技术领域
[0001] 本
发明涉及一种通过血清生物标志蛋白检测生物镉中毒的方法，属于生物体镉中毒的生物标志物检测领域。
[0002] 背景知识
[0003] 近年来，随着我国采矿、
冶炼、陶瓷、电
镀、及
电子工业的迅猛发展，使镉、砷、汞等有害重金属通过
废水、废气、废渣大量排放到自然界中，对耕地等
土壤环境造成污染，同时也通过地表进入
水体，流入海洋，导致了水体的严重污染。2014年4月我国公布最新的
土壤污染调查
公报显示，约16％的土壤遭受污染，其中重金属镉的污染约占7％，在过去的20年内增加了一倍，且有继续增加的趋势。这些镉在生物体内不易分解排放，蓄积在生物体内损伤
机体并且中毒后难以发现，严重的威胁到人类的健康问题。因此，重金属镉的污染已经引起了全社会的关注，也是国内外学者面临的重要研究命题之一。
[0004] 镉(Cd)的
原子量为112.41，处于周期表ⅡB副族。镉溶于酸但不溶于
碱，有Cd2+和Cd1+两种
氧化态。镉对动
植物的危害较大，被镉污染的空气对人体危害严重。在上个世纪五十年代，日本富山县出现的“痛痛病”事件就是由于当地的冶炼厂排放的镉物质污染了水体和土壤，通过食物进入人体，使镉在体内蓄积而中毒致病的，患者出现了腰、背、手、脚等关节刺痛，骨骼
变形易骨折的现象。根据美国国立卫生研究院(NIH)有毒物质
数据库(HSDB)公布的信息可知，体内的镉大部分集中在肝脏及肾脏中，在骨骼和肌肉中也有相当量积累。体内和体外实验表明镉可以导致
染色体损伤，还会影响基因的表达以及
信号传导，目前研究表明过量的镉可以增加
乳腺癌、
肺癌、
前列腺癌、睾丸癌和肾癌的发生几率。世界卫生组织(WHO)的国际癌症研究所(IRAC)把镉列为人类已知的致癌物，美国环保局把镉列为B1组人类致癌物。我国也是镉污染的重灾区，近年来不断的出现镉污染、镉中毒的事件，自2011年以来，中国多地市场发现大米镉含量超过国家规定的标准，引起了食品卫生部
门的高度重视，这些食物中的镉通过食物链进入牲畜，最终进入人体，危害人体健康。这也使得对镉的研究显得尤为重要。
[0005] 目前，世界各国也都十分重视重金属镉污染的检测和研究。现有检测镉的方法主要是通过化学反应以及紫外-可见光分光光度法、原子吸收
光谱法等测定生物体中组织或者器官中镉的含量，对于
哺乳动物主要是血液和尿液中镉的含量。但是镉在进入机体后经过血液进入肝脏，再进入肾脏，其会在器官中不断的迁移，所以在不同的时期、不同的器官中镉的含量都不稳定；在检测过程中还容易被外界环境污染，误差较大。另外，尿液中的β2-微球蛋白、尿α1-微球蛋白也是现有的检测镉中毒的一些指标，但是这些蛋白的变化都出现在肾脏受到损伤之后。因此这些传统的方法存在着操作麻烦费时、检出灵敏度低、特异性差和
稳定性差的缺点，且不能及时的反应出生物体在镉诱导下生理、生化反应及代谢等方面的变化。本发明就是基于重金属镉对小鼠产生毒害的情况下，引起小鼠相关基因的变化而建立起来的一种快速、灵敏的人体镉中毒的有效检测方法，为镉中毒的防治提供了科学有效的检测依据。
[0006] 本发明通过二维
电泳这种非偏好型的筛选差异蛋白的方法，在小鼠血清中发现了一组镉诱导表达变化的蛋白，经质谱鉴定得到8个蛋白，包括4个下调蛋白载脂蛋白A-Ⅳ(Apolipoprotein A-IV，妊娠带蛋白(Pregnancy zone protein)，载脂蛋白A-Ⅰ前体(Apolipoprotein A-I precursor)，视黄醇结合蛋白(Retinol-binding protein)和4个上调蛋白
淀粉体P成分前体(amyloid P-component precursor)，载脂蛋白E(Apolipoprotein E)，载脂蛋白C-Ⅲ前体(Apolipoprotein C-III precursor)，载脂蛋白A-Ⅱ(Apolipoprotein A-II)。这组蛋白的变化或者其中某些蛋白的变化可以反应体内镉的情况，被认为可以作为检测机体内镉的生物标志物。这类标志物能实际的反映生物体在镉胁迫下其生理、生化反应及代谢等方面的变化，这种变化常早于重金属在生物体积累产生的毒害作用，且样品容易获取，能起到提前防治的作用。另外，利用血清中表达差异的蛋白作为重金属镉检测指标的研究还比较少。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于克服传统检测手段中存在的缺点和不足，提供一种快速、灵敏、高效的生物体重金属镉的分子生物学检测方法。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用的技术法案如下：
[0009] (1)建立一个用来研究镉蓄积的毒性模型：
[0010] 将不同浓度的镉加入小鼠食物，根据小鼠的存活率确定致死剂量；然后在远低于致死剂量的前提下，选取一个安全的镉剂量作为研究对象。
[0011] (2)利用步骤(1)得到的毒性模型检测重金属镉中毒的生物学方法，具体步骤如下：
[0012] A.通过二维电泳筛选小鼠血清中表达差异蛋白：
[0013] A-1.小鼠血清和肝脏组织的的获取：通过眼球取血的方法获取试验小鼠的
全血，静置离心得到小鼠血清；然后解剖小鼠，获取肝脏组织。
[0014] A-2.血清蛋白中差异蛋白的筛选：去除血清
白蛋白，测定蛋白浓度后，通过二维电泳(2-DE)筛选出生物体内蓄积镉诱导的差异蛋白。
[0015] A-3.差异蛋白的鉴定：抠取二维电泳胶上的蛋白点，质谱鉴定差异蛋白。
[0016] B.筛选出的差异蛋白在小鼠肝脏mRNA水平相对表达量的测算：
[0017] 为了确保二维电泳筛选出的差异蛋白表达变化的结果的准确性，进一步从mRNA水平上验证这些蛋白的表达变化情况。由于镉通过血液首先进入肝脏，血液和肝脏中的变化很相似，且肝脏RNA容易提取，故选用小鼠肝脏验证差异蛋白在mRNA水平上的变化情况。
[0018] B-1.提取小鼠肝脏总RNA。
[0019] B-2.小鼠肝脏中差异蛋白基因表达量的测定：
[0020] 首先以小鼠肝脏总RNA为模板，通过RT-PCR合成cDNA第一链；然后以合成的cDNA为
模版，根据差异基因的cDNA序列设计特异性引物和内参引物，进行Real time-PCR反应，并得到每个基因的Ct值：最后根据PCR得到的Ct值，计算出筛选到的差异蛋白在小鼠肝脏中的相对表达量，利用下面公式计算：
[0021] 基因相对表达量＝2-ΔΔCt
[0022] ΔCt＝Ct(目的基因)-Ct(β-actin)
[0023] ΔΔCt＝(Ct(目的基因)-Ct(β-actin))实验组-(Ct(目的基因)-Ct(β-actin))对照组
[0024] 2-ΔΔCt计算的结果即为差异基因相对于对照组的变化量，称为相对表达量。β-actin是管家基因，在所有类型的细胞中都有表达，受环境因素影响很小，具有比较稳定的表达，因此常用来作为测定目标基因表达量的参照基因。本发明中2-ΔΔCt数值变化越大，表明在镉的作用下该基因表达量变化越大，待测样品中镉含量就越大。
[0025] 其中，步骤A-3通过二维电泳这种非偏好型的筛选差异蛋白的方法，在小鼠血清中发现了一组镉诱导表达变化的蛋白，经质谱鉴定得到8个蛋白，包括4个下调蛋白：载脂蛋白A-Ⅳ(Apolipoprotein A-IV)，妊娠带蛋白(Pregnancy zone protein)，载脂蛋白A-Ⅰ前体(Apolipoprotein A-I precursor)，视黄醇结合蛋白(Retinol-binding protein)；4个上调蛋白：淀粉体P成分前体(amyloid P-component precursor)，载脂蛋白E(Apolipoprotein E)，载脂蛋白C-Ⅲ前体(Apolipoprotein C-III precursor)，载脂蛋白A-Ⅱ(Apolipoprotein A-II)。这组蛋白的变化或者其中某些蛋白的变化可以反应体内镉的情况，被认为可以作为检测机体内镉的生物标志物。这类标志物能实际的反映生物体在镉胁迫下其生理、生化反应及代谢等方面的变化，这种变化常早于重金属在生物体积累产生的毒害作用，且样品容易获取，能起到提前防治的作用。
[0026] 步骤B-2中所述根据差异蛋白的cDNA序列，设计出符合Real time-PCR反应特点的特异性引物如下所示：(总RNA反转录得到的cDNA包含差异蛋白的cDNA序列，通过设计特异的差异蛋白基因的引物可以从总cDNA中扩增得到差异蛋白基因序列)。
[0027]
[0028] 本发明和已有的技术相比，具有以下优势：
[0029] (1)与传统的检测生物体内重金属蓄积量分析相比，本发明检测的是生物体内实际生理变化，是个体免疫应激产生的相关指标的变化，这种变化常早于重金属在生物体积累产生的毒害作用，能起到提前
预防的作用。
[0030] (2)本发明以小鼠血清中一些差异基因的相对表达量作为检测指标，实验表明这些基因对镉非常敏感，在镉的胁迫下会先发生变化，经过多次重复实验，表明这些基因表达变化情况稳定、显著，技术手段先进、灵敏度高的特点。
[0031] (3)本发明在二维电泳筛选结果的
基础上结合Real time-PCR技术，在蛋白水平和RNA水平上对基因的表达进行检测，大大提高了检测的可靠性和灵敏度。并且在Real time-PCR中，采用的是全封闭的反应体系，有效避免了其他因素造成的试验误差，保证了结果的可靠性和重复性。
附图说明
[0032] 图1小鼠镉中毒模型的致死曲线。
[0033] 图2差异蛋白基因在小鼠肝脏中相对表达变化情况。图中：1为对照组2为100ppm镉处理组。
具体实施方式
[0034] 结合下列实例进一步说明本发明的实施方案，但不应该当作本发明的限制。
[0035]
实施例1：食物中镉离子(Cd2+)对小鼠血清蛋白变化的筛选
[0036] 1.小鼠镉中毒模型实验
[0037] 本实验通过Cd2+胁迫小鼠的毒性试验，得到重金属镉对小鼠的致死剂量(10000ppm)，从而选取一个安全剂量(100ppm)作为Cd2+胁迫小鼠基因表达实验的离子浓度参数。
[0038] 小鼠选取形态指标没有显著差异的成熟个体，在小鼠食物中加入浓度为10000ppm的镉离子溶液，其终浓度为达到毒性实验中选取的镉离子安全剂量100ppm；每天添食一次，同时设置空白对照组，每组喂养小鼠5只；一周后，对每组的小鼠取眼球
放血，然后解剖后获取小鼠肝脏，于液氮中冷冻备用。
[0039] 2.血清蛋白的获取、纯化和二维电泳的筛选
[0040] 将取到的小鼠血液4℃静置12-14h，12000rpm，4℃离心15-20分钟，
抽取上清，通过QIAGEN公司的Albumin Depletion Kit去除血清白蛋白，用BCA法测定蛋白含量，取一部分进行二维电泳分离筛选差异蛋白，剩余部分分装之后于-80℃保存备用。
[0041] 3.差异蛋白点的鉴定
[0042] 将二维电泳筛选出来的蛋白点抠出，经过50％的乙腈脱色和100％的乙腈脱水之后，加
[0043]
[0044] 入15μL浓度为0.1μg/μL的胰酶，37℃过夜消化。消化好的蛋白通过MALDI-TOF-MS鉴定分析，可以得到二维电泳筛选出的差异蛋白的具体信息，结果如下表所示。
[0045] 实施例2：对二维电泳筛选出的差异蛋白基因进行Real time PCR测定[0046] 1.小鼠肝脏总RNA的提取和纯化(总RNA反转录得到的cDNA包含差异蛋白的cDNA序列，通过设计特异的差异蛋白基因的引物可以从总cDNA中扩增得到差异蛋白基因序列)[0047] (1)取50-100mg小鼠肝脏组织，加入1mL 4℃预冷的Trizol，
冰上充分
研磨使细胞裂解装入EP管中，震荡2min，室温放置3-5min。
[0048] (2)加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min，然后12000rpm，4℃离心10min。
[0049] (3)吸取上清至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置10min，然后12000rpm，4℃离心10min，弃上清。
[0050] (4)加入1mL的75％的
乙醇洗涤沉淀，12000rpm，4℃离心10min，重复2-3次。
[0051] (5)弃上清，室温干燥5-10min，加入30-50μL的RNase-free水，充分溶解RNA。
[0052] 2.Real time-PCR验证差异蛋白基因表达情况
[0053] (1)引物设计：根据差异蛋白的cDNA序列，设计出符合Real time-PCR反应特点的特异性引物。
[0054]
[0055] 以及作为内参基因的小鼠β-actin基因特异性引物：
[0056] β-actin-F 5’CGTTGACATCCGTAAAGACC 3’
[0057] β-actin-R 5’AACAGTCCGCCTAGAAGCAC 3’
[0058] (2)cDNA的合成
[0059] Ⅰ.将1中提取的RNA用DNase消化残留的DNA；
[0060]
[0061] 37℃反应30min，加入1μL的DNA酶反应终止液，65℃，10min，灭活DNA酶。
[0062] Ⅱ.反转录
[0063] 取消化好的RNA 2μg，加入：
[0064] Oligo dT 1μL
[0065] 随机引物 1μL
[0066] DEPC水 加至12μL
[0067] 混合物在65℃加热5min，迅速置于冰上，短暂离心后加入以下组分：
[0068]
[0069] 轻轻混匀后，37℃孵育2min，然后加入1μL的M-MLV逆转录酶，37℃孵育50min，然后在70℃加热15min以终止反应。
[0070] Ⅲ.Real time-PCR检测
[0071] Real time-PCR反应
试剂盒采用杭州博日公司的SYBR Green进行Real time-PCR扩增反应，获得各管的Ct值(
软件自动生成)。
[0072] Real time-PCR反应体系如下：
[0073]试剂 用量
2×SYBR Mix(
荧光PCR混合物) 10μL
Taq Polymerase(聚合酶) 0.12μL
Forward Primer(10μM)正向引物 0.5μL
Reverse Primer(10μM)反向引物 0.5μL
cDNA(100ng)模板 1μL
ddH2O灭菌水 7.98μL
Total Volume总体积 20μL
[0074] Real time-PCR反应程序如下：
[0075]
[0076] Dissociation(熔解曲线的制作)
[0077] (3)小鼠肝脏差异基因相对表达量的计算：根据PCR仪得到的Ct值(软件自动生成)，利用下面公式计算：
[0078] 基因相对表达量＝2-ΔΔCt
[0079] ΔCt＝Ct(目的基因)-Ct(β-actin)
[0080] ΔΔCt＝(Ct(目的基因)-Ct(β-actin))实验组-(Ct(目的基因)-Ct(β-actin))对照组使用2-ΔΔCt计算实验组模板中小鼠差异蛋白基因相对于对照组的表达倍数，取平均值，即为小鼠肝脏差异蛋白基因的相对表达量，其表达变化情况如图2所示：A:载脂蛋白A-Ⅳ(Apolipoprotein A-IV)，结果与对照组相比降低0.4倍；B:妊娠带蛋白(Pregnancy zone protein)，降低0.69倍；C:载脂蛋白A-Ⅰ前体(Apolipoprotein A-I precursor)，降低0.35倍；D:视黄醇结合蛋白(Retinol-binding protein)，降低0.64倍；E:淀粉体P成分前体(amyloid P-component precursor)，上升2.4倍；F:载脂蛋白E(Apolipoprotein E)，降低0.63倍；G:载脂蛋白C-Ⅲ前体(Apolipoprotein C-III precursor)，降低0.85倍；H:载脂蛋白A-Ⅱ(Apolipoprotein A-II)，降低0.82倍.β-actin作为内参基因。取3次重复的平均值，标准差用误差线来指示，星号表示在统计学上有显著的差异(p<0.05)。
[0081] 本发明中涉及的小鼠血清中差异蛋白基因定量表达技术，可以归属于第二代分子生物学检测新技术，操作简单易学，对设备的要求不高且成本较低；另外，这组差异蛋白存在于血清中，检测样品获取方便快捷；且对于重金属镉的敏感性较高，因而本发明具有检测方便快捷、灵敏的特点。这在镉污染对于生物体的危害检测、预防方面有着重要的社会意义。
