技术领域
[0001] 本
发明涉及一种侧流膜装置和包括所述侧流膜装置的侧流免疫测定装置，所述侧流膜装置包括
支撑在液体不可渗透的支撑层上的微孔膜层。
背景技术
[0002] 在现代的生化分析中，免疫测定经常用于检测
生物体液(如血液、尿液或唾液)中各种物质的存在或浓度，所述物质通常指配体或分析物。在固相免疫测定中，结合剂(binding agent)，典型地为待检测的配体的特异性
抗体，被固定在固体支撑体上。可能包括待检测配体的测试液与所述固体支撑体
接触且在所述配体存在的情况下，所述结合剂和所述配体之间形成络合物(complex)。为了使所述络合物可见，可使用结合所述络合物的标记物抗体，然后目视检测与所述络合物结合的所述标记物抗体。
[0003] 美国
专利申请US5,591,645公开了一种夹心式免疫测定方法，其中，配体夹在标记物抗体和固定在固体支撑体上的抗体之间。
[0004] 在固相免疫测定中，多孔材料如硝化
纤维素、尼龙、
醋酸纤维素、玻璃纤维和其它多孔
聚合物已经被用作固体支撑体。在所谓的侧流(lateral flow)测定中，用于测试配体存在的液体被施加在多孔膜层的一端并在毛细管
力的作用下侧向流过所述膜。所述多孔膜包括固定(immobilized)结合剂，所述结合剂能与被检测的所述配体结合。所述固定化结合剂可均匀地分布在整个膜上。然而，通常所述固定化结合剂位于所述膜中规定的测试区或检测区，通常在狭窄的测试线上，所述测试线已经通
过喷墨印刷或
气溶胶喷涂技术得到应用。
[0005] 在侧流免疫测定中，通常具有固定化结合剂的微孔材料的薄层支撑在液体不可渗透的层，以为所述易碎的膜层提供足够的刚性。通常，厚度范围约为100～200mm的微孔材料层支撑在支撑层(通常称为“膜背衬”)上。然而，根据需要，所述膜的厚度可能薄于100μm或厚于200μm。
[0006] 侧流免疫测定法经常发生的问题与测定灵敏度和
信号强度有关。例如，与酶联
免疫吸附测定法(ELISA)相比，该测定的灵敏度通常低5～10倍。已经提出若干改进信号的措施，例如信号放大策略，如信号酶增强，但仍有改进的空间。
[0007] 因此，本发明的目的在于提供一种侧流膜装置，从而改进测定的灵敏度和信号强度。
发明内容
[0008] 现已发现上述目的可通过提供一种侧流膜装置实现，其中，微孔膜层具有至少一个检测区和至少一个非检测区，所述检测区的厚度比所述非检测区的厚度小，因而在很大程度上可提高所述侧流免疫测定的灵敏度和信号强度。
[0009] 因此，本发明涉及一种侧流膜装置，包括微孔膜层和液体不可渗透的支撑层，对于通过所述微孔膜层的液体的侧流，所述微孔膜层支撑在所述液体不可渗透的支撑层上且具有至少一个检测区和至少一个非检测区，结合剂被固定在所述至少一个检测区，所述液体不可渗透的支撑层具有至少一个具有大厚度的区域和至少一个具有小厚度的区域，所述微孔膜层支撑在所述液体不可渗透的支撑层上，从而所述至少一个检测区设置在所述支撑层的具有大厚度的所述至少一个区域上方且所述至少一个非检测区设置在所述支撑层的具有小厚度的所述至少一个区域上方，所述区域被定向为与所述液体的侧流方向
正交的方向，在所述膜的整个宽度的方向上所述检测区的厚度为100-150μm，在所述膜的整个宽度的方向上所述非检测区的厚度最多为300μm，所述侧流膜装置具有恒定的厚度。
[0010] 有利地，所述膜装置可应用于固相侧流免疫测定中。
[0011] 如本发明采用的，厚度比所述非检测区的厚度小的检测区的一个重要优点在于在所述检测区，被分析的所述液体被迫流过部分所述微孔膜层，所述微孔膜层包括固定化结合剂。这将导致与所述固定化结合剂相互作用的配体数量增加且增强了所述免疫测定的灵敏度和信号强度。
[0012] 在另一方面，本发明涉及一种侧流免疫测定装置，它包括前述的所述膜装置。
[0013] 在再一方面，本发明涉及在免疫
妊娠试验中使用上述侧流膜装置的用途。
附图说明
[0014] 图1a-1c为本发明的侧流膜装置的纵向截面图。
[0015] 图2图示了
实施例3中使用的所述侧流膜装置的信号强度的定量化结果。
[0016] 图3图示了实施例3中使用的所述侧流膜装置的信号强度的进一步的定量化结果。
具体实施方式
[0017] 本发明的所述侧流膜装置为微孔膜层支撑在液体不可渗透的支撑层上的细长装置。所述装置适合于液体在毛细管力的作用下侧向流过所述膜层且通常用于侧流免疫测定中以检测侧向流过所述微孔膜层的测试液体中的配体或分析物(analyte)。所述细长装置具有长度、宽度和厚度或高度。所述装置的厚度或高度，如支撑层加上膜层，为恒定的。在所述膜装置的整个宽度的方向上所述膜层的检测区的厚度范围为100～150μm，优选地为100～130μm，更优选地为110～120μm。然而，在某些实施例中，所述膜层的检测区的厚度小于100μm或大于150μm。
[0018] 在本发明的所述膜装置中，所述膜装置中的所述膜层中，在横向上，所述检测区和所述非检测区的在所述膜装置的整个宽度的方向上的厚度交替，非检测区的厚度大于检测区的厚度。所述膜层的非检测区的厚度最多为300μm，优选地范围为100～250μm，更优选地为150～250μm，甚至更优选地为150～200μm。由于具有所述膜层和支撑层的所述装置具有恒定的厚度，所述支撑层的厚度将减小而所述膜层的厚度增加，反之亦然。
[0019] 所述膜层的厚度可以以合适的方式减小或增加，例如步进式地(stepwise)或渐进式地(gradually)。优选地，从所述检测区的厚度到所述非检测区的厚度，所述膜层的厚度逐渐地减小。此处提及的逐渐地减小是指有梯度的减小而不是步进式的减小，即跟随有限切线减小(每单位膜的长度的厚度的减小)。更优选地，所述厚度的最多减小300％(在1μm膜的长度上，厚度减小3μm)，甚至更优选地至多200％，甚至更优选地减小的范围为30～100％。
[0020] 所述膜层可由任何合适于侧流膜的微孔材料制成。所述材料在本领域是公知的，其包括硝化纤维素(nitrocellulose)、尼龙、醋酸纤维素、玻璃纤维、交联葡聚糖和其它多孔聚合物。优选地，所述膜层为硝化纤维素层。用于测流测定的
硝酸纤维素膜层在本领域是公知的且由互相连接的硝化纤维素组成。
[0021] 所述支撑层是液体不可渗透的支撑层。所述支撑层在本领域是公知的且通常被称为“背衬”(backing)。合适的支撑层包括聚合物材料，如聚酯、聚丙烯、聚乙烯、
丙烯酸聚合物/共聚物、乙烯基丙烯聚合物、聚
碳酸酯和杂多糖。
[0022] 优选地，本发明的所述膜装置用于侧流免疫测定。在侧流免疫测定中，能够与所述测试液中的待检测的所述配体或分析物结合的被固定在所述微孔膜层中，所述测试液流过所述微孔膜层。因此，本发明的所述膜装置包括固定在所述至少一个检测区的结合剂。结合剂在本领域是公知的且包括例如抗体和适体。
[0023] 根据本发明的优选实施例，所述结合剂为直接针对用于妊娠测试中的hCG的抗体。
[0024] 通常，在侧流免疫测定中，此类结合剂以至少一条测试线或点且经常为一条控制线或点的形式被固定，所述控制线或点通过喷涂技术如喷墨印刷或其它气溶胶喷涂技术应用在所述膜层上。然后，所述膜层包括其中固定有结合剂的至少一个检测区。每个检测区可包括具有固定化结合剂的至少一条线或一个点。因此，在本发明的所述膜装置中，所述结合剂被固定在所述膜层中的至少一个具有规定厚度的检测区。
[0025] 为了使在所述检测区形成的所述配体和所述结合剂之间的络合物可见，通常使用如免疫标记物的可检测标记物。非常普遍的是，被分析的液体首先流过所谓的结合垫(conjugate pad)，然后流过所述侧流膜。所述结合垫包括包含可检测标记物和检测剂的可移动缀合物，所述检测剂即为可与所述配体结合的
试剂且与所述结合剂相同或不同。如果被分析的所述液体流过所述结合垫，所述缀合物与所述配体结合且所述配体/缀合物的络合物随所述液体流过所述膜层。在所述膜层上，所述配体-缀合物的络合物与固定化的结合剂结合。作为所述侧流膜上游的结合垫替代方案，所述侧流膜可包括至少一个结合区，该结合区包括含有可检测标记物和检测剂的可移动缀合物。此类结合区优选地位于所述检测区的上游。如果所述膜层包括至少一个结合区，优选地的是所述膜层在所述至少一个结合区中的厚度与在所述至少一个检测区的厚度相同。可用在该方面的合适的可检测标记物没有特别限制且为本领域公知。它们包括例如
荧光染料和金纳米颗粒。
[0026] 为了使所述配体与所述检测区中的结合剂以及(如果存在)在结合区中的检测剂的结合增强，优选地在所述检测区和所述结合区中被分析的所述液体的流速相对较低。因此，所述膜层具有所述至少一个检测区的厚度即厚度范围为100～150μm的所述检测和/结合区中的所述膜装置的宽度优选地大于所述膜层具有所述至少一个非检测区的较大厚度的区域中的所述膜装置的宽度。更优选地，具有所述至少一个检测区的厚度的检测和/或结合区中的所述膜装置的宽度是这样的，这些区域中的流速等于或低于这些区域外的流速，优选地低于。优选地，这些区域中的流速为该区域外的流速的25～100％，更优选地为50～95％。因此，具有所述检测/结合区中的所述膜层的厚度和所述膜装置的宽度的乘积优选地不小于具有所述检测/结合区外的厚度的区域中的此乘积。
[0027] 本发明还涉及一种侧流免疫测定装置，其包括本发明的所述膜装置。侧流免疫测定装置为本领域公知且例如在US2006/0205059、US5,252,496和US5,591,645中有描述。所述膜装置可用于本领域已知的任何合适的侧流免疫测定装置中。
[0028] 通常，所述侧流免疫测定装置包括反应区、位于所述反应区上游的样品添加区和位于所述反应下游的吸收区，所述反应区包括具有支撑在液体不可渗透的支撑层上的具有固定化结合剂的测流膜。此处提及的上游或下游是指相对所述侧向液体流动的方向而言。测试液体被加入到所述样品添加区，所述样品添加区通常包括吸收液体的过滤垫。在毛细管力的作用下，所述液体从所述样品添加区流过所述反应区到达所述吸收区。所述装置在所述样品添加区和所述反应区之间包含所谓的结合区，所述结合区包括可移动的免疫标记物或其它可检测的标记物，所述可移动的免疫标记物或其它可检测标记物与检测剂结合，所述检测剂与所述测试液体中的被检测配体结合，因而所述测试液体被驱使流过所述结合区。所述标记的检测剂随后与所述测试液中的所述配体结合且标记的配体流过所述测试区并与所述反应区中的固定化结合剂结合，在所述反应区它们被
可视化。可替代地，所述膜层包括如上所述的至少一个结合区。
[0029] 优选地，本发明的所述侧流免疫测定装置为包括微孔膜层的侧流免疫装置，所述微孔膜层包括结合剂，所述结合剂通过喷墨印刷或其他喷涂技术被施加在所述检测区。
[0030] 本发明的所述膜装置优选地由以下步骤制造，首先提供一个液体不可渗透的支撑层，然后将溶于适当
溶剂的组成膜层的材料的溶液施加在所述支撑层上。接着，所述溶剂被
蒸发，从而获得支撑在所述支撑层上的膜层的膜装置。，通过提供具有细长突出物的液体不可渗透的支撑层获得所述检测区和非检测区(及可选地在结合区和非结合区)中在其宽度方向上具有不同的厚度的微孔膜层，所述细长突出物的高度与获得的所述膜层中的所述检测区和所述非检测区(及可选地所述结合区和非结合区)之间的厚度差类似。在优选的实施例中，通过将支撑层材料条与不具有突出物的液体不可渗透的支撑层粘附可获得所述突出物，其中，所述材料条的厚度对应于所述检测区和所述非检测区之间的厚度差。可替代地，通过激光蚀刻所述液体不可渗透的支撑层获得所述突出物，所述液体不可渗透的支撑层的厚度对应于所述检测区中的所述支撑层的厚度。在另一实施例中，本发明的所述膜装置的制造方法还包括步骤：通过喷墨印刷或气溶胶喷涂的方式将所述结合剂施加到所述检测区。
[0031] 实际上，所述支撑层充当待获得的所述膜层的模具。通过将所述膜材料用作液体溶液来施加，得到具有恒定高度的膜装置，即膜层加支撑层。适用于侧流免疫测定装置的本发明的细长膜装置可从如此获得的所述支撑层和膜层的装置中切割。
[0032] 另外，本发明提供了在免疫妊娠测试中使用上述测流膜装置的用途，因而可进行具有改进的检测灵敏度和信号强度的妊娠测试。在该方面，所述结合剂优选地为直接针对hCG的抗体。
[0033] 图1a-1c图示了本发明的侧流膜装置1的实施例的纵截面。本发明的侧流膜装置1包括微孔膜层2和支撑层3。支撑层3在其整个宽度上具有突出物4，所述突出物4具有不同的形状(a，b，c)。膜层2包括检测区5和非检测区，所述检测区5包括结合剂，所述结合剂固定在承载有结合剂6的区域中。每个检测区5包括承载有结合剂6的区域。膜层2在检测区5具有厚度7和在所述检测区外(在所述非检测区)具有厚度8。在每个检测区5的上游，膜层2的厚度从厚度8减小为厚度7。所述膜装置1具有厚度9，所述厚度9在所述膜装置1的整个长度方向上为恒定的。此处提及的上游是以所述侧向流动方向为参照。箭头'a'指示了所述流动方向。
[0034] 本发明通过下列实施例进一步说明，但并不限于此。
[0035] 实施例
[0036] 实施例1：制备侧流膜装置
[0037] 液体不可渗透的支撑层使用了厚度为100μm且尺寸为30×50cm的聚酯
薄膜(Melinex400,透明的，一个表面进行了光滑处理，由德国公司Pütz GmbH+Co.Folien KG,Taunusstein制造)。在所述聚酯薄膜上，厚度约为50μm的聚酯薄膜(Melinex400，透明的，一个表面进行了光滑处理，由德国公司Pütz GmbH+Co.Folien KG,Taunusstein制造)的宽度为0.5cm的长条粘附在2.5cm(从一个长条的宽度方向的中心到下一个长条的宽度方向的中心进行测量得到)的距离处，因而100μm的液体不可渗透支撑层和5μm的长条的经过光滑处理的表面均朝上。对于粘合所述长条的
粘合剂(厚度约为35μm)，采用了由美国公司3M,St.Paul,MN制造的Scotch Weld 49(基于丙烯酸酯的压敏粘着剂)。
[0038] 然后，硝化纤维素溶液(3～8wt％的硝化纤维素，其具有12％的硝化级(nitration grade)，35～45wt％的异丙醇，40～50wt％的乙酸甲酯和7～13wt％的
水)被施加在所述支撑层上，所述支撑层包括所述长条，在所述长条的方向上，所述长条具有小刮片(doctor blade)。所述溶液被施加在厚度1200μm处，然后干燥45分钟，从而获得侧流膜装置(所述侧流膜装置的整个厚度为约300μm)，所述侧流膜装置具有微孔膜，所述微孔膜具有200μm的所述非检测区的厚度和115μm的所述检测区的厚度。获得的侧流膜装置最终被切割成0.5cm宽的长条。
[0039] 实施例2：侧流测定
[0040]
修改实施例1中制备的膜以进行侧流测试。样品垫被固定在底端(Ahlstrom，6615级)。吸收垫固定在顶端(Ahlstrom，222级)。
[0041] 将100pH值为8.0的100mM的三(羟甲基)
氨基甲烷缓冲液中的约10μl的抗β-hCG金缀合抗体(gold conjugated antibody)溶液，OD 10(抗体：a)标准金FSHWHO 92/510-NIBSC，BBI国际，Nr.hCG WHO 75/589；或替代方案b)单克隆抗β-hCG CGC克隆1，Arista Biologicals公司Nr.CGBCG-0701)邻近所述预滤器喷涂在被测试长条的底端。将包含所述
抗原特异性抗体的捕获抗体的测试线沿水平线在从所述膜长条的底部起算的长度的约一半的距离处分注(pipetted)。将包括用于其它抗体的非特异性结合的抗体的控制线分注到所述测试线的上游。测试线和控制线的分注可通过自动分配系统或手动进行。
[0042] 所述测试线的抗体被制备为pH值为8.0的含有5mM
硼砂和150mM
氯化钠的缓冲液中的0.5mg/ml的抗α-hCG单克隆山羊抗α-hCG(Arista Biologicals公司，Nr.ABACG-0500)溶液。所述控制线的抗体包括pH值为8.0的含有5mM硼砂和150mM氯化钠的缓冲液中的1.25mg/ml的来自山羊(Alchemy Laboratories公司，Nr.143)的抗小鼠IgG。
[0043] 然后，用液体探针培养负载所述抗体的所述膜，以确定所述抗原(在特殊的情况下，人类绒毛膜促性腺
激素)是否存在。通过将负载有其样品垫的上述膜长条放入所述液体探针的小液滴中并将其在垂直
位置上保持在小液滴中直到所述液体边界线到达所述吸收垫，从而进行培养。如果所述测试线和所述控制线为红色(图3，顶部)，那么所述液体探针包括所述抗原。如果只有控制线变彩色，所述液体探针不包括所述抗原。如果所述控制线没有照亮，那么所述测试不通过。通过肉眼或优选地通过公众可获得的侧流读取器(Skannex AS)可检查所述
颜色的强度。
[0044] 实施例3：结构化的膜
[0045] 已经根据实施例2的方法培养了包括膜(控制，结构化膜)的两个测试条。
[0046] 已经根据实施例1制备了所述结构化的膜。
[0047] 所述控制(非结构化)膜由100μm厚的支撑层、具有160μm厚的硝化纤维素膜层的聚酯薄膜(Melinex400，透明的，一个表面进行光滑处理，由德国公司Pütz GmbH+Co.Folien KG,Taunusstein制造)组成，所述硝化纤维素膜层的形成与实施例1的方式相同。
[0048] 所述金标记抗体的浓度为50mlU(图3)或25mlU(图4)。0.5mg的所述测试线抗体被施加在所述控制膜(具有恒定厚度的连续硝化纤维素)和所述结构化的膜上。
[0049] 图3和图4的图表描绘了以依赖时间的方式进行的几个独立实验的结果。
[0050] 时间中的左栏的每个点总是表示所述控制膜，而右栏显示了所述结构化的膜的结果。在所有情况下，来自所述结构化的膜途径的信号强度输出高于来自所述控制膜的信号强度。对于缩短培育的时间尤其如此(图2和图3；5分钟)。
[0051] 从这些结果得出的结论是，对于一组给定的抗原和抗体，结构化的膜显示出更好的信号强度。更好的信号强度有不同的影响，如降低
假阳性的
风险，假阳性可能成为病人的负担，如当寻找
疾病(癌症)或在妊娠试验时。
[0052] 另外可缩短培育的时间。可以在较低的浓度下检测抗原，从而使生理参数或疾病的标记物可更早的被检测出。
[0053] 为了获得相同的效果，还可能使用较少的抗体就能获得通过花费巨大价值而获得的效果相同，所述巨大价值因昂贵材料产生。
[0054] 下面为本发明中使用的参考标号：
[0055] (1)侧流膜装置
[0056] (2)微孔膜层
[0057] (3)液体不可渗透的支撑层
[0058] (4)所述液体不可渗透的支撑层的突出物
[0059] (5)检测区
[0060] (6)负载结合剂的区
[0061] (7)检测区的厚度
[0063] (9)所述侧流膜装置的厚度
