一般小于100微米，仅相当于几个细胞直径。这使得这些源非常适合于肿瘤(包括微转移)的治疗，因为它们具有到达肿瘤内的邻近细胞的范围，但如果它们被准确靶向，则几乎没有放射能量将越过靶细胞。因此，并非每个细胞都需要被靶向，而对周围健康组织的损伤可降到最小(参见Feinendegen等,Radiat Res148:195-201(1997))。相比之下，β粒子在水中具有1mm或更大的范围(参见Wilbur,Antibody Immunocon Radiopharm 4:85-96(1991))。
[0005] 相比于由β粒子、γ射线和X射线所带的能量，α粒子放射的能量较高，通常为5-8MeV，或为β粒子的5至10倍以及γ射线的能量的20倍或更大。因此，大量能量在很短距离上的这种沉积使得α放射相比于γ和β放射具有异常高的线性能量转移(LET)、高的相对生物功效(RBE)和低的氧增强比(OER)(参见Hall,"Radiobiology for the radiologist",第五版,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia PA,USA,2000)。这解释了α发射放射性核素的异常细胞毒性并且还对此类同位素的生物靶向以及α发射放射性核素分布的控制水平和研究施加了严格要求，为避免不可接受的副作用，这是必要的。
[0006] 下表1示出了迄今为止在文献中尽可能宽泛提出的具有治疗功效的α发射体的物理衰变特性。
[0007] 表1
[0008]候选核素 T1/2* 临床测试用于
225Ac 10.0天 白血病
211At 7.2小时 胶质母细胞瘤
213Bi 46分钟 白血病
223Ra 11.4天 骨转移
224Ra 3.66天 强直性脊柱炎
225Ac 10.0天 白血病
211At 7.2小时 胶质母细胞瘤
213Bi 46分钟 白血病
223Ra 11.4天 骨转移
224Ra 3.66天 强直性脊柱炎
[0009] *半衰期
[0010] 迄今为止，关于在放射免疫疗法中的应用，主要注意力集中在211At、213Bi和225Ac，并且这三种核素已经被探索用于临床免疫疗法试验中。
[0011] 已经提出的若干种放射性核素是短寿命的，即具有小于12小时的半衰期。如此短的半衰期使得难以以商业方式生产和分配基于这些放射性核素的放射性药物。短寿命的核素的施用也增加了放射剂量的比例，所述放射剂量将在到达靶位点之前在体内发射。
[0012] 来自α发射的反冲能在许多情况下将造成子体核素从母体衰变位置释放。这种反冲能足以从例如其中母体与配体如螯合剂络合的可保持母体的化学环境中分裂出许多子体核素。即使其中子体与相同配体化学相容、即可与相同配体络合，这也将发生。同样，在子体核素是气体，特别是惰性气体如氡气，或者与配体化学不相容时，这种释放作用将甚至会更大。当子体核素具有超过几秒钟的半衰期时，它们可以扩散进入不受保持母体的配位剂约束的血液系统中。这些游离的放射性子体然后可造成不希望的全身毒性。
[0013] 几年前提出在其中维持223Ra子同位素的控制的条件下使用钍-227(T1/2＝18.7天)(参见WO 01/60417和WO 02/05859)。这是其中使用允许由封闭环境滞留子体核素的载体系统的情形。在一种情况下，放射性核素被配置在脂质体内并且大尺寸的脂质体(与反冲距离相比)有助于将子体核素滞留在脂质体内。在第二种情况下，使用放射性核素的趋骨性络合物，其并入骨基质中并因此限制了子体核素的释放。这些是潜在非常有利的方法，但脂质体的施用在一些情况下是不希望的，并且存在许多其中放射性核素不能被矿化基质包围以滞留子同位素的软组织疾病。
[0014] 最近，已确定在227Th衰变后释放的223Ra子核的毒性可相比于根据关于类似核的先前测试所预测在更大的程度上在哺乳动物体内耐受。在不存在上文讨论的滞留钍-227的镭子体的具体方式的情况下，关于镭毒性的可公开获得的信息使得清楚认识到，不可能使用钍-227作为治疗剂，这是因为从钍-227衰变实现治疗作用所需的剂量将产生来自镭子体衰变的高毒性且可能致命剂量的放射，即不存在治疗窗。
[0015] WO 04/091668描述一种意想不到的发现，即存在治疗性治疗窗，其中可向受试者(通常是哺乳动物)施用治疗有效量的靶向钍-227放射性核素而不产生足以造成不可接受的骨髓毒性的量的镭-223。这可因此用于治疗和预防在骨和软组织部位处所有类型的疾病。
[0016] 鉴于上述发展，现在有可能在内放射性核素疗法中使用α发射钍-227核而不具有由所生成的223Ra引起的致命骨髓毒性。然而，治疗窗保持相对较窄，并且在所有情况下希望向受试者施用不超过绝对必要量的α发射放射性同位素。如果α发射钍-227核可被络合并以高可靠性程度靶向，则这种新治疗窗的有效利用因此将会极大增强。
[0017] 因为放射性核素不断衰变，所以在分离与向受试者施用之间处理材料所花费的时间非常重要。如果α发射钍核可以快速且便于制备、优选需要很少步骤、短温育期和/或不会不可逆影响靶向实体的性质的温度的形式络合、靶向和/或施用，则其也将具有相当大的价值。此外，可在施用前无需去除的溶剂中(基本上在水溶液中)进行的工艺具有避免溶剂蒸发或渗析步骤的显著优点。
[0018] 鉴于在治疗中对于细胞毒性剂递送的选择性的需要，存在对于α放射性核素络合物的靶向的明显需要。然而，合适的螯合剂与小的靶向肽或小的蛋白质的缀合物倾向于在水性系统中显示不良溶解性，这是因为小的生物分子不能将不溶性螯合物保持在溶液中。不良溶解性导致聚集和沉淀。在待施用至人受试者的药物制剂中，聚集体是不可接受的，并且明显沉淀使得组合物完全不可用。
[0019] 此外，还对于较大的靶向肽/蛋白质，如单克隆抗体，螯合剂将作为疏水性‘点’暴露在缀合物的表面上。这在某些情况下可能会导致微聚集问题。
[0020] 在生物系统中，例如在人患者中，疏水性一般与肝脏中不希望的吸收有关。显然这对于高细胞毒性剂如α发射体比对于典型的药物化合物更为严重。螯合剂的疏水性也增加了免疫反应的风险，因为疏水性促进由宿主的免疫系统所产生抗体的更强结合。此外，由于α发射体的异常细胞毒性，其特别受到关注。因此显然非常需要通过具有增强的亲水性(特别是配体部分)的缀合物来选择性递送α发射钍放射性核素的方法，以解决一种或多种上文所讨论的问题。
[0021] 含有羟基吡啶酮基团的八齿螯合剂先前已显示适于配位α发射体钍-277，用于随后连接至靶向部分(WO2011098611)。描述了八齿螯合剂，其含有通过连接子基团接合至胺类骨架的四个3,2-羟基吡啶酮基团，所述胺类骨架具有用于缀合至靶向分子的单独反应性基团。先前发明的优选结构含有在杂环的1位中具有甲基取代氮的3,2-羟基吡啶酮基团，并且通过包括在4位连接的甲酸的胺键连接至胺类骨架，如由化合物ALG-DD-NCS、ALG1005-38、Bb-1-HOPO-1-DEBN所示。在其中这些含羟基吡啶酮的分子之一缀合至靶向肿瘤的抗体的实验中，将该分子溶解在有机溶剂DMSO中，因为它不能溶解在水性缓冲液中。
[0023] 本发明人现在已出乎意料地确定，使用由包含四个HOPO部分(其中至少一个被合适的增溶部分取代)的羟基吡啶酮(HOPO)型八齿配体络合的4+钍-227离子可提供络合物的溶解性和相应特性的显著改善。此外，这种配体与CD22结合靶向部分的偶联可提供具有有利特性的缀合物。
发明内容
[0024] 从第一方面来看，本发明因此提供一种组织靶向络合物，其包含组织靶向部分、包含四个HOPO部分的含羟基吡啶酮的八齿配体以及α发射钍放射性核素的离子，其中四个HOPO部分中的至少一个在N位(1位)被羟基烷基增溶基团取代，其中所述组织靶向部分具有对CD22受体的结合亲和力。在一个实施方案中，此类络合物可溶于纯水中。
[0025] 在一个优选的实施方案中，八齿配体包含至少一个3,2-HOPO部分，并且优选2、3或4个3,2-HOPO部分。在另一个优选的实施方案中，至少2个、优选至少3个并且最优选全部4个HOPO部分包含在N位的羟基烷基增溶部分。
[0026] 优选的靶向部分包括多克隆和特别地单克隆抗体和其片段。特异性结合片段诸如Fab、Fab'、Fab'2和单链特异性结合抗体是典型的片段。
[0027] 在这些络合物(以及优选在本发明的所有方面)中，钍离子一般将由含羟基吡啶酮的八齿配体络合，所述八齿配体又将通过任何合适的方式连接至组织靶向部分。这些方式可包括直接共价连接或借助于任何合适的特异性结合对(例如生物素/抗生物素蛋白型结合对)连接。可使用任何合适的连接，但直接共价键合或使用共价或结合对连接子部分将是典型的方法。共价酯或酰胺键是优选的方法。
[0028] 从另一个方面来看，本发明提供组织靶向络合物(包括本文所述的任何此类络合物)用于制造供治疗增生性或肿瘤性疾病(包括本文所述的任何此类疾病)的药物的用途，所述组织靶向络合物包含组织靶向部分、包含四个HOPO部分的含羟基吡啶酮的八齿配体以及α发射钍放射性核素的离子，其中四个HOPO部分中的至少一个在N位被羟基烷基增溶基团取代并且其中所述组织靶向部分具有对CD22受体的结合亲和力。
[0029] 在一个相应的方面，本发明提供一种治疗人或非人动物(特别是有需要者)的方法，其包括施用至少一种组织靶向络合物(包括本文所述的任何此类络合物)，所述组织靶向络合物包含组织靶向部分、包含四个HOPO部分的含羟基吡啶酮的八齿配体以及α发射钍放射性核素的离子，其中四个HOPO部分中的至少一个在N位被羟基烷基增溶基团取代并且其中所述组织靶向部分具有对CD22受体的结合亲和力。这种方法优选用于治疗增生性或肿瘤性疾病，包括本文所述的任何此类疾病。这种方法通常对人或非人哺乳动物受试者，诸如有需要者进行。
[0030] 在另一个相应的实施方案中，本发明提供一种组织靶向络合物(包括如本文所公开的所有此类络合物)，其包含组织靶向部分、包含四个HOPO部分的含羟基吡啶酮的八齿配体以及α发射钍放射性核素的离子，其中四个HOPO部分中的至少一个在N位被羟基烷基增溶基团取代并且其中所述组织靶向部分具有对CD22受体的结合亲和力，所述组织靶向络合物是用于疗法中，并且特别是用于治疗增生性和/或肿瘤性疾病(包括任何此类疾病)和本文所述的方法。
[0031] 从另一个方面来看，本发明提供一种药物组合物，其包含组织靶向络合物(包括本文所述的所有此类络合物)以及至少一种药物载体或赋形剂，所述组织靶向络合物包含组织靶向部分、包含四个HOPO部分的含羟基吡啶酮的八齿配体以及α发射钍放射性核素的离子，其中四个HOPO部分中的至少一个在N位被羟基烷基增溶基团取代并且其中所述组织靶向部分具有对CD22受体的结合亲和力。
[0032] 为与最丰富的天然存在的钍同位素，即钍-232(半衰期1010年并且有效非放射性)的钍络合物相区别，应理解，本文所要求保护的钍络合物和其组合物包括比天然相对丰度3
更大，例如大至少20％的α发射钍放射性同位素(即半衰期小于10年的至少一种钍的同位素，例如钍-227)。这无需影响其中明确要求治疗有效量的放射性钍诸如钍-227的本发明方法的定义，但在所有方面优选将是这种情况。
更大，例如大至少20％的α发射钍放射性同位素(即半衰期小于10年的至少一种钍的同位素，例如钍-227)。这无需影响其中明确要求治疗有效量的放射性钍诸如钍-227的本发明方法的定义，但在所有方面优选将是这种情况。
[0033] 在本发明的所有方面，α发射钍离子优选是钍-227的离子。钍的4+离子是优选用于本发明络合物中的离子。相应地，非常优选钍-227的4+离子。
[0034] 从另一个方面来看，本发明还提供一种用于根据本发明的方法中的试剂盒，所述试剂盒包含缀合或可缀合至包含四个HOPO部分的含羟基吡啶酮的八齿配体的组织靶向部分，其中四个HOPO部分的至少一个在N位(1位)被羟基烷基增溶基团取代并且其中所述组织靶向部分具有对CD22受体的结合亲和力。所有结合部分和配体优选是本文所述的那227
些。这种试剂盒将任选地且优选地包括α发射钍放射性核素，诸如 Th。
些。这种试剂盒将任选地且优选地包括α发射钍放射性核素，诸如 Th。
[0035] 在另一个方面，本发明此外提供一种用于形成组织靶向络合物的方法，所述方法包括使组织靶向部分与含羟基吡啶酮的八齿配体在水溶液中偶联，所述络合物包含四个HOPO部分和α发射钍放射性核素的离子，其中四个HOPO部分中的至少一个在N位被羟基烷基增溶基团取代并且其中所述组织靶向部分具有对CD22受体的结合亲和力。这种方法可在基本上不存在任何有机溶剂的情况下进行。
具体实施方式
[0036] 在本发明的情形下，“组织靶向”在本文用于指示所讨论的物质(特别是当呈如本文所述的组织靶向络合物形式时)用于优先自身定位(并且特别是定位任何缀合的钍络合物)至需要其存在(例如以递送放射性衰变)的至少一个组织部位。因此，在施用至受试者后，组织靶向基团或部分用于向所述受试者体内的至少一个所需部位提供大于平均值的定位。在本发明情况下靶向部分应经过选择以特异性结合至细胞表面受体CD22。这可例如通过对于表达CD22的细胞的结合亲和力是对于非表达CD22的细胞的结合亲和力的100倍或更多来反映。认为CD22在具有某些疾病状态(如本文所示)的细胞中表达和/或过度表达并且因此CD22特异性结合物可用于将络合物靶向此类受疾病影响的细胞。类似地，组织靶向部分可结合至受疾病影响细胞附近的细胞上存在的细胞表面标志物(例如CD22受体)。CD22细胞表面标志物可在患病细胞表面上比健康细胞表面上更多表达或者在生长或复制期间比在休眠期间在细胞表面上更多表达。在一个实施方案中，CD22特异性结合配体可与疾病特异性细胞表面标志物的另一种结合物组合使用，因此得到双重结合络合物。
[0037] 组织靶向部分还可包含共同具有将钍络合物靶向所需组织的作用的两种或更多种成分。这可能是例如其中首先施用一种成分并结合至特定组织、肿瘤或细胞类型(组织结合剂)，并且同时或优选随后施用第二种和/或其它成分(连接剂)，其在体内结合至所述组织结合剂。连接剂将直接或间接缀合至络合的α发射钍并且因此组织结合剂和连接剂将共同形成组织靶向部分。适于向组织结合剂和连接剂提供相互亲和力的合适的特异性结合对是本领域中众所周知的(例如生物素与抗生物素蛋白或链霉亲和素)。
[0038] 如本文所述的本发明的多个方面涉及疾病的治疗，特别是用于选择性靶向患病组织，以及涉及可用于所述方法的络合物、缀合物、药物、制剂、试剂盒等。在所有方面，患病组织可能位于体内的单一位点(例如在局部化实体肿瘤的情况下)或者可位于多个位点(例如其中在关节炎中或者在分布式或转移式癌性疾病中有若干个关节受影响)。
[0039] 待靶向的患病组织可处于软组织位点、钙化组织位点或多个位点，其可全部在软组织中，全部在钙化组织中或者可包括至少一个软组织位点和/或至少一个钙化组织位点。在一个实施方案中，靶向至少一个软组织位点。靶向位点和疾病起源位点可能相同，但或者可能不同(例如其中特异性靶向转移位点)。在涉及一个以上位点的情况中，这可包括起源位点或者可为多个二级位点。
[0040] 术语“软组织”在本文用于指示不具有“硬质”矿化基质的组织。特别地，如本文所用的软组织可为并非骨骼组织的任何组织。相应地，如本文所用的“软组织疾病”指示在如本文所用的“软组织”中存在的疾病。本发明特别适于治疗癌症并且“软组织疾病”因此涵盖在任何“软质”(即非矿化)组织中存在的癌瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和混合型癌症，以及所述组织的其它非癌性疾病。癌性“软组织疾病”包括软组织中存在的实体肿瘤以及转移性和微转移性肿瘤。实际上，软组织疾病可包括软组织的原发性实体肿瘤和在同一患者中的软组织的至少一种转移性肿瘤。或者，“软组织疾病”可仅由原发性肿瘤或仅由转移瘤组成，其中所述原发性肿瘤是骨骼疾病。在本发明的所有适当方面特别适于治疗和/或靶向的是血液肿瘤以及尤其是淋巴细胞的肿瘤性疾病，例如淋巴瘤和淋巴样白血病，包括非霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤的B细胞肿瘤。类似地，在本发明的所有适当方面，骨髓、脊柱(尤其是脊髓)、淋巴结和/或血液细胞的任何肿瘤性疾病也适于治疗和/或靶向。
[0041] 在本发明的适当方面适于治疗和/或靶向的B细胞肿瘤的一些实例包括：
[0042] 慢性淋巴细胞性白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞性白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤(例如瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症( macroglobulinemia))、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞肿瘤(例如浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链疾病)、结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵膈(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤/白血病。
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[0043] 最近的一个关键发现是，某些α放射性钍同位素(例如 Th)可以在治疗上有效并且不会产生不可耐受的骨髓毒性的量施用。如本文所用，术语“可接受的非骨髓毒性”用于指示，最重要的是，通过所施用的钍-227放射性同位素的衰变所产生的镭-223的量一般不足以对受试者直接致命。然而，本领域技术人员将清楚知道，将为所述治疗的可接受副作用的骨髓损伤的量(以及致命反应的可能性)将随着所治疗疾病的类型、治疗方案的目标以及对于受试者的预后而显著改变。尽管本发明的优选受试者是人，但其它哺乳动物，特别是狗将从本发明的使用中获益，并且可接受的骨髓损伤水平也可反映受试者的物种。在恶性疾病的治疗中，相比于非恶性疾病，可接受的骨髓损伤水平一般将更大。骨髓毒性水平的一个众所周知的量度是嗜中性粒细胞计数，并且在本发明中，可接受的非骨髓毒性量的223
Ra通常将是经过控制以使得在最低点(最低限度)时嗜中性粒细胞分率不少于在治疗之
223
前的计数的10％的量。可接受的非骨髓毒性量的 Ra优选将是使得嗜中性粒细胞分率为最低限度时的至少20％并且更优选至少30％的量。至少40％的最低限度嗜中性粒细胞分率是最优选的。
227
Ra通常将是经过控制以使得在最低点(最低限度)时嗜中性粒细胞分率不少于在治疗之
223
前的计数的10％的量。可接受的非骨髓毒性量的 Ra优选将是使得嗜中性粒细胞分率为最低限度时的至少20％并且更优选至少30％的量。至少40％的最低限度嗜中性粒细胞分率是最优选的。
227
[0044] 另外，含放射性钍(例如 Th)的化合物可以高剂量方案使用，其中当包括干细胞223
支持或类似的恢复方法时，所产生的镭(例如 Ra)的骨髓毒性通常将是不可耐受的。在这些情况下，嗜中性粒细胞计数可降至低于最低限度时的10％并且例外情况下将降至5％或必要时低于5％，从而采取合适的预防措施并且给予后续干细胞支持。这些技术是本领域中众所周知的。
支持或类似的恢复方法时，所产生的镭(例如 Ra)的骨髓毒性通常将是不可耐受的。在这些情况下，嗜中性粒细胞计数可降至低于最低限度时的10％并且例外情况下将降至5％或必要时低于5％，从而采取合适的预防措施并且给予后续干细胞支持。这些技术是本领域中众所周知的。
[0045] 本发明中特别关注的钍同位素是钍-227，并且在情形允许时对于本文中钍的所有226
提及，钍-227是优选的同位素。钍-227相对容易产生并且可以从中子辐照的 Ra间接制
227 227 226
备，其将含有 Th的母体核素，即 Ac(T1/2＝22年)。锕-227可以相当容易地与 Ra靶
227
标分离并用作 Th的发生器。必要时可将这种工艺扩展到工业规模，并且因此可以避免关于被视为分子靶向放射疗法的候选物的大多数其它α发射体可见的供应问题。
提及，钍-227是优选的同位素。钍-227相对容易产生并且可以从中子辐照的 Ra间接制
227 227 226
备，其将含有 Th的母体核素，即 Ac(T1/2＝22年)。锕-227可以相当容易地与 Ra靶
227
标分离并用作 Th的发生器。必要时可将这种工艺扩展到工业规模，并且因此可以避免关于被视为分子靶向放射疗法的候选物的大多数其它α发射体可见的供应问题。
[0046] 钍-227通过镭-223衰变。在这种情况下，原发性子体具有11.4天的半衰期。从227 223 227
纯 Th源，在前几天内仅产生中等量的镭。然而，Ra的潜在毒性高于 Th，这是因为α
223
粒子从 Ra中发射之后，接着数分钟内从短寿命子体产生三个其它α粒子(参见下表2，其阐述钍-227的衰变系列)。
纯 Th源，在前几天内仅产生中等量的镭。然而，Ra的潜在毒性高于 Th，这是因为α
223
粒子从 Ra中发射之后，接着数分钟内从短寿命子体产生三个其它α粒子(参见下表2，其阐述钍-227的衰变系列)。
[0047] 表2
[0048]核素 衰变模式 平均粒子能量(MeV) 半衰期
227Th α 6.02 18.72天
223Ra α 5.78 11.43天
219Rn α 6.88 3.96秒
215Po α 7.53 1.78毫秒
211Pb β 0.45 36.1分钟
211Bi α 6.67 2.17分钟
207
TI β 1.42 4.77分钟
207Pb 稳定
227Th α 6.02 18.72天
223Ra α 5.78 11.43天
219Rn α 6.88 3.96秒
215Po α 7.53 1.78毫秒
211Pb β 0.45 36.1分钟
211Bi α 6.67 2.17分钟
207
TI β 1.42 4.77分钟
207Pb 稳定
[0049] 部分原因是因为其产生潜在有害的衰变产物，钍-227(T1/2＝18.7天)还没有被广泛考虑用于α粒子疗法。
[0050] 钍-227可以足以提供所需治疗作用而不产生那么多的镭-223以致于造成不可耐受的骨髓抑制的量施用。理想的是将子同位素保持在靶向区域中以使得可从其衰变得到其它治疗作用。然而，为了获得有用的治疗作用而不诱导不可接受的骨髓毒性，不必维持钍衰变产物的控制。
[0051] 假设肿瘤细胞杀伤作用将主要来自钍-227而非来自其子体，可通过与其它α发射体进行比较来确定这种同位素的可能治疗剂量。例如，对于砹-211，在动物中的治疗剂量通常是2-10MBq/kg。通过校正半衰期和能量，钍-227的相应剂量将是至少36-200kBq/227
kg体重。这将设定预期治疗作用时可有效施用的 Th量下限。这种计算假定砹和钍的类似滞留。然而，显然钍的18.7天半衰期将很可能导致这种同位素在其衰变前的更大消除。
227
这种计算剂量因此应通常被认为是最低有效量。根据完全滞留的 Th(即未从体内消除的
227
Th)表达的治疗剂量通常将为至少18或25kBq/kg，优选至少36kBq/kg并且最优选至少
75kBq/kg，例如100kBq/kg或更多。更大量的钍将预期具有更大的治疗作用，但如果将产生不可耐受的副作用，则不能施用。同样地，如果钍以具有短生物半衰期(即在从仍带有钍的体内消除之前的半衰期)的形式施用，则为获得治疗作用将需要更大量的放射性同位素，因为大量的钍将在其衰变之前被消除。然而，所生成的镭-223的量将存在相应降低。当同位素被完全滞留时待施用的钍-227的上述量可容易地与具有较短生物半衰期的等效剂量相关。这些计算是本领域中众所周知的并且在WO 04/091668中(例如正文中以及实施例
1和2中)给出。
kg体重。这将设定预期治疗作用时可有效施用的 Th量下限。这种计算假定砹和钍的类似滞留。然而，显然钍的18.7天半衰期将很可能导致这种同位素在其衰变前的更大消除。
227
这种计算剂量因此应通常被认为是最低有效量。根据完全滞留的 Th(即未从体内消除的
227
Th)表达的治疗剂量通常将为至少18或25kBq/kg，优选至少36kBq/kg并且最优选至少
75kBq/kg，例如100kBq/kg或更多。更大量的钍将预期具有更大的治疗作用，但如果将产生不可耐受的副作用，则不能施用。同样地，如果钍以具有短生物半衰期(即在从仍带有钍的体内消除之前的半衰期)的形式施用，则为获得治疗作用将需要更大量的放射性同位素，因为大量的钍将在其衰变之前被消除。然而，所生成的镭-223的量将存在相应降低。当同位素被完全滞留时待施用的钍-227的上述量可容易地与具有较短生物半衰期的等效剂量相关。这些计算是本领域中众所周知的并且在WO 04/091668中(例如正文中以及实施例
1和2中)给出。
[0052] 如果放射性标记的化合物释放子体核素，则重要的是知道任何放射性子体核素的227 223
命运(如果适用的话)。对于 Th，主要子体产物是 Ra，由于其趋骨特性，其正处于临床评价中。镭-223非常快速地清除血液并且集中在骨骼中或通过肠道和肾脏途径排泄(参见
227
Larsen,J Nucl Med 43(5,增刊):160P(2002))。在体内从 Th释放的镭-223因此可能不会在较大程度上影响健康软组织。在Müller于Int.J.Radiat.Biol.20:233-243(1971)
227 227 223
中关于呈溶解的柠檬酸盐形式的 Th分布的研究中，发现在软组织中从 Th产生的 Ra容易再分配至骨骼或排泄。因此α发射镭的已知毒性，特别是对于骨髓的已知毒性是伴随钍剂量的问题。
命运(如果适用的话)。对于 Th，主要子体产物是 Ra，由于其趋骨特性，其正处于临床评价中。镭-223非常快速地清除血液并且集中在骨骼中或通过肠道和肾脏途径排泄(参见
227
Larsen,J Nucl Med 43(5,增刊):160P(2002))。在体内从 Th释放的镭-223因此可能不会在较大程度上影响健康软组织。在Müller于Int.J.Radiat.Biol.20:233-243(1971)
227 227 223
中关于呈溶解的柠檬酸盐形式的 Th分布的研究中，发现在软组织中从 Th产生的 Ra容易再分配至骨骼或排泄。因此α发射镭的已知毒性，特别是对于骨髓的已知毒性是伴随钍剂量的问题。
[0053] 在WO 04/091668中首次确定，实际上，剂量为至少200kBq/kg的223Ra可施用并在人受试者中耐受。这些数据呈现在所述公开案中。因此，现在可以看出，相当意外地，存在227
治疗窗，其中可向哺乳动物受试者施用治疗有效量的 Th(例如大于36kBq/kg)而预期这种受试者不会遭受不可接受的严重或甚至致命的骨髓毒性的风险。然而，极其重要的是，进行这种治疗窗的最佳使用，并且因此必要的的是放射性钍快速并有效地络合，并且以非常高的亲和力保持以使得最大可能比例的剂量被递送至靶位点。
治疗窗，其中可向哺乳动物受试者施用治疗有效量的 Th(例如大于36kBq/kg)而预期这种受试者不会遭受不可接受的严重或甚至致命的骨髓毒性的风险。然而，极其重要的是，进行这种治疗窗的最佳使用，并且因此必要的的是放射性钍快速并有效地络合，并且以非常高的亲和力保持以使得最大可能比例的剂量被递送至靶位点。
[0054] 从227Th药物产生的223Ra的量将取决于放射性标记的化合物的生物半衰期。理想情况将是使用具有快速肿瘤吸收的络合物，所述肿瘤吸收包括内化至肿瘤细胞中、强烈223
肿瘤滞留以及在正常组织中的短生物半衰期。然而只要 Ra的剂量保持在可耐受的水平内，具有小于理想生物半衰期的络合物就可以是有用的。在体内产生的镭-223的量将是所施用的钍的量和钍络合物的生物滞留时间的因素。在任何特定情况下，本领域普通技术
227
人员可容易地计算所产生的镭-223的量。 Th的最大可施用量将由体内产生的镭的量确定并且必须小于将产生不可耐受水平的副作用，特别是骨髓毒性的量。这个量一般将小于
300kBq/kg，特别是小于200kBq/kg并且更优选小于170kBq/kg(例如小于130kBq/kg)。最小有效剂量将由钍的细胞毒性、患病组织对所产生的α照射的易感性以及钍被靶向络合物(在这种情况下为配体与靶向部分的组合)有效组合、保持和递送的程度确定。
肿瘤滞留以及在正常组织中的短生物半衰期。然而只要 Ra的剂量保持在可耐受的水平内，具有小于理想生物半衰期的络合物就可以是有用的。在体内产生的镭-223的量将是所施用的钍的量和钍络合物的生物滞留时间的因素。在任何特定情况下，本领域普通技术
227
人员可容易地计算所产生的镭-223的量。 Th的最大可施用量将由体内产生的镭的量确定并且必须小于将产生不可耐受水平的副作用，特别是骨髓毒性的量。这个量一般将小于
300kBq/kg，特别是小于200kBq/kg并且更优选小于170kBq/kg(例如小于130kBq/kg)。最小有效剂量将由钍的细胞毒性、患病组织对所产生的α照射的易感性以及钍被靶向络合物(在这种情况下为配体与靶向部分的组合)有效组合、保持和递送的程度确定。
[0055] 在本发明的方法中，希望钍络合物以18至400kBq/kg体重、优选36至200kBq/kg(例如50至200kBq/kg)、更优选75至170kBq/kg、尤其100至130kBq/kg的钍-227剂量施用。相应地，单一剂量可包含大约任何这些范围乘以合适的体重，例如30至150Kg、优选40至100Kg(例如每剂540kBq至4000KBq的范围等)。此外将需要钍剂量、络合剂和施用途径以使得体内产生的镭-223剂量小于300kBq/kg、更优选小于200kBq/kg、仍更优选小于150kBq/kg、尤其小于100kBq/kg。此外，这将提供由这些范围乘以任何所示体重所指示223 227 227
的 Ra暴露。上述剂量水平优选是完全滞留的 Th剂量，但考虑到一些 Th将在其衰变前从体内清除，其可为所施用剂量。
的 Ra暴露。上述剂量水平优选是完全滞留的 Th剂量，但考虑到一些 Th将在其衰变前从体内清除，其可为所施用剂量。
[0056] 在227Th络合物的生物半衰期相比于物理半衰期(例如小于7天，尤其是小于3天)较短时，可能需要显著较大的所施用剂量来提供等效滞留剂量。因此，例如，150kBq/kg的完全滞留剂量等效于以711kBq/kg的剂量施用的具有5天半衰期的络合物。可使用本领域中众所周知的方法由络合物的生物清除率来计算任何适当滞留剂量的等效施用剂量。
[0057] 由于一个227Th核的衰变提供一个223Ra原子，227Th的滞留和治疗活性将与患者所223 223
遭受的 Ra剂量直接相关。可使用众所周知的方法来计算在任何特定情形下所产生的 Ra的量。
遭受的 Ra剂量直接相关。可使用众所周知的方法来计算在任何特定情形下所产生的 Ra的量。
[0058] 在一个优选的实施方案中，本发明因此提供一种用于治疗哺乳动物受试者(如本文所述)中的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的缀合物，所述缀合物包含组织靶向部分、八齿配体(尤其是任何本文所述的那些)和放射性钍同位素(例如钍-227)。
[0059] 除非其特性被有效使用，否则显然需要将受试者对于223Ra子同位素的暴露降至最小。特别是，体内产生的镭-223的量通常将大于40kBq/kg，例如大于60kBq/Kg。在一些情223
况下，体内产生的 Ra将必需大于80kBq/kg，例如大于100或115kBq/kg。
况下，体内产生的 Ra将必需大于80kBq/kg，例如大于100或115kBq/kg。
[0060] 在适当的载体溶液中的钍-227标记的缀合物可经静脉内、腔内(例如腹膜内)、皮下、经口或经局部、以单次应用或以分次应用方案施用。缀合至靶向部分的络合物优选将以溶液形式通过肠胃外(例如经皮)途径、尤其是静脉内或通过腔内途径施用。优选地，本发明的组合物将配制成无菌溶液以用于肠胃外施用。
[0061] 在本发明的方法和产物中的钍-227可单独使用或与其它治疗形式组合使用，所述治疗形式包括手术、外照射疗法、化疗、其它放射性核素、或组织温度调节等。这构成了本发明方法的另一个优选的实施方案，并且制剂/药物可相应地包含至少一种其它治疗活性剂如另一种放射性剂或化疗剂。
[0062] 在一个特定优选的实施方案中，受试者还经历干细胞治疗和/或其它支持疗法以降低镭-223诱导的骨髓毒性的作用。
[0063] 根据本发明，227Th可由靶向络合剂络合。靶向部分通常将具有100g/mol至数百万g/mol(特别是100g/mol至1百万g/mol)的分子量，并且优选将直接具有对于疾病相关受227
体的亲和力，和/或将包含结合至在施用 Th之前已靶向疾病的分子的合适的预施用结合物(例如生物素或抗生物素蛋白)。合适的靶向部分包括多肽和寡肽、蛋白质、DNA和RNA片段、适体等，优选为蛋白质，例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、多克隆或单克隆抗体(包括IgG和IgM型抗体)、或蛋白质或蛋白质片段或构建体的混合物。抗体、抗体构建体、抗体片段(例如Fab片段或包含至少一个抗原结合区域的任何片段)、片段构建体(例如单链抗体)或其混合物是特别优选的。合适的片段特别包括Fab、F(ab')2、Fab'和/或scFv。抗体构建体可为本文所示的任何抗体或片段。
体的亲和力，和/或将包含结合至在施用 Th之前已靶向疾病的分子的合适的预施用结合物(例如生物素或抗生物素蛋白)。合适的靶向部分包括多肽和寡肽、蛋白质、DNA和RNA片段、适体等，优选为蛋白质，例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、多克隆或单克隆抗体(包括IgG和IgM型抗体)、或蛋白质或蛋白质片段或构建体的混合物。抗体、抗体构建体、抗体片段(例如Fab片段或包含至少一个抗原结合区域的任何片段)、片段构建体(例如单链抗体)或其混合物是特别优选的。合适的片段特别包括Fab、F(ab')2、Fab'和/或scFv。抗体构建体可为本文所示的任何抗体或片段。
[0064] 在一个方面，特异性结合物(组织靶向部分)可为与如下所示的至少一个序列具有序列相似性或同一性的肽：
[0065] 轻链：
[0066]
[0067] 重链：
[0068]
[0069] 在上述序列中，人源化(H'ised)序列中的“-”指示残基相比于鼠序列未改变。
[0070] 在上述序列(SeqID1-5)中，粗体区域被认为是关键的特异性结合区域(CDR)，加下划线的区域被认为在结合中具有次要重要性并且未强调的区域被认为表示结构性而非特异性结合区域。
[0071] 在本发明的所有方面，组织靶向部分可具有与任何SeqID 1至5中所示那些序列中的至少一种具有实质序列同一性或实质序列相似性的序列。实质序列同一性/相似性可视为与完整序列具有至少80％的序列相似性/同一性和/或与特异性结合区域(在上述序列中以粗体显示的那些区域和任选地加下划线的那些部分)具有至少90％的序列相似性/同一性。对于粗体区域以及优选也对于全序列，优选的序列相似性或更优选同一性可为至少92％、95％、97％、98％或99％。可使用来自威斯康星大学(University of Wisconsin)的Genetics Computer Group第10版软件包的“BestFit”程序测定序列相似性和/或同一性。所述程序使用Smith和Waterman的局部算法(local had algorithm)，其中默认值为：空位产生罚分＝8，空位延伸罚分＝2，平均匹配＝2.912，平均错配2.003。
[0072] 组织靶向部分可包含一个以上肽序列，在这种情况下至少一个以及优选所有序列可(独立地)符合与任何SeqlD1-5的上述序列相似性以及优选地序列同一性。
[0073] 组织靶向部分将具有对CD22的结合亲和力并且在一个实施方案中还可具有对于完全结构域具有多至约40种变化(优选0至30种变化)的序列。变体可通过插入、缺失和/或取代得到并且可关于seqID 1-5为连续或非连续的。取代或插入通常将借助于遗传密码的20种氨基酸中的至少一种并且取代最通常将为保守性取代。然而，在一个实施方案中，可对具有可用于连接至配体部分的反应性侧链的氨基酸进行至少一个插入和/或取代。这种侧链可包含例如至少一个硫醇、胺、醇、酸或酰胺基或其任何保护等效物(例如酯、硫酯等)。保护基是有机化学中众所周知的并且可选自诸如Theodora Greene的“Protective Groups in Organic Chemistry”等标准教科书(以引用的方式并入本文中)。
[0074] 一般来说，八齿配体直接或间接(例如通过连接子部分)缀合至靶向部分。这种类型的一般构建体；即活性(例如治疗或诊断活性)金属-络合部分-任选的连接子部分-靶向部分，是靶向放射性药物和靶向造影剂领域中众所周知的。然而，很少或没有研究评估各种配体对于钍4+离子特异性使用的适宜性。就此而言，例如可参考"Handbook of Targeted Delivery of Imaging Agents",Torchilin编,CRC Press,1995。
[0075] 对于具有羟基吡啶酮配体的钍离子的最相关先前研究以WO2011/098611公布并且公开了产生与含HOPO的八齿配体络合的钍离子的相对容易性。
[0076] 先前已知的钍螯合剂也包括聚氨基聚酸螯合剂，其包含在主链氮上连接有酸性基团(例如羧基烷基)的线性、环状或分支聚氮杂烷烃主链。这些螯合剂的实例包括DOTA衍生物如对异硫氰基苄基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-SCN-Bz-DOTA)以及DTPA衍生物如对异硫氰基苄基-二亚乙基三胺五乙酸(p-SCN-Bz-DTPA)，前者为环状螯合剂，后者为线性螯合剂。
[0077] 先前已例示1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸的衍生物，但标准方法不能容易地用于螯合钍与DOTA衍生物。将DOTA衍生物与金属一起加热有效提供螯合剂，但通常产率较低。存在配体的至少一部分在程序期间不可逆变性的趋势。此外，由于其对于不可逆变性的相对高的易感性，一般有必要避免靶向部分的连接直至完成所有的加热步骤。这增加了一个额外的化学步骤(具有所有必要的处理和分离)，其必须在α发射钍同位素的衰变寿命期间进行。显然优选不以这种方式处理α发射材料或者在比必要更大的程度上产生相应的废物。此外，制备缀合物所花费的所有时间浪费了一部分钍，其将在这个制备期内衰变。
[0078] 在本发明的所有方面，α发射钍和八齿配体的络合物优选是在或可在不具有高于60℃加热(例如不具有高于50℃加热)、优选不具有高于38℃加热并且最优选不具有高于
25℃加热的情况下形成。
25℃加热的情况下形成。
[0079] 另外优选的是在添加α发射钍同位素(例如227Th4+离子)之前制备靶向部分与八齿配体的缀合物。本发明的产物因此优选是或可通过八齿配体与组织靶向部分的缀合物227 4+
对α发射钍同位素(例如 Th 离子)的络合而形成。
对α发射钍同位素(例如 Th 离子)的络合而形成。
[0080] 螯合剂可为非膦酸酯分子，并且在本发明的一个实施方案中，227Th将不会连接至任何膦酸酯或其它靶向骨骼的基团，并且不与所述材料一起施用。
[0081] 本发明人现已确定，包含含有四个HOPO部分的含羟基吡啶酮的八齿配体与α发射钍放射性核素的离子的络合物非常适于在室温和/或生理温度下(例如20℃或37℃下)产生。这种络合物可迅速产生并且此外由于产生温度相对较低，在配体部分已经结合或以其它方式缀合至组织靶向部分之后可发生钍成分的络合，因此降低在加入放射性同位素之后所需的步骤的数目。
[0082] 除上述之外，包含四个HOPO部分(其中至少一个HOPO部分包含羟基烷基增溶基团)的含羟基吡啶酮的八齿配体的更易溶于水的特性用于进一步提高完整缀合物的制造容易性。具体地，在缀合物制造期间，必须将疏水性螯合剂如先前已知的八齿配体溶解在有机溶剂如DMSO或DMA中。在缀合后有必要除去所有微量的有机溶剂，但对于这些非挥发性极性有机溶剂是困难的并且难以通过分析证明完全去除。分析所花费的时间显然是不希望的，其中已并入α发射体，因为放射性核素持续衰变并且缀合物的效能随时间降低。
[0083] 由于需要有机溶剂，疏水性螯合剂不仅对于与蛋白质类靶向分子组合具挑战性，而且对于与更具亲水性的替代靶向分子组合更具挑战性，所述替代靶向分子包括在表面上具有PEG或右旋糖苷的纳米粒子。
[0084] 出于生物学原因如延长的半衰期或降低免疫反应，可能需要PEG或替代的亲水性高水溶性间隔基。由于两个部分的溶解度性质的差异，螯合剂-PEG单元在缀合至蛋白质之前的制造也具挑战性。PEG或类似的间隔基向分子中的螯合部分与载体蛋白之间引入更大亲水性。然而，这仅使螯合剂移动以进一步远离载体蛋白，而螯合剂的疏水性不受影响。因此，疏水性螯合剂仍可被识别为(聚乙二醇化)靶向分子的表面上的疏水性点并产生如上文所讨论的不希望的反应。
[0085] 多种类型的靶向化合物可通过八齿螯合剂(包含如本文所述的偶联部分)连接至钍(例如钍-227)。靶向部分可选自已知的靶向基团，其包括单克隆或多克隆抗体、生长因子、肽、激素和激素类似物、叶酸和叶酸衍生物、生物素、抗生物素蛋白和链霉亲和素或其类似物。其它可能的靶向基团包括RNA、DNA或其片段(例如适体)、寡核苷酸、碳水化合物、脂质或通过在存在或不存在蛋白质等的情况下组合这些基团而制备的化合物。可如上文所示包括PEG部分，例如以增加生物滞留时间和/或降低免疫刺激。
[0086] 在一个实施方案中，组织靶向部分可排除趋骨物、脂质体和叶酸缀合抗体或抗体片段。或者，可包括这些部分。
[0087] 本发明的钍(例如钍-227)标记的分子可通过靶向疾病相关受体而用于治疗癌性227
或非癌性疾病。通常，基于通过螯合剂将 Th连接至抗体、抗体片段、或抗体或抗体片段的
227 227
构建体，Th的这种医学用途将通过放射免疫疗法用于治疗癌性或非癌性疾病。 Th在根据本发明的方法和药物中的用途特别适于治疗任何形式的癌症，包括癌瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病、特别是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、口腔癌、结肠直肠癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。
或非癌性疾病。通常，基于通过螯合剂将 Th连接至抗体、抗体片段、或抗体或抗体片段的
227 227
构建体，Th的这种医学用途将通过放射免疫疗法用于治疗癌性或非癌性疾病。 Th在根据本发明的方法和药物中的用途特别适于治疗任何形式的癌症，包括癌瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病、特别是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、胃癌、胰腺癌、食道癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、口腔癌、结肠直肠癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。
[0088] 如果携带227Th的分子在体内具有短的生物滞留半衰期，则所释放的223Ra的量可227 223
降至最小，因为在高比例的 Th衰变为 Ra之前，这种放射性核素将大部分被消除。然而，
227 227
根据本发明，Th的量将需要增加以保持治疗有效性。如果选择络合剂以将 Th递送至靶向细胞的内部，则由于子同位素至少部分滞留在肿瘤位点处，这将进一步增加特异性细胞
227
毒性并降低放射性子体的全身毒性作用。这些特征都加宽了 Th治疗窗并因此构成本发明的优选实施方案。
降至最小，因为在高比例的 Th衰变为 Ra之前，这种放射性核素将大部分被消除。然而，
227 227
根据本发明，Th的量将需要增加以保持治疗有效性。如果选择络合剂以将 Th递送至靶向细胞的内部，则由于子同位素至少部分滞留在肿瘤位点处，这将进一步增加特异性细胞
227
毒性并降低放射性子体的全身毒性作用。这些特征都加宽了 Th治疗窗并因此构成本发明的优选实施方案。
[0089] 在本发明的另一个实施方案中，具有软组织和骨骼疾病的患者可由227Th和由所施223
用的钍在体内产生的 Ra来治疗。在这个特别有利的方面，通过靶向骨骼疾病，对于治疗
223 227
的额外治疗成分源自可接受的非骨髓毒性量的 Ra。在这种治疗方法中， Th通常通过适
227
当靶向原发性和/或转移性软组织癌而用于治疗原发性和/或转移性软组织癌并且由 Th
223
衰变产生的 Ra被用于治疗同一受试者中的相关骨骼疾病。这种骨骼疾病可能是由原发性软组织癌产生的骨骼转移，或者可为其中软组织治疗是抵抗转移性癌症的原发性疾病。偶尔，软组织和骨骼疾病可能无关(例如在患有风湿性软组织疾病的患者中额外治疗骨骼疾病)。
用的钍在体内产生的 Ra来治疗。在这个特别有利的方面，通过靶向骨骼疾病，对于治疗
223 227
的额外治疗成分源自可接受的非骨髓毒性量的 Ra。在这种治疗方法中， Th通常通过适
227
当靶向原发性和/或转移性软组织癌而用于治疗原发性和/或转移性软组织癌并且由 Th
223
衰变产生的 Ra被用于治疗同一受试者中的相关骨骼疾病。这种骨骼疾病可能是由原发性软组织癌产生的骨骼转移，或者可为其中软组织治疗是抵抗转移性癌症的原发性疾病。偶尔，软组织和骨骼疾病可能无关(例如在患有风湿性软组织疾病的患者中额外治疗骨骼疾病)。
[0090] 在所有方面，本发明的一个关键方面是使用八齿配体，特别是包含四个HOPO部分的含羟基吡啶酮的八齿配体。这些配体通常将包含至少四个螯合基团，其各自独立地具有下列被取代的吡啶结构(I)：
[0091]
[0092] 其中R1为任选的N取代基增溶基团，其将存在于四个式I部分中的至少一个中并且可存在于2、3或全部4个这些部分中。R1因此可不存在或者可选自OH和羟基烷基部分。合适的羟基烷基部分将包含至少一个OH基团，但可任选包含一个以上、例如两个、三个或四个OH基团。在羟基烷基部分上，一个或两个OH基团是优选的。
[0093] HOPO部分(特别是3,2-HOPO和2,3-HOPO)的吡啶酮环上的氮是适于引入亲水性取代基而不会非常影响环的性质的点，并且重要的是，其将在分子与载体蛋白或其它靶向分子缀合后面向外部。先前已显示，基于在这个位置上具有甲基的嘧啶酮环的螯合剂适于螯合钍离子。新型的螯合剂具有在N位引入的替代基团，包括羟基乙基。令人惊讶的是，从甲基到羟基乙基的微小变化产生完全可溶于纯水中的螯合剂。下文显示这种分子和一些相关的实例。
[0094] 如本文所用，所有烃基部分独立地选自短烃基，例如C1至C8烃基，包括C1至C8烷基、烯基或炔基。相应地，烷基通常将为直链或支链C1至C8烷基如甲基、乙基、正丙基或异丙基、正丁基、异丁基或仲丁基等。
[0095] 非常优选的R1基团包括具有连接至烷基链的碳原子的一个、两个或更多个羟基的直链或支链烷基(例如上文所示那些)。一些非常优选的羟基烷基包括羟基甲基、羟基乙基、羟基正丙基、羟基异丙基、二羟基正丙基(例如1,2-二羟基丙基、2,3-二羟基丙基或1,3-二羟基丙基)、羟基正丁基、二羟基正丁基和三羟基正丁基，其中羟基乙基是最优选的。在一个实施方案中，八齿配体的4个HOPO部分各自将包含在位置R1处的羟基烷基(例如羟基乙基)。在另一个实施方案中，所有四个HOPO部分将包含相同的羟基烷基(例如所有4个HOPO基团将在N位被羟基乙基取代或者所有4个HOPO基团将被二羟基丙基取代)。
[0096] 在一个非常优选的实施方案中，所有4个HOPO基团将为选自3,2HOPO和2,3HOPO基团的相同HOPO基团。在另一个非常优选的实施方案(其可任选地与前述组合)中，所有4个HOPO基团将在N位被选自羟基甲基、羟基乙基、羟基丙基、羟基丁基、二羟基丙基和二羟基丁基的相同羟基烷基取代。在这个列表中，羟基乙基、羟基丙基和二羟基丙基是最优选的。
[0097] 在式I中，基团R2至R6可各自独立地选自H、OH、＝O、短烃基(如本文所述)、连接子部分(如本文所述)和/或偶联部分(如本文所述)。一般来说，基团R2至R6中的至少一个将为OH。一般来说，基团R2至R6中的至少一个将为＝O。一般来说，基团R2至R6中的至少一个将为连接子部分(如本文所述)。基团R2至R6中优选只有一个将为＝O。基团R2至R6中优选只有一个将为OH。基团R2至R6中优选只有一个将为连接子部分(如本文所述)。其余基团R2至R6可为任何本文所示的那些部分，但优选为H。在连接子部分或连接至连接子部分的任何其它连接子、模板或螯合基团不包含偶联部分时，基团R1至R6中的一个优选为偶联部分(如本文所述)。
[0098] 在一个优选的实施方案中，基团R2至R6中的一个将为OH并且R2至R6中的一个将为＝O，并且OH和＝O基团将在环的相邻原子上。因此，在一个优选的实施方案中，OH和＝O可分别在原子2,3；3,2；3,4；或4,3上(如将预期从氮开始编号)。具有至少一个螯合部分的八齿配体是非常优选的，其中OH和＝O基团分别存在于位置3和位置2。八齿配体可具有2、3或4个这种螯合基团，其中2或4个这种基团是非常优选的。N上取代的3,2-HOPO部分非常优选作为八齿配体的所有四个络合部分。
[0099] 合适的螯合部分可通过本领域中已知的方法形成，包括US 5,624,901(例如实施例1和2)和WO2008/063721(都以引用的方式并入本文中)中所述的方法。
[0100] 如本文所用，术语“连接子部分”(式II中的RL)用于指示用于接合八齿配体中的至少两个螯合基团的化学实体，其在本发明的多个方面形成关键成分。连接子部分还可将八齿配体部分接合至组织靶向部分。通常，每个螯合基团(例如上文式I和/或下文式II的那些)将为双齿的并且因此四个螯合基团(其中至少一个具有式I)通常将存在于配体中。这些螯合基团借助于其连接子部分而彼此接合。因此，在一个以上式I和/或II的螯合基团之间可共用连接子部分(例如下文基团RL)。连接子部分还可充当八齿配体与靶向部分的络合部分之间的连接点。在这种情况下，至少一个连接子部分将接合至偶联部分(RC)。合适的连接子部分包括短烃基，例如C1至C12烃基，包括C1至C12烷基、烯基或炔基，包括所有拓扑结构的甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和/或己基。
[0101] 连接子部分还可为或包含任何其它适当稳固的化学键，包括酯、醚、胺和/或酰胺基团。接合两个螯合部分的原子总数(如果存在一个以上路径，则通过最短的路径计数)一般将是有限的，以便以适于络合物形成的布置来限制螯合部分。因此，连接子部分通常将经过选择以在螯合部分之间提供不超过15个原子，优选地在螯合部分之间提供1至12个原子并且更优选1至10个原子。在连接子部分直接接合两个螯合部分时，连接子长度通常将为1至12个原子，优选2至10个原子(例如乙基、丙基、正丁基等)。在连接子部分接合至中心模板(参见下文)时，则每一连接子可能较短，其中两个独立的连接子接合螯合部分。在这种情况下，1至8个原子，优选1至6个原子的连接子长度可为优选的(甲基、乙基和丙基是合适的，诸如在一端或两端具有酯、醚或酰胺键的这些基团也是如此)。
[0102] 除了主要用于将八齿配体的各种螯合基团彼此连接和/或连接至中心模板的连接子部分之外，八齿配体优选进一步包含“偶联部分”(RC)。偶联部分的功能是将八齿配体连接至靶向部分。这可通过共价或非共价连接(例如通过特异性结合对如生物素/抗生物素蛋白(链霉亲和素))来实现。如上文所述的连接子部分形成可能的偶联部分。偶联部分优选将通过直接共价连接至一个螯合基团或者更通常通过连接至连接子部分或模板而共价连接至螯合基团。应使用两个或更多个偶联部分，各自可连接至例如任何模板、连接子或螯合基团上的任何可用位点。
[0103] 在一个实施方案中，偶联部分可具有以下结构：
[0104]
[0105] 其中R7为桥联部分，其为选自被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的杂环烷基、被取代或未被取代的芳基以及被取代或未被取代的杂芳基的成员；并且X是靶向部分或反应性官能团。优选的桥联部分包括本文指示为合适的连接子部分的所有这些基团。优选的靶向部分包括本文所述的所有那些靶向部分并且优选的反应性X基团包括能够与靶向部分形成共价键的任何基团，包括例如COOH、OH、SH、NHR和COH基团，其中NHR的R可为H或本文所述的任何短烃基。用于连接至靶向部分上的非常优选的基团包括赖氨酸残基的ε-胺和半胱氨酸残基的硫醇基团。合适的反应性X基团的非限制性实例包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、酰亚胺酯、酰基卤、N-马来酰亚胺、α-卤基乙酰基和异硫氰酸酯，其中后三种适于与硫醇基团反应。
[0106] 优选连接偶联部分，以使得所得偶联的八齿配体将能够经历稳定的金属离子络合物的形成。偶联部分因此将优选在不显著干扰络合的位点处连接至连接子、模板或螯合部分。这种位点优选将在连接子或模板上，更优选在远离结合至靶标的表面的位置处。
[0107] 优选的螯合基团包括以下式II的那些：
[0108]
[0109] 在上式II中，＝O部分表示连接至吡啶环的任何碳的酮基，-OH表示连接至吡啶环的任何碳的羟基部分，并且-RL表示将羟基吡啶酮部分连接至其它络合部分以形成整个八齿配体的连接子部分。本文所述的任何连接子部分可适用作包括短烃基的RL，所述短烃基例如C1至C8烃基，包括C1至C8烷基、烯基或炔基，包括所有拓扑结构的甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和/或己基。RL可在吡啶环的任何碳处接合式II的环。RL基团然后又可直接键合至另一个螯合部分、另一个连接子基团和/或中心原子或基团，例如环或其它模板(如本文所述)。连接子、螯合基团和任选的模板部分经过选择以形成适当的八齿配体。
[0110] 在一个优选的实施方案中，式II的-OH和＝O部分处在吡啶环的相邻原子上，以使得2,3-、3,2-、4,3-和3,4-羟基吡啶酮衍生物都非常合适。
[0111] 部分RL处在吡啶环的氮上。在一些式II基团中可能不存在基团RN，其中在八齿配体中存在一个以上不同的式II基团。然而，每一八齿配体中的至少一个RN基团将为如本文所示的羟基烷基。
[0112] 在一个优选的实施方案中，至少一个3,2-羟基吡啶酮部分存在于八齿配体结构中。这显然可被任何本文所示的各种取代基部分取代。
[0113] 由于每一式II的部分具有两个可能络合的氧，因此本发明的一个实施方案提供包含至少2个、优选至少3个并且最优选4个独立选择的式II部分的八齿配体。每一式II的部分可具有独立的取代模式，但在一个优选的实施方案中，至少一个部分是3,2-羟基吡啶酮部分。配体可包括2、3或4个3,2-羟基吡啶酮部分(适当时被取代，如本文所述)。
[0114] 八齿配体中的每一式I或II的部分可通过如本文所讨论并且呈任何适当拓扑结构的任何适当连接子基团接合至配体的其余部分。例如，式I的四个基团可通过其连接子基团接合至主链以形成线性配体，或者可通过连接子基团桥联以形成“寡聚物”型结构，其可为线性的或环状的。或者，式I和/或II的配体部分可各自通过连接子(例如“RL”部分)以“十字”或“星形”外形接合至中心原子或基团。连接子(RL)部分可仅通过碳碳键接合，或者可通过任何适当稳固的官能团(包括胺、酰胺、酯、醚、硫醚或二硫键)彼此连接，连接至其它螯合基团、主链、模板、偶联部分或其它连接子。
[0115] “星形”布置示于下式III中：
[0116]
[0117] 其中所有基团和位置如上文所指示并且“T”另外为中心原子或模板基团，例如碳原子、烃链(例如任何上文所述的那些)、脂族或芳族环(包括杂环)或稠环系统。最基本的模板将是单一碳，其然后将通过其连接基团连接至各螯合部分。较长链如乙基或丙基同样可行，其中两个螯合部分连接至模板的每一端。显然，任何适当稳固的键可用于接合模板与连接子部分，包括碳碳键、酯、醚、胺、酰胺、硫醚或二硫键。
[0118] 显然，在式II、III、IV和IVb的结构中，适当时，并未以其它方式被取代(例如被连接子或偶联部分取代)的吡啶环的那些位置可带有在式I中关于R1至R5所述的取代基。特别是，小的烷基取代基如甲基、乙基或丙基可存在于任何位置。
[0119] 八齿配体一般将另外包含至少一个如上文所述的偶联部分。这可为任何合适的结构，包括本文所示的那些中的任何一种，并且将以靶向部分、特异性结合物或能够连接至这种靶向部分或特异性结合物的官能团封端。
[0120] 偶联部分可连接至连接子、模板或螯合部分的任何合适点，例如在如式III中所示的点a)、b)和/或c)处。偶联部分的连接可通过任何适当稳固的键，例如碳碳键、酯、醚、胺、酰胺、硫醚或二硫键。类似地，能够与靶向部分形成任何这些键的基团适于偶联部分的官能末端并且所述部分当连接至靶向部分时将以这些基团封端。
[0121] 作为替代，“主链”型结构示于以下式IV中
[0122]
[0123] 其中所有基团和位置都如上文所示并且“RB”另外为主链部分，其通常将具有类似结构并用于任何本文所示的连接子部分，并且因此在情形允许时，连接子部分的任何定义可适用于主链部分。合适的主链部分将形成骨架，其后借助于其连接子基团连接螯合部分。通常需要三个或四个主链部分。通常对于线性主链将是三个，或者如果主链被环化，则将是四个。特别优选的主链部分包括任选在一端或两端具有杂原子或官能部分的短烃链(例如本文所述的那些)。在这方面，胺和酰胺基团是特别合适的。
[0124] 偶联部分可连接至连接子、主链或螯合部分的任何合适点，例如在如式IV中所示的点a)、b)和/或c')处。偶联部分的连接可能是通过任何适当稳固的键，例如碳碳键、酯、醚、胺、酰胺、硫醚或二硫键。类似地，能够与靶向部分形成任何这些键的基团适于偶联部分的官能末端并且所述部分当连接至靶向部分时将以这些基团封端。
[0125] 通过酰胺连接子基团连接至主链的具有四个3,2-HOPO螯合部分(各自具有一个羟基乙基增溶基团)的“主链”型八齿配体的实例将是如以下式V：
[0126]
[0127] 显然，连接子基团RL可在这个分子上的任何合适点添加，例如在一个仲胺基处或以任何主链烷基上的分支点形式添加。所有小的烷基如主链亚丙基或n取代亚乙基可用其它小的亚烷基如任何本文所述的那些(其中亚甲基、亚乙基、亚丙基和亚丁基是非常合适的)取代。
[0128] 各自具有分别通过乙基酰胺基连接至乙基和丙基二胺的四个3,2-HOPO螯合部分的示例性“模板化”八齿配体将是如以下式VI：
[0129]
[0130] 显然，在式VI中显示为亚乙基部分的任何亚烷基可用其它小的亚烷基如亚甲基、亚丙基或亚正丁基独立地取代。优选在分子中保留一些对称性并且因此例如中心亚乙基可被亚丙基取代，而其它亚乙基保留，或者将HOPO部分连接至一个或两个中心叔胺的两个亚乙基可被亚甲基或亚丙基置换。类似地，如本文所讨论，N取代基团可被如整个本文中所讨论的任何其它羟基烷基置换。
[0131] 如上文所示，八齿配体通常将包括可在任何点接合至配体的其余部分的偶联部分。适用于连接子连接的点示于以下式VI中：
[0132]
[0133] 其中RL是任何合适的连接部分，特别用于连接至组织靶向基团。在活性基团如胺中封端的短烃基如C1至C8环状、支链或直链芳族或脂族基团非常适合作为式VI和整个本文中的基团RL。
[0134] 显示适用于配体连接的位点的非常优选的八齿配体包括以下式VII和VIII的那些：
[0135]
[0136] 其中在式VII和VIII中，RL可为如本文所述的任何合适的连接子基团或反应性部分。RL通常将形成配体与靶向部分的连接点并且因此任何合适的反应性基团可以直接地或使用另一个连接子而用于这种连接。在式VII和VIII中适用于RL的反应性部分包括NH2和NCS基团。
[0137] 根据这个实施方案，以官能化部分封端偶联部分的示例性化合物是以下的结构IX(连接子苯胺基团适当时显然可被如本文所示的任何其它RL基团取代，例如化合物12中的NCS)：
[0138]
[0139] 化合物IX的合成描述于以下并且遵循下列合成路线：
[0140]
[0141] 本文提及的所有文献特此以引用的方式并入，包括Gordon AEV等,Rational design of sequestering agents for plutonium and other actinides.Chem.Rev.2003,103,4207-4282；PCT 专 利 申 请 WO 2008/063721A2 和 T.N.Lambert等,Tetrahedron Letters 43(2002)7379-7383。
[0142] 在本发明的络合物的形成方法中，优选在水溶液中进行反应。这具有若干优点。首先，其消除了制造商去除所有溶剂至可接受水平以下并验证所述去除的负担。其次，其减少废物并且最重要的是其通过避免分离或去除步骤而加速生产。在本发明放射性药物的情形下，重要的是尽可能快速地进行合成，因为放射性同位素将在任何时候衰变并且制备所花费的时间浪费了有价值的物质并引入了污染物子同位素。
[0143] 在一个实施方案中，所述方法包括形成含羟基吡啶酮的八齿配体(如整个本文中所述)的第一水溶液和组织靶向部分(如整个本文中所述)的第二水溶液并且使所述第一水溶液与所述第二水溶液接触。
[0144] 在一个相关实施方案中，在基本上不存在任何有机溶剂的情况下进行本发明的形成方法。在这种情形下，并且“有机溶剂”采用其在室温或大约室温下为液体并且其包含至少一个碳的材料的天然含义。这些有机溶剂通常包含烃、醇、酯、酰胺、酯和/或卤代部分并且这些溶剂优选在本文提及的水溶液中以不超过1重量％(例如0.0001至1重量％)、优选不超过0.5重量％并且最优选不超过0.2重量％的量存在。为了避免疑问，术语“有机溶剂”不涵盖本文提及的靶向部分和配体。某些有机物质如有机酸、胺和其盐可以稍微较高的浓度存在以充当水性溶剂中的pH缓冲剂。在存在时，这些通常将为不超过10重量％(例如0.001至10重量％)、优选不超过5重量％、更优选不超过1重量％的浓度。
[0145] 合适的偶联部分在上文详细讨论并且本文作为偶联和/或连接基团讨论的所有基团和部分可适当用于将靶向部分偶联至配体。一些优选的偶联基团包括酰胺、酯、醚和胺偶联基团。宜借助于从羧酸生成活化酯基来形成酯和酰胺。这种羧酸可存在于靶向部分上、偶联部分上和/或配体部分上并且通常将与醇或胺反应以形成酯或酰胺。这些方法是本领域中众所周知的并且可利用众所周知的活化试剂，包括N-羟基马来酰亚胺、碳化二亚胺和/或偶氮二羧酸酯活化试剂如DCC、DIC、DEAD、DIAD等。附图说明
[0146] 图1：AGC1115在280nm(A)和335nm(B)下的SEC-UV色谱图。平均螯合剂/抗体比率(CAR)为约0.9。
[0147] 图2通过流式细胞术在CD22阳性Raji细胞上分析的AGC1100和AGC1115的结合。使用小鼠抗人IgG Fc、PE缀合的二抗进行检测，并且绘制中值荧光强度(MFI)对一抗的对数浓度(nM)的曲线。将曲妥珠单抗用作同种型对照物。
[0148] 图3：与Th-227标记的AGC0015缀合的C22结合mAb AGC1115(实心圆形)、Th-227标记的AGC0015缀合的对照mAb曲妥珠单抗(实心正方形)或培养基(实心菱形)温育的Ramos细胞。这两种mAb都用Th-227标记至相同特异性活性(44kBq/μg)，并且以3nM(A)使用。
[0149] 现将通过以下非限制性实施例来说明本发明。在实施例中示例的所有化合物构成本发明的优选实施方案(包括优选的中间体和前体)并且在情形允许时在任何方面可单独地使用或以任何组合使用。因此，例如，每个以及所有的实施例2的化合物2至4、实施例3的化合物10和实施例4的化合物7构成其各种类型的优选实施方案。
[0150] 在实施例中，提及下列抗体和抗体缀合物：
[0151] AG01100-如在实施例3中所产生的抗CD22抗体
[0152] AG01115-缀合至高溶解性配体(12)的AG01100
[0153] 实施例1-纯钍-227的分离
[0154] 从锕-227源分离出钍-227。锕-227是通过以下方式产生：镭-226的热中子辐照，接着镭-227衰变(t1/2＝42.2m)为锕-227。通过阴离子交换色谱法在8M HNO3溶液中从锕-227衰变混合物选择性滞留钍-227。使用含有70mg的 1-X8树脂(200-400目，硝酸盐形式)的2mm内径且长度为30mm的柱。在锕-227、镭-223和子体已从柱中洗脱后，用12M HCl从柱中提取钍-227。将含有钍-227的洗脱液蒸发至干燥并且将残余物再次悬浮在0.01M HCl中。
[0155] 实施例2-化合物12的合成
[0156] 步骤1
[0157]
[0158] 将2-苄氧基乙胺(31g，207mmol)和乙醇腈(16mL，70％水溶液，207mmol)溶解在300mL EtOH(绝对)中并且回流4小时。减压除去挥发物。粗产物(24.7g，130mmol)不经进一步纯化即继续进行下一步骤。
[0159] 1H-NMR(CDCl3,400MHz):2.92(m,2H),3.58-3.62(m,4H),4.51(s,2H),7.25-7.37(m,5H)
[0160] 步骤2
[0161]
[0162] 将1(24.7g，130mmol)溶解在无水乙醚中。使HCl(气)鼓泡通过溶液持续30分钟。过滤沉淀物并减压干燥，得到所需产物(27.8g，122.6mmol。所述产物不经进一步纯化或分析即继续进行下一步骤。
[0163] 步骤3
[0164]
[0165] 在室温下将2(27.8g，122.6mmol)溶解在230mL氯苯中。在室温下经30分钟滴加溶解在100mL氯苯中的草酰氯(45mL，530mmol)。在室温下搅拌反应混合物45小时。通过滴加100mL水小心地中止反应。分离各相，并且用3*100mL DCM萃取水相。将有机相合并并用100mL盐水洗涤。有机相经Na2SO4干燥，过滤并且减压除去挥发物。通过干式快速色谱法在SiO2上使用含MeOH(0-2％)的DCM梯度纯化粗产物，得到所需产物(21.2g，70.8mmol)。
[0166] 1H-NMR(CDCl3,400MHz):3.71-3.76(m,2H),4.06-4.12(m,2H),4.47(s,2H),7.217-7.22(m,2H),7.26-7.36(m,4H)
[0167] MS(ESI正离子模式,m/z,):321.0
[0168] 步骤4
[0169]
[0170] 在0℃下将氢化钠(60％分散液，3.60g，90mmol)在50mL THF中搅拌并且经10分钟滴加苄醇(8.3mL，80mmol)。在0℃下搅拌反应混合物30分钟，随后在0℃下滴加溶解在100mL THF中的3(21.2g，70.8mmol)。在室温下将反应混合物在黑暗中搅拌过夜。滴加含
50mL HCl的二噁烷(4M)，然后在真空中缩减反应混合物。加入500mL DCM，接着加入200mL水。分离各相并且用200mL DCM萃取水相。将有机相合并并用100mL盐水洗涤。有机相经Na2SO4干燥，过滤并且减压除去挥发物。在SiO2上使用含MeOH(0-6％)的DCM梯度进行干式快速色谱法，得到所需产物(25.6g，69mmol)。
50mL HCl的二噁烷(4M)，然后在真空中缩减反应混合物。加入500mL DCM，接着加入200mL水。分离各相并且用200mL DCM萃取水相。将有机相合并并用100mL盐水洗涤。有机相经Na2SO4干燥，过滤并且减压除去挥发物。在SiO2上使用含MeOH(0-6％)的DCM梯度进行干式快速色谱法，得到所需产物(25.6g，69mmol)。
[0171] 1H-NMR(CDCl3,300MHz):3.69-3.75(m,2H),4.01-4.07(m,2H),4.46(s,2H),5.37(s,2H),6.97(s,1H),7.19-7.39(m,8H),7.44-7.51(m,2H)
[0172] MS(ESI正离子模式,m/z):371.1,763.2
[0173] 步骤5
[0174]
[0175] 在140℃下加热4(25.6g，69mmol)和丙炔酸乙酯(41mL，0.4mol)持续5小时。将反应混合物冷却至室温并且通过在SiO2上进行干式快速色谱法来纯化反应混合物。利用含MeOH(0-10％)的DCM梯度，得到呈所需4-异构体与5-异构体的不可分离的混合物形式的所需产物。这种混合物(28.6g，约65mmol)不经进一步纯化即直接用于下一步骤中。
[0176] 步骤6
[0177]
[0178] 在0℃下将如先前步骤中所获得的5(28.6g，约65mmol)溶解在300mL THF中。加入100mL KOH(1M，水溶液)，并且在室温下搅拌反应混合物40小时。加入HCL(1M，水溶液)直至pH值为约2(125mL)并且用3*250mL CHCl3萃取水相。将有机相合并并用100mL盐水洗涤，过滤并且在真空中除去挥发物。所得物质(25.9g，约65mmol)不经进一步纯化或分析即直接用于下一步骤中。
[0179] 步骤7
[0180]
[0181] 将如先前步骤中所获得的6(25.9g，约64mmol)部分溶解在400mL DCM中。加入2-噻唑啉-2-硫醇(8.94g，75mmol)和DMAP(0.86g，7mmol)，接着加入DCC(15.48g，75mmol)。在室温下搅拌反应混合物过夜。通过Celite垫过滤反应混合物并且用100mL DCM洗涤Celite垫。在真空中除去挥发物。通过干式快速色谱法在SiO2上依次使用含DCM(50-100％)的庚烷梯度和含THF(0-15％)的DCM梯度纯化产物混合物。将适当馏分在真空中缩减，得到产物的混合物。通过快速色谱法在SiO2上使用含EtOAc(25-75％)的庚烷梯度纯化这种不纯的混合物。将适当馏分在真空中缩减，得到产物的混合物。最后，为得到所需产物，在RP18二氧化硅上使用含MeCN(25-75％)的水的梯度通过干式快速色谱法纯化产物混合物。这得到所需产物(8.65g，18mmol)。
[0182] 1H-NMR(CDCl3,300MHz):2.90(t,J＝7.3Hz,2H),3.77-3.84(m,2H),4.18-4.23(m,2H),4.35(t,J＝ 7.3Hz,2H),4.51(s,2H),5.33(s,2H),6.11(d,7.0Hz,1H),7.21-7.48(m,1
1H)
1H)
[0183] MS(ESI正离子模式,m/z):503.1
[0184] 步骤8
[0185]
[0186] 将7(5.77g，12mmol)和8(1.44g，2.4mmol)部分溶解在40mL DMPU中。滴加DBU(2.7mL，18mmol)。在室温下搅拌反应物4天。通过干式快速色谱法在SiO2上使用含DCM和MeOH的EtOAc梯度纯化，得到所需产物(3.93g，2.15mmol)。
[0187] 1H-NMR(CDCl3,400MHz):2.20-2.32(m,10H),2.44-2.50(m,2H),3.05-3.20(m,10H),3.23-3.27(m,1H),3.69-3.77(m,8H),4.06-4.15(m,8H),4.43(s,8H),5.24(s,8H),6.62(d,J＝7.2Hz,4H),7.13(d,J＝7.2Hz,4H),7.16-7.38(m,42H),7.82-7.93(m,6H)[0188] 步骤9
[0189]
[0190] 在室温下将9(3.93g，2.15mmol)溶解在300mL EtOH中。加入60mL水，接着加入NH4Cl(5.94g，32.3mmol)。将反应混合物加热至60℃，然后加入铁粉(1.80g，32.3mmol)。在60℃下搅拌反应混合物1小时。将反应混合物冷却至室温并且加入400mL DCM和100mL水。过滤反应混合物，并且用100mL水和100mL盐水洗涤有机相。将水相合并并用3*100mL DCM反萃取。将有机相合并，经Na2SO4干燥，过滤并且减压除去挥发物。通过干式快速色谱法在SiO2上使用含MeOH(0-7％)的DCM梯度纯化产物混合物，得到所需产物(3.52g，
1.96mmol)。
1.96mmol)。
[0191] MS(ESI正离子模式,m/z):899.2
[0192] 步骤10
[0193]
[0194] 将10(1.00g，0.56mmol)、Pd(OH)2/C(Pearlman催化剂，1.00g)和10mL AcOH置于压力反应器中。通过吸水器排空反应器并且引入H2(7巴)。将反应混合物搅拌1小时，然后释放压力并且将5mL HCl(6M，水溶液)加入反应混合物中。如先前所述排空反应器并且再次引入H2(7巴)。在搅拌7天后，HPLC指示完全转化。过滤反应混合物并且减压除去挥发物。将残余物溶解在MeOH/MeCN(1:1)中并且通过加入Et2O析出产物。通过离心并且倾析出上清液收集固体，然后在真空中干燥产物(484mg，0.45mmol)。1
[0195] H-NMR(D2O,400MHz):2.70-2.95(m,2H),3.00-3.10(m,2H),3.15-3.65(m,19H),3.75-4.23(m,16H),6.25(bs,4H),7.04(d,J＝7.0Hz,4H),7.44(d,J＝8.2Hz,2H),7.57(d,J＝8.2Hz,2H)
[0196] MS(ESI正离子模式,m/z):1076.4
[0197] 步骤11
[0198]
[0199] 将化合物11(20mg，18μmol)溶解在3mL MeCN和3mL水中。加入20μL硫光气。将反应混合物快速搅拌1小时。减压除去挥发物并且将残余物溶解在4mL MeCN中。通过向40mL Et2O中加入乙腈相来析出产物。通过离心并且倾析出上清液收集固体，然后在真空中干燥产物(10mg，9μmol)。
[0200] MS(ESI正离子模式,m/z):1118.4
[0201] 实施例3：抗CD22单克隆抗体(AGC1100)的生成。
[0202] 如(1)中所述构建单克隆抗体(mAb)hLL2(也称为依帕珠单抗，本文表示为AGC1100)的序列。本实施例中使用的mAb是由Immunomedics Inc,New Jersey,USA制备。可例如在用对编码轻链和重链的基因进行编码的质粒转染的中国仓鼠卵巢悬浮(CHO-S)细胞中进行这种mAb的产生。首先将使用标准程序选择稳定的克隆。在单次使用的生物反应器中约14天后，可在上清液过滤后收集单克隆抗体。将通过蛋白质A亲和色谱法(MabSelect SuRe,Atoll,Weingarten/Germany)以及接着离子交换步骤进一步纯化AGC1100。可使用基于静电和疏水性的第三纯化步骤除去聚集体和潜在的残余杂质。将通过等电聚焦、SDS-PAGE分析、N端测序和LC/MS分析来确认AGC1100的身份。将通过尺寸排阻色谱法(SEC)进一步分析样品纯度。
[0203] 参考文献：
[0204] (1)Leung,Goldenberg,Dion,Pellegrini,Shevitz,Shih,and Hansen.Molecular Immunology32:1413-27,1995。
[0205] 实施例4：AGC1100与螯合剂AGC0015的缀合。
[0206] 将抗体AGC1100与水溶性螯合剂AGC0015缀合。(12)在PBS与70mM硼酸盐缓冲液(pH 8.5)混合的1:1(v/v)混合物中进行缀合反应。螯合剂AGC0015如以下所示：
[0207]
[0208] 将螯合剂AGC0015(以上12)溶解在不含金属的水中，然后将其加入缀合反应中。使用标称摩尔比率为1.3:1的螯合剂/抗体并且在21℃下将反应温育22小时。在反应时间结束时，通过尺寸排阻色谱法在 纯化器(GE Healthcare)上使用HiLoad Superdex
20016/600PG柱(GE Healthcare；代码号28-9893-35)并使用0.9％NaCl、100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)作为流动相，从游离螯合剂中分离出抗体馏分。通过HPLC尺寸排阻色谱法-UV(SEC-UV)分析测定纯化缀合物的最终螯合剂/抗体比率(CAR)。在Agilent 1200系列HPLC系统(AgilentTechnologies)上进行CAR测定，其中柱TSKgel SuperSW 3000，
4.6×300mm，4μm粒子(TosohBioscience，部件号18675)维持在室温下并且流动相为
300mM NaCl、200mM乙酸铵pH 6.8(等度洗脱)，其中总操作时间为15分钟。注射体积为
5μl并且LC流速为0.35ml/min。在280和335nm下监测UV信号，分别对应于mAb和螯合剂最大吸光度。CAR测定的代表性结果呈现于图1中。
20016/600PG柱(GE Healthcare；代码号28-9893-35)并使用0.9％NaCl、100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)作为流动相，从游离螯合剂中分离出抗体馏分。通过HPLC尺寸排阻色谱法-UV(SEC-UV)分析测定纯化缀合物的最终螯合剂/抗体比率(CAR)。在Agilent 1200系列HPLC系统(AgilentTechnologies)上进行CAR测定，其中柱TSKgel SuperSW 3000，
4.6×300mm，4μm粒子(TosohBioscience，部件号18675)维持在室温下并且流动相为
300mM NaCl、200mM乙酸铵pH 6.8(等度洗脱)，其中总操作时间为15分钟。注射体积为
5μl并且LC流速为0.35ml/min。在280和335nm下监测UV信号，分别对应于mAb和螯合剂最大吸光度。CAR测定的代表性结果呈现于图1中。
[0209] 实施例5：抗体/螯合剂缀合物AGC1115与Th-227的螯合227 227
[0210] 从锕-227( Ac)发生器系统中分离出呈4+离子形式的钍-227( Th)。通过阴227 227 227 4+
离子交换色谱法在8M HNO3中从 Ac衰变混合物中选择性滞留 Th，其中用 Th 形成
227 227
带负电的硝酸盐络合物。从柱中洗出 Ac和子体核素并且在12M HCl中洗脱出 Th。将
227
Th-洗脱物蒸发至干燥并且将残余物溶解在0.5M HCl中。
227
离子交换色谱法在8M HNO3中从 Ac衰变混合物中选择性滞留 Th，其中用 Th 形成
227 227
带负电的硝酸盐络合物。从柱中洗出 Ac和子体核素并且在12M HCl中洗脱出 Th。将
227
Th-洗脱物蒸发至干燥并且将残余物溶解在0.5M HCl中。
227
[0211] 在螯合反应中，在每0.5mg抗体缀合物1MBq Th的存在下在21℃/室温下将抗体-缀合物AGC1115在0.9％NaCl 100mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5.5)中温育15分钟。通227
过尺寸排阻色谱法使用NAP-5DNA Grade柱(GE Healthcare)从游离的 Th和子体核素中分离出含有放射性标记的抗体-缀合物的高分子馏分。标记效率通常为96-98％，包括在NAP-5脱盐步骤中的潜在损失。
过尺寸排阻色谱法使用NAP-5DNA Grade柱(GE Healthcare)从游离的 Th和子体核素中分离出含有放射性标记的抗体-缀合物的高分子馏分。标记效率通常为96-98％，包括在NAP-5脱盐步骤中的潜在损失。
[0212] 实施例6：通过流式细胞术进行AGC1115和AGC1100与CD22阳性Raji细胞的结合分析。
[0213] 通过流式细胞术分析AGC1115和AGC1100(抗人CD22，Immunomedics；hLL2，#1003164，10mg/ml)与CD22阳性Raji细胞(ATCC，#CCL-86)的结合。将从拟合曲线测定的EC50值用于比较抗体相对于抗体缀合物结合效能。这种分析用于证实，抗体缀合物与CD22的结合效能不受缀合程序影响。
[0214] 在10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素存在下使Raji细胞在RPMI1640(PAA；#E15-840)中生长。对于流式细胞术分析，通过在4℃下在340×g下离心5分钟来收集50ml细胞培养物。将细胞再次悬浮并在补充有1％FBS的10ml PBS中洗涤两次，并通过在4℃下在340×g下离心5分钟来形成沉淀。随后，将20μl再次悬浮的细胞的制剂以1:500稀释于Coulter Isoton II稀释剂中，并使用Beckman Coulter Z2仪器(Beckman
6
Coulter；CA,USA)计数。将制剂调节至1×10个细胞/毫升的细胞密度并且将100μL转移至V形底96孔板(Nunc/Fisher Scientific；NH,USA)的每个孔中。将细胞短暂离心并在倾析后再次悬浮，将得到每个孔50μl细胞悬浮液的近似体积。
6
Coulter；CA,USA)计数。将制剂调节至1×10个细胞/毫升的细胞密度并且将100μL转移至V形底96孔板(Nunc/Fisher Scientific；NH,USA)的每个孔中。将细胞短暂离心并在倾析后再次悬浮，将得到每个孔50μl细胞悬浮液的近似体积。
[0215] 将AGC1115和AGC1100稀释至50μg/ml并以3倍稀释步骤在12个点滴定。相应地制备同种型对照抗体(曲妥珠单抗)。将来自每一抗体稀释液的100μl加入含有Raji细胞的孔中。在4℃下温育1.5小时后，将细胞短暂离心并以补充有1％FBS的200μl冷PBS洗涤两次。将PE缀合的小鼠抗人IgG Fc(BioLegend；#409304)用作用于检测人mAb的二抗试剂。所述二抗试剂是在补充有1％FBS的PBS中以1μg/ml制备。随后将来自二抗试剂的100μl加入每个孔，然后在4℃下在黑暗中温育1小时。如上文所述将细胞洗涤两次，并且再次悬浮在补充有1％FBS的200μl PBS中。在V形底96孔板中分析所有样品。将荧光信号记录在Beckham Coulter Cell Lab Quanta SC MPL流式细胞仪(Beckman Coulter；CA,USA)上。将中值(MFI)导出到Excel图表中并针对浓度([nM])绘制曲线。
[0216] 在GraphPadPrism(PrismSoftware；CA,USA)中使用“log(激动剂)对反应-可变斜率(四个参数)”结合模型拟合数据并且根据拟合计算EC50值(图2)。用二抗使Raji细胞直接染色显示低本底，MFI值为约1(AGC1115MFI值的0.5-1％)。
[0217] AGC1100和AGC1115的拟合滴定曲线的所计算EC50值分别为9nM和6nM，并且指示缀合物AGC1115的结合效能与AGC1100类似。
[0218] 实施例7：AGC1115-Th-227的Th-227诱导的细胞毒性。
[0219] 在CD22阳性Ramos细胞中研究体外细胞毒性(参见实施例6)。将AGC1115和与AGC0015缀合的对照曲妥珠单抗用于螯合Th-227至特异性活性为44kBq/μg。
[0220] 使Ramos细胞在37℃与5％CO2下生长，并且每周三次分成1:5。在测定前一天，用新培养基更换培养基(具有20％FBS和1％青霉素/链霉素的伊斯科夫改良达尔伯克培养基(IMDM))并且调节体积以得到400000个细胞/毫升。将约1600000个细胞(4mL)加入6孔板的每个孔。将板温育直至第二天，以加入标记的mAb或培养基。
[0221] 在加入标记的mAb或培养基之后，将板再温育4小时。在实验中，将AGC1115或曲妥珠单抗-AGC0015加入每个孔至最终浓度为3nM。在温育后，将细胞在培养基中洗涤两次，并且测量上清液和沉淀中的ATP。然后将细胞分成1:2并在37℃与5％CO2下在培养基中温育。在第3天、第5天和第7天重复相同程序，但仅洗涤一次。
[0222] 将ATP的定量用作不同样品时间下的细胞活力的量度(来自Promega的CellTiter-Glo发光细胞活力测定)，产生图3中所示的曲线。与Th-227标记的对照构建体(未结合至Ramos细胞)相反，结合AGC1115-Th-227的Ramos细胞产生细胞毒性，[0223] 实施例8—酸衍生物
[0224] 制备水溶性螯合剂的酸衍生物能够得到替代偶联化学。
[0225] 这个实施例显示酸衍生物的成功合成。这种螯合剂的衍生物能够例如与肿瘤靶向蛋白质的ε胺形成酰胺键。
[0226] 本实施例显示可溶性螯合剂的合成并从物质11(实施例2)起始。将43mg(约0.04mmol)物质11溶解在4mL DMSO、4mL乙腈和30μL NEt3中。加入6mg琥珀酸酐(0.06mmol)。在室温下反应22小时后反应混合物的LC/MS分析显示已形成物质15。形成一些污染物二酰化副产物。以多份加入酸酐会使酯形成降至最少并提高产物14的摩尔产率。所得反应混合物的HPLC分析示于图6中。
[0227]
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