奶牛早孕因子蛋白、表达载体及其在奶牛早孕判断中的应
用
技术领域
[0001] 本
发明涉及奶牛早孕判断技术领域，尤其涉及一种
奶牛早孕因子蛋白、表达载体及其在奶牛早孕判断中的应用。
背景技术
[0002] 玫瑰花环抑制试验是检测奶牛早孕的主要方法，该方法一般需要制备抗淋巴细胞
白蛋白(ALS)，方法繁琐，灵敏度差。
发明内容
[0003] 有鉴于此，本发明
实施例提供一种奶牛早孕因子蛋白、表达载体及其在奶牛早孕判断中的应用，主要目的是对奶牛进行早期或超早期妊娠初步诊断。
[0004] 为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：
[0005] 一方面，本发明实施例提供了一种奶牛早孕因子蛋白，具有以下序列：
[0006] ATGGCAGGACAGGCATTTAGAAAGTTTCTTCCCCTCTTTGACCGAGTATTAGTTGAAAGAAGTGCGGCCGAAACTGTAACCAAAGGAGGGATTATGCTTCCAGAAAAATCACAAGGAAAAGTATTGCAAGCAACGGTGGTAGCTGTTGGATCAGGCTCTAAAGGAAAGGGTGGAGAGATTCAACCAGTTAGTGTGAAAGTTGGAGATAAAGTTCTTCTCCCAGAATATGGAGGCACCAAAGTAGTTCTAGACGACAAGGATTATTTCTTATTTAGAGATGGTGACATTCTTGGGAAATATGTCGACTGA。
[0007] 另一方面，本发明实施例提供了一种奶牛早孕因子基因
片段的表达载体，该表达载体克隆有上述的奶牛早孕因子蛋白。
[0008] 作为优选，所述表达载体通过如下步骤获得：
[0009] 根据GenBank公布的牛cpn10核苷酸序列NM_174346.2，设计1对引物，引物序列为：
[0010] 上游引物EPF-F：5′-TATGGATCCATGGCAGGACAGGCATTTAG-3′；
[0011] 下游引物EPF-R：5′-TATCTCGAGTCAGTCGACATATTTCCCAAG-3′；下划线部分为BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，扩增目的基因EPF长度为309bp；
[0012] 构建奶牛早孕因子重组蛋白原核表达载体pET32a-EPF，转化至大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达，建立十二烷基
硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶
电泳切胶纯化回收重组蛋白的方法，获得电泳纯级早孕因子重组蛋白。
[0013] 再一方面，本发明实施例提供了一种奶牛早孕因子基因片段的表达载体在奶牛早孕判断中的应用。
[0014] 作为优选，上述的应用中，以所述表达载体作为
抗原，制备单克隆
抗体，建立ELISA检测方法，对配种后奶牛的妊娠状况进行检测。
[0015] 作为优选，所述间接ELISA建立的具体步骤如下：用奶牛早孕因子重组蛋白包被96孔板，用封闭液封闭以避免包被孔上未结合
蛋白质的蛋白表位在后续试验中发生非特异性结合；将鼠抗血清加入包被孔，血清中的奶牛早孕因子蛋白单克隆抗体与包被的抗原形成复合物；洗去反应孔中没有结合的物质，加入可以与结合到孔内的鼠抗血清结合的酶标二抗；洗去反应孔中没有结合的底物溶液，加入TMB底物显色液，孔内溶液
颜色的深浅与检测样品中奶牛早孕因子蛋白单克隆抗体量直接相关，加终止液终止反应，用酶标仪测定并记录数据，优化上述各步骤的条件，建立间接ELISA方法。
[0016] 作为优选，抗原在4℃过夜条件下包被，包被浓度为20μg/mL，5％的
脱脂奶粉37℃封闭1h，鼠抗牛EPF抗血清的稀释倍数为1:1000，酶标二抗的稀释倍数为1:10000，底物显色15min，建立间接ELISA检测方法。
[0017] 与
现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0018] 本发明实施例的奶牛早孕因子蛋白、表达载体及其在奶牛早孕判断中的应用通过对提供的奶牛EPF基因片段进行原核表达，获得电泳纯级早孕因子重组蛋白，以该蛋白作为抗原，制备鼠抗牛单克隆抗体，通过优化检测条件，建立间接ELISA检测方法，对奶牛进行早期或超早期妊娠初步诊断，监测奶牛空怀或胚胎死亡后早孕因子活性
水平，是一种有效可行的方法，是
基层牛场值得推广的早孕诊断方法。
附图说明
[0019] 图1为本发明实施例的表达载体构建示意图。
[0020] 图2为重组质粒的双酶切鉴定结果。
具体实施方式
[0021] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
[0022] 以下实施例中所使用的技术，包括基因测序、PCR扩增和检测、载体构建等分子
生物学技术，除非特别说明，均可采用本领域技术人员已知的常规技术，所使用的仪器设备、
试剂、质粒和载体等，除非是特别注明，本领域技术人员均可以通过公共途径获得。
[0023] 实施例1
[0024] 奶牛早孕因子(EPF)蛋白，具有以下序列：
[0025] ATGGCAGGACAGGCATTTAGAAAGTTTCTTCCCCTCTTTGACCGAGTATTAGTTGAAAGAAGTGCGGCCGAAACTGTAACCAAAGGAGGGATTATGCTTCCAGAAAAATCACAAGGAAAAGTATTGCAAGCAACGGTGGTAGCTGTTGGATCAGGCTCTAAAGGAAAGGGTGGAGAGATTCAACCAGTTAGTGTGAAAGTTGGAGATAAAGTTCTTCTCCCAGAATATGGAGGCACCAAAGTAGTTCTAGACGACAAGGATTATTTCTTATTTAGAGATGGTGACATTCTTGGGAAATATGTCGACTGA。
[0026] 本实施例的奶牛早孕因子蛋白通过如下方法获得：从怀孕奶牛卵巢组织中提取总RNA，以其为模板，按照PrimeScript RT Reagent Kit
试剂盒说明书，以Oligo(dT)为引物，通过42℃2min除去基因组DNA，经过gDNA Eraser处理后进行15min的反转录反应合成cDNA，并以cDNA为模板；
[0027] 以上游引物EPF-F：5′-TATGGATCCATGGCAGGACAGGCATTTAG-3′和下游引物EPF-R5′-TATCTCGAGTCAGTCGACATATTTCCCAAG-3′进行PCR扩增。PCR反应体系20μL：cDNA模板
1μL，Mix(含dNTPs、10′PCR Buffer、Taq DNA酶)10μL，上、下游引物各0.5μL，ddH2O
8μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性40s，59℃
退火40s，72℃延伸5s，共35个循环；72℃延伸10min。用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收目的片段。
[0028] 实施例2
[0029] 奶牛早孕因子基因片段的表达载体，该表达载体克隆有实施例1的奶牛早孕因子蛋白。
[0030] 作为一种优选，参见图1，实施例2的表达载体可通过如下步骤获得：
[0031] 根据GenBank公布的牛cpn10核苷酸序列(NM_174346.2)，应用Primer Premier5.0
软件设计1对引物，引物序列为：
[0032] 上游引物EPF-F：5′-TATGGATCCATGGCAGGACAGGCATTTAG-3′；
[0033] 下游引物EPF-R：5′-TATCTCGAGTCAGTCGACATATTTCCCAAG-3′；
[0034] 其中，下划线部分为BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，扩增目的基因EPF长度为309bp。所用引物由上海生工
生物工程技术服务有限公司合成。
[0035] 构建奶牛早孕因子重组蛋白原核表达载体pET32a-EPF，转化至大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达，建立十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳切胶纯化回收重组蛋白的方法，获得电泳纯级早孕因子重组蛋白。并用Western blot对重组蛋白进行检测。最终成功表达并纯化了奶牛早孕因子重组蛋白。
[0036] 实施例3
[0037] 上述实施例中的表达载体在奶牛早孕判断中的应用。
[0038] 作为该实施例的优选，具体步骤如下：以实施例2的表达载体作为抗原，制备单克隆抗体，建立ELISA检测方法，对配种后奶牛的妊娠状况进行检测。本实施例中鼠抗牛早孕因子蛋白单克隆抗体由上海强耀生物科技有限公司根据提供电泳纯级的早孕因子重组蛋白制备。
[0039] 作为上述实施例的优选，间接ELISA法建立的具体步骤如下：用奶牛早孕因子重组蛋白包被96孔板，用封闭液封闭以避免包被孔上未结合蛋白质的蛋白表位在后续试验中发生非特异性结合；将鼠抗血清加入包被孔，血清中的奶牛早孕因子蛋白单克隆抗体与包被的抗原形成复合物；洗去反应孔中没有结合的物质，加入可以与结合到孔内的鼠抗血清结合的酶标二抗；洗去反应孔中没有结合的底物溶液，加入TMB底物显色液，孔内溶液颜色的深浅与检测样品中奶牛早孕因子蛋白单克隆抗体量直接相关，加终止液终止反应，用酶标仪测定并记录数据，优化上述各步骤的条件，建立间接ELISA方法。
[0040] 作为上述实施例的优选，间接ELISA法最佳反应条件如下：
[0041] 抗原在4℃过夜条件下包被，最佳包被浓度为20μg/mL，5％的脱脂奶粉37℃封闭1h，鼠抗牛EPF抗血清的最佳稀释倍数为1:1000，酶标二抗的最佳稀释倍数为1:10000，底物显色15min，建立间接ELISA检测方法。鼠抗牛EPF抗血清与人绒毛膜促性腺
激素、孕
酮均不发生交叉反应，早孕因子重组蛋白的最低检出限为320ng/ml，妊娠奶牛血清样本的敏感性为91％(n＝100)，批内和批间重复性试验变异系数均低于10％。
[0042] 重组原核表达质粒pET32a-EPF的构建及鉴定：
[0043] 用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ对重组质粒进行双酶切，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物，在2700bp和309bp处各有一条清晰的条带，见图2，图2为重组质粒的双酶切鉴定结果，M.DL 600DNA相对分子
质量标准。测序显示，牛早孕因子目的基因片段序列与GenBank公布的牛cpn10核苷酸序列(NM_174346.2)完全一致，未发生突变。与预期结果相符。
[0044] 间接ELISA特异性实验结果：
[0045] 根据已建立的间接ELISA方法包被未经配种的奶牛血清作为阴性对照，包被怀孕奶牛血清作为阳性对照，同时包被HCG、孕酮进行检测，测定OD450nm值发现，孕牛血清的OD450nm值大于0.087，检测结果显阳性，HCG、孕酮、未经配种的奶牛血清的OD450nm值都小于0.087，检测结果均显阴性，说明本实验所制备的单克隆抗体不与其他妊娠诊断相关激素发生交叉反应，具有很好的特异性，结果如表1。
[0046] 表1 ELISA特异性试验结果
[0047]检测样品 HCG 孕酮 阳性对照 阴性对照
OD450nm 0.067 0.065 0.13 0.071
[0048] EPF检出符合率结果
[0049] 应用间接ELISA方法对233份样品进行检测，每份样品重复检测3次，测定OD450nm值。将检测结果与奶牛配种后60天直肠检测定胎结果进行比较，经计算，间接ELISA法检出符合率为90.56％，结果见表2。
[0050] 表2 间接ELISA检测方法和奶牛直肠检测的比较结果
[0051]项目 间接ELISA 爱德士牛怀孕检测试剂盒
阳性数 109 128
阴性数 102 105
检出总数 211 233
[0052] 妊娠与空怀奶牛血清中EPF活性的比较结果
[0053] 应用间接ELISA检测妊娠奶牛及空怀奶牛血清样本，测量OD450nm值，结果显示，妊娠奶牛血清中EPF活性高于空怀奶牛，经SPSS软件分析，妊娠奶牛比空怀奶牛血清中EPF活性高，且差异极显著(P<0.01)，结果见表3。
[0054] 表3 妊娠与空怀奶牛血清中EPF活性的比较
[0055]奶牛数量 妊娠情况 OD450nm
99 妊娠 0.139±0.007A
92 空怀 0.063±0.002B
[0056] 注1：同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)
[0057] 不同年龄妊娠奶牛血清中EPF活性比较结果
[0058] 应用上述实施例的间接ELISA检测2～3岁、4～5岁和6～7岁妊娠奶牛血清样本，计算OD450nm值，经SPSS软件分析，2～3岁妊娠奶牛血清中EPF活性比4～5岁妊娠奶牛高，且差异极显著(P<0.01)，2～3岁妊娠奶牛与6～7岁妊娠奶牛血清中EPF活性差异不显著，结果见表4。
[0059] 表4 不同年龄妊娠奶牛血清中EPF活性比较
[0060]
[0061] 注2：同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)
[0062] 不同胎次妊娠奶牛血清中EPF活性的比较结果
[0063] 应用间接ELISA检测不同胎次奶牛血清样本，计算OD450nm值，经SPSS软件分析，不同胎次奶牛血清中EPF活性差异均不显著，结果见表5。
[0064] 表5 不同胎次奶牛血清中EPF活性比较
[0065]
[0066] 注3：同列相同大写字母表示差异不显著(P>0.05)
[0067] 同玫瑰花环抑制试验相比，本发明实施例的ELISA法检测早孕因子蛋白的实验操作简单、需要配制的试剂较少、容易获得且价格低廉，可以用酶标仪客观判断结果，具有敏感性高、特异性强的优点，能进行超早孕检测、监测
家畜早期胚胎丢失、预测流产、鉴定胚胎移植效果，是一种有效可行的方法。
[0068] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉
本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述
权利要求的保护范围为准。
