技术领域
[0001] 本
发明属于医药卫生领域，具体涉及结直肠癌DNA甲基化标志物。
背景技术
[0002] 结直肠癌(CRC)是常见的消化系统
恶性肿瘤，美国等发达国家CRC死亡人数约占癌症死亡人数的10％，仅次于
肺癌而位居第2位。2017年中国肿瘤登记年报显示，我国CRC发病率和死亡率近年来呈明显上升趋势，每年新增CRC病例约40万，每年因CRC死亡病例约19.5万，年增速约为4.2％，超过国际平均
水平2％，CRC防治形势依旧严峻。
[0003] 结直肠癌的防治重在结直肠癌的早期筛查与早期诊断，在
疾病发病期内实现早发现早
治疗，阻止病程进展、防止蔓延或减缓其发展。据2016结直肠癌
预防共识意见显示，Ⅳ期结直肠癌的五年生存率为12％，II-III期为70％，而Isi-I期为90％，可以看出，若能实现早诊早治，将有效延长结直肠癌患者生存期。
[0004] 总之，筛查与早期诊断是结直肠癌防治最经济有效的方法，可发现结直肠癌高危人群，降低结直肠癌的发病率，而早期肠癌的筛查与诊断将有效提高肠癌治疗效果，降低患者死亡率，改善其
生活质量，从而降低医疗
费用，这也是提高我国结直肠癌防治水平的关键。
[0005] 目前用于筛查与早期诊断CRC的手段主要有
电子肠镜(影像学技术)、
粪便潜血实验(FOBT)以及2009年出现的甲基化检测技术(m)SEPT9。
[0006] 电子肠镜技术，需要患者1-3天的肠道准备周期；检测过程中可出现肠道
疼痛和不适感；且有一些禁忌症，如
高血压、冠心病等。这些造成其适用人群的局限性及增加了其在中国推广的难度。
[0007] FOBT也是一项CRC筛查的普遍应用技术，是通过检测粪便中血红蛋白的含量来判断消化道是否出血，如，消化性溃疡、药物致胃黏膜损伤、钩虫病、肠结核、Crohn(克罗恩)病、溃疡性结肠炎、结肠息肉、胃癌、结直肠癌时，FOBT均可阳性。据报道消化性溃疡时，其阳性率为40-70％；消化道癌症时，阳性率达95％。可见，对于CRC筛查，FOBT的敏感度不高。且对于无出血等症状的早期CRC，阳性率几乎为零。
[0008] Septin9(SEPT9)基因血清游离DNA甲基化检测结直肠癌(CRC)敏感度为72％，特异度为86％，其升级版检测
试剂盒(Epi proColon 2.0)敏感度为68-95％，特异度为80-99％。由此可见，SEPT9DNA甲基化检测敏感度与特异度均需提高。故需要开发新的CRC筛查与早诊方法。
发明内容
[0009] 本发明是提供一种结直肠癌DNA甲基化标志物，以解决背景技术中所提出的问题。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明的
实施例提供一种用于预测结直肠癌(CRC)
风险的DNA甲基化标志物集，所述标志物集包括ESR1、ZNF132、ZNF229、ZNF542和ZNF677。
[0011] 本发明的实施例还提供一种用于测定结直肠癌DNA甲基化标志物集的试剂盒，其包含根据ESR1、ZNF132、ZNF229、ZNF542和ZNF677这5种DMR所设计的一种或多种探针。
[0012] 本发明的实施例还一种结直肠癌DNA甲基化标志物集用于制备预测受试者中结直肠癌(CRC)风险的试剂盒的用途。
[0013] 本发明的实施例还一种获取结直肠癌DNA甲基化标志物集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0014] (1)通过下载并整合TCGA与GEO
数据库中结直肠癌患者1104例、腺瘤性息肉患者54例及癌旁正常组织268例的DNA甲基化数据；
[0015] (2)对所得到的DNA甲基化数据进行如下分析：
[0016] (I)定义甲基化区间(MR)，要求其包含至少6个CpG位点且长度小于1000bp，筛选得到共6166个候选MR；
[0017] (II)再根据MR区间在肿瘤组织中平均甲基化率需高于0.50，在腺瘤组织中甲基化率也高于0.50，同时在癌旁组织中平均甲基化率低于0.30的标准，得到共计85个候选差异MR；
[0018] (Ⅲ)剔除了血液中的甲基化背景干扰，通过整合正常对照样本的
全血1438例、
外周血单个核细胞样本111例及外周血白细胞样本529例，从85个候选MR中筛选得到32个MR，其在上述血液组织中的平均甲基化率小于0.10；
[0019] (Ⅳ)剔除MR位于同一基因上的，最终得到10个候选MR；
[0020] (Ⅴ)根据MR位于转录因子结合位点(TFBS)及MR与其基因表达负相关的特点，得到7种候选DMR；
[0021] (Ⅵ)剔除PCR引物设计困难及存在单核苷酸多态性(SNP)的MR，最终得到五个DNA甲基化标志物，即ESR1、ZNF132、ZNF229、ZNF542和ZNF677。
[0022] 进一步的，还包括步骤(3)标志物集的验证，具体包括以下过程，选取CRC患者的癌组织和
配对癌旁组织218例分别两个批次进行验证，发现五个标志物ESR1，ZNF132，ZNF229，ZNF542和ZNF677，以及阳性对照SEPT9基因，在CRC患者的肿瘤中的DNA甲基化水平显著高于癌旁组织中的DNA甲基化水平。
[0023] 本发明还提供一种用于评估结直肠癌DNA甲基化标志物集诊断准确性的方法，其特征在于，将所述标志物集的五个分子标志物作为自变量，利用Logistic回归的方法利用这5个分子标志物构建诊断模型，具体方法如下：
[0024] S1、首先对上述五个基因中的基因i和任意样本j，构造一个k维向量，Mij＝(a1，a2，…，ak)，其中a1-ak分别代表样本j在基因i上的k个CpG位点上的甲基化水平(范围在0–1之间)；针对每个样本，将其在基因i上的k个CpG位点上的DNA甲基化水平转
化成为一个k维的向量；
[0025] S2、利用主成分分析的方法，将每个样本在每个基因上的k维向量进行
降维，并将其第一主成分的值PC1ij作为样本j在基因i上的总体DNA甲基化水平；
[0026] S3、在步骤S2的
基础上，获得了一个j×i的二维矩阵X并用于构建logistic回归方程；同时，构建一个结果向量Y＝(Y1，Y2，…Yn)，其中Yj代表样本j的真实标签，以1代表肿瘤样本，而0代表癌旁样本；通过拟合
[0027]
[0029] 模型3：
[0030] ，阈值为0.24；
[0031] 其中，x1，x2，x3，x4，x5分别代表样本在ESR1、ZNF132、ZNF229、ZNF542和ZNF677基因上的多个位点甲基化率进行主成分分析后得到的第一主成分值PC1；
[0032] S4、在步骤S3的三个模型中，模型1为区分CRC肿瘤与癌旁对照的模型，当y>0.12时，模型判定该样本属于肿瘤样本；模型2为区分KRAS突变阳性的肿瘤与癌旁对照的模型，当y>0.01时，模型判定该样本属于KRAS突变的肿瘤样本；模型3为区分KRAS突变阴性的肿瘤样本与癌旁对照的模型，当y>0.24时，判定该样本属于KRAS突变阴性的肿瘤样本。
[0033] 进一步的，还包括步骤S5、样本分析及模型准确性评估，发现对于模型1，其诊断CRC肿瘤和癌旁的敏感度为0.83，而特异度为0.97；而对于模型2，其诊断KRAS突变阳性的CRC肿瘤和癌旁的敏感度为1，特异度也为1；对于模型3，其诊断KRAS突变阴性的CRC肿瘤和癌旁的敏感度为0.72，特异度为0.93。
[0034] 本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明的结直肠癌DNA甲基化标志物，包括ESR1、ZNF132、ZNF229、ZNF542和ZNF677，这5种
生物标志物的存在和/或水平指示了结肠直肠癌；这5种标志物可用于测定结肠直肠癌的试剂盒，可用于结肠直肠癌的诊断；本发明中的获取DNA甲基化标志物集的方法，提供了一种获取方法，本发明中用于评估结直肠癌DNA甲基化标志物集诊断准确性的方法，构建了诊断模型(模型1、模型2和模型3)，可用于CRC筛查与早期诊断，并优于目前广泛使用的SEPT9方法；可推广应用于结直肠癌的诊断。
附图说明
[0035] 图1为本发明的一种获取结直肠癌DNA甲基化标志物集的方法中实现的技术路线；
[0036] 图2为本发明的一种获取结直肠癌DNA甲基化标志物集的方法中第一批次人群中DNA甲基化热图及统计图；
[0037] 其中，图2A为DNA甲基化热图；图2B为ESR1的甲基化程度统计图；图2C为ZNF132的甲基化程度统计图；图2D为ZNF229的甲基化程度统计图；图2E为ZNF542的甲基化程度统计图；图2F为ZNF677的甲基化程度统计图；图2G为阳性对照SEPT 9的甲基化程度统计图；
[0038] 图3为本发明的一种获取结直肠癌DNA甲基化标志物集的方法中第二批次人群中DNA甲基化热图及统计图；
[0039] 其中，图3A为DNA甲基化热图；图3B为ESR1的甲基化程度统计图；图3C为ZNF132的甲基化程度统计图；图3D为ZNF229的甲基化程度统计图；图3E为ZNF542的甲基化程度统计图；图3F为ZNF677的甲基化程度统计图；图3G为阳性对照SEPT 9的甲基化程度统计图；
[0040] 图4为本发明的用于评估结直肠癌DNA甲基化标志物集诊断准确性的方法中受试者工作曲线(AUC)；
[0041] 其中，图4A为ESR1的诊断效能；图4B为ZNF132的诊断效能；图4C为ZNF229的诊断效能；图4D为ZNF542的诊断效能；图4E为ZNF677的诊断效能；图4F为阳性对照SEPT 9的诊断效能；图4G为的ESR1，ZNF132，ZNF229，ZNF542和ZNF677，以及阳性对照SEPT 9联合的诊断效能；图4H为ESR1和ZNF132联合的诊断效能。
具体实施方式
[0042] 为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。术语如“一个”、“一种”和“所述”不旨在仅指单数的实体，而是包括可用于说明特定实施例的一般类别。本文的术语用于描述本发明的具体实施例，但它们的使用并不限定本发明，除非在
权利要求中指出。
[0043] 在一方面，本发明涉及一种用于预测结直肠癌(CRC)风险的DNA甲基化标志物集，所述标志物集包括ESR1、ZNF132、ZNF229、ZNF542和ZNF677。
[0044] 在另一方面，本发明的实施例还提供一种用于测定结直肠癌DNA甲基化标志物集的试剂盒，其包含根据ESR1、ZNF132、ZNF229、ZNF542和ZNF677这5种DMR所设计的一种或多种探针。
[0045] 在另一方面，本发明的实施例还一种结直肠癌DNA甲基化标志物集用于制备预测受试者中结直肠癌(CRC)风险的试剂盒的用途。
[0046] 在另一方面，本发明的实施例还一种获取结直肠癌DNA甲基化标志物集的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0047] (1)通过下载并整合TCGA与GEO数据库中结直肠癌患者1104例、腺瘤性息肉患者54例及癌旁正常组织268例的DNA甲基化数据。
[0048] (2)对所得到的DNA甲基化数据进行如下分析：
[0049] (I)定义甲基化区间(MR)，要求其包含至少6个CpG位点且长度小于1000bp，筛选得到共6166个候选MR。
[0050] (II)再根据MR区间在肿瘤组织中平均甲基化率需高于0.50，在腺瘤组织中甲基化率也高于0.50，同时在癌旁组织中平均甲基化率低于0.30的标准，得到共计85个候选差异MR。
[0051] (Ⅲ)剔除了血液中的甲基化背景干扰，通过整合正常对照样本的全血1438例、外周血单个核细胞样本111例及外周血白细胞样本529例，从85个候选MR中筛选得到32个MR，其在上述血液组织中的平均甲基化率小于0.10。
[0052] (Ⅳ)剔除MR位于同一基因上的，最终得到10个候选MR。
[0053] (Ⅴ)根据MR位于转录因子结合位点(TFBS)及MR与其基因表达负相关的特点，得到7种候选DMR。
[0054] (Ⅵ)剔除PCR引物设计困难及存在单核苷酸多态性(SNP)的MR，最终得到五个DNA甲基化标志物，即ESR1、ZNF132、ZNF229、ZNF542和ZNF677。
[0055] 在优选的进一步实施例中，还包括步骤(3)标志物集的验证，具体包括以下过程，选取CRC患者的癌组织和配对癌旁组织218例分别两个批次进行验证，发现五个标志物ESR1，ZNF132，ZNF229，ZNF542和ZNF677，以及阳性对照SEPT9基因，在CRC患者的肿瘤中的DNA甲基化水平显著高于癌旁组织中的DNA甲基化水平。
[0056] 在本实施例中，选取218例中国结直肠癌患者及其癌旁正常组织验证了上述差异基因在结直肠癌筛查与早期诊断中的价值，同时以Septin 9基因DMR为阳性对照。技术路线如图1所示；通过两个批次人群进行验证。
[0057] 通过第一批次人群(n＝104)的验证，发现联合KRAS基因突变检测时，KRAS突变型CRC患者，5种DMR，即ESR1，ZNF132，ZNF229，ZNF542和ZNF677，以及阳性对照SEPT 9的甲基化程度均显著KRAS野生型患者和癌旁正常对照组，验证结果如图2所示。同理，通过第二批次人群(n＝114)的验证(n＝114)，同样发现与第一批人群相似的结果，5种DMR，即ESR1，ZNF132，ZNF229，ZNF542和ZNF677，以及阳性对照SEPT 9的甲基化程度均显著KRAS野生型患者和癌旁正常对照组，验证结果如图3所示。
[0058] 在发明中，如果基于CRC患者的基因突变谱，将患者分为KRAS突变阳性和KRAS突变阴性两类，则这两类患者这五个基因上的DNA甲基化水平出现显著差异。其中，KRAS突变阳性的患者的DNA甲基化水平在这五个标志物以及SEPT9这个已知标志物中均显著高于KRAS突变阴性的患者。
[0059] 为了进一步对整合本发明中5个分子标志物的诊断能
力，本发明还提供一种用于评估结直肠癌DNA甲基化标志物集诊断准确性的方法，将所述标志物集的五个分子标志物作为自变量，利用Logistic回归的方法利用这5个分子标志物构建诊断模型，具体方法如下：
[0060] S1、首先对上述五个基因中的基因i和任意样本j，构造一个k维向量，Mij＝(a1，a2，…，ak)，其中a1-ak分别代表样本j在基因i上的k个CpG位点上的甲基化水平(范围在0–1之间)；针对每个样本，将其在基因i上的k个CpG位点上的DNA甲基化水平转化成为一个k维的向量。
[0061] S2、利用主成分分析的方法，将每个样本在每个基因上的k维向量进行降维，并将其第一主成分的值PC1ij作为样本j在基因i上的总体DNA甲基化水平。
[0062] S3、在步骤S2的基础上，获得了一个j×i的二维矩阵X并用于构建logistic回归方程；同时，构建一个结果向量Y＝(Y1，Y2，…Yn)，其中Yj代表样本j的真实标签，以1代表肿瘤样本，而0代表癌旁样本；通过拟合二维矩阵X和结果变量Y，构建了Logistic回归方程，结果如下所示：
[0063] 模型1：
[0064] ，阈值为0.12；
[0065] 模型2：
[0066] ，阈值为0.01；
[0067] 模型3：
[0068] ，阈值为0.24；
[0069] 其中，x1，x2，x3，x4，x5分别代表样本在ESR1、ZNF132、ZNF229、ZNF542和ZNF677基因上的多个位点甲基化率进行主成分分析后得到的第一主成分值PC1。
[0070] S4、在步骤S3的三个模型中，模型1为区分CRC肿瘤与癌旁对照的模型，当y>0.12时，模型判定该样本属于肿瘤样本；模型2为区分KRAS突变阳性的肿瘤与癌旁对照的模型，当y>0.01时，模型判定该样本属于KRAS突变的肿瘤样本；模型3为区分KRAS突变阴性的肿瘤样本与癌旁对照的模型，当y>0.24时，判定该样本属于KRAS突变阴性的肿瘤样本。
[0071] 在优选的进一步实施例中，还包括步骤S5、样本分析及模型准确性评估，发现对于模型1，其诊断CRC肿瘤和癌旁的敏感度为0.83，而特异度为0.97；而对于模型2，其诊断KRAS突变阳性的CRC肿瘤和癌旁的敏感度为1，特异度也为1；对于模型3，其诊断KRAS突变阴性的CRC肿瘤和癌旁的敏感度为0.72，特异度为0.93。
[0072] 在一种用于评估结直肠癌DNA甲基化标志物集诊断准确性的方法中，先选用第一批次的104例对CRC癌组织和癌旁组织进行模型预测能力评估；评估方法如上述步骤S1-S5；为进一步对上述模型的可靠性进行评估，对第二批次独立人群(n＝114)进行验证，发现与第一批次的104例相同，上述五个标志物在CRC肿瘤组织，尤其是KRAS突变阳性的肿瘤组织中显著高甲基化，如图3所示。
[0073] 本发明中利用上述构建的模型1、模型2、模型3，在第二批次样本中进行独立验证，结果表明，基于模型1对CRC总体肿瘤组织和癌旁组织进行区分时，敏感度为0.90，特异度为0.92，显著高于mSEPT9升级版检测试剂盒(Epi proColon 2.0)的敏感度(68-95％)和特异度(80-99％)。而基于模型2对KRAS突变阳性的CRC肿瘤组织及其癌旁进行区分时，敏感度为
0.96，特异度为1；基于模型3对KRAS突变阴性的CRC肿瘤组织及其癌旁进行区分时，敏感度为0.85，特异度为0.85。如图4所示的受试者工作曲线，5种DMR，即ESR1，ZNF132，ZNF229，ZNF542和ZNF677，以及阳性对照SEPT 9联合KRAS突变及KRAS未突变的受试者工作曲线(AUC)，可以发现，ESR1和ZNF132的诊断效能等于或优于SEPT9。
[0074] 以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
