使用放射性标记的磷脂醚类似物的虚拟结肠镜检查
阅读：562发布：2020-05-21
专利汇可以提供使用放射性标记的磷脂醚类似物的虚拟结肠镜检查专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于双模态虚拟 结肠镜 检查 的 试剂 和方法，其使用混合的CT/PET扫描提供解剖学和功能信息。在优选的实施方案中，本发明提供了用于区分良性息肉和 恶性 肿瘤 的 放射性 标记的肿瘤特异性试剂和方法。在进一步的实施方案中，本发明提供了基于磷脂代谢的相对 水 平来区分所选择的组织区域的形态学和功能亚区的组合物和方法。优选的放射性标记的肿瘤－特异性试剂是用卤素放射性同位素标记的磷脂醚类似物。在某些优选的实施方案中，包含放射性标记的磷脂醚类似物的组合物除了功能性 鉴别 恶性组织以外，还具有 治疗 作用。，下面是使用放射性标记的磷脂醚类似物的虚拟结肠镜检查专利的具体信息内容。
1.一种用于在受试者消化道的选择区域区分良性结构和恶性组 织的方法，该方法包括以下步骤：
提供放射性标记的肿瘤特异性试剂；
将所述放射性标记的肿瘤特异性试剂施用给受试者；
使用第一种技术产生具有良性结构和恶性组织的选择区域的形态 学的显影；
使用第二种技术产生由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的 放射性分布的显影；并且
将选择区域的形态学的显影与由所述放射性标记的肿瘤特异性试 剂产生的放射性分布的显影比较，从而区分良性结构和恶性组织。
2.权利要求1的方法，该方法进一步包括切除恶性组织的步骤。
3.权利要求1的方法，其中所述放射性标记的肿瘤特异性试剂优 先在恶性组织中累积。
4.权利要求3的方法，其中所述放射性标记的肿瘤特异性试剂在 恶性组织中的累积与恶性组织大小的减少相关联。
5.权利要求1的方法，其中所述良性结构是腺瘤性息肉。
6.权利要求1的方法，其中所述恶性组织包括腺癌细胞。
7.权利要求1的方法，其中所述肿瘤特异性试剂用卤素同位素放 射性标记，所述卤素同位素选自18F、36Cl、75Br、76Br、77Br、82Br、 123I、124I、125I、131I、211At及其混合物。
8.权利要求1的方法，其中所述放射性标记的肿瘤特异性试剂是 正电子发射体。
9.权利要求1的方法，其中所述放射性标记的肿瘤特异性试剂是 用卤素放射性同位素标记的磷脂醚类似物。
10.权利要求7的方法，其中所述放射性标记的肿瘤特异性试剂 选自123I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、124I-18-(4-碘苯基)-十八烷 基磷酸胆碱、125I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、131I-18-(4-碘苯基)- 十八烷基磷酸胆碱及其混合物。
11.权利要求1的方法，其中所述放射性标记的肿瘤特异性试剂 具有治疗功能以及诊断功能。
12.权利要求1的方法，其中同样施用所述放射性标记的肿瘤特 异性试剂引起肿瘤的收缩以及肿瘤的鉴别。
13.权利要求1的方法，其中所述消化道的选择区域是结肠。
14.权利要求1的方法，其中所述第一种技术是计算机体层摄影 术、磁共振成像或摄影术。
15.权利要求1的方法，其中所述第一种技术是常规的结肠成像 术。
16.权利要求1的方法，其中所述第二种技术是正电子发射体层 摄影术、单光子发射体层摄影术或闪烁显像法。
17.权利要求1的方法，其中将选择区域形态学的显影与由所述 放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的放射性分布的显影比较的步骤包 括通过重构二维图像产生三维结构图像的步骤。
18.权利要求1的方法，其中所述比较步骤包括将由所述放射性 标记的肿瘤特异性试剂产生的放射性分布的显影叠加在选择区域形态 学的显影上。
19.一种用于在受试者消化道的选择区域区分良性结构和恶性组 织的方法，该方法包括以下步骤：
提供用卤素放射性同位素标记的肿瘤特异性磷脂醚类似物；
将用卤素放射性同位素标记的磷脂醚类似物施用给受试者；
使用计算机体层摄影术使具有良性结构和恶性组织的选择区域形 态显影；
使用正电子发射体层摄影术使由所述放射性标记的肿瘤特异性试 剂产生的放射性分布显影；并且
将选择区域的形态学与由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生 的放射性分布比较，从而区分良性结构和恶性组织。
20.权利要求19的方法，其中所述卤素同位素是正电子发射体。
21.权利要求19的方法，其中所述肿瘤特异性磷脂醚类似物包括 124I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱。
22.权利要求19的方法，其中所述肿瘤特异性磷脂醚类似物包括 124I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱与123I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷 酸胆碱的混合物、124I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱与125I-18-(4- 碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱的混合物或124I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷 酸胆碱与131I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱的混合物。
23.权利要求19的方法，其中所述放射性标记的肿瘤特异性磷脂 醚类似物具有治疗功能以及诊断功能。
24.权利要求19的方法，其中所述同样施用放射性标记的肿瘤特 异性磷脂醚类似物产生肿瘤的收缩以及肿瘤的鉴别。
25.权利要求19的方法，其中消化道的选择性区域是结肠。
26.一种用于监测受试者中的结肠直肠癌治疗的功效的方法，该 方法包括以下步骤：
通过提供放射性标记的肿瘤特异性试剂的步骤测定结肠直肠癌的 治疗前状态；
施用放射性标记的肿瘤特异性试剂给受试者；
使用第一种技术产生具有良性结构和恶性组织的选择区域的形态 学的显影；
使用第二种技术产生由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的 放射性分布的显影；
并将选择区域的形态学的显影与由所述放射性标记的肿瘤特异性 试剂产生的放射性分布的显影比较；
实施选择的治疗；
通过提供放射性标记的肿瘤特异性试剂的步骤评价治疗后状态；
施用放射性标记的肿瘤特异性试剂给受试者；
使用第一种技术产生具有良性结构和恶性组织的选择区域的形态 学的显影；
使用第二种技术产生由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的 放射性分布的显影；
并将选择区域的形态学的显影与由所述放射性标记的肿瘤特异性 试剂产生的放射性分布的显影比较；并且
将治疗前的状态与治疗后的状态进行比较，来监测所述治疗的功 效。
27.一种基于磷脂代谢的相对水平，来区分组织的选择区域的形 态学和功能亚区的方法，该方法包括以下步骤：
提供磷脂酶底物，它是经放射性卤素标记的磷脂醚类似物；
选择怀疑具有多种形态学不同的组织亚区的组织的区域，所述组 织亚区进一步通过不同水平的磷脂代谢来区分；
将所述组织区域与经放射性卤素标记的磷脂醚类似物接触，其中 所述放射性卤素标记的磷脂醚类似物被摄取并选择性地保留于具有相 对较低水平的磷脂代谢的组织亚区中；
使用第一种技术产生选择区域的形态的表现；
使用第二种技术产生由选择性保留的放射性卤素标记的磷脂醚类 似物产生的放射性分布的表现；并且
将选择区域的形态学的表现与由选择性保留的放射性卤素标记的 磷脂醚类似物产生的放射性分布的表现进行比较，从而基于磷脂代谢 的相对水平来区分组织的选择区域的形态学和功能亚区。
28.权利要求27的方法，其中所述磷脂醚类似物用卤素同位素放 射性标记，所述卤素同位素选自18F、36Cl、75Br、76Br、77Br、82Br、 123I、124I、125I、131I、211At及其混合物。
29.权利要求27的方法，其中所述放射性标记的肿瘤特异性试剂 选自123I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、124I-18-(4-碘苯基)-十八烷 基磷酸胆碱、125I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、131I-18-(4-碘苯基)- 十八烷基磷酸胆碱及其混合物。
30.权利要求27的方法，其中所述第一种技术是计算机体层摄影 术、磁共振成像、内镜检查或摄影术。
31.权利要求27的方法，其中所述第二种技术是正电子发射体层 摄影术、单光子发射体层摄影术或闪烁显像法。
32.权利要求27的方法，其中所述接触步骤在体外进行。
33.权利要求27的方法，其中所述接触步骤在体内进行。
34.一种被配制用于肠胃外施用的组合物，该组合物含有诊断有 效量的放射性标记的磷脂醚类似物和药学上可接受的载体。
35.权利要求34的组合物，其中所述放射性标记的磷脂醚类似物 选自123I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、124I-18-(4-碘苯基)-十八烷 基磷酸胆碱、125I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、131I-18-(4-碘苯基)- 十八烷基磷酸胆碱及其混合物。
36.权利要求34的组合物，其中所述磷脂醚类似物用卤素同位素 放射性标记，所述卤素同位素选自18F、36Cl、75Br、76Br、77Br、82Br、 123I、124I、125I、131I、211At及其混合物。
37.一种被配制用于肠胃外施用的组合物，该组合物含有治疗有 效量的放射性标记的磷脂醚类似物和药学上可接受的载体。
38.权利要求37的组合物，其中所述放射性标记的磷脂醚类似物 选自123I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、124I-18-(4-碘苯基)-十八烷 基磷酸胆碱、125I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、131I-18-(4-碘苯基)- 十八烷基磷酸胆碱及其混合物。
39.权利要求37的组合物，其中所述磷脂醚类似物用卤素同位素 放射标记，所述卤素同位素选自18F、36Cl、75Br、76Br、77Br、82Br、 123I、124I、125I、131I、211At及其混合物。
40.磷脂醚类似物在生产用于鉴别受试者的消化道内的恶性组织 的放射性药物制剂中的用途。
41.磷脂醚类似物在生产用于检测或治疗结肠直肠癌的放射性药 物制剂中的用途。
42.磷脂醚类似物在生产用于双模态虚拟结肠镜检查的放射性药 物制剂中的用途。
发明领域
本发明总地来说涉及肿瘤的成像并具体而言涉及肿瘤的诊断性成 像和表征，所述成像和表征是使用虚拟结肠镜检查结合使用放射性标 记的肿瘤特异性试剂，例如用放射性卤素标记的磷脂醚类似物进行的。
发明背景
早期检测癌已经成为现代成像技术的主要目的之一，因为对处于 局部化阶段的可疑肿瘤的鉴别明显提高了成功治疗和消除癌性组织的 机会。因而已经设计了大量成像策略，使用多种技术和模态(modality) 来帮助医生尽可能早的作出准确诊断。
在美国每年诊断出大约130,000个新的结肠直肠癌病例。因而结 肠直肠癌是第四最常见的癌，每年引起60,000人死亡(Cancer Facts and Figures.American Cancer Society 2001)。治疗主要取决于癌的 阶段，但可以包括手术、放射、化疗和/或射频或冷冻消融术。然而， 对结肠直肠癌患者的常规随访中，对癌胚抗原(CEA)(一种直肠结 肠肿瘤标记物)的测定和重复结肠检查(O′Dwyer PJ等，Follow-up of stage B and C colorectal cancer in the United States and France. Seminars in Oncology 2001；28：Suppl-9)在超过50％的患者中不能检 测出复发的疾病。参见Wichmann MW等，The Colorectal Cancer Study Group；Carcinoembryonic antigen for the detection of recurrent disease following curative resection of colorectal cancer. Anticancer Research 2000；20：4953-4955。因而，需要发展其它的方法 用于检测复发的疾病。
虚拟结肠镜检查是一种在人中通过计算机体层扫描进行的非侵入 扫描操作，已据报道比传统的结肠镜检查更精确。(Pickhardt PJ.等， Computed tomographic virtual colonoscopy to screen for colorectal neoplasia in asymptomatic adults.New England Journal of Medicine. 349(23)：2191-200，2003 Dec 4)。在传统的多检测器螺旋CT扫描器进 行的，虚拟结肠检查使得能非侵入地自动扫描肠腔的肿瘤，但是不能 将占位性病变表征为息肉(腺瘤)或腺癌(恶性)。肿瘤类型的测定 显著地影响这些患者的治疗计划和治疗结果。
而且，在使用RF切除和CT扫描的治疗和诊断过程中很难从CT 扫描获得功能性信息。使用对比增强的螺旋式CT，可在一定程度上 评估肿瘤血管分布，但是不能精确测定活的肿瘤细胞是否仍保留在 RF-切除的病变内。而且，RF产生的热损伤在该操作后直到6个月进 行后操作CT扫描时，通常有一圈炎症围绕它们周围。PET扫描已经 用于跟踪切除后患者，但是这一圈围绕RF热损伤的炎症通常展示出 增加的摄取，甚至是在没有活的肿瘤时。这降低了早期检测复发肿瘤 的灵敏性和特异性。因而对恶性肿瘤细胞有选择性并被其无限保留的 试剂是优选的，这不像氟脱氧葡萄糖(FDG)，所述FDG对肿瘤细 胞是非选择性的并定位于感染性位点和增生(例如巴雷特食管)。此 外含有124I的化合物，其具有4天的物理半衰期并因而可运送到全世 界任何地方，相对FDG是优选的，所述FDG具有110分钟的半衰期 并因而可能仅具有有限的分布，限于生产地点的200英里内。
经历延长的保留时间的化合物(并且不被代谢)的化合物是优选 的，因为当与合适的放射性同位素如125I、131I或211At配合时更可能 它们具有显著的治疗潜力。同样，可用多种碘同位素标记并具有扩展 的多功能性(诊断和治疗以及用于实验动物研究的工具)的化合物是 优于FDG的，所述FDG局限于用18F标记用于PET扫描或潜在地可 用19F(稳定的)标记而用于磁共振成像，尽管是灵敏度水平非常地低。 已公开可用于PET的其它化合物包括124I-或131I-标记的2’-氟-2’-脱氧 -1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-5-碘尿嘧啶(FIAU)、18F-标记的9-[4-氟-3-(羟 甲基)丁基]鸟嘌呤(FHBG)和18F-标记的-9-[3-氟-1-羟基-2-丙氧基甲 基]鸟嘌呤(FHPG)。不考虑它们的肿瘤靶向能力，由于其在肿瘤细胞 中的快速代谢，18F-FDG不具有治疗潜能。因而，需要其它化合物来 研究治疗后的局部复发。
而且，即使当化学疗法是治疗模式时，对化学治疗的反应的改进 的监测是必须的。因此，期望开发用来研究对化学治疗的反应的早期 预后指标，使得医生快速地终止使用无效的化学治疗方案而避免让患 者曝露于延长的治疗的毒性。如果外部光束放射疗法是用于患者的备 选治疗时，其中所述患者具有相似组织学的肿瘤，所述肿瘤可能对用 于治愈目的的外部放射疗法(XRT)产生截然不同的反应。一些用术 前放射进行治疗的患有直肠癌的患者将具有完全的反应，而具有相似 组织学(在光学显微镜水平下)的其它患者将对治疗具有较差的反应 并会复发。对放射的反应是最终控制肿瘤和许多癌(包括许多胃肠癌、 肺癌、脑和颈癌以及妇科癌)存活的预示因素。大多数的反应表征方 法，尽管能十分好的预测反应，但是在治疗完成后进行。尽管一些治 疗期间的临床评估可用于调整治疗(Mayr，N.A.等，Method and timing of tumor volume measurement for outcome prediction in cervical cancer using magnetic resonance imaging.International Journal of Radiation Oncology，Biology，Physics 2002；52；1：14-22)， 在大多情况下没有在实际的治疗过程中预测肿瘤反应的准确方法。这 样的检验方法，特别是可应用于广泛的肿瘤位点或组织学的方法，将 是十分有用的和令人期待的。其它的治疗和诊断方法包括已经提出来 用于预测对治疗的反应的分子测定法，并且最近的成果包括使用DNA 微阵列来鉴定与对治疗有反应或缺少反应相关的基因改变。这些还处 于研究中并且没有处于常规的临床应用中。
还有的其它诊断和治疗方法包括使用成像模态来预测在XRT治 疗过程中的反应。治疗期间的使用FDG的PET扫描正在积极研究中， 其中将放射治疗中途原发性肿瘤的同位素摄取与治疗前的摄取比较。 数个回溯性研究表明，在治疗期间具有持续强摄取的患者比在治疗期 间其肿瘤较不亲和FDG的患者具有更差的肿瘤控制效果(Greven，K. 等，Can positron emission tomography distinguish tumor recurrence from irradiation sequelae in patients treated for larynx cancer？ Cancer Journal Scientifica American 1997；3：353-357)。然而，用于 不同癌的更有效的筛选、诊断和治疗剂以及方法是特别期望的。
令人遗憾的是，常规的成像技术例如计算机体层摄影术(CT)和 MRI(磁共振成像)局限于它们提供对可疑病变的确定诊断的能力， 因为它们仅能观测组织的密度或形态学中的不同。常常还必需更具有 侵入性和费钱的活检步骤来提供确定的诊断。相比较而言，核医学技 术例如正电子发射体层摄影术(PET)和单光子发射体层摄影术 (SPECT)可提供有关特定器官或目标区域的功能或生化信息。然而， 这些核成像技术的成功在很大程度上取决于合适的放射性药物的选择 性摄取和检测。选择性摄取又取决于具有高度靶标组织特异性的放射 性药物的开发。令人遗憾的是，迄今开发的用于肿瘤学应用的定位肿 瘤的试剂仅具有有限的应用。
例如，这些现有技术化合物之一，即67Ga枸橼酸镓，最初确定了 其在肿瘤组织中累积的能力。令人遗憾的是，67Ga枸橼酸镓也可被多 种其它非-肿瘤病变(包括炎性病变)吸收，并且也可以在肝脏和脾脏 中累积不可接受量的放射性。放射性药物在这些器官中的快速积累可 严重干扰附近病变的成像并且也减少了可安全给予患者的剂量。
一种备选的方法已经用来开发针对肿瘤特异性抗原的放射性标记 的单克隆抗体(Mab)。然而，这些单克隆抗体仅对产生它们的特定 的肿瘤组织是特异性的，并因而不会普遍定位于瘤组织中。而且，将 Mab用于诊断性成像已经导致了其它问题，包括抗原表达的可变程 度、低的肿瘤摄取、非特异性结合和不利的免疫原性反应以及通常高 的肝脏定位。
为了解决这些问题，本发明人最近已经鉴定并开发了一系列新的 化合物，所述化合物证实了有用的肿瘤选择性。见例如美国专利Nos. 4,925,649；4,965,391；5,087,721；5,347,030；6,255,519和6,417,384； 在此将它们全部并入本文作为参考。据信，这些放射性碘化的磷脂醚 类似物利用了恶性肿瘤细胞独特的生化特性，即其相对于相应的正常 组织不能代谢磷脂醚类似物的能力。尽管确切的作用机制没有完全弄 清楚，主要的假说认为所述磷脂醚类似物由于恶性肿瘤细胞膜明显缺 少合适的代谢酶而被截留在其中。因此，这些化合物定位于肿瘤细胞 中并在生化上适当地被锁定，用于诊断性和/或治疗性应用。当前可利 用的肿瘤学PET剂(例如18F-FDG)定位于良性病变和炎性位点以及 肿瘤中，因而不是好的恶性肿瘤的指示剂。
因此，在本领域中存在对放射性药物的巨大需要，所述放射性药 物表现出从非靶标性组织的快速清除率以及在血浆中的长的半衰期， 同时仍然保持了它对瘤组织的特异性和亲和力。这种试剂应该不仅有 助于原发性肿瘤和转移肿瘤的非侵入性的成像和表征，不管它们在体 内的定位，而且也应该作为细胞毒性剂的载体用于位点特异性地根除 恶性肿瘤组织，特别当其涉及最频繁诊断的癌形式时。另外也期望放 射性药物对恶性肿瘤而不是对癌前组织(包括腺瘤和增生)是特异性 的。
因此，很容易利用的、可在具有结肠直肠癌的患者中精确鉴定和 潜在治疗早期转移性疾病的放射性药物在分类和对治疗反应方面将对 患者护理具有重要影响。仍然存在对精确的基于肿瘤特异性功能的功 能成像技术的需要，所述功能成像技术可以使用相对便宜和普遍可利 用的成像设备非侵入地筛查整个身体。
发明概述
在优选的实施方案中，本发明提供了使用混合CT/PET扫描的给 出解剖学和功能信息的用于双模态虚拟结肠镜检查的组合物和方法。 在优选的实施方案中，本发明提供了包括放射性标记的肿瘤特异性试 剂的组合物和用于区分良性息肉和恶性肿瘤的方法。优选的放射性标 记的肿瘤-特异性试剂是用卤素放射性同位素标记的磷脂醚类似物。对 于用于使用混合的CT/PET扫描的双模态虚拟结肠镜检查，所述放射 性同位素应该是正电子发射体。特别优选的放射性标记的肿瘤特异性 试剂是124I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱(124I-NM-404)。
在某些实施方案中，本发明提供了用于在受试者消化道的选择区 域区分良性结构和恶性组织的方法，该方法包括以下步骤：提供放射 性标记的肿瘤特异性试剂；将所述放射性标记的肿瘤特异性试剂施用 给受试者；使用第一种技术使具有良性结构和恶性组织的选择区域的 形态学显影；使用第二种技术使由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂 产生的放射性在选择区域内的分布显影；并将选择区域的形态学与在 选择区域内由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的放射性的分布 比较，从而区分良性结构和恶性组织。
第一种技术可以是计算机体层摄影术、磁共振成像、内镜检查或 摄影术。第二种技术可以是正电子发射体层摄影术(PET)、单光子 发射体层摄影术或闪烁显像法。
通常，将选择区域的形态学的显影与由所述放射性标记的肿瘤特 异性试剂产生的放射性分布的显影比较的步骤包括通过重构二维图像 产生三维结构图像的步骤。在优选的实施方案中，比较步骤包括将由 所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的放射性的分布的显影重叠在 选择区域的形态学的显影上。
在特别优选的实施方案中，所述放射性标记的肿瘤特异性试剂具 有治疗功能以及诊断功能。优选地，同样施用所述放射性标记的肿瘤 特异性试剂引起了肿瘤的退化和收缩以及肿瘤的鉴别。在某些实施方 案中，同样施用所述放射性标记的肿瘤特异性试剂最初提供了对可疑 肿块的准确检测、定位和表征，并且当与用治疗性同位素放射性标记 的相同的或不同的肿瘤特异性试剂联合施用时，也可以提供治疗恶性 肿瘤的能力。在其它的实施方案中，本发明提供了用于监测治疗进展 的试剂和方法，其中试剂被肿瘤亲和地摄取。
在优选的实施方案中，所述放射性标记的肿瘤特异性试剂是用卤 素放射性同位素标记的磷脂醚类似物。在优选的实施方案中，所述磷 脂醚类似物共价地连接至放射性卤素上。所述放射性卤素取代基合适 地是18F、36Cl、75Br、76Br、77Br、82Br、123I、124I、125I、131I和211At， 其中18F、76Br、123I、124I优选用于诊断目的而77Br、125I、131I和211At 优选用于治疗目的。用于诊断目的的优选的放射性卤素取代基是124I。 在一些优选的实施方案中，可将共价连接至选自18F、76Br、123I和124I 的放射性卤素上的磷脂醚类似物的混合物与共价连接至选自77Br、 125I、131I和211At的放射性卤素上的磷脂醚类似物混合施用。在某些优 选的实施方案中，共价连接至124I上的磷脂醚类似物的混合物可以与 共价连接至适于治疗目的的放射性卤素的磷脂醚类似物混合施用。合 适的放射性标记的磷脂醚类似物可选自123I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷 酸胆碱、124I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、125I-18-(4-碘苯基)-十 八烷基磷酸胆碱、131I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱及其混合物。 合适的混合物包括124I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱和123I-18-(4- 碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱的混合物、124I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷 酸胆碱和125I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱的混合物或124I-18-(4- 碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱和131I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱的 混合物。
在进一步的优选实施方案中，本发明提供用于在受试者消化道的 选择区域中区分良性结构和恶性组织的方法，该方法包括以下步骤： 提供用卤素放射性同位素标记的肿瘤特异性磷脂醚类似物；将所述用 卤素放射性同位素标记的磷脂醚类似物施用给受试者；用计算机体层 摄影术显影具有良性结构和恶性组织的选择区域的形态学；用正电子 发射体层摄影术显影由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的放射 性的分布；并且将选择区域的形态学与由所述放射性标记的肿瘤特异 性试剂产生的放射性的分布比较，从而区分良性结构和恶性组织。
在另外的实施方案中，本发明提供用于监测治疗受试者中结肠直 肠癌的功效的方法，该方法包括以下步骤：测定结肠直肠癌的治疗前 状况(测定步骤包括：提供放射性标记的肿瘤特异性试剂；将所述放 射性标记的肿瘤特异性试剂施用给受试者；用第一种技术产生具有良 性结构和恶性组织的选择区域的形态学显影；用第二种技术产生由所 述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的放射性的分布的显影；并将选 择区域的形态学显影与由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的放 射性的分布的显影比较)、施用选择的治疗、评估治疗后的状况(该 评估步骤包括：提供放射性标记的肿瘤特异性试剂；将所述放射性标 记的肿瘤特异性试剂施用给受试者；用第一种技术产生具有良性结构 和恶性组织的选择区域的形态学显影；用第二种技术产生由所述放射 性标记的肿瘤特异性试剂产生的放射性的分布的显影；并将选择区域 的形态学显影与由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的放射性的 分布的显影比较)和将治疗前的状况与治疗后的状况比较来监测治疗 的功效。
在另外的实施方案中，本发明提供基于磷脂代谢的相对水平区分 选取的组织区域的形态学和功能性亚区域的方法，该方法包括以下步 骤：提供磷脂酶底物，所述底物为放射性卤素标记的磷脂醚类似物； 选择怀疑具有多种形态学上不同的组织亚区域的组织区域，所述组织 亚区域进一步通过磷脂代谢的不同水平区分；将所述组织区域与放射 性卤素-标记的磷脂醚类似接触，其中所述放射性卤素标记的磷脂醚类 似物被吸收并选择性地保留在具有相对较低的磷脂代谢水平的组织的 亚区域中；用第一种技术产生所述选择区域的形态学的表现；用第二 种技术产生由选择性保留的放射性卤素标记的磷脂醚类似物产生的放 射性的分布的表现；并将所述选择区域的形态学表现与放射性的分布 的表现比较，所述放射性由选择性保留的放射性卤素标记的磷脂醚类 似物产生，从而基于磷脂代谢的相对水平区分选择的组织区域的形态 学和功能性亚区域。
在另外的实施方案中，本发明提供了含有诊断有效量的放射性标 记的磷脂醚类似物和药学上可接受的载体的组合物，该组合物被配制 成用于肠胃外施用。磷脂醚类似可以适当地用卤素同位素标记，所述 卤素同位素选自18F、36Cl、75Br、76Br、77Br、82Br、123I、124I、125I、 131I、211At及其混合物，在优选的实施方案中，放射性标记磷脂醚类 似物选自123I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、124I-18-(4-碘苯基)-十 八烷基磷酸胆碱、125I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、131I-18-(4-碘 苯基)-十八烷基磷酸胆碱及其混合物。
在另外的实施方案中，本发明提供了含有治疗有效量的放射性标 记的磷脂醚类似物和药学上可接受的载体的组合物，该组合物被配制 成用于肠胃外施用。所述磷脂醚类似物可适当地用卤素同位素标记， 所述卤素同位素选自18F、36Cl、75Br、76Br、77Br、82Br、123I、124I、 125I、131I、211At及其混合物。在优选的实施方案中，放射性标记的磷 脂醚类似选自123I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、124I-18-(4-碘苯 基)-十八烷基磷酸胆碱、125I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、 131I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱及其混合物。
在另外的实施方案中，本发明提供磷脂醚类似物在生产用于鉴别 受试者的消化道中恶性组织的放射性药物制剂中的用途。在优选的实 施方案中，本发明提供了磷脂醚类似物在生产用于检测或治疗结肠直 肠癌的放射性药物制剂中的用途。在进一步的实施方案中，本发明提 供了磷脂醚类似物在生产用于双模态虚拟结肠镜检查的放射性药物制 剂中的用途。
附图简要说明
图1A和1B是良性和恶性细胞的不同的磷脂代谢的示意图，假设 对磷脂醚类似物(PLE)的摄取和肿瘤特异性保留有不同的效果。
图2提供了患者03的前胸的闪烁法图像，所述图像是在W施用 1mCi131I-MM324后1、2和6天获得的。在左边小舌肺癌(T)可见 摄取，随时间增加肿瘤与背景的比率。
图3A和图3B提供了三种碘化的磷脂醚类似物的化学结构，所述 磷脂醚类似物称为NM324(图3A)、NM404(图3A和图3B)和NM412 (图3A)。
图4A和图4B说明了在IV施用放射性标记的磷脂醚类似物后， SCID小鼠肿瘤模型中磷脂醚类似物NM404(图4A)和NM324(图4B) 的分布的闪烁显像比较的结果。在其中注意到，大多数的NM324(图 4B)放射性在肠55中发现，并不是在肿瘤50(移植入大腿内)中发 现，而NM404(图4A)正确地识别了在左腿和右腿中的肿瘤50。随 着时间过去，与组织的其它部分比较放射性标记的磷脂醚类似物 NM404变得更有选择性地定位于肿瘤50中，这种现象对于放射性标 记的磷脂醚类似物NM324没有观察到。
图4C显示了IV施用放射性标记的磷脂醚类似物NM404后的闪 烁法图像，该图像显示了所述磷脂醚类似物定位于Copenhagen大鼠 中的Dunning R3327转移的前列腺肿瘤(“tumor”)中，所述大鼠通 过手术去除了原发性肿瘤位点(腿)。在处死后证实有两个淋巴结肿 瘤。
图5是在已经接受了皮下注射CT-26细胞的小鼠中肿瘤生长的图 示。
图6A是离体的CT-26肿瘤50和离体的左和右淋巴结的摄影图 像。图6B是图6A中的离体的肿瘤和淋巴结的闪烁法图像，该图像显 示了定位于肿瘤的显著的放射性60而极少或没有定位于淋巴结的放 射性。图6C是将图6A的数字化闪烁法图像和图6B的数字化闪烁法 图像合并产生的图像，显示了放射性和肿瘤的相关性。
图7A-图7D显示了图6的活小鼠的微型(microCT)图像，该图像 显示了CT-26肿瘤(箭头)的大小和位置。3D-表面表现的像和平面 切片图像显示于图7A和图7B中，而冠状和纵向层面(90μm厚)分 别显示于图7C和图7D中。
图8显示了正常(图8A)和RF-切除的(图8B)CT-26肿瘤的 组织学切片(H&E)的摄影图像。在切除的切片中的细胞已经丧失了膜 的完整性并出现为固缩。
图9显示了注射125I-NM404后10天患有TGF-α肝癌的小鼠的冠 状微型CT扫描的图像(图9A)和背侧的闪烁法图像(图9B)。用 ITG(一种肝细胞选择性CT造影剂)增强了微型CT图像上的肝脏。
图10显示了注射NM404后7天患有CT-26肿瘤的小鼠离体肝脏 的摄影图像(图10A)和闪烁法图像(图10B)。肝脏肿瘤牵涉广泛。 在这次扫描前15天肿瘤移植物出现。也显示了离体切开的肿瘤(T) 和正常的未受累及的肝脏(L)的闪烁法图像(图10C)和摄影图片 (图10D)。
图11A-C表现了与图10A-D中所示的相同的小鼠的微型CT图 像，显示了多个CT26肿瘤的存在。用ITG(一种肝细胞选择性显影 剂)增强肝脏。这些图像在肿瘤细胞植入后10天和在图10B和图10C 的闪烁法图像前5天获得。肿瘤通过箭头标示并且“GB”表示胆囊。
图12B-12D表现了IV施用125I-NM404(15μCi)后在不同时间 获得的患有自发性右腋乳房腺癌(10mm直径)的Min小鼠的闪烁法 图像。图12A是冠状微型CT图像(未进行对照增强)，其用来做解 剖学对照(T＝肿瘤)。
图13A和图13E分别是来自施用NM404后8天的FVBxBoMin 小鼠的离体乳腺和结肠的闪烁法图像。相同的离体乳腺组织和结肠组 织的相应摄影图像分别为图13B和图13D。卡红染色的组织的放大摄 影图像(图13C)显示了增生(箭头)的存在，但是在闪烁法图像(图 13A)中没有发现相应的病灶放射性。在所述闪烁图像(图13A)上 的明亮区80对应图13B中更大的腺癌82。离体结肠的摄影图像(图 13D)和闪烁法图像(图13E)的比较说明在腺瘤性息肉中没有摄取 NM404(参见84和86)。
图14A-C显示了图13A-E中显示的Min小鼠的微型CT扫描图 像。图14A是低密度的表面透视图，显示了大的左轴乳腺肿瘤。图14B 是在施用血池CT显影剂BP1O来帮助定位肿瘤饲养血管后的高密度 的表面透视图。图14C是复合的冠状CT图像和高密度表面透视图， 显示了绝对的饲养血管的定位。在图14C中取向为从底下看，而图14A 和图14B是从上面看。
图15是磷脂醚的酶促代谢途径的示意图。
图16是在不同品系Min/+小鼠中ENU-处理后产生第一个肿瘤的 时间的图示。产生第一个乳房肿瘤的时间表示为ENU后的天数。用 ENU处理雌性Min/+小鼠并每周两次检查乳房肿瘤的存在。对于 B6Min/+(n＝45)(D)、BRB6 Min/+(n＝18)(Δ)、FVBB6 Min/+(n＝18)(0) 的ENU处理后至第一个肿瘤出现的时间以5天间隔进行绘图。
图17A-C显示了FVBxBo Min小鼠的微型CT图像，该图像显示 了大的腋乳腺肿瘤。冠状和轴向切片显示于图17A中，而3D-表面和 冠状切片同时以后(图17B)视图和前(图17C)视图展示。
图18是在注射125I-NM404后0、4、9和41天以时间顺序显示 SCC1和SCC6肿瘤80的一组小鼠背面照片，说明了肿瘤80大小的 减小。
图19A和图19B是离体小鼠结肠的微型CT表面表现扫描的图像， 图19A从远方显示了突进结肠腔中的肿瘤100，图19B从更近的有利 点显示了所述肿瘤100。
图20A和图20B是麻醉小鼠的对比增强的下胃肠道的高密度表面 表现的微型CT图像，平面冠状切片图像110包括界标在下肠的结肠 112和盲肠114的位置。由于下肠腔中高的钡浓度，充满钡的下肠的 密度实际上超过了相邻的骨116的密度；在高密度设置下大多数软组 织从视图中排除了。
图21A和图21B是麻醉小鼠的对比增强的下胃肠道的表面表现的 (图21A)和透明表现(图21B)的微型CT图像，显示了下肠的结 肠112和盲肠114。图21B也显示了肿瘤117和良性结构(粪粒119) 之间的差别。
图22是离体并切开的小鼠结肠120的图像，所述结肠具有直径 3.5mm的肿瘤122。
图23A-B是离体的肠的空肠/回肠切片的照片(图23A)和相应的 闪烁法(图23B)图像。施用125I-NM404后3天使患有肠腺癌的Min 小鼠成像。肿瘤130(箭头)测量为9x18mm。
图24A-E是离体的Min小鼠十二指肠(图24A，顶部为胃结合)、 空肠(图24B)、空肠/回肠(图24C)、回肠(图24D)和结肠(图 24E)的闪烁法图像，放射性标记的NM404的强的肿瘤摄取。为相同 数量的计数将所有图像标准化。图24C为10cm长。
图25A显示了3D表面透视MRI图像400和3D微型PET图像 420的重叠，所述图像是iv注射124I-NM404(100μCi)进入患有CNS-I 神经胶质瘤脑肿瘤的大鼠后24小时获得的。用Amira(v3.1)软件(TGS， Inc.，San Diego，CA)合并图像。图25B是通过肿瘤420的对照增强的 冠状MRI切片410，图25C显示了重叠的冠状MRI和124I-NM404 微型PET图像，该图证实了肿瘤的存在和定位。
优选实施方案的描述
在描述本发明方法之前，应理解本发明不限于描述的特定方法学、 方案、细胞系和试剂，因为这些可以变化。还应该理解，这里使用的 术语目的在于仅描述特定的实施方案，并且不意于限制本发明的范围， 本发明的范围仅由附带的权利要求限制。
必须指出，如这里和在附带权利要求中使用的，单数形式“a”、“an” 和“the”包括复数指代，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，涉 及“细胞”时包括多个这种细胞及其本领域技术人员已知的等价物，等 等。而且，术语“a”(或“an”)、“一个或多个”以及“至少一个”在这里 可以交换使用。还应该注意术语“包含”、“包括”和“具有”可交换使用。
除非另外定义，这里使用的所有技术和科学术语具有的含义与本 发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同。尽管任何与在这里描 述的那些方法和材料类似或等价的方法和材料可用于本发明的实践或 实验，但现在只描述优选的方法和材料。在这里提及的所有出版物并 入本文作为参考，以便描述并公开可结合本发明使用的在所述出版物 中报导的化学试剂、细胞系、载体、动物、仪器、统计分析和方法学。 不应该将本文中的任何内容解释为承认由于先前的发明而本发明没有 权利将这些公开内容提前。
如在这里定义的，术语“异构体”包括但不限于光学异构体及类似 物、结构异构体及类似物、构象异构体及类似物等。在一个实施方案 中，本发明包括使用本发明的肿瘤特异性磷脂醚类似物的不同光学异 构体。本领域那些技术人员将理解，可用于本发明的肿瘤特异性磷脂 醚类似物可含有至少一个手性中心。因此，用于本发明方法的化合物 可能以光学活性形式或外消旋形式存在并分离。一些化合物还可能表 现多晶型现象。
应理解本发明可以包括使用任何外消旋的、光学活性的、多晶型 的或立体异构的形式或其混合物，所述形式具有可用于治疗在此描述 和要求保护的肿瘤相关的疾病的特性。在一个实施方案中，肿瘤特异 性磷脂醚类似物可以包括纯的(R)-异构体。在另一实施方案中，肿 瘤特异性磷脂醚类似物可以包括纯的(S)-异构体。在另一实施方案 中，化合物可以包括(R)和(S)异构体的混合物。在另一实施方案中， 化合物可以包括含有(R)和(S)异构体的外消旋混合物。如何制备光学 活性形式(例如，通过用再结晶技术拆分外消旋形式、通过从光学活 性原料合成、通过手性合成或通过用手性固定相进行色谱法分离)是 本领域熟知的。
“药学上可接受的”意思是指其可用于制备药物组合物，所述药物 组合物一般来说是安全的、无毒性的，并且不会在生物学上和其它方 面上不理想并且包括其可接受用于兽医以及人的药学用途。术语“药学 上可接受的盐”或“前药”包括化合物的盐和前药，所述化合物的盐和前 药，在合理的医学判断的范围内，适合用于受试者而没有过度毒性、 刺激性、变应性反应等等，具有合理的利益/风险比，并且对预期用途 是有效的，以及包括所述化合物的两性离子形式(如果有可能的话)。
本发明化合物的合适的药学上可接受的盐包括酸加成盐，所述酸 加成盐可以例如通过将根据本发明的化合物溶液与药学上可接受的酸 (例如，盐酸、硫酸、甲磺酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯 甲酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸)的溶液混合形成。而且， 当本发明化合物带有酸性部分时，其合适的药学上可接受的盐可以包 括碱金属盐(例如钠盐或钾盐；碱土金属盐如钙或镁盐)以及与合适 的有机配体形成的盐(如季铵盐)。
术语“盐”指化合物的无机和有机盐。这些盐可在化合物的最终分 离和纯化过程中原位制备，或者通过分别将纯化的化合物与合适的有 机或无机酸或碱反应，如果合适，并分离因而形成的盐得以制备。典 型的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、醋酸盐、 草酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸 盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、乙磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸 盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(naphthylate)、甲 磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐和月桂基磺酸盐等。这些盐可包括 基于碱金属和碱土金属的阳离子(例如钠、锂、钾、钙、镁等)以及 非毒性铵、季铵和胺阳离子(包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲 胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等)。还包括具有氨基基团的N- 氧化物的化合物，例如通过与过氧化氢反应产生的化合物。
“前药”表示药理学非活性形式的化合物，所述形式的化合物在施 用后必须通过受试者在体内代谢为药理学活性形式的化合物以便产生 期望的药理学效果。在施用给受试者后，药理学非活性形式的化合物 在生物流体或酶的影响下在体内转化成药理学活性形式的化合物。尽 管对于多数化合物新陈代谢主要在肝脏发生，但是几乎所有的其它组 织和器官，特别是肺，能够进行不同程度的新陈代谢。例如，前药的 新陈代谢可以通过在血液中水解而发生。前药形式的化合物可用于例 如提高生物利用度、掩盖令人不愉快的特性(例如苦味)、改变溶解 度以便静脉内施用或者提供化合物的位点特异性递送。这里提及化合 物包括前药形式的化合物。
对前药用途的讨论由T.Higuchi和W.Stella，“Pro-drugs as Novel Delivery Systems，”Vol.14 of the A.C.S.Symposium Series，和在 Bioreversible Carriers in Drug Design，ed.Edward B.Roche， American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，1987提 供。例如，如果化合物包含羧酸官能团，则前药可包括酯，所述酯通 过用基团如(C1-C8)烷基、(C2-C12)烷酰氧甲基、有4-9个碳原子 的1-(烷酰氧基)乙基、有5-10个碳原子的1-甲基-1-(烷酰氧基)- 乙基、有3-6个碳原子的烷氧基羰氧基甲基、有4-7个碳原子的1-(烷 氧基羰氧基)乙基、有5-8个碳原子的1-甲基-1-(烷氧基羰氧基)乙 基、有3-9个碳原子的N-(烷氧基羰基)氨甲基、有4-10个碳原子的 1-(N-(烷氧基羰基)氨基)乙基、3-酞基，4-巴豆内酯基 (4-crotonolactonyl)、γ-丁内酯-4-基、二-N，N-(C1-C2)烷基氨基 (C2-C3)烷基(如β-二甲基氨乙基)、氨甲酰基-(C1-C2)烷基、N， N-二(C1-C2)烷基氨甲酰基-(C1-C2)烷基和哌啶基-、吡咯烷基-或 吗啉代(C2-C3)烷基置换酸基团的氢原子形成。
类似地，如果化合物包含醇官能团，则前药可通过用下列基团取 代醇基团的氢原子形成，所述基团如(C1-C6)烷酰氧基甲基、1-(C1-C6) 烷酰氧基)乙基、1-甲基-1-(C1-C6)烷酰氧基)乙基、(C1-C6)烷 氧基羰氧基甲基、N-(C1-C6)烷氧基羰基氨甲基、琥珀酰基、(C1-C6) 烷酰基、α-氨基(C1-C4)烷酰基、芳酰基和α-氨酰基或α-氨酰基-α- 氨酰基，其中每个α-氨酰基独立地选自天然存在的L-氨基酸、P(O) (OH)2、P(O)(O(C1-C6)烷基)2或糖基(该基团通过去除半 缩醛形式的碳水化合物的羟基产生)。
如果化合物包含胺官能团，则前药可通过用基团例如R-羰基、RO- 羰基、NRR′-羰基置换胺基中的氢原子形成，其中R和R′每个独立地 是(C1-C10)烷基、(C3-C7)环烷基、苄基或者R-羰基是天然α-氨 酰基或天然的α-氨酰基-、-C(OH)C(O)OY(其中Y是H、(C1-C6) 烷基或苄基)、-C(OY0)Y1(其中Y0是(C1-C4)烷基而Y1是(C1-C6) 烷基、羧基(C1-C6)烷基、氨基(C1-C4)烷基或单-N-或双-N，N- (C1-C6)烷基氨烷基、-C(Y2)Y3(其中Y2是H或甲基并且Y3是 单-N-或双-N，N-(C1-C6)烷基氨基、吗啉代、哌啶-1-基或吡咯烷-1- 基。
如果根据本发明的化合物具有至少一个不对称中心，它们因而可 以作为对映体存在。当根据本发明的化合物具有两个或更多个不对称 中心时，它们又可作为非对映异构体存在。应理解所有的这些异构体 及其任何比例的混合物都包含在本发明的范围内。
本发明还包括在这里描述的化合物的氨基取代基的N-氧化物。药 学上可接受的盐还可以通过用无机碱(例如氢氧化钠)处理而从酚类 化合物制备。而且，所述酚类化合物的酯可用脂族和芳族羧酸制备， 例如乙酸和苯甲酸酯。
本发明进一步包括使用所述肿瘤特异性磷脂醚类似物的衍生物的 方法。术语“衍生物”包括但不限于醚衍生物、酸衍生物、酰胺衍生物、 酯衍生物等。另外，本发明进一步包括使用所述肿瘤特异性磷脂醚类 似物的水合物的方法。术语“水合物”包括但不限于半水化物、一水化 物、二水化物、三水合物等。
本发明进一步包括使用所述肿瘤特异性磷脂醚类似物的代谢产物 的方法。术语“代谢产物”意思是指通过新陈代谢或代谢过程从另一种 物质产生的任何物质。
如在这里定义的，“接触”意思是指将用于本发明的肿瘤特异性磷 脂醚类似物引入至试管、烧瓶、组织培养物、芯片、阵列、板、微量 滴定板、毛细管等中的含有细胞或组织的样品上，并在足以允许肿瘤 特异性磷脂醚类似物结合受体或嵌入膜内的温度下和时间内孵育。用 于将样品和所述肿瘤特异性磷脂醚类似物或其它特异性结合成分接触 的方法是本领域那些技术人员已知的，并且可根据要进行的测定方案 类型来选择。孵育方法也是标准的并且是本领域技术人员已知的。
在另一个实施方案中，术语“接触”意思是指将用于本发明的肿瘤 特异性磷脂醚类似物引入进接受治疗的受试者中，并且允许所述化合 物在体内接触。在进一步的实施方案中，术语“接触”意思是指将用于 本发明的肿瘤特异性磷脂醚类似物引入需要筛查肿瘤的受试者中，并 且允许该化合物在体内接触。
如此处使用的“药学上可接受的”酯或盐意思是指活性成分的酯或 盐形式，所述活性成分与药物组合物的任何其它成分是相容的并对施 用该组合物的受试者是无害的。术语“药学上可接受的盐”或“前药”包 括化合物的盐和前药，所述化合物的盐和前药，在合理的医学判断的 范围内，适合用于受试者而没有过度的毒性、刺激性、变应性反应等 等，具有合理的利益/风险比，并且对预期用途是有效的，以及包括所 述化合物的两性离子形式(如果有可能的话)。
“治疗有效量”意思是指当施用给受试者用于治疗疾病时，足够实 现该疾病的治疗的化合物的量。“治疗有效量”将根据化合物、受治疗 的疾病状态、受治疗疾病的严重性、受试者的年龄和相对健康、施用 的路径和形式、主治的医学或兽医从业者的判断和其它因素而变化。
“诊断有效量”意思是指化合物的量，当施用给受试者用于筛选肿 瘤时，所述量足以产生良性结构和恶性肿瘤之间可检测的区别。“诊断 有效量”将根据化合物、要检测的状况、状况的严重性、受试者的年龄 和相对健康状态、施用的路径和形式、主治的医学或兽医从业者的判 断和其它因素而不同。
对本发明来说，“治疗”描述了对受试者的处理和护理以便对抗疾 病、病症或障碍。该术语包含预防性的治疗和治标治疗。治疗包括施 用本发明的化合物来预防症状或并发症的发作、减轻症状或并发症或 消除疾病、病状或障碍。
将活性化合物施用至细胞的形式不是关键，活性化合物仅需要到 达细胞(直接地或间接地)。本发明包括制备和使用药剂和药物组合 物，所述药剂和药物组合物含有在此描述的化合物作为活性成分。
将本发明化合物以诊断有效量或治疗有效量施用给受试者。本发 明的化合物可以单独施用或作为药学上可接受的组合物的一部分施 用，而且，化合物或组合物可以一次全部施用(例如，通过一次性推 注)、多次施用(例如通过一系列片剂)或在一段时间内实质均匀地 递送(例如采用透皮给药法)。还应该注意化合物的剂量可随时间而 不同。本发明的化合物可使用即时释放制剂、控制释放制剂或其组合 来施用。术语“控制释放”包括持续释放、延迟释放及其组合。在优选 的实施方案中，将本发明的磷脂醚类似物与药学上可接受的载体组合 以产生用于肠胃外施用的药物制剂。
本发明的药物组合物可以作为单个单位剂量或作为多个单一单位 剂量大批制备、包装或销售。在这里使用的，“单位剂量”指离散量的 药物组合物，所述药物组合物含有预定量的活性成分。活性成分的量 通常等于将施用给受试者的活性成分的剂量，或者等于该剂量的合适 分数，例如该剂量的二分之一或三分之一。
如在这里使用的，术语“治疗”包括预防以及病症缓解性治疗。如 在这里使用的，术语“减轻”、“压制”和“抑制”具有它们通常被理解的 意思，即减轻或降低。如此处使用的，术语“进展”意思是指范围或严 重性增加、提升、增长或变坏。如此处使用的，术语“复发”意思是指 疾病缓和后的恢复。
如此处用的，术语“施用”指使患者、组织、器官或细胞与根据本 发明的肿瘤特异性磷脂醚类似物接触。如此处使用的，施用可以在活 体外(即试管中)完成，或在体内即在活生物(例如人)的细胞或组 织内完成。
在某些实施方案中，本发明包括将本发明中有用的化合物施用给 非-人或人受试者。“受试者”意思是指哺乳动物和非哺乳动物。“哺乳 动物”意思是指哺乳纲的任何成员，包括但不限于人、非-人灵长类如 猩猩和其它猿以及猴种；农场动物例如牛、马、绵羊、山羊和猪；家 畜例如兔、狗和猫；实验室动物包括啮齿动物如大鼠、小鼠和豚鼠等。 非哺乳动物的实例包括但不限于禽类等。术语“受试者”不表示特定的 年龄或性别。
如此处使用的，“药物组合物”意思是指与合适的稀释剂、防腐剂、 增溶剂、乳化剂和佐剂(统称“药学上可接受的载体”)一起的治疗有 效量的肿瘤特异性磷脂醚类似物。如此处使用的，术语“有效量”、“诊 断有效量”和“治疗有效量”指足以产生预期效果而无过度的不利副作 用例如毒性、刺激性或过敏反应的活性剂的量。特定的“有效量”将明 显地随这些因素而变化，例如诊断或治疗的具体病症、受试者的身体 健康状况、受试者物种、治疗持续时间、同时进行的疗法的性质(如 果有的话)以及采用的特定制剂和该化合物或其衍生物的结构。在这 种情况下，如果某一量导致下列情况的一个或多个：(a)预防疾病(例 如结肠直肠癌)；和(b)该疾病的逆转或稳定，则认为该量是治疗 有效的。最佳有效量可由本领域普通技术人员使用常规实验很容易测 定。
药物组合物是液体或冻干的或其它方式干燥的制剂，并且包括不 同缓冲容量(例如，Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的 稀释剂、添加剂例如防止吸附表面的白蛋白或明胶、去垢剂(例如吐 温20TM、吐温80TM、Pluronic F68TM、胆汁酸盐)、增溶剂(例如甘 油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂 (例如ThimerosalTM、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、膨胀物质或张力 调节剂(例如乳糖、甘露醇)、将聚合物例如聚乙二醇共价连接至蛋 白质、与金属离子的络合，或将物质整合至聚合化合物例如聚乳酸、 聚乙醇酸、水凝胶等的颗粒制剂中或其上，或者整合在脂质体、微乳 剂、胶束、单层或多层囊、红细胞血影或球形体上。这种组合物将影 响物理状态、溶解性、稳定性、体内释放的速率和体内清除速率。控 释或缓释组合物包括亲脂贮库(例如脂肪酸、蜡类、油类)中的制剂。
本发明还包括施用颗粒组合物的方法，所述颗粒组合物用聚合物 (例如泊洛沙姆或poloxamine)包被。组合物的其它实施方案包括微 粒形式保护性涂层、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂以用于不同的施用路 径，包括局部的、肠胃外的、肺的、鼻的和口的。在一个实施方案中， 药物组合物经肠胃外、癌侧(paracancerally)、透粘膜、透皮、肌内、 静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内和瘤内施用。
此外，如在此使用的“药学上可接受的载体”是本领域技术人员熟 知的并包括(但不限于)0.01-0.1M并优选为0.05M的磷酸盐缓冲液 或0.9％的盐水。此外，这种药学上可接受的载体可以是含水或非水 溶液、混悬剂和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油 例如橄榄油以及可注射有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、含酒精/ 含水溶液、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。
肠胃外载体包括氯化钠溶液、复方氯化钠葡萄糖、葡萄糖和氯化 钠、乳酸林格氏注射液和不挥发油。静脉内载体包括流体和营养补给 液、电解质补给液如基于复方氯化钠葡萄糖的那些等。还可以存在防 腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、对照剂、惰性气体 等。
根据本发明可施用的控释或缓释组合物包括在亲脂贮库(例如脂 肪酸、蜡类、油类)中的制剂。本发明还包括用聚合物(例如泊洛沙 姆或poloxamine)包被的微粒组合物和连接至对抗组织特异性受体的 抗体、配体或抗原的化合物或连接至组织特异性受体的化合物。
根据本发明施用的组合物的其它实施方案包括颗粒形式、保护性 涂层、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂用于不同的施用路径，包括肠胃外、 肺、鼻和口。
已知用水溶性聚合物例如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚 物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸 共价连接修饰的化合物在静脉内注射后表现出在血液中比相应未修饰 的化合物实质更长的半衰期(Abuchowski等人，1981年；Newmark 等人，1982年；和Katre等人，1987年)。这种修饰还可以增加化合 物在含水溶液中的溶解度、消除聚集、增强化合物的物理和化学稳定 性，并极大地减少了化合物的免疫原性和反应性。因而，与使用未经 修饰的化合物比较，期望的体内生物活性可通过以较低频率或较低剂 量施用这种聚合物-化合物来获得。
还在根据本发明的另一种方法中，药物组合物可在控释系统中递 送。例如，试剂可采用静脉内输注、可植入的渗透泵、透皮贴剂、脂 质体或其它施用方式施用。在一个实施方案中，可使用泵(见Langer、 上文；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald 等人，Surgery 88：507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574 (1989))。在另一个实施方案中，可使用聚合材料。还在另一个实施 方案中，可将控释系统置于治疗靶点(例如肝脏)附近，从而只需要 全身剂量的一部分(见，例如Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，上文，vol.2，pp.115-138(1984))。其它控释系统 在Langer的综述中讨论(Science 249：1527-1533(1990))。
药物制剂可以只包含肿瘤特异性磷脂醚类似物，或可以进一步包 含药学上可接受的载体，并且可以是固体或液体形式例如片剂、散剂、 胶囊剂、丸剂、溶液、混悬剂、酏剂、乳剂、凝胶剂、乳膏剂或栓剂 (包括直肠和尿道栓剂)。药学上可接受的载体包括树胶、淀粉、糖、 纤维素物质及其混合物。含有肿瘤特异性磷脂醚类似物的药物制剂可 以通过例如皮下植入丸剂来施用给患者。在进一步的实施方案中，丸 剂在一段时间内提供了肿瘤特异性磷脂醚类似物的控制释放。制剂还 可以通过静脉内、动脉内或肌内注射液体制剂、口服液体或固体制剂， 或者通过局部应用来给药。施用还可以通过使用直肠栓剂或尿道栓剂 来完成。
根据本发明可施用的药物制剂可通过已知的溶解、混合、制粒或 药片形成步骤来制备。对于口服施用，将肿瘤特异性磷脂醚类似物或 它们的生理耐受衍生物例如盐、酯、N-氧化物等与通常用于该目的的 添加剂(例如赋形剂、稳定剂或惰性稀释剂)混合，并通过惯用方法 将其转化成合适的施用形式，例如片剂、包衣片剂、硬或软明胶胶囊、 含水、含酒精或油性溶液。合适的惰性赋形剂的实例是常规的片剂基 质，例如与粘合剂(如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶)组合、与崩解剂 (如玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸)组合，或与润滑剂(如硬脂酸或 硬脂酸镁)组合的乳糖、蔗糖或玉米淀粉。
合适的油性赋形剂或溶剂的实例是植物或动物油例如向日葵油或 鱼肝油。制剂可作为干颗粒和湿颗粒实施。对于肠胃外施用(皮下、 静脉内、动脉内或肌内注射)，将肿瘤特异性磷脂醚类似物或它们的 生理耐受衍生物例如盐、酯、N-氧化物等转化成溶液、混悬剂或排出 剂，如果需要，与习惯使用的并适于该目的的物质(例如增溶剂或其 它佐剂)一起。实例是加入了或未加入表面活性剂和其它药学上可接 受的佐剂的无菌液体例如水和油。示例性油是石油、动物、植物或合 成来源的，例如花生油、大豆油或矿物油。通常，水、盐水、含水葡 萄糖和相关的糖溶液，以及二元醇类例如丙二醇或聚乙二醇是优选的 液体载体，特别用于可注射的溶液。
含有活性成分的药物组合物的制备是本领域十分清楚的。这种组 合物可制备成递送至鼻咽的气溶剂或制备成可注射剂(液体溶液或混 悬剂)；然而，也可以制备在注射前适于溶解或悬浮于液体中的固体 形式。还可以乳化所述制剂。活性治疗成分通常与赋形剂混合，所述 赋形剂是药学上可接受的并与活性成分相容。合适的赋形剂是例如水、 盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等或它们的任意组合。
而且，组合物可包含小量的辅助物制，例如润湿剂或乳化剂、pH 缓冲剂，所述辅助物质能增强活性成分的有效性。
可将活性成分配制进组合物中，作为中和的药学上可接受的盐形 式。药学上可接受的盐包括酸加成盐，所述酸加成盐用无机酸例如盐 酸或磷酸，或者有机酸例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。从 游离羧基形成的盐也可以源于无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧 化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙 氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
对于使用例如乳膏剂、凝胶剂、滴剂等局部施用至体表，肿瘤特 异性磷脂醚类似物或它们的生理耐受衍生物例如盐、酯、N-氧化物等 可在有或无药用载体的生理可接受稀释剂中作为溶液、混悬剂或乳剂 制备并施用。
在根据本发明的另一种方法中，活性化合物可在小囊泡，特别在 脂质体中递送(见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等， in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez- Berestein and Fidler(eds.)，Liss，N.Y.，pp.353-365(1989)； Lopez-Berestein，同上.，pp.317-327；通常见同上)。
通常，NM404是有希望的新的肿瘤选择性诊断显像剂，用于监测 数种肿瘤治疗模态的治疗反应。放射性碘化的NM404(第二代磷脂醚 类似物)已经在10/10个异种移植物肿瘤模型中以及更近期在另外的 17/17个自发性啮齿动物肿瘤模型中显示出显著的肿瘤选择性。由于在 肿瘤细胞的膜中缺少代谢磷脂酶，这种方法普遍的假说是，由于它们 不能被代谢和消除，磷脂醚类似物全部截留于肿瘤细胞膜中。因而， 正常细胞与有活力的肿瘤细胞不同的磷脂醚清除速率形成了这种概念 的基础。在多种肿瘤模型中获得的结果表明，NM404受有活力的恶性 肿瘤细胞螯合并得以选择性地保留，并且定位于原发病灶和与解剖学 位置无关的转移病灶处，包括淋巴结中发现的那些病灶。与FDG不 同，这种试剂不定位于感染性位点。NM404优于FDG的其它优点包 括如下：NM404对恶性肿瘤细胞有选择性并被恶性肿瘤细胞无限期保 留，而FDG对肿瘤细胞无选择性并定位于感染性位点和增生(巴雷 特食管)。而且，由于124I具有4天的物理半衰期，其能运送至世界 的任何地方，而FDG具有110分钟的半衰期，可能受限制地分布于 产地的200英里内。NM404经历长的保留(不发生代谢)并因而当与 合适的放射性同位元素(如131I或125I)配合时可提供显著的治疗潜力， 而FDG不具有任何治疗潜力。NM404可用多种碘同位素标记，扩展 了它的多功能性(诊断和治疗以及用于实验动物研究的工具)，而FDG 局限于18F用于PET扫描或潜在地可用19F(稳定)标记用于磁共振 成像)，尽管是灵敏度水平十分低。不考虑它们的肿瘤靶向能力，由 于其在肿瘤细胞中的快速代谢，其不具有治疗潜能。NM404提供了不 仅精确预测对多种治疗模态的局部肿瘤反应的潜力，而且在治疗不足 的原发性肿瘤治疗的情形下，还使得能检测远距离转移病灶。
具体对双模态虚拟结肠镜检查来说，当在混合的CT/PET扫描仪 上进行时，NM404或其磷脂醚(PLE)类似物之一在通过PET或 SPECT成像而单独使用或与基于虚拟结肠镜检查的CT组合使用时， 提供了对肠病灶的非侵入检测和表征潜力。而且，如果通过摄取 NM404或其PLE类似物至肠病灶内证实恶性肿瘤的话，则当用治疗 性放射性卤素标记时，其可随后用作治疗剂。作为第三个用途，NM404 可用于在常规治疗范例后监测结肠癌或肠癌患者的肿瘤反应。由于其 仅由恶性肿瘤细胞摄取并选择性保留，可将其在常规治疗后施用，并 且通过PET或PET-CT成像对肿瘤细胞的整体性非侵入性地进行评 估。在最初的肿瘤位点定位将意味着还剩余有功能的肿瘤细胞，而最 初的肿瘤位点缺少放射性则意味着治疗成功。如果结肠镜配备有合适 的辐射探测器，它还将有助于传统的结肠镜检查。
NM404对恶性细胞(迄今27/27类型)有选择性，这与FDG不 同，已知FDG还定位于增生细胞和炎性位点。我们已经显示，在大 鼠Carageenan测定法中，磷脂醚类似物如NM404及其前体物NM324 都不定位于炎性病灶。NM404选择性地保留于恶性细胞中并且由于其 能用任何卤素标记而具有很大的治疗潜力，这与FDG不同，所述卤 素包括所有碘同位素，其中碘同位素包括具有治疗性发射的那些碘同 位素(125I、131I以及卤素砹-211，其也是具有非常类似碘的化学特性 的卤素)。
NM404不穿过完整的血脑障碍并因而在脑肿瘤检测中比FDG更 好，FDG当然可很好地位于正常的脑组织中从而限制了它在脑肿瘤检 测中的使用。
用碘-124标记的NM404可以在一处生产并运送至世界的任何地 方，这与18F-FDG不同，18F-FDG由于其110分钟的物理半衰期而具 有有限的递送范围，并因而需要许多产地。
相对于用碘-124标记的其它肿瘤学PET试剂(如124I-FIAU)， NM404碘由于其芳族C-I键合结构而对于体内脱碘作用更稳定得多。 已知许多含有脂族碘的其它物质(包括FIAU)在注射后迅速脱碘。
虽然FDG允许在注射后扫描45分钟，但使用NM404则可以等 待更长，由于在肿瘤中渐进性浓度而提高了对比。在临床实践中，由 于NM404对恶性肿瘤有特异性，则直到24或48小时的成像延迟时 间不是问题。由于PET的体层摄影特性，对于肿瘤在6小时内扫描是 可能的。
在许多实验肿瘤模型中，NM404已经证明了对瘤组织而不是肿瘤 前组织有显著特异性。高的肿瘤对背景亲合力以及NM404的肿瘤选 择性表明，其比18F-FDG PET扫描有可能更好地用于治疗期间肿瘤成 像。NM404的肿瘤特异性的确切机制正在研究中，并且目前没有像 18F-FDG摄取的葡萄糖利用机制那样得到很好描述。不能完全确定 NM404在瘤组织中的摄取和选择性保留是否取决于该组织的生存能 力，或者这种摄取现象是否与不依赖于组织生存能力的一些膜或基质 成分相关。如果这种摄取和特异性与肿瘤生存能力有联系，则由此得 出刚刚通过辐射灭菌的肿瘤中NM404摄取将不存在或很低，而抗辐 射的肿瘤将显示持续的摄取。最近，本发明人在裸小鼠中证明了 NM404摄取和放射敏感的和抗放射性鳞癌细胞(SCCl和SSC6)两者 中的杀死作用。这种测定法可用于管理用放射疗法治疗的患者，因为 没有表现出治疗后NM404定位的患者将表示治疗成功，而对具有抗 性肿瘤(持续摄取NM404)的患者可以提供其它的非放射性选择(手 术、化学疗法等)。
开发灵敏的、更可利用的成像检查的一种方法是设计载体分子， 所述载体分子能选择性递送放射性药物探针至目的靶标组织。本发明 人的方法已经利用了显示出高度组织或肿瘤选择性的分子的独特生物 化学或药理学特性。
Snyder和同事观察到，多种动物和人肿瘤细胞在细胞膜中含有比 正常组织更高得多浓度的天然存在的醚脂质。见Snyder F，Wood R. Alkyl and alk-1-enyl ethers of glycerol in lipids from normal and neoplastic human tissues.Cancer Research.1969；29：251-257：Snyder F，Blank ML，Morris HP.Occurrence and nature of o-alkyl and o- alkyl-1-enyl moieties of glycerol in lipids of Morris transplanted hepatomas and normal rat livers.Biochem Biophys Acta.1969； 176：502-510。这些作者认为，醚脂质在肿瘤中的积聚是肿瘤细胞由于 缺少关键的代谢酶而使代谢这些脂质的能力较低的结果。本发明人利 用了这种观测结果，通过合成多种放射性碘化的磷脂醚(PLE)类似 物作为潜在的肿瘤选择性显像剂。数种PLE类似物已经显示出惊人且 明显普遍的能力，所述能力是能够定位并选择性地保留于多种多样的 自发性的和移植的大鼠、鼠类和人肿瘤模型(25/25)中。
工作原理的假设(图1)是，磷脂醚由于它们不能被代谢和消除 而截留于有活力的肿瘤细胞膜中。这种假设受到下面报导的酶促活性 和表达研究的实验结果的支持。典型的代谢酶包括磷脂酶A2(PLA2)、 磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)。施用放射性碘化的磷脂醚试 剂后提取肿瘤显示只存在完整的试剂，而对尿和粪便的分析仅显示代 谢产物。虽然不愿局限于特定假设或作用机制，但这些结果和下面描 述的那些结果表明，正是磷脂醚从正常细胞相对于从肿瘤细胞的不同 清除速率，以及细胞磷脂代谢的根本不同形成了本发明磷脂醚类似物 的肿瘤特异性的基础。
在超过25种异种移植物和自发性肿瘤模型中获得的初步结果(表 1)显示，在检测的所有肿瘤中NM404经历了选择性摄取和长的保留。 因为所述试剂在肝脏中在一定程度上被代谢，由于高的肝脏本底放射 性水平本发明人避免在肝脏肿瘤模型中进行早期的化合物评估。进一 步，因为NM404产生比其前体物更低的肝脏本底水平，根据给患有 HCC的患者显像已经成为问题这一事实，本发明人把评估扩展到肝脏 肿瘤中。许多患者具有潜在的肝硬变并因此很难在横断层面成像上区 分再生小结和HCC。而且，评估使用FDG的PET扫描的初步研究已 经显示，在检测该疾病中仅有20-50％的灵敏性。Verhoef C等，Liver (2002)22：51-56。而且，PET FDG不能用于在脑中的诊断筛选。同样， 由于肝细胞的高的自然摄取FDG不能用于评估肝脏中的疾病。
下列实施例描述了本发明的多个方面。仅为了示例目的描述这些 实施例而且不应该认为是缩小或限制本发明范围。
实施例1：NM404的合成、放射性标记和制剂
合成方法基于用于烷基链延长格利雅试剂与烷基甲苯磺酸酯或卤 化物的铜催化的交叉-偶联反应(见下面的方案)。合成从对-碘苄基 醇1开始，通过与三甲基硅烷基溴反应将所述醇1转化为对-碘苄基溴 2，在存在Li2CuCl4作为催化剂时将对-碘苄基溴2进一步与格利雅试 剂3偶联。将第一个偶联产物4去保护后获得的12-(对-碘苯基)十 二烷醇5转化为甲苯磺酸酯6。在接着的步骤中，将甲苯磺酸酯6与 含有6个碳原子的格利雅试剂7偶联，这完成了链的延伸步骤。将8 进行THP去保护得到18-(对-碘苯基)十八烷醇9，通过如下面方案中 显示的两步程序将其转化为10(NM404)。
进一步，用于用任意同位素(如果是碘，则包括124I、125I和131I) 标记NM404的快速高产率合成方法通过以下步骤进行：
首先，将铝加热器装置预加热至145℃并用一个5ml一次性注射 筒制备冷凝器，所述注射筒在顶部安装有弯曲的1.5英寸18ga一次性 针头和橡胶隔片。
第二步，初始化HPLC系统并用过滤过的脱气的溶剂(己烷/异丙 醇/水(40∶52∶8))充满容器。平衡该系统，随后系统地检查辅助系统 如泵、检测器、图表记录器和计算机积分仪。
第三步，通过在底端使用玻璃棉塞、将注射器用颗粒状的活性炭 充满2.5ml、在顶部加入另一玻璃棉塞并插入一隔膜而制备3ml的一 次性注射器活性炭阱。将一短的管形接头针头装在该注射器上并将一 18-ga针头插进顶部的隔膜。将所述炭阱连接至冷凝器的顶部并通过 硫代硫酸钠阱与大气相通。
第四步，将5mg硫酸铵加进2ml硼硅玻璃的V形小瓶中的20μl 去离子水中，然后将20μl无水乙醇中的20μg未标记的NM404加 至该小瓶中。轻轻搅动或晃动该小瓶以确保混合，并将6个硼硅玻璃 珠(3mm)也加入至该小瓶中。然后用涂有Teflon的丁基橡胶隔片 和铝卷曲盖密封。用18-ga针头穿刺该隔片并将期望量的含水碘化钠 -131(在0.1 N NaOH，通常是15μl中5mCi)通过哈密顿微量注射 器穿过隔片加入。再次轻轻搅动或晃动小瓶以确保混合。在剂量校准 器中测定该小瓶。
第五步，将活性炭阱注射器插入进所述反应小瓶中并将该反应小 瓶放入进加热器孔(用沙填充一半)中。在145℃下将反应小瓶加热 40分钟，在此期间大多数溶剂被蒸发并在冷凝器中凝结。用25-ml的 注射器将气流(4×25ml)缓慢地注入进该反应小瓶中。将反应小瓶 的温度升至155℃并继续另外加热30分钟。从所述块式加热器移开该 反应小瓶并且拆开冷凝器/阱部件并丢弃，让小瓶冷却至室温。
第6步，将0.5ml无水乙醇加入至所述反应瓶中。轻轻地搅动小 瓶并在剂量校准器中测定。
第七步，在硅胶(氯仿/甲醇/水(65/35/4))上进行粗的标记产 物的放射-TLC分析。
第8步，通过在5ml的无水乙醇中预先浸泡1.0g树脂30分钟制 备Amberlite IRA 400树脂柱。倾析出乙醇并用两份另外的5ml乙醇 冲洗树脂。将湿的树脂加进3ml的底部有一玻璃棉塞并装上Acrodisc 滤器和2通连接阀的一次性注射筒中。将粗的放射性碘化产物的乙醇 溶液逐渐地通过所述树脂柱洗脱进5ml小瓶中。
第9步，插入隔板并用氮气流吹去溶剂。在开始通入氮气流前将 活性炭注射器连接在瓶的出口。一旦干燥后，将50μl乙醇用于稀释 并将内容物转移至300μlv形瓶中。另外用50μl乙醇冲洗源小瓶并转 移至所述v形瓶中。
第10步，使HPLC泵稳定并建立1.0ml/分钟的溶剂流量。在 Perkin-Elmer筒硅胶柱(4.3×33mm，3μm二氧化硅)上通过HPLC 纯化该反应混合物，所述柱用己烷/异丙醇/水(40∶52∶8)以1.0ml/分 钟洗脱。通过在230和254nm的UV和通过放射性检测峰。一旦合适 的峰收集在无菌瓶中，移出一小份样品用于放射性-TLC分析并用氮 气流蒸发剩下的溶剂得到目的化合物的干的残余物。必要时计算比放 射性。
第11步，从无水乙醇中的5％聚山梨酯20TM的储备溶液将聚山 梨酯-20TM以0.1μl/1.0μgNM404的比例加至烧瓶中。聚山梨酯20TM 是药物级的吐温20TM，现在将其与NM404用于人和动物研究中。在 ＜30℃下通过旋转蒸发10分钟除去溶剂。通过混合进足够的无菌水中 溶解残余物以产生2％聚山梨酯-20的溶液。将配制好的产物通过无 菌的0.2μm PaIl-Gelman Acrodisc过滤器(13mm)传入干的、无菌 的、多次剂量瓶(Hollister-Stier)中，所述多次剂量瓶用另一无菌的 0.2μm过滤器通气。将100μl产物溶液转移进小瓶中用于QC分析。
第12步，在剂量校准器中测量放射性并进行质量控制检测(无菌 性，不致热性)。
所有未标记的NM404取自最近进行了急性毒理学检验的原始储 备批次以使得研究之间潜在的合成差异最小化。NM404的放射性碘化 通过在由发明人(Weichert JP，Van Dort ME，Groziak MP，Counsell RE.Radioiodination via isotope exchange in pivalic acid.Int J Appl Rad Isotopes.1986；37：907-913)发展的新戊酸的熔化物中进行同位素 交换反应或通过在此描述的新方法按常规获得，并根据由发明者描述 的标准方法(Rampy MA，Brown RS，PinchukAN，Weichert JP， Skinner RW，Fisher SJ，Wahl RL，Gross MD，Ethier SP，Counsell RE. Biological disposition and im aging of a radioiodinated alkylphosphocholine in two rodent models of breast cancer.J Nucl Med.1996；37(9)：1540-1545)制备用于注射。这种方法可有效地用来 制备无菌的材料用于最初的使用NM324(NM404的前体)的人体试 验，并已经超过40次用于制备125I和131I-标记的NM404。一般来说， 在用HPLC纯化并精确地质量定量后，将放射性药物溶解于无水乙醇 (50-500μl)和聚山梨酯-20TM(0.1μl/μg化合物)中。在真空下除去 乙醇并将残余物溶解进无菌水中得到含有不超过2-3％的聚山梨酯-20 的终溶液。通过滤过无菌0.2μm滤器单元完成灭菌。在用于受试者前 最终的放射化学纯度必须超过97％。最终的比放射性的定量和计算通 过使用已知质量标准的HPLC分析完成，放射性(125I)的定量通过 在PE Wallac γ-计数器中稀释并计数来完成以避免衰减担心。较高能 量的同位素(包括131I)的定量用剂量校准器进行，所述剂量校准器 具有这些同位素的内嵌设置。一般获得每100μg放射性碘化的NM404 有1mCi的比放射性。注射体积一般为每只小鼠约100μl。组织分布 数据表示为每克组织的百分比注射剂量(±SEM)，并且当整个器官 根据公开的方法(Rampy MA，Brown RS，Pinchuk AN，Weichert JP， Skinner RW，Fisher SJ，Wahl RL，Gross MD，Ethier SP，Counsell RE. Biological disposition and imaging of a radioiodinated alkylphosphocholine in two rodent models of breast cancer.J Nucl Med.1996；37(9)：1540-1545)称重时，也表示为每个器官的百分比注 射剂量。在每个时间点，基于每克组织的百分比注射剂量计算肿瘤对 组织的比率。
一般的组织分布(TD)分析：根据由发明者发展的标准方法 (Weichert JP等，Polyiodinated Triglyceride Analogs as Potential CT Imaging Agents for the Liver.J Med Chem 1995；38：636-646)在雌性 小鼠上进行生物分布研究。通过尾静脉注射施用放射性碘化的NM404 (100μl中，5μCi)。在预先确定的时间点将动物(每个时间点3只) 通过放血实施安乐死，同时处于戊巴比妥麻醉下。获取包括血液、血 浆、肾上腺、膀胱、骨髓、脂肪、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、脾 脏、卵巢、皮肤、甲状腺和肿瘤的总共16种组织，冲洗并切割使得没 有外来的组织。将大的器官切碎并称重双份的组织样品并放置于塑料 管中用于同位素计数。注射位点和残留尸体的放射性也在适当地计数 器中测定。这些标准的方法已经在发明人的试验室中，在适当的动物 照顾和放射性安全认可下用了许多年。通过计算机程序生成了组织分 布的表格，基于百分比注射剂量/g、％kg剂量和百分比注射剂量/器官 ±SEM，其产生了衰败-校正的组织放射性浓度数据。在每个时间点， 基于每克组织的百分比注射剂量计算肿瘤对组织的比率。在NM404 注射后4、7、14、21和28天时在负载肿瘤的小鼠上进行了对照TD 研究(3只小鼠/时间点，总共15只)以建立所有治疗方案的比较TD 表。
一般的成像方案：经尾静脉注射并在预先确定的时间点接受125I- NM 404(10μCi)的动物随后麻醉(戊巴比妥钠麻醉，0.06mg/g体重) 并用经改良用于小鼠成像的Bioscan AR2000放射-TLC扫描仪进行 放射性核素扫描(2mm高分辨率准直器/每道(lane)1分钟采集时间 /1mm道增量)。用购自Bioscan的Winscan 2D软件定量并显示数据。 一旦切除，也将对照的和处理过的肿瘤在Bioscan仪器上进行离体扫 描以使得能通过消除整个身体的放射性核素衰减而进行更精确的目的 区域(ROI)分析。用中等分辨率采集参数对动物(戊巴比妥钠麻醉， 0.06mg/g体重)进行微型CT扫描(Imtek MicroCAT I，390步采集 /43Kvp/410μA；CTI Molecular Imaging，Inc.，Knoxville，TN)。对数 据集进行三维重建并用AMIRA 3D可视化软件可视化。该软件能进行 ROI密度分析和方便的在屏测量。
实施例2：高比放射性合成和放射性标记
在高比放射性NM-404的合成中，首先在存在Pd催化剂时将冷 的NM-404与双-(新戊基甘醇酰(glycolato)二硼)偶联而形成芳基硼 酸酯。在第二步中，用放射性碘化钠和氯胺-T让所述芳基硼酸酯接受 放射性碘去硼化而获得具有高比放射性的放射性碘化的NM-404。
二烃基代硼酸的二元醇酯的其它酯也可用于第一个反应，例如， 双-(频那酰(pinacolato))和双(亚己基-甘醇酰)二硼。
高比放射性合成的重要标准是最终的标记化合物(例如131I- NM404)和它的前体二烃基代硼酸酯化合物必须可容易通过HPLC分 离。这确保了差不多每个通过HPLC分离的NM404分子得以放射性 标记。所述化合物的理论比放射性是约2500居里/mmol。现存的同位 素交换方法局限于约10居里/mmol比放射性。对于治疗，这是重要的， 因为受试者治疗需要的化合物(例如用放射性同位素131I-NM404治 疗)的大概量是约60-100mCi。与目前可利用的同位素交换条件，特 别是获得131I类似物的治疗剂量所需要的条件比较，这种新的高比放 射性合成将提供更大质量剂量的放射性标记的NM404。
实施例3：用PLE类似物的临床前研究
用上面描述的同位素交换方法可容易地用碘放射性同位素标记磷 脂醚。特定地设计所述碘苯基磷脂醚类似物以使得连接在每个分子上 的放射性碘对体内容易进行的脱碘作用是稳定的。合成并且体外和体 内检测了超过20种放射性标记的PLE化合物。其中两种，即NM294 和NM324[12-(3-碘苯基)-十二烷基-磷酸胆碱]，在动物肿瘤定位研究 中最初显示出最有希望。这些原型化合物，用125I标记，在以下动物 肿瘤模型中随时间过去而选择性地定位于肿瘤中：1)负载有Walker 256癌肉瘤的Sprague-Dawley大鼠；2)负载有乳腺肿瘤的Lewis大鼠； 3)负载有Dunning R3327前列腺肿瘤的Copenhagen大鼠；4)负载有 Vx2肿瘤的兔；和5)负载人乳腺肿瘤(HT39)、小细胞肺肿瘤(NCI-69)、 结肠直肠肿瘤(LS174T)、卵巢肿瘤(HTB77IP3)和黑素瘤肿瘤的 无胸腺小鼠。这些试剂的最佳肿瘤定位需要1-7天。
使用PLE类似物的机制研究：NM324和NM404在结构上类似于 米替福新(十六烷胆碱磷酸)，米替福新是在欧洲最广泛研究的一种 抗肿瘤醚脂质。米替福新和数种其它抗肿瘤磷脂醚类似物的抗肿瘤特 性已经在广泛的肿瘤细胞系中得到证明，所述细胞系包括前列腺癌、 膀胱癌和畸胎癌、鼠和人白血病以及肺、结肠、卵巢、脑和乳腺癌 (Arthur G，Bittman R.The inhibition of cell signaling pathways by antitumor ether lipids.Bioehim Biophys Acta.1998；1390：85-102)。 与许多抗癌药物比较，这些磷脂醚类似物不直接结合DNA并且不是 诱变剂。尽管还没有确定确切的抗增殖作用机制，但它们明显在多个 肿瘤细胞位点起作用。已经将这些化合物与多种细胞效应联系起来了， 所述细胞效应包括转运、细胞因子形成的促进、细胞凋亡诱导和干扰 多个关键的脂代谢以及细胞信号传导酶，它们大部分位于细胞膜内。 尽管对摄取进细胞的模式存在争议，但现在多数的报道支持这样的观 点，即这些醚脂质直接吸收进它们积聚的细胞膜内。一个普遍的观点 认为，这些试剂通过扰乱膜磷脂代谢而起作用；然而用这些试剂进行 的细胞分布研究已经受到在均化和亚细胞分级分离过程中自发的细胞 腔隙的重新分布的限制。与本发明人已经使用的示踪剂成像剂量(数 μg)比较，抗肿瘤效果仅在一般超过300-1000mg/天的剂量时才可观 察到(Arthur & Bittman，1998)。
对数种PLE类似物(包括NM324，其为NM404的前体)进行了 正式的代谢研究。在这些研究中，对每种试剂进行检验以确定它们作 为与PLE代谢相关的酶的底物的能力。如图15显示，三条主要的酶 促途径涉及PLE的代谢。O-烷基甘油单氧化酶(AGMO)负责C-I 处的烷基醚键的裂解以形成长链脂肪醇或脂肪酸。磷脂酶C(PLC) 和D(PLD)，另一方面，分别产生了甘油或磷脂酸产物。使用微粒体 AGMO酶制备物，当与[3H]-lyso-PAF(血小板激活因子)比较时， NM324不是这个酶的底物，所述[3H]-lyso-PAF被大量地代谢。以类 似的方式，分析NM324作为分离自蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus) 的PLD的底物，相对于1-棕榈酰-2-[3H]-棕榈酰-L-3-磷脂酰胆碱 (DPPC)，NM324没有水解，而所述DPPC进行了明显的水解。
最后，让数种PLE类似物接受PLD测定。分离自卷心菜的PLD 类似于哺乳动物的PLD，因为当在存在乙醇下进行酶促反应时，卷心 菜形式除了提供磷脂酸外还提供了磷脂酰乙醇-类型的产物。数种接受 这些测定条件的PLE类似物真的产生了磷脂酰乙醇产物，表明所述 PLE可能与PLD相互作用。
也对数种NM404前体在多种细胞系(包括Walker 256肿瘤细胞、 大鼠肌肉细胞(H9c2)和大鼠肝细胞)中进行了体外代谢研究。在这 些研究中，基于孵育多个时间段后形成的放射性标记产物和用细胞数 目或细胞蛋白的量标准化的结果测定了代谢的程度。随后的孵育培养 基和细胞悬浮物的脂质提取证明，在48小时的研究过程中在Walker 肿瘤细胞中极少生成PLE代谢物而在肌肉细胞和肝细胞中都可看见 明显的代谢物产生。这些结果与用所有类似物完成的体内生物分布研 究很好地相关联。尽管已经完成了数个研究，但在肿瘤细胞内代谢捕 获在放射性标记PLE类似物的摄取和保留中的作用还没有很好地确 定，并且当前还有检测的放射性区域。
NM324的临床评价：在数种有希望的第一代PLE类似中，NM324 更易于化学合成并因而选取它作为先导化合物用于初始的临床研究。 尽管在五个人肺癌患者中获得的图像检测到肿瘤，但是高的肝脏放射 性(图2)使图像变得复杂。
第二代PLE类似物：为了降低肝脏摄取并延长血浆阶段，合成了 9种NM324的结构类似物并用125I进行放射性标记用于在负载有 Dunning R3327前列腺肿瘤的Copenhagen大鼠中进行初始的图像分 析。基于这种初始的筛选，选取NM347、NM404[18-(4-碘苯基)-十八 烷基磷酸胆碱]和NM412(图3)来在动物肿瘤模型中进行进一步的成 像和生物分布分析。
在动物模型中用NM404和NM412进行的最近的成像研究显示， 在显影多种肿瘤中它们两者都优于NM324。重要地是，在静脉内施用 NM404或NM412后在转移的前列腺肿瘤模型中，清楚地描述出了淋 巴结转移瘤。最重要地是，未涉及的淋巴结没有保留所述示踪剂(图 4A)。
图4A和图4B说明了在IV施用放射性标记的磷脂醚类似物后， SCID小鼠肿瘤模型中磷脂醚类似物NM404(图4A)和NM324(图4B) 的分布的闪烁图比较的结果。在其中注意到，大多数的NM324(图 4B)放射性在肠55中发现，并不是在肿瘤50(移植入大腿内)中发 现，而NM404(图4A)正确地识别了在左腿和右腿中的肿瘤50。随 着时间过去，与组织的其它部分比较，放射性标记的磷脂醚类似物 NM404变得更有选择性地定位于肿瘤50中，这种现象对于放射性标 记的磷脂醚类似物NM 324没有观察到。图4C显示了IV施用放射性 标记的磷脂醚类似物NM404后的闪烁法图像，该图像显示了所述磷 脂醚类似物定位于Copenhagen大鼠中的Dunning R3327转移的前列 腺肿瘤(“tumor”，)中，所述大鼠通过手术移除了原发性肿瘤位点(腿)。 在处死后证实有两个淋巴结肿瘤。
尽管是在前列腺模型中进行的，这个发现与乳腺癌显著相关，所 述乳腺癌中牵涉到淋巴结也是这样一种重要的预后指标。在负载有人 A549 NSCLC肿瘤的SCID小鼠中进行的初步的先导研究令人鼓舞并 证明了NM404克服了这样一个问题，即由肝脏引起的NM324的高的 首过清除率。NM404显示了极好的肿瘤显影，特别显著的是在延迟成 像中，与NM324比较其具有最小的肝脏和肾脏摄取(图4A和图4B)。 组织生物分布研究进一步确认在肿瘤中残存高水平的放射性。尽管成 像结果与NM404和NM412相似，但在大鼠中获得的放射量测定数据 显示，相对于NM412，发现NM404具有更低的肾脏剂量，并因而选 择NM404用于进一步研究。比较NM324和NM404在前列腺癌和A549 肺癌肿瘤模型的SCID小鼠中的生物分布数据显示，NM404产生高的 肿瘤对正常组织的比率和超过25％的注射剂量的肿瘤摄取。
在小鼠模型中进行的动物成像研究总结于表1中，所述研究目的 是测定广泛多样的肿瘤模型中的摄取特性。在B6 ApeMin/+小鼠中的初 步结果表明，NM40在这个模型中不为腺瘤性息肉摄取而是由乳房腺 癌吸收并保留，因而表明其对恶性肿瘤细胞可能有特异性。这些研究 目的是测定NM404用于非侵入地表征肿瘤的潜力。NM404已经在每 个研究的腺癌模型中展示了显著的肿瘤摄取和保留。
CT-26鼠肿瘤模型的相关性：发明人在鼠(BALB/C小鼠)模型 中探索了NM404作为肿瘤反应的预测物，所述小鼠皮下接种CT-26 细胞进入其两胁。所述CT-26细胞系是分化不足的鼠腺癌，其通过在 Balb/c小鼠中直肠注射N-亚硝基-N-甲基尿烷诱导。所述细胞系简单 地在体外生长并当注射进脉管系统(尾静脉注射，转移模型)，进入 皮肤(图5)或肝脏时，其产生可预测的生长模式。图5是在已经接 受了皮下注射CT-26细胞的小鼠中肿瘤生长的图示。参见Weber，SM， Shi F等，Interleukin-12 gene transfer results in CD8-dependent regression of murine CT26 liver tumors.Ann Surg Oncol 1999； 6：186-194；Imboden M等，The level of MHC class I expression on murine adenocarcinoma can change the antitumor effector mechanism of immunocytokine therapy.Cancer Res 2001； 61：1500-1507。由于所述细胞系源于结肠直肠癌，这种鼠模型对于这 些研究是高度临床相关的。
在CT-26肿瘤中使用NM404的成像结果：本研究显示，放射性 卤素标记的磷脂醚类似物(NM404)定位于皮下的CT-26异种移植物 中。用125I-NM404(10μCi)注射(IV尾静脉)两只小鼠并随后在注射 后1、4和7天，在改良的Bioscan AR-2000 TLC成像扫描仪上成像 以获得放射性同位素分布的2维闪烁法图像(Bioscan，Washington， D.C.；配备有高分辨率的1mm准直器和2-D图像采集和分析软件)。 在第7天，对动物实施安乐死并取出肿瘤，摄像并在Bioscan上离体 扫描(图6)。由于与碘-125相关的严重的组织衰减效果，离体扫描 是发明人试验室中标准的方案。在第7天实施安乐死和切开肿瘤前， 也将每只动物进行微型CT扫描(图7)。
通过比较组织形态和放射性分布，在离体闪烁法图像上通过目视 将放射性的病灶热点与所有肿瘤关联(图6A-C)。图6A是切除的 CT-26肿瘤50和切除的左和右淋巴结的摄影图像。图6B是图6A中 的离体的肿瘤和淋巴结的闪烁法图像，该图像显示，显著的放射性60 定位于肿瘤中而极少或没有放射性定位于淋巴结中。图6C是将图6A 数字化摄影图像和图6B的数字化闪烁法图像合并产生的图像，显示 了放射性和肿瘤的相关性。
尽管淋巴结在摄影图像中形态学上是可见的，但是极少或没有放 射性与它们相关，这表明没有肿瘤细胞浸润。图6和图7中的主要肿 瘤在组织学上分类为腺癌。在另外的研究中，用微型CT扫描广泛多 样的皮下肿瘤；下至直径小于300微米大小时所有的肿瘤是容易检测 的。
表1：肿瘤模型的概述
肿瘤模型 物种 种类 摄取 人类肿瘤异种移植物 前列腺PC-3 肺A-549(NSCLC) 肺NCI H-69(Oat细胞) 肾上腺H-295 肾上腺RL-251 黑素瘤A-375 结肠LS-180 卵巢HTB-77 动物肿瘤异种移植物 乳房MCF-7 前列腺MatLyLu Walker-256 最近的啮齿类动物模型 TRAMP前列腺 肝CT-26 SCID小鼠 SCID小鼠 裸鼠 SCID小鼠 SCID小鼠 裸鼠 裸鼠 裸鼠 大鼠 大鼠 大鼠 自发性小鼠 小鼠异种移植物 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 癌肉瘤 腺癌 结肠直肠腺癌 有 有 有 有 有 有 有 有 有 有 有 有 有
皮下CT-26 Min小鼠肠 黑素瘤 SCC1和6 乳房SCC和ACC 肝细胞癌 胰腺c-myc和kras 神经胶质瘤L9 成视网膜细胞瘤 子宫颈的 腺瘤性息肉 乳房增生 小鼠异种移植物 内源性小鼠 小鼠异种移植物 裸鼠 ApcMin/+小鼠 自发性TGF-α小鼠 自发性小鼠 大鼠 自发性小鼠 自发性小鼠 自发性小鼠 内源性小鼠 结肠直肠腺癌 腺癌 腺癌 鳞状细胞癌 鳞状细胞癌和腺癌 腺癌 腺癌 神经胶质瘤 胚细胞瘤 腺癌 腺瘤 小泡增生 有 有 有 有 有 有 有 有 有 有 无 无
因为肿瘤-靶向机制看似涉及随时间过去选择性的肿瘤保留，相对 短寿命的核素例如18F或甚至是99mTc在目前用于标记是不可行的。然 而，如同早期使用单克隆抗体(其唯一用碘的放射性同位素标记)， 有可能用备选的标记物(例如碘-124)标记PLE类似物，其中物理学 半衰期与PLE肿瘤摄取和保留动力学很好地匹配。这种方法除了利用 PET成像提供的相对于传统的γ照相成像的解析增强和3-维能力以 外，还将利用18FDG的使用，因为18FDG被摄取到肿瘤细胞中是经由 不同于葡萄糖利用的生化机制发生的。
正如上面已经讨论的，当前可利用的示踪剂(例如67Ga和18FDG) 受限于缺少区分瘤和炎症的特异性。然而，用PLE试剂的初步研究已 经提供了克服这种临床上的显著局限性的希望，其中角叉藻聚糖在大 鼠中诱导的肉芽肿不能在高于背景放射性上显影并且没有显示出组织 保留。Counsell-RE等，Tumor visualization with a radioiodiuated phospholipid ether.JNucl Med 31(3)：332-336，1990。然而枸橼酸镓(在 那个研究中用作对照)确实在所述肉芽肿中显著地集中。这些发现进 一步证明了扩展本发明人用PLE类似物试剂作为潜在有用的肿瘤选 择性显像剂的研究是正确的。
人体研究：基于在动物中十分有希望的药物动力学和成像数据， 促使本发明人将放射性标记的磷脂醚的研究进入临床阶段。最初在大 鼠和兔上评估了未标记的NM324的急性毒性作用，所述评估是在 Buffalo的Toxicology Research Center，State University of New (SUNY)进行的研究中完成的。在这些急性剂量毒理学研究中在3.2 mg/kg(＞150倍最高预期的人的剂量)的剂量水平没有发现毒性作用。 而且，在这种高剂量水平没有证明血小板激活特性。
将未标记的NM324施用给正常的、无疾病的人以获得放射性药 物研究委员会(RDRC)对用于人施用的放射性标记试剂的批准。这 些受试者没有中毒的迹象，这通过症状、临床检查、生命体征和连续 的血液化学检查表明。
作为先导的可行性项目，在RDRC批准下在Ann Arbor，Michigan VA医院用131I-标记的NM324研究了4位肺癌患者。在全部三个肺癌 患者中肺肿瘤清楚地得以显影(两个患有NSCLC以及一个患有小细 胞肺癌)，下面有详细描述。肿瘤摄取的程度，在多个时间点，从1+ (刚好在背景之上可见)到3+(强烈的摄取，比正常结构大得多)变 化。注意，选择进行这些初始研究的患者是具有已知的、相对大的癌 的那些患者。在这个阶段不准备研究存在进行肿瘤分类问题的患者。
病例史：
患者01是55岁的老年妇女，其右边中叶肺肿块侵蚀进右肋，组 织学上可能为肺起源的产生粘蛋白的腺癌。在6小时时最初的131I- NM324闪烁法成像显示在右侧中间的肺中有摄取的病灶。由于与闪烁 法试验无关的原因，该患者超过6小时不能返回医院进行进一步的成 像。
患者02是一位62岁的老年男性，其有一大的(9×7×7.5cm)、 分叶状的纵隔肿块，从主肺动脉窗和左肺门延伸。组织类型是小细胞 未分化的(燕麦(oat)细胞)癌。131I-NM324闪烁法成像显示了左上 的肺部中的摄取焦点，其相对于正常的背景放射性强度随时间增强。
患者03是一位74岁的老年男性，其患有右上叶NSCLC(腺癌)， 其先前用放射疗法治疗了5个月。疾病在左舌(2.5×2×3cm肿块)、 下胸椎(约T8)和肝脏的右叶复发。131I-NM324闪烁法显像在肺肿块 和胸椎病变中显示了十分确定的吸收，这证明靶标对背景的比率随时 间增加(图2)。在肝脏转移瘤中的吸收不能在正常肝的背景上分辨。
这些研究提供了放射性标记的PLE类似物的临床希望的曙光。尽 管131I不是最佳的用于成像目的的同位素，但所有三个肺肿瘤中的摄 取得以清楚地描绘。正如预期的，基于先前的动物生物分布试验，肿 瘤中的放射性随时间增加，如患者02和03中清楚说明的。在患者03 中，肿瘤对正常组织的比率从第2天的2.74增加到第7天的4.23。患 者01超过6小时没有返回进行后面的成像阶段。增加的靶标对背景的 比率构成了强有力的证据，证明肿瘤显影的机制不是仅基于异常的血 流或肿瘤过度的血管分布的机制。事实上，用99mTc人血清白蛋白进 行的动物研究证实了这个观点。
CT-26结肠腺癌异种移植物模型：也在异种移植物结肠腺癌肿瘤 模型中评估了NM404，为此先前将CT-26细胞(5x105细胞/50μl)直 接注射进雌性Balb/C小鼠的肝实质中用于产生病灶肝肿瘤。
成像研究：在新戊酸的熔化物中通过同位素交换用125I对NM404 (图3A，100μg)进行放射性碘化。Weichert JP等，Int J Applied Radiat Isot(1986)37(8)：907-913。HPLC纯化后，将其溶解于含水的2％吐 温-20溶液中，随后将其经尾静脉注射(高比放射性15μCi/20g小鼠) 进3只TGF-α内源性小鼠或备选注射进3只负载有CT-26-肿瘤的小 鼠中。将小鼠麻醉并在改良的Bioscan AR2000放射-TLC扫描仪(以 2分钟采集/道扫描，增量为2mm和1mm高分辨率准直器)放射上扫 描直到注射后21天并且还在ImTek微型CT扫描仪上扫描(390步) 用于解剖学相关。用Amira软件显示了微型CT图像。处死时，最初 将负载有肿瘤的肝脏切下并离体扫描。然后切取肿瘤、称重、离体扫 描并定量放射性。将病变样品进行组织学分类。
结果和讨论：用NM404的最初的成像结果(图9，图10)在肝 脏中自发的和移植的癌中显示惊人的摄取(＞20％剂量/g)和延长的滞 留时间。NM404的肿瘤滞留时间在这些动物中持续了21天(预先确 定的研究终点)。对照增强的微型CT成像确认了所有肝脏肿瘤的存 在和精确定位(图9，图11)。肿瘤组织的脂质提取和随后的HPLC 分析表明，放射性仍然与母体化合物相关。正如在先前的细胞培养物 和体内动物模型研究中已经观察到的，NM404明显被代谢并且从正常 细胞中消除，但代谢捕获于肿瘤细胞膜中。
结论：正如在所有先前检验的肿瘤模型中的情况，NM404显示出 选择性和长时间的保留在本研究中评估的自发性的和异种移植物鼠肝 脏肿瘤模型中。
实施例4：在ApcMm/+内源性乳房腺癌模型中增生相对于瘤形成的 特异性
材料和方法：ApcMin/+小鼠模型：这种模型由携带Ape的Min等 位基因的小鼠(ApcMin/+小鼠)组成。这种模型提供了比异种移植物模 型更特别的优势，因为ApcMin/+小鼠易于产生乳腺的增生和癌以及肠 腺瘤。在C57BL6/J的遗传背景上，到100天大时约5％未经处理的雌 鼠会发生乳腺肿瘤。Moser，A.R.等，Proc Natl Acad Sci USA(1993) 90：8977-81。所述乳腺病变的发生率和多重性可以通过单剂量的乙基 亚硝基脲(ENU)增加，所述ENU是直接作用的烷化剂。用ENU处 理导致90％的B6 ApcMin/+雌鼠平均发生3个乳腺鳞状细胞癌(SCC)， 但是处理后60天内发生很少的增生病变。
遗传背景可以影响这样发生的乳腺病变的发病率、潜伏期和类型。 例如，在处理120天内FVBxBo ApcMin/+雌鼠每只平均发生0.2个乳腺 肿瘤，而每只小鼠发生4个增生。Balb/xB6 ApcMin/+雌鼠每只平均发 生1.8个乳腺肿瘤和0.6个增生。Moser AR，Hegge LF，Cardiff RD. Cancer Research(2001)61：3480-3485。FVBxB6和BALBxBo ApcMin/+ 小鼠发生乳腺SCC和腺癌(AC)。
成像研究：在新戊酸的熔化物中通过同位素交换用125I对NM404 (图3A，100μg)进行放射性碘化。HPLC纯化后，将其溶解于含水的 2％吐温-20溶液中，之后将其经尾静脉注射(15μCi/20g小鼠)进6 只ApcMin/+小鼠中。麻醉并扫描小鼠直至注射后30天，所述扫描是在 改良的Bioscan AR2000放射性-TLC扫描仪(以2分钟采集/道扫描， 增量为2mm以及1mm高分辨率准直器)并且也在ImTek微型CT 扫描仪中进行扫描(390步)用于解剖学比较。用Amira软件显示微 型CT图像。处死时，将乳腺或切取的肿瘤进行离体成像，切取病变， 称重并定量放射性。将病变样品进行组织学分类。如果需要，在CT 扫描前经静脉内注射一种长效CT血池造影剂(BP20)以便促进血管 显影(图14)，所述BP20为发明人试验室开发的并适于长的微型CT 采集时间。Weichert JP等，Radiology(2000)216：865-871。
结果和讨论：该模型是独特的，因为增生的乳腺病变、乳腺癌和 肠腺瘤在同一小鼠中发生。使用NM404的最初的成像结果(图12， 图13)显示了所有自发性乳腺癌中的惊人的摄取(＞20％剂量/g)和 长的保留时间，所述乳腺癌直径在2-15mm变化。尽管肿瘤定位出现 得快，但在身体清除阶段背景放射性在肝脏和肠中持续数天。放射性 尿和粪便的HPLC分析表明存在代谢物并且没有母体NM404。NM404 的肿瘤滞留时间持续了21天(预先确定的研究终点)。然而，NM404 没有定位于在这些小鼠中频繁可见的病灶肺泡增生或肠腺瘤性息肉 (图13)中。微型CT成像证实了所有乳腺肿瘤的存在和精确定位(图 14)。NM404明显被代谢并且从正常细胞清除，但代谢捕获于肿瘤膜 中。
结论：NM404已经在到此为止检查的25/25例动物和人的异种移 植物肿瘤模型中展示了惊人的肿瘤亲和力。而且，尽管其通过在这种 自发性肿瘤模型中的乳腺腺癌和鳞状细胞癌展示了选择性和长时间的 保留，但并没有定位于伴随的病灶肺泡增生或肠腺瘤性息肉中，并因 而表现了对恶性肿瘤细胞的选择性。
实施例5：NM404的选择性保留的机制
导言：某些磷脂醚类似物(例如NM404)长时间地选择性保留在 许多类型的肿瘤细胞内。本发明人试图用酶促测定法和定量PCR测定 的PLD表达来评价NM404在肿瘤细胞中选择性保留的机制，所述酶 促测定法用来评估磷脂酶D(PLD)蛋白的活性。本发明人假设，肿 瘤细胞中降低的PLD水平导致了代谢并排泄NM404能力的降低。
方法：将鼠肿瘤细胞系(包括hepa-1(肝癌)、CT26(结肠直肠腺 癌)和TS/A(乳腺腺癌))的单细胞悬浮物用以下两种测定法分析： (1)AmplexRed测定法，使用商业提供的试剂盒(Molecular Probes)，其用荧光小平板读数仪评估PLD活性，和(2)定量PCR， 用于测定PLD mRNA的水平。将肿瘤细胞系与正常组织比较。对于 AmplexRed测定法，用去垢剂溶液(Triton-X-100)提取总蛋白并 将PLD的量与标准的阳性对照比较。对于PCR，纯化mRNA并用逆 转录酶(Promega)将其转化为cDNA。实时PCR扩增cDNA的条件 包括：50个循环的94℃，30秒；65℃，30秒和72℃，30秒(iCycler， iQmix，Bio-Rad)。使用了以下用于PLD1的引物对：(有义的) 5’-TCTGGTTTCACCCCGTCAGAA-3’(SEQ ID NO：1)，(反义 的)5’-TTGCTCATATCTGCGGCGAT-3′(SEQ ID NO：2)。将产物与 稀释至1μg-10-7μg的标准cDNA(GAPDH，Biosource)比较。所有的 测定一式两份。
结果：定量PLD，如下面表2中显示。在所有测试的细胞系中 PLD蛋白活性和mRNA水平都明显低于正常的肝脏组织(p＜0.05，T- 检验)。
表2
细胞/组织 PLD蛋白活性(mU/ 荧光/微克蛋白质/毫升) mRNA(μg×10-5/ 0.01μg总cDNA) Hepa-1 CT26 TS/A 正常肝脏 3.3 7.8 2.8 14.1 6.2 2.4 4.0 12.2
结论：在鼠肿瘤细胞系中观测到了减少的PLD蛋白活性和降低的 PLD表达。因而，NM404的选择性保留的机制可能是由于明显缺少 存在于恶性肿瘤细胞中的磷脂酶，引起试剂生化上锁在了这些细胞中。 在肿瘤细胞和恶性组织中PLD活性降低也能以作为其它候选抗-肿瘤 试剂的分子靶标起作用。
实施例6：NM404在内源性鼠乳腺肿瘤模型的治疗效果
NM404治疗研究的模型：尽管长期存活对成像研究来说不是必需 的，但对提出的治疗研究是有利的。用于成像研究的模型遭受伴随的 肠肿瘤的折磨，其通常导致动物的死亡。为了增加每只小鼠产生的肿 瘤数目并降低肠肿瘤的数目，希望增加负载肿瘤的小鼠的寿命，将雄 性B6 Min/+小鼠与雌性C57BR/cdJ(BR)小数杂交。得到的BRB6 F1 Min/+雌性小鼠在用ENU处理后比B6 Min/+小鼠产生明显多的乳腺 肿瘤(P＝0.016)，平均接近每只5个。患有肿瘤的小鼠数目和产生 第一个肿瘤的时间在这两个品系间没有差别(分别是P＝1和P＝0.06) (图16)。BRB6 F1小鼠乳腺肿瘤数目的增加可能部分是由于杂交的 BRB6 F1 Min/+小鼠相对B6 Min/+小鼠明显更长的存活时间 (P＝2×10-7)。
B6和BRB6 F1 Min/+小鼠在乳腺表现型上是十分相似的，但是在 对肠肿瘤的易感性上十分不同。可以认为B6和BR品系是对Min诱 导的乳腺肿瘤发生的敏感背景，因为所述小鼠在ENU处理后在短时 间内产生大量的肿瘤。然而，BR品系在影响肠肿瘤产生的修饰基因 基因座上携带显性的抗性等位基因，这可以证明与进一步的治疗考虑 相关。
在Min小鼠中使用NM404的成像结果：在用来显示NM404定位 于内源性FVBxB6 ApcMin/+小鼠乳腺肿瘤的研究中，将两只动物注射 (IV尾静脉)125I-NM404(15μCi)并在注射后1、4和7天在Bioscan AR2000放射性TLC扫描仪(配置有高分辨率的2mm准直器和2-D 采集和分析软件)上成像(图17A、图17B)。在实施安乐死前第10 天对每只动物进行微型CT扫描(图17)，并解剖取出乳腺和相关的 肿瘤。通过肉眼将病灶热点与离体闪烁法图像(图17C)上的所有肿 瘤关联。尽管淋巴结可见，但没有放射性与它们相关联，表明没有肿 瘤细胞浸润。图17C中主要的肿瘤经组织学分类为腺癌。在两只小鼠 上都有4个乳腺肿瘤，并且在切除乳腺的离体闪烁法图像中全部容易 检测。
NM404的放射治疗效果：在最近用“显像”剂量(15-20μCi/20g 小鼠)的125I-标记的NM404进行的小鼠肿瘤摄取和保留研究过程中， 已经观察到了数个明显的治疗反应。在ApcMin/+小鼠乳腺肿瘤模型中， 通常注意到在单次静脉内注射NM404后肿瘤生长保持静止。在注射 后约8天，这些动物中的一些在较大的乳腺肿瘤上也脱掉了所有的毛。 而且，这些小鼠也产生了肠肿瘤并且通常遭受肠出血，其导致严重的 贫血，这使它们的足变白。注意到这些小鼠的足在单次注射NM404 后约5天已经转为粉红色。解剖这些动物显示，在这个阶段通常发现 的预期每只小鼠大约20个肠肿瘤中仅有十分少的数目(如果有的话)。
所述“白色变为粉红色足“的现象也在单独的，但是更侵略性、小 鼠肠腺癌模型中观测到了，其中施用NM404后12天进行解剖，再次 显示，仅有十分少的(如果有的话)预期的肠肿瘤存在，在两种肠肿 瘤模型中，接受了NM404的动物更容易比它们未经处理的同胎伙伴 活得长。这些发现在两个独立的年龄匹配的组中再次得以证实，所述 组中各自多于6只小鼠。用125I-NM404的这些观察结果表明这种化合 物以及131I-NM404作为用于放射治疗应用的试剂的潜力。
同位素的选择：由于其60天的物理半衰期和低能量35KeV光子 发射，125I适于小鼠和大鼠中的成像实验。125I也提供了治疗特性并且 目前用于持久性前列腺近距疗法埋植剂中。在一成像研究中，将2只 裸鼠每只在相对的两胁用皮下鳞状细胞1和6肿瘤细胞移植物接种。 使用SCC 1和SCC 6细胞是因为一个相对另一个是放射敏感的。14 天后当平均肿瘤大小(总共4个)达到直径为0.5cm时，一只小鼠接 受20μCi的125I标记的NM404，另一只以相等的质量剂量接受未标 记的NM404。由于两个肿瘤达到了在我们的动物使用方案中确定的终 止大小限度，仅接受未标记化合物的小鼠必须在注射后20天实施安乐 死。在7周期间，125I-NM404处理的小鼠中两个肿瘤显著地退化(图 18)。实际上，这个小鼠的肿瘤从未达到终止大小并实际上将该小鼠 在80天后实施安乐死以便收集组织学切片。在这时，肿瘤的中心已经 变得坏死而周围边缘看起来稍微有些许活力。组织学检查证实了坏死 的中心和有活力的边缘。虽然血液供给因素可有助于这种观测现象， 但也有可能125I的光子发射在肿瘤边缘导致较差的电子平衡而导致肿 瘤“外壳”给药不足。这种电子平衡问题在放射肿瘤学中是关键的。在 与组织相互作用并发挥它们的生物学作用前，光子传播有限的距离， 这由它们的能量决定的。具有太高能量的光子可以导致肿瘤小结边缘 的给药不足，因为光子在沉积它们的剂量前远离小结传开(离开肿瘤)。 然而，使用125I时，光子具有相对低的能量，确保了相当局部的沉积。 虽然复杂的蒙特卡罗计算法可以改进这种估计，但确定最佳同位素选 择的最好方法是试验，因为有许多起作用的因素，它们不能精确地模 拟(组织分布的细节、多次穿过等)。125I的一个优势是所有的光子 具有低能量，确保了肿瘤周围正常组织十分有限的曝露。
131I已经用于治疗甲状腺癌，其具有极大的效力。十分安全的131I 剂量可以控制分化得很好的甲状腺癌的亚临床沉积，所述甲状腺癌如 同正常的甲状腺，很有亲和力地集中碘。这种主动摄取过程有助于限 制正常组织的剂量。碘-131有β和数种γ发射，但是主要的组织剂量 是产生自β发射。基于甲状腺癌的临床成功，结合在低度淋巴瘤患者 中应用Bexxar(131I-标记的基于抗体的试剂)获得的结果，发明人选 择了131I-标记的NM404。主要的β发射和多数低能量γ发射优化了肿 瘤结节自身内的剂量均匀性。而且，与125I的60天的半衰期比较，更 短的半衰期(8天)提供了更临床相关的剂量-强度。这些因素使得发 明人对这种试剂的效力进行最好的评价。131I的一个潜在缺点是还有 较高能量的γ发射，所述较高能量的γ发射比125I发生的实际上可以 让邻近的周围组织曝露于更多的辐射。这里提出的内源性模型中的肿 瘤位于乳腺的外围并因而应不代表对动物整体健康状况的直接威胁。 因为器官毒性也是试验终点之一，也对周围组织和关键器官系统(骨 髓、肝脏、肾脏、肠、脑等)的反应进行了评估。放射性标记NM404 的组织分布数据和实际的放射剂量测定将确定其最佳的治疗潜力。有 可能在治疗环境中不同的同位素相互补充。
实施例7：使用NM404组合物的双模态虚拟结肠镜检查。
双模态PET/CT虚拟结肠镜检查：人体中的虚拟结肠镜检查，即 通过CT扫描进行的非侵入性扫描过程，据报道比传统的结肠镜检查 更准确。(Pickhardt PJ.等，Computed tomographic virtual colonoscopy to screen for colorectal neoplasia in asymptomatic adults.New England Journal of Medicine.349(23)：2191-200，2003 Dec 4.在传统 的多检测器螺旋CT扫描器上进行的，虚拟结肠检查使得能非侵入地 自动扫描肠腔的肿瘤，但是不能将占位性病变表征为息肉(腺瘤)或 腺癌(恶性)。肿瘤类型的测定十分影响治疗计划和这些患者的治疗 结果。
使用本发明的方法，通过预先施用肿瘤选择性正电子发射剂(如 18F-FDG或124I-NM404)并在混合的CT/PET扫描仪上扫描受试者， 熟练的技术人员可以同时在解剖学检测(CT)和功能性分类(PET) 恶性肿瘤，所述这种方法比通过使用内镜检查方法如结肠镜检查侵入 性更小。因为已知NM404被恶性肿瘤而不是增生的癌前细胞吸收并 选择性地保留长的时间(见图19-图24)，在重构肠腔的虚拟飞行通 过时，在双模扫描的PET组分上恶性肿瘤将展现大量的放射性(发光) 而腺瘤性息肉将不会发光。因而可以区分肠肿瘤类型而不需求助于侵 入性方法如内窥镜检查法。正如上面注意的，放射性标记的磷脂醚类 似物如124I-NM404选择性地保留在恶性肿瘤细胞中并因而显著优于 18F-FDG，所述18F-FDG缺少肿瘤特异性并且已知其除被肿瘤吸收外， 还被炎性位点和增生区域(巴雷特氏食管)吸收。
在小鼠模型中结果证明NM404被恶性肿瘤细胞选择性地吸收和 保留并且已经用微型CT扫描仪在小鼠中进行了虚拟结肠镜检查。目 前在人肺癌患者中对NM404进行评价，早期的结果表明其被吸收并 选择性地保留于这种人癌中，所述吸收和保留方式与先前在25/25个 动物肿瘤模型中展示的方式相似。而且，由于其摄取和延长的选择性 保留于肿瘤中，发明人已经观测到明显的肿瘤退化，所述退化是由于 其在数个不同的小鼠肿瘤模型中的放射治疗效果而致。因而可表征试 剂如放射性卤素标记的NM404的这种特征为“DiapeuticTM”，因为其 既可以检测又可以治疗恶性肿瘤。那么由此得出，用NM404 CTVPET 扫描同时检测并表征肠恶性肿瘤也可以导致随后用治疗剂量的磷脂醚 类似物治疗受试者，所述磷脂醚类似物是例如用选自124I、125I或131I 或其混合物的放射性卤素标记的NM404。
配制成用于静脉内注射的NM404组合物可如上面描述的进行施 用。用于本实施例的方法基本上是描述于Pickhardt，PJ.等， Microcomputed tomography colonography for polyp detection in an in vivo mouse tumor model，Proc.Natl.Acad.USA，2005，102： 3419-3422中的那些方法。所有的动物研究是在由在Wisconsin大学的 Institutional Animal Care and Use Committee of the American Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care提出的批准的指南下进行的。通过将来自C57BL/6J遗传背景的 Ape基因的Min等位基因导到C57BL/6J Tyrc-2J遗传背景上而产生用 于本研究的同类系中，所述基因导入是通过回交10代完成的。在20 只小鼠中这些同类系平均每只产生2.1±0.4(SEM)结肠肿瘤(范围是 0-7)。这些品系代表了好的用于评价微型CT结肠造影的体系，因为 结肠肿瘤的数目与人结肠直肠癌的其它小鼠模型相比相对要高。
总共选取了20只同类系小鼠用于微型CT扫描。在微型CT扫描 前，给所述小鼠任意提供两天的新鲜蔬菜、生的未加盐的葵瓜子和水 的饮食，随后提供樱桃味的NuLYTELY(Braintree Scientific)16小 时。这种饮食方法明显地降低微型CT中由常常在标准的颗粒状鼠食 中发现的骨粉和其它高密度填充物产生的条纹状人为现象。用戊巴比 妥(0.06mg/g体重，i.p.注射)麻醉这20只小鼠(17-22g体重)，施 用由1-1.5ml的玉米油组成的灌肠剂，并用微型CT扫描结肠肿瘤。 在MRI和CT扫描前，用重钡(225 wt/vol％逆向充满肠道。
在直肠施用造影剂后，立刻在俯卧位对麻醉的小鼠进行扫描。在 微型CT扫描仪(Micro-CAT I，ImTek，Knoxville，TN)上用以下成像 参数采集图形：43-kV峰，410μA，390步，20分钟扫描时间。假如 涉及长的采集时间，则不用i.v.施用造影剂，也不用试图去门控对蠕 动或呼吸运动的图像摄取。通过使用反向投影并且没有在合适的 subvolume上进行线束硬化矫正的Shepp-Logan滤波器而将图像数据 重构为256×256×256的三维像素(200-μm空间分辨率)。尽管使用 这些扫描仪可能获得更高的分辨率，实际上，这些采集和重构参数很 容易提供足够充分的空间分辨率而同时使对活的受试者的放射剂量最 小化。CT扫描后立即对麻醉的小鼠实施安乐死。
通过使用商业提供的可视化软件(AMIRA，3.1版，TGS，San Diego)分析来自每只小鼠的微型CT图像数据，所述软件显示所述数 据为2D轴向的、矢状的和冠状的横断面图像。靠近直肠的结肠腔通 过注射器的末端对齐，所述注射器防止显影剂在扫描过程中流出来。 放射学家能够顺着结肠腔从直肠到盲肠。优化用于2D显示的窗口-水 平设置来进行息肉检测，这与用于人中的CT结肠造影的相似。在小 鼠结肠的示意图上标出每个检测到的病变的相对位置和大小以助于将 放射学信息与尸体解剖上回溯性的大致的病理学发现匹配。切开离体 的结肠并摄像以确认结肠肿瘤的形态学存在和位置。
离体小鼠结肠的大致的病理观测用为金标准，将微型CT结果与 之相比较。微型CT扫描后立即杀死小鼠。取出结肠，纵向打开，进 行数码摄像，用PBS洗涤并再次摄像。总共鉴定了41个结肠肿瘤和 33颗粪粒。肿瘤大小在～1mm直到5mm间变化。这种方法提供了同 时将在尸体剖检时观察到的肿瘤和粪粒记录到通过用体内微型CT成 像识别并描绘的那些肿瘤和粪粒的能力。
图19A和图19B是离体小鼠结肠的微型CT表面成像扫描的图像， 图19A从远处显示了突出进入结肠腔的肿瘤100，图19B从较近的有 利位置显示了肿瘤100。
图20A和图20B是麻醉小鼠的对比增强的下胃肠道的高密度表面 表现的微型CT图像，包括平面冠状切片图像110以界标在下肠的结 肠112和盲肠114。由于下肠腔中高的钡浓度，充满钡的下肠的密度 实际上超过了相邻的骨116的密度；由于高密度设置，大多数软组织 从视图中消失。
图21A和图21B是麻醉小鼠的对比增强的下胃肠道的表面表现 (图21A)和透明表现(图21B)的微型CT图像，显示了下肠的结 肠112和盲肠114。图21B还显示了肿瘤117和良性结构，粪粒119 之间的区分。
图22是离体并切开的小鼠结肠120的图像，所述结肠具有直径 3.5mm的肿瘤122。
图23A-B是离体的肠的空肠/回肠的照片(图23A)和相应的闪烁 法图像(图23B)。在施用125I-NM404后3天对患有肠腺癌的Min 小鼠成像。肿瘤130(箭头)测量为9×18mm。
图24A-E是离体的Min小鼠十二指肠(图24A，顶部为胃结合)、 空肠(图24B)、空肠/回肠(图24C)、回肠(图24D)和结肠(图 24E)、放射性标记的NM404的强肿瘤摄取的闪烁法图像。为相同数 量的计数将所有图像标准化。图24C为10cm长。
备选地，在本发明的双模态虚拟结肠镜检查中，可以使用其它形 态学技术如MRI来代替CT扫描与PET结合。图25A显示了3D表 面表现的MRI图像400和3D微PET图像420的重叠，所述图像是 iv注射124I-NM404(100μCi)进入患有CNS-I神经胶质瘤脑肿瘤的大 鼠后24小时获得的。用Amira(v3.1)软件(TGS，Inc.，San Diego，CA) 合并图像。图25B是通过肿瘤420的对照增强的冠状MRI切片410， 图25C显示了重叠的冠状MRI和124I-NM404微PET图像，该图确 证了肿瘤的存在和定位。
应该理解这里描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且提 示本领域技术人员根据它们进行的多种修饰或改变并也将包含在本申 请的精神和范围以及附带的权利要求书的范围内。在此引用的所有出 版物、专利和专利申请通过将它们全文引入本文作为参考。
相关的申请
本申请要求享有2004年7月8日申请的美国临时专利申请 60/521,831的利益，该申请的全部内容为所有目的被引入本文作为参 考。
序列表
<110>Cellectar，LLC
Weichert，Jamey P.
Longino，Marc A.
<120>使用放射性标记的磷脂醚类似物的虚拟结肠镜检查
<130>060438-0011
<150>US 60/521,831
<151>2005-07-08
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<170>Patentln version 3.2
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在美国每年诊断出大约130,000个新的结肠直肠癌病例。因而结 肠直肠癌是第四最常见的癌，每年引起60,000人死亡(Cancer Facts and Figures.American Cancer Society 2001)。治疗主要取决于癌的 阶段，但可以包括手术、放射、化疗和/或射频或冷冻消融术。然而， 对结肠直肠癌患者的常规随访中，对癌胚抗原(CEA)(一种直肠结 肠肿瘤标记物)的测定和重复结肠检查(O′Dwyer PJ等，Follow-up of stage B and C colorectal cancer in the United States and France. Seminars in Oncology 2001；28：Suppl-9)在超过50％的患者中不能检 测出复发的疾病。参见Wichmann MW等，The Colorectal Cancer Study Group；Carcinoembryonic antigen for the detection of recurrent disease following curative resection of colorectal cancer. Anticancer Research 2000；20：4953-4955。因而，需要发展其它的方法 用于检测复发的疾病。
虚拟结肠镜检查是一种在人中通过计算机体层扫描进行的非侵入 扫描操作，已据报道比传统的结肠镜检查更精确。(Pickhardt PJ.等， Computed tomographic virtual colonoscopy to screen for colorectal neoplasia in asymptomatic adults.New England Journal of Medicine. 349(23)：2191-200，2003 Dec 4)。在传统的多检测器螺旋CT扫描器进 行的，虚拟结肠检查使得能非侵入地自动扫描肠腔的肿瘤，但是不能 将占位性病变表征为息肉(腺瘤)或腺癌(恶性)。肿瘤类型的测定 显著地影响这些患者的治疗计划和治疗结果。
而且，在使用RF切除和CT扫描的治疗和诊断过程中很难从CT 扫描获得功能性信息。使用对比增强的螺旋式CT，可在一定程度上 评估肿瘤血管分布，但是不能精确测定活的肿瘤细胞是否仍保留在 RF-切除的病变内。而且，RF产生的热损伤在该操作后直到6个月进 行后操作CT扫描时，通常有一圈炎症围绕它们周围。PET扫描已经 用于跟踪切除后患者，但是这一圈围绕RF热损伤的炎症通常展示出 增加的摄取，甚至是在没有活的肿瘤时。这降低了早期检测复发肿瘤 的灵敏性和特异性。因而对恶性肿瘤细胞有选择性并被其无限保留的 试剂是优选的，这不像氟脱氧葡萄糖(FDG)，所述FDG对肿瘤细 胞是非选择性的并定位于感染性位点和增生(例如巴雷特食管)。此 外含有124I的化合物，其具有4天的物理半衰期并因而可运送到全世 界任何地方，相对FDG是优选的，所述FDG具有110分钟的半衰期 并因而可能仅具有有限的分布，限于生产地点的200英里内。
经历延长的保留时间的化合物(并且不被代谢)的化合物是优选 的，因为当与合适的放射性同位素如125I、131I或211At配合时更可能 它们具有显著的治疗潜力。同样，可用多种碘同位素标记并具有扩展 的多功能性(诊断和治疗以及用于实验动物研究的工具)的化合物是 优于FDG的，所述FDG局限于用18F标记用于PET扫描或潜在地可 用19F(稳定的)标记而用于磁共振成像，尽管是灵敏度水平非常地低。 已公开可用于PET的其它化合物包括124I-或131I-标记的2’-氟-2’-脱氧 -1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-5-碘尿嘧啶(FIAU)、18F-标记的9-[4-氟-3-(羟 甲基)丁基]鸟嘌呤(FHBG)和18F-标记的-9-[3-氟-1-羟基-2-丙氧基甲 基]鸟嘌呤(FHPG)。不考虑它们的肿瘤靶向能力，由于其在肿瘤细胞 中的快速代谢，18F-FDG不具有治疗潜能。因而，需要其它化合物来 研究治疗后的局部复发。
而且，即使当化学疗法是治疗模式时，对化学治疗的反应的改进 的监测是必须的。因此，期望开发用来研究对化学治疗的反应的早期 预后指标，使得医生快速地终止使用无效的化学治疗方案而避免让患 者曝露于延长的治疗的毒性。如果外部光束放射疗法是用于患者的备 选治疗时，其中所述患者具有相似组织学的肿瘤，所述肿瘤可能对用 于治愈目的的外部放射疗法(XRT)产生截然不同的反应。一些用术 前放射进行治疗的患有直肠癌的患者将具有完全的反应，而具有相似 组织学(在光学显微镜水平下)的其它患者将对治疗具有较差的反应 并会复发。对放射的反应是最终控制肿瘤和许多癌(包括许多胃肠癌、 肺癌、脑和颈癌以及妇科癌)存活的预示因素。大多数的反应表征方 法，尽管能十分好的预测反应，但是在治疗完成后进行。尽管一些治 疗期间的临床评估可用于调整治疗(Mayr，N.A.等，Method and timing of tumor volume measurement for outcome prediction in cervical cancer using magnetic resonance imaging.International Journal of Radiation Oncology，Biology，Physics 2002；52；1：14-22)， 在大多情况下没有在实际的治疗过程中预测肿瘤反应的准确方法。这 样的检验方法，特别是可应用于广泛的肿瘤位点或组织学的方法，将 是十分有用的和令人期待的。其它的治疗和诊断方法包括已经提出来 用于预测对治疗的反应的分子测定法，并且最近的成果包括使用DNA 微阵列来鉴定与对治疗有反应或缺少反应相关的基因改变。这些还处 于研究中并且没有处于常规的临床应用中。
还有的其它诊断和治疗方法包括使用成像模态来预测在XRT治 疗过程中的反应。治疗期间的使用FDG的PET扫描正在积极研究中， 其中将放射治疗中途原发性肿瘤的同位素摄取与治疗前的摄取比较。 数个回溯性研究表明，在治疗期间具有持续强摄取的患者比在治疗期 间其肿瘤较不亲和FDG的患者具有更差的肿瘤控制效果(Greven，K. 等，Can positron emission tomography distinguish tumor recurrence from irradiation sequelae in patients treated for larynx cancer？ Cancer Journal Scientifica American 1997；3：353-357)。然而，用于 不同癌的更有效的筛选、诊断和治疗剂以及方法是特别期望的。
令人遗憾的是，常规的成像技术例如计算机体层摄影术(CT)和 MRI(磁共振成像)局限于它们提供对可疑病变的确定诊断的能力， 因为它们仅能观测组织的密度或形态学中的不同。常常还必需更具有 侵入性和费钱的活检步骤来提供确定的诊断。相比较而言，核医学技 术例如正电子发射体层摄影术(PET)和单光子发射体层摄影术 (SPECT)可提供有关特定器官或目标区域的功能或生化信息。然而， 这些核成像技术的成功在很大程度上取决于合适的放射性药物的选择 性摄取和检测。选择性摄取又取决于具有高度靶标组织特异性的放射 性药物的开发。令人遗憾的是，迄今开发的用于肿瘤学应用的定位肿 瘤的试剂仅具有有限的应用。
例如，这些现有技术化合物之一，即67Ga枸橼酸镓，最初确定了 其在肿瘤组织中累积的能力。令人遗憾的是，67Ga枸橼酸镓也可被多 种其它非-肿瘤病变(包括炎性病变)吸收，并且也可以在肝脏和脾脏 中累积不可接受量的放射性。放射性药物在这些器官中的快速积累可 严重干扰附近病变的成像并且也减少了可安全给予患者的剂量。
一种备选的方法已经用来开发针对肿瘤特异性抗原的放射性标记 的单克隆抗体(Mab)。然而，这些单克隆抗体仅对产生它们的特定 的肿瘤组织是特异性的，并因而不会普遍定位于瘤组织中。而且，将 Mab用于诊断性成像已经导致了其它问题，包括抗原表达的可变程 度、低的肿瘤摄取、非特异性结合和不利的免疫原性反应以及通常高 的肝脏定位。
为了解决这些问题，本发明人最近已经鉴定并开发了一系列新的 化合物，所述化合物证实了有用的肿瘤选择性。见例如美国专利Nos. 4,925,649；4,965,391；5,087,721；5,347,030；6,255,519和6,417,384； 在此将它们全部并入本文作为参考。据信，这些放射性碘化的磷脂醚 类似物利用了恶性肿瘤细胞独特的生化特性，即其相对于相应的正常 组织不能代谢磷脂醚类似物的能力。尽管确切的作用机制没有完全弄 清楚，主要的假说认为所述磷脂醚类似物由于恶性肿瘤细胞膜明显缺 少合适的代谢酶而被截留在其中。因此，这些化合物定位于肿瘤细胞 中并在生化上适当地被锁定，用于诊断性和/或治疗性应用。当前可利 用的肿瘤学PET剂(例如18F-FDG)定位于良性病变和炎性位点以及 肿瘤中，因而不是好的恶性肿瘤的指示剂。
因此，在本领域中存在对放射性药物的巨大需要，所述放射性药 物表现出从非靶标性组织的快速清除率以及在血浆中的长的半衰期， 同时仍然保持了它对瘤组织的特异性和亲和力。这种试剂应该不仅有 助于原发性肿瘤和转移肿瘤的非侵入性的成像和表征，不管它们在体 内的定位，而且也应该作为细胞毒性剂的载体用于位点特异性地根除 恶性肿瘤组织，特别当其涉及最频繁诊断的癌形式时。另外也期望放 射性药物对恶性肿瘤而不是对癌前组织(包括腺瘤和增生)是特异性 的。
因此，很容易利用的、可在具有结肠直肠癌的患者中精确鉴定和 潜在治疗早期转移性疾病的放射性药物在分类和对治疗反应方面将对 患者护理具有重要影响。仍然存在对精确的基于肿瘤特异性功能的功 能成像技术的需要，所述功能成像技术可以使用相对便宜和普遍可利 用的成像设备非侵入地筛查整个身体。
发明概述
在优选的实施方案中，本发明提供了使用混合CT/PET扫描的给 出解剖学和功能信息的用于双模态虚拟结肠镜检查的组合物和方法。 在优选的实施方案中，本发明提供了包括放射性标记的肿瘤特异性试 剂的组合物和用于区分良性息肉和恶性肿瘤的方法。优选的放射性标 记的肿瘤-特异性试剂是用卤素放射性同位素标记的磷脂醚类似物。对 于用于使用混合的CT/PET扫描的双模态虚拟结肠镜检查，所述放射 性同位素应该是正电子发射体。特别优选的放射性标记的肿瘤特异性 试剂是124I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱(124I-NM-404)。
在某些实施方案中，本发明提供了用于在受试者消化道的选择区 域区分良性结构和恶性组织的方法，该方法包括以下步骤：提供放射 性标记的肿瘤特异性试剂；将所述放射性标记的肿瘤特异性试剂施用 给受试者；使用第一种技术使具有良性结构和恶性组织的选择区域的 形态学显影；使用第二种技术使由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂 产生的放射性在选择区域内的分布显影；并将选择区域的形态学与在 选择区域内由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的放射性的分布 比较，从而区分良性结构和恶性组织。
第一种技术可以是计算机体层摄影术、磁共振成像、内镜检查或 摄影术。第二种技术可以是正电子发射体层摄影术(PET)、单光子 发射体层摄影术或闪烁显像法。
通常，将选择区域的形态学的显影与由所述放射性标记的肿瘤特 异性试剂产生的放射性分布的显影比较的步骤包括通过重构二维图像 产生三维结构图像的步骤。在优选的实施方案中，比较步骤包括将由 所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的放射性的分布的显影重叠在 选择区域的形态学的显影上。
在特别优选的实施方案中，所述放射性标记的肿瘤特异性试剂具 有治疗功能以及诊断功能。优选地，同样施用所述放射性标记的肿瘤 特异性试剂引起了肿瘤的退化和收缩以及肿瘤的鉴别。在某些实施方 案中，同样施用所述放射性标记的肿瘤特异性试剂最初提供了对可疑 肿块的准确检测、定位和表征，并且当与用治疗性同位素放射性标记 的相同的或不同的肿瘤特异性试剂联合施用时，也可以提供治疗恶性 肿瘤的能力。在其它的实施方案中，本发明提供了用于监测治疗进展 的试剂和方法，其中试剂被肿瘤亲和地摄取。
在优选的实施方案中，所述放射性标记的肿瘤特异性试剂是用卤 素放射性同位素标记的磷脂醚类似物。在优选的实施方案中，所述磷 脂醚类似物共价地连接至放射性卤素上。所述放射性卤素取代基合适 地是18F、36Cl、75Br、76Br、77Br、82Br、123I、124I、125I、131I和211At， 其中18F、76Br、123I、124I优选用于诊断目的而77Br、125I、131I和211At 优选用于治疗目的。用于诊断目的的优选的放射性卤素取代基是124I。 在一些优选的实施方案中，可将共价连接至选自18F、76Br、123I和124I 的放射性卤素上的磷脂醚类似物的混合物与共价连接至选自77Br、 125I、131I和211At的放射性卤素上的磷脂醚类似物混合施用。在某些优 选的实施方案中，共价连接至124I上的磷脂醚类似物的混合物可以与 共价连接至适于治疗目的的放射性卤素的磷脂醚类似物混合施用。合 适的放射性标记的磷脂醚类似物可选自123I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷 酸胆碱、124I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、125I-18-(4-碘苯基)-十 八烷基磷酸胆碱、131I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱及其混合物。 合适的混合物包括124I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱和123I-18-(4- 碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱的混合物、124I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷 酸胆碱和125I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱的混合物或124I-18-(4- 碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱和131I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱的 混合物。
在进一步的优选实施方案中，本发明提供用于在受试者消化道的 选择区域中区分良性结构和恶性组织的方法，该方法包括以下步骤： 提供用卤素放射性同位素标记的肿瘤特异性磷脂醚类似物；将所述用 卤素放射性同位素标记的磷脂醚类似物施用给受试者；用计算机体层 摄影术显影具有良性结构和恶性组织的选择区域的形态学；用正电子 发射体层摄影术显影由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的放射 性的分布；并且将选择区域的形态学与由所述放射性标记的肿瘤特异 性试剂产生的放射性的分布比较，从而区分良性结构和恶性组织。
在另外的实施方案中，本发明提供用于监测治疗受试者中结肠直 肠癌的功效的方法，该方法包括以下步骤：测定结肠直肠癌的治疗前 状况(测定步骤包括：提供放射性标记的肿瘤特异性试剂；将所述放 射性标记的肿瘤特异性试剂施用给受试者；用第一种技术产生具有良 性结构和恶性组织的选择区域的形态学显影；用第二种技术产生由所 述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的放射性的分布的显影；并将选 择区域的形态学显影与由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的放 射性的分布的显影比较)、施用选择的治疗、评估治疗后的状况(该 评估步骤包括：提供放射性标记的肿瘤特异性试剂；将所述放射性标 记的肿瘤特异性试剂施用给受试者；用第一种技术产生具有良性结构 和恶性组织的选择区域的形态学显影；用第二种技术产生由所述放射 性标记的肿瘤特异性试剂产生的放射性的分布的显影；并将选择区域 的形态学显影与由所述放射性标记的肿瘤特异性试剂产生的放射性的 分布的显影比较)和将治疗前的状况与治疗后的状况比较来监测治疗 的功效。
在另外的实施方案中，本发明提供基于磷脂代谢的相对水平区分 选取的组织区域的形态学和功能性亚区域的方法，该方法包括以下步 骤：提供磷脂酶底物，所述底物为放射性卤素标记的磷脂醚类似物； 选择怀疑具有多种形态学上不同的组织亚区域的组织区域，所述组织 亚区域进一步通过磷脂代谢的不同水平区分；将所述组织区域与放射 性卤素-标记的磷脂醚类似接触，其中所述放射性卤素标记的磷脂醚类 似物被吸收并选择性地保留在具有相对较低的磷脂代谢水平的组织的 亚区域中；用第一种技术产生所述选择区域的形态学的表现；用第二 种技术产生由选择性保留的放射性卤素标记的磷脂醚类似物产生的放 射性的分布的表现；并将所述选择区域的形态学表现与放射性的分布 的表现比较，所述放射性由选择性保留的放射性卤素标记的磷脂醚类 似物产生，从而基于磷脂代谢的相对水平区分选择的组织区域的形态 学和功能性亚区域。
在另外的实施方案中，本发明提供了含有诊断有效量的放射性标 记的磷脂醚类似物和药学上可接受的载体的组合物，该组合物被配制 成用于肠胃外施用。磷脂醚类似可以适当地用卤素同位素标记，所述 卤素同位素选自18F、36Cl、75Br、76Br、77Br、82Br、123I、124I、125I、 131I、211At及其混合物，在优选的实施方案中，放射性标记磷脂醚类 似物选自123I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、124I-18-(4-碘苯基)-十 八烷基磷酸胆碱、125I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、131I-18-(4-碘 苯基)-十八烷基磷酸胆碱及其混合物。
在另外的实施方案中，本发明提供了含有治疗有效量的放射性标 记的磷脂醚类似物和药学上可接受的载体的组合物，该组合物被配制 成用于肠胃外施用。所述磷脂醚类似物可适当地用卤素同位素标记， 所述卤素同位素选自18F、36Cl、75Br、76Br、77Br、82Br、123I、124I、 125I、131I、211At及其混合物。在优选的实施方案中，放射性标记的磷 脂醚类似选自123I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、124I-18-(4-碘苯 基)-十八烷基磷酸胆碱、125I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱、 131I-18-(4-碘苯基)-十八烷基磷酸胆碱及其混合物。
在另外的实施方案中，本发明提供磷脂醚类似物在生产用于鉴别 受试者的消化道中恶性组织的放射性药物制剂中的用途。在优选的实 施方案中，本发明提供了磷脂醚类似物在生产用于检测或治疗结肠直 肠癌的放射性药物制剂中的用途。在进一步的实施方案中，本发明提 供了磷脂醚类似物在生产用于双模态虚拟结肠镜检查的放射性药物制 剂中的用途。
附图简要说明
图1A和1B是良性和恶性细胞的不同的磷脂代谢的示意图，假设 对磷脂醚类似物(PLE)的摄取和肿瘤特异性保留有不同的效果。
图2提供了患者03的前胸的闪烁法图像，所述图像是在W施用 1mCi131I-MM324后1、2和6天获得的。在左边小舌肺癌(T)可见 摄取，随时间增加肿瘤与背景的比率。
图3A和图3B提供了三种碘化的磷脂醚类似物的化学结构，所述 磷脂醚类似物称为NM324(图3A)、NM404(图3A和图3B)和NM412 (图3A)。
图4A和图4B说明了在IV施用放射性标记的磷脂醚类似物后， SCID小鼠肿瘤模型中磷脂醚类似物NM404(图4A)和NM324(图4B) 的分布的闪烁显像比较的结果。在其中注意到，大多数的NM324(图 4B)放射性在肠55中发现，并不是在肿瘤50(移植入大腿内)中发 现，而NM404(图4A)正确地识别了在左腿和右腿中的肿瘤50。随 着时间过去，与组织的其它部分比较放射性标记的磷脂醚类似物 NM404变得更有选择性地定位于肿瘤50中，这种现象对于放射性标 记的磷脂醚类似物NM324没有观察到。
图4C显示了IV施用放射性标记的磷脂醚类似物NM404后的闪 烁法图像，该图像显示了所述磷脂醚类似物定位于Copenhagen大鼠 中的Dunning R3327转移的前列腺肿瘤(“tumor”)中，所述大鼠通 过手术去除了原发性肿瘤位点(腿)。在处死后证实有两个淋巴结肿 瘤。
图5是在已经接受了皮下注射CT-26细胞的小鼠中肿瘤生长的图 示。
图6A是离体的CT-26肿瘤50和离体的左和右淋巴结的摄影图 像。图6B是图6A中的离体的肿瘤和淋巴结的闪烁法图像，该图像显 示了定位于肿瘤的显著的放射性60而极少或没有定位于淋巴结的放 射性。图6C是将图6A的数字化闪烁法图像和图6B的数字化闪烁法 图像合并产生的图像，显示了放射性和肿瘤的相关性。
图7A-图7D显示了图6的活小鼠的微型(microCT)图像，该图像 显示了CT-26肿瘤(箭头)的大小和位置。3D-表面表现的像和平面 切片图像显示于图7A和图7B中，而冠状和纵向层面(90μm厚)分 别显示于图7C和图7D中。
图8显示了正常(图8A)和RF-切除的(图8B)CT-26肿瘤的 组织学切片(H&E)的摄影图像。在切除的切片中的细胞已经丧失了膜 的完整性并出现为固缩。
图9显示了注射125I-NM404后10天患有TGF-α肝癌的小鼠的冠 状微型CT扫描的图像(图9A)和背侧的闪烁法图像(图9B)。用 ITG(一种肝细胞选择性CT造影剂)增强了微型CT图像上的肝脏。
图10显示了注射NM404后7天患有CT-26肿瘤的小鼠离体肝脏 的摄影图像(图10A)和闪烁法图像(图10B)。肝脏肿瘤牵涉广泛。 在这次扫描前15天肿瘤移植物出现。也显示了离体切开的肿瘤(T) 和正常的未受累及的肝脏(L)的闪烁法图像(图10C)和摄影图片 (图10D)。
图11A-C表现了与图10A-D中所示的相同的小鼠的微型CT图 像，显示了多个CT26肿瘤的存在。用ITG(一种肝细胞选择性显影 剂)增强肝脏。这些图像在肿瘤细胞植入后10天和在图10B和图10C 的闪烁法图像前5天获得。肿瘤通过箭头标示并且“GB”表示胆囊。
图12B-12D表现了IV施用125I-NM404(15μCi)后在不同时间 获得的患有自发性右腋乳房腺癌(10mm直径)的Min小鼠的闪烁法 图像。图12A是冠状微型CT图像(未进行对照增强)，其用来做解 剖学对照(T＝肿瘤)。
图13A和图13E分别是来自施用NM404后8天的FVBxBoMin 小鼠的离体乳腺和结肠的闪烁法图像。相同的离体乳腺组织和结肠组 织的相应摄影图像分别为图13B和图13D。卡红染色的组织的放大摄 影图像(图13C)显示了增生(箭头)的存在，但是在闪烁法图像(图 13A)中没有发现相应的病灶放射性。在所述闪烁图像(图13A)上 的明亮区80对应图13B中更大的腺癌82。离体结肠的摄影图像(图 13D)和闪烁法图像(图13E)的比较说明在腺瘤性息肉中没有摄取 NM404(参见84和86)。
图14A-C显示了图13A-E中显示的Min小鼠的微型CT扫描图 像。图14A是低密度的表面透视图，显示了大的左轴乳腺肿瘤。图14B 是在施用血池CT显影剂BP1O来帮助定位肿瘤饲养血管后的高密度 的表面透视图。图14C是复合的冠状CT图像和高密度表面透视图， 显示了绝对的饲养血管的定位。在图14C中取向为从底下看，而图14A 和图14B是从上面看。
图15是磷脂醚的酶促代谢途径的示意图。
图16是在不同品系Min/+小鼠中ENU-处理后产生第一个肿瘤的 时间的图示。产生第一个乳房肿瘤的时间表示为ENU后的天数。用 ENU处理雌性Min/+小鼠并每周两次检查乳房肿瘤的存在。对于 B6Min/+(n＝45)(D)、BRB6 Min/+(n＝18)(Δ)、FVBB6 Min/+(n＝18)(0) 的ENU处理后至第一个肿瘤出现的时间以5天间隔进行绘图。
图17A-C显示了FVBxBo Min小鼠的微型CT图像，该图像显示 了大的腋乳腺肿瘤。冠状和轴向切片显示于图17A中，而3D-表面和 冠状切片同时以后(图17B)视图和前(图17C)视图展示。
图18是在注射125I-NM404后0、4、9和41天以时间顺序显示 SCC1和SCC6肿瘤80的一组小鼠背面照片，说明了肿瘤80大小的 减小。
图19A和图19B是离体小鼠结肠的微型CT表面表现扫描的图像， 图19A从远方显示了突进结肠腔中的肿瘤100，图19B从更近的有利 点显示了所述肿瘤100。
图20A和图20B是麻醉小鼠的对比增强的下胃肠道的高密度表面 表现的微型CT图像，平面冠状切片图像110包括界标在下肠的结肠 112和盲肠114的位置。由于下肠腔中高的钡浓度，充满钡的下肠的 密度实际上超过了相邻的骨116的密度；在高密度设置下大多数软组 织从视图中排除了。
图21A和图21B是麻醉小鼠的对比增强的下胃肠道的表面表现的 (图21A)和透明表现(图21B)的微型CT图像，显示了下肠的结 肠112和盲肠114。图21B也显示了肿瘤117和良性结构(粪粒119) 之间的差别。
图22是离体并切开的小鼠结肠120的图像，所述结肠具有直径 3.5mm的肿瘤122。
图23A-B是离体的肠的空肠/回肠切片的照片(图23A)和相应的 闪烁法(图23B)图像。施用125I-NM404后3天使患有肠腺癌的Min 小鼠成像。肿瘤130(箭头)测量为9x18mm。
图24A-E是离体的Min小鼠十二指肠(图24A，顶部为胃结合)、 空肠(图24B)、空肠/回肠(图24C)、回肠(图24D)和结肠(图 24E)的闪烁法图像，放射性标记的NM404的强的肿瘤摄取。为相同 数量的计数将所有图像标准化。图24C为10cm长。
图25A显示了3D表面透视MRI图像400和3D微型PET图像 420的重叠，所述图像是iv注射124I-NM404(100μCi)进入患有CNS-I 神经胶质瘤脑肿瘤的大鼠后24小时获得的。用Amira(v3.1)软件(TGS， Inc.，San Diego，CA)合并图像。图25B是通过肿瘤420的对照增强的 冠状MRI切片410，图25C显示了重叠的冠状MRI和124I-NM404 微型PET图像，该图证实了肿瘤的存在和定位。
优选实施方案的描述
在描述本发明方法之前，应理解本发明不限于描述的特定方法学、 方案、细胞系和试剂，因为这些可以变化。还应该理解，这里使用的 术语目的在于仅描述特定的实施方案，并且不意于限制本发明的范围， 本发明的范围仅由附带的权利要求限制。
必须指出，如这里和在附带权利要求中使用的，单数形式“a”、“an” 和“the”包括复数指代，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，涉 及“细胞”时包括多个这种细胞及其本领域技术人员已知的等价物，等 等。而且，术语“a”(或“an”)、“一个或多个”以及“至少一个”在这里 可以交换使用。还应该注意术语“包含”、“包括”和“具有”可交换使用。
除非另外定义，这里使用的所有技术和科学术语具有的含义与本 发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同。尽管任何与在这里描 述的那些方法和材料类似或等价的方法和材料可用于本发明的实践或 实验，但现在只描述优选的方法和材料。在这里提及的所有出版物并 入本文作为参考，以便描述并公开可结合本发明使用的在所述出版物 中报导的化学试剂、细胞系、载体、动物、仪器、统计分析和方法学。 不应该将本文中的任何内容解释为承认由于先前的发明而本发明没有 权利将这些公开内容提前。
如在这里定义的，术语“异构体”包括但不限于光学异构体及类似 物、结构异构体及类似物、构象异构体及类似物等。在一个实施方案 中，本发明包括使用本发明的肿瘤特异性磷脂醚类似物的不同光学异 构体。本领域那些技术人员将理解，可用于本发明的肿瘤特异性磷脂 醚类似物可含有至少一个手性中心。因此，用于本发明方法的化合物 可能以光学活性形式或外消旋形式存在并分离。一些化合物还可能表 现多晶型现象。
应理解本发明可以包括使用任何外消旋的、光学活性的、多晶型 的或立体异构的形式或其混合物，所述形式具有可用于治疗在此描述 和要求保护的肿瘤相关的疾病的特性。在一个实施方案中，肿瘤特异 性磷脂醚类似物可以包括纯的(R)-异构体。在另一实施方案中，肿 瘤特异性磷脂醚类似物可以包括纯的(S)-异构体。在另一实施方案 中，化合物可以包括(R)和(S)异构体的混合物。在另一实施方案中， 化合物可以包括含有(R)和(S)异构体的外消旋混合物。如何制备光学 活性形式(例如，通过用再结晶技术拆分外消旋形式、通过从光学活 性原料合成、通过手性合成或通过用手性固定相进行色谱法分离)是 本领域熟知的。
“药学上可接受的”意思是指其可用于制备药物组合物，所述药物 组合物一般来说是安全的、无毒性的，并且不会在生物学上和其它方 面上不理想并且包括其可接受用于兽医以及人的药学用途。术语“药学 上可接受的盐”或“前药”包括化合物的盐和前药，所述化合物的盐和前 药，在合理的医学判断的范围内，适合用于受试者而没有过度毒性、 刺激性、变应性反应等等，具有合理的利益/风险比，并且对预期用途 是有效的，以及包括所述化合物的两性离子形式(如果有可能的话)。
本发明化合物的合适的药学上可接受的盐包括酸加成盐，所述酸 加成盐可以例如通过将根据本发明的化合物溶液与药学上可接受的酸 (例如，盐酸、硫酸、甲磺酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯 甲酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸)的溶液混合形成。而且， 当本发明化合物带有酸性部分时，其合适的药学上可接受的盐可以包 括碱金属盐(例如钠盐或钾盐；碱土金属盐如钙或镁盐)以及与合适 的有机配体形成的盐(如季铵盐)。
术语“盐”指化合物的无机和有机盐。这些盐可在化合物的最终分 离和纯化过程中原位制备，或者通过分别将纯化的化合物与合适的有 机或无机酸或碱反应，如果合适，并分离因而形成的盐得以制备。典 型的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、醋酸盐、 草酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸 盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、乙磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸 盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(naphthylate)、甲 磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐和月桂基磺酸盐等。这些盐可包括 基于碱金属和碱土金属的阳离子(例如钠、锂、钾、钙、镁等)以及 非毒性铵、季铵和胺阳离子(包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲 胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等)。还包括具有氨基基团的N- 氧化物的化合物，例如通过与过氧化氢反应产生的化合物。
“前药”表示药理学非活性形式的化合物，所述形式的化合物在施 用后必须通过受试者在体内代谢为药理学活性形式的化合物以便产生 期望的药理学效果。在施用给受试者后，药理学非活性形式的化合物 在生物流体或酶的影响下在体内转化成药理学活性形式的化合物。尽 管对于多数化合物新陈代谢主要在肝脏发生，但是几乎所有的其它组 织和器官，特别是肺，能够进行不同程度的新陈代谢。例如，前药的 新陈代谢可以通过在血液中水解而发生。前药形式的化合物可用于例 如提高生物利用度、掩盖令人不愉快的特性(例如苦味)、改变溶解 度以便静脉内施用或者提供化合物的位点特异性递送。这里提及化合 物包括前药形式的化合物。
对前药用途的讨论由T.Higuchi和W.Stella，“Pro-drugs as Novel Delivery Systems，”Vol.14 of the A.C.S.Symposium Series，和在 Bioreversible Carriers in Drug Design，ed.Edward B.Roche， American Pharmaceutical Association and Pergamon Press，1987提 供。例如，如果化合物包含羧酸官能团，则前药可包括酯，所述酯通 过用基团如(C1-C8)烷基、(C2-C12)烷酰氧甲基、有4-9个碳原子 的1-(烷酰氧基)乙基、有5-10个碳原子的1-甲基-1-(烷酰氧基)- 乙基、有3-6个碳原子的烷氧基羰氧基甲基、有4-7个碳原子的1-(烷 氧基羰氧基)乙基、有5-8个碳原子的1-甲基-1-(烷氧基羰氧基)乙 基、有3-9个碳原子的N-(烷氧基羰基)氨甲基、有4-10个碳原子的 1-(N-(烷氧基羰基)氨基)乙基、3-酞基，4-巴豆内酯基 (4-crotonolactonyl)、γ-丁内酯-4-基、二-N，N-(C1-C2)烷基氨基 (C2-C3)烷基(如β-二甲基氨乙基)、氨甲酰基-(C1-C2)烷基、N， N-二(C1-C2)烷基氨甲酰基-(C1-C2)烷基和哌啶基-、吡咯烷基-或 吗啉代(C2-C3)烷基置换酸基团的氢原子形成。
类似地，如果化合物包含醇官能团，则前药可通过用下列基团取 代醇基团的氢原子形成，所述基团如(C1-C6)烷酰氧基甲基、1-(C1-C6) 烷酰氧基)乙基、1-甲基-1-(C1-C6)烷酰氧基)乙基、(C1-C6)烷 氧基羰氧基甲基、N-(C1-C6)烷氧基羰基氨甲基、琥珀酰基、(C1-C6) 烷酰基、α-氨基(C1-C4)烷酰基、芳酰基和α-氨酰基或α-氨酰基-α- 氨酰基，其中每个α-氨酰基独立地选自天然存在的L-氨基酸、P(O) (OH)2、P(O)(O(C1-C6)烷基)2或糖基(该基团通过去除半 缩醛形式的碳水化合物的羟基产生)。
如果化合物包含胺官能团，则前药可通过用基团例如R-羰基、RO- 羰基、NRR′-羰基置换胺基中的氢原子形成，其中R和R′每个独立地 是(C1-C10)烷基、(C3-C7)环烷基、苄基或者R-羰基是天然α-氨 酰基或天然的α-氨酰基-、-C(OH)C(O)OY(其中Y是H、(C1-C6) 烷基或苄基)、-C(OY0)Y1(其中Y0是(C1-C4)烷基而Y1是(C1-C6) 烷基、羧基(C1-C6)烷基、氨基(C1-C4)烷基或单-N-或双-N，N- (C1-C6)烷基氨烷基、-C(Y2)Y3(其中Y2是H或甲基并且Y3是 单-N-或双-N，N-(C1-C6)烷基氨基、吗啉代、哌啶-1-基或吡咯烷-1- 基。
如果根据本发明的化合物具有至少一个不对称中心，它们因而可 以作为对映体存在。当根据本发明的化合物具有两个或更多个不对称 中心时，它们又可作为非对映异构体存在。应理解所有的这些异构体 及其任何比例的混合物都包含在本发明的范围内。
本发明还包括在这里描述的化合物的氨基取代基的N-氧化物。药 学上可接受的盐还可以通过用无机碱(例如氢氧化钠)处理而从酚类 化合物制备。而且，所述酚类化合物的酯可用脂族和芳族羧酸制备， 例如乙酸和苯甲酸酯。
本发明进一步包括使用所述肿瘤特异性磷脂醚类似物的衍生物的 方法。术语“衍生物”包括但不限于醚衍生物、酸衍生物、酰胺衍生物、 酯衍生物等。另外，本发明进一步包括使用所述肿瘤特异性磷脂醚类 似物的水合物的方法。术语“水合物”包括但不限于半水化物、一水化 物、二水化物、三水合物等。
本发明进一步包括使用所述肿瘤特异性磷脂醚类似物的代谢产物 的方法。术语“代谢产物”意思是指通过新陈代谢或代谢过程从另一种 物质产生的任何物质。
如在这里定义的，“接触”意思是指将用于本发明的肿瘤特异性磷 脂醚类似物引入至试管、烧瓶、组织培养物、芯片、阵列、板、微量 滴定板、毛细管等中的含有细胞或组织的样品上，并在足以允许肿瘤 特异性磷脂醚类似物结合受体或嵌入膜内的温度下和时间内孵育。用 于将样品和所述肿瘤特异性磷脂醚类似物或其它特异性结合成分接触 的方法是本领域那些技术人员已知的，并且可根据要进行的测定方案 类型来选择。孵育方法也是标准的并且是本领域技术人员已知的。
在另一个实施方案中，术语“接触”意思是指将用于本发明的肿瘤 特异性磷脂醚类似物引入进接受治疗的受试者中，并且允许所述化合 物在体内接触。在进一步的实施方案中，术语“接触”意思是指将用于 本发明的肿瘤特异性磷脂醚类似物引入需要筛查肿瘤的受试者中，并 且允许该化合物在体内接触。
如此处使用的“药学上可接受的”酯或盐意思是指活性成分的酯或 盐形式，所述活性成分与药物组合物的任何其它成分是相容的并对施 用该组合物的受试者是无害的。术语“药学上可接受的盐”或“前药”包 括化合物的盐和前药，所述化合物的盐和前药，在合理的医学判断的 范围内，适合用于受试者而没有过度的毒性、刺激性、变应性反应等 等，具有合理的利益/风险比，并且对预期用途是有效的，以及包括所 述化合物的两性离子形式(如果有可能的话)。
“治疗有效量”意思是指当施用给受试者用于治疗疾病时，足够实 现该疾病的治疗的化合物的量。“治疗有效量”将根据化合物、受治疗 的疾病状态、受治疗疾病的严重性、受试者的年龄和相对健康、施用 的路径和形式、主治的医学或兽医从业者的判断和其它因素而变化。
“诊断有效量”意思是指化合物的量，当施用给受试者用于筛选肿 瘤时，所述量足以产生良性结构和恶性肿瘤之间可检测的区别。“诊断 有效量”将根据化合物、要检测的状况、状况的严重性、受试者的年龄 和相对健康状态、施用的路径和形式、主治的医学或兽医从业者的判 断和其它因素而不同。
对本发明来说，“治疗”描述了对受试者的处理和护理以便对抗疾 病、病症或障碍。该术语包含预防性的治疗和治标治疗。治疗包括施 用本发明的化合物来预防症状或并发症的发作、减轻症状或并发症或 消除疾病、病状或障碍。
将活性化合物施用至细胞的形式不是关键，活性化合物仅需要到 达细胞(直接地或间接地)。本发明包括制备和使用药剂和药物组合 物，所述药剂和药物组合物含有在此描述的化合物作为活性成分。
将本发明化合物以诊断有效量或治疗有效量施用给受试者。本发 明的化合物可以单独施用或作为药学上可接受的组合物的一部分施 用，而且，化合物或组合物可以一次全部施用(例如，通过一次性推 注)、多次施用(例如通过一系列片剂)或在一段时间内实质均匀地 递送(例如采用透皮给药法)。还应该注意化合物的剂量可随时间而 不同。本发明的化合物可使用即时释放制剂、控制释放制剂或其组合 来施用。术语“控制释放”包括持续释放、延迟释放及其组合。在优选 的实施方案中，将本发明的磷脂醚类似物与药学上可接受的载体组合 以产生用于肠胃外施用的药物制剂。
本发明的药物组合物可以作为单个单位剂量或作为多个单一单位 剂量大批制备、包装或销售。在这里使用的，“单位剂量”指离散量的 药物组合物，所述药物组合物含有预定量的活性成分。活性成分的量 通常等于将施用给受试者的活性成分的剂量，或者等于该剂量的合适 分数，例如该剂量的二分之一或三分之一。
如在这里使用的，术语“治疗”包括预防以及病症缓解性治疗。如 在这里使用的，术语“减轻”、“压制”和“抑制”具有它们通常被理解的 意思，即减轻或降低。如此处使用的，术语“进展”意思是指范围或严 重性增加、提升、增长或变坏。如此处使用的，术语“复发”意思是指 疾病缓和后的恢复。
如此处用的，术语“施用”指使患者、组织、器官或细胞与根据本 发明的肿瘤特异性磷脂醚类似物接触。如此处使用的，施用可以在活 体外(即试管中)完成，或在体内即在活生物(例如人)的细胞或组 织内完成。
在某些实施方案中，本发明包括将本发明中有用的化合物施用给 非-人或人受试者。“受试者”意思是指哺乳动物和非哺乳动物。“哺乳 动物”意思是指哺乳纲的任何成员，包括但不限于人、非-人灵长类如 猩猩和其它猿以及猴种；农场动物例如牛、马、绵羊、山羊和猪；家 畜例如兔、狗和猫；实验室动物包括啮齿动物如大鼠、小鼠和豚鼠等。 非哺乳动物的实例包括但不限于禽类等。术语“受试者”不表示特定的 年龄或性别。
如此处使用的，“药物组合物”意思是指与合适的稀释剂、防腐剂、 增溶剂、乳化剂和佐剂(统称“药学上可接受的载体”)一起的治疗有 效量的肿瘤特异性磷脂醚类似物。如此处使用的，术语“有效量”、“诊 断有效量”和“治疗有效量”指足以产生预期效果而无过度的不利副作 用例如毒性、刺激性或过敏反应的活性剂的量。特定的“有效量”将明 显地随这些因素而变化，例如诊断或治疗的具体病症、受试者的身体 健康状况、受试者物种、治疗持续时间、同时进行的疗法的性质(如 果有的话)以及采用的特定制剂和该化合物或其衍生物的结构。在这 种情况下，如果某一量导致下列情况的一个或多个：(a)预防疾病(例 如结肠直肠癌)；和(b)该疾病的逆转或稳定，则认为该量是治疗 有效的。最佳有效量可由本领域普通技术人员使用常规实验很容易测 定。
药物组合物是液体或冻干的或其它方式干燥的制剂，并且包括不 同缓冲容量(例如，Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的 稀释剂、添加剂例如防止吸附表面的白蛋白或明胶、去垢剂(例如吐 温20TM、吐温80TM、Pluronic F68TM、胆汁酸盐)、增溶剂(例如甘 油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂 (例如ThimerosalTM、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、膨胀物质或张力 调节剂(例如乳糖、甘露醇)、将聚合物例如聚乙二醇共价连接至蛋 白质、与金属离子的络合，或将物质整合至聚合化合物例如聚乳酸、 聚乙醇酸、水凝胶等的颗粒制剂中或其上，或者整合在脂质体、微乳 剂、胶束、单层或多层囊、红细胞血影或球形体上。这种组合物将影 响物理状态、溶解性、稳定性、体内释放的速率和体内清除速率。控 释或缓释组合物包括亲脂贮库(例如脂肪酸、蜡类、油类)中的制剂。
本发明还包括施用颗粒组合物的方法，所述颗粒组合物用聚合物 (例如泊洛沙姆或poloxamine)包被。组合物的其它实施方案包括微 粒形式保护性涂层、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂以用于不同的施用路 径，包括局部的、肠胃外的、肺的、鼻的和口的。在一个实施方案中， 药物组合物经肠胃外、癌侧(paracancerally)、透粘膜、透皮、肌内、 静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内和瘤内施用。
此外，如在此使用的“药学上可接受的载体”是本领域技术人员熟 知的并包括(但不限于)0.01-0.1M并优选为0.05M的磷酸盐缓冲液 或0.9％的盐水。此外，这种药学上可接受的载体可以是含水或非水 溶液、混悬剂和乳剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油 例如橄榄油以及可注射有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、含酒精/ 含水溶液、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。
肠胃外载体包括氯化钠溶液、复方氯化钠葡萄糖、葡萄糖和氯化 钠、乳酸林格氏注射液和不挥发油。静脉内载体包括流体和营养补给 液、电解质补给液如基于复方氯化钠葡萄糖的那些等。还可以存在防 腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、对照剂、惰性气体 等。
根据本发明可施用的控释或缓释组合物包括在亲脂贮库(例如脂 肪酸、蜡类、油类)中的制剂。本发明还包括用聚合物(例如泊洛沙 姆或poloxamine)包被的微粒组合物和连接至对抗组织特异性受体的 抗体、配体或抗原的化合物或连接至组织特异性受体的化合物。
根据本发明施用的组合物的其它实施方案包括颗粒形式、保护性 涂层、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂用于不同的施用路径，包括肠胃外、 肺、鼻和口。
已知用水溶性聚合物例如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚 物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸 共价连接修饰的化合物在静脉内注射后表现出在血液中比相应未修饰 的化合物实质更长的半衰期(Abuchowski等人，1981年；Newmark 等人，1982年；和Katre等人，1987年)。这种修饰还可以增加化合 物在含水溶液中的溶解度、消除聚集、增强化合物的物理和化学稳定 性，并极大地减少了化合物的免疫原性和反应性。因而，与使用未经 修饰的化合物比较，期望的体内生物活性可通过以较低频率或较低剂 量施用这种聚合物-化合物来获得。
还在根据本发明的另一种方法中，药物组合物可在控释系统中递 送。例如，试剂可采用静脉内输注、可植入的渗透泵、透皮贴剂、脂 质体或其它施用方式施用。在一个实施方案中，可使用泵(见Langer、 上文；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald 等人，Surgery 88：507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574 (1989))。在另一个实施方案中，可使用聚合材料。还在另一个实施 方案中，可将控释系统置于治疗靶点(例如肝脏)附近，从而只需要 全身剂量的一部分(见，例如Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，上文，vol.2，pp.115-138(1984))。其它控释系统 在Langer的综述中讨论(Science 249：1527-1533(1990))。
药物制剂可以只包含肿瘤特异性磷脂醚类似物，或可以进一步包 含药学上可接受的载体，并且可以是固体或液体形式例如片剂、散剂、 胶囊剂、丸剂、溶液、混悬剂、酏剂、乳剂、凝胶剂、乳膏剂或栓剂 (包括直肠和尿道栓剂)。药学上可接受的载体包括树胶、淀粉、糖、 纤维素物质及其混合物。含有肿瘤特异性磷脂醚类似物的药物制剂可 以通过例如皮下植入丸剂来施用给患者。在进一步的实施方案中，丸 剂在一段时间内提供了肿瘤特异性磷脂醚类似物的控制释放。制剂还 可以通过静脉内、动脉内或肌内注射液体制剂、口服液体或固体制剂， 或者通过局部应用来给药。施用还可以通过使用直肠栓剂或尿道栓剂 来完成。
根据本发明可施用的药物制剂可通过已知的溶解、混合、制粒或 药片形成步骤来制备。对于口服施用，将肿瘤特异性磷脂醚类似物或 它们的生理耐受衍生物例如盐、酯、N-氧化物等与通常用于该目的的 添加剂(例如赋形剂、稳定剂或惰性稀释剂)混合，并通过惯用方法 将其转化成合适的施用形式，例如片剂、包衣片剂、硬或软明胶胶囊、 含水、含酒精或油性溶液。合适的惰性赋形剂的实例是常规的片剂基 质，例如与粘合剂(如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶)组合、与崩解剂 (如玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸)组合，或与润滑剂(如硬脂酸或 硬脂酸镁)组合的乳糖、蔗糖或玉米淀粉。
合适的油性赋形剂或溶剂的实例是植物或动物油例如向日葵油或 鱼肝油。制剂可作为干颗粒和湿颗粒实施。对于肠胃外施用(皮下、 静脉内、动脉内或肌内注射)，将肿瘤特异性磷脂醚类似物或它们的 生理耐受衍生物例如盐、酯、N-氧化物等转化成溶液、混悬剂或排出 剂，如果需要，与习惯使用的并适于该目的的物质(例如增溶剂或其 它佐剂)一起。实例是加入了或未加入表面活性剂和其它药学上可接 受的佐剂的无菌液体例如水和油。示例性油是石油、动物、植物或合 成来源的，例如花生油、大豆油或矿物油。通常，水、盐水、含水葡 萄糖和相关的糖溶液，以及二元醇类例如丙二醇或聚乙二醇是优选的 液体载体，特别用于可注射的溶液。
含有活性成分的药物组合物的制备是本领域十分清楚的。这种组 合物可制备成递送至鼻咽的气溶剂或制备成可注射剂(液体溶液或混 悬剂)；然而，也可以制备在注射前适于溶解或悬浮于液体中的固体 形式。还可以乳化所述制剂。活性治疗成分通常与赋形剂混合，所述 赋形剂是药学上可接受的并与活性成分相容。合适的赋形剂是例如水、 盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等或它们的任意组合。
而且，组合物可包含小量的辅助物制，例如润湿剂或乳化剂、pH 缓冲剂，所述辅助物质能增强活性成分的有效性。
可将活性成分配制进组合物中，作为中和的药学上可接受的盐形 式。药学上可接受的盐包括酸加成盐，所述酸加成盐用无机酸例如盐 酸或磷酸，或者有机酸例如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。从 游离羧基形成的盐也可以源于无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧 化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙 氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
对于使用例如乳膏剂、凝胶剂、滴剂等局部施用至体表，肿瘤特 异性磷脂醚类似物或它们的生理耐受衍生物例如盐、酯、N-氧化物等 可在有或无药用载体的生理可接受稀释剂中作为溶液、混悬剂或乳剂 制备并施用。
在根据本发明的另一种方法中，活性化合物可在小囊泡，特别在 脂质体中递送(见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等， in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez- Berestein and Fidler(eds.)，Liss，N.Y.，pp.353-365(1989)； Lopez-Berestein，同上.，pp.317-327；通常见同上)。
通常，NM404是有希望的新的肿瘤选择性诊断显像剂，用于监测 数种肿瘤治疗模态的治疗反应。放射性碘化的NM404(第二代磷脂醚 类似物)已经在10/10个异种移植物肿瘤模型中以及更近期在另外的 17/17个自发性啮齿动物肿瘤模型中显示出显著的肿瘤选择性。由于在 肿瘤细胞的膜中缺少代谢磷脂酶，这种方法普遍的假说是，由于它们 不能被代谢和消除，磷脂醚类似物全部截留于肿瘤细胞膜中。因而， 正常细胞与有活力的肿瘤细胞不同的磷脂醚清除速率形成了这种概念 的基础。在多种肿瘤模型中获得的结果表明，NM404受有活力的恶性 肿瘤细胞螯合并得以选择性地保留，并且定位于原发病灶和与解剖学 位置无关的转移病灶处，包括淋巴结中发现的那些病灶。与FDG不 同，这种试剂不定位于感染性位点。NM404优于FDG的其它优点包 括如下：NM404对恶性肿瘤细胞有选择性并被恶性肿瘤细胞无限期保 留，而FDG对肿瘤细胞无选择性并定位于感染性位点和增生(巴雷 特食管)。而且，由于124I具有4天的物理半衰期，其能运送至世界 的任何地方，而FDG具有110分钟的半衰期，可能受限制地分布于 产地的200英里内。NM404经历长的保留(不发生代谢)并因而当与 合适的放射性同位元素(如131I或125I)配合时可提供显著的治疗潜力， 而FDG不具有任何治疗潜力。NM404可用多种碘同位素标记，扩展 了它的多功能性(诊断和治疗以及用于实验动物研究的工具)，而FDG 局限于18F用于PET扫描或潜在地可用19F(稳定)标记用于磁共振 成像)，尽管是灵敏度水平十分低。不考虑它们的肿瘤靶向能力，由 于其在肿瘤细胞中的快速代谢，其不具有治疗潜能。NM404提供了不 仅精确预测对多种治疗模态的局部肿瘤反应的潜力，而且在治疗不足 的原发性肿瘤治疗的情形下，还使得能检测远距离转移病灶。
具体对双模态虚拟结肠镜检查来说，当在混合的CT/PET扫描仪 上进行时，NM404或其磷脂醚(PLE)类似物之一在通过PET或 SPECT成像而单独使用或与基于虚拟结肠镜检查的CT组合使用时， 提供了对肠病灶的非侵入检测和表征潜力。而且，如果通过摄取 NM404或其PLE类似物至肠病灶内证实恶性肿瘤的话，则当用治疗 性放射性卤素标记时，其可随后用作治疗剂。作为第三个用途，NM404 可用于在常规治疗范例后监测结肠癌或肠癌患者的肿瘤反应。由于其 仅由恶性肿瘤细胞摄取并选择性保留，可将其在常规治疗后施用，并 且通过PET或PET-CT成像对肿瘤细胞的整体性非侵入性地进行评 估。在最初的肿瘤位点定位将意味着还剩余有功能的肿瘤细胞，而最 初的肿瘤位点缺少放射性则意味着治疗成功。如果结肠镜配备有合适 的辐射探测器，它还将有助于传统的结肠镜检查。
NM404对恶性细胞(迄今27/27类型)有选择性，这与FDG不 同，已知FDG还定位于增生细胞和炎性位点。我们已经显示，在大 鼠Carageenan测定法中，磷脂醚类似物如NM404及其前体物NM324 都不定位于炎性病灶。NM404选择性地保留于恶性细胞中并且由于其 能用任何卤素标记而具有很大的治疗潜力，这与FDG不同，所述卤 素包括所有碘同位素，其中碘同位素包括具有治疗性发射的那些碘同 位素(125I、131I以及卤素砹-211，其也是具有非常类似碘的化学特性 的卤素)。
NM404不穿过完整的血脑障碍并因而在脑肿瘤检测中比FDG更 好，FDG当然可很好地位于正常的脑组织中从而限制了它在脑肿瘤检 测中的使用。
用碘-124标记的NM404可以在一处生产并运送至世界的任何地 方，这与18F-FDG不同，18F-FDG由于其110分钟的物理半衰期而具 有有限的递送范围，并因而需要许多产地。
相对于用碘-124标记的其它肿瘤学PET试剂(如124I-FIAU)， NM404碘由于其芳族C-I键合结构而对于体内脱碘作用更稳定得多。 已知许多含有脂族碘的其它物质(包括FIAU)在注射后迅速脱碘。
虽然FDG允许在注射后扫描45分钟，但使用NM404则可以等 待更长，由于在肿瘤中渐进性浓度而提高了对比。在临床实践中，由 于NM404对恶性肿瘤有特异性，则直到24或48小时的成像延迟时 间不是问题。由于PET的体层摄影特性，对于肿瘤在6小时内扫描是 可能的。
在许多实验肿瘤模型中，NM404已经证明了对瘤组织而不是肿瘤 前组织有显著特异性。高的肿瘤对背景亲合力以及NM404的肿瘤选 择性表明，其比18F-FDG PET扫描有可能更好地用于治疗期间肿瘤成 像。NM404的肿瘤特异性的确切机制正在研究中，并且目前没有像 18F-FDG摄取的葡萄糖利用机制那样得到很好描述。不能完全确定 NM404在瘤组织中的摄取和选择性保留是否取决于该组织的生存能 力，或者这种摄取现象是否与不依赖于组织生存能力的一些膜或基质 成分相关。如果这种摄取和特异性与肿瘤生存能力有联系，则由此得 出刚刚通过辐射灭菌的肿瘤中NM404摄取将不存在或很低，而抗辐 射的肿瘤将显示持续的摄取。最近，本发明人在裸小鼠中证明了 NM404摄取和放射敏感的和抗放射性鳞癌细胞(SCCl和SSC6)两者 中的杀死作用。这种测定法可用于管理用放射疗法治疗的患者，因为 没有表现出治疗后NM404定位的患者将表示治疗成功，而对具有抗 性肿瘤(持续摄取NM404)的患者可以提供其它的非放射性选择(手 术、化学疗法等)。
开发灵敏的、更可利用的成像检查的一种方法是设计载体分子， 所述载体分子能选择性递送放射性药物探针至目的靶标组织。本发明 人的方法已经利用了显示出高度组织或肿瘤选择性的分子的独特生物 化学或药理学特性。
Snyder和同事观察到，多种动物和人肿瘤细胞在细胞膜中含有比 正常组织更高得多浓度的天然存在的醚脂质。见Snyder F，Wood R. Alkyl and alk-1-enyl ethers of glycerol in lipids from normal and neoplastic human tissues.Cancer Research.1969；29：251-257：Snyder F，Blank ML，Morris HP.Occurrence and nature of o-alkyl and o- alkyl-1-enyl moieties of glycerol in lipids of Morris transplanted hepatomas and normal rat livers.Biochem Biophys Acta.1969； 176：502-510。这些作者认为，醚脂质在肿瘤中的积聚是肿瘤细胞由于 缺少关键的代谢酶而使代谢这些脂质的能力较低的结果。本发明人利 用了这种观测结果，通过合成多种放射性碘化的磷脂醚(PLE)类似 物作为潜在的肿瘤选择性显像剂。数种PLE类似物已经显示出惊人且 明显普遍的能力，所述能力是能够定位并选择性地保留于多种多样的 自发性的和移植的大鼠、鼠类和人肿瘤模型(25/25)中。
工作原理的假设(图1)是，磷脂醚由于它们不能被代谢和消除 而截留于有活力的肿瘤细胞膜中。这种假设受到下面报导的酶促活性 和表达研究的实验结果的支持。典型的代谢酶包括磷脂酶A2(PLA2)、 磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)。施用放射性碘化的磷脂醚试 剂后提取肿瘤显示只存在完整的试剂，而对尿和粪便的分析仅显示代 谢产物。虽然不愿局限于特定假设或作用机制，但这些结果和下面描 述的那些结果表明，正是磷脂醚从正常细胞相对于从肿瘤细胞的不同 清除速率，以及细胞磷脂代谢的根本不同形成了本发明磷脂醚类似物 的肿瘤特异性的基础。
在超过25种异种移植物和自发性肿瘤模型中获得的初步结果(表 1)显示，在检测的所有肿瘤中NM404经历了选择性摄取和长的保留。 因为所述试剂在肝脏中在一定程度上被代谢，由于高的肝脏本底放射 性水平本发明人避免在肝脏肿瘤模型中进行早期的化合物评估。进一 步，因为NM404产生比其前体物更低的肝脏本底水平，根据给患有 HCC的患者显像已经成为问题这一事实，本发明人把评估扩展到肝脏 肿瘤中。许多患者具有潜在的肝硬变并因此很难在横断层面成像上区 分再生小结和HCC。而且，评估使用FDG的PET扫描的初步研究已 经显示，在检测该疾病中仅有20-50％的灵敏性。Verhoef C等，Liver (2002)22：51-56。而且，PET FDG不能用于在脑中的诊断筛选。同样， 由于肝细胞的高的自然摄取FDG不能用于评估肝脏中的疾病。
下列实施例描述了本发明的多个方面。仅为了示例目的描述这些 实施例而且不应该认为是缩小或限制本发明范围。
实施例1：NM404的合成、放射性标记和制剂
合成方法基于用于烷基链延长格利雅试剂与烷基甲苯磺酸酯或卤 化物的铜催化的交叉-偶联反应(见下面的方案)。合成从对-碘苄基 醇1开始，通过与三甲基硅烷基溴反应将所述醇1转化为对-碘苄基溴 2，在存在Li2CuCl4作为催化剂时将对-碘苄基溴2进一步与格利雅试 剂3偶联。将第一个偶联产物4去保护后获得的12-(对-碘苯基)十 二烷醇5转化为甲苯磺酸酯6。在接着的步骤中，将甲苯磺酸酯6与 含有6个碳原子的格利雅试剂7偶联，这完成了链的延伸步骤。将8 进行THP去保护得到18-(对-碘苯基)十八烷醇9，通过如下面方案中 显示的两步程序将其转化为10(NM404)。
进一步，用于用任意同位素(如果是碘，则包括124I、125I和131I) 标记NM404的快速高产率合成方法通过以下步骤进行：
首先，将铝加热器装置预加热至145℃并用一个5ml一次性注射 筒制备冷凝器，所述注射筒在顶部安装有弯曲的1.5英寸18ga一次性 针头和橡胶隔片。
第二步，初始化HPLC系统并用过滤过的脱气的溶剂(己烷/异丙 醇/水(40∶52∶8))充满容器。平衡该系统，随后系统地检查辅助系统 如泵、检测器、图表记录器和计算机积分仪。
第三步，通过在底端使用玻璃棉塞、将注射器用颗粒状的活性炭 充满2.5ml、在顶部加入另一玻璃棉塞并插入一隔膜而制备3ml的一 次性注射器活性炭阱。将一短的管形接头针头装在该注射器上并将一 18-ga针头插进顶部的隔膜。将所述炭阱连接至冷凝器的顶部并通过 硫代硫酸钠阱与大气相通。
第四步，将5mg硫酸铵加进2ml硼硅玻璃的V形小瓶中的20μl 去离子水中，然后将20μl无水乙醇中的20μg未标记的NM404加 至该小瓶中。轻轻搅动或晃动该小瓶以确保混合，并将6个硼硅玻璃 珠(3mm)也加入至该小瓶中。然后用涂有Teflon的丁基橡胶隔片 和铝卷曲盖密封。用18-ga针头穿刺该隔片并将期望量的含水碘化钠 -131(在0.1 N NaOH，通常是15μl中5mCi)通过哈密顿微量注射 器穿过隔片加入。再次轻轻搅动或晃动小瓶以确保混合。在剂量校准 器中测定该小瓶。
第五步，将活性炭阱注射器插入进所述反应小瓶中并将该反应小 瓶放入进加热器孔(用沙填充一半)中。在145℃下将反应小瓶加热 40分钟，在此期间大多数溶剂被蒸发并在冷凝器中凝结。用25-ml的 注射器将气流(4×25ml)缓慢地注入进该反应小瓶中。将反应小瓶 的温度升至155℃并继续另外加热30分钟。从所述块式加热器移开该 反应小瓶并且拆开冷凝器/阱部件并丢弃，让小瓶冷却至室温。
第6步，将0.5ml无水乙醇加入至所述反应瓶中。轻轻地搅动小 瓶并在剂量校准器中测定。
第七步，在硅胶(氯仿/甲醇/水(65/35/4))上进行粗的标记产 物的放射-TLC分析。
第8步，通过在5ml的无水乙醇中预先浸泡1.0g树脂30分钟制 备Amberlite IRA 400树脂柱。倾析出乙醇并用两份另外的5ml乙醇 冲洗树脂。将湿的树脂加进3ml的底部有一玻璃棉塞并装上Acrodisc 滤器和2通连接阀的一次性注射筒中。将粗的放射性碘化产物的乙醇 溶液逐渐地通过所述树脂柱洗脱进5ml小瓶中。
第9步，插入隔板并用氮气流吹去溶剂。在开始通入氮气流前将 活性炭注射器连接在瓶的出口。一旦干燥后，将50μl乙醇用于稀释 并将内容物转移至300μlv形瓶中。另外用50μl乙醇冲洗源小瓶并转 移至所述v形瓶中。
第10步，使HPLC泵稳定并建立1.0ml/分钟的溶剂流量。在 Perkin-Elmer筒硅胶柱(4.3×33mm，3μm二氧化硅)上通过HPLC 纯化该反应混合物，所述柱用己烷/异丙醇/水(40∶52∶8)以1.0ml/分 钟洗脱。通过在230和254nm的UV和通过放射性检测峰。一旦合适 的峰收集在无菌瓶中，移出一小份样品用于放射性-TLC分析并用氮 气流蒸发剩下的溶剂得到目的化合物的干的残余物。必要时计算比放 射性。
第11步，从无水乙醇中的5％聚山梨酯20TM的储备溶液将聚山 梨酯-20TM以0.1μl/1.0μgNM404的比例加至烧瓶中。聚山梨酯20TM 是药物级的吐温20TM，现在将其与NM404用于人和动物研究中。在 ＜30℃下通过旋转蒸发10分钟除去溶剂。通过混合进足够的无菌水中 溶解残余物以产生2％聚山梨酯-20的溶液。将配制好的产物通过无 菌的0.2μm PaIl-Gelman Acrodisc过滤器(13mm)传入干的、无菌 的、多次剂量瓶(Hollister-Stier)中，所述多次剂量瓶用另一无菌的 0.2μm过滤器通气。将100μl产物溶液转移进小瓶中用于QC分析。
第12步，在剂量校准器中测量放射性并进行质量控制检测(无菌 性，不致热性)。
所有未标记的NM404取自最近进行了急性毒理学检验的原始储 备批次以使得研究之间潜在的合成差异最小化。NM404的放射性碘化 通过在由发明人(Weichert JP，Van Dort ME，Groziak MP，Counsell RE.Radioiodination via isotope exchange in pivalic acid.Int J Appl Rad Isotopes.1986；37：907-913)发展的新戊酸的熔化物中进行同位素 交换反应或通过在此描述的新方法按常规获得，并根据由发明者描述 的标准方法(Rampy MA，Brown RS，PinchukAN，Weichert JP， Skinner RW，Fisher SJ，Wahl RL，Gross MD，Ethier SP，Counsell RE. Biological disposition and im aging of a radioiodinated alkylphosphocholine in two rodent models of breast cancer.J Nucl Med.1996；37(9)：1540-1545)制备用于注射。这种方法可有效地用来 制备无菌的材料用于最初的使用NM324(NM404的前体)的人体试 验，并已经超过40次用于制备125I和131I-标记的NM404。一般来说， 在用HPLC纯化并精确地质量定量后，将放射性药物溶解于无水乙醇 (50-500μl)和聚山梨酯-20TM(0.1μl/μg化合物)中。在真空下除去 乙醇并将残余物溶解进无菌水中得到含有不超过2-3％的聚山梨酯-20 的终溶液。通过滤过无菌0.2μm滤器单元完成灭菌。在用于受试者前 最终的放射化学纯度必须超过97％。最终的比放射性的定量和计算通 过使用已知质量标准的HPLC分析完成，放射性(125I)的定量通过 在PE Wallac γ-计数器中稀释并计数来完成以避免衰减担心。较高能 量的同位素(包括131I)的定量用剂量校准器进行，所述剂量校准器 具有这些同位素的内嵌设置。一般获得每100μg放射性碘化的NM404 有1mCi的比放射性。注射体积一般为每只小鼠约100μl。组织分布 数据表示为每克组织的百分比注射剂量(±SEM)，并且当整个器官 根据公开的方法(Rampy MA，Brown RS，Pinchuk AN，Weichert JP， Skinner RW，Fisher SJ，Wahl RL，Gross MD，Ethier SP，Counsell RE. Biological disposition and imaging of a radioiodinated alkylphosphocholine in two rodent models of breast cancer.J Nucl Med.1996；37(9)：1540-1545)称重时，也表示为每个器官的百分比注 射剂量。在每个时间点，基于每克组织的百分比注射剂量计算肿瘤对 组织的比率。
一般的组织分布(TD)分析：根据由发明者发展的标准方法 (Weichert JP等，Polyiodinated Triglyceride Analogs as Potential CT Imaging Agents for the Liver.J Med Chem 1995；38：636-646)在雌性 小鼠上进行生物分布研究。通过尾静脉注射施用放射性碘化的NM404 (100μl中，5μCi)。在预先确定的时间点将动物(每个时间点3只) 通过放血实施安乐死，同时处于戊巴比妥麻醉下。获取包括血液、血 浆、肾上腺、膀胱、骨髓、脂肪、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、脾 脏、卵巢、皮肤、甲状腺和肿瘤的总共16种组织，冲洗并切割使得没 有外来的组织。将大的器官切碎并称重双份的组织样品并放置于塑料 管中用于同位素计数。注射位点和残留尸体的放射性也在适当地计数 器中测定。这些标准的方法已经在发明人的试验室中，在适当的动物 照顾和放射性安全认可下用了许多年。通过计算机程序生成了组织分 布的表格，基于百分比注射剂量/g、％kg剂量和百分比注射剂量/器官 ±SEM，其产生了衰败-校正的组织放射性浓度数据。在每个时间点， 基于每克组织的百分比注射剂量计算肿瘤对组织的比率。在NM404 注射后4、7、14、21和28天时在负载肿瘤的小鼠上进行了对照TD 研究(3只小鼠/时间点，总共15只)以建立所有治疗方案的比较TD 表。
一般的成像方案：经尾静脉注射并在预先确定的时间点接受125I- NM 404(10μCi)的动物随后麻醉(戊巴比妥钠麻醉，0.06mg/g体重) 并用经改良用于小鼠成像的Bioscan AR2000放射-TLC扫描仪进行 放射性核素扫描(2mm高分辨率准直器/每道(lane)1分钟采集时间 /1mm道增量)。用购自Bioscan的Winscan 2D软件定量并显示数据。 一旦切除，也将对照的和处理过的肿瘤在Bioscan仪器上进行离体扫 描以使得能通过消除整个身体的放射性核素衰减而进行更精确的目的 区域(ROI)分析。用中等分辨率采集参数对动物(戊巴比妥钠麻醉， 0.06mg/g体重)进行微型CT扫描(Imtek MicroCAT I，390步采集 /43Kvp/410μA；CTI Molecular Imaging，Inc.，Knoxville，TN)。对数 据集进行三维重建并用AMIRA 3D可视化软件可视化。该软件能进行 ROI密度分析和方便的在屏测量。
实施例2：高比放射性合成和放射性标记
在高比放射性NM-404的合成中，首先在存在Pd催化剂时将冷 的NM-404与双-(新戊基甘醇酰(glycolato)二硼)偶联而形成芳基硼 酸酯。在第二步中，用放射性碘化钠和氯胺-T让所述芳基硼酸酯接受 放射性碘去硼化而获得具有高比放射性的放射性碘化的NM-404。
二烃基代硼酸的二元醇酯的其它酯也可用于第一个反应，例如， 双-(频那酰(pinacolato))和双(亚己基-甘醇酰)二硼。
高比放射性合成的重要标准是最终的标记化合物(例如131I- NM404)和它的前体二烃基代硼酸酯化合物必须可容易通过HPLC分 离。这确保了差不多每个通过HPLC分离的NM404分子得以放射性 标记。所述化合物的理论比放射性是约2500居里/mmol。现存的同位 素交换方法局限于约10居里/mmol比放射性。对于治疗，这是重要的， 因为受试者治疗需要的化合物(例如用放射性同位素131I-NM404治 疗)的大概量是约60-100mCi。与目前可利用的同位素交换条件，特 别是获得131I类似物的治疗剂量所需要的条件比较，这种新的高比放 射性合成将提供更大质量剂量的放射性标记的NM404。
实施例3：用PLE类似物的临床前研究
用上面描述的同位素交换方法可容易地用碘放射性同位素标记磷 脂醚。特定地设计所述碘苯基磷脂醚类似物以使得连接在每个分子上 的放射性碘对体内容易进行的脱碘作用是稳定的。合成并且体外和体 内检测了超过20种放射性标记的PLE化合物。其中两种，即NM294 和NM324[12-(3-碘苯基)-十二烷基-磷酸胆碱]，在动物肿瘤定位研究 中最初显示出最有希望。这些原型化合物，用125I标记，在以下动物 肿瘤模型中随时间过去而选择性地定位于肿瘤中：1)负载有Walker 256癌肉瘤的Sprague-Dawley大鼠；2)负载有乳腺肿瘤的Lewis大鼠； 3)负载有Dunning R3327前列腺肿瘤的Copenhagen大鼠；4)负载有 Vx2肿瘤的兔；和5)负载人乳腺肿瘤(HT39)、小细胞肺肿瘤(NCI-69)、 结肠直肠肿瘤(LS174T)、卵巢肿瘤(HTB77IP3)和黑素瘤肿瘤的 无胸腺小鼠。这些试剂的最佳肿瘤定位需要1-7天。
使用PLE类似物的机制研究：NM324和NM404在结构上类似于 米替福新(十六烷胆碱磷酸)，米替福新是在欧洲最广泛研究的一种 抗肿瘤醚脂质。米替福新和数种其它抗肿瘤磷脂醚类似物的抗肿瘤特 性已经在广泛的肿瘤细胞系中得到证明，所述细胞系包括前列腺癌、 膀胱癌和畸胎癌、鼠和人白血病以及肺、结肠、卵巢、脑和乳腺癌 (Arthur G，Bittman R.The inhibition of cell signaling pathways by antitumor ether lipids.Bioehim Biophys Acta.1998；1390：85-102)。 与许多抗癌药物比较，这些磷脂醚类似物不直接结合DNA并且不是 诱变剂。尽管还没有确定确切的抗增殖作用机制，但它们明显在多个 肿瘤细胞位点起作用。已经将这些化合物与多种细胞效应联系起来了， 所述细胞效应包括转运、细胞因子形成的促进、细胞凋亡诱导和干扰 多个关键的脂代谢以及细胞信号传导酶，它们大部分位于细胞膜内。 尽管对摄取进细胞的模式存在争议，但现在多数的报道支持这样的观 点，即这些醚脂质直接吸收进它们积聚的细胞膜内。一个普遍的观点 认为，这些试剂通过扰乱膜磷脂代谢而起作用；然而用这些试剂进行 的细胞分布研究已经受到在均化和亚细胞分级分离过程中自发的细胞 腔隙的重新分布的限制。与本发明人已经使用的示踪剂成像剂量(数 μg)比较，抗肿瘤效果仅在一般超过300-1000mg/天的剂量时才可观 察到(Arthur & Bittman，1998)。
对数种PLE类似物(包括NM324，其为NM404的前体)进行了 正式的代谢研究。在这些研究中，对每种试剂进行检验以确定它们作 为与PLE代谢相关的酶的底物的能力。如图15显示，三条主要的酶 促途径涉及PLE的代谢。O-烷基甘油单氧化酶(AGMO)负责C-I 处的烷基醚键的裂解以形成长链脂肪醇或脂肪酸。磷脂酶C(PLC) 和D(PLD)，另一方面，分别产生了甘油或磷脂酸产物。使用微粒体 AGMO酶制备物，当与[3H]-lyso-PAF(血小板激活因子)比较时， NM324不是这个酶的底物，所述[3H]-lyso-PAF被大量地代谢。以类 似的方式，分析NM324作为分离自蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus) 的PLD的底物，相对于1-棕榈酰-2-[3H]-棕榈酰-L-3-磷脂酰胆碱 (DPPC)，NM324没有水解，而所述DPPC进行了明显的水解。
最后，让数种PLE类似物接受PLD测定。分离自卷心菜的PLD 类似于哺乳动物的PLD，因为当在存在乙醇下进行酶促反应时，卷心 菜形式除了提供磷脂酸外还提供了磷脂酰乙醇-类型的产物。数种接受 这些测定条件的PLE类似物真的产生了磷脂酰乙醇产物，表明所述 PLE可能与PLD相互作用。
也对数种NM404前体在多种细胞系(包括Walker 256肿瘤细胞、 大鼠肌肉细胞(H9c2)和大鼠肝细胞)中进行了体外代谢研究。在这 些研究中，基于孵育多个时间段后形成的放射性标记产物和用细胞数 目或细胞蛋白的量标准化的结果测定了代谢的程度。随后的孵育培养 基和细胞悬浮物的脂质提取证明，在48小时的研究过程中在Walker 肿瘤细胞中极少生成PLE代谢物而在肌肉细胞和肝细胞中都可看见 明显的代谢物产生。这些结果与用所有类似物完成的体内生物分布研 究很好地相关联。尽管已经完成了数个研究，但在肿瘤细胞内代谢捕 获在放射性标记PLE类似物的摄取和保留中的作用还没有很好地确 定，并且当前还有检测的放射性区域。
NM324的临床评价：在数种有希望的第一代PLE类似中，NM324 更易于化学合成并因而选取它作为先导化合物用于初始的临床研究。 尽管在五个人肺癌患者中获得的图像检测到肿瘤，但是高的肝脏放射 性(图2)使图像变得复杂。
第二代PLE类似物：为了降低肝脏摄取并延长血浆阶段，合成了 9种NM324的结构类似物并用125I进行放射性标记用于在负载有 Dunning R3327前列腺肿瘤的Copenhagen大鼠中进行初始的图像分 析。基于这种初始的筛选，选取NM347、NM404[18-(4-碘苯基)-十八 烷基磷酸胆碱]和NM412(图3)来在动物肿瘤模型中进行进一步的成 像和生物分布分析。
在动物模型中用NM404和NM412进行的最近的成像研究显示， 在显影多种肿瘤中它们两者都优于NM324。重要地是，在静脉内施用 NM404或NM412后在转移的前列腺肿瘤模型中，清楚地描述出了淋 巴结转移瘤。最重要地是，未涉及的淋巴结没有保留所述示踪剂(图 4A)。
图4A和图4B说明了在IV施用放射性标记的磷脂醚类似物后， SCID小鼠肿瘤模型中磷脂醚类似物NM404(图4A)和NM324(图4B) 的分布的闪烁图比较的结果。在其中注意到，大多数的NM324(图 4B)放射性在肠55中发现，并不是在肿瘤50(移植入大腿内)中发 现，而NM404(图4A)正确地识别了在左腿和右腿中的肿瘤50。随 着时间过去，与组织的其它部分比较，放射性标记的磷脂醚类似物 NM404变得更有选择性地定位于肿瘤50中，这种现象对于放射性标 记的磷脂醚类似物NM 324没有观察到。图4C显示了IV施用放射性 标记的磷脂醚类似物NM404后的闪烁法图像，该图像显示了所述磷 脂醚类似物定位于Copenhagen大鼠中的Dunning R3327转移的前列 腺肿瘤(“tumor”，)中，所述大鼠通过手术移除了原发性肿瘤位点(腿)。 在处死后证实有两个淋巴结肿瘤。
尽管是在前列腺模型中进行的，这个发现与乳腺癌显著相关，所 述乳腺癌中牵涉到淋巴结也是这样一种重要的预后指标。在负载有人 A549 NSCLC肿瘤的SCID小鼠中进行的初步的先导研究令人鼓舞并 证明了NM404克服了这样一个问题，即由肝脏引起的NM324的高的 首过清除率。NM404显示了极好的肿瘤显影，特别显著的是在延迟成 像中，与NM324比较其具有最小的肝脏和肾脏摄取(图4A和图4B)。 组织生物分布研究进一步确认在肿瘤中残存高水平的放射性。尽管成 像结果与NM404和NM412相似，但在大鼠中获得的放射量测定数据 显示，相对于NM412，发现NM404具有更低的肾脏剂量，并因而选 择NM404用于进一步研究。比较NM324和NM404在前列腺癌和A549 肺癌肿瘤模型的SCID小鼠中的生物分布数据显示，NM404产生高的 肿瘤对正常组织的比率和超过25％的注射剂量的肿瘤摄取。
在小鼠模型中进行的动物成像研究总结于表1中，所述研究目的 是测定广泛多样的肿瘤模型中的摄取特性。在B6 ApeMin/+小鼠中的初 步结果表明，NM40在这个模型中不为腺瘤性息肉摄取而是由乳房腺 癌吸收并保留，因而表明其对恶性肿瘤细胞可能有特异性。这些研究 目的是测定NM404用于非侵入地表征肿瘤的潜力。NM404已经在每 个研究的腺癌模型中展示了显著的肿瘤摄取和保留。
CT-26鼠肿瘤模型的相关性：发明人在鼠(BALB/C小鼠)模型 中探索了NM404作为肿瘤反应的预测物，所述小鼠皮下接种CT-26 细胞进入其两胁。所述CT-26细胞系是分化不足的鼠腺癌，其通过在 Balb/c小鼠中直肠注射N-亚硝基-N-甲基尿烷诱导。所述细胞系简单 地在体外生长并当注射进脉管系统(尾静脉注射，转移模型)，进入 皮肤(图5)或肝脏时，其产生可预测的生长模式。图5是在已经接 受了皮下注射CT-26细胞的小鼠中肿瘤生长的图示。参见Weber，SM， Shi F等，Interleukin-12 gene transfer results in CD8-dependent regression of murine CT26 liver tumors.Ann Surg Oncol 1999； 6：186-194；Imboden M等，The level of MHC class I expression on murine adenocarcinoma can change the antitumor effector mechanism of immunocytokine therapy.Cancer Res 2001； 61：1500-1507。由于所述细胞系源于结肠直肠癌，这种鼠模型对于这 些研究是高度临床相关的。
在CT-26肿瘤中使用NM404的成像结果：本研究显示，放射性 卤素标记的磷脂醚类似物(NM404)定位于皮下的CT-26异种移植物 中。用125I-NM404(10μCi)注射(IV尾静脉)两只小鼠并随后在注射 后1、4和7天，在改良的Bioscan AR-2000 TLC成像扫描仪上成像 以获得放射性同位素分布的2维闪烁法图像(Bioscan，Washington， D.C.；配备有高分辨率的1mm准直器和2-D图像采集和分析软件)。 在第7天，对动物实施安乐死并取出肿瘤，摄像并在Bioscan上离体 扫描(图6)。由于与碘-125相关的严重的组织衰减效果，离体扫描 是发明人试验室中标准的方案。在第7天实施安乐死和切开肿瘤前， 也将每只动物进行微型CT扫描(图7)。
通过比较组织形态和放射性分布，在离体闪烁法图像上通过目视 将放射性的病灶热点与所有肿瘤关联(图6A-C)。图6A是切除的 CT-26肿瘤50和切除的左和右淋巴结的摄影图像。图6B是图6A中 的离体的肿瘤和淋巴结的闪烁法图像，该图像显示，显著的放射性60 定位于肿瘤中而极少或没有放射性定位于淋巴结中。图6C是将图6A 数字化摄影图像和图6B的数字化闪烁法图像合并产生的图像，显示 了放射性和肿瘤的相关性。
尽管淋巴结在摄影图像中形态学上是可见的，但是极少或没有放 射性与它们相关，这表明没有肿瘤细胞浸润。图6和图7中的主要肿 瘤在组织学上分类为腺癌。在另外的研究中，用微型CT扫描广泛多 样的皮下肿瘤；下至直径小于300微米大小时所有的肿瘤是容易检测 的。
表1：肿瘤模型的概述
肿瘤模型 物种 种类 摄取 人类肿瘤异种移植物 前列腺PC-3 肺A-549(NSCLC) 肺NCI H-69(Oat细胞) 肾上腺H-295 肾上腺RL-251 黑素瘤A-375 结肠LS-180 卵巢HTB-77 动物肿瘤异种移植物 乳房MCF-7 前列腺MatLyLu Walker-256 最近的啮齿类动物模型 TRAMP前列腺 肝CT-26 SCID小鼠 SCID小鼠 裸鼠 SCID小鼠 SCID小鼠 裸鼠 裸鼠 裸鼠 大鼠 大鼠 大鼠 自发性小鼠 小鼠异种移植物 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 腺癌 癌肉瘤 腺癌 结肠直肠腺癌 有 有 有 有 有 有 有 有 有 有 有 有 有
皮下CT-26 Min小鼠肠 黑素瘤 SCC1和6 乳房SCC和ACC 肝细胞癌 胰腺c-myc和kras 神经胶质瘤L9 成视网膜细胞瘤 子宫颈的 腺瘤性息肉 乳房增生 小鼠异种移植物 内源性小鼠 小鼠异种移植物 裸鼠 ApcMin/+小鼠 自发性TGF-α小鼠 自发性小鼠 大鼠 自发性小鼠 自发性小鼠 自发性小鼠 内源性小鼠 结肠直肠腺癌 腺癌 腺癌 鳞状细胞癌 鳞状细胞癌和腺癌 腺癌 腺癌 神经胶质瘤 胚细胞瘤 腺癌 腺瘤 小泡增生 有 有 有 有 有 有 有 有 有 有 无 无
因为肿瘤-靶向机制看似涉及随时间过去选择性的肿瘤保留，相对 短寿命的核素例如18F或甚至是99mTc在目前用于标记是不可行的。然 而，如同早期使用单克隆抗体(其唯一用碘的放射性同位素标记)， 有可能用备选的标记物(例如碘-124)标记PLE类似物，其中物理学 半衰期与PLE肿瘤摄取和保留动力学很好地匹配。这种方法除了利用 PET成像提供的相对于传统的γ照相成像的解析增强和3-维能力以 外，还将利用18FDG的使用，因为18FDG被摄取到肿瘤细胞中是经由 不同于葡萄糖利用的生化机制发生的。
正如上面已经讨论的，当前可利用的示踪剂(例如67Ga和18FDG) 受限于缺少区分瘤和炎症的特异性。然而，用PLE试剂的初步研究已 经提供了克服这种临床上的显著局限性的希望，其中角叉藻聚糖在大 鼠中诱导的肉芽肿不能在高于背景放射性上显影并且没有显示出组织 保留。Counsell-RE等，Tumor visualization with a radioiodiuated phospholipid ether.JNucl Med 31(3)：332-336，1990。然而枸橼酸镓(在 那个研究中用作对照)确实在所述肉芽肿中显著地集中。这些发现进 一步证明了扩展本发明人用PLE类似物试剂作为潜在有用的肿瘤选 择性显像剂的研究是正确的。
人体研究：基于在动物中十分有希望的药物动力学和成像数据， 促使本发明人将放射性标记的磷脂醚的研究进入临床阶段。最初在大 鼠和兔上评估了未标记的NM324的急性毒性作用，所述评估是在 Buffalo的Toxicology Research Center，State University of New (SUNY)进行的研究中完成的。在这些急性剂量毒理学研究中在3.2 mg/kg(＞150倍最高预期的人的剂量)的剂量水平没有发现毒性作用。 而且，在这种高剂量水平没有证明血小板激活特性。
将未标记的NM324施用给正常的、无疾病的人以获得放射性药 物研究委员会(RDRC)对用于人施用的放射性标记试剂的批准。这 些受试者没有中毒的迹象，这通过症状、临床检查、生命体征和连续 的血液化学检查表明。
作为先导的可行性项目，在RDRC批准下在Ann Arbor，Michigan VA医院用131I-标记的NM324研究了4位肺癌患者。在全部三个肺癌 患者中肺肿瘤清楚地得以显影(两个患有NSCLC以及一个患有小细 胞肺癌)，下面有详细描述。肿瘤摄取的程度，在多个时间点，从1+ (刚好在背景之上可见)到3+(强烈的摄取，比正常结构大得多)变 化。注意，选择进行这些初始研究的患者是具有已知的、相对大的癌 的那些患者。在这个阶段不准备研究存在进行肿瘤分类问题的患者。
病例史：
患者01是55岁的老年妇女，其右边中叶肺肿块侵蚀进右肋，组 织学上可能为肺起源的产生粘蛋白的腺癌。在6小时时最初的131I- NM324闪烁法成像显示在右侧中间的肺中有摄取的病灶。由于与闪烁 法试验无关的原因，该患者超过6小时不能返回医院进行进一步的成 像。
患者02是一位62岁的老年男性，其有一大的(9×7×7.5cm)、 分叶状的纵隔肿块，从主肺动脉窗和左肺门延伸。组织类型是小细胞 未分化的(燕麦(oat)细胞)癌。131I-NM324闪烁法成像显示了左上 的肺部中的摄取焦点，其相对于正常的背景放射性强度随时间增强。
患者03是一位74岁的老年男性，其患有右上叶NSCLC(腺癌)， 其先前用放射疗法治疗了5个月。疾病在左舌(2.5×2×3cm肿块)、 下胸椎(约T8)和肝脏的右叶复发。131I-NM324闪烁法显像在肺肿块 和胸椎病变中显示了十分确定的吸收，这证明靶标对背景的比率随时 间增加(图2)。在肝脏转移瘤中的吸收不能在正常肝的背景上分辨。
这些研究提供了放射性标记的PLE类似物的临床希望的曙光。尽 管131I不是最佳的用于成像目的的同位素，但所有三个肺肿瘤中的摄 取得以清楚地描绘。正如预期的，基于先前的动物生物分布试验，肿 瘤中的放射性随时间增加，如患者02和03中清楚说明的。在患者03 中，肿瘤对正常组织的比率从第2天的2.74增加到第7天的4.23。患 者01超过6小时没有返回进行后面的成像阶段。增加的靶标对背景的 比率构成了强有力的证据，证明肿瘤显影的机制不是仅基于异常的血 流或肿瘤过度的血管分布的机制。事实上，用99mTc人血清白蛋白进 行的动物研究证实了这个观点。
CT-26结肠腺癌异种移植物模型：也在异种移植物结肠腺癌肿瘤 模型中评估了NM404，为此先前将CT-26细胞(5x105细胞/50μl)直 接注射进雌性Balb/C小鼠的肝实质中用于产生病灶肝肿瘤。
成像研究：在新戊酸的熔化物中通过同位素交换用125I对NM404 (图3A，100μg)进行放射性碘化。Weichert JP等，Int J Applied Radiat Isot(1986)37(8)：907-913。HPLC纯化后，将其溶解于含水的2％吐 温-20溶液中，随后将其经尾静脉注射(高比放射性15μCi/20g小鼠) 进3只TGF-α内源性小鼠或备选注射进3只负载有CT-26-肿瘤的小 鼠中。将小鼠麻醉并在改良的Bioscan AR2000放射-TLC扫描仪(以 2分钟采集/道扫描，增量为2mm和1mm高分辨率准直器)放射上扫 描直到注射后21天并且还在ImTek微型CT扫描仪上扫描(390步) 用于解剖学相关。用Amira软件显示了微型CT图像。处死时，最初 将负载有肿瘤的肝脏切下并离体扫描。然后切取肿瘤、称重、离体扫 描并定量放射性。将病变样品进行组织学分类。
结果和讨论：用NM404的最初的成像结果(图9，图10)在肝 脏中自发的和移植的癌中显示惊人的摄取(＞20％剂量/g)和延长的滞 留时间。NM404的肿瘤滞留时间在这些动物中持续了21天(预先确 定的研究终点)。对照增强的微型CT成像确认了所有肝脏肿瘤的存 在和精确定位(图9，图11)。肿瘤组织的脂质提取和随后的HPLC 分析表明，放射性仍然与母体化合物相关。正如在先前的细胞培养物 和体内动物模型研究中已经观察到的，NM404明显被代谢并且从正常 细胞中消除，但代谢捕获于肿瘤细胞膜中。
结论：正如在所有先前检验的肿瘤模型中的情况，NM404显示出 选择性和长时间的保留在本研究中评估的自发性的和异种移植物鼠肝 脏肿瘤模型中。
实施例4：在ApcMm/+内源性乳房腺癌模型中增生相对于瘤形成的 特异性
材料和方法：ApcMin/+小鼠模型：这种模型由携带Ape的Min等 位基因的小鼠(ApcMin/+小鼠)组成。这种模型提供了比异种移植物模 型更特别的优势，因为ApcMin/+小鼠易于产生乳腺的增生和癌以及肠 腺瘤。在C57BL6/J的遗传背景上，到100天大时约5％未经处理的雌 鼠会发生乳腺肿瘤。Moser，A.R.等，Proc Natl Acad Sci USA(1993) 90：8977-81。所述乳腺病变的发生率和多重性可以通过单剂量的乙基 亚硝基脲(ENU)增加，所述ENU是直接作用的烷化剂。用ENU处 理导致90％的B6 ApcMin/+雌鼠平均发生3个乳腺鳞状细胞癌(SCC)， 但是处理后60天内发生很少的增生病变。
遗传背景可以影响这样发生的乳腺病变的发病率、潜伏期和类型。 例如，在处理120天内FVBxBo ApcMin/+雌鼠每只平均发生0.2个乳腺 肿瘤，而每只小鼠发生4个增生。Balb/xB6 ApcMin/+雌鼠每只平均发 生1.8个乳腺肿瘤和0.6个增生。Moser AR，Hegge LF，Cardiff RD. Cancer Research(2001)61：3480-3485。FVBxB6和BALBxBo ApcMin/+ 小鼠发生乳腺SCC和腺癌(AC)。
成像研究：在新戊酸的熔化物中通过同位素交换用125I对NM404 (图3A，100μg)进行放射性碘化。HPLC纯化后，将其溶解于含水的 2％吐温-20溶液中，之后将其经尾静脉注射(15μCi/20g小鼠)进6 只ApcMin/+小鼠中。麻醉并扫描小鼠直至注射后30天，所述扫描是在 改良的Bioscan AR2000放射性-TLC扫描仪(以2分钟采集/道扫描， 增量为2mm以及1mm高分辨率准直器)并且也在ImTek微型CT 扫描仪中进行扫描(390步)用于解剖学比较。用Amira软件显示微 型CT图像。处死时，将乳腺或切取的肿瘤进行离体成像，切取病变， 称重并定量放射性。将病变样品进行组织学分类。如果需要，在CT 扫描前经静脉内注射一种长效CT血池造影剂(BP20)以便促进血管 显影(图14)，所述BP20为发明人试验室开发的并适于长的微型CT 采集时间。Weichert JP等，Radiology(2000)216：865-871。
结果和讨论：该模型是独特的，因为增生的乳腺病变、乳腺癌和 肠腺瘤在同一小鼠中发生。使用NM404的最初的成像结果(图12， 图13)显示了所有自发性乳腺癌中的惊人的摄取(＞20％剂量/g)和 长的保留时间，所述乳腺癌直径在2-15mm变化。尽管肿瘤定位出现 得快，但在身体清除阶段背景放射性在肝脏和肠中持续数天。放射性 尿和粪便的HPLC分析表明存在代谢物并且没有母体NM404。NM404 的肿瘤滞留时间持续了21天(预先确定的研究终点)。然而，NM404 没有定位于在这些小鼠中频繁可见的病灶肺泡增生或肠腺瘤性息肉 (图13)中。微型CT成像证实了所有乳腺肿瘤的存在和精确定位(图 14)。NM404明显被代谢并且从正常细胞清除，但代谢捕获于肿瘤膜 中。
结论：NM404已经在到此为止检查的25/25例动物和人的异种移 植物肿瘤模型中展示了惊人的肿瘤亲和力。而且，尽管其通过在这种 自发性肿瘤模型中的乳腺腺癌和鳞状细胞癌展示了选择性和长时间的 保留，但并没有定位于伴随的病灶肺泡增生或肠腺瘤性息肉中，并因 而表现了对恶性肿瘤细胞的选择性。
实施例5：NM404的选择性保留的机制
导言：某些磷脂醚类似物(例如NM404)长时间地选择性保留在 许多类型的肿瘤细胞内。本发明人试图用酶促测定法和定量PCR测定 的PLD表达来评价NM404在肿瘤细胞中选择性保留的机制，所述酶 促测定法用来评估磷脂酶D(PLD)蛋白的活性。本发明人假设，肿 瘤细胞中降低的PLD水平导致了代谢并排泄NM404能力的降低。
方法：将鼠肿瘤细胞系(包括hepa-1(肝癌)、CT26(结肠直肠腺 癌)和TS/A(乳腺腺癌))的单细胞悬浮物用以下两种测定法分析： (1)AmplexRed测定法，使用商业提供的试剂盒(Molecular Probes)，其用荧光小平板读数仪评估PLD活性，和(2)定量PCR， 用于测定PLD mRNA的水平。将肿瘤细胞系与正常组织比较。对于 AmplexRed测定法，用去垢剂溶液(Triton-X-100)提取总蛋白并 将PLD的量与标准的阳性对照比较。对于PCR，纯化mRNA并用逆 转录酶(Promega)将其转化为cDNA。实时PCR扩增cDNA的条件 包括：50个循环的94℃，30秒；65℃，30秒和72℃，30秒(iCycler， iQmix，Bio-Rad)。使用了以下用于PLD1的引物对：(有义的) 5’-TCTGGTTTCACCCCGTCAGAA-3’(SEQ ID NO：1)，(反义 的)5’-TTGCTCATATCTGCGGCGAT-3′(SEQ ID NO：2)。将产物与 稀释至1μg-10-7μg的标准cDNA(GAPDH，Biosource)比较。所有的 测定一式两份。
结果：定量PLD，如下面表2中显示。在所有测试的细胞系中 PLD蛋白活性和mRNA水平都明显低于正常的肝脏组织(p＜0.05，T- 检验)。
表2
细胞/组织 PLD蛋白活性(mU/ 荧光/微克蛋白质/毫升) mRNA(μg×10-5/ 0.01μg总cDNA) Hepa-1 CT26 TS/A 正常肝脏 3.3 7.8 2.8 14.1 6.2 2.4 4.0 12.2
结论：在鼠肿瘤细胞系中观测到了减少的PLD蛋白活性和降低的 PLD表达。因而，NM404的选择性保留的机制可能是由于明显缺少 存在于恶性肿瘤细胞中的磷脂酶，引起试剂生化上锁在了这些细胞中。 在肿瘤细胞和恶性组织中PLD活性降低也能以作为其它候选抗-肿瘤 试剂的分子靶标起作用。
实施例6：NM404在内源性鼠乳腺肿瘤模型的治疗效果
NM404治疗研究的模型：尽管长期存活对成像研究来说不是必需 的，但对提出的治疗研究是有利的。用于成像研究的模型遭受伴随的 肠肿瘤的折磨，其通常导致动物的死亡。为了增加每只小鼠产生的肿 瘤数目并降低肠肿瘤的数目，希望增加负载肿瘤的小鼠的寿命，将雄 性B6 Min/+小鼠与雌性C57BR/cdJ(BR)小数杂交。得到的BRB6 F1 Min/+雌性小鼠在用ENU处理后比B6 Min/+小鼠产生明显多的乳腺 肿瘤(P＝0.016)，平均接近每只5个。患有肿瘤的小鼠数目和产生 第一个肿瘤的时间在这两个品系间没有差别(分别是P＝1和P＝0.06) (图16)。BRB6 F1小鼠乳腺肿瘤数目的增加可能部分是由于杂交的 BRB6 F1 Min/+小鼠相对B6 Min/+小鼠明显更长的存活时间 (P＝2×10-7)。
B6和BRB6 F1 Min/+小鼠在乳腺表现型上是十分相似的，但是在 对肠肿瘤的易感性上十分不同。可以认为B6和BR品系是对Min诱 导的乳腺肿瘤发生的敏感背景，因为所述小鼠在ENU处理后在短时 间内产生大量的肿瘤。然而，BR品系在影响肠肿瘤产生的修饰基因 基因座上携带显性的抗性等位基因，这可以证明与进一步的治疗考虑 相关。
在Min小鼠中使用NM404的成像结果：在用来显示NM404定位 于内源性FVBxB6 ApcMin/+小鼠乳腺肿瘤的研究中，将两只动物注射 (IV尾静脉)125I-NM404(15μCi)并在注射后1、4和7天在Bioscan AR2000放射性TLC扫描仪(配置有高分辨率的2mm准直器和2-D 采集和分析软件)上成像(图17A、图17B)。在实施安乐死前第10 天对每只动物进行微型CT扫描(图17)，并解剖取出乳腺和相关的 肿瘤。通过肉眼将病灶热点与离体闪烁法图像(图17C)上的所有肿 瘤关联。尽管淋巴结可见，但没有放射性与它们相关联，表明没有肿 瘤细胞浸润。图17C中主要的肿瘤经组织学分类为腺癌。在两只小鼠 上都有4个乳腺肿瘤，并且在切除乳腺的离体闪烁法图像中全部容易 检测。
NM404的放射治疗效果：在最近用“显像”剂量(15-20μCi/20g 小鼠)的125I-标记的NM404进行的小鼠肿瘤摄取和保留研究过程中， 已经观察到了数个明显的治疗反应。在ApcMin/+小鼠乳腺肿瘤模型中， 通常注意到在单次静脉内注射NM404后肿瘤生长保持静止。在注射 后约8天，这些动物中的一些在较大的乳腺肿瘤上也脱掉了所有的毛。 而且，这些小鼠也产生了肠肿瘤并且通常遭受肠出血，其导致严重的 贫血，这使它们的足变白。注意到这些小鼠的足在单次注射NM404 后约5天已经转为粉红色。解剖这些动物显示，在这个阶段通常发现 的预期每只小鼠大约20个肠肿瘤中仅有十分少的数目(如果有的话)。
所述“白色变为粉红色足“的现象也在单独的，但是更侵略性、小 鼠肠腺癌模型中观测到了，其中施用NM404后12天进行解剖，再次 显示，仅有十分少的(如果有的话)预期的肠肿瘤存在，在两种肠肿 瘤模型中，接受了NM404的动物更容易比它们未经处理的同胎伙伴 活得长。这些发现在两个独立的年龄匹配的组中再次得以证实，所述 组中各自多于6只小鼠。用125I-NM404的这些观察结果表明这种化合 物以及131I-NM404作为用于放射治疗应用的试剂的潜力。
同位素的选择：由于其60天的物理半衰期和低能量35KeV光子 发射，125I适于小鼠和大鼠中的成像实验。125I也提供了治疗特性并且 目前用于持久性前列腺近距疗法埋植剂中。在一成像研究中，将2只 裸鼠每只在相对的两胁用皮下鳞状细胞1和6肿瘤细胞移植物接种。 使用SCC 1和SCC 6细胞是因为一个相对另一个是放射敏感的。14 天后当平均肿瘤大小(总共4个)达到直径为0.5cm时，一只小鼠接 受20μCi的125I标记的NM404，另一只以相等的质量剂量接受未标 记的NM404。由于两个肿瘤达到了在我们的动物使用方案中确定的终 止大小限度，仅接受未标记化合物的小鼠必须在注射后20天实施安乐 死。在7周期间，125I-NM404处理的小鼠中两个肿瘤显著地退化(图 18)。实际上，这个小鼠的肿瘤从未达到终止大小并实际上将该小鼠 在80天后实施安乐死以便收集组织学切片。在这时，肿瘤的中心已经 变得坏死而周围边缘看起来稍微有些许活力。组织学检查证实了坏死 的中心和有活力的边缘。虽然血液供给因素可有助于这种观测现象， 但也有可能125I的光子发射在肿瘤边缘导致较差的电子平衡而导致肿 瘤“外壳”给药不足。这种电子平衡问题在放射肿瘤学中是关键的。在 与组织相互作用并发挥它们的生物学作用前，光子传播有限的距离， 这由它们的能量决定的。具有太高能量的光子可以导致肿瘤小结边缘 的给药不足，因为光子在沉积它们的剂量前远离小结传开(离开肿瘤)。 然而，使用125I时，光子具有相对低的能量，确保了相当局部的沉积。 虽然复杂的蒙特卡罗计算法可以改进这种估计，但确定最佳同位素选 择的最好方法是试验，因为有许多起作用的因素，它们不能精确地模 拟(组织分布的细节、多次穿过等)。125I的一个优势是所有的光子 具有低能量，确保了肿瘤周围正常组织十分有限的曝露。
131I已经用于治疗甲状腺癌，其具有极大的效力。十分安全的131I 剂量可以控制分化得很好的甲状腺癌的亚临床沉积，所述甲状腺癌如 同正常的甲状腺，很有亲和力地集中碘。这种主动摄取过程有助于限 制正常组织的剂量。碘-131有β和数种γ发射，但是主要的组织剂量 是产生自β发射。基于甲状腺癌的临床成功，结合在低度淋巴瘤患者 中应用Bexxar(131I-标记的基于抗体的试剂)获得的结果，发明人选 择了131I-标记的NM404。主要的β发射和多数低能量γ发射优化了肿 瘤结节自身内的剂量均匀性。而且，与125I的60天的半衰期比较，更 短的半衰期(8天)提供了更临床相关的剂量-强度。这些因素使得发 明人对这种试剂的效力进行最好的评价。131I的一个潜在缺点是还有 较高能量的γ发射，所述较高能量的γ发射比125I发生的实际上可以 让邻近的周围组织曝露于更多的辐射。这里提出的内源性模型中的肿 瘤位于乳腺的外围并因而应不代表对动物整体健康状况的直接威胁。 因为器官毒性也是试验终点之一，也对周围组织和关键器官系统(骨 髓、肝脏、肾脏、肠、脑等)的反应进行了评估。放射性标记NM404 的组织分布数据和实际的放射剂量测定将确定其最佳的治疗潜力。有 可能在治疗环境中不同的同位素相互补充。
实施例7：使用NM404组合物的双模态虚拟结肠镜检查。
双模态PET/CT虚拟结肠镜检查：人体中的虚拟结肠镜检查，即 通过CT扫描进行的非侵入性扫描过程，据报道比传统的结肠镜检查 更准确。(Pickhardt PJ.等，Computed tomographic virtual colonoscopy to screen for colorectal neoplasia in asymptomatic adults.New England Journal of Medicine.349(23)：2191-200，2003 Dec 4.在传统 的多检测器螺旋CT扫描器上进行的，虚拟结肠检查使得能非侵入地 自动扫描肠腔的肿瘤，但是不能将占位性病变表征为息肉(腺瘤)或 腺癌(恶性)。肿瘤类型的测定十分影响治疗计划和这些患者的治疗 结果。
使用本发明的方法，通过预先施用肿瘤选择性正电子发射剂(如 18F-FDG或124I-NM404)并在混合的CT/PET扫描仪上扫描受试者， 熟练的技术人员可以同时在解剖学检测(CT)和功能性分类(PET) 恶性肿瘤，所述这种方法比通过使用内镜检查方法如结肠镜检查侵入 性更小。因为已知NM404被恶性肿瘤而不是增生的癌前细胞吸收并 选择性地保留长的时间(见图19-图24)，在重构肠腔的虚拟飞行通 过时，在双模扫描的PET组分上恶性肿瘤将展现大量的放射性(发光) 而腺瘤性息肉将不会发光。因而可以区分肠肿瘤类型而不需求助于侵 入性方法如内窥镜检查法。正如上面注意的，放射性标记的磷脂醚类 似物如124I-NM404选择性地保留在恶性肿瘤细胞中并因而显著优于 18F-FDG，所述18F-FDG缺少肿瘤特异性并且已知其除被肿瘤吸收外， 还被炎性位点和增生区域(巴雷特氏食管)吸收。
在小鼠模型中结果证明NM404被恶性肿瘤细胞选择性地吸收和 保留并且已经用微型CT扫描仪在小鼠中进行了虚拟结肠镜检查。目 前在人肺癌患者中对NM404进行评价，早期的结果表明其被吸收并 选择性地保留于这种人癌中，所述吸收和保留方式与先前在25/25个 动物肿瘤模型中展示的方式相似。而且，由于其摄取和延长的选择性 保留于肿瘤中，发明人已经观测到明显的肿瘤退化，所述退化是由于 其在数个不同的小鼠肿瘤模型中的放射治疗效果而致。因而可表征试 剂如放射性卤素标记的NM404的这种特征为“DiapeuticTM”，因为其 既可以检测又可以治疗恶性肿瘤。那么由此得出，用NM404 CTVPET 扫描同时检测并表征肠恶性肿瘤也可以导致随后用治疗剂量的磷脂醚 类似物治疗受试者，所述磷脂醚类似物是例如用选自124I、125I或131I 或其混合物的放射性卤素标记的NM404。
配制成用于静脉内注射的NM404组合物可如上面描述的进行施 用。用于本实施例的方法基本上是描述于Pickhardt，PJ.等， Microcomputed tomography colonography for polyp detection in an in vivo mouse tumor model，Proc.Natl.Acad.USA，2005，102： 3419-3422中的那些方法。所有的动物研究是在由在Wisconsin大学的 Institutional Animal Care and Use Committee of the American Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care提出的批准的指南下进行的。通过将来自C57BL/6J遗传背景的 Ape基因的Min等位基因导到C57BL/6J Tyrc-2J遗传背景上而产生用 于本研究的同类系中，所述基因导入是通过回交10代完成的。在20 只小鼠中这些同类系平均每只产生2.1±0.4(SEM)结肠肿瘤(范围是 0-7)。这些品系代表了好的用于评价微型CT结肠造影的体系，因为 结肠肿瘤的数目与人结肠直肠癌的其它小鼠模型相比相对要高。
总共选取了20只同类系小鼠用于微型CT扫描。在微型CT扫描 前，给所述小鼠任意提供两天的新鲜蔬菜、生的未加盐的葵瓜子和水 的饮食，随后提供樱桃味的NuLYTELY(Braintree Scientific)16小 时。这种饮食方法明显地降低微型CT中由常常在标准的颗粒状鼠食 中发现的骨粉和其它高密度填充物产生的条纹状人为现象。用戊巴比 妥(0.06mg/g体重，i.p.注射)麻醉这20只小鼠(17-22g体重)，施 用由1-1.5ml的玉米油组成的灌肠剂，并用微型CT扫描结肠肿瘤。 在MRI和CT扫描前，用重钡(225 wt/vol％逆向充满肠道。
在直肠施用造影剂后，立刻在俯卧位对麻醉的小鼠进行扫描。在 微型CT扫描仪(Micro-CAT I，ImTek，Knoxville，TN)上用以下成像 参数采集图形：43-kV峰，410μA，390步，20分钟扫描时间。假如 涉及长的采集时间，则不用i.v.施用造影剂，也不用试图去门控对蠕 动或呼吸运动的图像摄取。通过使用反向投影并且没有在合适的 subvolume上进行线束硬化矫正的Shepp-Logan滤波器而将图像数据 重构为256×256×256的三维像素(200-μm空间分辨率)。尽管使用 这些扫描仪可能获得更高的分辨率，实际上，这些采集和重构参数很 容易提供足够充分的空间分辨率而同时使对活的受试者的放射剂量最 小化。CT扫描后立即对麻醉的小鼠实施安乐死。
通过使用商业提供的可视化软件(AMIRA，3.1版，TGS，San Diego)分析来自每只小鼠的微型CT图像数据，所述软件显示所述数 据为2D轴向的、矢状的和冠状的横断面图像。靠近直肠的结肠腔通 过注射器的末端对齐，所述注射器防止显影剂在扫描过程中流出来。 放射学家能够顺着结肠腔从直肠到盲肠。优化用于2D显示的窗口-水 平设置来进行息肉检测，这与用于人中的CT结肠造影的相似。在小 鼠结肠的示意图上标出每个检测到的病变的相对位置和大小以助于将 放射学信息与尸体解剖上回溯性的大致的病理学发现匹配。切开离体 的结肠并摄像以确认结肠肿瘤的形态学存在和位置。
离体小鼠结肠的大致的病理观测用为金标准，将微型CT结果与 之相比较。微型CT扫描后立即杀死小鼠。取出结肠，纵向打开，进 行数码摄像，用PBS洗涤并再次摄像。总共鉴定了41个结肠肿瘤和 33颗粪粒。肿瘤大小在～1mm直到5mm间变化。这种方法提供了同 时将在尸体剖检时观察到的肿瘤和粪粒记录到通过用体内微型CT成 像识别并描绘的那些肿瘤和粪粒的能力。
图19A和图19B是离体小鼠结肠的微型CT表面成像扫描的图像， 图19A从远处显示了突出进入结肠腔的肿瘤100，图19B从较近的有 利位置显示了肿瘤100。
图20A和图20B是麻醉小鼠的对比增强的下胃肠道的高密度表面 表现的微型CT图像，包括平面冠状切片图像110以界标在下肠的结 肠112和盲肠114。由于下肠腔中高的钡浓度，充满钡的下肠的密度 实际上超过了相邻的骨116的密度；由于高密度设置，大多数软组织 从视图中消失。
图21A和图21B是麻醉小鼠的对比增强的下胃肠道的表面表现 (图21A)和透明表现(图21B)的微型CT图像，显示了下肠的结 肠112和盲肠114。图21B还显示了肿瘤117和良性结构，粪粒119 之间的区分。
图22是离体并切开的小鼠结肠120的图像，所述结肠具有直径 3.5mm的肿瘤122。
图23A-B是离体的肠的空肠/回肠的照片(图23A)和相应的闪烁 法图像(图23B)。在施用125I-NM404后3天对患有肠腺癌的Min 小鼠成像。肿瘤130(箭头)测量为9×18mm。
图24A-E是离体的Min小鼠十二指肠(图24A，顶部为胃结合)、 空肠(图24B)、空肠/回肠(图24C)、回肠(图24D)和结肠(图 24E)、放射性标记的NM404的强肿瘤摄取的闪烁法图像。为相同数 量的计数将所有图像标准化。图24C为10cm长。
备选地，在本发明的双模态虚拟结肠镜检查中，可以使用其它形 态学技术如MRI来代替CT扫描与PET结合。图25A显示了3D表 面表现的MRI图像400和3D微PET图像420的重叠，所述图像是 iv注射124I-NM404(100μCi)进入患有CNS-I神经胶质瘤脑肿瘤的大 鼠后24小时获得的。用Amira(v3.1)软件(TGS，Inc.，San Diego，CA) 合并图像。图25B是通过肿瘤420的对照增强的冠状MRI切片410， 图25C显示了重叠的冠状MRI和124I-NM404微PET图像，该图确 证了肿瘤的存在和定位。
应该理解这里描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且提 示本领域技术人员根据它们进行的多种修饰或改变并也将包含在本申 请的精神和范围以及附带的权利要求书的范围内。在此引用的所有出 版物、专利和专利申请通过将它们全文引入本文作为参考。
相关的申请
本申请要求享有2004年7月8日申请的美国临时专利申请 60/521,831的利益，该申请的全部内容为所有目的被引入本文作为参 考。
序列表
<110>Cellectar，LLC
Weichert，Jamey P.
Longino，Marc A.
<120>使用放射性标记的磷脂醚类似物的虚拟结肠镜检查
<130>060438-0011
<150>US 60/521,831
<151>2005-07-08
<160>2
<170>Patentln version 3.2
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>1
tctggtttca ccccgtcaga a 21
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>2
ttgctcatat ctgcggcgat 20
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