用于治疗结肠直肠癌的方法
阅读：107发布：2020-08-06
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1.用于治疗转移性结肠直肠癌的方法，其包括步骤：施用治疗有效量的包含特异结合至胃泌素原的抗体的组合物至需要治疗转移性结肠直肠癌的患者。
2.权利要求1的方法，其中所述转移性结肠直肠癌位于肝、肺、脑或淋巴结中。
3.权利要求1的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在手术切除转移性结肠直肠肿瘤之前实施。
4.权利要求1的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在手术切除转移性结肠直肠肿瘤之后实施。
5.权利要求1的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在施用转移性结肠直肠肿瘤辐射疗法的剂量之前实施。
6.权利要求1的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在施用转移性结肠直肠肿瘤辐射疗法的剂量之后实施。
7.权利要求1的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在施用治疗转移性结肠直肠肿瘤的化疗剂之前实施。
8.权利要求1的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤与施用治疗转移性结肠直肠肿瘤的化疗剂同时实施。
9.权利要求1的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在施用治疗转移性结肠直肠肿瘤的化疗剂之后实施。
10.根据权利要求7-9任一项的方法，其中所述化疗剂选自以下化疗剂：叶酸拮抗剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、DNA烷化剂、DNA交联药物、抗生素、铂络合物、蛋白体抑制剂、有丝分裂纺锤体毒剂、拓扑异构酶抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
11.权利要求1的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在施用具有针对除胃泌素原之外的特异性的第二治疗性抗体之前实施。
12.权利要求1的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤与施用具有针对除胃泌素原之外的特异性的第二治疗性抗体同时实施。
13.权利要求1的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在施用具有针对除胃泌素原之外的特异性的第二治疗性抗体之后实施。
14.权利要求11-13任一项的方法，其中所述第二抗体特异性结合VEGF或EGFR。
15.权利要求11-13任一项的方法，其中所述第二抗体是选自以下的单克隆抗体：西妥昔单抗、帕尼单抗和贝伐单抗。
16.权利要求1的方法，其中所述抗胃泌素原抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、骆驼化抗体、IgA1抗体、IgA2抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体和IgM抗体。
17.权利要求1的方法，其中所述抗体与部分缀合。
18.权利要求17的方法，其中所述部分是非蛋白质的。
19.权利要求17的方法，其中所述部分有效增加所述抗体的血清半寿期。
20.权利要求1的方法，其中改变所述抗体以增加其与FcRn结合。
21.权利要求1的方法，其中所述抗体具有至少约0.001nM到至少约5000nM的胃泌素原结合亲和力。
22.权利要求1的方法，其中所述组合物包含具有针对胃泌素原不同表位的特异性的多种抗体。
23.权利要求1的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是选自以下的单克隆抗体：
MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、MAb20、MAb21、MAb22和MAb23。
24.权利要求23的方法，其中所述单克隆抗体是人源化的。
25.权利要求1的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是包含重链可变区(VH)的单克隆抗体，在所述重链可变区中，互补决定区1(CDR1)选自VH CDR 1.3、VH CDR 1.4、VH CDR
1.8、VH CDR 1.13、VH CDR 1.16、VH CDR 1.19，CDR2选自VH CDR 2.3、VH CDR 2.4、VH CDR
2.8、VH CDR 2.13、VH CDR 2.16、VH CDR 2.19，并且CDR3选自VH CDR 3.3、VH CDR 3.4、VH CDR 3.8、VH CDR 3.13、VH CDR 3.16、VH CDR 3.19。
26.权利要求1的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是包含轻链可变区(VL)的单
克隆抗体，在所述轻链可变区中互补决定区1(CDR1)选自VL CDR 1.3、VL CDR 1.4、VL CDR
1.8、VL CDR 1.13、Vl CDR 1.16、VL CDR 1.19，CDR2选自VL CDR 2.3、VL CDR 2.4、VL CDR
2.8、VL CDR 2.13、VL CDR 2.16、VL CDR 2.19，并且CDR3选自VL CDR 3.3、VL CDR 3.4、VL CDR 3.8、VL CDR 3.13、VL CDR 3.16、VL CDR 3.19。
27.权利要求1的方法，其中所述抗体能够减少胃泌素原敏感的转移性结肠直肠癌细胞增殖。
28.权利要求1的方法，其中所述抗体能够增加胃泌素原敏感的转移性结肠直肠癌细胞的细胞死亡率。
29.权利要求1的方法，其中所述治疗有效在治疗的受试者中减少结肠直肠癌转移灶的平均数目。
30.权利要求1的方法，其中所述治疗有效在治疗的受试者中减少结肠直肠癌转移灶的平均大小。
31.权利要求1的方法，其中所述治疗有效在治疗的受试者中降低胃泌素原的血液浓度。
32.权利要求1的方法，其中所述抗体组合物通过选自以下的施用模式施用：肠胃外施用、鞘内施用、皮下施用、静脉内施用、肌内施用、腹膜内施用、输注施用和快速浓注施用。
33.权利要求1的方法，其中所述抗胃泌素原抗体以约0.001mg/kg至约250mg/kg的剂量施用。
34.权利要求33的方法，其中所述抗胃泌素原抗体的剂量以多个时间间隔的施用法施用。
35.用于治疗转移性结肠直肠癌的试剂盒，包含单位剂量的抗胃泌素原抗体和稀释剂。
36.权利要求35的试剂盒，还包含用于施用所述抗胃泌素原抗体至需要治疗转移性结肠直肠癌的患者的说明书。
37.用于阻止转移性结肠直肠癌的方法，其包括步骤：以有效阻止转移性结肠直肠癌的量施用包含特异结合至胃泌素原的抗体的组合物至需要阻止转移性结肠直肠癌的患者。
38.权利要求37的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在手术切除原发性结肠直肠肿瘤之前实施。
39.权利要求37的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在手术切除原发性结肠直肠肿瘤之后实施。
40.权利要求37的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在施用原发性结肠直肠肿瘤辐射疗法的剂量之前实施。
41.权利要求37的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在施用原发性结肠直肠肿瘤辐射疗法的剂量之后实施。
42.权利要求37的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在施用有效阻止转移性结肠直肠癌的第二药剂之前、与其同时或之后实施。
43.权利要求42的方法，其中所述第二药剂是有效阻止转移性结肠直肠癌的化疗剂。
44.权利要求43任一项的方法，其中所述化疗剂选自以下化疗剂：叶酸拮抗剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、DNA烷化剂、DNA交联药物、抗生素、铂络合物、蛋白体抑制剂、有丝分裂纺锤体毒剂、拓扑异构酶抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂。
45.权利要求42的方法，其中所述第二药剂是具有针对除胃泌素原之外的特异性的治疗性抗体。
46.权利要求37的方法，其中所述抗胃泌素原抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、骆驼化抗体、IgA1抗体、IgA2抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体和IgM抗体。
47.权利要求37的方法，其中所述抗体与部分缀合。
48.权利要求47的方法，其中所述部分是非蛋白质的。
49.权利要求47的方法，其中所述部分有效增加所述抗体的血清半寿期。
50.权利要求37的方法，其中改变所述抗体以增加其与FcRn结合。
51.权利要求37的方法，其中所述抗体具有至少约0.001nM到至少约5000nM的胃泌素原结合亲和力。
52.权利要求37的方法，其中所述组合物包含具有针对胃泌素原不同表位的特异性的多种抗体。
53.权利要求37的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是选自以下的单克隆抗体：
MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、MAb20、MAb21、MAb22和MAb23。
54.权利要求53的方法，其中所述单克隆抗体是人源化的。
55.权利要求37的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是包含重链可变区(VH)的单克隆抗体，在所述重链可变区中，互补决定区1(CDR1)选自VH CDR 1.3、VH CDR 1.4、VH CDR
1.8、VH CDR 1.13、VH CDR 1.16、VH CDR 1.19，CDR2选自VH CDR 2.3、VH CDR 2.4、VH CDR
2.8、VH CDR 2.13、VH CDR 2.16、VH CDR 2.19，并且CDR3选自VH CDR 3.3、VH CDR 3.4、VH CDR 3.8、VH CDR 3.13、VH CDR 3.16、VH CDR 3.19。
56.权利要求37的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是包含轻链可变区(VL)的单克隆抗体，在所述轻链可变区中，互补决定区1(CDR1)选自VL CDR 1.3、VL CDR 1.4、VL CDR
1.8、VL CDR 1.13、VL CDR 1.16、VLCDR 1.19，CDR2选自VL CDR 2.3、VL CDR 2.4、VL CDR 2.8、VL CDR 2.13、VL CDR 2.16、VL CDR 2.19，并且CDR3选自VL CDR 3.3、VL CDR 3.4、VL CDR
3.8、VL CDR 3.13、VL CDR 3.16、VL CDR 3.19。
57.权利要求37的方法，其中所述抗体能够抑制胃泌素原敏感的转移性结肠直肠癌细胞增殖。
58.权利要求37的方法，其中所述抗体能够增加胃泌素原敏感的转移性结肠直肠癌细胞的细胞死亡率。
59.权利要求37的方法，其中所述抗体的施用有效在治疗的受试者中降低胃泌素原的血液浓度。
60.权利要求37的方法，其中所述抗体组合物通过选自以下的施用模式施用：肠胃外施用、鞘内施用、皮下施用、静脉内施用、肌内施用、腹膜内施用、输注施用和快速浓注施用。
61.权利要求37的方法，其中所述抗胃泌素原抗体以约0.001mg/kg至约250mg/kg的剂量施用。
62.权利要求61的方法，其中所述抗胃泌素原抗体的剂量以多个时间间隔的施用法施用。
63.用于阻止结肠直肠癌复发的方法，其包括步骤：以有效阻止结肠直肠癌复发的量施用包含特异结合至胃泌素原的抗体的组合物至需要阻止结肠直肠癌复发的患者。
64.权利要求63的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在施用有效阻止结肠直肠癌复发的第二药剂之前、与其同时或在其之后实施。
65.权利要求64的方法，其中所述第二药剂是具有针对除胃泌素原之外的特异性的治疗性抗体。
66.权利要求63的方法，其中所述抗胃泌素原抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、骆驼化抗体、IgA1抗体、IgA2抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体和IgM抗体。
67.权利要求63的方法，其中所述抗体与部分缀合。
68.权利要求67的方法，其中所述部分是非蛋白质的。
69.权利要求67的方法，其中所述部分有效增加所述抗体的血清半寿期。
70.权利要求63的方法，其中改变所述抗体以增加其与FcRn结合。
71.权利要求63的方法，其中所述抗体具有至少约0.001nM到至少约5000nM的胃泌素原结合亲和力。
72.权利要求63的方法，其中所述组合物包含具有针对胃泌素原不同表位的特异性的多种抗体。
73.权利要求63的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是选自以下的单克隆抗体：
MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、MAb20、MAb21、MAb22和MAb23。
74.权利要求73的方法，其中所述单克隆抗体是人源化的。
75.权利要求63的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是包含重链可变区(VH)的单克隆抗体，在所述重链可变区中，互补决定区1(CDR1)选自VH CDR 1.3、VH CDR 1.4、VH CDR
1.8、VH CDR 1.13、VH CDR 1.16、VH CDR 1.19，CDR2选自VH CDR 2.3、VH CDR 2.4、VH CDR
2.8、VH CDR 2.13、VH CDR 2.16、VH CDR 2.19，并且CDR3选自VH CDR 3.3、VH CDR 3.4、VH CDR 3.8、VH CDR 3.13、VH CDR 3.16、VH CDR 3.19。
76.权利要求63的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是包含轻链可变区(VL)的单克隆抗体，在所述轻链可变区中，互补决定区1(CDR1)选自VL CDR 1.3、VL CDR 1.4、VL CDR
1.8、VL CDR 1.13、VL CDR 1.16、VLCDR 1.19，CDR2选自VL CDR 2.3、VL CDR 2.4、VL CDR 2.8、VL CDR 2.13、VLCDR 2.16、VLCDR 2.19，并且CDR3选自VL CDR 3.3、VL CDR 3.4、VL CDR 3.8、VL CDR 3.13、VL CDR 3.16、VL CDR 3.19。
77.权利要求63的方法，其中所述抗体能够抑制胃泌素原敏感的结肠直肠癌细胞增殖。
78.权利要求63的方法，其中所述抗体能够增加胃泌素原敏感的结肠直肠癌细胞的细胞死亡率。
79.权利要求63的方法，其中所述抗体的施用有效在治疗的受试者中降低胃泌素原的血液浓度。
80.权利要求63的方法，其中所述抗体组合物通过选自以下的施用模式施用：肠胃外施用、鞘内施用、皮下施用、静脉内施用、肌内施用、腹膜内施用、输注施用和快速浓注施用。
81.权利要求63的方法，其中所述抗胃泌素原抗体以约0.001mg/kg至约250mg/kg的剂量施用。
82.权利要求81的方法，其中所述抗胃泌素原抗体的剂量以多个时间间隔的施用法施用。
83.权利要求63的方法，其中所述患者先前接受过结肠直肠癌治疗，在所述治疗后，所述结肠直肠癌明显消失。
84.权利要求83的方法，其中所述治疗选自手术、辐射疗法、生物疗法、免疫疗法和化疗法。
85.用于在患者中抑制结肠直肠癌干细胞生长的方法，其包括步骤：以有效抑制结肠直肠癌干细胞的量施用包含特异结合至胃泌素原的抗体的组合物至需要抑制所述结肠直肠癌干细胞的患者。
86.权利要求85的方法，其中施用所述抗胃泌素原抗体组合物的步骤在施用有效抑制结肠直肠癌干细胞生长的第二药剂之前、与其同时或在其之后实施。
87.权利要求86的方法，其中所述第二药剂是具有针对除胃泌素原之外的特异性的治疗性抗体。
88.权利要求85的方法，其中所述抗胃泌素原抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、骆驼化抗体、IgA1抗体、IgA2抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体和IgM抗体。
89.权利要求85的方法，其中所述抗体与部分缀合。
90.权利要求89的方法，其中所述部分是非蛋白质的。
91.权利要求89的方法，其中所述部分有效增加所述抗体的血清半寿期。
92.权利要求85的方法，其中改变所述抗体以增加其与FcRn结合。
93.权利要求85的方法，其中所述抗体具有至少约0.001nM到至少约5000nM的胃泌素原结合亲和力。
94.权利要求85的方法，其中所述组合物包含具有针对胃泌素原不同表位的特异性的多种抗体。
95.权利要求85的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是选自以下的单克隆抗体：
MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、MAb20、MAb21、MAb22和MAb23。
96.权利要求95的方法，其中所述单克隆抗体是人源化的。
97.权利要求85的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是包含重链可变区(VH)的单克隆抗体，在所述重链可变区中，互补决定区1(CDR1)选自VH CDR 1.3、VH CDR 1.4、VH CDR
1.8、VH CDR 1.13、VH CDR 1.16、VH CDR 1.19，CDR2选自VH CDR 2.3、VH CDR 2.4、VH CDR
2.8、VH CDR 2.13、VH CDR 2.16、VH CDR 2.19，并且CDR3选自VH CDR 3.3、VH CDR 3.4、VH CDR 3.8、VH CDR 3.13、VH CDR 3.16、VH CDR 3.19。
98.权利要求85的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是包含轻链可变区(VL)的单克隆抗体，在所述轻链可变区中，互补决定区1(CDR1)选自VL CDR 1.3、VL CDR 1.4、VL CDR
1.8、VL CDR 1.13、VL CDR 1.16、VLCDR 1.19，CDR2选自VL CDR 2.3、VL CDR 2.4、VL CDR 2.8、VL CDR 2.13、VL CDR 2.16、VL CDR 2.19，并且CDR3选自VL CDR 3.3、VL CDR 3.4、VL CDR
3.8、VL CDR 3.13、VL CDR 3.16、VL CDR 3.19。
99.权利要求85的方法，其中所述抗体的施用有效在治疗的受试者中降低胃泌素原的血液浓度。
100.权利要求85的方法，其中所述抗体组合物通过选自以下的施用模式施用：肠胃外施用、鞘内施用、皮下施用、静脉内施用、肌内施用、腹膜内施用、输注施用和快速浓注施用。
101.权利要求85的方法，其中所述抗胃泌素原抗体以约0.001mg/kg至约250mg/kg的剂量施用。
102.权利要求101的方法，其中所述抗胃泌素原抗体的剂量以多个时间间隔的施用法施用。
103.用于监测转移性结肠直肠癌疗法在患者中功效的方法，包括步骤(i)确定胃泌素原在从转移性结肠直肠癌疗法之前的患者所获得的第一样品中的浓度，和(ii)将胃泌素原在所述第一样品中的浓度与胃泌素原在从转移性结肠直肠癌疗法之后的相同患者所获得的第二样品中的浓度比较，其中与所述第一样品相比，所述第二样品中胃泌素原浓度的降低表示疗法是有效的。
104.权利要求103的方法，其中所述样品从体液获得。
105.权利要求104的方法，其中体液选自血液、血清和血浆。
106.权利要求103的方法，其中将所述样品作为转移性结肠直肠肿瘤的活组织检查样品获得。
107.权利要求103的方法，其中所述转移性结肠直肠癌疗法选自手术、化疗法、生物疗法、免疫疗法和抗体疗法。
108.权利要求103的方法，其中使用了采用特异结合至胃泌素原的抗体的测定法实施确定第一样品中胃泌素原浓度的所述步骤。
109.权利要求108的方法，其中所述抗体是非中和性的。
110.权利要求108的方法，其中所述抗体选选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、骆驼化抗体、IgA1抗体、IgA2抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体和IgM抗体。
111.权利要求108的方法，其中所述抗体具有至少约0.001nM到至少约5000nM的胃泌素原结合亲和力。
112.权利要求108的方法，其中所述组合物包含具有针对胃泌素原不同表位的特异性的多种抗体。
113.权利要求108的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是选自以下的单克隆抗体：
MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、MAb20、MAb21、MAb22和MAb23。
114.权利要求108的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是包含重链可变区(VH)的单克隆抗体，在所述重链可变区中，互补决定区1(CDR1)选自VH CDR 1.3、VH CDR 1.4、VH CDR
1.8、VH CDR 1.13、VH CDR 1.16、VH CDR 1.19，CDR2选自VH CDR 2.3、VH CDR 2.4、VH CDR
2.8、VH CDR 2.13、VH CDR 2.16、VH CDR 2.19，并且CDR3选自VH CDR 3.3、VH CDR 3.4、VH CDR 3.8、VH CDR 3.13、VH CDR 3.16、VH CDR 3.19。
115.权利要求108的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是包含轻链可变区(VL)的单克隆抗体，在所述轻链可变区中，互补决定区1(CDR1)选自VL CDR 1.3、VL CDR 1.4、VL CDR
1.8、VL CDR 1.13、VL CDR 1.16、VLCDR 1.19，CDR2选自VL CDR 2.3、VL CDR 2.4、VL CDR 2.8、VL CDR 2.13、VL CDR 2.16、VL CDR 2.19，并且CDR3选自VL CDR 3.3、VL CDR 3.4、VL CDR
3.8、VL CDR 3.13、VL CDR 3.16、VL CDR 3.19。
116.权利要求108的方法，其中所述测定法是放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
117.用于诊断结肠直肠癌在患者中存在的方法，包括步骤(i)确定从疑似患有结肠直肠癌的患者获得的样品中胃泌素原的浓度，和(ii)将所述样品中胃泌素原的浓度与预定值比较，其中与预定值相比，样品中升高的胃泌素原水平表示结肠直肠癌在所述患者中存在。
118.权利要求117的方法，其中所述样品从体液获得。
119.权利要求117的方法，其中体液选自血液、血清和血浆。
120.权利要求117的方法，其中使用了采用特异结合至胃泌素原的抗体的测定法实施确定所述样品中胃泌素原浓度的所述步骤。
121.权利要求120的方法，其中所述抗体是非中和性的。
122.权利要求120的方法，其中所述抗体选选自多克隆抗体、单克隆抗体、人源化单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、骆驼化抗体、IgA1抗体、IgA2抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体和IgM抗体。
123.权利要求120的方法，其中所述抗体具有至少约0.001nM到至少约5000nM的胃泌素原结合亲和力。
124.权利要求120的方法，其中所述组合物包含具有针对胃泌素原不同表位的特异性的多种抗体。
125.权利要求120的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是选自以下的单克隆抗体：
MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、MAb20、MAb21、MAb22和MAb23。
126.权利要求120的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是包含重链可变区(VH)的单克隆抗体，在所述重链可变区中，互补决定区1(CDR1)选自VH CDR 1.3、VH CDR 1.4、VH CDR
1.8、VH CDR 1.13、VH CDR 1.16、VH CDR 1.19，CDR2选自VH CDR 2.3、VH CDR 2.4、VH CDR
2.8、VH CDR 2.13、VH CDR 2.16、VH CDR 2.19，并且CDR3选自VH CDR 3.3、VH CDR 3.4、VH CDR 3.8、VH CDR 3.13、VH CDR 3.16、VH CDR 3.19。
127.权利要求120的方法，其中所述胃泌素原特异性抗体是包含轻链可变区(VL)的单克隆抗体，在所述轻链可变区中，互补决定区1(CDR1)选自VL CDR 1.3、VL CDR 1.4、VL CDR
1.8、VL CDR 1.13、VL CDR 1.16、VLCDR 1.19，CDR2选自VL CDR 2.3、VL CDR 2.4、VL CDR 2.8、VL CDR 2.13、VL CDR 2.16、VL CDR 2.19，并且CDR3选自VL CDR 3.3、VL CDR 3.4、VL CDR
3.8、VL CDR 3.13、VL CDR 3.16、VL CDR 3.19。
128.权利要求120的方法，其中所述测定法是放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
129.权利要求117的方法，其中所述方法还包括对所述受试者进行诊断试验以证实结肠直肠癌存在的步骤。
130.权利要求129的方法，其中所述诊断试验选自以下：检测结肠直肠癌的探查手术、检测结肠直肠癌的医学成像检查、检测潜血的患者粪便检验、结肠镜检查、检测表示有结肠直肠癌的遗传物质的患者粪便检验、检查从所述患者获得的样品中存在表示结肠直肠癌存在的因子和检测形成结肠直肠癌的倾向性的基因测试。
131.权利要求129的方法，其中表示结肠直肠癌存在的所述因子是癌胚抗原(CEA)。
132.权利要求129的方法，其中检测形成结肠直肠癌的倾向性的基因测试是检测腺瘤性结肠息肉(APC)基因中突变的基因测试。
133.权利要求117的方法，其中所述患者先前治疗过结肠直肠癌并且在获得所述样品时处于缓解状态。
134.权利要求117的方法，其中预定值基于从无结肠直肠癌的人类群体所获得的相同类型样品中的平均胃泌素原浓度。
135.权利要求117的方法，其中预定值基于在所述患者无结肠直肠癌时从所述患者获得的相同类型样品中的历史平均胃泌素原浓度。
用于治疗结肠直肠癌的方法
[0001] 1.相关申请的交互引用
[0002] 本申请在35U.S.C.§119(e)下要求2010年1月8日提交的临时申请61/293,612号和2010年7月26日提交的临时申请61/367,855号的权益，全部所述临时申请的内容在此完整引入作为参考。
[0004] 序列表在此同时提交。
[0005] 3.发明领域
[0006] 本公开尤其涉及通过施用包含对胃泌素原特异的抗体的组合物来治疗和阻止结肠直肠癌转移和复发的方法。
[0007] 4.背景技术
[0008] 尽管数十年的基础及临床研究，结肠直肠癌仍是人类的大多致死性不可传染的疾病之一。根据世界卫生组织国际癌症研究机构的GLOBOCAN项目，估计在2008年结肠直肠癌的发病率超过120万例，并且同年超过60万人死于本病。然而，尽管最近已经了解更多关于结肠直肠癌如何在分子水平发展，但临床医生仍依赖于前一代肿瘤学家们已经熟悉的治疗模式如手术、辐射和化疗。因成像技术和分子诊断术进展而变得可能的早期诊断在任何疗法的成功中发挥很大作用。虽然全部这些疗法的功效已经改进多年，但是治愈率的改善和寿命的增加已经是递增的。甚至，因分子肿瘤学革命产生的新的靶向疗法在大多数情况下仅适度地改善结局。
[0009] 防治结肠直肠癌患者的两个最有挑战性的方面是转移和复发。
[0010] 在结肠直肠癌扩散至远离原发性肿瘤的器官时，转移发生。尽管经常可能的是切除原发性肿瘤，但是正是转移经常导致杀死患者，因为它们太多或与健康宿主组织交缠在一起以至于不能手术治疗。根据美国癌症协会，在1998年和2000年之间，在美国，诊断患有IIIC期结肠癌的患者的五年存活率是28％，在IV期(即，转移性结肠直肠癌)时降低至仅6％。
[0011] 复发是结肠直肠癌在应答于初始治疗并明显消失后恢复的现象。除了患者及其家属遭受的情绪损失外，复发是个问题，因为复发的癌症可能对有效打击首次癌症的疗法或多种疗法反应性较低。对于其他患者，用于首次癌症的先前疗法可以造成不可逆性副作用，如心脏或神经系统损伤。在此类患者中，使用相同疗法来抗击复发性癌症的风险可能太大。在这些情况下，患者可能具有较少的治疗选项，伴随较大的死亡风险率。
[0012] 尽管辐射疗法、化疗的改善和靶向疗法的进展已经增加遭受结肠直肠癌打击的患者的寿命，但是许多此类患者继续在其诊断后的数月至数年内死亡。因此迫切需要有效对抗转移性结肠直肠癌和结肠直肠癌复发的新疗法。
[0013] 5.发明概述
[0015] 在一些其他实施方案中，通过在手术切除转移性结肠直肠癌之前施用抗胃泌素原抗体组合物治疗患者是有用的。在其他实施方案中，通过在手术切除此类肿瘤之后施用抗体组合物治疗此类患者是有用的。
[0016] 在一些实施方案中，通过在给予辐射疗法至患者之前施用抗胃泌素原抗体组合物治疗患者是有用的。在其他实施方案中，通过在辐射疗法之后施用抗体组合物治疗此类患者是有用的。
[0017] 在一些其他实施方案中，通过在化疗剂之前、与其同时或在其之后施用抗胃泌素原抗体组合物治疗患者是有用的。用于这个目的的有用化疗剂，包括但不限于叶酸拮抗剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、DNA烷化剂、DNA交联药物、抗生素、铂络合物、蛋白体抑制剂、有丝分裂纺锤体毒剂、拓扑异构酶抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂等。
[0018] 在一些其他实施方案中，通过在不同类型的有效对抗转移性结肠直肠癌的抗体之前、与其同时或在其之后施用抗胃泌素原抗体组合物治疗患者是有用的。此类抗体包括但不限于靶向EGFR的抗体(如西妥昔单抗或帕尼单抗)和靶向VEGF的抗体(如贝伐单抗)。
[0019] 为了用于治疗转移性结肠直肠癌的方法中，治疗性抗体可以有效减少转移性结肠直肠癌细胞的增殖或增加转移性结肠直肠癌细胞的分化或其细胞死亡速率、减少结肠直肠转移物的平均数目或大小或降低治疗的患者中胃泌素原的血液浓度。
[0020] 用于本公开方法中的抗体组合物可以被制备为不同制剂，包括但不限于水混悬剂，以通过多种途径施用，所述途径包括但不限于肠胃外施用、鞘内施用、皮下施用、静脉内施用、肌内施用、腹膜内施用、输注施用或快速浓注(bolus)施用。在一些实施方案中，配制组合物用于肠胃外施用，并且在一些具体实施方案中，用于通过输注的静脉内注射。
[0021] 在一些实施方案中，本公开的抗胃泌素原抗体的有效剂量范围从0.001mg/kg至约250mg/kg，所述有效剂量可以按一次施用或经过多次、间隔施用给予。
[0022] 本公开也提供由临床医师和其他人用来促进施用抗胃泌素原抗体组合物至患者的药物试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括处于冻干形成或作为水溶液的本公开的抗胃泌素原抗体、稀释剂如药物级水或缓冲液、和用于施用抗胃泌素原抗体的装置，如注射器和针头。在其他实施方案中，试剂盒可以额外地包括第二治疗剂，如但不限于本公开的化疗剂、本公开的第二抗胃泌素原抗体或其他。
[0023] 还提供了通过以下方式阻止转移性结肠直肠癌的方法：以有效阻止转移性结肠直肠癌的量施用包含特异结合至胃泌素原的抗体的组合物至需要阻止转移性结肠直肠癌的患者。在许多的实施方案中，组合物的抗体有效减少转移性结肠直肠癌细胞的增殖或增加转移性结肠直肠癌细胞的分化或其细胞死亡速率、或者降低治疗的患者中胃泌素原的血液浓度。
[0024] 在一些实施方案中，组合物可以在用于原发性结肠直肠癌的手术或辐射疗法之前或之后或与施用有效阻止转移性结肠直肠癌的化疗剂同时或之后施用。组合物也可以与有效阻止转移性结肠直肠癌的具有除胃泌素原之外的特异性的第二治疗性抗体同时或在其之后施用。
[0025] 还提供了通过以下方式阻止结肠直肠癌复发的方法：以有效阻止结肠直肠癌复发的量施用包含特异结合至胃泌素原的抗体的组合物至需要阻止结肠直肠癌复发的患者。在这些方法的某些方法中，患者先前接受结肠直肠癌疗法如手术、辐射疗法、生物疗法、免疫疗法和化疗，此后结肠直肠癌明显消失。
[0026] 在许多的实施方案中，组合物的抗体有效减少转移性结肠直肠癌细胞的增殖或增加转移性结肠直肠癌细胞的分化或其细胞死亡速率、或者降低治疗的患者中胃泌素原的血液浓度。在其他实施方案中，组合物可以与有效阻止转移性结肠直肠癌的第二治疗剂(包括例如具有除胃泌素原之外的特异性的抗体)同时或在其之后施用。
[0027] 还提供了用于在患者中通过以下方式抑制结肠直肠癌干细胞生长的方法：以有效抑制结肠直肠癌干细胞的量施用包含特异结合至胃泌素原的抗体的组合物至需要抑制所述结肠直肠癌干细胞的患者。
[0028] 在许多的实施方案中，组合物的抗体有效减少结肠直肠癌干细胞的增殖或增加结肠直肠癌干细胞的分化或其细胞死亡速率、或降低治疗的患者中胃泌素原的血液浓度。在其他实施方案中，组合物可以与有效抑制结肠直肠癌干细胞生长的第二治疗剂(例如，具有除胃泌素原之外的特异性的抗体)同时或在其之后施用。
[0029] 还提供了用于通过以下方式监测转移性结肠直肠癌疗法(如化疗、生物疗法、免疫疗法或抗体疗法)在患者中功效的方法：确定胃泌素原在从转移性结肠直肠癌疗法之前的患者所获得的第一样品(如体液或转移性结肠直肠癌的活组织检查样品)中的浓度，并且随后将胃泌素原在所述第一样品中的浓度与胃泌素原在从治疗之后的相同患者所获得的第二样品中的浓度比较，其中与所述第一样品相比，所述第二样品中胃泌素原浓度的降低表示疗法是有效的。
[0030] 在本方法的一些实施方案中，使用了利用对胃泌素原特异的抗体的测定法(如RIA或ELISA)以确定第一和第二样品中胃泌素原的浓度。
[0031] 还提供了通过以下方式诊断结肠直肠癌在患者中存在的方法：确定从疑似患有结肠直肠癌的患者获得的样品(如体液)中胃泌素原的浓度，并且随后将所述样品中胃泌素原的浓度与预定值比较，其中与预定值相比，样品中升高的胃泌素原水平表示结肠直肠癌在患者中存在。在一些实施方案中，预定值基于已知患者无结肠直肠癌时所获得的样品值的平均数，并且在其他实施方案中，预定值基于群体平均数。
[0032] 在本方法的一些实施方案中，患者先前治疗过结肠直肠癌并且在获得样品时处于缓解状态。在其他实施方案中，该方法包括对患者进行第二诊断试验以证实结肠直肠癌存在的额外步骤，所述第二诊断试验包括例如，血液检查、医学成像检查或基因测试。在一些实施方案中，血液检查是检测癌胚抗原，并且在其他实施方案中，基因测试是检测腺瘤性结肠息肉(APC)基因中的突变。在又一些实施方案中，使用了利用对胃泌素原特异的抗体的测定法(如RIA或ELISA)以确定样品中胃泌素原的浓度。
[0033] 许多不同类型的特异结合至胃泌素原的抗体可以有效用于治疗转移性结肠直肠癌。这包括但不限于多克隆抗体；单克隆抗体，其可以经过人源化；以及嵌合抗体、具有IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM同种型的抗体、和单链抗体。在一些其他实施方案中，用于本公开方法的抗体包括与部分缀合的抗体，所述的部分有用地改变抗体的功能或特征，例如但不限于增加血清半寿期。在另外的实施方案中，可以为相似目的或其它目的实施氨基酸变化。
[0034] 在一些实施方案中，抗体仅识别胃泌素原的一个表位。在其他实施方案中，可以使用对胃泌素原的不同表位特异的抗体的混合物。
[0035] 用于治疗转移性结肠直肠癌的方法中的抗体可以具有针对胃泌素原的结合亲和力范围，例如，约5000nM或甚至更高，例如，至少约4000nM、3000nM、2000nM、1000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、
50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或
0.001nM。
50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或
0.001nM。
[0036] 在所公开的方法的某些实施方案中，可以使用如本文中公开的单克隆抗体，包括例如MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19、MAb20、MAb21、MAb22、MAb23或其他。
[0037] 在所公开的方法的其他实施方案中，可以使用如本文中公开的单克隆抗体，包括例如，单克隆抗体具有其中第一CDR选自VH CDR 1.3、VH CDR 1.4、VH CDR 1.8、VH CDR 1.13、VH CDR 1.16、VH CDR 1.19，第二CDR选自VH CDR 2.3、VH CDR 2.4、VH CDR 2.8、VH CDR 2.13、VH CDR 2.16、VH CDR 2.19并且第三CDR选自VH CDR 3.3、VH CDR 3.4、VH CDR 3.8、VH CDR3.13、VH CDR 3.16、VH CDR 3.19的重链可变区(VH)。下文描述这些CDR的具体序列。其他的有用抗体具有其中第一CDR选自VL CDR 1.3、VL CDR 1.4、VL CDR 1.8、VL CDR 1.13、VL CDR 1.16、VL CDR 1.19，第二CDR选自VL CDR 2.3、VL CDR 2.4、VL CDR 2.8、VL CDR 2.13、VL CDR 2.16、VL CDR 2.19并且第三CDR选自VL CDR 3.3、VL CDR 3.4、VL CDR 3.8、VL CDR
3.13、VL CDR 3.16、VL CDR 3.19的轻链区域(VL)。还在下文描述这些CDR的具体序列。
3.13、VL CDR 3.16、VL CDR 3.19的轻链区域(VL)。还在下文描述这些CDR的具体序列。
[0039] 图1提供了比较不同的人原发性和转移性结肠直肠癌细胞系当中胃泌素基因表达水平的图。
[0040] 图2提供了比较来自11位不同患者的每位患者的转移性结肠直肠肿瘤中相对胃泌素基因表达水平的图。来自每位患者的转移性结肠直肠肿瘤中的表达水平对匹配的来自同一位患者的原发性结肠直肠肿瘤中的表达水平归一化。
[0041] 图3提供了图，其比较由3种不同的转移性结肠直肠癌细胞系分泌至生长培养基中的胃泌素原的量。
[0042] 图4提供了图，其显示与健康对照相比，原发性结肠直肠癌患者、转移性结肠直肠癌患者和切除原发性肿瘤的转移性结肠直肠癌患者中的血浆或血清胃泌素原浓度。
[0043] 图5提供了图，其比较了对照和抗hPG多克隆抗体对培养的SW620转移性结肠直肠癌细胞生长的影响。
[0044] 图6A提供了图，其比较了对照和4种不同的抗hPG单克隆抗体(MAb1-MAb4)对培养的SW620转移性结肠直肠癌细胞生长的影响。
[0045] 图6B提供了图，其比较了与对照抗体相比，19种不同的抗hPG单克隆抗体(MAb5-MAb23)对培养的SW620转移性结肠直肠癌细胞生长的影响。
[0046] 图7提供了图，其比较了对照和抗hPG单克隆抗体对培养的T84转移性结肠直肠癌细胞生长的影响。
[0047] 图8A提供其中不存在可视转移灶的肝脏的照片，所述肝脏从用抗hPG多克隆抗体处理的裸小鼠取出。将SW620细胞注射至裸小鼠的脾中并且随后用抗hPG多克隆抗体、对照多克隆抗体或磷酸盐缓冲盐水处理6周。
[0048] 图8B提供具有可视转移灶的肝脏的照片，所述肝脏从用对照多克隆抗体处理的裸小鼠取出。将SW620细胞注射至裸小鼠的脾中并且随后用抗hPG多克隆抗体、对照多克隆抗体或磷酸盐缓冲盐水处理6周。
[0049] 图9提供了比较可视肝转移的数目的图，所述的可视肝转移在将SW620细胞注射至裸小鼠的脾中并且随后用抗hPG多克隆抗体、对照多克隆抗体或磷酸盐缓冲盐水处理6周后形成。
[0050] 图10提供了示例性肝脏微转移的显微照片，所述的肝脏微转移在将SW620细胞注射至对照裸小鼠的脾中并且随后用对照多克隆抗体或磷酸盐缓冲盐水处理6周后形成。
[0051] 图11提供了比较可视肝转移的数目的图，所述的可视肝转移在将SW620细胞注射至裸小鼠的脾中并且随后相对于对照抗体而言用抗hPG单克隆抗体处理6周后形成。
[0052] 图12提供了图，其显示低黏附培养条件下培育对原发性和转移性结肠直肠癌细胞系以及从原发性人结肠直肠癌的活组织检查样品中获得的细胞表达干细胞标志物LGR5的影响。
[0053] 图13提供了图，其显示低黏附培养条件下培育对原发性和转移性结肠直肠癌细胞系以及从原发性人结肠直肠癌的活组织检查样品中获得的细胞表达的胃泌素mRNA量的影响。
[0054] 图14提供了图，其显示由低黏附培养条件下培育的原发性和转移性结肠直肠癌细胞系以及从原发性人结肠直肠癌的活组织检查样品获得的细胞分泌至培养基中的胃泌素原的量。
[0055] 图15提供了图，其显示抗胃泌素原多克隆抗体对低黏附培养条件下培育的HT-29原发性结肠直肠癌细胞形成球状体的影响。
[0056] 图16提供了图，其显示抗胃泌素原多克隆抗体对低黏附培养条件下培育的HCT116原发性结肠直肠癌细胞形成球状体的影响。
[0057] 图17提供了图，其显示抗胃泌素原多克隆抗体对低黏附培养条件下培育的细胞形成球状体的影响，所述细胞从原发性人结肠直肠癌的活组织检查样品获得。
[0058] 图18A提供了图，其显示两种抗胃泌素原单克隆抗体对低黏附培养条件下孵育14日的LGR5阳性HT29原发性结肠直肠癌细胞形成球状体的影响。
[0059] 图18B提供了图，其显示抗胃泌素原单克隆抗体处理对低黏附培养下的LGR5阳性HT29原发性结肠直肠癌细胞形成球状体的抑制性作用在移去抗体后持续至少17日。
[0060] 图19A提供了图，其显示两种抗胃泌素原单克隆抗体对低黏附培养条件下孵育14日的LGR5阳性HCT116原发性结肠直肠癌细胞形成球状体的影响。
[0061] 图19B提供了图，其显示抗胃泌素原单克隆抗体处理对低黏附培养下的LGR5阳性HCT116原发性结肠直肠癌细胞形成球状体的抑制性作用在移去抗体后持续至少17日。
[0062] 图20提供了图，其显示用4种不同抗胃泌素原单克隆抗体处理对低黏附培养条件下培育的CRC1原发性结肠直肠癌细胞形成球状体的影响。
[0063] 图21提供了图，其显示抗胃泌素原单克隆抗体对低黏附培养条件下培育的T84转移性结肠直肠癌细胞形成球状体的影响。
[0064] 图22提供了图，其显示用4种不同抗胃泌素原单克隆抗体处理对常规组织培养条件下培育的ALDH1阳性原发性结肠直肠癌细胞生长的影响。
[0065] 图23提供了图，其显示用4种不同抗胃泌素原单克隆抗体预处理对低黏附培养条件下培育时原发性结肠直肠癌细胞生长为球状体的影响。
[0066] 图24提供了图，其显示抗胃泌素原单克隆抗体预处理对T84转移性结肠直肠癌细胞中癌干细胞标志物ALDH1的表达的影响。
[0067] 图25提供了图，其显示抗胃泌素原单克隆抗体预处理对SW620转移性结肠直肠癌细胞中癌干细胞标志物ALDH1的表达的影响。
[0068] 图26提供了图，其显示抗胃泌素原单克隆抗体预处理对低黏附培养条件下培育的T84转移性结肠直肠癌细胞形成球状体的影响。
[0069] 图27提供了图，其显示抗胃泌素原单克隆抗体预处理对低黏附培养条件下培育的SW620转移性结肠直肠癌细胞形成球状体的影响。
[0070] 图28提供了图，其显示用抗胃泌素原单克隆抗体处理携带人转移性结肠直肠癌异种移植物的小鼠影响从该异种移植物分离的转移性结肠直肠癌细胞在低黏附培养条件下生长为球状体的能力。
[0071] 图29提供了图，其显示用抗胃泌素原单克隆抗体处理携带人转移性结肠直肠癌异种移植物的小鼠影响从该异种移植物分离的转移性结肠直肠癌细胞在移植入其他小鼠时启动新肿瘤生长的能力。
[0072] 图30提供其中信号肽序列加下划线的人前胃泌素原(SEQ ID NO：100)、人成熟胃泌素原(SEQ ID NO：101)和胃泌素原加工的某些产物(包括G34(SEQ ID NO：102)、G34-Gly(SEQ ID NO：103)、G17(SEQ ID NO：104)、G17-Gly(SEQ ID NO：105)和CTFP(SEQ ID NO：106))的氨基酸序列。
[0073] 图31提供某些示例性鼠抗hPG单克隆抗体的可变轻链和可变重链的多核苷酸序列和氨基酸序列。在每种情况下，3个CDR以粗体加下划线的字体显示。具体而言：
[0074] 图31A提供鼠抗hPG MAb3的VH链的多肽序列(SEQ ID NO：12)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：16)；
[0075] 图31B提供鼠抗hPG MAb3的VL链的多肽序列(SEQ ID NO：13)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：17)；
[0076] 图31C提供鼠抗hPG MAb4的VH链的多肽序列(SEQ ID NO：14)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：18)；
[0077] 图31D提供鼠抗hPG MAb4的VL链的多肽序列(SEQ ID NO：15)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：19)；
[0078] 图31E提供鼠抗hPG MAb8的VH链的多肽序列(SEQ ID NO：59)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：67)；
[0079] 图31F提供鼠抗hPG MAb8的VL链的多肽序列(SEQ ID NO：63)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：71)；
[0080] 图31G提供鼠抗hPG MAb13的VH链的多肽序列(SEQ ID NO：60)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：68)；
[0081] 图31H提供鼠抗hPG MAb13的VL链的多肽序列(SEQ ID NO：64)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：72)；
[0082] 图31I提供鼠抗hPG MAb16的VH链的多肽序列(SEQ ID NO：61)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：69)；
[0083] 图31J提供鼠抗hPG MAb16的VL链的多肽序列(SEQ ID NO：65)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：73)；
[0084] 图31K提供鼠抗hPG MAb19的VH链的多肽序列(SEQ ID NO：62)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：70)；和
[0085] 图31L提供鼠抗hPG MAb19的VL链的多肽序列(SEQ ID NO：66)和编码它的多核苷酸序列(SEQ ID NO：74)。
[0086] 图32提供了本文所述选择的抗hPG单克隆抗体的人源化可变重链和轻链的突出(projected)多肽序列。在每种情况下，3个CDR以粗体加下划线的字体显示。具体而言：
[0087] 图32A提供人源化MAb3的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：21)；
[0088] 图32B提供人源化MAb3的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：22)；
[0089] 图32C提供人源化MAb4的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：23)；
[0090] 图32D提供人源化MAb4的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：24)；
[0091] 图32E提供人源化MAb8(a)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：75)；
[0092] 图32F提供人源化MAb8(a)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：76)；
[0093] 图32G提供人源化MAb8(b)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：77)；
[0094] 图32H提供人源化MAb8(b)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：78)；
[0095] 图32I提供人源化MAb8(c)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：79)；
[0096] 图32J提供人源化MAb8(c)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：76)；
[0097] 图32K提供人源化MAb13(a)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：80)；
[0098] 图32L提供人源化MAb13(a)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：81)；
[0099] 图32M提供人源化MAb13(b)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：82)；
[0100] 图32N提供人源化MAb13(b)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：83)；
[0101] 图32O提供人源化MAb16(a)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：84)；
[0102] 图32P提供人源化MAb16(a)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：85)；
[0103] 图32Q提供人源化MAb16(b)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：86)；
[0104] 图32R提供人源化MAb16(b)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：87)；
[0105] 图32S提供人源化MAb16(c)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：88)；
[0106] 图32T提供人源化MAb16(c)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：89)；
[0107] 图32U提供人源化MAb19(a)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：90)；
[0108] 图32V提供人源化MAb19(a)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：91)；
[0109] 图32W提供人源化MAb19(b)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：92)；
[0110] 图32X提供人源化MAb19(b)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：93)；
[0111] 图32Y提供人源化MAb19(c)的VH链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：94)；和[0112] 图32Z提供人源化MAb19(c)的VL链的突出氨基酸序列(SEQ ID NO：95)。
[0113] 7.具体描述
[0114] 7.1.结肠直肠癌转移
[0115] 转移指癌症扩散的过程。简而言之，肿瘤细胞离开原发性肿瘤，经血液循环或淋巴液系统行进至新组织部位并且形成继发性肿瘤。在新组织部位的肿瘤称作转移性肿瘤，并且一般地鉴定原发性肿瘤的来源。例如，已经扩散至其他组织的结肠直肠癌称作“转移性结肠直肠癌”，无论继发性、转移性肿瘤的组织位置在哪里。结肠直肠癌转移到达的最常见器官是肝和肺，但是结肠直肠癌也可以扩散至其他器官。
[0116] 癌细胞经常扩散至原发性肿瘤附近的淋巴结，这称作淋巴结累及或区域性疾病。
[0117] 不希望受任何具体操作理论约束，认为转移经由众多不同的步骤进行，包括侵入和移行、进入血管、循环、外渗和定居、增殖和血管生成。在侵入和移行期间，各个细胞自身从原发性肿瘤脱离并侵入相邻的健康组织。为实现这一点，癌细胞推定经历表型转化，称作上皮至间质转变。Kalluri，R.，等，J.Clin.Invest.，119(6)(2009)，1420-28。此类细胞可以产生能够降解胞外基质的酶，从而促进从原发性肿瘤移行出来并进入周围健康组织。在移行的癌细胞遇到血管或淋巴管时，它将自身插入内衬脉管的内皮细胞之间并且渗入血流或淋巴系统中。异常的细胞随后经循环系统或淋巴系统行至新的器官。癌细胞随后可以寄宿在新器官的毛细管或淋巴管并且随后通过渗透内皮而外渗至组织间隙中。最后，在定居、增殖和血管生成期间，转移性癌细胞在其新宿主组织中占据居所并且开始生长。当新的转移性肿瘤达到足够尺寸时，它可以分泌生长因子，如VEGF，以刺激新血管生长至肿瘤中，以供应快速生长的肿瘤所需要的氧和营养。
[0118] 7.2.结肠直肠癌复发
[0119] 结肠直肠癌复发定义为结肠直肠癌在明显导致结肠直肠癌消失的治疗后回复。如果回复的结肠直肠癌处于原始癌的相同位置或与它十分接近，则将它称作本地复发。当回复的结肠直肠癌在原始癌的位置附近的淋巴结或组织中生长时，将它称作区域性复发，并且当回复的结肠直肠癌转移至远离原始癌位置的器官或组织时，将它称作远端复发。
[0120] 7.3.癌干细胞和结肠直肠癌
[0121] 实体肿瘤不必然是均质组织。相反地，一些肿瘤包含具有不同表型特性和功能特性的多种异常细胞类型。在这个方面，此类肿瘤类似于异常器官。构成实体肿瘤的细胞之间的一个重要差异是它们能够在移植至相同宿主中的新位点或移植至相同或不同物种的新宿主时启动新肿瘤形成的程度。具有这种特性的细胞称作启动肿瘤或癌症的细胞，或备选地，肿瘤干细胞或癌干细胞。相反地，构成肿瘤的其他细胞具有相当程度地降低的移植后启动新肿瘤的潜力，甚至当使用更多细胞时也是如此。在一个非限制性实例中，源自人肿瘤的几百个结肠癌干细胞在移植入小鼠后足以启动新肿瘤，而来自所述肿瘤的10,000个非干细胞不足以做到这一点。Dalerba，P.，等，2007，“Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells(人结肠直肠癌干细胞的表型表征)，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA，104：10158-10163。
[0122] 在许多肿瘤中，癌干细胞包含在肿瘤内部相对小比例的完全活的细胞。相反地，在移植时，构成肿瘤主体的大部分肿瘤细胞不能启动新肿瘤。然而，在一些肿瘤中，癌干细胞可以构成肿瘤的大部分或甚至全部细胞。如本文所用，主体肿瘤细胞(bulk tumor cells)指移植时不能启动新肿瘤的肿瘤细胞，除非使用大量的此类细胞。癌干细胞还具有与主体肿瘤细胞不同的表型特征，包括自我更新和移植相对小数目的癌干细胞后形成新肿瘤的能力，和通过荧光激活细胞分选法(FACS)或其他测定法可检测的不同标志物的表达。癌干细胞与主体肿瘤细胞之间的其他差异也是可能的。
[0123] 不希望受任何具体操作理论约束，认为癌干细胞与正常干细胞共享某些特性，所述特性在癌干细胞的背景下有助于它们产生肿瘤的能力。具体而言，癌干细胞经历非对称性细胞分裂以产生两个类型的子细胞。第一类细胞保持非分化并且保留其亲本能够无限自我更新的干细胞特征。另一类子细胞，称作祖先细胞，能够分裂和分化，虽然是异常的，以产生许多实体肿瘤存在的一系列更为分化的细胞。祖先细胞以高于干细胞的速率增殖并且因而对肿瘤的物理生长有贡献，而干细胞通过产生新的祖先细胞负责肿瘤无限生长的能力。
[0124] 这些特性允许癌干细胞最终产生构成正在生长的肿瘤的巨大数目的细胞。因而，移植入新动物时，癌干细胞可以重构它们从中发源的肿瘤类型，甚至在多次连续移植后也是如此。然而，不同于正常干细胞，癌干细胞携带可以导致增殖模式改变和/或低凋亡率以及导致异常分化的遗传突变和/或后生遗传变化，所述异常分化引起可以构成肿瘤主体的异常细胞积累。
[0125] 癌干细胞可以根据使其与主体肿瘤细胞区分的众多表型特征来鉴定。首先，如上文所示，癌干细胞具有移植入新宿主时启动新肿瘤的能力。相反地，主体肿瘤细胞不能启动新肿瘤或需要比癌干细胞更多的细胞以实现新肿瘤启动。癌干细胞还因它们表达或不表达某些标志物而是可鉴定的，而来自相同肿瘤的主体肿瘤细胞具有不同的标志物表达模式。与主体肿瘤细胞相比，癌干细胞还具有在无血清低黏附培养条件下生长并且形成所谓球状体的优先能力。能够将癌干细胞与主体肿瘤细胞区分的其他表型差异是可能的。
[0126] 如上文指出，也可以根据单独或与其他标志物组合的某些标志物的表达模式鉴定癌干细胞。然而，来自不同肿瘤的癌干细胞可以显示不同的标志物表型。此类标志物包括在细胞内部或在细胞表面上表达的蛋白质，并且可以使用多种技术检测到，包括但不限于免疫组织化学法、免疫荧光法和FACS分析。根据本领域普通技术人员的知识，用于检测标志物的其他技术也是可能的。标志物也包括癌干细胞中可以功能性测定其活性的蛋白质。标志物类型的非限制性实例包括转运蛋白，如从细胞输出物质或将物质摄入细胞的那些转运蛋白，酶，如脱毒酶。
[0127] 可以用来鉴定结肠直肠癌干细胞的示例性标志物包括但不限于：CD133、CD44、CD166、EpCAM和LGR5。用于鉴定结肠直肠癌干细胞的其他标志物也是可能的。在一些实施方案中，某标志物表达不存在指示了癌干细胞表型。此外，醛脱氢酶1(ALDH1)是脱毒酶并且可以对癌细胞测定增加的ALDH1活性(癌干细胞的另一个标志物)。
[0128] 在本公开的一些实施方案中，可以使用FACS或本领域普通技术人员熟悉的其他技术，通过以下标志物表型鉴定结肠直肠癌干细胞：EpCAM(hi)CD44(+)、EpCAM(hi)CD44(+)CD166(+)、CD133(+)、ALDH1(+)、CD133(-)/ALDH1(+)、CD44(+)/CD24(+)或LGR5(+)。其他标志物的表达及其组合和模式也可以用来鉴定在这些癌症以及其他癌症类型中的癌干细胞。
[0129] 在本公开的其他实施方案中，癌干细胞可以使用FACS分析来鉴定，因为这些细胞根据它们排除某些染料偏好的能力被分选成所谓边侧群体(side population)。这种染料的一个非限制性实例是Hoechst染料33342。
[0130] 如上文指出，癌干细胞也可以因它们在移植入新宿主后启动新肿瘤生长的能力增加而与主体肿瘤细胞区分。因而，证实疑似为癌干细胞的细胞群体的身份的一种方式是与主体肿瘤细胞相比，测试相对小群体的此类细胞在移植入非人类受体动物后启动肿瘤生长的能力。
[0131] 用于评估肿瘤或细胞系是否含有癌干细胞的移植方法是本领域普通技术人员熟悉的。作为非限制性实例，分离疑似含有癌干细胞的肿瘤或其部分，如通过手术切除。此后，将肿瘤组织切碎并用酶处理或进行有效解散肿瘤和释放其组成细胞的一些其他处理。备选地，在分析细胞系时，可以仅需要用酶促或化学处理法使细胞解离。
[0132] 在制备细胞悬液后，通过离心收集细胞，并且根据本领域已知的方法分离出已知与癌干细胞相对应的亚群。如上文讨论，在一个非限制性实例中，此类细胞表现出指示癌干细胞的某些标志物模式，这些标志物模式是使用特异性抗体和荧光激活细胞分选法(FACS)可检测的。在其他实施方案中，疑似含有癌干细胞的亚群可以根据其他表型特征分离，如它们排除某些染料的能力。
[0133] 在分离相关细胞亚群后，随后将预定数目的此类细胞植入受体动物中的一个或多个靶组织或靶器官。在一些实施方案中，受体动物是免疫缺陷性小鼠，包括但不限于裸小鼠、重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠和非肥胖糖尿病SCID(NOD-SCID)小鼠。根据普通技术人员的知识，也可以使用其他物种。
[0134] 细胞可以皮下地植入脂肪垫(如小鼠的乳腺脂肪垫)中、植入脑、盲肠、胰或肝脏或植入肾中(如植入肾囊)。细胞也可以植入其他组织和器官中。在一些实施方案中，选择靶组织或器官以复制所分析的肿瘤起源的组织或器官。然而，在其他实施方案中，选择所植入细胞驻留的独特组织或器官。作为非限制性实例，可以将结肠癌干细胞移植入NOD-SCID小鼠的肾囊以评估它们启动新肿瘤的能力。
[0135] 在植入(这使用普通技术人员熟悉的技术实施)后，任由细胞不扰动以确定新肿瘤是否在植入部位生长。对于皮下植入的细胞，可以通过目视检查和触诊植入部位评估肿瘤生长。如果肿瘤的确生长，可以使用卡尺经过一段时间测量其大小。对于器官内部植入的细胞，可以在植入后的预定时间处死动物以确定肿瘤是否存在，并且如果存在，确定其大小。备选地，根据普通技术人员的知识，非侵入性技术可以用来评估肿瘤生长。
[0136] 癌干细胞表型也以癌干细胞在无血清、低黏附培养条件下生长为球状体的偏好能力为特征，而主体肿瘤细胞较不可能在相同条件下能够生长为球状体。球状体是致密的细胞球，这些细胞球在某些细胞作为解聚集的悬液接种后在培养下生长时形成。在无血清培养基中通常在特定生长因子存在下(包括但不限于表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))和在具有哺乳动物细胞对其黏附不良的表面的组织培养皿中培育细胞时，引发此类球状体的形成。类似于来自正常组织的干细胞，已经发现癌干细胞在适宜的培养条件下优先地生长为球状体。见，例如，Rappa，G.等，Exp.Cell Res.，314：2110(2008)；Singh，S.K.等，Cancer Res.，63：5821(2003)；Fang，D.等，Cancer Res.，65：9328(2005)。
相反地，倾向于更高度分化的主体肿瘤细胞在相同的培养条件较不可能形成球状体。在主体肿瘤细胞能够形成球状体的情况下，与相似数目的癌干细胞形成的那些球状体相比，这些球状体倾向于更小和/或在数目上更少。
相反地，倾向于更高度分化的主体肿瘤细胞在相同的培养条件较不可能形成球状体。在主体肿瘤细胞能够形成球状体的情况下，与相似数目的癌干细胞形成的那些球状体相比，这些球状体倾向于更小和/或在数目上更少。
[0137] 7.4.癌干细胞和结肠直肠癌复发
[0138] 已经鉴定到具有癌干细胞特性的显示增强的辐射和/或化疗剂耐药性的肿瘤细胞。已经提出不同的分子机制以解释癌干细胞对辐射或化疗剂的抵抗。例如，已经报道某些癌干细胞可以在基因毒性攻击后能够更轻易地修复它们的DNA，而其他癌干细胞表达高水平的抗凋亡蛋白或高水平的有效消除进入此类细胞的化疗剂的分子泵。Eyler，C.E.和J.N.Rich，J.Clin.Oncol.，26：2839-2845(2008)。癌干细胞还比祖先细胞增殖得更缓慢，这也可以解释干细胞在暴露于本会杀死主体肿瘤细胞的辐射和有毒化疗剂后存活的对比能力。
[0139] 不希望受任何具体操作理论约束，癌干细胞抵抗辐射和化疗的观察结果可以解释用此类疗法治疗的癌症患者中的复发现象。见上文Eyler。在此类患者中，治疗起初是有效的，引起肿瘤在诊断扫描时明显消失，但是肿瘤在治疗停止一些时间后复现。
[0140] 就癌干细胞在复发机制中的作用而言，假设尽管大部分或甚至全部主体肿瘤细胞被疗法杀死，但是仍存在许多有活力的癌干细胞，它们因其增强的抵抗辐射或化疗疗效的能力而存活。在疗法结束后，这些幸存的细胞继续生长，从而允许原始肿瘤的再形成或新肿瘤的形成。与这种理论一致，据报道，用化疗剂治疗小鼠引起从人结肠直肠癌细胞起源的肿瘤收缩，但是肿瘤内部癌干细胞比例增加。Dylla，S.J.等，2008，“Colorectal Cancer Stem Cells Are Enriched in Xenogeneic Tumors Following Chemotherapy(结肠直肠癌干细胞富集于化疗后的异种肿瘤)，”PLoS ONE，3(6)：e2428。
[0141] 7.5.理解结肠直肠癌中胃泌素原作用的进展
[0142] 已经惊讶地发现存在胃泌素原敏感的转移性结肠直肠癌细胞和结肠直肠癌干细胞，如与胃泌素原(“PG”)特异性结合的某些抗体在体外或在体内抑制此类细胞生长的能力所展示。
[0143] PG敏感性结肠直肠癌细胞是其存活和/或生长直接或间接地至少部分地依赖胃泌素原的一种结肠直肠癌细胞。不希望受任何具体操作理论约束，假设某些抗PG抗体通过与PG结合并阻断PG依赖性信号传导而有效抑制此类细胞的存活和/或生长。因此阻止胃泌素原介导其存活和/或生长促进作用。抗PG抗体抑制结肠直肠癌细胞存活和/或生长的其他机制可能存在，并且具体作用机制不意图限制本公开的范围。
[0144] 如实施例中更详细地描述，申请人已经惊讶地发现，胃泌素基因(GAST)在6个不同的人原发性结肠直肠癌细胞系(HT29，HCT116、RKO、SW480、DLD1和CRC1)细胞和在两个不同的人转移性结肠直肠癌细胞系(SW620和T84细胞)中表达。与来自体外实验的数据相关，申请人还已经惊讶地发现，胃泌素基因在从11位不同患者的每一位获得的原发性结肠直肠肿瘤和匹配的结肠直肠转移灶中表达，虽然相对于原发性肿瘤中的水平，匹配的转移灶中的表达水平在不同的患者之间是变化的。因为胃泌素原是胃泌素基因的产物(连同从相同基因产物中翻译后加工的其他肽)，所以这项数据表明原发性和转移性结肠直肠肿瘤分泌胃泌素原。如下文所示，额外的实验证实这一点。
[0145] 首先，申请人证实，可检测量的PG蛋白质由SW620和T84细胞分泌至生长培养基中(虽然Colo-205细胞不分泌)。另外，申请人证实，仅患有原发性结肠直肠癌、同时患有原发性和转移性结肠直肠癌、以及患有切除原发性肿瘤后转移性结肠直肠癌的患者在其血液中均具有统计显著高于健康对照的血液中的PG水平。这些结果表明原发性和转移性结肠直肠肿瘤分泌直接或间接进入血流的PG。因而，升高的血液PG水平指示存在原发性以及转移性结肠直肠癌。因而，本公开的方法提供了检测或诊断不同患者群体中原发性和转移性结肠直肠癌存在的方法。
[0146] 申请人还惊讶地发现某些抗PG抗体即中和性抗体能够抑制培养下的转移性结肠直肠癌细胞生长。具体而言，申请人实验地证实，抗PG多克隆抗体和4种不同的抗PG单克隆抗体能够抑制培养下正在生长的SW620细胞的生长。类似地，T84细胞的生长因与抗PG单克隆抗体孵育而被抑制。这些数据显示，中和性抗PG抗体能够阻止转移性结肠直肠癌细胞的生长并且此类细胞因此是PG敏感的。这些数据还表明治疗有效量的此类抗体在施与需要治疗转移性结肠直肠癌的受试者时将有效治疗此类转移。
[0147] 在裸小鼠中实施的其他实验扩展并证实了申请人的体外实验。因而，申请人将转移性SW620细胞注射入裸小鼠的脾中。此后不久，将脾切除，并且在时间过程内对小鼠施用抗PG单克隆抗体。类似地处理对照动物，但是用对照抗体注射。在6周治疗后，处死小鼠，并且计数肝脏中形成的转移灶的数目和重量。令人惊讶地，申请人发现与对照动物相比，平均转移灶数目在治疗的动物中统计显著地降低41％。这份有力的数据证实中和性抗PG抗体能够在体内抑制转移性结肠直肠癌的生长，并且表明治疗有效量的此类抗体在施与需要治疗转移性结肠直肠癌的受试者时有效治疗此类转移。
[0148] 由申请人在体外和在体内实施的额外实验已经令人惊讶地显示，原发性和转移性结肠直肠癌含有PG敏感的结肠直肠癌干细胞并且中和性抗hPG抗体能够抑制此类细胞的生长。
[0149] 在一个实验中，申请人显示在低黏附培养条件下培育原发性(HT29、HCT116、CRC1)和转移性(SW620和T84)结肠直肠癌细胞系增加了表达LGR5(结肠直肠癌干细胞的表型标志物)的细胞的比例。与非干细胞亚群相比，此类培养条件优先地选择癌干细胞的生长，并且增加的LGR5表达证实原发性和转移性结肠直肠癌均含有癌干细胞。
[0150] 申请人随后发现与常规条件下细胞的生长相比，低黏附条件增加相同细胞中胃泌素基因表达的水平。这份数据表明与相同群体中的非干细胞相比，胃泌素基因表达在来自原发性和转移性结肠直肠癌的结肠直肠癌干细胞中更高，并且还表明分泌的胃泌素原的水平也会更高。申请人证实在低黏附条件下培育时，胃泌素原表达在CRC1、HT29、SW620和T84细胞中处于不同水平，这表明这些细胞系含有PG敏感的结肠直肠癌干细胞。
[0151] 申请人通过用抗hPG抗体处理低黏附条件下培育的原发性和转移性结肠直肠癌细胞来证实这一点，并且惊讶地发现与对照抗体处理相比，形成的所谓细胞球状体的数目减少。因为在低黏附条件下形成球状体是结肠直肠癌干细胞的特性，但不是非干细胞亚群的特性，所以将这个结果解释为意味着抗hPG抗体有效抑制原发性和转移性结肠直肠癌中结肠直肠癌干细胞的生长。
[0152] 例如，用抗hPG多克隆抗体处理HT29、HCT116和CRC1细胞(均为原发性结肠直肠癌细胞)导致降低的球状体形成。使用两种不同的抗hPG单克隆抗体，对HCT116和HT29细胞的进一步测试发现了对LGR5阳性癌干细胞亚群的球状体生长的相似影响。令人感兴趣的是，通过洗涤移去抗体，随后在不存在添加的抗体时继续孵育17日，并不导致增加的球状体数目，这表明抗hPG抗体对结肠直肠癌干细胞的抑制性作用是持久的并且不依赖于它们的持续存在。4种不同的抗hPG单克隆抗体处理CRC1细胞也有效减少球状体形成。另外，用相同的抗hPG单克隆抗体对常规条件下生长的CRC1细胞的预处理减少ALDH1阳性细胞数目以及在预处理的细胞转移至低黏附培养条件后形成的球状体数目。3种抗体识别PG的C端部分，而1种抗体识别N端部分。
[0153] 在测试转移性结肠直肠癌细胞系时，获得相似的结果。因而，在分离ALDH1(结肠直肠癌干细胞的另一个标志物)阳性的T84细胞亚群后，与对照抗体相比，由此类细胞形成的球状体的数目因抗hPG单克隆抗体处理而以剂量反应方式减少。类似地，用相同的抗hPG单克隆抗体对常规条件下生长的T84和SW620细胞的预处理减少ALDH1阳性细胞数目以及在预处理的细胞转移至低黏附培养条件后形成的球状体数目。实际上，这种生长抑制作用大于化疗药物5-氟尿嘧啶的生长抑制作用。这份数据证实了以下令人惊讶的结论：转移性结肠直肠癌细胞含有胃泌素原敏感的干细胞，其生长可以通过特异性抗hPG单克隆抗体处理来抑制。
[0154] 如较早讨论的那样，癌干细胞的特征性属性之一是它们在移植后启动新肿瘤的能力。为了证实抗hPG抗体抑制结肠直肠癌干细胞的能力，申请人测试了特异性抗hPG单克隆抗体对于来自结肠直肠癌肝脏转移灶的细胞在培养下生长为球状体和移植后启动新肿瘤的能力的影响。如本实施例中进一步解释的那样，申请人将转移性SW620细胞注射入裸小鼠的脾中。此后不久，将脾切除，并且在时间过程内对小鼠施用抗PG单克隆抗体。类似地处理对照动物，但是用对照抗体注射。
[0155] 在6周治疗后，处死小鼠，并且剖取在肝脏中形成的结肠直肠转移灶并且随后进行处理以释放有活力的转移性结肠直肠癌细胞。随后测试这些细胞在低黏附培养时形成球状体和移植入新小鼠后形成新肿瘤的能力。这两种特性均是结肠直肠癌干细胞的特征。
[0156] 结果证实了抗hPG抗体对结肠直肠癌干细胞生长的抑制性作用。首先，申请人发现与对照相比，较少的球状体在来自转移性结肠直肠癌细胞的低黏附培养物中形成，所述转移性结肠直肠癌细胞分离自用特异性抗体处理的动物的肝脏。另外，申请人还发现，在来自球状体的细胞皮下注射入两只新的试验动物的大腿时，从用特异性抗体体内处理的细胞长出的肿瘤的大小平均而言相当程度地地小于从用对照抗体体内处理的细胞长出的那些肿瘤。这些有说服力的结果表明，用hPG特异的抗体在体内对转移性结肠直肠癌细胞的处理减少了转移性肿瘤中结肠直肠癌干细胞的数目。
[0157] 基于令人惊讶和有说服力的上述结果，用抗hPG抗体处理患者预期有效阻止原发性或转移性结肠直肠癌的复发。另外，抗体对此类干细胞生长的抑制性作用可以不需要抗hPG抗体的持续存在。
[0158] 7.6.抗体
[0159] 用于本文公开的方法和试剂盒中的抗体是这些抗体，它们与人胃泌素原的特异性结合胜过与胃泌素基因的其他产物的结合。如图30中所示，胃泌素基因翻译为101个氨基酸的多肽(称为前胃泌素原(pre-progastrin))，其包含被切除从而产生胃泌素原(80个氨基酸的多肽)的信号序列(加下划线)。胃泌素原转而经切割以产生在序列上与胃泌素原的残基38-71相应的34个氨基酸的产物，所述产物然后在其羧基端用甘氨酸残基延长，产生甘氨酸延长的G34(“G34-Gly”)。这种切割的副产物是一种6个氨基酸的肽(称为C端侧翼肽或CTFP)，其在序列上与胃泌素原的残基75-80相对应。G34-Gly然后经进一步切割以产生一种17个残基的多肽，该多肽在序列上与胃泌素原的残基55-71相对应，称为G17-Gly。去除G34-Gly和G17-Gly的C端甘氨酸，然后C端酰胺化，分别产生G34和G17，二者都是C端酰胺化的。
[0160] 如本文所用，如在标准结合测定法中测量的那样，如果一种抗体结合于全长胃泌素原但是完全不结合于CTFP、酰胺化胃泌素或甘氨酸延长的胃泌素，则它是“对hPG高度特异的”或“高度特异性结合”hPG，并且如果该抗体显示与hPG的结合至少约5倍高于CTFP和胃泌素基因的其他产物，则它是“对hPG特异的”或“特异性结合”hPG。实施例21中提供可以用来评估特定抗hPG抗体的特异性的具体ELISA测定法。
[0161] 此类高度特异性和/或特异性抗hPG抗体(在本文中称作“抗hPG抗体”)可以是多克隆的(“抗hPG PAb”)或单克隆的(“抗hPG MAb”)，不过对于治疗性用途并且在一些情况下，对于诊断或其他体外用途，单克隆抗体是优选的。
[0162] 被抗hPG抗体结合的表位不是关键的。有用的抗hPG抗体可以结合hPG的N端区域、hPG的C端区域或hPG的不同区域。最近，已经发现，至少对于单克隆抗hPG抗体，用来产生抗hPG抗体的抗原的选择可能是重要的(见，2010年10月15日提交的国际申请号PCT/EP2010/006329和2010年10月15日提交的美国申请号12/906,041，所述公开及其具体公开的抗hPG抗体通过引用方式并入本文；下文分别称作‘329申请和‘041申请)。如‘329申请和‘041申请中所公开，并非所有衍生自hPG的抗原均在生理条件下刺激特异性结合hPG的单克隆抗体的产生。实际上，已经用来成功产生多克隆抗hPG抗体的某些抗原(如全长重组hPG(见例如Singh的WO 08/076454)和与hPG的C端最后十个氨基酸相对应的肽(见例如Hollande的WO 07/135542))未能产生抗hPG单克隆抗体。如在‘329申请和‘041申请中所指出，已经在hPG序列内鉴定出可以用来产生特异性结合hPG的单克隆抗体的抗原性N端和C端序列。令人感兴趣的是，抗原性序列不需要限于对其独特的hPG序列区域。与胃泌素基因的其他产物(例如G17、G34和CTFP)具有共同序列区域的肽抗原产生了不但结合hPG，而且特异性结合hPG的单克隆抗体。
[0163] 可用具有对应于hPG N端区域的序列的肽抗原获得和/或与hPG N端区域结合的抗hPG抗体在本文中称为“N端抗PG抗体”。可以用来构建适于获得对hPG特异的多克隆和单克隆抗体的免疫原的具体示例性抗原区对应于hPG的残基1至14：SWKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO：25)。在下表1A中和实施例部分中提供用于获得N端抗hPG抗体的示例性免疫原以及用这些示例性免疫原获得的N端抗hPG单克隆抗体的CDR和VH和VL序列：
[0164]
[0165]
[0166] 在表1A中，用常规N→C取向表示所有氨基酸序列。对于每种免疫原，将胃泌素原肽合成为具有一个氨基己酸(Ahx)残基后接半胱氨酸(Cys)残基的C端接头，然后将其通过Cys接头残基与牛血清白蛋白(“BSA”)或匙孔血蓝蛋白(“KLH”)载体缀合。
[0167] 使用具有对应于hPG C端区域的序列的肽抗原可获得和/或与hPG C端区域结合的抗hPG抗体在本文中称为“C端抗hPG单克隆抗体”。可以用来构建用于获得多克隆和单克隆C端抗hPG抗体的免疫原的具体示例性抗原区对应于hPG的残基55至80：QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN(SEQ ID NO：27)。在下表1B中和实施例部分中提供用于获得C端抗hPG抗体的示例性免疫原(包括这种抗原)以及用这些示例性免疫原获得的C端抗hPG单克隆抗体的CDR和VH和VL序列：
[0168]
[0169]
[0170] 在表1B中，用常规N→C取向表示所有氨基酸序列。对于每种免疫原，将胃泌素原肽合成为具有N端Ahx-Ahx-Cys接头，其随后通过Cys接头残基与匙孔血蓝蛋白(“KLH”)或白喉毒素(“DT”)载体缀合。
[0171] 使用分别在Laune等，2002，J.Immunol.Methods 267：53-70和Laune，1997，J.Biol.Chem.272：30937-30944中描述的SPOT技术和丙氨酸扫描法图谱定位了由表1A和表1B中提供的示例性抗hPG单克隆抗体MAb1-MAb23结合的具体表位(也见，‘329申请的实施例6)。
[0172] 在SPOT技术中，产生跨越推定的表位的15个氨基酸肽序列，并点在硝酸纤维素膜上，然后用测试抗体探测来确定抗体识别的最小表位序列。丙氨酸扫描法用来确定表位内部对抗体结合关键的残基。将推定的表位内部的每个残基逐一突变成丙氨酸，并且随后用测试抗体探测含有丙氨酸的肽。
[0173] 对于N端抗hPG单克隆抗体MAb1-4和15-20，表位至少包含以下序列：DAPLG(SEQ ID NO：28)、PDAPLG(SEQ ID NO：29)、PRSQQPD(SEQ ID NO：30)、WKPRSQQPD(SEQ ID NO：31)或WKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO：32)，如以下表2A中所示。
[0174]
[0175] 对于C端抗hPG单克隆抗体MAb 5-7、9-12、14和21-23，表位至少包含以下序列：FGRR(SEQ ID NO：33)、MDFGR(SEQ ID NO：34)、AEDEN(SEQ ID NO：35)和GWMDFGRR(SEQ ID NO：36)，如以下表2B中所示。
[0176]
[0177] 表位图谱定位实验揭示，抗hPG MAb 2和MAb 4结合相同的表位；抗hPG MAb 1和MAb 3结合大致相同的表位；MAb 17、MAb 18、MAb 19和MAb 20结合大致相同的表位；MAb15和MAb 16结合大致相同的表位；抗hPG MAb 5、MAb 6、MAb 7、MAb 9和MAb 12结合相同的表位，且与抗hPG MAb 10结合大致相同的表位；抗hPG MAb 11和MAb 14结合大致相同的表位。
[0178] 用于本文所述的方法和试剂盒中的N端抗PG抗体的具体实施方案包括结合以下表位的抗体，所述表位是包括hPG的残基10至14(SEQ ID NO：28)、hPG的残基9至14(SEQ ID NO：29)、hPG的残基4至10(SEQ ID NO：30)、hPG的残基2至10(SEQ ID NO：31)或hPG的残基2至14(SEQ ID NO：32)的表位。
[0179] 用于本文所述的方法和试剂盒中的C端抗PG抗体的具体实施方案包括结合以下表位的抗体，所述表位包括hPG的残基71至74(SEQ ID NO：33)、hPG的残基69至73(SEQ ID NO：34)、hPG的残基76至80(SEQ ID NO：35)或hPG的残基67至74(SEQ ID NO：36)。
[0180] 除表1A和表1B中提供的那些之外，用于本文公开的方法和试剂盒中的N端和C端抗hPG抗体还可以在竞争性结合测定法中采用示例性MAb1-23或采用结合N-或C端表位的其他参考抗体来鉴定，如在稍后部分中更详细地描述。
[0181] 如实施例中所示，抗hPG抗体，甚至对hPG显示高程度特异性和亲和力的那些并不都中和hPG的生物学活性。例如，虽然抗hPG MAb14以约6pM的KD结合hPG，它在体外测定法中至少在所测试的浓度不抑制结肠直肠癌细胞的生长，而其他抗hPG单克隆抗体(例如MAb1-MAb13和MAb15-MAb23)显示程度不一的抑制活性。尽管特异性结合hPG的非中和抗体和中和抗体均用于本公开的诊断方法，但是用于治疗方法的抗hPG抗体应当显示中和活性。
[0182] 如本文所用，“中和性抗hPG抗体”是这样的抗hPG抗体，与用非特异性抗体处理的对照样品相比，其在抗hPG抗体处理的测试样品中导致活的结肠直肠癌细胞数目的统计显著减少。实施例22中描述了用于评估任意特定抗hPG抗体中和hPG的能力的具体测定法。虽然预期在这个测定法中显示较低中和活性水平(例如统计显著地减少活结肠直肠细胞数目40％、30％、20％、15％或甚至10％)的抗hPG抗体提供治疗益处，但是认为在这个测定法中显示使活结肠直肠癌细胞数目减少至少约50％的那些抗hPG抗体在治疗结肠直肠癌方面尤其有用。用于这些测定法中的示例性细胞包括但不限于本文所述的原发性和转移性结肠直肠癌细胞系。
[0183] 因此，在一些实施方案中，例如治疗性实施方案，有用的抗hPG抗体是中和性的。如本文公开和在‘329申请和‘041申请中公开，抗hPG单克隆抗体具有中和作用的能力不是表位依赖的，因为N端和C端抗hPG单克隆抗体均在结肠直肠癌细胞的测定法中显示中和活性。因而，在一些具体实施方案中，中和性抗hPG抗体是N端中和性抗hPG抗体。在其他实施方案中，中和性抗hPG抗体是C端中和性抗hPG抗体。
[0184] 任何特异性抗hPG抗体的亲和力不是关键的。然而，对于一些用途，可以优选显示至少约1μM亲和力的抗体。对于治疗性用途，可能想要至少约90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM、
0.001nM或甚至更大的亲和力。如下表3中所示，在表1A和表1B中鉴定的抗hPG单克隆抗-6 -12
体的测定的亲和性是10 至10 M：
0.001nM或甚至更大的亲和力。如下表3中所示，在表1A和表1B中鉴定的抗hPG单克隆抗-6 -12
体的测定的亲和性是10 至10 M：
[0185]
[0186] 具有尤其适合于所希望的具体应用的亲和力的抗PG单克隆抗体可以容易地从这些中选择，或者使用本文所述的多种免疫原、抗hPG抗体的互补决定区(CDR)序列、可变重链VH和可变轻链VL序列来产生或设计。可以用本领域熟知或本文所述的技术测定任意具体的抗PG单克隆抗体的亲和力，例如ELISA、等温滴定量热法(ITC)、BIAcore或荧光偏振测定法。在实施例23中提供具体的测定法。
[0187] 如表1A和表1B中所示，已经鉴定几种N端和C端单克隆抗hPG抗体。全部这些抗体均对hPG是特异的，并且除MAb14之外所列出的那些抗体均显示中和活性。用于获得这些抗体的几种杂交瘤根据布达佩斯条约在2010年10月6日保藏于法国国立微生物保藏中心(CNCM)。在表1A和表1B中提供了产生抗hPG MAbs1-23的杂交瘤的命名名称和那些保藏的杂交瘤的保藏注册编号。此外，对于这些抗体的几种，已经确定了它们的可变重链(VH)、可变轻链(VL)、VL互补决定区(CDR)和VHCDR的氨基酸序列。在表1A和表1B中还提供在本公开中自始至终用来指称它们的这些氨基酸序列和缩写命名。简而言之，鼠重链可变区和轻链可变区在本文中称作mVH和mVL，后接相应单克隆抗体的编号，例如mVH.3和mVL.3分别用于抗hPG MAb3的可变轻链和可变重链。类似地，人重链可变区和轻链可变区在本文中称作hVH和hVL，后接相应单克隆抗体的编号。3个可变重链CDR和3个可变轻链CDR分别称作VHCDR 1、2或3和VLCDR 1、2或3，后接特异性抗hPG单克隆抗体的编号。例如，MAb3的VHCDR 1表示为VHCDR 1.3，并且MAb3的VLCDR 1表示为VLCDR 1.3。MAb3的VHCDR 2表示为VHCDR 2.3，并且MAb3的VLCDR 2表示为VLCDR 2.3。
[0188] 预期结合大致相同表位的抗hPG单克隆抗体的相应CDR和/或VH和VL链可以互换以产生用于本文所述的方法和试剂盒中的新抗hPG单克隆抗体。例如，如上文指出，示例性抗hPG单克隆抗体MAb5和MAb6结合相同的表位。可以设计在其VL链中包含这两种抗体的VL CDR的多种组合和/或在其VH链中包含这两种抗体的VH CDR的多种组合的抗hPG单克隆抗体。作为说明多种可能的组合的具体非限制性实例，这种抗体可以在其VL链中包含MAb5的CDR 1和2(分别为VL CDR1.5和VLCDR2.5)及MAb 6的CDR 3(VLCDR3.6)，和在其VH链中包含MAb 6的CDR 1(VHCDR1.6)及MAb 5的CDR 2和3(分别为VHCDR2.5和VHCDR3.5)。
[0189] 可以使用常规手段获得由已经保藏的杂交瘤产生的抗体的CDR的氨基酸序列。例如，如下测定由杂交瘤6B5B11C10和20D2C3G2产生的抗体的相关序列。简而言之，根据制造商的说明书使用RNABee试剂，AMSBio目录号CS-104B，从冷冻的细胞沉淀物分离总RNA。使用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)，从mRNA制备V区的cDNA，随后5′快速扩增cDNA末端(RACE)。使用恒定区特异性引物实施cDNA合成，此后，纯化出第一链产物并且使用末端脱氧核苷酸转移酶用来添加均聚的尾部至cDNA的3′末端。随后通过PCR使用引物对扩增“加尾的”cDNA序列，每一引物分别针对均聚的尾部和VH或VL区。重链可变区和轻链可变区PCR产物随后克隆入“TA”克隆载体(p-GEM-T easy，Promega目录号A 1360)并且使用标准方法测序。见图31A-B(MAb 3)，图31C-D(MAb 4)。
[0190] 类似地，如下测定由杂交瘤1C10D3B9、2C6C3C7、1B3B4F1和1E9D9B61产生的抗体的相关序列。根据制造商的说明书，使用 -4PCR试剂盒(Ambion目录号AM1914)，从冷冻的细胞沉淀物分离总RNA。使用一组6种简并引物汇集物(HA至HF)扩增重链V区mRNA并且使用一组8种简并引物汇集物(7种用于κ类(KA至KG)和一种用于
λ类(LA))扩增轻链V区mRNA。使用RT-PCR，从mRNA制备可变区的cDNA。使用恒定区特异性引物实施cDNA合成，随后使用5′鼠信号序列的简并引物和分别针对IgGVH、IgκVL和IgλVL的3′恒定区引物的汇集物进行PCR。(Jones等，1991，Rapid PCR cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions(全长小鼠免疫球蛋白可变区的快速PCR克隆)，Bio/Technology 9：88-89)。重链可变区和轻链可变区PCR产物随后克隆入“TA”克隆载体(p-GEM-T easy，Promega目录号A 1360)并且使用标准方法测序。见图
31E-F(MAb 8)、31G-H(MAb 13)、31I-J(Mab 16)和31K-L(Mab 19)。
λ类(LA))扩增轻链V区mRNA。使用RT-PCR，从mRNA制备可变区的cDNA。使用恒定区特异性引物实施cDNA合成，随后使用5′鼠信号序列的简并引物和分别针对IgGVH、IgκVL和IgλVL的3′恒定区引物的汇集物进行PCR。(Jones等，1991，Rapid PCR cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions(全长小鼠免疫球蛋白可变区的快速PCR克隆)，Bio/Technology 9：88-89)。重链可变区和轻链可变区PCR产物随后克隆入“TA”克隆载体(p-GEM-T easy，Promega目录号A 1360)并且使用标准方法测序。见图
31E-F(MAb 8)、31G-H(MAb 13)、31I-J(Mab 16)和31K-L(Mab 19)。
[0191] 参照表1A，用于本文所述的方法和试剂盒中的N端抗hPG抗体的具体实施方案包括但不限于以下抗体：
[0192] (a)抗体，其具有在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VLCDR相对应的VLCDR和在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VHCDR相对应的VHCDR；
[0193] (b)抗体，其具有在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VLCDR和VHCDR相对应的VLCDR和VHCDR；
[0194] (c)抗体，其中：
[0195] (i)VLCDR 1选自QSIVHSNGNTY(“VL CDR 1.3”；SEQ ID NO：4)、QSLVHSSGVTY(“VL CDR 1.4”；SEQ ID NO：10)、QSLLDSDGKTY(“VL CDR 1.16”；SEQ ID NO：50)和SQHRTYT(“VL CDR 1.19”；SEQ ID NO：51)；
[0196] (ii)VL CDR2选自KVS(“VL CDR 2.3”和(“VL CDR 2.4”；SEQ ID NO：5)、LVS(“VL CDR 2.16”；SEQ ID NO：53)和VKKDGSH(“VL CDR 2.19”；SEQ ID NO：54)；
[0197] (iii)VLCDR3选自FQGSHVPFT(“VL CDR\3.3”；SEQ ID NO：6)、SQSTHVPPT(“VL CDR3.4”；SEQ ID NO：11)、WQGTHSPYT(“VL CDR 3.16”；SEQ ID NO：57)和GVGDAIKGQSVFV(“VL CDR 3.19”；SEQ ID NO：58)；
[0198] (iv)VHCDR1选自GYIFTSYW(“VH CDR 1.3”；SEQ ID NO：1)、GYTFSSSW(“VH CDR1.4”；SEQ ID NO：7)、GYTFTSYY(“VH CDR 1.16”；SEQ ID NO：39)和GYSITSDYA(“VH CDR
1.19”；SEQ ID NO：40)；
1.19”；SEQ ID NO：40)；
[0199] (v)VHCDR2选自FYPGNSDS(“VH CDR 2.3”；SEQ ID NO：2)、FLPGSGST(“VH CDR 2.4”；SEQ ID NO：8)、INPSNGGT(“VH CDR 2.16”；SEQ ID NO：43)和ISFSGYT(“VH CDR 2.19”；
SEQ ID NO：44)；和
SEQ ID NO：44)；和
[0200] (vi)VHCDR3选自TRRDSPQY(“VH CDR 3.3”；SEQ ID NO：3)、ATDGNYDWFAY(“VH CDR3.4”；SEQ ID NO：9)、TRGGYYPFDY(“VH CDR 3.16”；SEQ ID NO：47)和AREVNYGDSYHFDY(“VH CDR 3.19”；SEQ ID NO：48)；
[0201] (d)抗体，其具有在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VL相对应的VL和在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VH相对应的VH；和
[0202] (e)抗体，其具有在序列上与MAb1、MAb2、MAb3、MAb4、MAb15、MAb16、MAb17、MAb18、MAb19或MAb20的VL和VH相对应的VL和VH。
[0203] 参照表1B，用于本文所述的方法和试剂盒中的C端抗hPG抗体的具体实施方案包括但不限于以下抗体：
[0204] (f)抗体，其具有在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VLCDR相对应的VLCDR和在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VHCDR相对应的VHCDR；
[0205] (g)抗体，其具有在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VLCDR和VHCDR相对应的VLCDR和VHCDR；
[0206] (h)抗体，其中：
[0207] (vii)VLCDR1选自KSLRHTKGITF(“VL CDR 1.8”；SEQ ID NO：49)和QSLLDSDGKTY(“VL CDR 1.13”；SEQ ID NO：50)；
[0208] (viii)VLCDR2选自QMS(“VL CDR 2.8”；SEQ ID NO：52)和LVS(“VL CDR 2.13”；SEQ ID NO：53)；
[0209] (ix)VLCDR3选自AQNLELPLT(“VL CDR 3.8”；SEQ ID NO：55)和WQGTHFPQT(“VL CDR 3.13”；SEQ ID NO：56)；
[0210] (x)VHCDR1选自GFTFTTYA(“VH CDR 1.8”；SEQ ID NO：37)和GFIFSSYG(“VH CDR1.13”；SEQ ID NO：38)；
[0211] (xi)VHCDR2选自ISSGGTYT(“VH CDR 2.8”；SEQ ID NO：41)和INTFGDRT(“VH CDR2.13”；SEQ ID NO：42)；和
[0212] (xii)VHCDR3选自ATQGNYSLDF(“VH CDR 3.8”；SEQ ID NO：45)和ARGTGTY(“VH CDR 3.13”；SEQ ID NO：46)；
[0213] (i)抗体，其具有在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VL相对应的VL和在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VH相对应的VH；
[0214] (j)抗体，其具有在序列上与MAb5、MAb6、MAb7、MAb8、MAb9、MAb10、MAb11、MAb12、MAb13、MAb14、MAb21、MAb22或MAb23的VL和VH相对应的VL和VH。
[0215] 如技术人员将理解，用于诊断方法中的抗hPG抗体可以是任何来源的，包括例如哺乳动物(例如，人、灵长类、啮齿类、山羊或兔)、非哺乳动物或是在性质上嵌合的(源自多于一个起源物种)。适于在动物(包括人)中治疗性使用的抗体是优选地源自意在进行治疗的相同物种，或已经经修饰或设计以在正在治疗的动物中无免疫原性或具有减少的免疫原性。下文更详细地讨论，在人类中治疗性使用的抗hPG抗体的具体类型是人源化抗体类型。用于本文所述的方法和试剂盒中的抗hPG抗体还可以属于或衍生自任何同种型，包括例如IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM。设计用于治疗性使用的抗hPG抗体优选地是IgG同种型的。
[0216] 在一些实施方案中，用于本文所述的治疗方法的抗hPG抗体是人源化的。一般而言，人源化抗体包含至少一个(并且通常为两个)可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，全部或基本上全部构架区是人免疫球蛋白共有序列的那些，且可以称为“CDR移植的”。人源化抗体还可以包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白共有序列的恒定区。用于人源化抗体的方法(包括用于设计人源化抗体的方法)是本领域熟知的。见例如Lefranc等，2003，Dev.Comp.Immunol.27：55-77；Lefranc 等，2009，Nucl.Acids Res.37：D1006-1012；Lefranc，2008，Mol.Biotechnol.40：101-111；Riechmann等，1988，Nature 332：323-7；Queen等的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370；EP239400；PCT公开WO91/09967；美国专利号5,225,539；EP592106；EP519596；Padlan，1991，Mol.Immunol.，28：
489-498；Studnicka 等，1994，Prot.Eng.7：805-814；Roguska 等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.91：969-973；和美国专利号5,565,332；所述文献在此以通过引用方式完整并入。
489-498；Studnicka 等，1994，Prot.Eng.7：805-814；Roguska 等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.91：969-973；和美国专利号5,565,332；所述文献在此以通过引用方式完整并入。
[0217] 可以使用这些熟知的方法获得具有与非人抗hPG抗体的CDR相对应的CDR序列的抗体的人源化形式，例如包括并且不限于表1A中提供的多种N端抗hPG单克隆抗体和表1B中提供的多种C端抗hPG单克隆抗体。在表1A和表1B中提供了选择的抗hPG抗体的人源化VL和VH链的突出序列。人源化抗体的具体实例包括了包含以下区域的抗体：
[0218] (K)本文中公开的任何3个VLCDR和任何3个VHCDR；
[0219] (l)包含与SEQ ID NO：21相对应的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO：22相对应的氨基酸序列的轻链可变区；
[0220] (m)包含与SEQ ID NO：23相对应的氨基酸序列的重链可变区和包含与SEQ ID NO：24相对应的氨基酸序列的轻链可变区；
[0221] (n)包含选自SEQ ID NO：75、77和79的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQ ID NO：76和78的氨基酸序列的轻链可变区；
[0222] (o)包含选自SEQ ID NO：80和82的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQ ID NO：81和83的氨基酸序列的轻链可变区；
[0223] (p)包含选自SEQ ID NO：84、86和88的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQ ID NO：85、87和89的氨基酸序列的轻链可变区；和
[0224] (q)包含选自SEQ ID NO：90、92和94的氨基酸序列的重链可变区和包含选自SEQ ID NO：91、93和95的氨基酸序列的轻链可变区。
[0225] 如技术人员将认识到，可以使用本文所述的多种抗原和免疫原并且评估它们与目的参考抗体竞争结合hPG的能力，轻易地获得具有特异性结合特性(如结合特定目的表位的能力)的抗hPG抗体。本文所述的任何抗hPG抗体可以用作这种竞争测定法中的参考抗体。实施例24中提供了用于评估抗体与生物素酰化的目的参考抗hPG抗体竞争结合hPG的能力。
[0226] 在参考抗hPG抗体和任意测试抗体(不考虑物种或同种型)之间实施抗体竞争研究时，可以首先用可检测标记物(如放射性同位素或荧光团)直接标记或例如用生物素(通过与荧光标记的链霉亲和素结合是可检测的)或酶(通过酶促反应是可检测的)间接标记参考抗体，以能够进行后续鉴定。在这种情况下，将标记的抗hPG参考抗体(以固定浓度或增加的浓度)与已知量的hPG孵育，形成hPG：标记的抗hPG抗体复合物。随后将未标记测试抗体添加至这种复合物。测量复合的标记物的强度。如果测试抗体通过结合重叠表位与标记的参考抗hPG抗体竞争hPG，则相对于测试抗体不存在时所实施的对照实验，复合的标记物的强度将降低。
[0228] 如果一种抗体在竞争性结合测定法中并且尤其在实施例24的竞争性结合测定法中以0.01-100μg/ml范围内的测试抗体浓度(例如，0.01μg/ml、0.08μg/ml、0.4μg/ml、2μg/ml、10μg/ml、50μg/ml或100μg/ml或所述范围内的其他浓度)减少参考抗hPG抗体与hPG的结合至少50％，不过更高水平的减少(例如，60％、70％、80％、90％或甚至
100％)可以是合乎需要的，则认为该抗体与参考抗hPG抗体竞争结合hPG并且因而认为它大体上结合与参考抗hPG抗体相同或重叠的hPG表位。
100％)可以是合乎需要的，则认为该抗体与参考抗hPG抗体竞争结合hPG并且因而认为它大体上结合与参考抗hPG抗体相同或重叠的hPG表位。
[0229] 本公开的抗体也可以衍生化、共价修饰或与其他分子缀合以改变它们的特性或改善它们的功能。例如，但不作为限制，衍生化抗体包括已例如通过糖基化、岩藻糖基化、乙酰化、聚乙二醇化(pegylation)、磷酸化、酰胺化、甲酰化、通过已知保护/封闭基团衍生化、与细胞配体或其他蛋白质连接等修饰的抗体。备选地，可以改变可变区或恒定区中的特定氨基酸以改变或改善功能。在一个非限制性实例中，可以改变抗体Fc区中的氨基酸残基以增加抗体与FcRn结合来增加其血清半寿期。
[0230] 抗hPG单克隆抗体包括用可检测部分标记的抗体。这种标记物可以与本公开的抗hPG单克隆抗体直接或间接地缀合。标记物可以自身是可检测的(例如放射性同位素标记物、同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况下，可以催化底物化合物或组合物的可检测的化学变化。可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、使用多种正电子发射成像术的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
[0231] 虽然用于本文所述的方法和试剂盒中的多种抗hPG抗体已经用全长抗体例举，但是技术人员会理解，也可以使用从全长抗体或结合片段设计或衍生的结合片段或替代抗体。合适的片段、替代物等包括但不限于Fab′、F(ab′)2、Fab、Fv、vIgG、scFv片段和替代抗体、rIgG、二硫键稳定的Fv抗体(dsFv)、双体抗体、三体抗体和单结构域抗体，如骆驼化抗体或纳米体(nanobody)。
[0232] 本公开的抗体可以根据本领域普通技术人员已知的任何方式产生。在一个非限制性实例中，抗体可以从天然来源获得，包括从能够产生抗体的任何物种获得，如源自人、猴、鸡、山羊、兔和啮齿类(例如，大鼠、小鼠和仓鼠)的抗体。其他物种也是可能的。抗体也可以从利用基因工程或重组DNA技术的系统产生和分离，如但不限于在培养下的酵母细胞、细菌细胞和哺乳动物细胞(如CHO细胞)中表达重组抗体。抗体也可以完全地或部分地是合成的。
[0233] 本公开的单克隆抗体(MAb)不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。通过本领域可得或已知的任意手段从单个克隆(包括任意真核、原核或噬菌体克隆)衍生单克隆抗体。可以使用本领域已知的多种技术(包括使用杂交瘤技术、重组技术和噬菌体展示技术或其组合)制备单克隆抗体。
[0234] 转移性结肠直肠癌的常规治疗
[0235] 转移性结肠直肠癌可以用生物疗法、靶向疗法、抗体疗法、辐射疗法、化疗、手术、低温手术法或这些疗法的组合。用于转移性结肠直肠癌的其他疗法也是可能的。
[0236] 生物疗法是促进或恢复免疫系统对抗癌症的能力的疗法。生物疗法中所使用的药剂包括生物学应答调节物，如干扰素，白介素，集落刺进因子、单克隆抗体、疫苗、基因治疗和非特异性免疫调节剂。这些药剂中的一些药剂也可以具有直接抗肿瘤作用。癌症靶向疗法是通过干扰参与肿瘤生长和发展的特定分子而阻断癌症生长和扩散的药物或其他物质。
[0237] 抗体疗法包括施用直接或间接杀死转移性结肠直肠癌细胞、减缓或停止其生长的抗体，包括但不限于单克隆抗体。此类抗体可以通过多种独特的机制发挥作用。例如，某些抗体可以标记癌细胞以便由患者的免疫系统借助抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)或其他机制发动攻击。其他抗体与癌细胞需要用于存活或生长的抗原结合并且改变或抑制其功能。认为众多抗体以这种方式发挥作用，包括例如，与生长因子VEGF结合的贝伐单抗其他机制也是可能的，并且特定的抗体可以能够通过一个或多个作用机制发挥作用。然而，其他抗体可以与放射性或化学毒性部分缀合并且引导它们至优先表达由这些抗体特异性识别的抗原的癌细胞。贝伐单抗、西妥昔单抗和帕尼单抗是用于治疗转移性结肠直肠癌的抗体的具体实例。
[0238] 辐射疗法是使用来自X射线、伽玛射线、中子、质子和其他来源的高能辐射杀死癌细胞并且使肿瘤收缩。辐射可以来自身体外部的机器(外部光束辐射疗法)，或它可以来自置于身体内癌症附近的放射性物质(内部辐射疗法或近距离辐射疗法)。全身性辐射疗法使用在血液中穿行至全身各处组织的放射性物质，如放射标记的单克隆抗体。辐射疗法也可以称作照射法和放疗法。其他辐射疗法包括三维构象辐射疗法(3D-CRT)和强度可调节的辐射疗法(IMRT)。其他辐射疗法也是可能的。
[0239] 化疗是使用杀死(细胞毒性或杀细胞)或阻止癌细胞生长(抑制细胞)的有机小分子药物。通过多种机制介导其抗肿瘤作用的许多化疗剂可用于转移性结肠直肠癌的治疗。
[0240] 示例性化疗剂包括以下：叶酸拮抗剂，包括甲氨蝶呤和培美曲塞；嘌呤拮抗剂，包括克拉立滨、氯法拉滨、氟达拉滨、6-巯基嘌呤、奈拉滨(nelarabine)、喷司他丁；嘧啶拮抗剂，包括卡培他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲；博来霉素；DNA烷化剂，包括亚硝基脲、卡莫司汀、罗莫司汀；DNA交联药物和烷化剂，包括苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、氮芥、美法仓、达卡巴嗪、替莫唑胺、丙卡巴肼；天冬酰胺酶；抗生素类，包括丝裂霉素；铂络合物，包括卡铂、顺铂、奥沙利铂；蛋白体抑制剂，包括硼替佐米；纺锤体毒剂类，如紫杉烷类(包括多西紫杉醇、紫杉醇)和长春碱类(包括长春碱、长春新碱、长春瑞滨)；拓扑异构酶抑制剂，如蒽环类(包括佐柔比星、柔红霉素、多柔比星、表柔比星)、喜树碱类(包括依立替康和拓扑替康)、鬼臼毒素类(包括依托泊苷、替尼泊苷和米托蒽醌)。其他化疗剂也是可能的。
[0241] 转移性结肠直肠癌通常使用彼此组合的化疗剂和/或化疗剂与抗体的组合进行治疗。此类组合的实例包括5-氟尿嘧啶(5FU)与甲酰四氢叶酸(叶酸或LV)组合；替加氟与尿嘧啶(UFT)和甲酰四氢叶酸组合；奥沙利铂与5FU组合或进一步与卡培他滨组合；依立替康与卡培他滨组合；丝裂霉素C与5FU、依立替康或卡培他滨组合；FOLFOX(甲酰四氢叶酸(叶酸)、5-FU和奥沙利铂)自身或与贝伐单抗或西妥昔单抗组合；FOLFIRI(甲酰四氢叶酸、5-FU和依立替康)自身或与贝伐单抗或西妥昔单抗组合；CapeOX(卡培他滨和奥沙利铂)自身或与贝伐单抗或西妥昔单抗组合；5-FU和甲酰四氢叶酸与贝伐单抗组合；卡培他滨与贝伐单抗组合；FOLFOXIRI(甲酰四氢叶酸、5-FU、奥沙利铂和依立替康)；
依立替康与西妥昔单抗组合。其他组合方案包括5FU Mayo、5FU Roswell Park、LVFU2、FOLFOX4、FOLFOX6、bFOL、FUFOX、IFL、XELOX、XELIRI和CAPIRI，这些组合方案在Chau，I.和Cunningham，D.，Br.J.Cancer 100(2009)1704-19；以及Field，K.和Lipton，L.，World J.Gastroenterol.13(2007)3806-15中更详细地描述，所述文献通过引用方式并入。化疗剂和其他治疗剂的其他组合也是可能的。
依立替康与西妥昔单抗组合。其他组合方案包括5FU Mayo、5FU Roswell Park、LVFU2、FOLFOX4、FOLFOX6、bFOL、FUFOX、IFL、XELOX、XELIRI和CAPIRI，这些组合方案在Chau，I.和Cunningham，D.，Br.J.Cancer 100(2009)1704-19；以及Field，K.和Lipton，L.，World J.Gastroenterol.13(2007)3806-15中更详细地描述，所述文献通过引用方式并入。化疗剂和其他治疗剂的其他组合也是可能的。
[0242] 使用抗PG抗体的治疗方法
[0243] 本公开提供了治疗方法，所述方法包括出于治疗和阻止转移性结肠直肠癌、阻止结肠直肠癌复发和阻止结肠直肠癌干细胞生长的目的，施用组合物中的抗PG抗体至受试者。在某些实施方案中，抗体是对人胃泌素原(“hPG”)特异的，并且在其他实施方案中，此类抗体是单克隆抗体。
[0244] 根据这些实施方案中的某些实施方案，如本文公开的抗PG抗体在组合物中以治疗有效量作为单药疗法或作为联合疗法施与需要治疗转移性结肠直肠癌的受试者。此类受试者包括但不限于诊断患有转移性结肠直肠癌的那些受试者。在这些方法的某些实施方案中，抗体是抗hPG单克隆抗体。
[0245] 根据其他实施方案，如本文公开的抗PG抗体在组合物中以治疗有效量作为单药疗法或作为联合疗法施与需要阻止转移性结肠直肠癌的受试者。此类受试者包括但不限于确定患有原发性结肠直肠癌但是其中不知道癌症已经扩散至远端组织或器官的那些受试者。在这些方法的某些实施方案中，抗体是抗hPG单克隆抗体。
[0246] 根据另外的实施方案，如本文公开的抗PG抗体在组合物中以治疗有效量作为单药疗法或作为联合疗法施与需要阻止转移性结肠直肠癌复发的受试者。此类受试者包括但不限于先前治疗过原发性或转移性结肠直肠癌，在治疗后这种癌症明显消失的那些受试者。在这些方法的某些实施方案中，抗体是抗hPG单克隆抗体。
[0247] 根据其他实施方案，如本文公开的抗PG抗体在组合物中以治疗有效量作为单药疗法或作为联合疗法施与需要抑制结肠直肠癌干细胞生长的受试者。此类受试者包括但不限于患有以下结肠直肠癌的那些受试者，其中所述结肠直肠癌的生长或转移至少部分地归咎于其内部存在癌干细胞。其他实施方案提供了通过使结肠直肠癌干细胞与阻止或抑制此类细胞生长的有效量抗PG抗体组合物接触而阻止或抑制此类细胞生长的方法。此类方法可以在体外或在体内实施。在这些方法的某些实施方案中，抗体是抗hPG单克隆抗体。
[0248] 中和性抗PG抗体将是治疗性抗体组合物中的主要有效物质，虽然如果非中和性抗PG抗体的存在基本上不抑制中和性抗体的治疗性功效，则它们可以存在。
[0250] 出于治疗或阻止转移性结肠直肠癌或阻止结肠直肠癌复发的目的，抗PG抗体组合物可以作为单药疗法单独地或作为一种或多种有效治疗或阻止转移性结肠直肠癌或有效防阻止结肠直肠癌复发的主要疗法的辅助物施与受试者。
[0251] 因而，在本公开的某些实施方案中，抗hPG抗体组合物可以作为化疗的辅助物、作为辐射疗法的辅助物、作为生物疗法的辅助物，作为手术疗法的辅助物或作为其他类型抗体疗法的辅助物施与需要治疗或阻止转移性结肠直肠癌的受试者，有效治疗或阻止转移性结肠直肠癌。在另外的实施方案中，抗hPG抗体组合物可以作为其他有效阻止结肠直肠癌复发的疗法的辅助物施与需要阻止结肠直肠癌复发的受试者。
[0252] 作为辅助性疗法，抗hPG抗体组合物可以与主要疗法一起同时、相继或分别施用。
[0253] 当抗hPG抗体组合物和主要疗法在相同时间施用，则抗hPG抗体组合物和主要疗法是同时施用的，即使当分别的施用重叠但是在不同时间开始或结束时也是同时施用。同时施用的非限制性实例是在受试者接受转移性结肠直肠癌化疗或接受手术切除原发性结肠直肠肿瘤的同时，施用抗hPG抗体组合物。
[0254] 当抗hPG抗体组合物和主要疗法在相同日(例如在相同的临床就诊期间)但不同时施与受试者，则抗hPG抗体组合物和主要疗法是相继施用的。相继施用可以间隔1、2、3、4、5、6、7或8小时或更多小时发生。可以首先施用主要疗法，随后施用抗hPG抗体组合物。
在一个备选实施方案中，可以首先施用抗hPG抗体组合物，随后是主要疗法。
在一个备选实施方案中，可以首先施用抗hPG抗体组合物，随后是主要疗法。
[0255] 当抗hPG抗体组合物和主要疗法在不同日施与受试者，则抗hPG抗体组合物和主要疗法是分别施用的。在某些实施方案中，抗hPG抗体组合物和主要疗法可以按1日、2日、3日、4日、5日、6日、1周、2周、3周或1个月或更长的时间间隔施用。就相继施用而言，抗hPG抗体组合物的施用可以先于或后于主要疗法的独立施用。
[0256] 在本公开的某些其他实施方案中，抗hPG抗体组合物和主要疗法可以按交替模式反复施用，无论是否是相继施用还是分别施用。
[0257] 在某些实施方案中，施用作为主要疗法的辅助物的抗hPG抗体组合物可以产生大于相加效应的作用或协同效应，从而提供在这两种疗法均不能以治疗有效而不招致难以容忍性副作用的量单独施用时的治疗益处。在这些情况下，抗hPG抗体组合物和/或主要疗法可以按更低的量施用，从而降低副作用的可能性或严重性。然而，对于采用抗hPG抗体组合物的辅助疗法治疗有效而言，不要求协同效应。
[0258] 7.7.监测转移性结肠直肠癌治疗的功效的方法
[0259] 如上文指出，原发性和/或转移性结肠直肠癌患者具有升高的PG血浆和/或血清水平，而健康个体中PG的基线水平是可忽略的。在患有原发性和/或转移性结肠直肠癌的受试者中的PG血浆和/或血清水平是可测量的并且是约25pM或更大。基于这种观察结果，PG的血浆和/或血清水平尤其可以用来监测原发性或转移性结肠直肠癌治疗的有效性、检测和诊断原发性或转移性结肠直肠癌的存在并且选择可能从抗PG抗体治疗中获益的受试者。
[0260] 因而，本公开提供了监测因结肠直肠转移性癌症而正在治疗的受试者以确定前一轮转移性结肠直肠癌疗法之有效性的方法。这些方法可以用于任何类型针对转移性结肠直肠癌的疗法，所述疗法是单独使用的或与其他疗法组合的疗法，包括但不限于施用抗hPG抗体组合物、采用其他类型抗体的疗法、化疗、辐射疗法、生物疗法和其他。在一轮疗法结束后，负责护理受试者的治疗团队需要确定疗法是否有效，以决定是否施用新一轮疗法和作出其他临床决定。
[0261] 在监测方法的一些实施方案中，可以在启动转移性结肠直肠癌疗法之前测量一种或多种体液(如血液、血浆、血清或其他)中PG的浓度并且随后将其与治疗结束后某个时间在相同类型体液中所测量的PG水平比较。在其他实施方案中，测量目的组织(如结肠直肠癌的活组织检查样品)中的PG水平。
[0262] PG浓度的降低表示有功效。一般地而言，治疗后PG减少的程度越大，疗法越有效。不希望受任何具体的操作理论约束，认为随着患者中转移灶的数目和/或尺寸因有效治疗而缩减，由转移灶产生的PG的总量也下降。相反地，在治疗结束后PG水平没有降低或PG水平上升可能表明该疗法不是有效的。基于这种信息，治疗团队可以决定是否启动新一轮疗法。
[0263] 在一轮疗法结束后取得样品用于监测之前的合适时间间隔由本领域普通技术人员轻易地确定并且取决于此类变量如所考虑的疗法类型、受试者性别和年龄及其他。示例性时间间隔包括在一轮疗法结束后取得样品用于本公开的监测方法中之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11周和3、4、5或6个月。其他时间间隔也是可能的。在其他实施方案中，可以在治疗结束后以不同间隔期取得多个量值，并且随后绘图以确定趋势是否存在。在非限制性实例中，可以在一轮治疗结束后的头六个月每周或每月测定PG水平。其他时间间隔也是可能的。
[0264] 体液中的PG浓度水平可以是使用本领域普通技术人员熟悉的分析技术(如但不限于RIA和ELISA)测量。根据本领域普通技术人员的知识，可以使用非中和性或中和性抗体(如本文公开的那些)实施分析方法，如依赖于对hPG特异的抗体的那些方法。
[0265] 在一个具体实施方案中，可以使用夹心ELISA测量PG水平，其中所述夹心ELISA采用一个靶向胃泌素原N端的抗PG抗体和一个靶向胃泌素原C端的第二抗PG抗体。在稍后部分中描述用于这种夹心测定法的示例性N端和C端抗PG抗体。在这种测定法中，制备了与已知量的第一“捕获”N端或C端抗PG抗体结合的表面，如96孔板中的孔。随后将测试样品施加至该表面，随后是孵育时期。随后将表面洗涤以移去未结合的抗原，并且施加含有第二“检测”抗PG抗体的溶液，其中检测抗体结合PG的不同表位(例如，如果捕获抗体是C端抗PG抗体，则使用N端抗PG抗体作为检测抗体，并且反之亦然)。然后直接(如果例如将检测抗体与可检测标记缀合)或间接(通过结合检测抗PG抗体的标记第二抗体)测量PG水平。在实施例20中提供用于测量血浆和/或血清PG水平的具体夹心测定法。
[0266] 在本公开方法的一个备选实施方案中，可以监测施用抗hPG抗体组合物至受试者在降低目的体液中的PG水平方面的功效。在这些方法中，可以随时间推移取得样品并且将PG浓度作图以评估趋势。如果疗法有效治疗转移性结肠直肠癌的话，在残余抗hPG抗体存在的情况下，数据可以显示为PG水平因PG被抗体阻隔而降低，随后因这种作用削弱而升高，然后接着下降。
[0267] 根据本公开方法的其他实施方案，在小于约50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM、2pM、1pM或更小的预定阈值以下的血液、血清或血浆PG浓度指示了治疗转移性结肠直肠癌的功效。指示功效的其他PG浓度阈值也是可能的并且由本领域普通技术人员轻易地确定。
[0268] 7.8.确定存在结肠直肠癌的方法
[0269] 本公开还提供了某些实施方案，根据这些实施方案，可以对受试者测试以确定与适宜的基线相比，它们是否在体液(如血液、血浆、血清或其他)中具有升高的PG水平，目的在于检测原发性或转移性结肠直肠癌的存在或治疗后结肠直肠癌的复发。
[0270] 在本公开方法的某些实施方案中，受试者可以是这样一位受试者，对其而言需要确定原发性或转移性结肠直肠癌是否在这位受试者中存在。在此类受试者中，相对于基线而言升高的PG水平表示存在结肠直肠癌。不希望受任何具体操作理论约束，认为随着受试者中结肠直肠癌的大小和/或程度增加，全身性和/或局限化PG水平也在该受试者中增加。
[0271] 在其他实施方案中，受试者可以是先前治疗过原发性结肠直肠癌的一位受试者，对其而言需要确定结肠直肠癌是否已经转移至远端的组织或器官。在此类受试者中，相对于基线而言升高的PG水平表示存在转移性结肠直肠癌。对于此类受试者，本公开的方法尤其也用于确定意图阻止转移性结肠直肠癌的疗法是否有效。不希望受任何具体操作理论约束，认为随着受试者中转移灶的数目和/或大小增加，全身性和/或局限化PG水平也在该受试者中增加。
[0272] 根据另外的实施方案，受试者可以是先前治疗过原发性或继发性结肠直肠癌的一位受试者，其中癌症明显消失并且其中需要确定结肠直肠癌是否已经复发或回复。在此类受试者中，相对于基线而言升高的PG水平表示结肠直肠癌已经复发。不希望受任何具体操作理论约束，认为随着受试者中复发性结肠直肠癌的大小和/或程度增加，全身性和/或局限化PG水平也在该受试者中增加。
[0273] 考虑到本文所述的研究结果：转移性结肠直肠癌分泌PG并且是PG敏感的，本公开还提供了选择受试者的方法，所述受试者可以因施用抗PG抗体而从疗法中获益。因而，受试者可以由护理提供者筛查以检测他们是否相对于基线具有升高的血浆和/或血清PG水平。一旦鉴定出此类受试者，则护理提供者可以要求额外的测试以证实受试者中存在转移性结肠直肠癌。如果转移性结肠直肠癌得到证实，则可以开始治疗，包括施用抗hPG抗体。
[0274] 在用于选择受试者的方法的某些实施方案中，筛查可以作为例行体检的部分由受试者的初级保健医师进行或作为以更大受试者群体为目标的公共卫生计划的部分来进行。在其他实施方案中，待筛查的受试者是具有高于平均的转移性结肠直肠癌形成风险的特定亚群体的成员。这些类群包括但不限于具有已患结肠直肠癌的近亲(父母、兄弟、姐妹或孩子)的受试者、具有结肠直肠息肉病史的受试者、肥胖的受试者、吸烟的受试者和缺少身体活动的受试者。其他此类受试者是诊断患有溃疡性结肠炎、节段性回肠炎或家族性腺瘤息肉病(FAP)的那些受试者或在HNPCC基因中具有突变、在APC基因或与结肠直肠癌风险增加相关的其他基因中具有突变的那些受试者。另外的类群包括之前诊断有结肠直肠癌并且成功经过治疗的受试者。
[0275] PG浓度可以是使用普通技术人员熟悉的技术(如但不限于RIA和ELISA)测量。根据本领域普通技术人员的知识，可以使用非中和性或中和性抗体(如本文公开的那些)实施分析方法，如依赖于对hPG特异的抗体的那些方法。
[0276] 基于使用本公开的方法检测到升高的PG水平，治疗团队可以随后决定是否采取额外测试以证实结肠直肠癌的存在或结肠直肠癌在治疗后复发，或直接推进至治疗受试者。
[0277] 可以使用与受试者中测量到的PG水平相比较的不同基线。在本公开方法的一些实施方案中，通过测量目的体液中的PG水平建立基线，所述目的体液在先前时间从相同受试者中采样。可以按照预定的时间间隔取得此类样品，并且测量PG水平。在非限制性实例中，在治疗结束后头六个月每周或每月、随后每三个月一次直至治疗结束第二年并且随后每6个月或一年测量PG水平。其他预定的时间间隔也是可能的。
[0278] 在本公开方法的其他实施方案中，基线可以在与接受采样以检测结肠直肠癌转移或复发的那些受试者具有相似特征的个体群体中从平均PG水平建立。此类特征可以包括，但是不必然地限于性别、年龄、原发性结肠直肠肿瘤的分期、先前暴露于某些治疗、这些因素的组合及其他因素。在另外的实施方案中，受试者特异性基线以及群体衍生基线均可以用于评估受试者的状况。
[0279] 根据本领域普通技术人员的知识，在来自受试者的样品中相对于基线超过某个阈值的PG水平被推断为患有结肠直肠癌或治疗后已经复发的结肠直肠癌。治疗团队随后可以采取验证性测试以证实结肠直肠癌的存在。此类测试的非限制性实例包括检测结肠直肠癌的探查手术、检测结肠直肠癌的医学成像检查、检测潜血的受试者粪便检验、结肠镜检查、检测从受试者获得的样品中指示结肠直肠癌风险增加的基因突变的存在(如HNPCC基因或APC基因中)、检测从受试者获得的样品中指示结肠直肠癌的生物学因子(如癌胚抗原(CEA))的存在。
[0280] 因为进食通常增加胃泌素合成和分泌，所以进食可以导致血液PG水平的短暂增加，这可以干扰在正就治疗功效和转移存在进行监测的患者中精确测量由结肠直肠癌转移或复发性结肠直肠癌产生的PG。为避免这种影响，尤其待测定血浆和/或血清中的PG水平的情况下，可以从禁食足够时间后的受试者取得样品，这一点可以由本领域普通技术人员轻易地确定。
[0281] 7.9.药物组合物
[0282] 用于本公开的方法中的抗hPG抗体可以配制为组合物。任选地，组合物可以包含一个或多个额外的治疗剂，如具有针对转移性结肠直肠癌或结肠直肠癌复发的治疗性功效的化疗剂或其他抗体。组合物通常将作为无菌药物组合物的部分提供，该无菌药物组合物通常将包含可药用载体。这种组合物可以是任意适合的形式，其取决于所需的施用它至患者的方法。
[0283] 抗PG抗体可以通过多种途径，一般肠胃外地施与受试者，例如，通过皮下、静脉内、腹膜内或肌内注射。施用可以作为一个或多个快速浓注(bolus)或作为一个或多个输注实施。根据本领域普通技术人员的知识，其他施用途径也是可能的。在任意给定的情况下最合适的施用途径将取决于待施用的具体组合物和受试者的特征如年龄或性别。
[0284] 药物组合物可以便利地以每剂量含有预定量的本公开抗hPG抗体的单位剂量形式提供。这种单位可以包含例如但不限于5mg至5g，例如10mg至1g或20至50mg。取决于例如施用途径，用于本公开的可药用载体可以采用多种形式。
[0285] 可以通过将具有希望的纯度的抗体与可选的本领域中通常利用的可药用载体、赋形剂或稳定剂(在本文中全都称为“载体”)(即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂(isotonifier)、非离子型去垢剂、抗氧化剂和其他多种混合添加物)混合，将本公开的药物组合物制备为冻干制剂或水溶液进行保存。见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版(Osol编辑1980)。这类添加剂必须在所利用的剂量和浓度对接受者无毒性。
[0286] 缓冲剂帮助维持pH在接近生理条件的范围内。它们可以按约2mM至约50mM的范围内的浓度存在。适合用于本公开的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐二者，如柠檬酸缓冲液(例如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸缓冲液(例如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸缓冲液(例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、延胡索酸缓冲液(例如延胡索酸-延胡索酸单钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸单钠-延胡索酸二钠混合物等)、葡糖酸缓冲液(例如葡糖酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等)、草酸缓冲液(例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸缓冲液(例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸缓冲液(例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以使用磷酸缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐(如Tris)。
[0287] 可以添加防腐剂来延缓微生物生长，且可以按0.2％-1％(w/v)的范围内的量添加。适合用于本公开的防腐剂包括酚、苄醇、间甲酚、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苄烷铵卤化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯己双铵和尼泊金烷基酯(如尼泊金甲酯或丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可以加入等渗剂(有时称为“稳定剂”)来确保本公开的液体组合物的等渗性，其包括多元糖醇，例如三元糖醇或高级糖醇，如丙三醇、赤藓醇、阿糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。稳定剂指一大类赋形剂，其功能可以从填充剂至稳定治疗剂或帮助防止变性或黏附于容器壁的添加剂。常见的稳定剂可以是多元糖醇(上文所列)；氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、丙三醇等，包括环多醇，如肌醇(inositol)；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个残基或更少残基的肽)；蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，如乳糖、麦芽糖、蔗糖；三糖，如蜜三糖；和多糖，如葡聚糖。稳定剂可以以每份重量的活性蛋白质0.1至10,000重量存在。
[0288] 可以添加非离子型表面活性剂或去垢剂(也称为“湿润剂”)来帮助溶解治疗剂，以及保护治疗性蛋白质免受搅拌诱导的聚集，其还允许制剂暴露于应力剪切表面而不导致蛋白质变性。适宜的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、Polyoxamer(184、188等)、多聚醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐单醚( -20、 -80等)。非
离子型表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，例如约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。然而，表面活性剂具有与抗体结合的倾向性并且可以损害抗体的构象。因此，在使用表面活性剂时，起稳定作用的浓度应当是低的并且实验地断定。
离子型表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，例如约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。然而，表面活性剂具有与抗体结合的倾向性并且可以损害抗体的构象。因此，在使用表面活性剂时，起稳定作用的浓度应当是低的并且实验地断定。
[0290] 抗hPG抗体可以单一地施用或作为一种或多种抗hPG抗体的混合物单独施用或与用于阻止结肠直肠癌转移或复发的其他药物(包括但不限于化疗剂，生物治疗剂和抗体治疗剂(例如，贝伐单抗))混合或组合施用。
[0291] 7.10.药物试剂盒
[0292] 在某些实施方案中，本发明提供了由临床医生或其他人使用的药物试剂盒。药物试剂盒是一种包装，其包含本公开的抗hPG抗体(例如以冻干的形式或作为水溶液)和以下一种或多种：如本公开中其它地方所描述的至少第二治疗剂；施用抗hPG抗体的装置，例如，针头和/或注射器；和如果抗体为冻干或浓缩形式用于重悬或稀释抗体的药物级水或缓冲液。试剂盒也可以包括用于制备抗体组合物和/或施用该组合物至患者的说明书。
[0293] 每个单位剂量的抗hPG抗体组合物可以单独地包装，并且试剂盒可以含有一个或多个单位剂量(例如，2个单位剂量、3个单位剂量、4个单位剂量、5个单位剂量、7个单位剂量、8个单位剂量、10个单位剂量或更多)。在一个实施方案中，一个或多个单位剂量各自装在注射器，并且在另一个实施方案中，一个或多个单位剂量各自包含于适合与静脉内导管连接的袋内或相似容器内。
[0294] 7.11.有效剂量
[0295] 包含本公开的中和性抗hPG抗体的组合物通常以有效(至少部分)实现所需结局的剂量施与需要治疗或阻止结肠直肠癌转移或阻止结肠直肠癌复发的受试者。
[0296] 就治疗结肠直肠癌转移而言，治疗益处尤其意指转移性结肠直肠癌的任何改善、停顿或减慢结肠直肠癌转移灶的生长、减少此类转移灶在受试者内部的数目和/或大小、减少流向结肠直肠癌转移灶的血流量、降低结肠直肠癌转移灶的代谢、降低结肠直肠癌转移性癌症的严重性、抑制转移性结肠直肠癌细胞的增殖或增加其凋亡、停顿或延迟受试者中与转移性结肠直肠癌相关的症状或体征加重、允许手术切除结肠直肠癌转移灶，而在治疗之前此类切除本来已经不可能、增加患有转移性结肠直肠癌的受试者的寿命、舒适感或生活质量或减少这种受试者中的疼痛。对于治疗益处存在而言，不要求转移性结肠直肠癌的完全治愈，尽管转移性结肠直肠癌的完全治愈是所希望的。
[0297] 治疗益处也可以就无进展存活(PFS)来度量。在这种情况下，测量最初患有II、III或IV期结肠直肠癌的受试者经多久时间进展至本疾病更晚期。将PFS增加3、4、5、6、7、8、9、10或更多个月视为提供治疗益处。
[0298] 转移性结肠直肠癌肿瘤尺寸、数目和代谢可以使用多种扫描技术，包括但不限于CT、MRI、功能MRI、SPECT和PET以及本领域普通技术人员已知的其他方法测量。
[0299] 治疗益处也可以与一个或多个代用终点相关。通过举例方式，不受限制地，可以在受试者中随时间推移测量转移性结肠直肠癌产生某些蛋白质或其他因子，如胃泌素原或癌胚抗原(CEA)，其中所述因子水平的降低表示治疗益处。
[0300] 就阻止结肠直肠癌转移而言，有效剂量是这样的量，所述量至少部分地有效阻止转移性结肠直肠癌，尤其如以下佐证：不存在结肠直肠癌转移、延迟、停顿或减慢结肠直肠癌转移灶的生长、减少最终可能出现的任何结肠直肠转移灶的数目和/或大小并且抑制或干扰转移性结肠直肠癌细胞能够借以从原发性肿瘤扩散出来的任何机理性步骤。对于功效存在而言，不要求完全阻止结肠直肠癌转移，尽管完全阻止结肠直肠癌转移是所希望的。
[0301] 就阻止结肠直肠癌复发而言，有效剂量是这样的量，所述量至少部分地有效阻止转移性结肠直肠癌复发，尤其如以下佐证：不存在结肠直肠癌复发、维持结肠直肠癌消退、维持结肠直肠癌消退、或延迟、停顿或减慢其中初始结肠直肠癌变得不可检测到或明显消失的治疗后受试者中结肠直肠癌复现或再生长或新结肠直肠肿瘤生长。阻止结肠直肠癌复发的功效尤其也由以下情况佐证：杀死结肠直肠癌干细胞、延迟、停顿、抑制或减慢结肠直肠癌干细胞的生长或增殖、增加结肠直肠癌干细胞凋亡或引起结肠直肠癌干细胞分化成不能够有助于结肠直肠癌形成或生长的细胞。如本文其他处所描述，结肠直肠癌干细胞可鉴定为具有表示此类细胞特征的一个或多个表型属性，包括但不限于某些细胞标志物的表达，在低黏附培养条件下生长为球状体的能力和移植后启动新肿瘤生长的能力。对于功效存在而言，不要求完全阻止结肠直肠癌复发，尽管完全阻止结肠直肠癌复发是所希望的。
[0302] 为实现治疗性功效不必然要求结合全部胃泌素原。相反地，系统性降低肿瘤内部、尤其体液如腹水、来自胸膜渗出液、脑脊液、淋巴液、血液、血浆、血清或其他地方的流体内部胃泌素原的浓度也可以是有效的。
[0303] 根据本领域普通技术人员的知识，可以在患者中用滴定法测量抗hPG抗体组合物的剂量，从而在施用后在预定时间降低目的组织或体液中的游离hPG浓度至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％、或约5％-10％、约10％-15％、约
15％-20％、约20％-25％、约25％-30％、约30％-35％、约35％-40％、约40％-45％、约
45％-50％、约50％-55％、约55％-60％、约60％-65％、约65％-70％、约70％-75％、约
75％-80％、约80％-85％、约85％-90％、或约90％-95％、或范围在任何前述值之间的游离hPG浓度降低百分数。
15％-20％、约20％-25％、约25％-30％、约30％-35％、约35％-40％、约40％-45％、约
45％-50％、约50％-55％、约55％-60％、约60％-65％、约65％-70％、约70％-75％、约
75％-80％、约80％-85％、约85％-90％、或约90％-95％、或范围在任何前述值之间的游离hPG浓度降低百分数。
[0304] 所施用的抗hPG抗体的量将取决于多种因素，包括待治疗的受试者体格大小和重量、施用的形式、途径和部位，治疗方案(例如是否使用第二治疗剂)，正在治疗的具体受试者的年龄和病症、在治疗之前的所述受试者血液中检测到的PG水平、正在用抗PG抗体治疗的受试者的敏感性。本领域技术人员可以容易地测定适宜剂量。最终，临床医生将决定待使用的适当剂量。可以根据需要经常重复此剂量。如果出现副作用，可以按照正常临床实践改变或降低剂量的量和/或频率。适当的剂量和治疗方案可以通过使用本公开的方法或本领域普通技术人员已知的其他方法监测治疗进展来建立。
[0305] 最初可以从体外测定法估计有效剂量。例如，可以配制用于动物的起始剂量来达到抗hPG抗体的循环血液或血清浓度，该浓度处于或高于体外测量的抗体对胃泌素原的结合亲和力。考虑具体抗体的生物利用率来计算达到这类循环血液或血清浓度的剂量良好地处于技术人员的能力范围之内。对于指导，读者可参考第1部分：总原则(General Principles)，引自″Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第11版，Hardman，J.G.等，编著，McGraw-Hill Professional及其中引用的参考文献。也可以从体内数据(如动物模型)估计起始剂量。普通技术人员可以常规地改编这类信息来确定适合用于人施用的剂量。
[0306] 在具体实施方案中，可以通过以下方式确定个体受试者的静脉内剂量；在治疗之前一些日至一些周测量该个体的血清或血浆PG浓度若干次并且计算将具有饱和作用的抗PG抗体量，即，足以结合全部PG的量。如技术人员将理解，对给定PG血清或血浆浓度实现饱和作用所需要的任何特定抗体的量将部分地取决于特定抗体的亲和常数。用于计算特定目的抗PG抗体的饱和量的方法是熟知的。
[0307] 为确保饱和，可以施用大于计算饱和量的量，例如，可以施用大于计算饱和量至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或甚至10倍的量。对于除静脉内施用之外的施用模式，如本领域熟知，可以基于药物代谢动力学和生物利用率调整这个量。
[0308] 取决于寻求阻止复发的癌症的类型、施用途径及受试者的年龄、体重和状态，抗hPG抗体组合物的有效剂量可以是每个单次施用(例如，快速浓注)、多次施用或持续施用(例如，输注)从约0.001mg/kg至约250mg/kg或其中任意有效范围或值。在某些实施方案中，每个剂量可以是从约0.1mg/kg至约0.5mg/kg；约0.25mg/kg至约0.75mg/kg；约0.5mg/kg至约1mg/kg；约2mg/kg；约1.5mg/kg至约2.5mg/kg；约2mg/kg至约3mg/kg；约
2.5mg/kg至约3.5mg/kg；约3mg/kg至约4mg/kg；约3.5mg/kg至约4.5mg/kg；约4mg/kg至约5mg/kg；约5mg/kg至约7mg/kg；约6mg/kg至约8mg/kg；约7mg/kg至约9mg/kg；约8mg/kg至约10mg/kg；约10mg/kg至约15mg/kg；约12.5mg/kg至约17.5mg/kg；约15mg/kg至约20mg/kg；约17.5mg/kg至约22.5mg/kg；约20mg/kg至约25mg/kg；约22.5mg/kg至约
27.5mg/kg；约25mg/kg至约30mg/kg；约30mg/kg至约40mg/kg；约35mg/kg至约45mg/kg；
约40mg/kg至约50mg/kg；约45mg/kg至约55mg/kg；约50mg/kg至约60mg/kg；约55mg/kg至约65mg/kg；约60mg/kg至约70mg/kg；约65mg/kg至约75mg/kg；约70mg/kg至约80mg/kg；约75mg/kg至约85mg/kg；约80mg/kg至约90mg/kg；约85mg/kg至约95mg/kg；约90mg/kg至约100mg/kg；约95mg/kg至约105mg/kg；约100mg/kg至约150mg/kg；约125mg/kg至约175mg/kg；约150mg/kg至约200mg/kg；约175mg/kg至约225mg/kg；约200mg/kg至约
250mg/kg。其他剂量范围也是可能的。
2.5mg/kg至约3.5mg/kg；约3mg/kg至约4mg/kg；约3.5mg/kg至约4.5mg/kg；约4mg/kg至约5mg/kg；约5mg/kg至约7mg/kg；约6mg/kg至约8mg/kg；约7mg/kg至约9mg/kg；约8mg/kg至约10mg/kg；约10mg/kg至约15mg/kg；约12.5mg/kg至约17.5mg/kg；约15mg/kg至约20mg/kg；约17.5mg/kg至约22.5mg/kg；约20mg/kg至约25mg/kg；约22.5mg/kg至约
27.5mg/kg；约25mg/kg至约30mg/kg；约30mg/kg至约40mg/kg；约35mg/kg至约45mg/kg；
约40mg/kg至约50mg/kg；约45mg/kg至约55mg/kg；约50mg/kg至约60mg/kg；约55mg/kg至约65mg/kg；约60mg/kg至约70mg/kg；约65mg/kg至约75mg/kg；约70mg/kg至约80mg/kg；约75mg/kg至约85mg/kg；约80mg/kg至约90mg/kg；约85mg/kg至约95mg/kg；约90mg/kg至约100mg/kg；约95mg/kg至约105mg/kg；约100mg/kg至约150mg/kg；约125mg/kg至约175mg/kg；约150mg/kg至约200mg/kg；约175mg/kg至约225mg/kg；约200mg/kg至约
250mg/kg。其他剂量范围也是可能的。
[0309] 施用的量、频率和持续时间将取决于多种因素，如患者年龄、体重和疾病状态。因而，在非限制性实例中，治疗性施用方案可以持续1日或更长、2日或更长、3日或更长、4日或更长、5日或更长、6日或更长、1周或更长、2周至无限期、2周至6个月、3个月至5年、6个月至1年或2年、8个月至18个月等。任选地，提供治疗方案用于反复施用，例如每日一次、每日两次、每两日、三日、五日、一周、两周或一个月。可以按相同的剂量或按不同的剂量反复施用。可以反复施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。可以作为单次剂量或在治疗方案的过程内(例如在一周、两周、三周、一个月、三个月、六个月、一年或更长的过程内)施用治疗有效量的抗hPG抗体。
[0310] 8.实施例
[0311] 实施例1转移性结肠直肠癌细胞中胃泌素基因的表达
[0312] 本实施例描述了胃泌素(GAST)基因在人原发性结肠直肠癌细胞系HT29、HCT116、RKO、SW480和DLD1以及转移性结肠直肠癌细胞系SW620和T84中的表达。还测试了分离自活组织检查样品的细胞(CRC1)，其中所述活组织检查样品来自人原发性结肠直肠肿瘤。SW620细胞最初源自诊断患有Dukes氏C期结肠直肠腺癌的患者的淋巴结转移灶。T84细胞最初源自诊断患有结肠直肠癌的患者的肺转移灶。
[0313] A.方法
[0314] 使用标准技术，使用定量RT-PCR从HT29、HCT116、RKO、SW480、DLD1、SW620和T84细胞系的RNA制备物中定量GAST mRNA的表达。数据与RKO原发性结肠直肠癌细胞系中存在的胃泌素mRNA表达水平相比进行表述。RKO细胞正常地表达低水平的胃泌素原。注意相对胃泌素mRNA水平以对数标度报道。
[0315] B.结果
[0316] 图1中显示通过定量RT-PCR测量的胃泌素基因表达水平。检查的全部原发性和转移性结肠直肠癌细胞均表达胃泌素基因，但是水平是变化的。通过翻译后加工，胃泌素基因产物可以转换成胃泌素原。
[0317] 使用转移性结肠直肠癌细胞系Colo-205进行相似的实验，但结果不是可重复的。
[0318] 实施例2胃泌素基因在从患者手术取出的原发性和转移性结肠直肠肿瘤中的表达
[0319] 本实施例描述了胃泌素基因(GAST)在从患者手术取出的匹配的原发性和转移性结肠直肠肿瘤中的表达。
[0320] A.方法
[0321] 根据适用的伦理学指南，从患者中手术切除原发性和转移性结肠直肠肿瘤。使用标准技术，从肿瘤组织样品制备RNA并且通过定量RT-PCR测量胃泌素mRNA。胃泌素mRNA在转移性肿瘤中的表达相对于取自相同患者的匹配原发性肿瘤中的表达水平来归一化。
[0322] B.结果
[0323] 图2中显示相对于来自相同患者的匹配原发性肿瘤中的表达，在来自11位患者的转移性结肠直肠肿瘤中表达的胃泌素mRNA的水平。虽然研究的全部原发性和转移性结肠直肠肿瘤均表达胃泌素基因，但是相对于匹配的原发性肿瘤，在转移性肿瘤中的表达水平在不同患者当中广泛地变动。
[0324] 实施例3胃泌素原由转移性癌细胞的分泌
[0325] 本实施例描述了3种不同的转移性结肠直肠癌细胞的胃泌素原分泌的定量。
[0326] A.方法
[0327] 细胞在常规的75cm2塑料瓶中培育直至达到60％汇合度。随后移去培养基并且用PBS漂洗细胞1次。随后添加20ml的M11培养基(无酚红)至各瓶，并且将细胞孵育额外48小时。随后将培养基收集、以1,000g离心5分钟以除去细胞碎片，并且在-80℃冷冻。细胞随后用胰蛋白酶消化并计数。
[0328] 为了测量分泌的胃泌素原，将冷冻的生长培养基缓慢在冰上融化并且随后使用蛋白质浓缩器(Icon Pierce)通过以2,500g离心45分钟而浓缩40倍至500μl体积。随后使用夹心ELISA技术测量胃泌素原浓度。
[0329] B.结果
[0330] 图3中显示在3种转移性结肠直肠癌细胞系条件化的培养基中胃泌素原的浓度。数据表示为每生长48小时每百万个细胞的胃泌素原浓度，单位pM。在这个实验中，Colo-205细胞不产生处于所用测定法的检测限范围的PG。
[0331] 实施例4诊断患有原发性和转移性结肠直肠癌的患者中的血浆或血清胃泌素原浓度
[0332] 本实施例描述了定量患有原发性结肠直肠癌并且无转移的患者、转移性结肠直肠癌患者和外科手术切除原发性肿瘤的转移性结肠直肠癌患者中胃泌素原的血浆水平或血清水平。
[0333] C.方法
[0334] 测量健康个体中的血浆或血清胃泌素原浓度作为对照，并且测量结肠直肠癌患者中的血浆或血清胃泌素原浓度。健康对照样品(n＝104)从血库获得。结肠直肠癌患者包含三个类群。第一，在采样时诊断患有原发性癌症而无转移的患者(T+M-；n＝16)。第二，在采样时诊断患有转移性疾病的患者(T+M+；n＝24)。和第三，采样时诊断患有转移性疾病但是已经手术去除原发性肿瘤的患者(T-M+；n＝46)。大部分患有转移性疾病的患者，即24位T+M+患者中15位和46位T-M+患者中41位，在采样时正在接受化疗或已经刚刚接受了化疗。
[0335] 使用与下文预先描述的一种技术相似的胃泌素原特异的夹心ELISA技术，进行血浆或血清胃泌素原水平定量。
[0336] Nunc MaxiSORP 96孔板的孔用胃泌素原特异的第一抗体包被如下。在MilliQ水中的50mM，pH 9.6碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液的溶液内稀释对胃泌素原羧基端区域特异的抗胃泌素原多克隆抗体至浓度3μg/ml。随后将总计100μl抗体溶液添加至96孔板的每个孔并且在4℃孵育过夜。在结合后，从各孔中移去抗体溶液，各孔随后用100μl洗涤缓冲液(1X PBS/0.1％吐温20)洗涤3次。随后将总计100μl封闭缓冲液(1X PBS/0.1％吐温20/0.1％BSA)添加至每个孔并且在22℃孵育2小时。随后移去封闭缓冲液，并且各孔用洗涤缓冲液洗涤3次。随后将分离自患者的血浆或血清样品以100μl体积以稀释系列(一般1∶1、1∶2、1∶5和1∶10稀释度)添加至各孔并且随后在22℃孵育2小时。将血浆或血清样品一式两份分析。
[0337] 测定法还包括两条标准曲线。使用至每孔最终量1ng、0.5ng、0.25ng、0.1ng、0.05ng、0.01ng和0ng的重组胃泌素原稀释物制备第一标准曲线。第二标准曲线，充当阴性对照，是从在封闭缓冲液中以与测试样品相同的稀释度即1∶1、1∶2、1∶5和1∶10稀释的胃泌素原阴性的人血清制备的。备选地，在测定血浆样品时，第二标准曲线，充当阴性对照，是从在封闭缓冲液中以与测试样品相同的稀释度即1∶1、1∶2、1∶5和1∶10稀释的胃泌素原阴性的人血浆制备的。
[0338] 与血浆或血清样品的孵育完成后，移去孔内容物并且各孔用洗涤缓冲液洗涤3次，100μl/孔，此后，如下使用对胃泌素原特异的第二抗体检测与第一抗体结合的胃泌素原。
[0339] 在封闭缓冲液中稀释对胃泌素原氨基端区域特异的生物素偶联的抗胃泌素原多克隆或单克隆抗体至浓度0.1至10μg/ml，这取决于抗体。随后将总计100μl抗体溶液添加至每个孔并且在22℃孵育1小时。
[0340] 在第二抗体结合完成后，平板用洗涤缓冲液洗涤3次，100μl/孔，此后，将100μl的链霉亲和素-HRP溶液(封闭缓冲液中的25ng/mL)添加至每个孔并且在22℃孵育1小时。与链霉亲和素-HRP溶液的孵育完成后，平板用洗涤缓冲液洗涤3次，100μl/孔。此后，每孔添加使用Pierce SuperSignal ELISA Femto最大灵敏度化学发光底物试剂盒制备的100μl化学发光底物，在室温暗处孵育5分钟，并且在发光计上随后读数。
[0341] 基于发光计读数，使用线性回归分析来推导与标准曲线数据相对应的线的等式。使用这个等式，随后计算多种患者样品中胃泌素原的浓度。
[0342] D.结果
[0343] 图4的箱图显示与健康对照相比，三个类群的所测定的结肠直肠癌患者的血浆或血清胃泌素原浓度的第25百分位数、中位数和第75百分位数。须状图标表示血浆或血清胃泌素原浓度的第5和第95百分位数。T+或T-分别表示原发性肿瘤是仍存在或已经切除；M+或M-分别表示在患者中转移或未检测到转移。表4含有原始数据的统计分析汇总。
[0344] 这份数据表明，与健康个体相比，患有原发性和转移性结肠直肠癌的患者在其血浆或血清中均具有升高水平的胃泌素原。此外，胃泌素原水平在手术切除原发性肿瘤的转移性结肠直肠癌患者中仍是升高的。这表明此类患者中结肠直肠转移灶产生胃泌素原。
[0345]
[0346]
[0347] 实施例5抗胃泌素原多克隆抗体对培养的SW620转移性结肠直肠癌细胞生长的影响
[0348] 本实施例描述了抗hPG多克隆抗体对培养的SW620转移性人结肠直肠癌细胞系生长的影响。
[0349] A.方法
[0350] SW620细胞接种至6孔板中，血清饥饿过夜，随后每12小时用PBS、3微克/ml对照抗体(多克隆兔抗人IgG，Affinity BioReagents，Ref #SA1-600)或抗PG多克隆抗体处理。本实验一式两份实施，并且技术人员不知晓有关处理溶液的内容。开始处理后72小时，计数各孔中的存活细胞数3次。
[0351] B.结果
[0352] 如图5中所示，用抗PG多克隆抗体处理在72小时时间范围内导致SW620细胞的生长减少43.5％(p＝0.0294，曼-惠特尼检验；n＝2)。这个实验的结果表明，针对PG的多克隆抗体在体外有效降低转移性结肠直肠癌细胞的生长。
[0353] 实施例6抗胃泌素原单克隆抗体对培养的SW620转移性结肠直肠癌细胞生长的影响
[0354] 本实施例描述了抗hPG单克隆抗体对培养的SW620转移性人结肠直肠癌细胞系生长的影响。
[0355] A.方法
[0356] SW620细胞接种至6孔板中，血清饥饿过夜，随后每12小时用PBS、3微克/ml对照抗体(小鼠抗人IgG1，Calbiochem，Ref #411451)或4种不同的抗PG单克隆抗体MAb3、MAb4、MAb2和MAb1处理。本实验一式两份实施，并且技术人员不知晓有关处理溶液的内容。开始处理后48小时，计数各孔中的存活细胞数6次并进行平均。
[0357] 在一个独立实验中，将SW620细胞接种至6孔板中(每孔100,000个细胞)并且与上文类似地用5μg/ml抗hPG单克隆抗体5-23(即，MAb5-MAb23)或5μg/ml对照抗体处理。48小时后，计数活细胞的数目，从所述数目中减去实验开始时(即，T0)的细胞数目。特异性抗体处理孔中存活细胞的数目随后表示为对照的百分比。
[0358] B.结果
[0359] 图6A中所示的用MAb1-MAb4处理SW620细胞的结果计算为在实验结束时每孔平均细胞数减去实验开始时接种的细胞数。在表5中显示原始数目和统计量(曼-惠特尼检验)。这个实验的结果表明与对照抗体相比，针对PG的不同单克隆抗体在体外有效减少SW620转移性结肠直肠癌细胞的生长。所述结果还显示尽管与对照抗体相比，针对PG的全部单克隆抗体均有效减少细胞的生长，但是两种抗体MAb3和MAb4比其他抗体更有效。
[0360]
[0361] 图6B中显示用均能够特异性结合hPG的MAb5-MAb23处理SW620细胞的结果。如结果显示，与非特异性对照抗体相比，所测试的抗hPG单克隆抗体显示出抑制培养的SW620转移性结肠直肠癌细胞系生长的有效性范围。
[0362] 进行相关的实验以确定用MAb3处理Colo-205转移性结肠直肠癌细胞对生长的影响，但结果不是可重复的。
[0363] 实施例7抗胃泌素原单克隆抗体对培养的T84转移性结肠直肠癌细胞生长的影响[0364] 本实施例描述了抗hPG单克隆抗体对培养的T84转移性人结肠直肠癌细胞系生长的影响。
[0365] A.方法
[0366] 这个实验所使用的方法与用来度量抗胃泌素原单克隆抗体对SW620细胞影响的那些方法相似，除了所用的抗胃泌素原抗体是抗hPG MAb3之外。
[0367] B.结果
[0368] 图7中所示的结果计算为在实验结束时每孔平均细胞数减去实验开始时接种的细胞数。表6中显示统计分析汇总。这个实验的结果表明与对照抗体相比，抗hPG MAb3在体外有效减少T84转移性结肠直肠癌细胞的生长。
[0369]
[0370]
[0371] 进行相关的实验以确定用MAb3处理Colo-205转移性结肠直肠癌细胞对生长的影响，但结果不是可重复的。
[0372] 实施例8抗胃泌素原多克隆抗体对裸小鼠中SW620细胞异种移植物所致的肝转移灶形成的影响
[0373] 本实施例描述了抗PG多克隆抗体对SW620细胞在移植入裸小鼠后形成肝脏转移灶的能力的影响。
[0374] A.方法
[0375] 总计5×106个SW620细胞注射至年龄6周的31只BALBc/裸小鼠中每只裸小鼠的脾中。在注射细胞后两分钟，手术取出脾。在恢复4日后，将小鼠随机分成3组，每组进行3种不同处理中的一种。具体而言，11只小鼠用PBS注射，10只小鼠用稀释于PBS中的对照抗体注射，并且10只小鼠用也稀释于PBS中的抗PG多克隆抗体注射，抗体的剂量是150微升体积中的8mg/kg。每周2次腹膜内注射，持续6周。6周后，在注射过程完成后，将小鼠用二氧化碳安乐死并取出肝脏，并且计数存在的可视转移灶的数目。还制备肝脏和转移灶用于石蜡包埋和免疫组织化学分析。
[0376] B.结果
[0377] 图8A中显示无可视转移灶的肝脏的照片，所述肝脏来自用抗hPG多克隆抗体处理的小鼠。图8B显示具有可视转移灶的肝脏的照片，所述肝脏来自用对照多克隆抗体处理的小鼠。表7显示在来自用抗hPG多克隆抗体处理的小鼠中的每个肝脏中计数的转移灶数目。表8显示在来自用对照多克隆抗体处理的小鼠中的每个肝脏中计数的转移灶数目。表9显示在来自用PBS处理的小鼠中的每个肝脏中计数的转移灶数目。图9是与治疗组相比而言转移灶数目的图示。
[0378]
[0379]
[0380]
[0381]
[0382] 组织学分析揭示出来自两个对照组的肝脏切片中存在微转移灶，所述微转移灶不存在于从抗hPG抗体处理的动物的肝脏所获得的切片中。图10中所示的显微照片内显示在对照动物肝脏内的血管中检测到的微转移灶的实例。
[0383] 这种实施例中的结果表明与仅接受对照抗体或运载体的小鼠相比，用抗hPG抗体处理的移植有SW620细胞(结肠直肠癌转移性细胞系)的裸小鼠减少可视肝脏转移灶的总数。虽然减少的程度未达到统计显著性，但是数字数据中的趋势以及抗hPG抗体处理的小鼠的肝脏中不存在微转移灶，表明PG抗体在这个模型系统中有效减少结肠直肠癌转移的发生率。
[0384] 实施例9抗胃泌素原单克隆抗体对裸小鼠中SW620细胞异种移植物所致的肝转移灶形成的影响
[0385] 本实施例描述了抗PG单克隆抗体对SW620细胞在移植入裸小鼠后形成肝脏转移灶的能力的影响。
[0386] A.方法6
[0387] 总计5×10 个SW620细胞注射至年龄5周的20只BALBc/裸小鼠中每只裸小鼠的脾中。在注射细胞后两分钟，手术取出脾。在恢复后，将小鼠随机分成2组，每组进行2种不同处理中的一种。具体而言，10只小鼠用稀释于PBS中的对照抗体(抗人IgG1Fc)注射，并且10只小鼠用也稀释于PBS中的抗hPG单克隆抗体MAb3注射。抗体的剂量是150微升体积中的8mg/kg。每周2次腹膜内注射，持续6周。每只小鼠每周称重一次。6周后，在注射过程完成后，将小鼠用二氧化碳安乐死并取出肝脏，并且计数存在的可视转移灶的数目。
[0388] B.结果
[0389] 图11中显示结果。在施用对照抗体的小鼠中，转移灶的平均数目是7.3，并且在用抗hPG单克隆抗体MAb3治疗的小鼠中，转移灶的平均数目是4.3。这对应于下降41％，并且是统计显著的，p＝0.00006。下表10中显示统计分析。在治疗的小鼠中肝脏转移灶的平均重量与对照小鼠中的167mg相比也降至96mg，虽然这种差异未经计算达到统计显著性。
[0390]
[0391]
[0392] 实施例10结肠直肠癌细胞中LGR5的表达因低黏附培养条件下生长而增加。
[0393] 本实施例描述了结肠干细胞表面标志物LGR5的表达对低黏附培养条件下结肠直肠癌细胞系生长的影响。测试的细胞包括来自原发性结肠直肠癌和转移性结肠直肠癌细胞系的细胞、来自从人原发性结肠直肠癌获得的活组织检查样品中的细胞。低黏附培养条件可以促进癌干细胞生长为球状体并且提供用于结肠直肠癌干细胞的有用分析工具。
[0394] A.方法
[0395] 测试的细胞来自原发性结肠直肠癌细胞系HT29和HCT116和转移性结肠直肠癌细胞系SW620和T84。
[0396] 还如下测试了分离自活组织检查样品的细胞(CRC1)，其中所述活组织检查样品来自人原发性结肠直肠肿瘤。活组织检查样品在无菌Hanks平衡盐(HBSS)中漂洗几次，随后在室温置于HBSS中的0.4％次氯酸钠溶液内30分钟。在HBSS中再漂洗几次后，使用解剖刀片，将活组织检查样品切成1mm小片并漂洗。随后将小片在37℃于M11培养基中的50％Accumax溶液内孵育1小时，同时每20分钟柔和振摇一次，其中所述M11培养基含有强力抗生素和葡萄糖(含有20ng/mL EGF、10ng/mL FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml Cyproflaxin、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM/F12)。含有这些消化样品的Accumax溶液随后在100微米筛上过滤。使用台盼蓝技术对小等分试样的过滤溶液测定生存力。溶液随后以200g离心10分钟，并且沉淀物重悬于含有10％FBS以终止Accumax反应的2ml M11培养基中。细胞随后在Corning超低黏附培养瓶中孵育几日，随后转移至无FBS的M11培养基中进一步扩增。将来自CRC1样品的细胞扩增几周并且在进行实验之前冷冻/融化一次。
[0397] 细胞在两种不同的培养条件下培育。首先，细胞在用于培育哺乳动物细胞的标准2
塑料培养器具中培育，这促进细胞附着至表面。具体而言，将200,000个细胞接种至75cm瓶(Corning)中的DMEM+5％胎牛血清(FBS)+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素内。
塑料培养器具中培育，这促进细胞附着至表面。具体而言，将200,000个细胞接种至75cm瓶(Corning)中的DMEM+5％胎牛血清(FBS)+100U/ml青霉素+100U/ml链霉素内。
[0398] 其次，细胞在用于哺乳动物细胞典型的不良附着或完全不附着的低黏附培养器具2
中培育。具体而言，30,000个细胞在超低黏附性75cm 瓶(Corning)中的M11培养基内(含有20ng/mL EGF、10ng/mL FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml cyproflaxin、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM/F12)中培育。在生长时期后，使用Accumax(Innovative Cell Technologies，Inc.)，在FACS分析之前，将细胞在37℃重悬和解聚集成单细胞悬液持续45分钟。此后使用标准技术，细胞用针对细胞表面标志物LGR5的N端区域的抗体(Abgent，Inc.)染色并且通过FACS分选以测定表达该标志物的细胞的百分数。全部实验进行3次。
中培育。具体而言，30,000个细胞在超低黏附性75cm 瓶(Corning)中的M11培养基内(含有20ng/mL EGF、10ng/mL FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml cyproflaxin、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM/F12)中培育。在生长时期后，使用Accumax(Innovative Cell Technologies，Inc.)，在FACS分析之前，将细胞在37℃重悬和解聚集成单细胞悬液持续45分钟。此后使用标准技术，细胞用针对细胞表面标志物LGR5的N端区域的抗体(Abgent，Inc.)染色并且通过FACS分选以测定表达该标志物的细胞的百分数。全部实验进行3次。
[0399] B.结果
[0400] 图12中显示了因细胞在两种培养条件下生长而产生的表达LGR5的结肠直肠癌细胞的相对百分数。对于测试的全部细胞系，与常规条件下的生长相比(灰色棒)，表达LGR5的细胞的百分数在细胞于低黏附培养条件下生长为球状体(黑色棒)时更大。这种模式对于源自原发性结肠直肠癌细胞系(HT29和HCT116)以及转移性结肠直肠癌细胞系(SW620和T84)的细胞是相似的。
[0401] 从人原发性结肠直肠癌的活组织检查获得的CRC1细胞在低黏附培养条件下培育时也表达LGR5。然而，因为在这种特定实验中，CRC1细胞在常规贴壁条件下生长不良，所以不可能在细胞于贴壁条件对非贴壁条件下培育时直接比较LGR5表达水平。
[0402] 实施例11胃泌素基因的表达因结肠直肠癌细胞在低黏附培养条件下生长而增加[0403] 本实施例描述了对低黏附培养条件下培育的原发性和转移性结肠直肠癌细胞系以及来自从原发性人结肠直肠癌所获得的活组织检查样品的细胞中胃泌素基因表达的影响。此类生长条件富集癌干细胞。
[0404] A.方法
[0405] 测试的细胞来自原发性结肠直肠癌细胞系HT29、HCT116、RKO、SW480及DLD1和转移性结肠直肠癌细胞系SW620和T84。还测试了分离自活组织检查样品的细胞(CRC1)，其中所述活组织检查样品来自人原发性结肠直肠肿瘤。细胞在两种不同的培养条件下培育。首先，细胞在用于培育哺乳动物细胞的常规培养器具中培育，如上文所述，这促进细胞附着至塑料表面。其次，细胞还在用于哺乳动物细胞典型地附着不良的低黏附培养器具中培育。
如上文所述。在生长一段时间后，将细胞重悬并裂解，并且使用标准技术分离mRNA。随后根据标准技术，使用定量RT-PCR测量胃泌素基因的表达。每个实验重复三次。
如上文所述。在生长一段时间后，将细胞重悬并裂解，并且使用标准技术分离mRNA。随后根据标准技术，使用定量RT-PCR测量胃泌素基因的表达。每个实验重复三次。
[0406] B.结果
[0407] 图13中报道了在常规和低黏附培养条件下所测试的不同细胞中表达的胃泌素mRNA的相对水平。水平相对于RKO原发性结肠直肠癌细胞系中表达的胃泌素mRNA的量归一化。RKO细胞正常地表达低水平的胃泌素原。注意相对胃泌素mRNA水平以对数标度报道。对于测试的全部细胞系，与常规条件下的生长相比(灰色棒)，在细胞于低黏附培养条件下培育(黑色棒)时，胃泌素基因表达更高，有时高出许多倍。这种模式对于源自原发性结肠直肠癌细胞系以及转移性结肠直肠癌细胞系的细胞是相似的。
[0408] 实施例12在低黏附培养条件下培育的结肠直肠癌细胞表达胃泌素原蛋白质[0409] 本实施例描述了低黏附培养条件下培育的原发性和转移性结肠直肠癌细胞系以及来自从原发性人结肠直肠癌所获得的活组织检查样品的细胞表达胃泌素蛋白。此类生长条件富集癌干细胞。
[0410] A.方法
[0411] 测试的细胞来自原发性结肠直肠癌细胞系HT29和转移性结肠直肠癌细胞系SW620和T84。还测试了分离自活组织检查样品的细胞(CRC1)，其中所述活组织检查样品来自人原发性结肠直肠肿瘤。细胞在低黏附培养器具中的M11培养基(无酚红)中培育。在48小时后，将培养基收集，以1,000g离心5分钟以除去细胞碎片，并且在-80℃冷冻。使用Accumax使细胞解聚集并且对其计数。为了测量分泌的胃泌素原，将冷冻的培养基在冰上融化并且随后使用蛋白质浓缩器(Icon Pierce)通过以2,500g离心45分钟而浓缩40倍至
500μl体积。随后使用夹心ELISA技术测量胃泌素原浓度。每个实验重复二次。
500μl体积。随后使用夹心ELISA技术测量胃泌素原浓度。每个实验重复二次。
[0412] B.结果
[0413] 图14中显示在低黏附培养条件下生长48小时后由结肠直肠癌细胞分泌至生长培养基中的胃泌素原的浓度。测试的全部细胞(包括一个原发性结肠直肠癌细胞系、两个转移性结肠直肠癌细胞系和来自从人原发性结肠直肠癌获得的活组织检查样品的细胞)在低黏附培养条件下生长为球状体时均分泌胃泌素原。然而，SW620细胞分泌比研究的其他细胞系明显较少的胃泌素原。数据表示为每生长48小时每百万个细胞的胃泌素原浓度，单位pM。
[0414] 实施例13抗胃泌素原多克隆抗体对低黏附培养条件下原发性结肠直肠癌细胞生长为球状体的影响。
[0415] 本实施例描述了抗胃泌素原多克隆抗体对低黏附培养条件下培育的原发性结肠直肠癌细胞系以及来自从原发性人结肠直肠癌所获得的活组织检查样品的细胞生长为球状体的影响。此类生长条件富集癌干细胞。
[0416] A.方法
[0417] 测试的细胞来自原发性结肠直肠癌细胞系HT29和HCT116以及是从来自人原发性结肠直肠肿瘤的活组织检查样品中分离的细胞(CRC1)。将细胞接种至低黏附性96孔板(Corning)各孔内的M11培养基(含有20ng/mLEGF、10ng/mL FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml cyproflaxin、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM/F12)中。对于HT29和HCT116细胞，100μl中的总计500个细胞添加至每孔中，每种处理条件添加至3个孔，而对于CRC1细胞，100μl中的总计500个细胞添加至每孔中，每种处理条件添加至10个孔。每24小时，细胞用3μg/ml多克隆抗胃泌素原抗体或对照抗体(多克隆兔抗人IgG，Affinity BioReagents，Ref #SA1-600)处理。处理HT29和HCT116细胞10日后和处理CRC1细胞14日后，计数每个孔中细胞球状体的数目，并且计算每孔平均数。实施实验的技术人员不知晓有关正在测试的抗体溶液的内容。每个实验重复二次。
[0418] B.结果
[0419] 如图15-17中所示，与对照抗体相比，抗胃泌素原多克隆抗体相当程度地减少由低黏附培养条件下培育的原发性结肠直肠癌细胞形成的细胞球状体的数目。
[0420] 实施例14抗胃泌素原单克隆抗体对低黏附培养条件下原发性结肠直肠癌细胞生长为球状体的影响
[0421] 本实施例描述了抗胃泌素原单克隆抗体对来自两个原发性结肠直肠癌细胞系的LGR5阳性细胞在低黏附培养条件下培育时在此类细胞生长为球状体的影响。此类生长条件富集癌干细胞。
[0422] A.方法
[0423] 测试的细胞来自原发性结肠直肠癌细胞系HT29和HCT116。细胞首先由FACS (FACSaria，BD Biosciences)分选以分离表达癌症干细胞标志物LGR5的那些细胞。对于6
FACS，分选2x 10 个HT29细胞，并且分选1x106个HCT116细胞。用对LGR5的N端特异的
6
抗体(Abgent，Inc.，No.AP2745A)按2mg/1x 10 个细胞来标记细胞。在FACS后，将LGR5阳性细胞以每孔10个细胞的密度铺种至低黏附96孔板的30孔内的100μl M11培养基(含有20ng/mL EGF、10ng/mL FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml cyproflaxin、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM/F12)中。每24小时，细胞用0.3μg/ml两种不同的抗胃泌素原单克隆抗体(MAb2和MAb3)之一或对照单克隆抗体(单克隆小鼠抗人IgG1，Calbiochem，Ref #411451)处理，连续14日。在处理结束时，计数在每种类型抗体存在下形成的细胞球状体数。随后允许细胞生长额外的17日，在此期间每周更新培养基而无进一步抗体处理。实施实验的技术人员不知晓有关正在测试的抗体溶液的内容。
FACS，分选2x 10 个HT29细胞，并且分选1x106个HCT116细胞。用对LGR5的N端特异的
6
抗体(Abgent，Inc.，No.AP2745A)按2mg/1x 10 个细胞来标记细胞。在FACS后，将LGR5阳性细胞以每孔10个细胞的密度铺种至低黏附96孔板的30孔内的100μl M11培养基(含有20ng/mL EGF、10ng/mL FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml cyproflaxin、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM/F12)中。每24小时，细胞用0.3μg/ml两种不同的抗胃泌素原单克隆抗体(MAb2和MAb3)之一或对照单克隆抗体(单克隆小鼠抗人IgG1，Calbiochem，Ref #411451)处理，连续14日。在处理结束时，计数在每种类型抗体存在下形成的细胞球状体数。随后允许细胞生长额外的17日，在此期间每周更新培养基而无进一步抗体处理。实施实验的技术人员不知晓有关正在测试的抗体溶液的内容。
[0424] B.结果
[0425] 如图18A和图19A中分别所示，与对照单克隆抗体相比，来自两个原发性结肠直肠癌细胞系HCT116和HT29的LGR5阳性细胞在低黏附培养下经14日生长为球状体的能力因两种针对胃泌素原的独立单克隆抗体处理而降低。
[0426] 另外，如图18B和图19B中所示，在外部添加的抗体不存在时进一步孵育培养的HCT116和HT29细胞17日后，球状体的数目不增加。这个数据表明通过抗hPG抗体对球状体形成的抑制是持续的，甚至移出特异性抗体后也是如此。
[0427] 实施例15抗胃泌素原单克隆抗体对低黏附培养条件下原发性结肠直肠癌细胞生长为球状体的影响
[0428] 本实施例描述了4种不同的抗胃泌素原单克隆抗体对CRC1细胞在低黏附培养条件下培育时此类细胞生长为球状体的影响。此类生长条件富集癌干细胞。
[0429] A.方法
[0430] CRC1细胞根据标准方法从人结肠癌活组织检查样品获得。在Accumax(Sigma)中于37℃解离45分钟后，细胞以每孔100个细胞的密度铺种至低黏附96孔板内的M11培养基(含有20ng/mL EGF、10ng/mLFGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml cyproflaxin、5μg/ml庆大霉素和3mg/ml葡萄糖的DMEM/F12)中。对于每个处理组，使用10个孔。
[0431] 在第一日开始，细胞用4种不同的抗胃泌素原单克隆抗体MAb5、MAb8、MAb13或MAb16(3μg/ml)之一或相同浓度的单克隆抗体P3X63Ag8(ATCC，Ref TIB-9)或不添加抗体的培养基作为对照每日处理两次。此后，每日进行一次处理持续8日。每日将球状体照相用于后续计数。全部实验均以盲知方式实施。在实验结束后，计数来自每个处理措施的球状体的数目。
[0432] B.结果
[0433] 图20中显示结果。每种所测试的抗hPG单克隆抗体均有效减少由原发性结肠直肠癌细胞在低黏附培养条件下形成的球状体的数目。使用带有邦弗伦尼事后检验的单因素方差分析(one-way ANOVA)，与非特异性单克隆抗体和仅培养基相比，所测试的全部抗体的抑制性作用是统计显著的，p＜0.05。MAb5、MAb8和MAb13均识别hPG的C端表位，而MAb16与hPG的N端表位结合。
[0434] 实施例16抗胃泌素原单克隆抗体对低黏附培养条件下转移性结肠直肠癌细胞生长为球状体的影响
[0435] 本实施例描述了抗胃泌素原单克隆抗体对来自转移性结肠直肠癌细胞系的ALDH1阳性细胞在低黏附培养条件下培育时此类细胞生长为球状体的影响。
[0436] A.方法
[0437] 测试的细胞来自转移性结肠直肠癌细胞系T84。使用ALDEFLUOR试剂盒(Stemcell Technologies)，将细胞首先通过FACS(FACSaria，BD Biosciences)分选以分离表达癌症干细胞标志物ALDH1的那些细胞。在FACS后，将ALDH1阳性细胞(即，显示可检测的ALDH1酶活性的那些细胞)以每孔100个细胞的密度铺种至低黏附96孔板的孔内的100μl M11培养基(含有20ng/mL EGF、10ng/mL FGF、20μg/ml胰岛素、N2补充物、2μg/ml cyproflaxin、5μg/ml庆大霉素和3μg/ml葡萄糖的DMEM/F12)中。每24小时，细胞用三种不同浓度(0.01μg/ml、0.1μg/ml或1μg/ml)之一的抗胃泌素原单克隆抗体(MAb3)或1μg/ml对照单克隆抗体(单克隆小鼠抗人IgG1，Calbiochem，Ref#411451)处理，连续
11日。在处理结束时，计数在每种抗体存在下形成的细胞球状体数。实施实验的技术人员不知晓有关正在测试的抗体溶液的内容。
11日。在处理结束时，计数在每种抗体存在下形成的细胞球状体数。实施实验的技术人员不知晓有关正在测试的抗体溶液的内容。
[0438] B.结果
[0439] 如图21中所示，与对照单克隆抗体相比，来自T84转移性结肠直肠癌细胞系的ALDH1阳性细胞在低黏附培养下生长为球状体的能力因针对胃泌素原的单克隆抗体处理而以剂量依赖性方式降低。
[0440] 实施例17抗胃泌素原单克隆抗体预处理对低黏附培养条件下原发性结肠直肠癌细胞生长为球状体的影响
[0441] 本实施例描述了4种不同的抗胃泌素原单克隆抗体对ALDH1阳性CRC1细胞在常规培养条件下的生长和在这些细胞转移至低黏附培养条件时生长为球状体的影响。
[0442] A.方法
[0443] CRC1细胞根据标准方法从人结肠癌活组织检查样品获得。在Accumax(Sigma)中于37℃解离45分钟后，将CRC1细胞(100,000个细胞/孔)在常规贴壁培养条件下在无血清DMEM培养基中在抗hPG单克隆抗体MAb5、MAb8、MAb13或MAb16存在或不存在下培育72小时。实验以盲知方式实施。
[0444] 在处理结束时，对细胞实施两个不同的测定法。首先，通过FACS测定表达ALDH1(结肠直肠癌干细胞的标志物)的细胞的百分数。在第二测定法中，对于每个处理组，将200个细胞/孔铺种在低黏附24孔板的6孔内的补充有bFGF和EGF的500μl无血清M11培养基中并且在无进一步处理的情况下培育7日。在这个期间结束时，拍摄照片，计数每孔球状体的数目，并且测量球状体表面积。
[0445] B.结果
[0446] 图22和图23中显示结果。在常规贴壁培养3日后，与对照相比，所测试的4种抗hPG单克隆抗体中的每种均有效减少表达ALDH1的CRC1原发性结肠直肠癌细胞的数目。在移去抗体并且将细胞培育额外7日后，这些抗体的每一种还有效减少由原发性结肠直肠癌细胞在低黏附培养条件下形成的球状体的数目。使用带有邦弗伦尼事后检验的单因素方差分析(one-way ANOVA)，与对照相比，MAb5、MAb8和MAb16的抑制性作用是统计显著的，p＜0.05。虽然与对照相比，MAb13也减少球状体的数目，但是这种作用没有达到统计显著性。
[0447] 实施例18抗胃泌素原单克隆抗体预处理对低黏附培养条件下转移性结肠直肠癌细胞生长为球状体的影响
[0448] 本实施例描述了使用抗胃泌素原单克隆抗体预处理对来自两种转移性结肠直肠癌细胞系的ALDH1阳性细胞在低黏附培养条件下培育时此类细胞生长为球状体的影响。
[0449] A.方法
[0450] 测试的细胞来自转移性结肠直肠癌细胞系T84和SW620。细胞首先在常规贴壁培养器具中在抗胃泌素原单克隆抗体MAb3(1μg/ml)、对照单克隆抗体、化疗剂5-氟尿嘧啶(5FU 10μM)或溶剂二甲基亚砜(DMSO)存在下培育72小时。在处理后，细胞接受两个测定法。在第一测定法中，使用ALDEFLUOR试剂盒(Stemcell Technologies)，测定癌症干细胞标志物ALDH1阳性细胞的百分数。在第二测定法中，对于每个处理组，将细胞以每孔500个细胞的密度铺种至低黏附96孔板的6孔内的含有bFGF和EGF的100μl无血清培养基中并且在无进一步处理的情况下培育11日。在这个期间结束时，随后计数每孔球状体的数目。
[0451] B.结果
[0452] 如图24和图25中分别所示，与用对照单克隆抗体处理相比，ALDH1阳性T84和SW620转移性结肠直肠癌细胞的数目因采用抗胃泌素原单克隆抗体MAb3预处理72小时而减少。
[0453] 如图26和图27中分别所示，与对照单克隆抗体相比，T84和SW620转移性结肠直肠癌细胞在低黏附培养下生长为球状体的能力因采用针对胃泌素原的单克隆抗体预处理72小时而降低。
[0454] 实施例19抗胃泌素原抗体减少新肿瘤在体内启动
[0455] 本实施例描述了对人胃泌素原特异的单克隆抗体对从裸小鼠中生长的人转移性结肠直肠癌分离的细胞在移植后形成新肿瘤的能力的影响
[0456] A.方法
[0457] 使用标准技术，对免疫缺陷性BALBc/裸小鼠给予脾内注射人转移性SW620结肠直肠癌细胞。随后对小鼠施用抗hPG单克隆抗体MAb3或对照单克隆抗体，每周2次总计6周。对于每种抗体，剂量是8mg/kg。在处理期结束时，从治疗小鼠和对照小鼠的转移灶中剖取组织。通过用Accumax处理剖取的组织使肿瘤细胞解聚集、将其过滤并计数。从用MAb3处理的小鼠的转移性组织获得总计23,800个活肿瘤细胞，并且从对照小鼠获得36,400个活肿瘤细胞。
[0458] 随后测试分离的细胞，以通过测试细胞是否可以在低黏附培养条件下生长为球状体并且它们是否在移植入新宿主时启动新肿瘤而确定它们是否显示癌干细胞的表型特征。对于球状体实验，对于处理细胞和对照细胞的每一种，将2,000个细胞/孔接种至低黏附培养器具的5个孔内的补充有bFGF和EGF的M11培养基中。将细胞培育7日，并且随后计数每个孔中形成的球状体数目。对于移植实验，汇集从分离自处理转移灶和对照转移灶的细胞发育形成的球状体，将其解聚集并计数。从源自处理转移灶的球状体中获得总计20,000个细胞，并且从源自对照转移灶的球状体中获得110,000个细胞。两只新的BALBc/裸小鼠随后用相等数目的处理细胞或对照细胞移植。具体而言，将源自处理转移灶的6,500个肿瘤细胞皮下注射至小鼠的左大腿中，而将相同数目的对照细胞皮下注射至小鼠的右大腿中。以这种方式，每只小鼠充当起自身对照。随后计算两只动物中随时间推移的肿瘤体积。
[0459] B.结果
[0460] 如图28中所示，与采用相同剂量的对照单克隆抗体处理相比，从体内转移灶分离的人转移性结肠直肠癌细胞在低黏附培养下生长为球状体的能力因采用抗胃泌素原单克隆抗体MAb3处理动物而减少。
[0461] 如图29中所示，与采用相同剂量的对照单克隆抗体处理相比，在移植从体内转移灶分离的转移性结肠直肠癌细胞后启动新肿瘤生长的能力也因采用抗胃泌素原单克隆抗3
体MAb3处理所述细胞而降低。在本图中，Y-轴对应于单位为mm 的肿瘤体积。实心正方形表示一只在皮下注射源自转移灶的转移性结肠直肠癌细胞的裸小鼠的肿瘤体积数据点，其中所述转移灶在用对照单克隆抗体处理的小鼠中生长。相反地，空心正方形表示在对侧大腿中注射源自转移灶的转移性结肠直肠癌细胞的相同小鼠的肿瘤体积数据点，其中所述转移灶在用MAb3抗胃泌素原单克隆抗体处理的小鼠中生长。实心和空心菱形对应于从本实验内使用的第二只裸小鼠中收集的相似数据。
体MAb3处理所述细胞而降低。在本图中，Y-轴对应于单位为mm 的肿瘤体积。实心正方形表示一只在皮下注射源自转移灶的转移性结肠直肠癌细胞的裸小鼠的肿瘤体积数据点，其中所述转移灶在用对照单克隆抗体处理的小鼠中生长。相反地，空心正方形表示在对侧大腿中注射源自转移灶的转移性结肠直肠癌细胞的相同小鼠的肿瘤体积数据点，其中所述转移灶在用MAb3抗胃泌素原单克隆抗体处理的小鼠中生长。实心和空心菱形对应于从本实验内使用的第二只裸小鼠中收集的相似数据。
[0462] 实施例20血浆或血清PG水平的定量
[0463] 使用以下测定法，可以便利地测定PG的血浆和/或血清水平。96孔微量滴定板用0.5和10μg/mL之间的C端抗hPG抗体(例如，兔C端抗hPG多克隆抗体，或本文描述的C端抗hPG单克隆抗体)包被并且孵育过夜。然后将平板在PBS-Tween(0.05％)中洗涤三次，并用含2％(w/v)脱脂奶粉的PBS-Tween(0.05％)封闭。分别在适宜的稀释液(例如PBS-Tween0.05％)中制备测试样品、对照样品(空白或PG阴性血浆或血清样品)和约-11 -105pM(0.5×10 M)和约0.1nM(1×10 M)之间的hPG参考标准品(冻干hPG，其在PG阴性血浆或血清中稀释)。样品在包被的平板上在37℃孵育2至4小时或备选地在21℃孵育12至
16小时之间。在孵育后，将平板用PBS-Tween(0.05％)洗涤3次，并且用0.001和0.1μg/mL之间的与辣根过氧化物酶(HRP)(见，Nakane等，1974，J.Histochem.Cytochem.22(12)：
1084-1091)偶联的N端抗hPG抗体(例如，如本文所述的多克隆N端抗hPG抗体或N端单克隆抗hPG抗体)在21℃孵育30分钟。平板随后在PBS-Tween(0.05％)中洗涤3次，并在21℃添加HRP底物15分钟。通过添加100μL 0.5M硫酸来终止反应，并在405nm获取光密度测量结果。通过与从源自hPG参考标准品的测量结果中构建的标准曲线比较来确定测试样品hPG水平。
16小时之间。在孵育后，将平板用PBS-Tween(0.05％)洗涤3次，并且用0.001和0.1μg/mL之间的与辣根过氧化物酶(HRP)(见，Nakane等，1974，J.Histochem.Cytochem.22(12)：
1084-1091)偶联的N端抗hPG抗体(例如，如本文所述的多克隆N端抗hPG抗体或N端单克隆抗hPG抗体)在21℃孵育30分钟。平板随后在PBS-Tween(0.05％)中洗涤3次，并在21℃添加HRP底物15分钟。通过添加100μL 0.5M硫酸来终止反应，并在405nm获取光密度测量结果。通过与从源自hPG参考标准品的测量结果中构建的标准曲线比较来确定测试样品hPG水平。
[0464] 实施例21用于评估抗hPG抗体的特异性的ELISA测定法
[0465] 使用如下ELISA测定法，可以便利地测定抗hPG抗体的特异性。96孔平板用磷酸缓冲盐水(PBS)中的适宜浓度的测试肽(例如25和50ng重组人PG，及50和250ng CTFP或胃泌素衍生的其他基因产物)在4℃过夜孵育，此后，各孔用洗涤溶液(PBS和0.1％吐温20)洗涤3次，并且随后每孔用100μL封闭溶液(PBS、0.1％吐温20、0.1％牛血清白蛋白或酪蛋白水解物)在22℃孵育2小时。封闭后，将孔洗涤三次，并且添加待测定的抗体(测试抗体)。将PBS和0.1％吐温20中的100μL测试抗体(0.3至1ng/mL)添加至每个孔。平板随后在22℃孵育2小时，此后，将测试抗体溶液弃去并且在洗涤步骤(3×100μL洗涤溶液，如上文指出)后替换为含有第二抗体(与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG(Fc)抗体)的封闭溶液。在与第二抗体孵育1小时后，将100μL底物溶液(例如Fast OPD或二盐酸邻苯二胺，从Sigma-Aldrich Co.可获得，根据制造商的说明配制)添加入每个孔并且在22℃暗处孵育20分钟。反应通过添加50μL 4N硫酸终止，并通过在492nm测量光密度(O.D.)来确定所催化的底物量。底物转化与结合抗原的第一(测试)抗体的量成比例。实验一式两份进行，并且将OD测量结果作为抗原浓度的函数作图。如果对hPG的测量O.D.在0.2和1.5之间，且用CTFP或任意其他胃泌素基因衍生肽不存在高于背景的统计上显著的信号，则将测试抗体评分为对PG特异，其中背景是来自仅包含PBS的对照孔的平均信号。
[0466] 实施例22用于评估抗hPG抗体的中和活性的测定法
[0467] 用于评估特异性抗hPG抗体是否具有中和性的具体测试可以如下进行。将结肠直肠癌细胞以约50,000至100,000个细胞/孔接种在6孔板中。然后用测试抗hPG抗体或对照抗体以12小时的间隔处理细胞48小时，抗体浓度为约5μg/ml。使用双尾曼-惠特尼检验(p＜0.05时认为差异显著)，与用对照非特异性抗体处理的细胞的数目相比，如果用测试抗体处理的细胞的数目显示存活细胞数目统计上显著地减少至少10％，则将测试抗体定义为在此测定法中是中和性的。针对处理期开始时(称为T0)的细胞数目校正总细胞数。用于这种测定法中的示例性结肠直肠癌细胞包括但不限于本文公开的原发性和转移性结肠直肠癌细胞系。
[0468] 实施例23用于评估抗hPG抗体的亲和力的测定法
[0469] 可以根据Nahshol等，2008，Analytical Biochemistry 383：52-60(在此通过引用的方式完整并入)，使用Proteon Technique(BioRad)测量抗hPG抗体的亲和常数。简言之，对于鼠抗PG抗体，首先将抗小鼠IgG抗体(50μg/ml)包被在传感芯片上，确保注射抗体后通过芯片检测的信号落在10,000和11,500响应单位(RU)之间。随后(以常见浓度30μg/ml)注射鼠抗hPG目的抗体(测试抗体)。如果测试抗体充分地结合，则将观察到至少500RU的额外信号。然后通过注射不同浓度的hPG(例如200nM、100nM、50nM、25nM和12.5nM)并检测结合水平，获得测试抗体和hPG之间结合的时程。通常，几个通道可用于在单个实验中平行测试多个抗体，这使得可能以不同的hPG浓度平行测定单一测试抗体的结合。一个通道应当用非对hPG特异的鼠单克隆抗体注射作为非特异性结合的对照，另一个通道应当仅用稀释缓冲液注射作为背景信号的基线。通常，在注射非特异性鼠抗体的通道中检测不到结合。可以针对更低的hPG浓度(50nM、25nM、12.5nM、6.25和3.125nM)测试在此情形(其可以导致hPG饱和捕获的单克隆抗体)中显示高水平结合的抗体，以允许获得更精细的测量结果。
[0470] 将亲和常数(KD)计算为解离常数(kd)和结合常数(ka)之间的比值。可以通过分析基于结合测量结果的实验曲线和理论廓线间统计上相关的相似性来验证实验值。
[0471] 非鼠抗hPG抗体的亲和常数可以按相似方式，使用对于抗hPG测试抗体的起源物种特异的IgG进行评估。
[0472] 实施例24用于评估与参考抗hPG抗体竞争性结合的测定法
[0473] 可以如下进行用于评估目的抗体(测试抗体)是否与生物素酰化的参考抗hPG抗体竞争结合hPG的具体测定法。96孔板用捕获抗hPG抗体(识别hPG的N端或C端区域的多克隆或单克隆抗体，该区域不同于生物素酰化的参考抗hPG抗体识别的表位)以1-10μg/ml范围内选择的浓度在4℃包被过夜(0.1-1μg/孔)。用封闭缓冲液(PBS中的0.1％吐温20，0.1％BSA)在22℃封闭2小时后，将重组hPG按10pM至1nM(10至1000pg/孔)的浓度添加并在22℃孵育2小时。然后，将生物素酰化的参考抗hPG抗体(或含有生物素酰化的参考抗hPG抗体的混合物)连同渐增浓度的未标记测试抗体一起添加，并在22℃孵育1小时。在洗涤以除去未结合的抗体后，通过将混合物与50ng/mL链霉亲和素-HRP在22℃孵育1小时，然后与辣根过氧化物酶的生荧光底物孵育并且随后在发光计中定量相对发光单位(RLU)来进行结合的标记参考抗hPG抗体的检测。测定法一式两份进行。
[0474] 与参考抗hPG抗体竞争的抗体抑制参考抗体与hPG的结合。如观察到的RLU减少所证明，与参考抗体结合基本上相同的表位的抗体或与重叠表位结合的抗体显著减少(例如，至少50％)所结合的参考抗hPG抗体的量。
[0475] 高对照值从通过将标记的参考抗体与重组hPG在无测试抗体情况下孵育的对照实验中获得。低对照值从这样的对照实验中获得，所述对照试验通过将标记的参考抗体与重组hPG在过量浓度的未标记的参考抗体存在下孵育(未标记的参考抗体因而与标记的抗体竞争与hPG结合)。随后通过将标记的参考抗体与重组hPG在渐增浓度的未标记的测试抗体存在下孵育，确定测试抗体与参考抗hPG抗体竞争的能力。
[0476] 在测试测定法中，所观察的RLU在测试抗体存在下显著降低表示测试抗体识别表示测试抗体识别与参考抗hPG抗体基本上相同的表位。
[0477] 结合作用的抑制可以表示为根据以下公式计算的抑制常数或Ki：
[0478] Ki＝IC50/(1+([参考抗hPG Ab浓度]/KD参考抗hPG Ab))
[0479] 其中“IC50”是产生参考抗体的结合作用减少50％的测试抗体的浓度，KD参考抗hPG Ab是参考抗hPG Ab的解离常数(其对hPG的亲和力的量度)。与参考抗hPG抗体竞争的有用测试抗体(例如，本文所述的抗hPG抗体之一)一般在本文所述的测定条件下具有范围从10pM至100nM的Ki。
[0480] 本申请中引用的所有出版物、专利和专利申请在此为了所有目的以相同的程度以其整体引入作为参考，就如同每一单个出版物、专利、专利申请或其他文件被单独地说明为了所有目的引入作为参考一样。
[0481] 虽然已说明和描述了多种具体实施方案，但应理解，可以进行多种改变而不背离本发明的精神和范围。
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