凝血是由多种血液组分，或因子，之间复杂的相互作用组成的逐渐导 致纤维蛋白凝块形成的过程。通常参与凝血“级联反应”的血液组分是原 酶或酶原，即，不具有酶活性的蛋白，活化剂的作用可使其转变为活性形 式。对血液凝固的调节主要是由活化的蛋白C(APC)通过蛋白裂解作用灭活 凝血因子Va和VIIIa而实现的(Esmon，J Biol Chem 1989；264；4743-4746)。
蛋白C是一种丝氨酸蛋白酶，它以血浆中的酶原的形式循环，半寿期 约为7小时，血浆水平通常为3-5mg/l。它以461个氨基酸的单链前体多肽 的形式在体内肝脏中产生。此多肽经历多重翻译后修饰，包括a)切割42个 氨基酸的信号肽；b)切割赖氨酸和精氨酸残基(156和157位)，产生双链无 活性的酶原(一种具有155个氨基酸的轻链，经由二硫键与一种具有262个 氨基酸的重链相连)；c)对轻链的9个谷氨酸残基进行维生素K-依赖性羧基 化，从而在轻链的N-末端得到9个γ-羧基谷氨酸残基；和d)在四个位点与 碳水化合物相连(一个位点在轻链中，三个在重链中)。最后，通过去除重链 N-末端的十二肽(活化肽，第158-169位)，使上述双链酶原活化，产生活化 型蛋白C(APC)。
蛋白C通过位于内皮细胞内腔表面的与凝血酶调节素(thrombomodulin) 形成复合体的凝血酶的有限蛋白裂解而活化。如上所述，活化作用导致从 重链的N-末端释放12个氨基酸的小肽(称为活化肽)。APC在血浆中的半寿 期约为15分钟。
在有其辅因子蛋白S的情况下，APC通过蛋白裂解作用使凝血因子Va 和VIIIa失活，从而减少凝血酶的生成(Esmon，Thromb Haemost 1993；70； 29-35)。蛋白S以与另一种血浆蛋白，C4b-结合蛋白相结合的形式逆向循环。 仅游离的蛋白S可作为APC的辅因子。由于C4b-结合蛋白是一种急性期反 应物质，该蛋白的血浆水平在很多疾病中有很大差异并因此影响蛋白C系 统的抗凝活性。
编码人类蛋白C的基因定位于染色体2q13-q14(Patracchini等，Hum Genet 1989；81；191-192)，它跨11kb，包括一个编码区(外显子II-IX)和一 个包绕(encompassing)外显子I的5′非翻译区。由外显子II-IX编码的蛋白 结构域显示出与其它维生素K-依赖性凝血蛋白如凝血因子IX和X的较高 同源性。外显子II编码信号肽，外显子III编码原肽和包含9个Glu残基的 38个氨基酸的序列。原肽包含能与钙离子结合的羧化酶结合位点，此酶将 Glu残基转化为二元羧酸(Gla)，而这是磷脂的结合以及蛋白C的抗凝活性 所必需的一个步骤(Cheung等，Arch Biochem Biophys 1989；274；574-581)。 外显子IV，V和VI分别编码一段短连接序列和两种EGF-样结构域。外显 子VII编码含12个氨基酸的活化肽的结构域以及二肽156-157，所述活化肽 在蛋白C被凝血酶活化后可被释放，所述二肽被切割下来后，产生成熟的 双链形式的蛋白。外显子VIII和IX编码丝氨酸蛋白酶结构域。
人类蛋白C的完整氨基酸序列已由Foster等，PNAS.USA 1986；82； 4673-4677报道，它包括信号肽，原肽，轻链，重链，以及活化肽。
蛋白C与内皮细胞蛋白受体(EPCR)结合。APC与EPCR的结合使APC 不能灭活凝血因子Va和VIIIa，而蛋白C与EPCR的结合则明显增强凝血 酶-凝血酶调节素复合体对蛋白C的活化速率。这些相互作用的生理重要性 目前尚不清楚。但显然，蛋白C与EPCR的结合以磷脂非依赖性方式严格 依赖于Gla结构域的存在(Esmon等，Haematologica 1999；84；363-368)。
APC在血浆中受蛋白C抑制剂以及α-1-抗胰蛋白酶和α-2-巨球蛋白的 抑制。
据Mather等，EMBO J1996；15；6822-6831的报道，人类APC的实验 性三维结构已确定到2.8的分辨率水平。他们报道了不含Gla结构域的 APC的X-线结构。此结构包含共价结合的抑制剂(D-Phe-Pro-Arg氯甲基酮， PPACK)。
蛋白C现已从通过单克隆抗体亲和层析制备的凝血酶原浓缩物中分 离。此外，蛋白C也可以通过哺乳动物细胞的表达而重组产生或者通过修 饰蛋白C而获得。
APC可用于治疗遗传性和获得性蛋白C缺陷，有人建议将APC作为抗 凝剂用于以下患者：一些形式的狼疮，发作(stroke)或心肌梗塞之后，静脉 血栓，弥散性血管内凝血(DIC)，败血性休克，栓塞(emboli)如肺栓塞，移植 如骨髓移植，烧伤，妊娠，重大外科手术/创伤以及成人呼吸窘迫综合征 (ARDS)。
重组APC由Eli Lilly和Co制备，治疗脓毒症的III期临床试验(Bernard 等，N Engl J Med(2001)，344，pp.699-709)已于近期完成。严重脓毒症患者 在96小时内以24μg/kg/h的剂量灌输给药。
但是，由于APC的半寿期短，必需用相对较高的剂量和频繁的给药来 达到并维持所需的治疗或预防效应。结果是，很难对剂量进行充分调整， 而频繁地静脉给药高水平APC的需要将带来问题并且花费较高。
具有较长循环半寿期的分子将减少必需的给药次数并有效提供更好的 治疗性APC水平，同时治疗效应也增强。
APC的循环半寿期可以通过，例如，减少肾清除，减少蛋白裂解性降 解或减少抑制而得以增加。这可以通过，例如将APC与非多肽组分偶联来 实现，所述非多肽组分如PEG或碳水化合物，它们能导致对所述蛋白的肾 清除减少和/或有效阻断蛋白裂解性酶或抑制剂与上述蛋白的生理接触。此 外，这也可以通过使蛋白C分子突变来实现，所述突变导致蛋白C分子保 留活性但阻断了抑制剂与该蛋白的结合。
PEG化野生型APC的描述参见JP 8-92294。
WO 91/09960公开了一种杂合蛋白，它在蛋白C的重链部分包含修饰。
WO 01/59084描述了蛋白C变体，它包含D167F+D172K取代并且在位 置10，11，12，32，194，195，228，149，254，302或316还包含至少一 个取代。WO 01/59084中公开的变体据称具有增强的抗凝活性。
WO 98/44000广泛描述了具有增强的酰胺裂解活性的蛋白C变体。
EP 0 323 149描述了蛋白C的酶原形式，它在重链中具有以下突变： D167F/G/Y/W。这些变体据称对凝血酶活化作用的敏感性增加。
WO 00/66754报道了对位置194，195，228，249，254，302或316的 天然残基进行取代导致人血中APC的半寿期比野生型APC增加。WO 00/66754中公开的变体不包括在本发明的范围内。
WO 99/63070描述了C-末端截短型蛋白C。
EP 0 946 715报道了嵌合的蛋白C多肽，其中蛋白C的Gla结构域被 来自其它维生素K依赖性多肽(如凝血因子VII，凝血因子X和凝血酶原) 的Gla结构域代替。
WO 99/20767和WO 00/66753公开了维生素K-依赖性多肽变体，它们 在Gla结构域中包含修饰。
US 5,453,373公开了人类蛋白C的衍生物，它们的糖基化模式和活化 区都已改变，如N313Q和N329Q。US 5,453,373中公开的变体不包括在本
发明的范围内。
US 5,460,953公开了编码酶原形式的蛋白C的DNA序列，它们经修饰 去掉了一或多个天然糖基化位点。更具体地，US 5,460,953公开了变体N97Q， N248Q，N313Q和N329Q。US 5,460,953中公开的变体不包括在本发明的范 围内。上述现有技术文献中公开的变体都不包括在本发明的范围内。
US 5,270,178涉及特异性蛋白C变体，其中I 171已被删除，Asp已由 Asn取代。
US 5,041,376涉及鉴定并掩蔽转运型蛋白的功能性位点或表位的方法， 其中引入了额外的N-连接型糖基化位点。
US 5,766,921涉及对人血浆或αl-抗胰蛋白酶灭活作用的抗性已增强的 蛋白C变体，其重链中包含来自相应的牛型重链的取代。
WO 01/57193报道了包含双突变的蛋白C变体，其中一个突变发生在 位置10，11，32或33，另一突变发生在位置194，195，228，249，254， 392或316。
WO 01/36462涉及蛋白C变体，它在位置12包含取代，并任选在位置 10和/或11还有取代。
WO 00/26354涉及制备过敏原性减弱的糖基化蛋白变体的方法。
WO 00/26230涉及筛选免疫原性减弱的蛋白变体的方法。
人野生型蛋白C，包括其前体形式，的DNA序列和相应氨基酸序列公 开在US 4,775,624和US 4,968,626中。
上述专利/专利申请中公开的任一种变体都不包括在本发明的范围内。
发明简述
本发明涉及蛋白C的多肽变体与非多肽组分的新偶联物，制备所述偶 联物的工具和方法，包含所述偶联物的药物组合物，以及所述偶联物在治 疗中的用途，尤其是治疗各种凝血疾病。本发明还涉及所述偶联物的多肽 部分。
相应地，本发明第一方面涉及含有至少一个与蛋白C多肽共价相连的 非多肽组分的偶联物，所述蛋白C多肽包含不同于亲本蛋白C多肽的氨基 酸序列，其区别在于引入和/或去除了至少一个含有与所述非多肽组分相连 的基团的氨基酸残基。
本发明另一方面涉及亲本蛋白C多肽的变体，所述变体在选自下组的 位置包含取代：D172，D189，S190，K191，K192，K193，D214，E215，S216， K217，K218，L220，V243，V245，S250，K251，S252，T253，T254，D255，L296， Y302，H303，S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310，R312，T315，F316， V334，S336，N337，M338，I348，L349，D351，R352，E357，E382，G383，L386， L387和H388，前提是，所述取代并非选自：T254S，T254A，T254H，T254K， T254R，T254N，T254D，T254E，T254G，T254Q，Y302S，Y302A，Y302T，Y302H， Y302K，Y302R，Y302N，Y302D，Y302E，Y302G，Y302Q，F316S，F316A，F316T， F316H，F316K，F316R，F316N，F316D，F316E，F316G和F316Q。
本发明另一方面涉及本发明偶联物的多肽部分。
本发明还有一方面涉及编码本发明偶联物中多肽部分的核苷酸序列， 编码本发明多肽变体的核苷酸序列，包含本发明核苷酸序列的表达载体， 以及包含本发明核苷酸序列或本发明表达载体的宿主细胞。
本发明还有一方面涉及含有本发明偶联物或变体的药物组合物，以及 制备和应用本发明的偶联物和变体的方法。
发明详述
定义
在本申请和本发明的全文中，使用下列定义：
术语“偶联物”(或可互换为“偶联的多肽”)表示由一个或多个多肽与 一个或多个非多肽组分(如聚合物分子、亲脂化合物、糖组分或有机衍生剂) 共价连接而形成的杂合(指复合或嵌合)分子。优选地，偶联物在相关浓度和 条件下可溶，即在生理液体如血液中可溶。本发明偶联多肽的实例包括糖 基化多肽和/或PEG化多肽。
术语“共价连接”表示多肽与非多肽组分彼此直接共价连接，或者通 过一个或多个间插组分，如桥、间隔臂或连接组分，间接地共价连接。
术语“非偶联多肽”是偶联物的多肽部分。
本文所用术语“非多肽组分”表示不同于由氨基酸单体通过肽键连接 而成的肽聚合物的、能与本发明多肽的连接基团偶联的分子。此类分子的 优选实例包括聚合物分子、糖组分、亲脂性化合物或有机衍生剂。在本文 中用于本发明的偶联物时，应理解为非多肽组分通过多肽连接基团连接到 偶联物的多肽部分。如上说明，非多肽组分可能直接共价地连接到连接基 团，或通过一个或多个间插组分，如桥、间隔臂或接头组分，间接地共价 连接到连接基团。
术语“聚合物分子”是由两个或多个单体共价连接形成的分子，其中 所述单体无一是氨基酸残基，但所述聚合物不是人白蛋白或另一种丰富血 浆蛋白。术语“聚合物”可与术语“聚合物分子”互换。
术语“糖组分”是指含有一或多个单糖残基的含糖分子，它能通过体 内或体外糖基化而与多肽连接(以产生糖基化多肽形式的多肽偶联物)。术语 “体内糖基化”是指通过，例如N-连接和O-连接糖基化作用，而在体内出 现(即在表达所述多肽的糖基化细胞中翻译后加工期间出现)的任何糖组分 连接基团。实际上的寡糖结构很大程度上取决于相关的糖基化生物。术语 “体外糖基化”是指体外产生的合成性糖基化作用，通常涉及将糖组分与 多肽的连接基团相连，可选用交联剂。体内和体外糖基化将在下文详述。
“N-糖基化位点”具有序列N-X-S/T/C，其中X是除了脯氨酸以外的 任何氨基酸，N是天冬酰胺，S/T/C是丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸，优选丝 氨酸或苏氨酸，最优选苏氨酸。“O-糖基化位点”是丝氨酸或苏氨酸残基的 -OH基。
术语“连接基团”表示多肽中能与非多肽组分如聚合物分子、糖组分、 亲脂性化合物或有机衍生剂偶联的功能基团，特别是其氨基酸残基或糖组 分。有用的连接基团及其相配的非多肽组分见下表。
连接 基团 氨基酸 非多肽组分的实 例 偶联方法/- 活化的PEG 参考文献 -NH2  N末端， 聚合物，例如 mPEG-SPA Shearwater Inc.Delgado et al.，
Lys，His， Arg PEG，带酰胺基 或亚胺基 Tresylated mPEG Critical reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9(3，4)： 249-304(1992) -COOH C末端， Asp，Glu 聚合物，例如 PEG，带酯或酰 胺基 寡糖组分 mPEG-Hz 体外偶联 Shearwater Inc. -SH Cys 聚合物，例如 PEG，带二硫键， 马来酰亚胺或乙 烯砜基团 寡糖组分 PEG-乙烯砜 PEG-马来酰 亚胺 体外偶联 Shearwater Inc.Delgado et al.， Critical reviews in Therapeutic Drng Carrier Systems 9(3，4)： 249-304(1992) -OH Ser，Thr， -OH，Lys 寡糖组分 具有酯，乙醚，氨 基甲酸酯，碳酸盐 的PEG 体内O-连接 的糖基化 -CONH2 Asn作为 N糖基化 位点的一 部分 寡糖组分 聚合物，例如PEG 体内N糖基 化 芳香族 残基 Phe，Tyr， Trp 寡糖组分 体外偶联 -CONH2 Gln 寡糖组分 体外偶联 Yan and Wold，Biochemistry， 1984，Jul 31；23(16)：3759-65 醛酮 氧化的寡 糖 聚合物，例如 PEG，PEG-酰肼 PEG化 Andresz et al.，1978， Makromol.Chem.179：301， WO92/16555，WO02/23114 胍 Arg 寡糖组分 体外偶联 Lundblad and Noyes，Chemical Reagents for Protein Modification，CRC Press Inc.， Florida，USA 咪唑环 His 寡糖组分 体外偶联 与胍相同
对于体内N-糖基化来说，术语“连接基团”以非常规方式用于表示构 成N-糖基化位点的氨基酸残基。尽管N-糖基化位点的天冬酰胺残基是在糖 基化期间与糖组分连接的残基，但除非该N-糖基化位点存在其它氨基酸残 基，否则不能实现所述连接。
因此，当非多肽组分是糖组分，并且偶联是通过N-糖基化实现时，术 语“含有与非多肽组分连接的基团的氨基酸残基”与目的多肽的氨基酸序 列改变联用，应理解为构成N-糖基化位点的一个或多个氨基酸残基被改变， 从而使功能性N-糖基化位点被引入氨基酸序列或从所述序列中除去。
氨基酸的命名和原子的命名(如，CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、 C等)按蛋白数据库(PDB)(www.pdb.org)的定义来用，这些名称是根据IUPAC 命名法命名的(IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides(residue names，atom names etc.)，Eur.J.Biochem.138，9-37(1984)，并 在Eur.J.Biochem.152，1(1985)中对它们进行更正。
术语“氨基酸残基”表示包含在下组中的氨基酸残基：丙氨酸(Ala或 A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、笨丙氨 酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖 氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或 N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser 或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr 或Y)残基。
用于鉴定氨基酸位置/取代的术语举例说明如下：给定氨基酸序列中的 K174表示SEQ ID NO.2或4所示氨基酸序列中第174位被赖氨酸残基占据。 K174S表示第174位的赖氨酸残基被丝氨酸残基取代。备选取代可用“/” 表示，如K174S/T表示第174位的赖氨酸被丝氨酸或苏氨酸残基所取代。 多重取代用“+”表示，如D172N+K174S表示第172位天冬氨酸残基被天 冬酰胺残基所取代，并且第174位的赖氨酸残基被丝氨酸残基取代。额外 氨基酸的插入如下表示：在K174之后插入一个丙氨酸残基，表示为 K174KA。氨基酸残基的缺失以星号表示。例如，第174位赖氨酸的缺失表 示为K174*。除非另有说明，此处氨基酸残基的序号对应于SEQ ID NO：2 或4所示的氨基酸序列。
术语“不同于”当与特定突变联用时，是指除特定的氨基酸差异外允 许存在另外的差异。例如，除了去除和/或引入包含非多肽组分连接基团的 氨基酸残基外，蛋白C多肽可能还包含与这些氨基酸残基的引入和/或去除 无关的其它取代、插入或缺失。因此，除了本文公开的旨在去除和/或引入 非多肽组分连接基团的氨基酸改变外，应理解本发明多肽偶联物的氨基酸 序列，在需要时可包含不一定必须与连接位点的引入或去除相关的其它改 变，即其它的取代、插入或缺失。例如，这些改变可能包括去除N-和/或 C-末端的一个或多个氨基酸残基，或在N-和/或C-末端添加一个或多个额外 的氨基酸残基，如在N-末端添加一个甲硫氨酸残基，以及“保守氨基酸取 代”，即，取代是在具有相似特性的氨基酸(如，小氨基酸，酸性氨基酸，极 性氨基酸，碱性氨基酸，疏水氨基酸和芳香族氨基酸)之间进行。
本发明中的保守取代的实例具体可选自下表所列出的组。
  1 丙氨酸(A)    甘氨酸(G)  丝氨酸(S)  苏氨酸(T)   2 天冬氨酸(D)  谷氨酸(E)   3 天冬酰胺(N)  谷氨酰胺(Q)   4 精氨酸(R)    组氨酸(H)  赖氨酸(K)   5 异亮氨酸(I)  亮氨酸(L)  甲硫氨酸(M)  缬氨酸(V)   6 苯丙氨酸(F)  酪氨酸(Y)  色氨酸(W)
本文中术语“前体蛋白C”是指由DNA编码的蛋白C形式，即，它包 括信号肽(残基-42至-1)，轻链(残基1-155)，Lys-Arg二肽(残基156-157)以 及重链(158-419)，包括活化肽(残基158-169)，见SEQ ID NO：2。
术语“双链酶原蛋白C”是指分泌的无活性蛋白C形式，它包括轻链 (残基1-155)和重链(158-419)，其中包括活化肽(158-169)，见SEQ ID NO：4。
术语“单链酶原蛋白C”是指无活性的蛋白C形式，包括轻链(残基 1-155)，重链(158-419)，包括活性肽(158-169)，以及Lys-Arg二肽(残基 156-157)，见SEQ ID NO：4。
术语“酶原蛋白C”用于指单链和双链形式的酶原蛋白C。
术语“活化的蛋白C”，“活化的人类蛋白C”，“APC”或“人APC” 用于指活化的酶原，它们包括SEQ ID NO：4的轻链(残基1-155)和重链(不 含活化肽)。后一种氨基酸序列，即，活化的蛋白C的氨基酸序列有时在本 文中称为“SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中的APC部分”。
术语“蛋白C”包括所有如上所述的蛋白C形式，即“前体蛋白C” 形式，“酶原蛋白C”形式(单链形式以及双链形式)和“活化的蛋白C形式”。
术语“亲本”是指将要根据本发明进行改进的分子。通过本发明进行 修饰的亲本多肽可以是任何蛋白C多肽，并因此可以源自任何来源，例如 非人哺乳动物来源，但优选亲本多肽是人的蛋白C(即，人的前体蛋白C， 人的酶原蛋白C或人衍生的蛋白C)或其片段或变体。
片段是全长人的蛋白C序列的一部分，例如其C-末端或N-末端截短型。 亲本蛋白C多肽片段的具体例子包括C末端截短1-15个氨基酸残基和/ 或N-末端截短1-3个氨基酸残基的人的蛋白。
如上所述，亲本蛋白C多肽还可包含人的蛋白C的变体。人蛋白C变 体的具体例子包括，例如在N-末端添加甲硫氨酸残基的变体，以及含有一 或多个上述保守氨基酸取代的变体。变体的其它例子包括，在蛋白C的Gla 结构域中有一或多个氨基酸被取代或者其中的整个蛋白C Gla结构域已经 被另一种Gla结构域(如蛋白S的Gla结构域)取代的蛋白C变体。
术语(亲本多肽)的变体是指一种多肽，它与它的亲本多肽有一或多个氨 基酸残基不同，通常有1-15个氨基酸残基(如1，2，3，4，5，6，7，8，9， 10，11，12，13，14或15个氨基酸残基)，例如，1-10氨基酸残基或1-5 个氨基酸残基不同。
术语“突变”和“取代”在此可互换使用。
术语“核苷酸序列”表示两个或多个核苷酸分子的连续片段。核苷酸 序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源或其任意组合。
术语“聚合酶链反应”或“PCR”通常指体外扩增所需核苷酸序列的 方法，如美国专利4683195所述。PCR方法一般涉及使用能与模板核酸优 先杂交的寡核苷酸引物进行引物延伸合成反应，并使此反应重复多轮。
“细胞”、“宿主细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”在本文中可互换 使用，所有这些术语都应当理解为包括细胞生长或培养所产生的后代。
“转化”和“转染”可互换使用，指将DNA引入细胞的过程。
“可操作连接”指两个或多个核苷酸序列通过酶促连接等方式共价连 接在彼此相关的构象中，使序列行使正常功能。例如，编码前序列或分泌 前导序列的核苷酸序列如果表达为参与多肽分泌的前蛋白，则被可操作连 接到该多肽的核苷酸序列上；启动子或增强子如果要影响编码序列的转录， 则与该序列可操作连接；核糖体结合位点如果要处在促进翻译的位置，则 与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接”意指被连接的核苷酸序列是 邻接的，在分泌前导序列的情况下，是邻接的而且在阅读状态下。连接发 生在方便的限制性位点。如果不存在此类位点，那么使用合成的寡核苷酸 衔接子或接头，并使用标准的重组DNA方法。
术语“引入”主要指取代现有的氨基酸残基，也指插入另外的氨基酸 残基。
术语“除去”主要指用另外的氨基酸残基取代将要被除去的氨基酸残 基，也指删除(不经取代)将要被除去的氨基酸残基。
术语“功能性体内半寿期”使用其通常的含义，即多肽或偶联物在体 内/靶器官中仍具有50％生物活性的时间，或者多肽或偶联物的活性为最初 活性的50％的时间。作为功能性体内半寿期测定法的备选方法，可测定“血 清半寿期”，即，50％的多肽或偶联物分子在被清除之前在血浆或血流中循 环的时间。血清半寿期的测定常常比功能性体内半寿期的测定简单，并且 血清半寿期的大小通常可以很好地说明功能性体内半寿期大小。血清半寿 期的其它可替换术语包括“血浆半寿期”、“循环半寿期”、“血清清除”、 “血浆清除”和“清除半寿期”。多肽或偶联物通过网状内皮系统(RES)、 肾、脾或肝中一个或多个的作用，通过组织因子、SEC受体或其它受体介 导的清除作用，或通过特异或非特异的蛋白水解作用而清除。清除一般取 决于大小(相对于肾小球过滤的截留值而言)、电荷、连接的碳水化合物链， 以及是否存在该蛋白的细胞受体。将要保留的功能通常选自抗凝活性、酰 胺裂解活性或受体结合活性。功能性体内半寿期和血清半寿期可通过本领 域已知的任何合适方法来测定。
涉及功能性体内半寿期或血浆半寿期的术语“增加”用于表示偶联物 或多肽的相应半寿期经可比条件下的测定，相对于参照分子(如APC)有统计 学显著的增加。通常，当对多肽的清除、蛋白裂解性降解和/或抑制减少时， 功能性体内半寿期或血清半寿期增加。因此优选的偶联物是下述偶联物， 当它们为活性形式时，与人的APC相比，功能性体内半寿期或血清半寿期 增加。特别优选的偶联物是下述偶联物，它们的血清半寿期(或功能性体内 半寿期)与人APC的血清半寿期(或功能性体内半寿期)的比利为至少1.25， 更优选至少1.50，如至少1.75，例如至少2，还更优选至少3，如至少4， 例如至少5，最优选至少6，如至少7，例如至少8，至少9或至少10。
本发明多肽或偶联物的相关清除机制包括一或多种网状内皮细胞系统 (RES)，肾，脾或肝，受体介导的降解，或者特异性或非特异性蛋白裂解。 术语“肾清除”使用其通常的含义，即发生在肾的清除，例如，通过肾小 球过滤、肾小管排泄或在肾小管细胞中的降解来完成。肾清除取决于偶联 物的物理特性，包括分子量、大小(相对于肾小球过滤的截留值而言)、对称 性、形状/刚性和电荷。肾清除的截留值一般认为是分子量约67kDa。肾清 除一般可通过任何合适的试验来测定，如已建立的体内试验。例如，可将 标记(如，放射标记或荧光标记)的多肽偶联物给予患者，并测定所收集的患 者尿液中的标记物活性来测定肾清除。肾清除的减少可经过与参照分子， 如APC进行比较而确定。
术语“活性”，“APC活性”或“活化的蛋白C的活性”是指本发明偶 联物的活性形式保留了APC的基本特性。
本文实施例9描述了一种合适的体外APC活性试验(称为“APC酰胺 裂解试验”)。因此，更具体地，本发明的偶联物在活性形式时，用本文实 施例9所述的“APC酰胺裂解试验”测得活性为人APC的至少10％，则可 归类为具有“APC活性”。优选地，所述偶联物的活性为人APC活性的至 少20％，如至少30％，更优选所述偶联物的活性为人APC活性的至少40％， 如至少50％，还更优选所述偶联物的活性为人APC活性的至少60％，如至 少70％，最优选所述偶联物的活性为人APC活性的至少80％，如至少90％。 在一个特别优选的实施方案中，当用本文实施例9所述的“APC酰胺裂解 试验”检测时，所述偶联物具有与人APC基本相同或更高的活性。应理解， 本发明的偶联物和野生型人APC应该在同等条件下进行试验，即当如本文 实施例9所述进行试验时，这两种蛋白的浓度应相同。
或者，“APC活性”可以在本文实施例10所述的“ACP凝血试验”中 进行体外分析。更具体地，本发明的偶联物在活性形式时，如果用本文实 施例10所述的“APC凝血试验”测得抗凝活性为人APC的至少5％，则可 归类为具有“APC活性”。优选地，所述偶联物的抗凝活性为人APC的至 少10％，如至少20％，例如至少30％，更优选所述偶联物的抗凝活性为人 APC的至少40％，如至少50％，还更优选所述偶联物的抗凝活性为人APC 的至少60％，如至少70％，最优选所述偶联物的抗凝活性为人APC的至少 80％，如至少90％。在一个特别优选的实施方案中，当用本文实施例10所 述的“APC凝血试验”检测时，所述偶联物具有与人APC基本相同或更高 的抗凝活性。典型的PC活性区间的实例如，人APC的抗凝活性的5-75％， 如10-50％，如10-40％。应理解，本发明的偶联物和野生型人APC应该在 同等条件下进行试验，即当如本文实施例10所述进行试验时，这两种蛋白 的浓度应相同。
术语“对α-1-抗胰蛋白酶灭活作用的抗性增加”和“对人血浆的灭活 作用的抗性增加”分别主要是指本发明偶联物受α-1-抗胰蛋白酶或人血浆的 抑制的程度低于人APC。为了确保本领域技术人员在其早期开发中能选出 有效的和优选的偶联物，本发明人开发了合适的初步试验，本领域技术人 员可以轻易地实施所述试验，从而初步评估其偶联物的性能。因此，“α-1- 抗胰蛋白酶灭活试验”(本文实施例11)，“人血浆灭活试验I”(本文实施例 12)和“人血浆灭活试验II”(本文实施例13)可用于初步评估所选偶联物的 潜力。通过使用上述任一种或所有试验，可以评估所选偶联物抵抗α-1-抗胰 蛋白酶和/或人血浆的灭活作用的适应性，基本原理是，如果一种偶联物受 到α-1-抗胰蛋白酶和/或人血浆的强烈抑制，通常不必再进行其它试验。
因此，本文特别优选的偶联物是，当为其活性形式，并且当用16.6μM 的抑制剂浓度经本文实施例11所述的“α-1-抗胰蛋白酶灭活试验”检测时， 具有至少20％的残余活性。优选所述偶联物具有至少30％的残余活性，如 至少40％，更优选至少50％，如至少60％，还更优选至少70％，如至少 75％，最优选至少80％，如至少85％。
或者，或除了上述试验以外，还可用“人血浆灭活试验I”来检验所选 偶联物的适应性。因此，本文特别优选的偶联物是，当为其活性形式，并 且用本文实施例12所述的“人血浆灭活试验I”检测时，具有至少20％的 残余活性。优选所述偶联物具有至少30％的残余活性，如至少40％，更优 选至少50％，如至少60％，还更优选至少70％，如至少75％。
或者，或除了上述试验以外，还可用“人血浆灭活试验II”来检验所 选偶联物的适应性。因此，本文特别优选的偶联物是，用本文实施例13所 述的“人血浆灭活试验II”检测时，其活性形式的体外半寿期与人APC的 体外半寿期的比例至少为1.25，优选至少1.5，如至少2，更优选至少3， 如至少4，还更优选至少5，如至少6，最优选至少7，如至少8，尤其是至 少9，如至少10。
术语“减弱的免疫原性”是指本发明的偶联物比在相当条件下测定的 对照分子，例如野生型人APC或野生型人蛋白C，产生可测定的更低的免 疫应答。所述免疫应答可以是细胞免疫应答或抗体介导的应答(对免疫原性 的进一步定义参见，例如Roitt：Essential Immunology(第8版，Blackwell))。 通常，抗体反应性降低可指示免疫原性减弱。免疫原性减弱可利用本领域 已知的任何适当方法，例如体外或体内方法进行测定。
术语“至少25％的侧链暴露在表面”和“至少50％的侧链暴露在表 面”参考实施例1中详细描述的计算方法等来限定。
本发明的偶联物
本发明偶联物是开发蛋白C改进分子的总体新策略的结果。更具体的， 通过去除和/或引入含有所述非多肽组分的连接基团的氨基酸残基，有可能 特异地改变多肽，使该分子更易于与选定的非多肽组分偶联，使偶联模式 最佳化(如，确保非多肽组分以最适量最佳分布在蛋白C分子表面并确保分 子中只存在将偶联的连接基团)，从而获得新的偶联分子，其与现有的蛋白 C分子相比，具有或不具有APC活性，此外具有一种或多种改进的特性。 例如，当含有所选非多肽组分的连接基团的氨基酸残基总数增加到或降低 到一个最佳水平时，该偶联物的肾清除率通常因偶联导致的分子形状、大 小和/或电荷的改变而显著降低。此外，我们发现，有可能设计非多肽组分 与所述偶联物的多肽部分中连接基团的连接，致使人血浆或特定抑制剂(如 α-1-抗胰蛋白酶)的灭活作用显著减弱(见下文)。
包含非多肽组分连接基团的氨基酸残基，无论是被去除或引入，其选 择基于所选非多肽组分的性质，并且，多数情况下，基于多肽和非多肽组 分之间偶联所用的方法。例如，当非多肽组分是聚合物分子，如聚乙二醇 或聚环氧烷衍生的分子时，包含连接基团的氨基酸残基可选自：赖氨酸， 半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，组氨酸，或酪氨酸，优选半胱氨酸和赖氨 酸，特别优选赖氨酸。当非多肽组分是糖组分时，连接基团可以是，例如 体内糖基化位点，优选N-糖基化位点。
一旦非多肽组分的连接基团被引入本发明的蛋白C多肽中或从所述多 肽中被去除时，进行修饰的多肽部位通常如下选择：
所述位置优选位于蛋白C多肽的表面，更优选是由有25％以上(更优选 50％以上)侧链暴露于表面的那些氨基酸残基占据的位置。所述位置根据对 人野生型APC分子的三维结构的分析来确定，所用方法如本文方法部分所 述。此外，在含有与野生型人蛋白C同源的氨基酸序列的非人APC多肽(包 括其变体)中，同源位置可通过对相应序列或三维结构进行适当对比排列而 轻易确定。
为了确定连接基团的最佳分布，基于所述多肽的三维结构计算该多肽 表面的氨基酸残基间的距离。更具体的，对包含这种连接基团的氨基酸残 基的CB间的距离，或一种氨基酸的功能基团(赖氨酸的NZ，天冬氨酸的 CG，谷氨酸的CD，半胱氨酸的SG)与包含连接基团的另一种氨基酸残基的 CB间的距离进行了确定。对于甘氨酸，使用CA而非CB。在本发明偶联 物的多肽部分中，任何所述距离优选大于8，特别优选大于10，以避免 或降低异源偶联。
如本文后续章节所述，根据本发明将改变的氨基酸残基的总数(与亲本 蛋白C分子相比)通常不超过15个。被引入的氨基酸残基的确切数目和类 型取决于，例如，所需的偶联特性和程度(例如，非多肽组分的同一性，需 要或可能有多少非多肽组分与所述多肽偶联，需要实施还是避免所述多肽 偶联，等等)。优选，本发明偶联物的多肽部分或本发明的多肽包含下述氨 基酸序列，其与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列有1-15个氨基酸残基不同， 如1-8个或2-8个氨基酸残基不同，例如1-5个或2-5个氨基酸残基不同。 因此，本发明偶联物的多肽部分或本发明的多肽包含与SEQ ID NO：4所示 氨基酸序列有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个 氨基酸不同的氨基酸序列。
优选，本发明偶联物与野生型人APC相比，具有一项或多项以下改进 的特性：功能性体内半寿期增加，血清半寿期增加，对抑制剂的抗性增加， 肾清除减少，免疫原性减弱和/或生物可利用性增加。本发明的偶联物相对 于现有APC产物有多种优点，包括注射时间更长(longer duration between injections)，给药的蛋白更少，以及副作用更小。此外，抗凝活性减弱可能 有利于在维持APC偶联物的抗炎效应的同时降低出血的风险。这在偶联物 具有延长的血浆半寿期的情况中尤其重要。与允许更有效和安全的治疗的 抗凝活性相比，上述新特性应该能增强抗炎效应。
通常，本发明偶联物的分子量至少约67kDa，优选至少约70kDa，但 较小的分子量可以使肾清除减少。已发现聚合物分子(如PEG)或所引入的糖 基化位点对调整偶联物的分子量特别有效。
本发明的偶联物包含足够数量或类型的非多肽组分，以改进蛋白C多 肽的上述一或多种所需特性。通常，本发明的偶联物包含1-10个第一非多 肽组分，尤其是1-8或1-5个第一非-多肽组分。
本发明的偶联物还可包含至少一个与第一非-多肽组分不同的第二非 多肽组分。例如，本发明偶联物可包含1-10个第二非-多肽组分，尤其1-8 或1-5个第二非-多肽组分。例如，当第一非-多肽组分为糖组分(尤其是体内 连接的糖组分)时，第二非-多肽组分可以是PEG型聚合物。所述体内连接 的糖组分可以与所述多肽的天然体内糖基化位点相连，或与引入的位点相 连。
在一个非常优选的实施方案中，本发明的非-多肽组分被引入蛋白C的 活性位点区，基本原理是，在蛋白C分子的这一特定区域中引入一个或多 个非多肽组分将削弱抑制剂(如α-1-抗胰蛋白酶)与APC的结合，但同时仍 保留实质上的APC活性。这导致所述偶联物具有比野生型人APC显著延长 的半寿期，因为肝受体对抑制剂/APC复合体的消除作用得以避免或至少是 减少了。对位于蛋白C的活性位点区的氨基酸残基进行选择可如本文实施 例2详述。
本文所用术语“活性位点区”参照本文实施例2的限定，在实施例2 中，显示了组成活性位点区的实际氨基酸残基。
本发明特别优选的实施方案中，非多肽组分的连接基团被引入活性位 点区中由下述氨基酸残基占据的位置，所述氨基酸残基有至少25％的侧链 暴露在表面(见本文实施例3)，即，非多肽组分的连接基团被引入选自下组 的位置：D172，D189，S190，K191，K192，K193，D214，E215，S216，K217，K218， L220，V243，V245，N248，S250，K251，S252，T253，T254，D255，L296，Y302， H303，S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310，K311，R312，N313，R314， T315，F316，V334，S336，N337，M338，I348，L349，D351，R352，E357，E382， G383，L386，L387和H388(排除H211和C384)。优选所引入的连接基团是 糖组分的连接基团，特别是体内N-糖基化位点(参见题为“以糖组分作为非 -多肽组分的本发明偶联物”的章节)。
以糖组分作为非多肽组分的本发明偶联物
如上文所述，本发明一个优选实施方案涉及引入了至少一个与蛋白C 多肽共价连接的糖基化位点(尤其是体内N-糖基化位点)的偶联物，所述蛋 白C多肽包含不同于亲本蛋白C多肽的氨基酸序列，尤其是不同于SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其变体，不同之处在于至少一个引入的糖基化位点。
优选所述糖基化位点被引入由下述氨基酸残基占据的位置，所述残基 有至少25％(如至少50％)的侧链暴露在表面。这类氨基酸残基按照本文实 施例1所述来确定。应理解，当术语“至少25％(或至少50％)的侧链暴露 在表面”与体内N-糖基化位点的引入联用时，它表示实际上与糖组分连接 的位置中氨基酸侧链的表面可接近特性。在很多情况下，必须在相对于实 际上与糖组分相连的天冬酰胺残基而言为+2的位置上引入丝氨酸或苏氨酸 残基(当然，除非此位置已被丝氨酸或苏氨酸残基占据)，这些引入了丝氨酸 或苏氨酸残基的位置可以被掩盖，即它有不到25％的侧链暴露在表面。
为了削弱抑制剂，如α-1-抗胰蛋白酶与APC的结合，优选将所述糖基 化位点引入活性位点区(如本文实施例2所限定)内由有至少25％的侧链暴 露在表面的那些氨基酸残基占据的位置(如本文实施例3所限定)，即优选将 体内N-糖基化位点引入：D172N+K174S，D172N+K174T，D189N+K191S， D189N+K191T，S190N+K192S，S190N+K192T，K191N+K193S， K191N+K193T，K192N+L194S，K192N+L194T，K193N+A195S， K193N+A195T，D214N，D214N+S216T，E215N+K217S，E215N+K217T， S216N+K218S，S216N+K218T，K217N+L219S，K217N+L219T， K218N+L220S，K218N+L220T，L220N+R222S，L220N+R222T， V243N+V245S，V243N+V245T，V245N+P247S，V245N+P247T，S250N， S250N+S252T，K251N，K251N+T253S，S252N，S252N+T254S，T253N+D255S， T253N+D255T，T254N+N256S，T254N+N256T，D255N+D257S， D255N+D257T，L296N，L296N+T298S，Y302N，Y302N+S304T，H303N， H303N+S305T，S304N+R306S，S304N+R306T，S305N+E307S，S305N+E307T， R306N+K308S，R306N+K308T，E307N+E309S，E307N+E309T， K308N+A310S，K308N+A310T，E309N+K311S，E309N+K311T， A310N+R312S，A310N+R312T，R312N+R314S，R312N+R314T， T315N+V317S，T315N+V317T，F316N+L318S，F316N+L318T，V334N， V334N+S336T，S336N+M338S，S336N+M338T，V339S，V339T，M338N， M338N+S340T，I348N+G350S，I348N+G350T，L349N+D351S，L349N+D351T， D351N+Q353S，D351N+Q353T，R352N+D354S，R352N+D354T， E357N+D359S，E357N+D359T，G383N+G385S，G383N+G385T， L386N+H388S，L386N+H388T，L387N+N389S，L387N+N389T， H388N+Y390S或H388N+Y390T。
更优选将体内N-糖基化位点引入：S190N+K192S，S190N+K192T， K191N+K193S，K191N+K193T，D189N+K191S，D189N+K191T，D214N， D214N+S216T，K217N+L219S，K217N+L219T，K251N，K251N+T253S， S252N，S252N+T254S，T253N+D255S，T253N+D255T，Y302N，Y302N+S304T， S305N+E307S，S305N+E307T，E307N+E309S，E307N+E309T，S336N+M338S， S336N+M338T，V339S，V339T，M338N，M338N+S340T，G383N+G385S， G383N+G385T，L386N+H388S或L386N+H388T。
还更优选将体内N-糖基化位点引入：D189N+K191T，K191N+K193T， D214N，K251N，S252N，T253N+D255T，Y302N，S305N+E307T， S336N+M338T，V339T，M338N，或G3833N+G385T；最优选将体内N-糖基化 位点引入：D189N+K191T，K191N+K193T，D214N，T253N+D255T， S305N+E307T，S336N+M338T，M338N，G383N+G385T或L386N+H388T。在 一个特别优选的实施方案中，所引入的体内N-糖基化位点选自 D189N+K191T，D214N或L386+H388T。
如上所述，对α-1-抗胰蛋白酶和/或人血浆的灭活作用的抗性增加，可 通过本文所述的“α-1-抗胰蛋白酶灭活试验”、“人血浆灭活试验I”或“人 血浆灭活试验II”来测定。
本发明的偶联物可包含单个体内糖基化位点(除了已经存在于97，248， 313和329位的糖基化位点以外)。但为了有效掩蔽亲本多肽表面的蛋白酶 切割位点和/或有效削弱抑制剂的结合，通常希望所述偶联物的多肽部分包 含一个以上的体内糖基化位点，尤其2-5个(额外的)体内糖基化位点，如2， 3，4或5个(额外的)体内糖基化位点，优选通过上文所列的一或多种取代来 引入所述糖基化位点。
此外，具有至少一个上述体内N-糖基化位点修饰的多肽的氨基酸序列 可能与亲本多肽不同在于，已引入至少一个如上文“本发明偶联物，其中 非多肽组分与半胱氨酸残基相连”章节所定义的半胱氨酸残基，或已引入 至少一个如上文“本发明偶联物，其中非多肽组分与非半胱氨酸残基相连” 章节所定义的非半胱氨酸残基。
而且，本发明偶联物的多肽部分还可包含额外的已知具有好处的突变。 例如，除了上述糖基化位点以外，所述偶联物的多肽部分还可在选自下组 的位置上包含取代：L194，A195，L228，Y249或它们的组合，尤其L194S， L194S+T245S或L194A+T254S(见WO 00/66754)。优选的额外取代的其它 实例包括，在已知易被蛋白裂解作用降解的位置或其附近，取代或引入一 或多个糖基化位点。其中一个已知易被蛋白裂解作用降解的位置是野生型 人APC的H10(见WO 98/48822)。
应理解，为了制备本发明该方面的偶联物，所述多肽必须在糖基化宿 主细胞中表达或者接受体外糖基化，所述细胞应能将糖组分连接在糖基化 位点上。糖基化宿主细胞的实例可参见下文题为“与糖组分的偶联”的章 节。
本发明偶联物，其中非多肽组分与半胱氨酸残基相连
本发明另一个优选实施方案涉及包含至少一个与蛋白C多肽共价连接 的非多肽组分(尤其是聚合物分子)的偶联物，所述蛋白C多肽包含不同于亲 本蛋白C多肽的氨基酸序列，尤其是不同于SEQ ID NO：4的氨基酸序列或 其变体，不同之处在于引入和/或去除(优选引入)至少一个半胱氨酸残基。 因此，在本发明一个优选实施方案中，所述非多肽组分具有半胱氨酸作为 连接基团。优选将所述半胱氨酸连接基团引入由下述氨基酸残基占据的位 置，所述氨基酸残基有至少25％(如至少50％)的侧链暴露在表面。这类氨 基酸残基如本文实施例1所限定。所述位置中，最优选那些在亲本多肽中 由T或S残基(优选S残基)占据的位置。相应地，带有半胱氨酸-修饰的偶 联物是将半胱氨酸残基引入至少一个选自下组的位置中的那些：S3，S11， S12，T37，S42，S61，T68，S75，S77，S82，S99，S119，S153，S190，S216，S252， T253，T268，S270，S281，S304，S305，T315，S332，S336，S340，S367，或S416， 所述位置更优选S3，S11，S12，S42，S61，S75，S77，S82，S99，S119，S153，S190， S216，S252，S270，S281，S304，S305，S332，S336，S340，S367或S416。
以如上所述的相似方式(参见上文题为“以糖组分为非多肽组分的本发 明偶联物”的章节)，优选将半胱氨酸残基引入活性位点区(如本文实施例2 所限定)内由有至少25％的侧链暴露在表面的那些氨基酸残基占据的位置 (如本文实施例3所限定)，即，优选将所述半胱氨酸残基引入选自下组的位 置：D172，D189，S190，K191，K192，K193，D214，E215，S216，K217，K218， L220，V243，V245，S250，K251，S252，T253，T254，D255，L296，Y302，H303， S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310，R312，T315，F316，V334，S336， V339，M338，I348，L349，D351，R352，E357，G383，E385，L386，L387或H388。 更优选将所述半胱氨酸残基引入D189，S190，K191，D214，K217，K251，S252， T253，Y302，S305，E307，S336，V339，M338，G383或L386。
该实施方案中所述偶联物的多肽部分通常包含1-10个引入的半胱氨酸 残基，尤其1-5或1-3个引入的半胱氨酸残基，例如1，2或3个引入的半 胱氨酸残基。
本发明这一方面的偶联物的非-多肽组分可以是，当使用给定的偶联方 法时，具有半胱氨酸残基作为连接基团的任何分子(如聚合物组分，亲脂基 团或有机衍生剂)，优选所述非-多肽组分是聚合物分子，如“与聚合物分子 的偶联”章节中所述的任何分子。优选所述聚合物分子选自线性或分支的 聚乙二醇或聚环氧烷。最优选，所述聚合物分子是PEG，如VS-PEG。所述 多肽与聚合物之间的偶联可通过任何合适的方法实现，如以“与聚合物分 子的偶联”为标题的章节中描述的，例如使用上述章节中所涉及的一步法 或多步法。当多肽仅包含一个可偶联的半胱氨酸残基时，优选与具有至少 约10kDa到至少约15kDa分子量(如约12kDa，约15kDa，或约20kDa)的第 一非多肽组分直接偶联，或者通过低分子量聚合物间接偶联(见 WO99/55377)。当偶联物包含两个或多个第一非多肽组分时，这些非多肽组 分各自的分子量通常为约5kDa，约10kDa，或约12kDa。
此实施方案中的偶联物可包含至少一个第二非多肽组分，如1-10，1-8， 1-5或1-3个所述组分。当第一非-多肽组分为聚环氧烷或PEG衍生的聚合 物时，第二非-多肽组分优选糖组分，尤其体内连接的组分。糖组分可以出 现在亲本多肽的一或多个天然糖基化位点，或出现在引入的糖基化位点。 适当的引入的糖基化位点，尤其N-糖基化位点，描述在题为“以糖组分为 非多肽组分的本发明偶联物”的章节中。
而且，本发明偶联物的多肽部分还可包含额外的已知具有好处的突变。 例如，除了上述引入的半胱氨酸残基以外，所述偶联物的多肽部分还可在 选自下组的位置包含取代：L194，A195，L228，Y249或它们的组合，尤其 L194S，L194S+T245S或L194A+T254S(见WO 00/66754)。优选的额外取代 的其它实例包括，在已知易被蛋白裂解作用降解的位置或其附近，取代或 引入一或多个半胱氨酸残基。其中一个已知易被蛋白裂解作用降解的位置 是野生型人APC的H10(见WO 98/48822)。
本发明偶联物，其中非多肽组分与非半胱氨酸组分连接
根据本文公开的内容，本技术人员可以理解，使用上文举例的针对糖 基化位点和半胱氨酸残基的方法，可以将包含其它连接基团的氨基酸残基 通过取代而引入亲本多肽。例如，可以将包含酸性基团的一或多个氨基酸 残基(谷氨酸或天冬氨酸)、酪氨酸、丝氨酸或赖氨酸引入上述位置(参见题 为“以糖组分为非多肽组分的本发明偶联物”和“本发明偶联物，其中非 多肽组分与半胱氨酸残基连接”的章节)。
本发明的多肽变体
本发明另一方面一般性涉及亲本蛋白C多肽的新变体。所述新变体是 制备本发明偶联物的重要中间化合物。此外，并且从以下公开的内容和本 文所提供的实施例可以看出，所述变体本身具有令人感兴趣的特性。
因此，本发明最广泛的方面涉及亲本蛋白C多肽的新变体，所述变体 组成本发明偶联物的多肽部分，更尤其是APC部分。如实施例所示，一些 变体中引入了一或多个糖基化位点，它们未被利用，但它们具有令人感兴 趣的特性，尤其是对α-1-抗胰蛋白酶抑制作用的抗性增加以及对人血浆灭活 作用的抗性增加。这些变体在活性位点区(如本文实施例2所限定)内包含至 少一个取代，尤其是，它们在活性位点区内由有至少25％的侧链暴露在表 面的那些氨基酸残基占据的位置(如本文实施例3所限定)包含氨基酸取代。 因此，本发明该方面优选的变体在选自下组的位置包含取代：D172，D189， S190，K191，K192，K193，D214，E215，S216，K217，K218，L220，V243，V245， S250，K251，S252，T253，T254，D255，L296，Y302，H303，S304，S305，R306， E307，K308，E309，A310，R312，T315，F316，V334，S336，N337，M338，I348， L349，D351，R352，E357，E382，G383，L386，L387或H388，条件是，所述取 代并非选自：T254S，T254A，T254H，T254K，T254R，T254N，T254D，T254E， T254G，T254Q，Y302S，Y302A，Y302T，Y302H，Y302K，Y302R，Y302N， Y302D，Y302E，Y302G，Y302Q，F316S，F316A，F316T，F316H，F316K，F316R， F316N，F316D，F316E，F316G或F316Q。
上文列出的，位于活性位点区内、由有至少25％的侧链暴露在表面的 那些氨基酸残基占据的位置表明，大量的这类位置由带电荷的氨基酸残基 占据。对蛋白C，尤其上述区域的三维结构分析发现，至少一部分带电残基 彼此相互作用。例如，据信K251与D214形成盐桥。而且，还可见成簇的 带负电的氨基酸残基(D214，E215和E357)。在不受任何具体理论束缚的条 件下，上述区域内带电荷的氨基酸残基，或者至少是一部分这样的氨基酸 残基，对于捕获和/或结合底物/抑制剂十分重要。因此，本发明特别优选的 氨基酸取代包括，活性位点区内由有至少25％的侧链暴露在表面的那些氨 基酸残基占据的位置上的带电氨基酸残基，被不带电的氨基酸残基，尤其 是不带电但具有极性侧链的氨基酸残基(Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn或Gln)取 代；以及活性位点区内由有至少25％的侧链暴露在表面的那些氨基酸残基 占据的位置上的带电氨基酸残基，被带相反电荷的氨基酸残基取代。
使带电荷的目标氨基酸残基变为带相反电荷，这类氨基酸取代的具体 实例包括：D172K，D172R，D189K，D189R，K191D，K191E，K192D，K192E， K193D，K193E，D214K，D214R，E215K，E215R，K217D，K217E，K218D， K218E，K251D，K251E，D255K，D255R，R306D，R306E，E307K，E307R， K308D，K308E，E309K，E309R，R312D，R312E，D351K，D351R，R352D， R352E，E357K，E357R，E382K和E382R，如D214K，D214R，E215K，E215R， K251D，K251E，E357K和E357R，e.g.D214K，D214R，K251D和K251E。
使带电荷的目标氨基酸残基被具有极性侧链的氨基酸取代，这类氨基 酸取代的具体实例包括：D172G/S/T/C/Y/N/Q，D189G/S/T/C/Y/N/Q， K191G/S/T/C/Y/N/Q，K192G/S/T/C/Y/N/Q，K193G/S/T/C/Y/N/Q， D214G/S/T/C/Y/N/Q，E215G/S/T/C/Y/N/Q，K217G/S/T/C/Y/N/Q， K218G/S/T/C/Y/N/Q，K251G/S/T/C/Y/N/Q，D255G/S/T/C/Y/N/Q， R306G/S/T/C/Y/N/Q，E307G/S/T/C/Y/N/Q，K308G/S/T/C/Y/N/Q， E309G/S/T/C/Y/N/Q，R312G/S/T/C/Y/N/Q，D351G/S/T/C/Y/N/Q， R352G/S/T/C/Y/N/Q，E357G/S/T/C/Y/N/Q和E382G/S/T/C/Y/N/Q，如 D214G/S/T/C/Y/N/Q，E215G/S/T/C/Y/N/Q，K251G/S/T/C/Y/N/Q和 E357G/S/T/C/Y/N/Q，例如D214Q，E215Q，K251Q和E357Q，尤其K251Q。 另一种有兴趣的取代可能是K251N+T253A。
有兴趣的取代的其它具体实例包括题为“以糖组分为非多肽组分的本 发明偶联物”和“本发明偶联物，其中非多肽组分与半胱氨酸残基连接” 的章节中所公开的那些，尤其是选自下组的取代：K251N，S252N，Y302N或 S190+K192T，优选选自K251N或S252N，最优选K251N。
可以理解，只要合适，与本发明偶联物有关的细节和具体描述(如，蛋 白C的活化，取代的数量，偶联物的配制，使用偶联物的说明针对α-1-抗 胰蛋白酶和人血浆的灭活作用的抗性增加)对于本发明的变体而言也是相同 或相似的。因此，只要合适，与本发明偶联物有关的声明和详述，在进行 必要的修正后，可以应用于本文公开的蛋白C变体。
本发明偶联物的非多肽组分
如上所述，本发明偶联物的非多肽组分优选选自聚合物分子、亲脂性 化合物、糖组分(通过体内糖基化的方式)和有机衍生剂。所有这些物质都可 为偶联物的多肽部分提供所需特性，特别是增加功能性体内半寿期和/或增 加血浆半寿期。偶联物的多肽部分可以仅与一种类型的非多肽组分偶联， 但也可以与两种或多种不同类型的非多肽组分偶联，例如，与聚合物分子 和糖组分偶联，与亲脂性基团和糖组分偶联，与有机衍生剂和糖组分偶联， 与亲脂性基团和聚合物分子偶联等。与两种或多种不同类型的非多肽组分 偶联可同时或按顺序进行。
制备本发明偶联物的方法
在下列章节“与亲脂性化合物的偶联”，“与聚合物分子的偶联”，“与 糖组分的偶联”和“与有机衍生剂的偶联”中描述与各种类型非多肽组分 的偶联。一般地，本发明的多肽偶联物如下制备：在有利于所述多肽表达 的条件下培养合适的宿主细胞，获取所述多肽，其中a)所述多肽包含至少 一个N-或O-糖基化位点，且所述宿主细胞是能进行体内糖基化的真核细胞， 和/或b)所述多肽于体外偶联非多肽组分。
应理解，对偶联的设计应使所得分子在所连接的非多肽组分的数量， 这类分子的大小和形式(如线性或分支)，以及在所述多肽上的连接位点各方 面最佳。使用的非多肽组分的分子量可，如基于希望达到的效果进行选择。 例如，如果偶联的主要目的是获得具有高分子量的偶联物(如减少肾清除)， 通常要偶联尽量少的高分子量非多肽组分，以获得期望的分子量。如果希 望掩蔽程度较高，可使用足量的低分子量非多肽组分(如分子量从约300Da 到约5kDa，如分子量从300Da到2kDa)。
与聚合物分子的偶联
与多肽偶联的聚合物分子可以是任何合适的聚合物分子，如天然或合 成的均聚物或杂聚物，分子量通常范围约300-100,000Da，如约 500-20,000Da，更优选约500-15,000Da，甚至更优选约2-12kDa，如约3-10 kDa。当此处所用术语“约”涉及某一分子量时，“约”就表示大约的平均 分子量，且反映这样一个事实，即在一定的聚合物制剂中通常有一定的分 子量分布。
均聚物的实例包括聚醇(即，聚-OH)、聚胺(即，聚-NH2)和聚羧酸(即， 聚-COOH)。杂聚物是含不同偶联基团(如羟基和氨基)的聚合物。
合适的聚合物分子的实例包括选自以下的聚合物分子：聚环氧烷 (PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分 支的PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚碳酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯共马来酸 酐，聚苯乙烯共马来酸酐，葡聚糖包括羧甲基葡聚糖，或任何其它适于减 小免疫原性和/或增加功能性体内半寿期和/或血清半寿期的生物聚合物。聚 合物分子的另一实例是人白蛋白或另一丰富的血浆蛋白。一般来说，聚亚 烷基二醇衍生的聚合物是生物相容的、无毒的、无抗原性的、无免疫原性 的，具有各种水溶性特性并易于从活的生物中分泌。
PEG是优选的聚合物分子，因为其与，例如多糖如葡聚糖相比仅仅具 有极少量的能交联的反应基团。特别感兴趣的是单功能PEG，如单甲氧基 聚乙二醇(mPEG)，因为它的偶联化学相对简单(仅仅一个反应基团可用于与 多糖上的连接基团偶联)。因此，交联的危险被减弱，所得多肽偶联物更均 一并且聚合物分子与多肽的反应更易于控制。
为了使聚合物分子与多肽共价连接，聚合物分子的羟基末端基团必须 为活化形式，即具有反应性功能基团(实例包括伯胺基团、酰肼(HZ)、巯基 (thiol)、琥珀酸酯(SUC)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基琥珀酰 胺(SSA)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基丁酸酯(SBA)、琥珀酰 亚胺基羧甲基化物(SCM)、苯并三唑碳酸酯(BTC)、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)、醛、硝基苯基碳酸酯(NPC)和tresylate(TRES))。适当活化的聚合物 分子有商品，例如可得自Shearwater Polymer，Inc.，Huntsville，AL，USA或得 自PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK。
或者，聚合物分子可通过本领域已知的常规方法，例如，如WO 90/13540 中所述活化。本发明中所使用活化型线性或分支聚合物分子的具体实例描 述于Shearwater Polymers，Inc.1997和2000目录(Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals，Polvethylene Glycol and Derivatives，引入本文供参考)。
活化的PEG聚合物的具体实例包括以下线性PEG：NHS-PEG(例如 SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG，和 SCM-PEG)，和NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG， CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG，包括其 mPEG形式；和分支的PEG如PEG2-NHS，包括其mPEG形式，以及US 5,932,462和US 5,643,575(都引入本文作为参考)公开的那些。此外，引入本 文供参考的下列出版物中公开了有用的聚合物分子和/或PEG化化学过程： US 5,824,778，US 5,476,653，WO 97/32607，EP 229,108，EP 402,378，US 4,902,502，US 5,281,698，US 5,122,614，US 5,219,564，WO 92/16555，WO 94/04193，WO 94/14758，WO 94/17039，WO 94/18247，WO 94/28024，WO 95/00162，WO 95/11924，WO 95/13090，WO 95/33490，WO 96/00080，WO 97/18832，WO 98/41562，WO 98/48837，WO 99/32134，WO 99/32139，WO 99/32140，WO 96/40791，WO 98/32466，WO 95/06058，EP 439 508，WO 97/03106，WO 96/21469，WO 95/13312，EP 921 131，US 5,736,625，WO 98/05363，EP 809 996，US 5,629,384，WO 96/41813，WO 96/07670，US 5,473,034，US 5,516,673，EP 605 963，US 5,382,657，EP 510 356，EP 400 472， EP 183 503和EP 154 316。
多肽和活化的聚合物分子的偶联可通过使用任何常规方法，例如，按 下列参考文献所述(所述参考文献中也描述了活化聚合物分子的适宜方法) 进行：R.F.Taylor，(1991)，“Protein immobilisation.Fundamental and applications”，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等， (1993)，“Immobilized Affinity Ligand Techniques”，Academic Press，N.Y.)。 技术人员知道，将要使用的活化方法和/或偶联化学取决于所述多肽的连接 基团(以上已给出实例)以及聚合物的功能基(例如，是胺、羟基、羧基、醛， sulfydryl，琥珀酰亚胺，马来酰亚胺，vinysulfone或卤代醋酸盐)。PEG化 可涉及与多肽上的所有可利用的连接基团(即，暴露于多肽表面的连接基团) 偶联，或可与一个或多个特定的连接基团如，N-末端胺基直接偶联(如US 5,985,265所述)。而且，偶联可以在一步中完成或以多步方式来完成(如， WO 99/55377所述)。
应理解，PEG化作用需设计为，使所得分子在连接的PEG分子的数目、 这些分子的大小和形式(如，线性还是分支)，以及多肽分子的连接诶位点各 方面最佳。例如，可根据需达到的效果来选择所使用的聚合物的分子量。
仅与蛋白质上一个连接基团(如N-末端胺基)偶联时，有利的是线性或 分支的聚合物分子具有高分子量，优选约10-25kDa，如约15-25kDa，例 如约20kDa。
一般来说，聚合物偶联的条件是使尽可能多的可利用的聚合物连接基 团与聚合物分子反应。这可以通过使所述聚合物相对于所述多肽适当摩尔 过量来实现。通常，活化的聚合物分子与多肽的摩尔比最高可达约1000-1， 如最高约200-1，或最高约100-1。有些情况下，为获得最佳反应，所述摩 尔比也可能略低，如最高约50-1，10-1，5-1，2-1或1-1。
本发明还涉及经由接头使聚合物分子与多肽偶联。合适的接头是技术 人员已知的。优选的实例是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，J.Biol.Chem.， 252，3578-3581；US4179337；Shafer等人(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem. Ed.，24，375-378)。
偶联后，按本领域已知的方法，如通过将伯胺加入到反应混合物中， 来封闭残留的活化型聚合物分子，并通过合适的方法除去所产生的失活的 聚合物分子。
应理解，基于各种条件(如多肽的氨基酸序列，使用的活化型PEG化合 物的性质以及特定的PEG化条件，包括PEG与多肽的摩尔比)，可能获得 不同程度的PEG化，较高程度的PEG化通常来自PEG与多肽的较高摩尔 比。然而，来源于任何给定PEG化过程的PEG化多肽，通常包含PEG化 程度略有不同的多肽偶联物的随机分布。
与糖组分的偶联
为实现蛋白C分子(包含一个或多个糖基化位点)的体内糖基化，必须将 编码该多肽的核苷酸序列插入糖基化的真核表达宿主中。表达宿主细胞可 选自真菌(丝状真菌或酵母)、昆虫、或动物细胞，或选自转基因植物细胞。 在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞(如COS细胞、CHO细胞、 BHK细胞或HEK细胞，如HEK293细胞)，或者昆虫细胞(如SF9细胞)， 或者酵母细胞如酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)或毕赤巴斯德酵母 (Pichia pastoris)，或任何下文进一步描述的宿主细胞。
糖组分(如葡聚糖)与所述多肽的氨基酸残基在体外的共价偶联也可使 用WO87/05330和Aplin等，CRC Crit Rev.Biochem.，pp.259-306，1981所述 的方法。糖组分或PEG与蛋白质结合型和肽结合型Gln-残基的体外偶联也 可以通过谷氨酰胺转移酶(TGases)来进行。谷氨酰胺转移酶以一种所谓的交 联反应的方式催化供体氨基转移到蛋白-和肽-结合的Gln残基上。供体氨基 可以是蛋白-或肽-结合的，如赖氨酸残基中的ε氨基，或也可以是小或大的 有机分子的一部分。在谷氨酰胺转移酶催化的交联中作为氨基供体的小的 有机分子如腐胺(1，4-二氨基丁烷)。在谷氨酰胺转移酶催化的交联中作为氨 基供体的大的有机分子如含氨基-PEG(Sato等，1996，Biochemistry 35， 13072-13080)。
通常，谷氨酰胺转移酶是高度特异的酶，并非所有暴露于蛋白表面的 Gln残基都可用于谷氨酰胺转移酶催化的含氨基物质的交联。相反，只有少 数Gln残基是谷氨酰胺转移酶的天然底物，但对于控制Gln残基作为适合 的谷氨酰胺转移酶底物的确切参数仍不可知。因此，为了使蛋白对谷氨酰 胺转移酶催化的交联反应敏感，经常的前提是在方便的位置增加一段氨基 酸序列，所述氨基酸序列已知可很好地用做谷氨酰胺转移酶的底物。已知 几种氨基酸序列可为谷氨酰胺转移酶的底物，或包含谷氨酰胺转移酶的底 物，如物质P，elafin，纤维蛋白原，纤连蛋白，α2-纤溶酶抑制剂，α-酪蛋 白和β-酪蛋白。
与有机衍生剂的偶联
所述多肽的共价修饰可通过多肽的一个或多个连接基团与有机衍生剂 反应来进行。合适的衍生剂和方法在本领域中是已知的。例如，半胱氨酰 基残基最常与α-卤代乙酸酯(和相应的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反应，产生 羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰基残基也可与以下物质反应而 衍生：溴三氟丙酮、α-溴-β-(4-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来 酰亚胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、对氯汞基苯甲酸 盐、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-噁-1，3-二唑。组氨酰基残基通过 与二乙基焦碳酸酯在pH5.5-7.0反应进行衍生，因为该试剂相对特异于组氨 酰基侧链。对溴苯甲酰甲基溴化物也有效；该反应优选在pH6.0的0.1M卡 可酸钠中反应。赖氨酰基和氨基末端残基可与琥珀酸酐或其它羧酸酐反应。 用这些试剂进行衍生具有使赖氨酰基残基的电荷逆转的作用。适于使含α- 氨基的残基衍生的其它试剂包括亚氨基酯如甲基吡啶亚酰胺(methyl picolinimidate)、磷酸吡多醛、吡多醛、氯代氢硼化物、三硝基苯磺酸、邻 甲基异脲、2，4-戊二酮和转氨酶催化的与乙醛酸盐的反应。精氨酰基残基通 过与一种或多种常规试剂的反应来修饰，所述试剂包括苯基乙二醛、2，3-丁 二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生要求反应在碱性条件下进 行，因为胍功能基的pKa较高。
此外，这些试剂可与赖氨酸以及精氨酸胍基反应。羧基侧基(天冬氨酰 基或谷氨酰基)通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R′)反应来进行选择性修饰，其中 R和R′是不同的烷基，如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基 -3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。而且，天冬氨酰基和谷氨酰基通过 与铵离子反应转化为天冬酰酰胺基(asparaginyl)和谷氨酰酰胺基 (glutaminyl)。
与亲脂性化合物的偶联
多肽和亲脂性化合物可以直接或通过使用接头彼此偶联。亲脂性化合 物可以是天然化合物如饱和或不饱和脂肪酸、脂肪酸二酮、萜烯、前列腺 素、维生素、类胡萝卜素或甾体激素，或者合成的化合物如碳酸、醇、胺 和具有一个或多个烷基-、芳基-、链烯基-的磺酸或其它多元不饱和化合物。 可按本领域已知的方法，如按Bodanszky在Peptide Synthesis，John Wiley， New York，1976和WO96/12505中所述的方法来进行多肽和亲脂性化合物之 间的偶联(任选通过接头来连接)。
与标记多肽的偶联
多肽可表达为与标记物的融合蛋白，即通常由1-30，如1-20个氨基酸 残基构成的氨基酸序列或肽段。除了能快速和容易地进行纯化，标记物是 完成标记多肽和非多肽组分之间偶联的便利工具。特别是，标记物可用于 在微滴定板或其它载体如顺磁珠上完成偶联，这样标记的多肽可通过标记 物来固定。在，例如，微滴定板上与标记的多肽偶联的优点是，标记的多 肽可从培养肉汤直接固定到微滴定板上(原则上不经任何纯化)并进行偶联。 因此，可减少操作步骤(从表达到偶联)的总数。而且，标记物可起间隔臂分 子的作用以确保使固定的多肽更易于偶联。使用标记多肽进行的偶联可以 是与本文中公开的任何非多肽组分的偶联，如与聚合物分子如PEG的偶联。
使用何种具体标记物不是关键，只要该标记物能与多肽一起表达并且 能固定在适宜的表面或载体物质上即可。许多适宜的标记物可通过商业渠 道获得，例如，可购于Unizyme Laboratories，丹麦。例如，所述标记物可以 是下列任一序列：
His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-His-His-His-His
Met-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-His
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln
Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-Gln
或下列任一序列：
EQKLI SEEDL(描述于Mol.Cell.Biol.5：3610-16，1985的C-端标记物)
DYKDDDDK(C-或N-端标记物)
YPYDVPDYA
抗上述标记物的抗体通常可通过商业渠道获得，例如购于ADI，Aves Lab and Research Diagnostics。
随后可用市售酶从多肽上将标记物切离。
制备本发明多肽变体或本发明偶联物的多肽部分的方法
本发明多肽变体或本发明偶联物的多肽部分(任选为糖基化形式)可通 过本领域已知的任何合适的方法来制备。这些方法包括构建编码该多肽的 核苷酸序列并在合适的转化或转染宿主中表达该序列。优选宿主细胞是γ- 羧基化的宿主细胞，如哺乳动物细胞。然而，可通过化学合成方法或化学 合成方法的组合或者化学合成方法和重组DNA技术的组合来产生本发明的 多肽，但效率很低。
编码本发明多肽变体或本发明偶联物的多肽部分的核苷酸序列可通过 分离或合成编码亲本蛋白C，如具有SEQ ID NO：2和4所示氨基酸序列的 蛋白C的核苷酸序列来构建，然后改变所述核苷酸序列以引入(即插入或取 代)或消除(即去除或取代)相关氨基酸残基。
核苷酸序列可通过已知方法经定点诱变方便地进行修饰。或者，核苷 酸序列可通过化学合成来制备，例如通过使用寡核苷酸合成仪，其中基于 所需多肽的氨基酸序列来设计寡核苷酸，并且优选选择生产重组多肽的宿 主细胞偏好的那些密码子。例如，可以合成多个编码所需多肽的各部分的 小分子寡核苷酸，然后通过PCR、连接反应或连接酶链反应(LCR)(Barany， PNAS 88：189-193，1991)来装配。各个寡核苷酸通常含有5′或3′突出端用 于互补装配。
另有核苷酸序列修饰方法可用于产生多肽变体，以便将多肽变体用于 高流量筛选，例如US5093257中公开的涉及同源交换的方法，以及有关基 因改组的方法，即两个或多个同源核苷酸序列间的重组，导致产生与起始 核苷酸序列相比有许多核苷酸改变的新的核苷酸序列。基因改组(也被称为 DNA改组)涉及核苷酸序列的随机片段化和重新装配的一次或多次循环，随 之通过筛选选择编码具有所期望特性的多肽的核苷酸序列。为了使基于同 源性的核酸改组能发生，所述核苷酸序列的相关部分优选至少有50％的同 一性，如至少60％的同一性，更优选至少70％的同一性，如至少80％的同 一性。重组可在体外或体内进行。
以下文献中公开了适当的体外基因改组方法的实例：Stemmer等，(1994)， Proc.Natl.Acad.Sci.USA；vol.91，pp.10747-10751；Stemmer(1994)，Naturem Vol.370，pp.389-391；Smith(1994)，Nature Vol.370，pp.324-325；Zhao等，Nat. Biotechnol.1998.Mar；16(3)：258-61；Zhao H.和Arnold，FB，Nucleic Acids Research，1997，Vol.25.No.6 pp.1307-1308；Shao等，Nucleic Acids Research 1998，Jan 15；26(2)：pp.681-83；以及WO95/17413。
WO97/07205中公开了一种合适的体内改组方法。其它通过体外或体内 重组进行核酸诱变的技术在，如WO97/20078和US5837458中公开。特别 的改组技术包括“基因族改组(Family shuffling)”，“合成改组”“计算机(in sliico)改组”。
基因族改组是使来自不同物种的一族同源基因进行一次或多次的改组 和后续筛选或选择的循环。基因族改组技术公开在，如：Crameri等，(1998)， Nature，vol.391，pp.288-291；Christians等，(1999)，Nature Biotechnology，vol. 17，pp.259-264；Chang等(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，pp.793-797； 以及Ness等(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，893-896中。
合成改组涉及根据目的同源基因之间的序列比对来提供重叠的合成寡 核苷酸文库。使合成的寡核苷酸重组，对所得重组核酸序列进行筛选，如 需要可用于进一步的改组循环。合成改组可参见WO00/42561。
计算机(in silico)改组指利用计算机系统实施或模拟(modelled)，因此部 分或完全无须对核酸进行物理操作的一种DNA改组方法。计算机改组可参 见WO00/42560。一旦装配(通过合成、定点诱变或另一方法)后，编码多肽 的核苷酸序列立即被插入重组载体中，并与蛋白C在目标转化宿主细胞中 表达所必需的调控序列可操作地连接。
当然，应理解不是所有载体和表达调控序列都能同样良好地表达本文 所述多肽的核苷酸序列。不是所有宿主都能以相同的表达系统发挥同样优 良的功能。然而，本领域技术人员不用进行实验就可以对这些载体、表达 调控序列和宿主作出选择。例如，在选择载体时必须考虑宿主，因为载体 必须能在其中复制或能整合到染色体中。也应考虑载体拷贝数、控制拷贝 数的能力、以及载体编码的任何其它蛋白质(如抗生素标记)的表达。在选择 表达调控序列时，也应考虑多种因素。这些因素包括，如，序列的相对长 度、其可控制性、以及与编码多肽的核苷酸序列的相容性，特别要考虑潜 在的二级结构。选择宿主时应考虑它们与所选载体的相容性、核苷酸序列 编码的产物的毒性、宿主的分泌特性、宿主正确折叠多肽的能力、宿主的 发酵和培养需求、以及核苷酸序列编码产物纯化的难易。重组载体可以是 自主复制的载体，即作为染色体外实体存在、其复制独立于染色体复制的 一种载体，例如质粒。另外，载体可以是引入宿主细胞时，可整合到宿主 细胞基因组中并且与其整合的染色体一起复制的载体。
载体优选是表达载体，其中编码本发明多肽的核苷酸序列可与核苷酸 序列转录所需的额外片段可操作地连接。载体通常由质粒或病毒DNA衍生。 用于在本文所述宿主细胞中表达的多种合适的表达载体是可商购的或有文 献描述的。可用于真核宿主的表达载体包括，如，含有来自SV40、牛乳头 瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达调控序列的载体。具体的载体如 pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和pCI-neo(Stratagene，La Jola，CA，USA)。可用于酵母细胞的表达载体包括2μ质粒及其衍生物，POT1 载体(US 4,931,373)，pJSO37载体(描述于Okkels，Ann.New York Acad.Sci. 782，202-207，1996)和pPICZ A，B或C(Invitrogen)。可用于昆虫细胞的表达 载体包括pVL941，pBG311(Cate等，＂Isolation of Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells＂，Cell，45，pp.685-98(1986)，pBluebac 4.5和pMelbac(都来自 Invitrogen)。可用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，如来自大肠 杆菌的质粒，包括pBR322，pET3a和pET12a(都来自Novagen Inc.，WI，USA)， 较宽宿主范围的质粒，如RP4，噬菌体DNA，例如λ噬菌体的多种衍生物， 例如NM989，和其它DNA噬菌体，如M13和丝状单链DNA噬菌体。
本发明中使用的其它载体包括允许编码多肽的核苷酸序列扩增多个拷 贝的那些载体。这种可扩增的载体是本领域已知的。例如，它们包括能通 过DHFR扩增的载体(例如参见Kaufman，U.S.Pat.No.4,470,461，Kaufman and Sharp，＂Construction Of A Modular Dihydrofolate Reductase cDNA Gene： Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression＂，Mol.Cell.Biol.，2，pp. 1304-19(1982))和可通过谷氨酰胺合成酶(″GS″)扩增的载体(例如参见US 5,122,464和EP338,841)。
重组载体可进一步包含能使所述载体在目标宿主细胞中复制的DNA 序列。此类序列的一个例子(宿主细胞是哺乳动物细胞时)是SV40的复制起 始点。当宿主细胞是酵母细胞时，能使载体复制的合适序列是酵母质粒2μ 复制基因REP 1-3和复制起始点。
载体也可含有可选择的标记，如以其产物补充宿主细胞缺陷的那些基 因，如编码二氢叶酸还原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)TPI的基因(P.R.Russell，Gene 40，1985，pp.125-130)，或者赋予对药 物如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶 呤的抗性的基因。对于酿酒酵母来说，可选择的标记包括ura3和leu2。对 于丝状真菌来说，可选择的标记包括amdS、pyrG、arcB、niaD和sC。
术语“调控序列”在本文中包括对本发明多肽表达必需的或有利的所 有成分。每个调控序列对编码多肽的核苷酸序列来说可以是天然的或外来 的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、 启动子、增强子或上游活化序列、信号肽序列和转录终止子。调控序列至 少包括启动子。
本发明可以使用各种各样的表达调控序列。这些可使用的表达调控序 列包括与前述表达载体的结构基因相连的表达调控序列以及已知调控原核 或真核细胞或其病毒的基因表达的任何序列及其各种组合。
哺乳动物细胞中指导转录的合适调控序列的实例包括SV40和腺病毒 的早期和晚期启动子，如腺病毒2的主要晚期启动子、MT-1(金属硫蛋白基 因)启动子、人巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV)、人延伸因子1α(EF-1α) 启动子、果蝇最小热休克蛋白70启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、人 遍在蛋白C(UbC)启动子、人生长激素终止子、SV40或腺病毒Elb区聚腺苷 酸化信号和Kozak共有序列(Kozak，M.J Mol Biol 1987 Aug 20； 196(4)：947-50)。
为了改进在哺乳动物细胞中的表达，可以将合成的内含子插入编码所 述多肽的核苷酸序列的5′非翻译区。合成内含子的实例是来自质粒pCI-Neo 的合成内含子(购自Promega Corporation，WI，USA)。
昆虫细胞中指导转录的合适调控序列的实例包括多角体蛋白启动子、 P10启动子、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多角体病毒碱性蛋白启动 子、杆状病毒立即早期基因1启动子和杆状病毒39K延迟早期基因启动子、 和SV40聚腺苷酸化序列。在酵母宿主细胞中使用的合适调控序列的实例包 括酵母α交配系统的启动子、酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)启动子、来自酵母 糖酵解基因或醇脱氢酶基因的启动子、ADH2-4c启动子和诱导型GAL启动 子。在丝状真菌宿主细胞中使用的合适调控序列的实例包括ADH3启动子 和终止子、由编码米曲霉TAKA淀粉酶丙糖磷酸异构酶或碱性蛋白酶、黑 曲霉α淀粉酶、黑曲霉或构巢曲霉(A.Nidulans)葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉乙 酰胺酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂肪酶的基因衍 生的启动子、TPI1终止子和ADH3终止子。在细菌宿主细胞中使用的合适 调控序列的实例包括lac系统、trp系统、TAC或TRC系统的启动子和λ噬 菌体的主要启动子区域。
信号肽的存在与否取决于，例如，用于生产将要被表达的多肽(胞内或 胞外多肽)的表达宿主细胞和是否需要分泌。为了在丝状真菌中使用，信号 肽可以由编码曲霉属菌株的淀粉酶或葡萄糖淀粉酶的基因、编码米赫根毛 霉脂肪酶或蛋白酶或Humicola lanuginosa脂肪酶的基因方便地衍生。信号 肽优选由编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定 淀粉酶或黑曲霉葡萄糖淀粉酶的基因衍生。为了在昆虫细胞中使用，信号 肽可以由昆虫基因方便地衍生(参见WO90/05783)，如鳞翅目Manduca sexta 脂动激素前体(US5023328)、蜜蜂蜂毒素(Invitrogen)、蜕皮甾类UDP葡萄糖 基转移酶(glucosyltransferase，egt)(Murphy等，Protein Expression and Purification 4，349-357(1993))或人胰脂酶(hpl)(Methods in Enzymology 284， pp.262-272，1997)。哺乳动物细胞中使用的优选信号肽是hFVII的或鼠Igκ 轻链的信号肽(Coloma，M(1992)J.Imm.Methods 152：89-104)。为了在酵母细 胞中使用，合适的信号肽是酿酒酵母α-因子信号肽(参见US4870008)、改性 的羧肽酶信号肽(参见L.A.Valls等人，Cell 48，1987，pp.887-897)、酵母BAR1 信号肽(参见WO87/02670)、酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M. Egel-Mitani等人，Yeast 6，1990，pp.127-137)以及合成的前导序列 TA57(WO98/32867)。大肠杆菌的合适信号肽是信号肽ompA(EP581821)。
本发明编码蛋白C多肽变体的核苷酸序列，无论通过定点诱变、合成、 PCR或其它何种方法制备，可选包括编码信号肽的核苷酸序列。如多肽需 要从表达细胞中分泌则需要信号肽。这种信号肽，如果存在，应该是能被 表达所述多肽的细胞识别的。信号肽可与所述多肽同源(如，通常与人蛋白 C相连)或异源(如其起源异于人蛋白C)，或者可以与宿主细胞同源或异源， 即所述信号肽是该宿主细胞通常表达的信号肽或者其不是该宿主细胞通常 表达的信号肽。相应的，所述信号肽可以是原核的，如来源于细菌如大肠 杆菌，或者是真核的，如来源于哺乳动物或昆虫或酵母细胞。
可以使用任何合适的宿主产生本发明的多肽或本发明偶联物的多肽部 分，包括细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物或其它合适的动物 细胞或细胞系、以及转基因动物或植物。细菌宿主细胞的实例包括革兰氏 阳性细菌如芽孢杆菌属，如短芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、假单孢菌属或链 霉菌属，或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌菌株。将载体引入细菌宿主细胞 可通过，例如，原生质体转化(参见如Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)、使用感受态细胞(参见如Young and Spizizin， 1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或Dubnau and Davidoff-Abelson， 1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)、电穿孔(参见如Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)、或偶联(参见如Koehler and Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278)来进行。合适的丝状真 菌宿主细胞的实例包括曲霉属菌株，如米曲霉、黑曲霉或构巢曲霉，镰刀 菌属或木霉菌属。真菌细胞可以通过涉及以下的过程转化：原生质体形成、 原生质体转化和细胞壁通过本身已知的方式再生。在EP238023和 US5679543中描述了转化曲霉属宿主细胞的合适方法。在Malardier等人 1989，Gene 78：147-156和WO96/00787中描述了转化镰刀菌属的合适方法。 合适的酵母宿主细胞的实例包括糖酵母属的菌株(如酿酒酵母)、裂殖酵母 属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属(如巴斯德毕赤酵母或P.Methanolica)、汉逊 酵母属(如多形汉逊酵母)、或Yarrowia。酵母可使用Becker和Guarente，In Abelson，J.N.And Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.， New York；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology 153：163；和Hinnen等人 1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920；以及由 Clontech Laboratories，Inc，Palo Alto，CA，USA(YeastmakerTM酵母转化 系统试剂盒的产品手册)中所述的方法来转化。合适的昆虫宿主细胞的实例 包括鳞翅目细胞系，如草地夜蛾(Sf9或Sf21)或粉纹夜蛾细胞(High Five)(US5077214)。可以按Invitrogen所述方法转化昆虫细胞并在其中产生 异源多肽。合适的哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系 (如，CHO-K1；ATCC CCL-61)、绿猴细胞系(COS)(如，COS1(ATCC CRL-1650)、COS7(ATCC CRL-1651))；小鼠细胞(如，NS/O)、仓鼠幼鼠肾 脏(BHK)细胞系(如，ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人细胞(如， HEK293(ATCC CRL-1573))，以及组织培养中的植物细胞。其它合适的细胞 系在本领域中是已知的并可购自公共保藏中心，如美国典型培养物保藏中 心，Rockville，Maryland。而且，哺乳动物细胞(如CHO细胞)可按US5047335 所述方法进行改性来表达唾液酸转移酶，如，1，6-唾液酸转移酶，以便改进 蛋白C多肽的糖基化。
为了增加分泌，使本发明多肽与内切蛋白酶，尤其是PACE(配对的碱 性氨基酸转化酶)(如US5986079中所述)，如Kex2内切蛋白酶(如 WO00/28065中所述)一起产生是有利的。
将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染、电 穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、病毒载体和由Life Technologies Ltd，Paisley，UK所述的使用Lipofectamin2000进行的转染方法。 这些方法在本领域中是已知的，例如在Ausbel等人(eds.)，1996，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，USA中所述。哺 乳动物细胞的培养按建立的方法进行，例如参见Animal Cell Biotechnology， Methods and Protocols，Nigel Jenkins编，1999，Human Press Inc，Totowa，New Jersey，USA and Harrison MA and Rae IF，General Techniques of Cell Culture， Cambridge University Press 1997。
在本发明的生产方法中，用本领域已知的方法在适于生产多肽的营养 培养基中培养细胞。例如，细胞可以在实验室中通过摇瓶培养、小规模或 大规模发酵(包括连续、成批、补料分批或固态发酵)或在合适培养基和允许 表达和/或分离所述多肽的条件下进行工业发酵。培养在含有碳源和氮源和 无机盐的合适营养培养基中使用本领域已知的方法来进行。合适的培养基 可商购或可以按公开的组成来制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目 录中所述的)。如果多肽分泌在营养培养基中，该多肽可从培养基中直接回 收。如果多肽不被分泌，可从细胞裂解物中回收。
可通过本领域已知的方法来回收所得多肽。例如，可通过常规方法包 括但不限于离心、过滤、超滤、提取或沉淀从营养培养基中回收多肽。
可通过本领域已知的各种方法包括但不限于层析(如，离子交换、亲和、 疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(如，制备性等电聚焦)、溶解度差 异(如，硫酸铵沉淀)、或提取(参见，如Protein Purification，J.-C.Janson and Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)来纯化多肽。
药物组合物和用途
本发明另一方面涉及一种药物组合物，它包含本发明的偶联物或本发 明的变体，以及一种可药用的载体或赋形剂。在上下文中，“可药用”意指 在给药的患者中不引起任何不想要或有害的作用的载体或赋形剂。这类可 药用载体和赋形剂在本领域中是已知的(参见，如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack Publishing Company[1990]； Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins，S.Frokjaer and L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis[2000]；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press[2000])。
本发明另一方面涉及本发明的偶联物，本发明的变体，或本发明的药 物组合物用于制备药物的用途。更具体地，本发明的偶联物，变体或药物 组合物可用于制备治疗下列的药物：发作(stroke)；心肌梗塞；静脉血栓后； 弥散性血管内凝血(DIC)；脓毒症(sepsis)；败血性休克；栓塞(emboli)，如肺 栓塞；移植，如骨髓移植；烧伤；妊娠；重大外科手术/创伤或成人呼吸窘 迫综合征(ARDS)，尤其是用于制备治疗败血性休克的药物。
本发明还涉及治疗或预防选自下组的疾病的方法：发作；心肌梗塞， 静脉血栓后；弥散性血管内凝血(DIC)；脓毒症；败血性休克；栓塞，如肺 栓塞；移植，如骨髓移植；烧伤；妊娠；重大外科手术/创伤或成人呼吸窘 迫综合征(ARDS)，所述方法包括对需要相应治疗的患者给予有效量的本发 明偶联物、本发明变体、或本发明药物组合物，尤其是治疗或预防(更尤其 是治疗)败血性休克。
本发明中“患者”包括人和其它哺乳动物。因此所述方法可用于人的 治疗或兽用。
本发明的多肽变体和偶联物可以以有效剂量给予患者。本文中“有效 剂量”是指对所治疾病状态足以产生预期效果的剂量。给药的准确剂量取 决于所治疾病，可由本领域技术人员通过已知的方法加以确定。如上所述， 治疗严重脓毒症时，以24μg/kg/h人APC的量给药96小时，它对应于体重 约100kg的患者给药总量约230mg的蛋白。本发明偶联物和变体由于血浆 半寿期增加，使其在血浆中发挥作用的时间延长，因此被认为具有较强的 效力。这种增强的效力可以，例如，通过计算“人血浆灭活试验II”中曲线 以下的面积(AUC)来评估，或者通过测定血清半寿期来评估。增强的效力是 指，针对具体疾病获得所需效应所必需的有效剂量比人APC的有效剂量小 (需要给药的蛋白的量更少)。此外，血浆半寿期增加还使得能在给定的时间 段有规律地使用APC变体或偶联物进行治疗。因此，这些新特性导致能以 较少量和/或和较少的给药次数(如大药丸注射(bolus injection))来使用本发 明的化合物。例如，本发明的化合物可以以大药丸(bolus)或灌输剂或它们的 组合的形式给药，给药剂量的范围从每第二小时给药1μg/kg体重的大药丸， 持续数日(如96小时)至每第四日给药1mg/kg体重的大药丸一次。优选以尽 可能小的剂量给药尽可能少的次数，例如，每4-96小时，例如，每8-96小 时，如每16-96，每24-96小时，每40-96小时，每48-96小时，每56-96 小时，每72-96小时，按照1-500μg/kg体重，优选1-250μg/kg体重，如 1-100μg/kg体重，更优选1-50μg/kg体重的量给药大药丸。
本发明优选的化合物是，用本文实施例13所述“人血浆灭活试验II” 检测时，其活性形式的AUC与人APC的AUC的比率至少为1.25的那些。 优选所述比率至少为1.5，如至少为2，例如至少为3，更优选所述比率至 少为4，如至少为5，例如至少为6，还更优选所述比率至少为7，如至少 为8，例如至少为9，最优选所述比率至少为10。
本发明的多肽变体或偶联物可“以其原本的形式”和/或以其盐的形式 使用。合适的盐包括但不限于，与碱金属或碱土金属，例如钠，钾，钙和 镁的盐以及例如锌形成的盐。这些盐或复合物可以以结晶和/或无定形的结 构存在。
本发明的药物组合物可以单独给药或与其它治疗剂一起给药。这些制 剂可以掺合在同一种药物组合物中，或者可以与本发明的多肽或偶联物分 开给药，可以是同时给药，或者按照另一种治疗时间表给药。此外，本发 明的多肽、偶联物或药物组合物可以作为其它治疗的辅助形式。
本发明的药物组合物可以配制成各种形式，例如液体，胶，冻干品， 或压缩固体。优选的形式取决于所治疗的具体适应征且对本领域的技术人 员而言是显而易见的。
本发明的配制剂可以以多种方式给药，包括但不限于，口服、皮下， 静脉内、小脑内、鼻内、经皮、腹膜内、肌肉内、肺内、经阴道、经直肠、 眼内或以任何其它适宜的方式。尽管使用本领域熟知的技术(例如泵或植入) 进行大丸药注射是可接受的，但所述配制剂可以以输注的方式连续用药。 在某些情况下，配制剂可以以溶液或喷雾剂的形式直接应用。
非胃肠道组合物(Parental composition)
药物组合物的实例是设计成非胃肠道给药的溶液。尽管在很多情况下， 药物溶液配制剂可以以适用于立即使用的液体形式提供，但所述非胃肠道 配制剂也可以以冷冻或冻干形式提供。在前者情况下，所述组合物在使用 前必须解冻。后一剂型通常用于增强组合物中所包含的活性组分在各种贮 存条件下的稳定性，正如本领域技术人员已知的那样，冻干制剂通常比其 液体相应物更稳定。所述冻干制剂在使用前通过加入一种或多种适宜的可 药用稀释剂如无菌注射用水或无菌生理盐水溶液重新配制。
在非胃肠道给药的情况下，它们被制成冻干的配制剂或水溶液的形式， 方法是根据需要，将具有所需纯度的多肽与一种或多种本领域常用的可药 用载体、赋形剂或稳定剂(统称为“赋形剂”)适当混合，赋形剂如缓冲剂、 稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子表面活性剂、抗氧化剂和/或其它各种添 加剂。
缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。它们通常以大约 2mM-50mM的浓度范围存在。本发明使用的合适缓冲剂包括有机和无机酸 及其盐如柠檬酸盐缓冲剂(如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠 檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(如，琥 珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混 合物等)、酒石酸盐缓冲剂(如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾 混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(如，富马酸-富马酸 一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物 等)、葡萄糖酸盐(gluconate)缓冲剂(如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄 糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(如， 草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸 盐缓冲剂(如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混 合物等)和乙酸盐缓冲剂(如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。 其它可能的缓冲剂是磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和三甲胺盐如Tris。
可以加入防腐剂来阻滞微生物生长，加入的量通常约为0.2％-1％ (w/v)。本发明使用的合适防腐剂包括酚、苯甲醇、间甲酚、羟苯甲酸(paraben) 甲酯、羟苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化铵、苯亚甲基鎓卤化物 (如苯亚甲基鎓氯化物、溴化物或碘化物)、氯化己烷双胺、羟苯甲酸烷基 酯如甲酯或丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
可以加入等渗剂来确保液体组合物的等渗性，等渗剂包括多羟糖醇， 优选三羟或更高级糖醇，如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖 醇和甘露糖醇。多羟基醇的量可为0.1％-25％重量比，通常为1％-5％，以 相对其它组分的量计算。
稳定剂涉及一大类赋形剂，其功能范围从膨胀剂到溶解治疗剂的或有 助于防止变性或与容器壁粘附的添加剂。通常的稳定剂可以是多羟糖醇(上 文列举的)；氨基酸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组 氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有 机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、 核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环醇如环己六醇；聚乙二醇；氨 基酸聚合物；含硫还原剂，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代 甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即＜10个残基)；蛋白质 如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚 乙烯吡咯烷酮；单糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麦芽 糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖。基于活性蛋白质重量计算，稳 定剂通常的存在范围为0.1-10000重量份。
可以存在非离子表面活性剂或去污剂(也称作“湿润剂”)以有助于溶解 治疗剂以及保护治疗性多肽以避免搅拌诱导的聚集，其也允许配制剂暴露 于剪切表面压力而不导致多肽变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨 酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic多元醇、聚 氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(吐温20、吐温80等)。
其它各种赋形剂包括膨胀剂或填充剂(如淀粉)、螯合剂(如EDTA)、抗 氧化剂(如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。
活性组分也可以被包裹在通过，例如coascervation技术或通过界面聚 合所制备的微囊，如羟甲基纤维素、明胶或聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中， 包裹在胶体状药物运送体系(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和 纳米胶囊)中，或包裹在大乳剂中。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(同 上)中公开了这些技术。
体内给药所使用的非胃肠道制剂必须是无菌的。该过程可通过，例如， 除菌滤膜的过滤而轻易完成。
持续释放制剂
持续释放制剂的合适例子包括含有多肽或偶联物的固体疏水聚合物的 半渗透基质、具有合适形式如膜或微囊的基质。持续释放基质的例子包括 聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基丙烯酸甲酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L- 谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳 酸-乙醇酸共聚物如ProLease技术或Lupron Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物 和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。聚合物如乙烯 乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能长时间释放分子如长达或超过100天，某些水凝 胶在较短时间内释放蛋白质。当包囊中的多肽长时间保留在体内时，它们 因在37℃潮湿的环境中暴露而变性或聚集，导致生物活性丧失并且可能改 变免疫原性。合理的稳定策略可根据所涉及的机理设计。例如，如果发现 聚集机理是通过硫代二硫化物相互交换形成分子内S-S键，那么可通过修饰 巯基、将酸性溶液冻干、控制湿度、使用适宜的添加剂和开发特异性聚合 物基质组合物来达到稳定。
附图说明
图1显示了纯化的野生型人APC以及本发明的各种偶联物和变体。这 些蛋白在凝胶上迁移，有三条明显的带对应于表观分子量分别为41,000和 37,000的重链α-和β-链，以及表观分子量为22,000的轻链。可以从图1所 示的凝胶上分析糖基化程度：偶联物D214N和M338N的重链的迁移位置 更靠近阴极(与变体K251N和S252N相反，其显然未利用引入的糖基化位 点)，这表明这两种变体都被糖基化，并且位点都得到充分利用。对重链亚 型(α和β)的迁移的检查表明，每一位点的糖侧链的分子量约为3,000- 4,000。
图2显示本发明各种偶联物和变体与不同浓度的α-1-抗胰蛋白酶 (16.6μM(黑条)和42.3μM(白条))一起在37℃保温20小时后，残余的酰胺裂 解活性。详述参见本文实施例11。
图3和4显示人血浆中，本发明各种偶联物和变体的残余酰胺裂解活 性的时间函数。详细情况，包括计算出的人血浆中的体内半寿期，参见本 文实施例13。
本发明由以下非限制性实施例进一步举例说明。
方法
可接近的表面区域(ASA)
用计算机程序Access(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55：379-400 (1971))版本2(1983 Yale University)计算所述结构中各个原子的可接近的 表面区域(ASA)。该方法一般使用1.4的探针大小且将可接近的表面区域 (ASA)定义为由探针的中心形成的区域。计算前，从坐标系(coordinate set) 中去掉所有水分子和氢原子，也除去与该蛋白质不直接相关其它原子。
侧链的分部(fractional)ASA
侧链原子的分部ASA通过用侧链中原子的ASA总和除以延伸的 ALA-x-ALA三肽中代表该残基类型的侧链原子的ASA值来计算。参见 Hubbard，Campbell & Thornton(1991)J.Mol.Biol.：220，507-530。在该实例 中，将CA原子视为甘氨酸残基而非其它残基的侧链的一部分。下列值作为 侧链的标准100％ASA来用：
Ala    69.23                     Leu      140.76     
Arg    200.35     2             Lys      162.50     2
Asn    106.25     2             Met      156.08     2
Asp    102.06     2             Phe      163.90     2
Cys    96.69      2             Pro      119.65     2
Gln    140.58     2             Ser      78.16      2
Glu    134.61     2             Thr      101.67     2
Gly    32.28      2             Trp      210.89     2
His    147.00     2             Tyr      176.61     2
Ile    137.91     2             Val      114.14     2
该结构中未探测到的残基被定义为100％暴露，因为可以认为这些残基 位于弹性区域。
确定原子之间的距离
原子之间的距离用分子制图软件，例如InsightIIO v.98.0，MSI Inc.确定。
实施例
实施例1-确定暴露在表面的氨基酸
野生型人APC的X-线结构的坐标(Mather，T.，Oganessyan，V.，Hof，P.， Huber，R.，Foundling，S.，Esmon，C.，Bode，W.，1996)可从蛋白数据库(PDB) (Bernstein et.al.J.Mol.Biol.(1977)112 pp。535)获得，也可以从The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB在http：//www.pdb.org/的登录 密码为1AUT的地址获得其电子版本。在计算可接近的表面积之前，从该结 构中除去所有水分子以及共价结合的抑制剂。在本实施例中，第71位的β 羟基-ASP(AP)作为常规ASP残基进行处理。残基K156-R169(Lys-Arg二肽 和活性肽)不包括在计算中。
序列编号
本实施例中使用的序列编号等同于具有SEQ ID NO：4所示酶原蛋白C 的序列编号。
表面暴露
对APC分子进行分部ASA计算，得出以下具有可接近性为0的侧链 的残基：G67，C89，C98，G103，C105，H107，C109，Y124，G142，G173，V186， L187，A198，V199，I201，V206，L207，T208，A210，C212，V221，E235，I258， A259，L260，L261，L263，A267，V274，I276，L283，V297，C331，M335，A346， G361，M364，T371，F373，L374，G376，L377，V392，I403。
以下残基有25％以上的侧链暴露在表面：Q49，L51，V52，P54，L55，E56， H57，P58，C59，A60，S61，G65，H66，T68，I70，D71，G72，I73，G74，S75，F76， S77，D79，R81，S82，G83，W84，E85，R87，F88，Q90，R91，E92，F95，L96，N97， S99，L100，D101，L110，E111，E112，V113，G114，W115，R117，S119，P122， G123，K125，G127，D128，D129，L130，L131，Q132，H134，P135，A136，V137， K138，R143，W145，K146，D172，K174，M175，R177，R178，D180，D189，S190， K191，K192，K193，H202，P203，H211，D214，E215，S216，K217，K218，L220， R229，R230，W231，K233，W234，L236，D237，D239，K241，E242，V243，F244， V245，P247，N248，S250，K251，S252，T253，T254，D255，A264，Q265，P266， T268，S270，Q271，D280，S281，G282，E285，R286，E287，Q290，A291，G292， Q293，E294，L296，Y302，H303，S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310， K311，R312，N313，R314，T315，F316，F320，K322，P327，H328，N329，E330， S332，E333，V334，S336，N337，M338，S340，E341，I348，L349，G350，D351， R352，E357，S367，H369，G370，E382，G383，C384，L386，L387，H388，R398， D401，H404，G405，H406，R408，D409。可看出，活性位点组氨酸(H211)暴露 在表面。但H211不是本发明要予以修饰的候选者。而以上所列的半胱氨酸 残基通常也不是本发明所要修饰的残基。
以下残基有50％以上的侧链暴露在表面：Q49，L51，V52，P54，L55，E56， A60，S61，G65，I70，D71，G72，I73，G74，S75，S77，D79，R81，S82，R87，R91， E92，F95，L96，N97，S99，Bill，V113，G114，W115，R117，P122，K125，D128， D129，L130，Q132，H134，V137，K138，K146，D172，K174，R177，S190，K191， K192，K193，D214，E215，K217，K218，R229，R230，W231，K233，D239，K241， E242，P247，N248，K251，S252，Q265，P266，T268，Q271，S281，E285，Q290， G292，Y302，S305，R306，E307，K308，E309，A310，R312，N313，T315，K322， N329，E330，E333，S336，N337，M338，E341，I348，G350，R352，E357，G370， G383，H388，R398，D401，H404，G405，R408，D409。
残基A1，N2，S3，F4，L5，E6，E7，L8，R9，H10，S11，S12，L13，E14，R15， E16，C17，I18，E19，E20，I21，C22，D23，F24，E25，E26，A27，K28，E29，I30， F31，Q32，N33，V34，D35，D36，T37，L38，A39，F40，W41，S42，K43，H44，V45， D46，G47，D48，R147，M148，E149，K150，K151，R152，S153，H154，L155， K410，E411，A412，P413，Q414，K415，S416，W417，A418，P419都不包括在所 述结构中，并且，在本申请中，被视为100％暴露于表面的类型。
实施例2-活性位点区的确定
使用以下方法确定活性位点区：使用程序Modeller‘98，将APC的重 连(1AUT)重叠(superimposing)在三元(ternary)复合物的X-线结构上，所述复 合物由结合于活性位点中的凝血因子VIIa、组织因子以及一种BPTI变体组 成(PDB登录号1FAK.参见Zhang，E.，St Charles，R.，Tulinsky，A.：Structure of Extracellular Tissue Factor Complexed with Factor Viia Inhibited with a Bpti Mutant J.Mol.Biol.285 pp.2089(1999))，从而能将“活性位点区”定义为 APC重连中，具有与所重叠的BPTI分子相距不超过12的原子的任何残 基。此外，观察发现，位于该区以外的一个环(残基306-314)也被认为是活 性位点区的组成部分。
用这种方法发现以下残基包括在“活性位点区”中：
L170，I171，D172，G173，Q184，V185，V186，L187，L188，D189，S190， K191，K192，K193，L194，A195，C196，G197，A198，T208，A209，A210，H211， C212，M213，D214，E215，S216，K217，K218，L219，L220，L228，I240，V243， V245，N248，Y249，S250，K251，S252，T253，T254，D255，N256，D257，I258， A259，L261，T295，L296，V297，T298，G299，W300，G301，Y302，H303，S304， S305，R306，E307，K308，E309，A310，K311，R312，N313，R314，T315，F316， I321，I323，P324，V326，C331，V334，M335，S336，N337，M338，V339，M343， L344，C345，A346，G347，I348，L349，D351，R352，Q353，D354，A355，C356， E357，G358，D359，S360，G361，G362，P363，M364，G376，L377，V378，S379， W380，G381，E382，G383，C384，G385，L386，L387，H388，N389，Y390，G391， V392，Y393和T394。活性位点残基(H211，D257和S360)尽管也列在其中， 但它们不是本发明将要修饰的候选者。而上述所列的半胱氨酸残基通常也 不是本发明将要修饰的候选者。
实施例3-确定活性位点区内的表面暴露型氨基酸
将具有25％以上侧链暴露于表面的氨基酸的列表(见实施例1)与包括 在活性位点区内的氨基酸的列表(见实施例2)组合，发现以下氨基酸残基既 位于活性位点区内、又有至少25％的侧链暴露在表面：
D172，D189，S190，K191，K192，K193，D214，E215，S216，K217，K218， H211，L220，V243，V245，N248，S250，K251，S252，T253，T254，D255，L296， Y302，H303，S304，S305，R306，E307，K308，E309，A310，K311，R312，N313， R314，T315，F316，V334，S336，N337，M338，I348，L349，D351，R352，E357， E382，G383，C384，L386，L387和H388。活性位点组氨酸(H211)尽管也在此 列中，但它不是本发明将要修饰的候选者。C384通常也不是本发明将要修 饰的候选者。
实施例4-构建蛋白C表达载体
编码人蛋白C前体的基因通过用PCR组装合成型寡核苷酸而构建，所 用方法类似于Stemmer等，(1995)Gene 164，pp.49-53所述。天然(native)蛋 白C的信号序列被保留以便于基因产物的分泌。合成基因经过设计，在5’ 端有NheI位点，在3’端有XbaI位点，用这些位点将其亚克隆至 pcDNA3.1/Hygro(Invitrogen)中CMV启动子之后。所得质粒命名为pCR4， 其中的蛋白C前体序列见SEQ ID NO：1。
此外，为了检验较高水平的基因表达，将合成基因克隆至 pcDNA3.1/Hygro的KpnI-XbaI位点中，使该基因的5’非翻译区中包含一个 内含子(来自pCI-Neo(Promega))。将所得质粒命名为pRC2。
实施例5-定点诱变
用Quick-Change(Stratagene)构建蛋白C的所有突变体。引物购自TAG Technology(Copenhagen)，它们含有合适的突变。按照厂家手册进行PCR 反应，将质粒转化至TG1感受态细胞中。在单个克隆上制备质粒制剂，用 DNA测序仪3100 genetic Ahalyser(ABI)检验序列。
引物：
D172N
POF003：
CAAGTAGATCCGCGGCTCATTAACGGGAAGATGACCAGGCGGGG
POF004：
CCCCGCCTGGTCATCTTCCCGTTAATGAGCCGCGGATCTACTTG
D214N
EKO001：
CTGACAGCGGCCCACTGCATGAACGAGTCCAAGAAGCTCCTTGTC
EKO002：
GACAAGGAGCTTCTTGGACTCGTTCATGCAGTGGGCCGCTGTCAG
D214A
EK0048：
CTGACAGCGGCCCACTGCATGGCCGAGTCCAAGAAGCTCCTTGTC
EK0049：
GACAAGGAGCTTCTTGGACTCGGCCATGCAGTGGGCCGCTGTCAG
K251N
EK0003：
CTTCGTCCACCCCAACTACAGCAACAGCACCACCGACAATGACATC
EK0004：
GATGTCATTGTCGGTGGTGCTGTTGCTGTAGTTGGGGTGGACGAAG
S252N
EKO005：
CGTCCACCCCAACTACAGCAAGAACACCACCGACAATGACATCGC
EK0006：
GCGATGTCATTGTCGGTGGTGTTCTTGCTGTAGTTGGGGTGGACG
Y302N
EK0007：
CCCTCGTGACGGGCTGGGGCAACCACAGCAGCCGAGAGAAGGAGGCC
EK0008：
GGCCTCCTTCTCTCGGCTGCTGTGGTTGCCCCAGCCCGTCACGAGGG
M338N
EK0011：
CAGCGAGGTCATGAGCAACAACGTGTCTGAGAACATGC
EK0012：
GCATGTTCTCAGACACGTTGTTGCTCATGACCTCGCTG
M338A
EK0046：
GCAGCGAGGTCATGAGCAACGCCGTGTCTGAGAACATGC
EK0047：
GCATGTTCTCAGACACGGCGTTGCTCATGACCTCGCTGC
D189N+K191N
EK0019：
CCCCTGGCAGGTGGTCCTGCTGAACTCAAACAAGAAGCTGGCCTGCG
GGG
EK0020：
CCCCGCAGGCCAGCTTCTTGTTTGAGTTCAGCAGGACCACCTGCCAGG
GG
D189N+K191T
EK0033：
CCCCTGGCAGGTGGTCCTGCTGAACTCAACCAAGAAGCTGGCCTGCG
GGG
EK0034：
CCCCGCAGGCCAGCTTCTTGGTTGAGTTCAGCAGGACCACCTGCC
S190N+K192T
EK0044：
GGCAGGTGGTCCTGCTGGACAACAAGACCAAGCTGGCCTGCGGGGCA
GTGC
EK0045：
GCACTGCCCCGCAGGCCAGCTTGGTCTTGTTGTCCAGCAGGACCACCT
GCC
K191N+K193T
EKO050：
GTCCTGCTGGACTCAAACAAGACCCTGGCCTGCGGGGCAGTG
EK0051：
CACTGCCCCGCAGGCCAGGGTCTTGTTTGAGTCCAGCAGGAC
K217N+L219T
EK0029：
GCATGGATGAGTCCAACAAGACCCTTGTCAGGCTTGGAGAGTATGACC
EK0030：
GGTCATACTCTCCAAGCCTGACAAGGGTCTTGTTGGACTCATCCATGC
T253N+D255T
EK0031：
CCAACTACAGCAAGAGCAACACCACCAATGACATCGCACTGCTGCACC
TGGC
EK0032：
GCCAGGTGCAGCAGTGCGATGTCATTGGTGGTGTTGCTCTTGCTGTAGT
TGG
S305N+E307T
EK0023：
GGCTGGGGCTACCACAGCAACCGAACCAAGGAGGCCAAGAGAAACC
GC
EK0024：
GCGGTTTCTCTTGGCCTCCTTGGTTCGGTTGCTGTGGTAGCCCCAGCC
E307N+E309T
EK0025：
GGCTACCACAGCAGCCGAAACAAGACCGCCAAGAGAAACCGCACCTT
CG
EK0026：
CGAAGGTGCGGTTTCTCTTGGCGGTCTTGTTTCGGCTGCTGTGGTAGCC
S336N+M338T
EK0027：
GCAGCGAGGTCATGAACAACACCGTGTCTGAGAACATGCTGTGTGCGG
G
EK0028：
CCCGCACACAGCATGTTCTCAGACACGGTGTTGTTCATGACCTCGCTG
C
L386N+H388T
EK0017：
GGTGAGCTGGGGTGAGGGCTGTGGGAACCTTACCAACTACGGCGTTTA
CACC
EK0018：
GGTGTAAACGCCGTAGTTGGTAAGGTTCCCACAGCCCTCACCCCAGCT
CACC
实施例6-制备
野生型蛋白C和蛋白C变体的瞬时表达用Fugene转染试剂(Roche)在 COS7细胞中进行，所述细胞培养在添加了10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰 胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素和5μg/ml维生素K的DMEM(Gibco 21969035)中。转染当天，将培养基更换为新鲜培养基，4-5小时后进行转染。 转染的次日，将培养基更换为基于DMEM(Gibco 31053-028)的无血清制备 培养基，其中添加有2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，1/500 Ex-cyte (serologicals)，1/100 ITSA(Gibco 51300-044)，100U/ml青霉素，100μg/ml链 霉素和5μg/ml维生素K。保温2天后，收获培养基，分析所表达的变体的 产生和活性(见以下实施例9)。
实施例7-纯化
根据说明书，将约15mg Ca特异性单克隆抗体偶联至5ml CNBr-活化 的Sepharose FF(Pharmacia)上。将约1ml已偶联的基质装填至HR 10柱中， 用缓冲液A(20mM Tris，0.3M NaCl，5mM CaCl2，pH7.5)以1ml/min的流速 洗柱。使大约90ml已过滤除菌的培养基含有0.3M NaCl和5mM CaCl2， 然后以相同流速加载于柱中。洗脱前，用20倍柱体积的缓冲液A洗柱。洗 脱用缓冲液B(20mM Tris和10mM EDTA，pH7.5)进行，按照1ml的级分 进行分级分离。通过OD280，western印迹和SDS-PAGE确定含有蛋白C的级 分，将它们收集在一起并于-80℃贮藏。上述纯化方法只是众多可能用于纯 化蛋白C的方法之一(参见，例如Kiesel，J.Clin.Invest.(1979)64 pp. 761-769)。
所纯化的蛋白用活化方案进行活化(见以下实施例8)。所有蛋白的纯度 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行检查。此外，糖基化程度从这些凝胶 分析物中评估，方法是监控分子量的变化。相对于野生型人APC具有增加 的表观分子量，就说明APC变体已经糖基化。
野生型APC和APC变体的实例可见图1。蛋白在凝胶上迁移，有三条 明显的带对应于：表观分子量分别为41,000和37,000的重链α-和β-链，以 及表观分子量为22,000的轻链。糖基化程度也可以在此PAGE分析中进行 研究。图1包括两种APC变体，它们在引入的糖基化位点发生糖基化。APC 变体D214N和M338N的重链的迁移位置更靠近阴极，这表明这两种变体 都被糖基化，并且位点都得到充分利用。对重链亚型(α和β)的迁移的检查 表明，每一位点的糖侧链的分子量约为3,000-4,000。
实施例8-活化
蛋白C变体和偶联物用毒液蛋白C激活剂ACC-C活化(Nakagaki等， Thrombosis Research 58：593-602，1990)。将酶原形式在37℃的50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，5mM EDTA中用终浓度为1ng/ml的 ACC-C保温约60min。活化过程用APC酰胺裂解活性试验(见以下实施例 9)和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检查。
实施例9-测定酰胺裂解活性
APC酰胺裂解试验
人APC和本发明化合物的酰胺裂解活性用肽底物SPECTROZYME PCa进行测定，所述肽底物具有通式H-D-Lys(γ-Cbo)-Pro-Arg-pNA.2AcOH (American Diagnostica Inc，产品编号336)，终浓度为0.5mM。试验在23℃ 的50mM Tris-HCl(pH8.3)，100mM NaCl，5mM CaCl2中进行。PCa底物被 人APC和本发明化合物水解的速率在读板仪(plate reader)中于405nm记录 3min，记录形式为吸光单位/min的改变。
结果
分析所表达和活化的所有偶联物和变体的活性。如上所述对4μl(未纯 化的)细胞培养物进行分析。所获得的活性至少依赖于表达水平，因而不反 映比活性，但它可指示蛋白是否表达以及它们是否具有活性。
获得了以下活性：
表1
化合物                              milliOD405/min
野生型COS 7 APC                     41
 D214N                              28
 D214A(对照)                        10
 K251N*                            19
 S252N*                            16
 Y302N*                            14
 M338N                              53
 M338A(对照)                        33
 D189N+K191T                        8
 D189N+K191N(对照)                  12
 S190N+K192T*                      29
 K191N+K193T                        4
 K217+L219T                         16
 T253N+D255T                        2
 S305N+E307T                        6
 E307N+E309T                        30
 S336N+M338T                        4
 L386N+H388T                        13
*：未能通过SDS-PAGE检测出与引入的糖基化位点连接的糖组分
将选定的候选者纯化，用浓度为30nM的蛋白经上述试验测定它们的 特异性酰胺裂解活性。发现以下活性：
表1b
化合物              milliOD405/min     ％野生型APC
野生型COS 7 APC          48.9              -
D214N                    34.8              71
K251N*                  45.2              92
S252N*                  43.1              88
M338N                    44.8              92
S336N+M338T              41.5              85
L386N+H388T              23.0              47
*：未能通过SDS-PAGE检测出与引入的糖基化位点连接的糖组分
可以看出，所测试的偶联物和变体的特异性酰胺裂解活性与野生型人 APC分子的处在相同水平。
实施例10-测定抗凝活性
APC凝血试验
抗凝活性通过监控凝血时间的延长来评估，所述监控是在活化的部分 促凝血酶原激酶时间(APTT)试验中用Nycoplastin(Nycomed，产品编号 1002448)以及常规止血参考血浆(Normal Hemostasis Reference Plasma， American Diagnostica Inc.，目录号258N)进行。凝血通过将含有APC或本发 明化合物的APTT试剂与常规止血参考血浆在37℃一起保温而启动，并通 过手动混合来测量凝血时间。将人APC的凝血时间与本发明化合物的凝血 时间进行比较，以便计算抗凝活性，并表示为人APC抗凝活性的百分比。
结果
使用上述试验发现以下抗凝活性：
表2
化合物                   抗凝活性(％人APC)
D214N                       22.4
K251N*                     24.5
S252N*                     24.5
M338N                       34.7
L386N+H388T                 14.3
*：未能通过SDS-PAGE检测出与引入的糖基化位点连接的糖组分
这些结果表明，本发明偶联物和变体的抗凝活性在很大程度上得以保 留。这清楚地表明，有可能设计出具有显著增加的针对血浆抑制作用的抗 性(见以下实施例)并保留抗凝活性的APC变体和偶联物。
实施例11-α-l-抗胰蛋白酶的灭活作用
α-l-抗胰蛋白酶灭活试验
人APC或本发明化合物与16.6或42.3μM人α-1-抗胰蛋白酶(Sigma)在 10mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl，5mM CaCl2(含0.1％BSA)中37℃保 温。保温20小时后，从保温的混合物中取15μl样品添加至微滴板中110μl 的50mM Tris-HCl(pH8.3)，100mM NaCl，5mM CaCl2中，如“APC酰胺裂 解试验”中所述，分析APC酰胺裂解活性。计算残余活性，参照缺乏α-1- 抗胰蛋白酶但仍在相同条件下保温的样品所获得的活性进行标准化。
结果
用上述试验获得以下结果：
表3
                        ％残余的酰胺裂解活性
化合物
                        16.6μM抑制剂   42.3μM抑制剂
野生型血浆APC                 10              2
野生型COS 7 APC               7               ＜1
D214N                         80              81
D214A(对照)                   21              1
K251N*                       62              53
S252N*                       62              34
Y302N*                       50              30
M338N                         38              12
M338A(对照)                   9               2
D189N+K191T                   90              77
D189N+K191N(对照)             12              ＜1
S190N+K192T*                 28              5
K191N+K193T                   59              24
K217+L219T                    20              4
T253N+D255T                   56              38
S305N+E307T                   42              9
E307N+E309T                   10              ＜1
S336N+M338T                   72              40
L386N+H388T                   68              44
*：未能通过SDS-PAGE检测出与引入的糖基化位点连接的糖组分
以上数据也示于图2。结果表明，实际上所有偶联物对α-1-抗胰蛋白酶 的抑制作用的抗性增强。尤其，D214N和D189N+K191T即使在最高的α-1- 抗胰蛋白酶浓度也保留了70％以上的酰胺裂解活性。这些化合物糖基化的 效应在将这两种偶联物与缺乏糖基化的D214A和D189N+K191N进行比较 时得以显示。这些变体比它们的糖基化等价物受到更显著的抑制，说明糖 基化作用对于增强针对α-1-抗胰蛋白酶抑制作用的抗性十分重要。而且应注 意到，变体K251N，S252N，Y302N和S190+K192T(它们显然并未利用它们 的引入的糖基化位点，如SDS PAGE所判定)与野生型人APC相比，显著增 强了它们针对α-1-抗胰蛋白酶抑制作用的抗性。
实施例12-人血浆的灭活作用
人血浆灭活试验I
人APC或本发明的化合物在含50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl， 5mM CaCl2的的90％正常人血浆(Sigma Diagnostics，AccuclotTM参考血浆) 中37℃保温。200min后，取等份试样，如“APC酰胺裂解试验”所述分 析APC酰胺裂解活性。将200min后的残余APC活性表示为开始实验时 APC活性的百分比。
结果
使用上述试验获得以下结果：
表4
                    在90％的正常人血浆中200min后
化合物
                     的％残余的酰胺裂解活性
野生型血浆APC                     5
野生型COS 7 APC                   7
D214N                             80
K251N*                           57
S252N*                           45
M338N                             22
S336N+M338T                       45
L386N+H388T                       72
*：未能通过SDS-PAGE检测出与引入的糖基化位点连接的糖组分
以上结果清楚表明，本发明的偶联物和变体对人血浆的灭活作用具有 较高抗性。
实施例13-人血浆中的体外半寿期
人血浆灭活试验II
人APC或本发明的化合物在含50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl， 5mM CaCl2的90％正常人血浆(Sigma Diagnostics，AccuclotTM参考血浆)中 37℃保温。在不同时间点取等份试样，如“APC酰胺裂解试验”所述分析 APC酰胺裂解活性。将不同时间点的残余APC活性表示为开始实验时APC 活性的百分比。计算体外半寿期(以分钟计)，表示为仍然保留50％APC活 性的时间。
结果
获得以下体外半寿期：
表5
化合物              体外半寿期      相对于野生型人APC
                       (min)            的倍数增加
野生型血浆APC            40                 -
野生型COS 7 APC          42                 -
D214N                    ＞400              ＞10
K251N*                  255                6.4
S252N*                  155                3.9
M338N                    85                 2.1
S336N+M338T              185                4.6
L386N+H388T              ＞400              ＞10
*：未能通过SDS-PAGE检测出与引入的糖基化位点连接的糖组分
以上实验数据也可见于图3和4。这些结果表明，APC变体和偶联物 在人血浆中具有显著增加的体外半寿期。尤其D214N和L386N+H388T偶 联物显示出显著增加的体外半寿期(增加10倍以上)。
                       序列表
<110>马克西根公司(Maxygen Aps)；马克西根控股公司(Maxygen Holding)
<120>蛋白C或活化的蛋白C-样分子
<130>0219wo310-protein C
<140>
<141>
<160>40
<170>Patent In Ver.2.1
<210>1
<211>1383
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1383)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(127)..(1383)
<400>1
atg tgg cag ctc aca agc ctc ctg ctg ttc gtg gcc acc tgg gga att   48
Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile
        -40                 -35                 -30
tcc ggc aca cca gct cct ctt gac tca gtg ttc tcc agc agc gag cgt   96
Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg
    -25                 -20                 -15
gcc cac cag gtg ctg cgg atc cgc aaa cgt gcc aac tcc ttc ctg gag  144
Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu
-10                 -5              -1    1               5
gag ctc cgt cac agc agc ctg gag cgg gag tgc ata gag gag atc tgt  192
Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys
             10                  15                  20
gac ttc gag gag gcc aag gaa att ttc caa aat gtg gat gac aca ctg  240
Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu
         25                  30                  35
gcc ttc tgg tcc aag cac gtc gac ggt gac cag tgc ttg gtc ttg ccc  288
Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp Gln Cys Leu Val Leu Pro
     40                  45                  50
ttg gag cac ccg tgc gcc agc ctg tgc tgc ggg cac ggc acg tgc atc  336
Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys Ile
 55                  60                  65                  70
gac ggc atc ggc agc ttc agc tgc gac tgc cgc agc ggc tgg gag ggc  384
Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu Gly
                 75                  80                  85
cgc ttc tgc cag cgc gag gtg agc ttc ctc aat tgc tcg ctg gac aac  432
Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser Leu Asp Asn
             90                  95                 100
ggc ggc tgc acg cat tac tgc cta gag gag gtg ggc tgg cgg cgc tgt    480
Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg Arg Cys
        105                 110                 115
agc tgt gcg cct ggc tac aag ctg ggg gac gac ctc ctg cag tgt cac    528
Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln Cys His
    120                 125                 130
ccc gca gtg aag ttc cct tgt ggg agg ccc tgg aag cgg atg gag aag    576
Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys
135                 140                 145                 150
aag cgc agt cac ctg aaa cga gac aca gaa gac caa gaa gac caa gta    624
Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Asp Thr Glu Asp Gln Glu Asp Gln Val
                155                 160                 165
gat ccg cgg ctc att gat ggg aag atg acc agg cgg gga gac agc ccc    672  
Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro
            170                 175                 180
tgg cag gtg gtc ctg ctg gac tca aag aag aag ctg gcc tgc ggg gca    720
Trp Gln Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala
        185                 190                 195
gtg ctc atc cac ccc tcc tgg gtg ctg aca gcg gcc cac tgc atg gat    768
Val Leu Ile His Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp
    200                 205                  210
gag tcc aag aag ctc ctt gtc agg ctt gga gag tat gac ctg cgg cgc    816
Glu Ser Lys Lys Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg
215                 220                 225                 230
tgg gag aag tgg gag ctg gac ctg gac atc aag gag gtc ttc gtc cac    864
Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His
                235                 240                 245
ccc aac tac agc aag agc acc acc gac aat gac atc gca ctg ctg cac    912
Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His
            250                 255                 260
ctg gcc cag ccc gcc acc ctc tcg cag acc ata gtg ccc atc tgc ctc    960
Leu Ala Gln Pro Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val pro Ile Cys Leu
        265                 270                 275
ccg gac agc ggc ctt gca gag cgc gag ctc aat cag gcc ggc cag gag    1008
Pro Asp Ser Gly Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu
    280                 285                  290
acc ctc gtg acg ggc tgg ggc tac cac agc agc cga gag aag gag gcc    1056
Thr Leu Val Thr Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala
 295                300                 305                 310
aag aga aac cgc acc ttc gtc ctc aac ttc atc aag att ccc gtg gtc    1104
Lys Arg Asn Arg Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val
                315                 320                 325
ccg cac aat gag tgc agc gag gtc atg agc aac atg gtg tct gag aac    1152
Pro His Asn Glu Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn
            330                 335                 340
atg ctg tgt gcg ggc atc ctc ggg gac cgg cag gat gcc tgc gag ggc    1200
Met Leu Cys Ala G1y Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly
        345                 350                 355
gac agt ggg ggg ccc atg gtc gcc tcc ttc cac ggc acc tgg ttc ctg    1248
Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu
    360                 365                 370
gtg ggc ctg gtg agc tgg ggt gag ggc tgt ggg ctc ctt cac aac tac    1296
Val Gly Leu Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr
375                 380                 385                 390
ggc gtt tac acc aaa gtc agc cgc tac ctc gac tgg atc cat ggg cac    1344
Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His
                395                 400                 405
atc aga gac aag gaa gcc ccc cag aag agc tgg gca cct                1383
Ile Arg Asp Lys Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro
            410                 415
<210>2
<211>461
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Trp Gln Leu Thr Ser Leu Leu Leu Phe Val Ala Thr Trp Gly Ile
        -40                 -35                 -30
Ser Gly Thr Pro Ala Pro Leu Asp Ser Val Phe Ser Ser Ser Glu Arg
    -25                 -20                 -15
Ala His Gln Val Leu Arg Ile Arg Lys Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu
-10                  -5              -1   1               5
Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Ile Glu Glu Ile Cys
             10                  15                  20
Asp Phe Glu Glu A1a Lys Glu Ile Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu
         25                  30                  35
Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp Gln Cys Leu Val Leu Pro
     40                  45                  50
Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys Gly His Gly Thr Cys Ile
 55                  60                  65                  70
Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys Arg Ser Gly Trp Glu Gly
                 75                  80                  85
Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu Asn Cys Ser Leu Asp Asn
             90                  95                 100
Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu Val Gly Trp Arg Arg Cys
        105                 110                 115
Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp Asp Leu Leu Gln Cys His
    120                 125                 130
Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro Trp Lys Arg Met Glu Lys
135                 140                 145                 150
Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Asp Thr Glu Asp Gln Glu Asp Gln Val
                155                 160                 165
Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr Arg Arg Gly Asp Ser Pro
            170                 175                 180
Trp Gln Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Lys Lys Leu Ala Cys Gly Ala
        185                 190                 195
Val Leu Ile His Pro Ser Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Met Asp
    200                 205                 210
Glu Ser Lys Lys Leu Leu Val Arg Leu Gly Glu Tyr Asp Leu Arg Arg
 215                220                 225                 230
Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp Ile Lys Glu Val Phe Val His
                235                 240                 245
Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Thr Thr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu His
            250                 255                 260
Leu Ala Gln Pro Ala Thr Leu Ser Gln Thr Ile Val Pro Ile Cys Leu
        265                 270                 275
Pro Asp Ser Gly Leu Ala Glu Arg Glu Leu Asn Gln Ala Gly Gln Glu
    280                 285                 290
Thr Leu Val Thr Gly Trp Gly Tyr His Ser Ser Arg Glu Lys Glu Ala
295                 300                 305                 310
Lys Arg Asn Arg Thr Phe Val Leu Asn Phe Ile Lys Ile Pro Val Val
                315                 320                 325
Pro His Asn Glu Cys Ser Glu Val Met Ser Asn Met Val Ser Glu Asn
            330                 335                 340
Met Leu Cys Ala Gly Ile Leu Gly Asp Arg Gln Asp Ala Cys Glu Gly
        345                 350                 355
Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Ala Ser Phe His Gly Thr Trp Phe Leu
    360                 365                 370
Val Gly Leu Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Gly Leu Leu His Asn Tyr
375                 380                 385                 390
Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Leu Asp Trp Ile His Gly His
                395                 400                 405
Ile Arg Asp Lys Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro
            410                 415
<210>3
<211>1257
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1257)
<400>3
gcc aac tcc ttc ctg gag gag ctc cgt cac agc agc ctg gag cgg gag     48
Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu
  1               5                  10                  15
tgc ata gag gag atc tgt gac ttc gag gag gcc aag gaa att ttc caa     96
Cys Ile Glu Glu Ile Cys Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln
             20                  25                  30
aat gtg gat gac aca ctg gcc ttc tgg tcc aag cac gtc gac ggt gac    144
Asn Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp
         35                  40                  45
cag tgc ttg gtc ttg ccc ttg gag cac ccg tgc gcc agc ctg tgc tgc    192
Gln Cys Leu Val Leu Pro Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys
     50                  55                  60
ggg cac ggc acg tgc atc gac ggc atc ggc agc ttc agc tgc gac tgc    240
Gly His Gly Thr Cys Ile Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys
 65                  70                  75                  80
cgc agc ggc tgg gag ggc cgc ttc tgc cag cgc gag gtg agc ttc ct c   288
Arg Ser Gly Trp Glu Gly Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu
                 85                  90                  95
aat tgc tcg ctg gac aac ggc ggc tgc acg cat tac tgc cta gag gag    336
Asn Cys Ser Leu Asp Asn Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu
            100                 105                 110
gtg ggc tgg cgg cgc tgt agc tgt gcg cct ggc tac aag ctg ggg gac    384
Val Gly Trp Arg Arg Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp
        115                  120                125
gac ctc ctg cag tgt cac ccc gca gtg aag ttc cct tgt ggg agg ccc    432
Asp Leu Leu Gln Cys His Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro
    130                 135                 140
tgg aag cgg atg gag aag aag cgc agt cac ctg aaa cga gac aca gaa    480
Trp Lys Arg Met Glu Lys Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Asp Thr Glu
145                 150                 155                 160
gac caa gaa gac caa gta gat ccg cgg ctc att gat ggg aag atg acc    528
Asp Gln Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr
                165                 170                 175
agg cgg gga gac agc ccc tgg cag gtg gtc ctg ctg gac tca aag aag    576
Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Lys
            180                 185                 190
aag ctg gcc tgc ggg gca gtg ctc atc cac ccc tcc tgg gtg ctg aca    624
Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His Pro Ser Trp Val Leu Thr
        195                 200                 205
gcg gcc cac tgc atg gat gag tcc aag aag ctc ctt gtc agg ctt gga    672
Ala Ala His Cys Met Asp Glu Ser Lys Lys Leu Leu Val Arg Leu Gly
    210                 215                 220
gag tat gac ctg cgg cgc tgg gag aag tgg gag ctg gac ctg gac atc    720
Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp Ile
225                 230                 235                 240
aag gag gtc ttc gtc cac ccc aac tac agc aag agc acc acc gac aat    768
Lys Glu Val Phe Val His Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Thr Thr Asp Asn
                245                 250                 255
gac atc gca ctg ctg cac ctg gcc cag ccc gcc acc ctc tcg cag acc    816
Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gln Pro Ala Thr Leu Ser Gln Thr
            260                 265                 270
ata gtg ccc atc tgc ctc ccg gac agc ggc ctt gca gag cgc gag ctc    864
Ile Val Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ser Gly Leu Ala Glu Arg Glu Leu
        275                 280                 285
aat cag gcc ggc cag gag acc ctc gtg acg ggc tgg ggc tac cac agc   912
Asn Gln Ala Gly Gln Glu Thr Leu Val Thr Gly Trp Gly Tyr His Ser
    290                 295                 300
agc cga gag aag gag gcc aag aga aac cgc acc ttc gtc ctc aac ttc    960
Ser Arg Glu Lys Glu Ala Lys Arg Asn Arg Thr Phe Val Leu Asn Phe
305                 310                 315                 320
atc aag att ccc gtg gtc ccg cac aat gag tgc agc gag gtc atg agc    1008
Ile Lys Ile Pro Val Val Pro His Asn Glu Cys Ser Glu Val Met Ser
                325                 330                 335
aac atg gtg tct gag aac atg ctg tgt gcg ggc atc ctc ggg gac cgg    1056
Asn Met Val Ser Glu Asn Met Leu Cys Ala Gly Ile Leu Gly Asp Arg
            340                 345                 350
cag gat gcc tgc gag ggc gac agt ggg ggg ccc atg gtc gcc tcc ttc    1104
Gln Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Ala Ser Phe
        355                 360                 365
cac ggc acc tgg ttc ctg gtg ggc ctg gtg agc tgg ggt gag ggc tgt    1152
His Gly Thr Trp Phe Leu Val Gly Leu Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys
    370                 375                 380
ggg ctc ctt cac aac tac ggc gtt tac acc aaa gtc agc cgc tac ctc    1200
Gly Leu Leu His Asn Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Leu
385                 390                 395                 400
gac tgg atc cat ggg cac atc aga gac aag gaa gcc ccc cag aag agc    1248
Asp Trp Ile His Gly His Ile Arg Asp Lys Glu Ala Pro Gln Lys Ser
                405                 410                 415
tgg gca cct                                                        1257
Trp Ala Pro
<210>4
<211>419
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu
  1               5                  10                  15
Cys Ile Glu Glu Ile Cys Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu Ile Phe Gln
             20                  25                  30
Asn Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp Gly Asp
         35                  40                  45
Gln Cys Leu Val Leu Pro Leu Glu His Pro Cys Ala Ser Leu Cys Cys
     50                  55                  60
Gly His Gly Thr Cys Ile Asp Gly Ile Gly Ser Phe Ser Cys Asp Cys
 65                  70                  75                  80
Arg Ser Gly Trp Glu Gly Arg Phe Cys Gln Arg Glu Val Ser Phe Leu
                 85                  90                  95
Asn Cys Ser Leu Asp Asn Gly Gly Cys Thr His Tyr Cys Leu Glu Glu
            100                 105                 110
Val Gly Trp Arg Arg Cys Ser Cys Ala Pro Gly Tyr Lys Leu Gly Asp
        115                 120                 125
Asp Leu Leu Gln Cys His Pro Ala Val Lys Phe Pro Cys Gly Arg Pro
    130                 135                 140
Trp Lys Arg Met Glu Lys Lys Arg Ser His Leu Lys Arg Asp Thr Glu
145                 150                 155                 160
Asp Gln Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly Lys Met Thr
                165                 170                 175
Arg Arg Gly Asp Ser Pro Trp Gln Val Val Leu Leu Asp Ser Lys Lys
            180                 185                 190
Lys Leu Ala Cys Gly Ala Val Leu Ile His Pro Ser Trp Val Leu Thr
        195                 200                 205
Ala Ala His Cys Met Asp Glu Ser Lys Lys Leu Leu Val Arg Leu Gly
    210                 215                 220
Glu Tyr Asp Leu Arg Arg Trp Glu Lys Trp Glu Leu Asp Leu Asp Ile
 225                230                 235                 240
Lys Glu Val Phe Val His Pro Asn Tyr Ser Lys Ser Thr Thr Asp Asn
                245                 250                 255
Asp Ile Ala Leu Leu His Leu Ala Gln Pro Ala Thr Leu Ser Gln Thr
            260                 265                 270
Ile Val Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ser Gly Leu Ala Glu Arg Glu Leu
        275                 280                 285
Asn Gln Ala Gly Gln Glu Thr Leu Val Thr Gly Trp Gly Tyr His Ser
    290                 295                 300
Ser Arg Glu Lys Glu Ala Lys Arg Asn Arg Thr Phe Val Leu Asn Phe
305                 310                 315                 320
Ile Lys Ile Pro Val Val Pro His Asn Glu Cys Ser Glu Val Met Ser
                325                 330                 335
Asn Met Val Ser Glu Asn Met Leu Cys Ala Gly Ile Leu Gly Asp Arg
            340                 345                 350
Gln Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Met Val Ala Ser Phe
        355                 360                 365
His Gly Thr Trp Phe Leu Val Gly Leu Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys
    370                 375                 380
Gly Leu Leu His Asn Tyr Gly Val Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Leu
385                 390                 395                 400
Asp Trp Ile His Gly His Ile Arg Asp Lys Glu Ala Pro Gln Lys Ser
                 405                410             415
Trp Ala Pro
<210>5
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>5
 caagtagatc cgcggctcat taacgggaag atgaccaggc gggg          44
<210>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>6
<210>7
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>7
ctgacagcgg cccactgcat gaacgagtcc aagaagctcc ttgtc          45
<210>8
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>8
gacaaggagc ttcttggact cgttcatgca gtgggccgct gtcag          45
<210>9
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>9
ctgacagcgg cccactgcat ggccgagtcc aagaagctcc ttgtc          45
<210>10
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>10
 gacaaggagc ttcttggact cggccatgca gtgggccgct gtcag      45
<210>11
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>11
 cttcgtccac cccaactaca gcaacagcac caccgacaat gacatc     46
<210>12
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>12
gatgtcattg tcggtggtgc tgttgctgta gttggggtgg acgaag      46
<210>13
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>13
cgtccacccc aactacagca agaacaccac cgacaatgac atcgc       45
<210>14
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>14
gcgatgtcat tgtcggtggt gttcttgctg tagttggggt ggacg       45
<210>15
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>15
ccctcgtgac gggctggggc aaccacagca gccgagagaa ggaggcc      47
<210>16
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>16
ggcctccttc tctcggctgc tgtggttgcc ccagcccgtc acgaggg      47
<210>17
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>17
cagcgaggtc atgagcaaca acgtgtctga gaacatgc                38
<210>18
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>18
gcatgttctc agacacgttg ttgctcatga cctcgctg                38
<210>19
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>19
gcagcgaggt catgagcaac gccgtgtctg agaacatgc               39
<210>20
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>20
 gcatgttctc agacacggcg ttgctcatga cctcgctgc                    39
<210>21
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>21
 cccctggcag gtggtcctgc tgaactcaaa caagaagctg gcctgcgggg        50
<210>22
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>22
ccccgcaggc cagcttcttg tttgagttca gcaggaccac ctgccagggg         50
<210>23
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>23
cccctggcag gtggtcctgc tgaactcaac caagaagctg gcctgcgggg         50
<210>24
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>24
ccccgcaggc cagcttcttg gttgagttca gcaggaccac ctgcc              45
<210>25
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>25
 ggcaggtggt cctgctggac aacaagacca agctggcctg cggggcagt           49
<210>26
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>26
 gcactgcccc gcaggccagc ttggtcttgt tgtccagcag gaccacctgc c        51
<210>27
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>27
gtcctgctgg aetcaaacaa gaccctggcc tgcggggcag tg                   42
<210>28
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>28
cactgccccg caggccaggg tcttgtttga gtccagcagg ac                   42
<210>29
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>29
gcatggatga gtccaacaag acccttgtca ggcttggaga gtatgacc             48
<210>30
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>30
ggtcatactc tccaagcctg acaagggtct tgttggactc atccatgc             48
<210>31
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>31
ccaactacag caagagcaac accaccaatg acatcgcact gctgcacctg           50
<210>32
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>32
gccaggtgca gcagtgcgat gtcattggtg gtgttgctct tgctgtagtt gg        52
<210>33
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>33
ggctggggct accacagcaa ccgaaccaag gaggccaaga gaaaccgc             48
<210>34
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>34
gcggtttctc ttggcctcct tggttcggtt gctgtggtag ccccagcc             48
<210>35
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>35
ggctaccaca gcagccgaaa caagaccgcc aagagaaacc gcaccttcg            49
<210>36
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>36
cgaaggtgcg gtttctcttg gcggtcttgt ttcggctgct gtggtagcc          49
<210>37
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>37
gcagcgaggt catgaacaac accgtgtctg agaacatgct gtgtgcggg          49
<210>38
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>38
cccgcacaca gcatgttctc agacacggtg ttgttcatga cctcgctgc          49
<210>39
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>39
ggtgagctgg ggtgagggct gtgggaacct taccaactac ggcgtttaca cc      52
<210>40
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>40
ggtgtaaacg ccgtagttgg taaggttccc acagccctca ccccagctca cc      52