唐氏综合症一步快速免疫诊断检测盒或检测条及诊断法

本发明涉及一种免疫诊断检测盒或检测条及其诊断方法，尤是针对“唐氏综合症”血液中的相关抗原作出快速检测的检测盒或检测条及其诊断方法。

“唐氏综合症”Down’s Syndrom(缩写DS)即第21对染色体为3倍体，是一种常见先天性遗传性的智力发育障碍，新生儿含有不同程度痴呆，呈现精神呆滞，其发病率为千分之1.3。故在妊娠期早期诊断是优生的十分重要的一环。现有的早期诊断方法是：母体妊娠期诊断，用羊膜穿刺或绒毛膜取样，这种方法具有损伤性，可诱发流产，其发生率为0.5-1.5％。

本发明目的在于提供一种能一步快速安全检测唐氏综合症免疫诊断检测盒或检测条及其诊断方法。

本发明是通过检测孕妇血液中与“唐氏综合症”相关的指标，如绒毛膜促性腺激素(hCG)及其β-亚单位绒毛膜促性腺激素(β-hCG)，甲胎蛋白(α-FP)，妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy-Associated PlasmaProtein A，缩写PAPP-A)。本发明是在先申请的“半定量一步法免疫诊断法”申请号98122892.5的应用。基于抗原、抗体、可见颗粒标记以及固相层析的原理。可见颗粒标记包括象金标、硒标、碳标等。用半定量检测与“唐氏综合症”相关抗原在血液中浓度。

本发明的唐氏综合症一步快速免疫诊断检测盒或检测条，由标记抗体固相区；固相膜层析区；对照区；试验区；吸水纸分贴在一个平面板上组成。

固相膜层析区的层析膜为涂固有抗体的层析膜，标记抗体固相区的标记抗体为可见颗粒标记抗体如象金标、硒标、碳标等。

检测盒用于检测绒毛膜促性腺激素(hCG)时，所述的标记抗体固相区的标记抗体由抗绒毛膜促性腺激素单克隆抗体和胶体金溶液、复合化学组分组成。

当检测盒或检测条用于检测绒毛膜促性腺激素(hCG)时，所述的包被抗体含有另一配对的抗绒毛膜促性腺激素单克隆抗体。

当检测盒或检测条用于检测甲胎蛋白(α-FP)时，标记抗体固相区的标记抗体由作用于抗原不同位点上的抗α-FP单克隆抗体和胶体金溶液，复合化学组分组成。

当检测盒或检测条用于检测甲胎蛋白(α-FP)时，所述的包被抗体含有另一配对的抗α-FP单克隆抗体。

本发明是在检测与唐氏综合症相关的血液指标中的指标如绒毛膜促性腺激素(hCG)及其β-亚单位绒毛膜促性腺激素(β-hCG)、甲胎蛋白(α-FP)、妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy-Associated Plasma ProteinA，缩写PAPP-A)中应用。

本发明的检测盒或检测条含有或不含有待测物质抗原阻断剂。

本发明的唐氏综合症一步快速免疫诊断方法，包括有以下步骤：(1)唐氏综合症一步快速免疫诊断检测盒或检测条；(2)待测物质为唐氏综合症相关的抗原血液浓度；(3)设定试验区和对照区，对照区颜色深浅程度代表待测物质的某一特定浓度即临界值，待测物质于检测盒或检测条的试验区所形成的色带与检测盒或检测条的对照区的色带颜色进行对比，以半定量方式决定待测物质抗原的浓度水平再以此判断唐氏综合症的可能性。

其待测物质为绒毛膜促性腺激素(hCG)及其β-亚单位绒毛膜促性腺激素(β-hCG)、甲胎蛋白(α-FP)、妊娠相关血浆蛋白A(Pregnancy-Associated Plasma Protein A，缩写PAPP-A)。

检测的血液中与唐氏综合症相关的指标是通过检测盒或检测条进行检测，检测盒或检测条的固相膜上设有试验区(T)和对照区(一个对照区C，或二个对照区C1/C2)。对照区色带深浅相当于某特定浓度待测指标称临界值。比较试验区和对照区色带，可判断待测抗原浓度范围。如待测浓度高于(或低于)临界值，予示胎儿有较大可能性为“唐氏综合症”患者，需进一步随访确诊。

检测盒或检测条包括一条层析吸收膜和一对能选择性鉴别待测样品血中相关抗原的单克隆抗体。层析膜的试验带上涂有相关单克隆抗体，而对照带上则涂有羊抗鼠抗体，其共分7个区，第1区是玻璃纤维膜，为样品吸收区，第2区为标记抗体固相区，第3区为固相膜层析区，第4区为对照区C1，是低临界值区，第5区为试验区T，第6区为对照区C2，是高临界值，第7区为吸水纸片，待测样滴加于第一区的玻璃纤维膜，展开剂以毛细管原理溶解第2区标记抗体、沿第3区层析膜上行。这时待测抗原成分与标记抗体形成紫色抗原抗体复合物。展开剂继续上行时，在第4、5、6区分别形成沉淀线。对照区“4、6”沉淀线颜色相当于“高”和“低”两个临界值(某些诊断只需一个临界值即检测盒或检测条只有一个对照区)。实验区“5”，即“T”的色带深浅与待测抗原含量成正比。抗原含量愈高色带愈深。在测试设定时间，约5-10分钟时，将“T”区的色带深浅与“C”区颜色比较，以决定抗原浓度范围。

检测盒或检测条的制备方法：1、标记抗体的制备：将所需抗体加入所需量胶体金溶液，搅拌10分钟后，加入1/10体积的1％小牛血清蛋白液作稳定剂，高速离心，取得红色沉淀物，即标记抗体。

2、将上述沉淀物溶解于缓冲剂F中，加之适量阻断剂，铺于玻璃纸上，真空抽干。

3、包被抗体制备：将与标记抗体相对应之另一抗体溶液用喷雾方法划线于硝基纤维膜上，于37℃烘干20分钟。

4、装配：将上述各组分贴在有胶面的塑料薄板上，上下两端再贴上吸水纸。切割成条，再装入塑壳之中。

附图说明

：如图1所示一步快速免疫诊断法的检测盒的结构示意图。

1—第1区：样品吸收区2—第2区：标记抗体固相区3—第3区：固相膜层析区4—第4区：对照区C15—第5区：试验区T6—第6区：对照区C27—第7区：吸水纸片由于孕期不同，血中相关抗原的含量也不同，按孕妇的周龄不同，检测盒共有四种，如表1所示。

表1.不同孕龄的检测盒试验编号                     用于测试孕妇的周龄14                               1415                               1516                               1617                               17实施例1DS-HCG测试1、材料：单抗鼠抗体hCG标准品、吸水纸片、包被抗体是抗α-hCG单克隆抗体，标记抗体是抗β-hCG单克隆抗体、胶体金、硝基纤维膜、玻璃纤维膜、阻断剂、缓冲剂F。

2、方法(1)标记抗体：将所需量的抗β-hCG抗体加入相应量胶体金溶液，搅拌10分钟后，加1/10体积的1％小牛血清蛋白作稳定剂，高速离心，取得红色沉淀物即为标记抗体。

(2)将上述沉淀物溶解于缓冲剂F，加之适量阻断剂，铺于玻璃纤维膜上，真空抽干。

(3)包被抗体，将抗α-hCG单克隆抗体溶液用喷雾方法划线于硝基纤维膜上，于37℃烘干20分钟。

(4)将上述各组分贴在有胶面的塑料薄板上，上下两端再贴上吸水纸，切割成条，制得本发明检测盒。

孕妇血液中hCG浓度与孕周有关。唐氏综合症孕妇血中hCG的水平为正常值的1.94倍，具体数据如表2。

表2正常与患者孕妇血液hCG水平

如某孕妇血液中hCG高于正常水平1.94倍，其婴儿患“唐氏综合”的可能性为65-75％。用于测定14周孕妇血样的检测盒，其第6区“C2”相当于hCG 64IU/ml水平，第4区“C1”相当于33IU/ml。测试时取14周孕妇血样，于加样后10分钟时，比较试验区“T”带与“C1带和C2”带的颜色深浅，如T＞C2，其婴儿患“唐氏综合症”的可能性为65-75％。以此类推其它孕周测试盒。

3.操作方法：如图1所示首先将14周孕妇血样滴加至第一区玻璃纤维膜1上，展开剂以毛细管原理溶解于第2区标记抗体固相区2中、沿第3区固相膜层析区3上行，约数分钟，第5区试验区T5处形成色带T，在指定时间时，如10分钟，比较T带与第4区4中的C1带和第6区6中C2带颜色的深浅，如T带颜色深于C2带的颜色即可判断患唐氏综合症可能性为65-75％。

4.测试结果：①产品批内差异检测：

每个浓度测10管，其测定值和标准值100％一致。②产品批间差异检测：用10种浓度(同批内差异)，四个不同批的测试盒在10天内重复测定10次，其测定值和标准值100％一致。③特异性检测：如表3所示，下列物质对检测结果无干扰影响。

5.方法学评价：特异性：如表3所列的有可能干扰测试结果的物质在所试浓度下并不干扰血中hCG的测定。

正确性：102个孕妇血样，用本检测盒和酶联法定量诊断法平行对比，其相关性为99％，参见表4。

表3测试有可能干扰测定结果的物质和浓度所加物                            浓度醋酸酚                            20mg/dl抗坏血酸                          20mg/dl乙酰水杨酸                        20mg/dl阿托品                            20mg/dl咖啡因                            20mg/dl龙胆酸，2、5二羟苯甲酸            20mg/dl氨苄青霉素                        20mg/dl四环素                            20mg/dl白蛋白                            2000ng/dl葡萄糖                            2000ng/dl人血清蛋白                        2000ng/dl尿酸                              10mg/dl考的松                            200mg/dlDHEA-S                            500ng/dl雌二醇(E2)                       25ng/dl雌三醇(E3)                       25ng/dl黄体生成素(LH)                    300mIU/ml甲状腺刺激素(TSH)                 1000μIU/ml滤泡刺激素(FSH)                   1000mIU/ml

表4本发明与酶联法相关性(DS-hCG)病例             酶联法(IU/ml)              本发明方法1                    17.1                      T＜T22                    43.4                      C2＜T＜C13                    32.0                      T＝C24                    11.4                      T＜C25                    12.7                      T＜C26                    24.5                      T＜C27                    21.4                      T＜C28                    26.6                      T＜C29                    15.5                      T＜C210                   47.9                      C2＜T＜C111                   66.9                      T＞C112                   12.0                      T＜C213                   34.0                      T＝C214                   20.0                      T＜C215                   21.4                      T＜C216                   19.9                      T＜C217                   29.3                      T＜C21 8                  31.2                      T＝C219                   19.4                      T＜C220                   47.9                      C2＜T＜C121                   32.1                      T＝C222                   49.4                      C2＜T＜C123                   50.6                      C2＜T＜C124                   32.2                      T＝C225                   17.1                      T＜C226                   19.4                      T＜C227                   29.3                      T＜C228                   39.3                      C2＜T＜C129                   27.2                      T＜C230                   8.4                       T＜C231                   29.9                      T＜C232                   44.0                      C2＜T＜C133                   36.4                    C2＜T＜C134                   25.5                    T＜C235                   21.1                    T＜C236                   36.5                    C2＜T＜C137                   29.4                    T＜C238                   49.2                    C2＜T＜C139                   28.1                    T＜C240                   22.1                    T＜C241                   34.1                    C2＜T＜C142                   33.9                    T＝C243                   12.6                    T＜C244                   47.2                    C2＜T＜C145                   18.1                    T＜C246                   52.7                    C2＜T＜C147                   22.1                    T＜C248                   49.1                    C2＜T＜C149                   21.2                    T＜C250                   19.0                    T＜C251                   12.7                    T＜C252                   47.2                    C2＜T＜C153                   51.2                    C2＜T＜C154                   31.9                    T＝C255                   49.1                    C2＜T＜C156                   26.9                    T＜C257                   28.2                    T＜C258                   17.0                    T＜C259                   29.4                    T＜C260                   52.1                    C2＜T＜C161                   9.1                     T＜C262                   47.7                    C2＜T＜C163                   31.9                    T＝C264*                  23.3                    T＝C265                   18.9                    T＜C266                   53.3                    C2＜T＜C167                   21.1                    T＜C268                   32.6                    T＝C269                  42.2                     C2＜T＜C170                  19.9                     T＜C271                  17.8                     T＜C272                  18.4                     T＜C273                  29.3                     T＜C274                  66.2                     T＞C175                  26.9                     T＜C276                  42.1                     C2＞T＞C177                  29.0                     C2＜T78                  40.6                     C2＜T＜C179                  21.1                     T＜C280                  55.2                     C2＜T＜C181                  29.1                     T＜C282                  48.8                     C2＜T＜C183                  51.9                     C2＜T＜C184                  32.9                     T＝C285                  33.1                     T＝C286                  19.9                     T＜C287                  22.7                     T＜C288                  54.4                     C2＜T＜C189                  44.4                     C2＜T＜C190                  28.1                     T＜C291                  32.4                     T＝C292                  22.0                     T＜C293                  30.1                     T＜C294                  58.9                     C2＜T＜C195                  11.9                     T＜C296                  28.1                     T＜C297                  39.9                     C2＜T＜C198                  51.1                     C2＜T＜C199                  24.4                     T＜C2100                 32.8                     T＝C2101                 49.2                     C2＜T＜C1102                 19.9                     T＜C2

综上所述，本发明用检测盒或检测条检测DS-hCG浓度与酶联法的相关性为99.0％。

实施例2 α-FP测试检测盒制备方法：1、材料：单克隆抗鼠抗体α-FP标准品、吸水纸片、包被抗体是抗α-FP单克隆抗体，标记抗体是另一作用于抗原不同位点上的抗α-FP单克隆抗体、胶体金、硝基纤维膜、玻璃纤维膜、阻断剂、缓冲剂F。

2、方法(1)标记抗体：将所需量的另一作用于抗原不同位点的抗α-FP单克隆抗加入相应量胶体金溶液，搅拌10分钟后，加1/10体积的1％小牛血清蛋白作稳定剂，高速离心，取得红色沉淀物即为标记抗体。

(2)将上述沉淀物溶解于缓冲剂F，加之适量阻断剂，铺于玻璃纤维膜上，真空抽干。

(3)包被抗体：将另一抗α-FP单克隆抗体溶液用喷雾方法划线于硝基纤维膜上，于37℃烘干20分钟。

(4)将上述各组分贴在有胶面的塑料薄板上，上下两端再贴上吸水纸，切割成条，便制得本发明检测盒。

孕妇血液中α-FP浓度水平随孕周而异。婴儿“患唐氏综症”的孕妇血中α-FP水平低于正常值的0.77倍(见表5)。

表5：正常与患者孕妇α-FP水平

如某孕妇血液中α-FP浓度水平低于正常值的0.77倍，其婴儿患“唐氏综合症”的可能性为65-75％。14孕周检测盒第6区对照区的“C”相当于9.2IU/ml(该测试盒仅需一条)。于滴样后约10分钟时，比较“T”和“C”颜色的深浅，若T＜C其婴儿患“唐氏综合症”的可能性为65-75％。以此类推其它孕周测试盒。

3、操作方法：将14周孕妇血样滴加至第一区玻璃纤维膜1上，展开剂毛细管原理溶解于第2区标记抗体固相区2中，沿第3区固相膜层析区3上行，约数分钟，第5区试验T5处形成色带T，比较第5区中T带与第6区中的C带的颜色深浅，如C带颜色深于T带的颜色，即可判断患唐氏综合症可能性为65-75％。

4、方法学评价：特异性：如表3所示的各物质在所试验浓度下，并不干扰血样中α-FP 0和9.2UIU/ml的测定。

正确性：取102例用酶联法诊断的病人的血清，用本检测盒和酶联法同时比较，其相关性为99.0％，参见表6。

精密度：批内差异：共测了含有α-FP 0、6、9.2和12 UIU/ml的标准样品四种浓度，每个浓度测10管，结果测定值和标准值100％一致。

批间差异：用4个不同的浓度(0、6、9.2和12 UIU/ml)四个不同批号的诊断盒在10天内重复测定10次，其测定值和标准值100％一致。

表6本发明与酶联法相关性(α-FP)病例            酶联法(IU/ml)              本发明方法1                    3.2                      T＜C2                    4.8                      T＜C3                    14.4                     T＞C4                    11.2                     T＞C5                    20.8                     T＞C6                    8.9                      T＝C7                    11.7                     T＞C8                    16.6                     T＞C9                    4.2                      T＜C10                   4.4                      T＜C11                   16.2                     T＞C12                   5.0                      T＜C13                   19.6                     T＞C14                   7.0                      T＜C15                   11.1                     T＞C16                   17.5                     T＞C17                   17.4                     T＞C18                   16.2                     T＞C19                   7.2                      T＜C20                   2.7                      T＜C21                   14.3                     T＞C22                   4.4                      T＜C23                   4.6                      T＜C24                   9.2                      T＝C25                   10.4                     T＜C26                   16.6                     T＞C27                   14.2                     T＞C28                   12.3                     T＞C29                   8.9                      T＝C30                   6.0                      T＜C31                   18.9                     T＞C32                   2.0                      T＜C33                   20.0                     T＞C34                   13.3                     T＞C35                   8.7                      T＝C36                   7.4                      T＜C37                  18.7                    T＞C38                  4.1                     T＜C39                  8.9                     T＝C40                  5.5                     T＜C41                  4.1                     T＜C42                  3.9                     T＜C43                  12.2                    T＞C44                  18.1                    T＞C45                  22.0                    T＞C46                  2.9                     T＜C47                  17.6                    T＞C48                  2.3                     T＜C49                  5.2                     T＜C50                  7.6                     T＜C51                  12.2                    T＞C52                  17.0                    T＞C53                  19.0                    T＞C54                  17.2                    T＞C55                  12.7                    T＞C56                  3.3                     T＜C57                  14.0                    T＞C58                  5.0                     T＜C59                  19.1                    T＞C60                  12.6                    T＞C61                  14.4                    T＞C62                  6.4                     T＜C63                  12.4                    T＞C64                  13.9                    T＞C65                  13.2                    T＞C66                  4.8                     T＜C67                  8.9                     T＝C68                  2.9                     T＜C69                  5.0                     T＜C70                  4.9                     T＜C71                  8.1                     T＜C72                  3.3                     T＜C73                  6.0                     T＜C74                  6.7                     T＜C75                  7.4                     T＜C76                  14.2                    T＞C77                   18.9                     T＞C78                   15.4                     T＞C79                   20.3                     T＞C80                   6.9                      T＜C81                   3.9                      T＜C82                   5.6                      T＜C83                   6.2                      T＜C84                   5.5                      T＜C85                   6.7                      T＜C86                   9.0                      T＝C87                   5.3                      T＜C88                   14.9                     T＞C89                   18.1                     T＞C90                   13.2                     T＞C91                   8.0                      T＜C92                   8.9                      T＝C93                   15.5                     T＞C94                   16.9                     T＞C95                   5.9                      T＜C96                   4.5                      T＜C97                   7.2                      T＜C98                   4.1                      T＜C99                   6.9                      T＜C100                  7.2                      T＜C101                  4.8                      T＜C102                  15.0                     T＞C综上所述，本发明检测盒或检测条检测α-FP浓度与酶联法相关性为99.0％。

本发明与酶联法及羊膜穿刺法临床比较如表7所示，临床作了28例实例对比研究。

表7本发明与酶联法及羊膜穿刺法临床比较编号      α-FP         DS-α-FP         HCG         DS-hCG       羊膜穿刺法酶联法       本发明方法       酶联法     本发明方法1         15.4         T＞C             32.0        C1＜T＜C2     正常2         13.8         T＞C             42.2        C1＜T＜C2     正常3         15.9         T＞C             31.0        C1＞T         正常4         15.1         T＞C             29.8        C1＞T         正常5         12.8         T＞C             45.6        C1＜T＜C2     正常6         15.4         T＞C             32.2        C1＝T         正常7         14.2         T＞C             49.6        C1＜T＜C2     正常8         16.3         T＞C             30.8        C1＞T         正常9         13.1         T＞C             44.1        C1＜T＜C2     正常10        12.8         T＞C             33.7        C1＝T         正常11        16.2         T＞C             48.2        C1＜T＜C2     正常12        14.9         T＞C             40.7        C1＜T＜C2     正常13        13.7         T＞C             29.1        C1＞T         正常14        12.4         T＞C             49.2        C1＜T＜C2     正常15        12.9         T＞C             51.4        C1＜T＜C2     正常16        7.1          T＜C             70.1        T＞C2         三倍体即DS唐氏综合症17        12.8         T＞C             39.4        C1＜T＜C2     正常18        14.1         T＞C             58.6        C1＜T＜C2     正常19        12.9         T＞C             50.4        C1＜T＜C2     正常20        13.1         T＞C             49.6        C1＜T＜C2     正常21        12.2         T＞C             39.9        C1＜T＜C2     正常22        11.6         T＞C             55.2        C1＜T＜C2     正常23        13.6         T＞C             52.2        C1＜T＜C2     正常24        12.9         T＞C             47.5        C1＜T＜C2     正常25        6.6          T＜C             72.2        T＞C2         三倍体即DS唐氏综合症26        12.9         T＞C             52.2        C1＜T＜C2     正常27        6.9          T＜C             69.8        T＞C2         三倍体即DS唐氏综合症28        13.1         T＞C             52.2        C1＜T＜C2     正常注：孕周为14-15周综上所述，请参见表7，临床数据表明，使用本发明检测盒或检测条检测h-CG与α-FP的浓度诊断“唐氏综合症”与酶联法及羊膜穿刺法结果完全一致。