提高人婴儿之生长速度的方法
阅读：54发布：2020-06-26
专利汇可以提供提高人婴儿之生长速度的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于提高人婴儿之生长速度的方法，所述方法包括向所述婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶(recombinant human bile-salt-stimulated lipase，rhBSSL)。此类方法特别地用于重量不足或早产人婴儿、尤其是有提高其生长速度之医学需要的那些。在另一些方面，本发明涉及组合物，包括婴儿食物、 试剂 盒 、经 包装 药用产品和药用组合物，以及还涉及制备婴儿食物的方法，在每种情况中其可用于提高人婴儿的生长速度。在另一个方面中，本发明涉及用于以下的方法：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累；在每种情况中所述方法包括向所述婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的步骤。本发明还涉及组合物，包括婴儿食物、试剂盒、经包装药用产品和药物组合物，以及还涉及用于制备婴儿食物的方法，在每种情况中其可用于这些保护性或限制积累的方法。，下面是提高人婴儿之生长速度的方法专利的具体信息内容。
1.用于提高人婴儿之生长速度的方法，所述方法包括向所述婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的步骤。
2.权利要求1的方法，其中以每天1至100mg所述脂肪酶/Kg婴儿体重、5至50mg所述脂肪酶/Kg婴儿体重、15至40mg所述脂肪酶/Kg婴儿体重或约22.5至27mg所述脂肪酶/Kg婴儿体重的量施用所述脂肪酶。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述婴儿不喂食新鲜的母亲乳汁。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中将所述脂肪酶首先添加至之后喂食给所述婴儿的婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁，从而肠施用所述脂肪酶。
5.权利要求4的方法，其中将所述脂肪酶添加至婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁至终浓度为0.03至0.5g/L配方食品或乳汁。
6.权利要求4的方法，其中将所述脂肪酶添加至婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁至终浓度为0.05至0.3g/L配方食品或乳汁、0.1至0.2g/L配方食品或乳汁或者约0.15g/L配方食品或乳汁。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述人婴儿是体重不足人婴儿。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述人婴儿是早产人婴儿。
9.权利要求8的方法，其中所述早产人婴儿是妊娠约37周之前出生的早产人婴儿，或者是妊娠约37周至约32周、妊娠约32周至约25周或妊娠约25周至约22周出生的早产人婴儿。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食施用所述脂肪酶。
11.权利要求10的方法，其中所述脂肪酶随每天的大多数或全部喂食施用。
12.权利要求10或权利要求11的方法，其中所述脂肪酶施用至少约2周、至少约3周或至少约4周的时间。
13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述人婴儿之生长速度的提高是所述婴儿之体重增长速率的提高。
14.权利要求13的方法，其中所述人婴儿之体重增长的速率是约10至30g体重增加/Kg所述婴儿体重/天(g/Kg/天)、约15至25g/Kg/天或者约20g/Kg/天或约18g/Kg/天。
15.权利要求1至14中任一项的方法，其中所述生长速度的提高不伴随整体脂肪吸收系数的增加、由其所表明和/或与其相关联。
16.权利要求1至15中任一项的方法，其中所述脂肪酶包含具有包含SEQ ID.NO.1或由SEQ ID.NO.1所示之氨基酸序列的蛋白质。
17.权利要求1至16中任一项的方法，其中所述脂肪酶可由核酸表达，所述核酸包含SEQ ID.NO.2之151位至2316位的序列。
18.权利要求1至17中任一项的方法，其中所述脂肪酶分离自重组中国仓鼠卵巢细胞系的表达产物。
19.权利要求1至18中任一项的方法，其中所述脂肪酶还由选自以下的一种或更多种特性所定义：
a.所述脂肪酶不含其他乳蛋白质或乳组分，例如乳的酪蛋白和乳清蛋白例如乳铁蛋白，或者不含对乳来说为天然的其他杂质，尤其是其中此类乳源蛋白质或其他杂质来源于人、绵羊或小鼠的乳；
b.所述脂肪酶的纯度大于约70％，例如纯度大于约80％、90％或95％；
c.所述脂肪酶的糖基化水平低于BSSL-MAM的糖基化水平和/或高于rhBSSL-OVI的糖基化水平；
d.所述脂肪酶的糖基化模式与BSSL-MAM的糖基化模式不同和/或与rhBSSL-OVI的糖基化模式不同；
e.所述脂肪酶的分子量是90KDa至75KDa、约84至86KDa或约85KDa；和/或f.以下述形式存在的脂肪酶分子的量大于以由SEQ ID.NO.1所示序列代表的全长形式存在的脂肪酶分子的量的50％，例如约100％至500％、约200％至400％或约300％，所述形式即：与由SEQ ID.NO.1所示序列代表的全长形式相比在C末端短1或2个氨基酸。
20.权利要求1至19中任一项的方法，其中所述婴儿有提高生长速度之治疗性处理的医学需要，并且施用的所述脂肪酶的量是治疗有效量。
21.用于治疗遭受体重不足或早产之人婴儿的治疗性方法，所述方法包括向有医学需要的婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的步骤。
22.制备用于提高人婴儿之生长速度的改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁的方法，所述方法包括以下步骤：
i.提供第一量的重组人胆盐刺激脂肪酶和第二量的未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁；以及
ii.将一定量的所述脂肪酶添加至所述未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁中，从而形成改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，
从而形成改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其包含当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁时有效提高所述人婴儿生长速度之量的脂肪酶。
23.权利要求22的方法，其中所述脂肪酶以冻干制剂形式提供。
24.权利要求23的方法，其中在步骤(ii.)之前溶解所述冻干制剂，例如采用无菌水。
25.权利要求22至24中任一项的方法，其中以单位剂量提供所述脂肪酶，所述单位剂量包含1.5至75mg，5至45mg或者约10、15、20或25mg量的所述脂肪酶。
26.权利要求22的方法，其中在溶液中以1.5至150mg/mL、7.5至30mg/mL或约15mg/mL的浓度提供所述脂肪酶。
27.权利要求22至26中任一项的方法，其还包括在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁的步骤。
28.权利要求27的方法，其中对每天的大多数或所有喂食重复所述方法的步骤。
29.改良婴儿配方食品，其包含当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品时有效提高所述人婴儿生长速度之量的重组人胆盐刺激脂肪酶。
30.改良巴氏消毒乳汁，其包含当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向人婴儿喂食所述改良巴氏消毒乳汁时有效提高所述婴儿生长速度之量的重组人胆盐刺激脂肪酶。
31.用于制备用以提高人婴儿之生长速度的改良婴儿配方食品或改良乳汁的试剂盒，所述试剂盒包含以下组件：
a.至少一个第一容器，其包含第一量的重组人胆盐刺激脂肪酶，例如以冻干制剂的形式；和
b.至少一个第二容器，其区别于所述第一容器，所述第二容器包含第二量的未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁；
其中所述脂肪酶与所述未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁各自为足以分别制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁的量，所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁分别包含当向人婴儿喂食例如在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向所述人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁时有效提高所述人婴儿生长速度之量的所述脂肪酶。
32.权利要求31的试剂盒，其还包含使用说明，其中所述使用说明描述以下步骤：
i.制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，例如通过分别向未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁添加一定量的所述脂肪酶，从而形成改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁；以及
ii.在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约
7天中每天至少一次喂食向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁。
33.用于提高人婴儿之生长速度的方法，所述方法包括以下步骤：
i.制备或以其他形式提供权利要求29的改良婴儿配方食品或权利要求30的改良巴氏消毒乳汁，或者根据权利要求22至28中任一项的方法或通过使用权利要求31或32的试剂盒来制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁；
ii.向所述婴儿喂食如此制备或以其他形式提供的所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁；和
iii.在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食地重复前述步骤。
34.包含药物组合物的经包装药用产品，所述药物组合物包含一定量的重组人胆盐刺激脂肪酶，其中所述经包装药用产品还包含描述以下步骤的使用说明：
i.制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其含当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁时有效提高所述婴儿生长速度之量的所述脂肪酶；以及
ii.向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁来肠施用所述量的脂肪酶，例如在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约
7天中每天至少一次喂食。
35.权利要求34的经包装药用产品，其中所述婴儿遭受或所述使用说明描述所述婴儿应遭受体重不足或早产出生。
36.权利要求34或35的经包装药用产品，其中所述使用说明描述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁用于或有效用于或者在临床试验中显示/证明有效且安全地用于：(A)提高人婴儿的生长速度；和/或(B)：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
37.权利要求34至36中任一项的经包装药用产品，其还包含婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁。
38.权利要求34至37中任一项的经包装药用产品，其中所述脂肪酶为单位剂量，所述单位剂量包含1.5至75mg、5至45mg或者约10、15、20或25mg量的脂肪酶。
39.单位剂量形式的药物组合物，其包含0.1至100mg重组人胆盐刺激脂肪酶，例如
1.5至75mg所述脂肪酶、5至45mg所述脂肪酶或约20mg所述脂肪酶。
40.权利要求39的药物组合物，其中所述单位剂量是适于肠施用和/或适于对人婴儿施用的形式。
41.用于下述的方法，即用于：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累；在每种情况中，所述方法包括向所述婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的步骤。
42.权利要求41的方法，其中所述脂肪酶的施用保护小肠粘膜免受不完全消化的或过量的脂肪和/或脂质的有害作用。
43.权利要求41或权利要求42的方法，其中向所述婴儿喂食婴儿配方食品和/或不完全消化的或过量的脂肪和/或脂质来源于婴儿配方食品。
44.权利要求41或权利要求43的方法，其中所述婴儿喂食巴氏消毒乳汁和/或不完全消化的或过量的脂肪和/或脂质来源于巴氏消毒乳汁。
45.权利要求41至44中任一项的方法，其中所述脂肪酶的施用保护所述婴儿的空肠和/或回肠的粘膜免受损伤。
46.权利要求41至45中任一项的方法，其中所述脂肪酶的施用保护所述婴儿的绒毛上皮免受损伤。
47.权利要求41至46中任一项的方法，其中所述脂肪酶的施用保护所述婴儿的小肠粘膜免受粘膜和/或跨粘膜坏死和/或炎症。
48.权利要求41至47中任一项的方法，其中所述脂肪酶的施用保护所述婴儿免受坏死性小肠结肠炎和/或回肠穿孔，和/或预防或降低坏死性小肠结肠炎和/或回肠穿孔在所述婴儿中的可能性、严重性和/或发生率。
49.权利要求41至48中任一项的方法，其中通过肠管或胃管喂食所述婴儿。
50.权利要求41至49中任一项的方法，其中所述婴儿不喂食新鲜的母亲乳。
51.权利要求41至50中任一项的方法，其中首先将所述脂肪酶添加至婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁，之后向所述婴儿喂食，从而肠施用所述脂肪酶。
52.权利要求51的方法，其中将所述脂肪酶添加至婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁至终浓度为0.03至0.5g/L配方食品或乳。
53.权利要求51的方法，其中将所述脂肪酶添加至婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁至终浓度为0.05至0.3g/L配方食品或乳、0.1至0.2g/L配方食品或乳或者约0.15g/L配方食品或乳。
54.权利要求41至53中任一项的方法，其中所述人婴儿是体重不足人婴儿。
55.权利要求41至54中任一项的方法，其中所述人婴儿是早产人婴儿。
56.权利要求55的方法，其中所述早产人婴儿是在妊娠约37周之前出生的早产人婴儿，或者是妊娠约37周至约32周、妊娠约32周至约25周或妊娠约25周至约22周出生的早产人婴儿。
57.权利要求41至56中任一项的方法，其中通过在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食来施用所述脂肪酶。
58.权利要求57的方法，其中随每天的大多数或全部喂食施用所述脂肪酶。
59.权利要求57或权利要求58的方法，其中在至少约2周、至少约3周或至少约4周的时间中来施用所述脂肪酶。
60.权利要求41至59中任一项的方法，其中所述保护性和/或限制积累作用伴随了人婴儿生长速度的提高，例如所述婴儿体重增长之速率的提高。
61.权利要求60的方法，其中人婴儿体重增长的速率是约10至30g体重增加/Kg所述婴儿体重/天(g/Kg/天)、约15至25g/Kg/天或者约20g/Kg/天或约18g/Kg/天。
62.权利要求60或61的方法，其中所述生长速度的提高不伴随整体脂肪吸收系数的增加、由其表明和/或与其相关联。
63.权利要求41至62中任一项的方法，其中所述脂肪酶包含具有包含SEQ ID.NO.1或由SEQ ID.NO.1所示之氨基酸序列的蛋白质。
64.权利要求41至63中任一项的方法，其中所述脂肪酶可由核酸表达，所述核酸包含SEQ ID.NO.2之151位至2316位的序列。
65.权利要求41至64中任一项的方法，其中所述脂肪酶分离自重组中国仓鼠卵巢细胞系的表达产物。
66.权利要求41至65中任一项的方法，其中所述脂肪酶还由选自以下的一种或更多种特性所定义：
a.所述脂肪酶不含其他乳蛋白质或乳组分，例如乳的酪蛋白和乳清蛋白例如乳铁蛋白，或者不含对乳来说是天然的其他杂质，尤其是其中此类乳源蛋白质或其他杂质来源于人、绵羊或小鼠的乳；
b.所述脂肪酶的纯度大于约70％，例如纯度大于约80％、90％或95％；
c.所述脂肪酶的糖基化水平低于BSSL-MAM的糖基化水平和/或高于rhBSSL-OVI的糖基化水平；
d.所述脂肪酶的糖基化模式与BSSL-MAM的糖基化模式不同和/或与rhBSSL-OVI的糖基化模式不同；
e.所述脂肪酶的分子量是90KDa至75KDa、约84至86KDa或约85KDa；和/或f.以下述形式存在的脂肪酶分子的量大于以由SEQ ID.NO.1所示序列代表的全长形式存在的脂肪酶分子的量的50％，例如约100％至500％、约200％至400％或约300％，所述形式即：与由SEQ ID.NO.1所示序列代表的全长形式相比在C末端短1或2个氨基酸。
67.权利要求41至66中任一项的方法，其中所述婴儿具有治疗性处理的医学需要，以用于：(X)保护小肠粘膜免受损伤；(Y)保护未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在回肠中的积累；在每种情况中其中施用的所述脂肪酶的量是治疗有效量。
68.治疗性方法，其用于：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累；在每种情况中所述方法包括向有医学需要的婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的步骤。
69.制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁的方法，所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁用于：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累，在每种情况中所述方法包括以下步骤：
i.提供第一量的重组人胆盐刺激脂肪酶和第二量的未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁；以及
ii.将一定量的所述脂肪酶添加至所述未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁中从而形成改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，
从而分别形成改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其包含有效用于以下之量的脂肪酶：在每种情况中当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向所述婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁时，(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
70.权利要求69的方法，其中所述脂肪酶以冻干制剂形式提供。
71.权利要求70的方法，其中在步骤(ii.)之前溶解所述冻干制剂，例如采用无菌水。
72.权利要求69至71中任一项的方法，其中以单位剂量提供所述脂肪酶，所述单位剂量包含1.5至75mg、5至45mg或者约10、15、20或25mg量的所述脂肪酶。
73.权利要求69的方法，其中以在溶液中1.5至150mg/mL、7.5至30mg/mL或约15mg/mL的浓度提供所述脂肪酶。
74.权利要求69至73中任一项的方法，其还包括在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁的步骤。
75.权利要求74的方法，其中随每天的大多数或所有喂食重复所述方法的步骤。
76.改良婴儿配方食品，其包含有效用于以下之量的重组人胆盐刺激脂肪酶：在每种情况中当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向所述婴儿喂食所述改良婴儿配方食品时，(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
77.改良巴氏消毒乳汁，其包含有效用于以下之量的重组人胆盐刺激脂肪酶：在每种情况中当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向所述婴儿喂食所述改良巴氏消毒乳汁时，(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；用于(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或用于(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
78.用于制备改良婴儿配方食品或改良乳汁的试剂盒，所述改良婴儿配方食品或改良乳汁用于：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累，所述试剂盒包含以下组件：
a.至少一个第一容器，其包含第一量的重组人胆盐刺激脂肪酶，例如以冻干制剂的形式；和
b.至少一个第二容器，其区别于所述第一容器，所述第二容器包含第二量的未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁；
其中所述脂肪酶与所述未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁各自为足以分别制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁的量，所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁分别包含有效用于以下之量的所述脂肪酶：在每种情况中当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向所述婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁时，(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
79.权利要求78的试剂盒，其还包含使用说明，其中所述使用说明描述以下步骤：
i.制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，例如通过向未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁添加一定量的所述脂肪酶，从而分别形成改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁；以及
ii.在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约
7天中每天至少一次喂食向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁。
80.用于下述的方法，即用于(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累，在每种情况中所述方法包括以下步骤：
i.制备或以其他形式提供权利要求76的改良婴儿配方食品或权利要求77的改良巴氏消毒乳汁，或者根据权利要求69至75中任一项的方法或通过使用权利要求78或79的试剂盒来制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁；
ii.向所述婴儿喂食如此制备或以其他形式提供的所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁；和
iii.在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食地重复前述步骤。
81.包含药物组合物的经包装药用产品，所述药物组合物包含一定量的重组人胆盐刺激脂肪酶，其中所述经包装药用产品还包含描述以下步骤的使用说明：
i.制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其含有有效用于以下之量的所述脂肪酶：在每种情况中当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向所述婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁时，(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累；以及
ii.通过喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁向人婴儿肠施用所述量的脂肪酶，例如在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食。
82.权利要求81的经包装药用产品，其中所述婴儿遭受或所述使用说明描述所述婴儿应遭受体重不足或早产出生。
83.权利要求81或82的经包装药用产品，其中所述使用说明描述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁用于或有效用于或者在临床试验中证明有效且安全地用于：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
84.权利要求81至83中任一项的经包装药用产品，其还包含婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁。
85.权利要求81至84中任一项的经包装药用产品，其中所述脂肪酶为单位剂量的形式，所述单位剂量包含1.5至75mg、5至45mg或者约10、15、20或25mg量的脂肪酶。
86.改良巴氏消毒乳汁，其包含用于以下的重组人胆盐刺激脂肪酶：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
87.改良婴儿配方食品，其包含用于以下的重组人胆盐刺激脂肪酶：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
88.药物组合物，其包含用于以下的重组人胆盐刺激脂肪酶：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
89.重组人胆盐刺激脂肪酶，其用于：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
90.权利要求86的改良巴氏消毒乳汁、权利要求87的改良婴儿配方食品、权利要求88的药物组合物或权利要求89的重组人胆盐刺激脂肪酶，在每种情况中其用于(V)保护所述婴儿的小肠粘膜免受粘膜和/或跨粘膜坏死和/或炎症；和/或(W)保护人婴儿免受坏死性小肠结肠炎和/或回肠穿孔，和/或预防或降低在所述婴儿中坏死性小肠结肠炎和/或回肠穿孔的可能性、严重性和/或发生率。
91.权利要求88或90的药物组合物或者权利要求89或90的重组人胆盐刺激脂肪酶，在任一种情况中适于对人婴儿肠施用。
92.权利要求86或90的改良巴氏消毒乳汁，权利要求87或90的改良婴儿配方食品，权利要求88、90或91的药物组合物或者权利要求89、90或91的重组人胆盐刺激脂肪酶，在每种情况中，其中所述婴儿通过肠管或胃管喂食，所述婴儿喂食婴儿配方食品和/或所述婴儿是早产的。
93.重组人胆盐刺激脂肪酶用于制造药物的用途，所述药物用于：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
94.权利要求93用于制造药物的用途，所述药物用于(V)保护所述婴儿的小肠粘膜免受粘膜和/或跨粘膜坏死和/或炎症；和/或(W)保护人婴儿免受坏死性小肠结肠炎和/或回肠穿孔，和/或预防或降低在所述婴儿中坏死性小肠结肠炎和/或回肠穿孔的可能性、严重性和/或发生率。
95.权利要求93或94的用途，其中所述重组人胆盐刺激脂肪酶适于肠施用至所述婴儿。
96.权利要求93至95中任一项的用途，其中所述婴儿通过肠管或胃管喂食，所述婴儿喂食婴儿配方食品和/或所述婴儿是早产的。
提高人婴儿之生长速度的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于提高人婴儿之生长速度的方法，所述方法包括向所述婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶(recombinant human bile-salt-stimulated lipase，rhBSSL)。此类方法特别地可用于体重不足或早产人婴儿、尤其是有提高其生长速度之医学需要的那些。在另一些方面中，本发明涉及组合物，包括婴儿食物、试剂盒、经包装药用产品和药物组合物，以及还涉及用于制备婴儿食物的方法，在每种情况中其可用于提高人婴儿之生长速度。在另一个方面中，本发明涉及用于以下方法：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累；在每种情况中所述方法包括向所述婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的步骤。本发明还涉及组合物，包括婴儿食物、试剂盒、经包装药用产品和药物组合物，以及还涉及用于制备婴儿食物的方法，在每种情况中用于这些保护和限制积累的方法。
背景技术
[0002] 出生体重低于2,500g的婴儿被认为是低出生体重(low birth weight，LBW)，并且有增加的新生儿严重健康问题(持久残疾和甚至死亡)的风险。某些LBW婴儿可进一步分类为出生时低于1,500g的非常低出生体重(Very Low Birth Weight，VLBW)婴儿和出生时低于1000g的极其低出生体重(Extremely Low Birth Weight，ELBW)婴儿。LBW新生儿的比率在全世界范围内都不同。例如，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)估计，2000年在欠发达地区中出生人数的16.5％是LBW。与此相反，2005年在美国每12个(8.3％)出生的婴儿中有约1个是出生的LBW(Martin等，2007；National Vital Statistics Reports，56(6))，而在英格兰和威尔士，LBW婴儿的整体比率报道为7.3％(Doyle，2000；BMJ，320：941-942)。LBW婴儿的比率处于不断提高之中，尤其是在例如美国等较发达的地区，认为这主要是由人工受孕多胎妊娠的早产的增加所造成的。
[0003] 由于许多LBW婴儿尤其易受健康问题的影响，所以他们需要在新生儿重症监护室(Newborn Intensive Care Unit，NICU)中的特别照料(例如，McIntire等，1999；N Engl J Med，340：1234-1238中所报道的)，所述健康问题包括呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome，RDS)、紫绀发作(cyanotic attack)、脑中出血(脑室内出血(intraventricular hemorrhage，IVH))、大脑性瘫痪、心脏问题(例如动脉导管未闭(patent ductus artiousus，PDA))、低钙血症、低血糖、肠疾病(例如坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC))、黄疸和视网膜发育问题(例如早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP))。许多研究已经发现，新生儿护理的护理费用随出生体重的下降而急剧上升，美国研究评估，与出生体重超过3,000g出生的婴儿仅1000美元相比，出生体重为500-700g新生婴儿的费用为224,400美元，并且有人估计在美国每年超过500亿美元的支出是为提供这样的护理。在此类急性护理之外，已经报道出生体重不足与许多中期健康问题有关，包括：(a)婴儿期较差的体重增长和头发育(Gutbrod等，2000；
Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed，82：208-214)；(b)幼儿期发育迟缓和之后的语言问题(Marlow等，2005；N Engl J Med，352：9-19)；(c)神经异常；以及(d)增加的耳聋发生率。一些研究还表明LBW出生的个体可能在成年期有增加的某些慢性疾病的风险，所述疾病包括高血压、2型糖尿病和心脏病。
Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed，82：208-214)；(b)幼儿期发育迟缓和之后的语言问题(Marlow等，2005；N Engl J Med，352：9-19)；(c)神经异常；以及(d)增加的耳聋发生率。一些研究还表明LBW出生的个体可能在成年期有增加的某些慢性疾病的风险，所述疾病包括高血压、2型糖尿病和心脏病。
[0004] 为什么婴儿出生时可能具有低出生体重，有两个主要原因：(1)早产-正常妊娠持续约40周(38-42周)，并且WHO将早产定义为从末次月经期的第一天起在满37周之前出生的婴儿。婴儿越早出生，可能体重越低；和(2)胎儿生长受限-足月但是体重不足的婴儿，也称为小于孕龄(small-for-gestational age，SGA)或小于胎龄(small-for-date)婴儿。由于他们的父母矮小(small)，所以这些婴儿中的一些仅仅是矮小(并且这些婴儿十分健康)，而另一些具有低出生体重，这是由于一些物质延缓或停止他们在子宫中的生长(或子宫内生长阻滞(intra-uterine growth retardation，IUGR))。一些婴儿是早产的并遭受IUGR二者，以及这些婴儿尤其有例如上述那些的健康问题的高风险。
[0005] 最近，WHO系统地综述了世界早产的发生率(Beck等，2010；Bull World Health Organ，88：31-38)，他们估计2005年有1290万出生人数(即全世界所有出生人数的9.6％)是早产的。这些早产人数中近1100万(85％)集中在非洲和亚洲，而约50万发生在欧洲和北美洲(包括墨西哥)以及90万在拉丁美洲和加勒比地区。早产的最高比率在非洲和北美洲(分别占全部出生人数的11.9％和10.6％)，最低的在欧洲(6.2％)。对于北美洲，估计的相对高比率的早产人数等同于2005年480,000的早产人数的绝对数目，尽管在同一年在欧洲具有相对较低比率，可是仍然有估计466,000的早产人数。来自一些发达国家(例如英国、美国和斯堪第纳维亚国家)可用的早产率表明在过去的20年显著上升(例如Callaghan等，2006；Pediatrics，118：1566-1573)。可归因于但不完全解释该上升趋势的因素包括增加的多胎出生率、辅助再生产技术的更多应用、在超过34岁的女性当中生育人数之比例的增加和临床实施的变化(例如更频繁使用择期剖宫产)。
[0006] 作为LBW婴儿的早产婴儿通常易受同样的健康问题的影响，并且问题的严重性随着早产的程度而增加：36周时出生的婴儿将可能较少缓慢喂食；33周前出生的婴儿将具有更严重的问题，可能包括未成熟肺；而28周前出生引起非常显著的问题但是存活率十分显著。数据表明如果出生时超过800g则有90％存活，如果超过500g则有50％存活以及如果在28周前出生则有80％存活；但是这些数据也可能隐藏了存活者中的显著残疾。例如，严重问题(例如大脑性瘫痪、失明和耳聋)可影响多达10至15％的显著早产婴儿，4个出生体重低于1.5kg的婴儿中约1个具有外周听觉损伤或中枢听觉损伤或者其二者(Jiang等，2001；Acta Paediatr，901411-1415)以及66％的低于1.25kg的婴儿发生ROP(Allin等，
2006；Pediatrics，117：309-316)。
2006；Pediatrics，117：309-316)。
[0007] 出生时胰和肝功能尚未完全发育并且在早产婴儿中这尤其明显。Lindquist和Hernell(1990；Curr Opin Clin Nutr Metab Care，13：314-320)最近综述了一生中前期里脂质消化和吸收的主题。胸喂(breast-feed)婴儿比配方食品喂食婴儿更有效地消化和吸收脂肪(并且重要的是长链多不饱和脂肪酸(long-chain polyunsaturated fatty acid，LCPUFA))(Bernback 等，1990；J Clin Invest，85：1221-1226；Carnielli 等，1998；Am J Clin Nutr，67：97-103)。除了与婴儿配方食品类似的脂肪组成之外，母亲的乳汁还含有宽特异性脂肪酶，胆盐刺激脂肪酶(bile-salt stimulate lipase，BSSL)(EC3.1.1.13)，其促进从乳汁中高度有效的脂肪吸收。
[0008] BSSL是天然存在的胰酶，其被十二指肠中的胆盐活化并与其他脂肪酶一起参与脂质的水解。在早期的婴儿、尤其在早产婴儿中，胰外分泌功能尚未完全发育(Manson&Weaver，1997；Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed，76：206-211)。因此，在早产儿的胰腺中，与成年人胰腺相比，胰脂肪酶的表达较低(Lombardo，2001；Biochim Biophys Acta，1533：1-28；Li等1007；Pediatr Res，62：537-541)。因此，在乳汁中存在的BSSL对于这些婴儿来说是重要的脂肪酶；泌乳乳腺中BSSL的表达以及酶随着母亲乳汁一起分泌补偿了胰脂肪酶的低水平。人泌乳乳腺合成并分泌BSSL，在被婴儿下段肠(lower intestine)中主要的胆盐特定活化后，所述BSSL有助于胸喂婴儿肠脂肪消化的内源性能力。
[0009] 据信BSSL比大部分脂肪酶具有更宽的底物特异性。该酶不仅能够完全水解甘油三酯(三酰甘油(triacylglycerol，TG))的全部三种脂肪酸，而且能够完全水解脂溶性维生素脂(例如维生素A)以及胆固醇脂。因此，BSSL驱使管腔内脂肪分解趋于完成并导致形成甘油和游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)(包括长链多不饱和脂肪酸(long-chain polyunsaturated fatty acid，LCPUFA))，后者是发育中枢神经系统不可或缺的构建模块(Hernell，1975；Eur J Clin Invest，5：267-272；Bernback等，1990；Hernell等，1993；J Pediat Gastro Nutr，16：426-431；Chen等，1994；Biochem Biophys Acta，1210：239-243)。BSSL在pH8-8.5显示出最优活性并且在酸性环境中比胰脂肪酶更稳定。BSSL在生理浓度下对胃蛋白酶的降解具有抗性。BSSL在乳中占总体蛋白质的约1％并且以0.1-0.2g/L的浓度存在(Blackberg等，1987；FEBS Lett，217：37-41；Wang & Johnson，1983；Anal Biochem，
133：457-461；Stromqvist等，1997；Arch Biochem Biophys，347：30-36)。尽管BSSL的浓度可随着泌乳期的持续而下降(Torres等，2001；J Natl Med Assoc，93：201-207)，但是BSSL在乳汁中的水平在一天之中是类似的(Freed等，1986；J Pediatr Gastroenterol Nutr，5：
938-942)并且乳汁中的BSSL产生维持至少3个月(Hernell等，1977；Am J Clin Nutr，30：
508-511)。甘油三酯占乳汁或配方食品中所有脂质的约98％或更多，从而占能量成分的约
50％。
133：457-461；Stromqvist等，1997；Arch Biochem Biophys，347：30-36)。尽管BSSL的浓度可随着泌乳期的持续而下降(Torres等，2001；J Natl Med Assoc，93：201-207)，但是BSSL在乳汁中的水平在一天之中是类似的(Freed等，1986；J Pediatr Gastroenterol Nutr，5：
938-942)并且乳汁中的BSSL产生维持至少3个月(Hernell等，1977；Am J Clin Nutr，30：
508-511)。甘油三酯占乳汁或配方食品中所有脂质的约98％或更多，从而占能量成分的约
50％。
[0010] 在许多研究和专家组推荐中已经证明了人乳汁作为营养来源对足月婴儿以及早产婴儿的优势。因此，全世界推荐的喂食方法是胸喂。然而，出于医学原因，胸喂或喂食母亲自己的乳汁并不总是可能的或者推荐的，以及出于许多其他原因可能不进行胸喂，在本文中其他地方描述了以上每种情况。
[0011] 尽管在1980年代从约60％下降至约50％(Foss & Southwell，2006；Int Breastfeeding J 1∶10)，开始时进行胸喂的美国妇女的百分比从1990年代起增加并且在2004年报道有约74％(Scanlon等，2007，in CDC Morbidity and Mortality Weekly Report，2007年8月2日)。然而，持续胸喂的妇女的百分比在产后早期开始后似乎显著下降，并且该研究报道了在2004年仅42％和21％的妇女分别在6和12个月后仍胸喂。来自英国的谢菲尔德的数据显示了相同趋势，在1980年代从约70％下降至50％，而且仅35％至30％(在同一时间期间)的此类妇女在生育后一个月时确实这么做(Emery等，1990，Arch Dis Childhd，65：369-372)。纯胸喂的妇女的百分比甚至更低，对于美国2004年出生的婴儿，整体仅约31％和11％的妇女分别在3月龄和6月龄中纯胸喂，并且在这些妇女的亚组之间有显著的不一致；在3月龄中纯胸喂的比率在黑人婴儿(20％)当中和以下母亲的婴儿当中是最低的：年龄＜20岁(17％)，具有高中教育或更低(分别是23％和24％)，在农村地区居住的(24％)未婚的(19％)和收入贫困比率(income-to-poverty ratio)低于
100％(24％)(Scanlon等，2007)。实际上，在胸喂中存在显著的民族和文化差异。Emery &其同事(1990)报道了在英国谢菲尔德打算胸喂的亚洲妇女比白人妇女具有显著更低的百分比。另外，Singh(2010；Eur J Sci Res，40：404-422)报道了，在巴西，纯胸喂的平均持续时间仅为28.9天，在马来西亚仅25％的婴儿纯胸喂2个月，以及在波哥大和内罗毕该百分比分别是12％和21％的婴儿。
100％(24％)(Scanlon等，2007)。实际上，在胸喂中存在显著的民族和文化差异。Emery &其同事(1990)报道了在英国谢菲尔德打算胸喂的亚洲妇女比白人妇女具有显著更低的百分比。另外，Singh(2010；Eur J Sci Res，40：404-422)报道了，在巴西，纯胸喂的平均持续时间仅为28.9天，在马来西亚仅25％的婴儿纯胸喂2个月，以及在波哥大和内罗毕该百分比分别是12％和21％的婴儿。
[0012] 在婴儿非胸喂的情况中，常常使用婴儿配方食品或库存的和非库存的巴氏消毒和/或冷冻乳汁(breast milk)。然而，在一些方面中，所有这些在营养上对新出生婴儿都是次优的。
[0013] 由于病毒性感染的风险(人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)[HIV]、巨细胞病毒(cytomegalovirus)[CMV]、肝炎)和由于致病菌的较低程度传播，所以在所谓的乳库(milk bank)中使用的供体乳在使用之前通常是巴氏消毒的。然而，BSSL在乳汁的巴氏消毒期间失活( 等，1980；Br Med J，201：267-272)；其也不存在于许多不同配方食品之任一种中，所述配方食品针对早产或足月新生儿的营养而存在。已经显示，与巴氏消毒乳汁相比，在喂食新鲜乳汁的婴儿中脂肪吸收、体重增长和线性生长更 高 (Andersson等2007；Acta Paediatr，96：1445-1449；Williams等，1978；Arch Dis Child43：555-563)。这是为什么提倡以下的一个原因：不可喂食其自己母亲乳的新出生婴儿、尤其是早产婴儿应喂食来自其他母亲的非巴氏消毒乳( 等，1980)。
[0014] Hamosh(1983；J Ped Gastro Nutr，2：248-251)报道了BSSL酶活性存在于在第26至30周分娩的妇女之新鲜乳汁中。该报道还描述了，在-20或-10℃贮存的乳样品表现出BSSL活性的缓慢丧失，但是仅在-10℃贮存3周后活性的胆盐依赖性更显著丧失，此依赖性可有助于水解乳脂质，甚至在-20℃乳汁贮存期间也是如此。
[0015] 仅在某些物种(即人、大猩猩、猫和狗)的乳中发现了乳胆盐刺激脂肪酶(Freed，等，1986；Biochim Biophys Acta，878：209-215)。母牛、马、大鼠、兔子、山羊、猪或恒河猴(Rhesus monkey)不产生乳胆盐刺激脂肪酶(Blackberg等，1980；Freudenberg，1966；Experientia，22：317)。
[0016] 如 由 Blackberg & Hernell(1981；Eur J Biochem，116：221-225) 和 Wang & Johnson(1983)报道的，已经将天然乳汁BSSL(hBSSL-MAM)纯化至均一性，并且Nilsson(1990；Eur J Biochem，192：543-550)鉴定了以及在WO91/15234和WO91/18923中公开了人BSSL的cDNA序列。来自数个实验室的表征和序列研究表明，蛋白质hBSSL-MAM和胰羧酸酯水解酶(carboxylic ester hydrolase，CEH)(也称为胰BSSL)是同一基因的产物(例如，Baba等，1991；Biochem，30：500-510Hui等，1990；FEBS Lett，276：131-134；Reue等，1991；J Lipid Res，32：267-276)。
[0017] 在分离cDNA序列之后，已经在包括转基因绵羊中(rhBSSL-OVI)产生了重组人BSSL(rhBSSL)以及其变体；例如在US5716817、WO94/20610和WO99/54443中描述的。使用转基因动物产生用于治疗用途的蛋白质已经满足显著的安全性、科学、标准和伦理抵抗。实际上，迄今为止，在美国和欧洲市场上尚未有从转基因绵羊中产生的经批准的治疗产品，到目前为止仅批准了从其他转基因动物中产生的两种医学产品：从转基因山羊中产生的ATRYN(重组抗凝血酶)和从转基因兔子中产生的RUCONEST(重组组分1酯酶抑制剂)。以此类方式(在乳腺组织中表达并且在乳中分泌)产生的蛋白质可被在这些动物的乳中自然发现的组分所污染，例如乳清或者非乳汁或乳清蛋白，如果此类蛋白质用于某些个体的人用途时可引起安全问题，例如对基于乳的组分或产品的不耐受或过敏的那些。
[0018] 长久以来已知的是(至少1960年代中期)，将脂肪酶或含酯酶组织提取物添加至基于乳的食品中用于治疗动物的家畜腹泻病(CA662815& US3081225)。另外，US326150提议了外源性脂肪酶在包括幼儿的人中用于治疗乳糜泻或吸收不良综合征的用途。其中描述的方法涉及提取和使用来自组织(例如小牛、小山羊和羔羊的舌头和其他口组织)的大量未表征的酶混合物。
[0019] 关于婴儿喂食实践，尤其是LBW婴儿的喂食，长期提倡新鲜人乳最适于喂食LBW婴儿。这基于这样的研究，例如Williams等(1978)的早期工作，其显示，在3至6周龄的7个VLBW早产婴儿(低于1.3Kg)的实验性研究中，用原始乳汁、巴氏消毒乳汁和煮过的乳汁，每种喂食一周，喂食连续三周，乳汁的热处理(与生乳汁相比)使脂肪吸收降低了约三分之一。该研究提示，与经热处理的乳汁相比，脂肪吸收的改善可能与生乳汁中乳脂肪酶的保留有关。应注意，该研究描述了在所有的婴儿喂食原始乳的那周期间他们的体重增长最快；在此期间比在施用巴氏消毒的或煮过的乳的类似期间平均体重增长(以增长的g/周/100mL消耗的乳报道)增加了约三分之一。在由Alemi报道的较大的(但是较短的)研究(1980；Pediatrics.68：484-489)中，在出生体重为660至1,695g并且孕龄为26至33周的15个VLBW婴儿中研究了脂肪排泄，该研究在出生后7至44天开始。与仅喂食配方食品的婴儿相比，在喂食乳汁和配方食品之混合物72小时的那些婴儿中脂肪排泄较低。最近，Andersson &其同事(2007)在随机化研究中报道了对母亲自己的乳巴氏消毒降低了早产婴儿的脂肪吸收和生长，并且提出这些作用是由于通过巴氏消毒使基于乳的BSSL失活。应注意的是，报道的来自许多研究(包括上述那些)的脂肪吸收系数(coefficient of fat absorption，CFA)的范围很宽；来自乳汁和来自配方食品二者。这可部分地解释为给定的脂肪的量和组成以及部分地解释为在早产新出生儿中利用膳食脂肪的能力上大的个体间差异，但是这也反映了在正确评估CFA上相当大的困难(Hernell，1999；J Pediatr，136：407-409)。
[0020] 一个动物模型研究尝试调查通过将外源BSSL添加至新生儿食品中对婴儿生长的作用(Wang等，1989；Am J Clin Nutr，49：457-463)。该研究涉及将经纯化的人BSSL(0.1mg/mL)添加至小猫配方食品(3比1与牛乳混合)用于六只奶瓶喂食小猫喂食5天。该研究报道了用添加有hBSSL的小猫配方食品饲喂的小猫的生长速度是单独用配方食品饲喂的那些的两倍。应注意的是，该配方食品添加了牛乳，小猫是非早产的或低出生体重的，它们在其生命的最初48小时进行胸喂并且该研究用经纯化的天然hBSSL进行。作者建议，小猫可在BSSL的功能性作用研究中用作动物模型，并且提交了以该研究为基础的相关专利申请(包括US4944944、EP0317355和EP0605913)，所述专利申请公开了(在其他方面当中)：一种用于加强缺乏胆盐激活脂肪酶(bile-salt-activated lipase)之含脂肪婴儿配方食品的方法，其包括向所述配方食品添加有效量的经分离的选自乳胆盐激活脂肪酶[BSSL]和胆盐激活胰羧酸酯酶[现在也称为BSSL]的胆盐激活脂肪酶，以增加来自所述配方食品的脂肪吸收和所述婴儿的生长；以及一种用来自包含脂肪之第一来源的饮食基础喂食婴儿的方法，所述方法由以下组成：以足以改善所述婴儿消化和吸收基础中脂肪并增加所述婴儿生长的量向所述婴儿施用经分离的选自乳胆盐激活脂肪酶[BSSL]和胆盐激活胰羧酸酯酶[现在也称为BSSL]的胆盐激活脂肪酶，其中所述脂肪酶来源于第二来源。没有公开支持改善脂肪吸收的数据，也没有从涉及人婴儿的任何研究中获得任何数据。由Lindquist & Hernell(2010)报道了另一个研究(Lindquist等，2007；J Pediatr Gastroenterol Nutr44：E335)是，向由BSSL敲除母兽哺乳的BSSL敲除小鼠幼兽人工喂食经纯化的人BSSL以恢复正常脂肪吸收并预防肠损伤形成。
[0021] 在hBSSL cDNA的克隆和用于产生大量重组人BSSL(recombinant human BSSL，rhBSSL)的各种方法的公开之后，已经产生许多公开并要求保护多种包含rhBSSL的婴儿配方食品(例如US5200183、WO91/15234、WO91/18923和US5716817)以及此类配方食品或rhBSSL(包括作为婴儿补充剂)用于改善饮食脂质利用，治疗脂肪吸收不良、某些胰腺胰异常和囊性纤维化的多种方法和用途(例如WO91/18923、WO94/20610和WO99/54443)。然而，正如较早的提示性研究那样，没有公开从采用重组胆盐刺激脂肪酶补充人婴儿的实验中获得的支持性数据。实际上，在1996年所有这些建议、相关研究和公开之后，本领域中领先的研究人员仍质疑：“应将乳汁生物活性组分[例如BSSL]补充至配方食品喂食婴儿吗？”；并且还认为：“对于试图补充消化酶[例如BSSL]还未有数据”(Hamosh，at Symposium：
Bioactive Components in Milk and Development of the Neonate：Does Their Absence Make a Difference？Reported in J Nutr，12：971-974；1997)。最近，Andersson &其同事(2007)推测，采用重组乳汁BSSL添加巴氏消毒乳可恢复该乳的内源性脂肪分解活性。
Bioactive Components in Milk and Development of the Neonate：Does Their Absence Make a Difference？Reported in J Nutr，12：971-974；1997)。最近，Andersson &其同事(2007)推测，采用重组乳汁BSSL添加巴氏消毒乳可恢复该乳的内源性脂肪分解活性。
[0022] 722个氨基酸的天然BSSL被大量糖基化(30-40％碳水化合物)(Abouakil等，1989；Biochem Biophys Acta，1002：225-230)，并且在该分子的C端部分内有大量的O-糖基化位点，在其最丰富的形式中含有16个具有O连接碳水化合物的11残基的富脯氨酸重复(Hansson等，1993；J Biol Chem，268：26692-26698)。尚未证明大量O-糖基化的作用，但是基于其序列组成，预测大的C端尾是非常亲水的和易接近的(Wang等，1995；
Biochemistry，34：10639-10644)。
Biochemistry，34：10639-10644)。
[0023] 糖基化模式的差异可在许多蛋白质(尤其是用于医药的蛋白质)的活性或其他特性上具有显著差异。例如，ARANESP(阿法达贝泊汀(darbepoetin alpha))是特定设计的促红细胞生成素变体，它与PROCRIT(阿法依泊汀(epoetin alpha))有两个氨基酸的不同，从而提供具有5条(而不是3条)N连接寡糖链的分子，并且该不同之处显著改变了药代动力学特性；达贝泊汀与依泊汀相比表现出在血清中的半衰期增加了3倍和增加的体内活性(Sinclair和Elliot，2005；J Pharm Sci94：1626-1635)。
[0024] 不同的重组生产系统(例如哺乳动物细胞、酵母、转基因动物)乃至在生产过程中与统一表达系统的微小改变可导致同一蛋白质/多肽序列之糖基化的变化。例如，在酶替代治疗中使用重组人α半乳糖苷酶A用于法布瑞氏症(Fabry′s disease)，以两种方式生产商业药物产品，其具有相同的氨基酸序列但是各自具有不同的糖基化模式：REPLAGAL(阿加糖酶α(agalsidase alfa))和FABRAZYME(阿加糖酶β(agalsidase beta))。在连续的人成纤维细胞系中生产REPLAGAL，而在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞中生产FABRAZYME，并且每种产品具有不同的糖基化。与从CHO细胞中产生的其他蛋白质一样，FABRAZYME是唾液酸化(sialyated)糖蛋白并且其与REPLAGAL相比唾液酸化和磷酸化的程度有差异(Lee等，2003；Glycobiology，13：305-313)。与天然人糖蛋白相比，在CHO细胞中产生的糖蛋白的唾液酸化的定性和定量差异影响生物分布和免疫原性效价的水平。事实上，在几乎所有采用阿加糖酶β治疗的患者中都报道了存在IgG，相比之下，采用阿加糖酶α治疗的患者仅55％(Linthorst等，2004；Kidney Int，66：1589-1595)。另外，在一些情况下，对采用阿加糖酶β治疗的过敏类型反应记录为在循环中存在IgE和/或阳性皮内反应(Wilcox等，2004；Am J Hum Genet，75：65-74)。
[0025] 实际上，当它们的肽图谱非常类似时，天然BSSL的糖基化模式确实与小鼠C127和仓鼠CHO细胞系中产生的rhBSSL的糖基化模式显著不同，并且在结合某些凝集素(lectin)(包括伴刀豆球蛋白、蓖麻(Ricinus communis)凝集素(agglutinin)和橙黄网孢盘菌(Aleuria aurantia)凝集素)的能力方面也存在不同，表明天然BSSL比重组形式含有显著更多的岩藻糖和末端β-半乳糖残基(Stromqvist等，1995；J Chromatogr，718：53-58)。Landberg等(1997；Arch Biochem Biophys344：94-102)进一步表征了这两种重组形式，并报道这两种重组形式具有较低摩尔百分比的总体单糖(与天然hBSSL的23％相比，C127-和CHO-产生的rhBSSL分别是20％和15％)，以及天然hBSSL与某些Lewis抗原检测抗体反应，而C127-rhBSSL不与其反应。
[0026] 尽管以上报道的C127-和CHO-产生的rhBSSL彼此在分子量、糖基化和凝集素结合的方面大致相似，但是，与此相反，从转基因小鼠的乳中分离的rhBSSL在尺寸排阻色谱(size-exclusion chromatography，SEC)上显示出较低的表观分子量以及与凝集素组没有可检测的相互作用，表明在来自转基因小鼠的乳中的rhBSSL的O-糖基化程度显著低于其他重组形式所发现的O-糖基化程度(Stromqvist等，1996；Transgen Res5：475-485)。
[0027] 已经报道了在特定的适应症中采用一种特定形式rhBSSL进行的临床研究；即由于慢性胰腺炎或囊性纤维化(CF)的外分泌胰腺机能不全(pancreatic insufficiency，PI)的早期探索性研究。2004年，报道的二期试验显示，与以常规剂量或25％剂量单独给予得每通(Creon)相比，当以单次剂量0.2g或1g的rhBSSL作为25％常规得每通剂量之补充时，具有PI的CF患者(年龄为12至39岁)具有更快速和有效的脂质摄入(Strandvik等，2004；18th North American Cystic Fibrosis Conference，St Louis MI；abstract published in Pediatr Pulmonol，S27：333)，以及在2005年第二个二期试验的结果报道rhBSSL显示出极大改善一组有PI的瑞典CF患者消化脂肪的能力(来自Biovitrum的通讯稿，报道Strandvik等，2005；28th European Cystic Fibrosis Society(ECFS)Conference，Crete)。在这两个临床试验中，使用rhBSSL-OVI获得了这些临床结果。最近，宣布已经完成了又一个二期试验，其使用rhBSSL(其中描述为“布塞脂酶α(布塞脂酶α alpha)”)的经口混悬剂，以170mg的剂量每天3次施用5-6天，以评估在患有CF和PI的成年患者中对脂肪吸收的作用，但是迄今尚未发表由此所致的疗效结果(临床试验.政府标识号NCT00743483)。
[0028] 自至少2008年以来，已经公开了计划并进行使用rhBSSL的两个二期试验，其每个用以研究脂肪吸收系数以及身高和体重的变化，在32周胎龄之前出生的早产婴儿中，用添加至婴儿配方食品(临床试验.政府标识号NCT00658905)或添加至巴氏消毒乳汁(临床试验.政府标识号NCT00659243)的0.15g/L rhBSSL或安慰剂各自治疗一周。
[0029] 鉴于现有技术和长期切身需要解决方案，因此本发明的目的是提供一种提高人婴儿(例如体重不足或早产人婴儿)之生长速度的方法。所述方法应克服现有技术的一个或更多个缺点，其包括：可大量可靠地和/或可再现地生产活性成分；通过科学地、标准地和/或伦理上可接受的方法制造活性成分；和/或在涉及人婴儿的随机化临床试验内证明本方法或用于本方法的活性成分是有效的和安全的。
发明内容
[0031] 在一个方面中，本发明涉及一种提高人婴儿之生长速度的方法，所述方法包括向所述婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的步骤。
[0032] 在另一个方面中，本发明涉及一种用于治疗遭受体重不足或早产之人婴儿的治疗性方法，所述方法包括向有医学需要的婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的步骤。
[0033] 本发明的另一个方面涉及一种制备用于提高人婴儿之生长速度的改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁的方法，所述方法包括以下步骤：
[0034] i.提供第一量的重组人胆盐刺激脂肪酶和第二量的未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁；以及
[0035] ii.将一定量的所述脂肪酶添加至所述未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁中，
[0036] 从而以形成改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其包含当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁时有效提高所述婴儿之生长速度的量的脂肪酶。
[0037] 在又一些方面中，本发明涉及：(a)改良婴儿配方食品，其包含当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品时有效提高所述婴儿之生长速度的量的重组人胆盐刺激脂肪酶；和/或(b)改良巴氏消毒乳汁，其包含当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向人婴儿喂食所述改良巴氏消毒乳汁时有效提高所述婴儿之生长速度的量的重组人胆盐刺激脂肪酶。
[0038] 本发明的又一个方面涉及一种用来制备用于提高人婴儿之生长速度的改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁的试剂盒，所述试剂盒包含以下组件：
[0039] (a)至少一个第一容器，其包含第一量的重组人胆盐刺激脂肪酶，例如作为冻干制剂；和
[0040] (b)至少一个第二容器，其区别于所述第一容器，所述第二容器包含第二量的未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁；
[0041] 其中所述脂肪酶与所述未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁各自分别为足以制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁的量，所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁分别包含当向人婴儿(例如在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向所述婴儿)喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁时有效提高所述婴儿之生长速度的量的所述脂肪酶。
[0042] 在又一个方面中，本发明涉及一种用于提高人婴儿之生长速度的方法，所述方法包括以下步骤：
[0043] i.制备或以其他方式提供改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，或者根据本发明的方法或通过使用本发明的试剂盒来制备本发明的改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁；
[0044] ii.向所述婴儿喂食如此制备或以其他方式提供的所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁；和
[0045] iii.在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食地重复前述步骤。
[0046] 在又一个方面中，本发明涉及包含药物组合物的经包装药用产品，所述药物组合物包含一定量的重组人胆盐刺激脂肪酶，其中所述经包装药用产品还包含描述以下步骤的使用说明：
[0047] i.制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其包含当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁时有效提高所述婴儿之生长速度的一定量的所述脂肪酶；和
[0048] ii.例如在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食通过喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁向人婴儿肠施用所述量的脂肪酶。
[0049] 在一个特定的方面中，本发明还涉及单位剂量的药物组合物，所述单位剂量包含0.1至100mg重组人胆盐刺激脂肪酶，例如1.5至75mg所述脂肪酶、5至45mg所述脂肪酶或约20mg所述脂肪酶。
[0050] 在一些可替换的方面中，本发明还涉及：用于以下的方法；制备可用于以下的婴儿食物的方法；可用于以下的婴儿食物；可用于以下的试剂盒；用于以下的经包装药用包装；用于以下的药物组合物；和用于以下的重组人胆盐刺激脂肪酶：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累；在每种情况中涉及用于所述婴儿的重组人胆盐刺激脂肪酶。附图说明
[0051] 图1.1示出rhBSSL的结构的图示，还示出潜在糖基化的位点。
[0052] 图2.1示出将rhBSSL添加至婴儿配方食品或添加至巴氏消毒乳汁的临床试验的示意图。
[0053] 图2.2示出对于PP群体的生长速度(g/kg/天)和CFA(％)组合数据的差异之间的相关性。
[0054] 发明详述
[0055] 在一个方面中，本发明涉及提高人婴儿之生长速度的方法，所述方法包括向所述婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的步骤。
[0056] 本文中描述、定义或提及了用于本发明的重组人胆盐刺激脂肪酶(rhBSSL)。例如，其包括由本领域技术人员可辨识的多肽，即人胆盐刺激脂肪酶，其中由非人来源(例如非人有机体)产生或从其中分离所述人脂肪酶，使其适应或修饰(例如通过重组基因技术)以产生此类多肽。
[0057] 人胆盐刺激脂肪酶是已知为多种标识符或别名的酶；例如，“羧酸酯脂肪酶(carboxyl ester lipase，CEL)”、“胆盐激活脂肪酶(bile-salt-activated lipase，BAL)”、“胆盐依赖性脂肪酶(bile-salt-dependent lipase，BSDL)”、“羧酸酯酶”、“羧酸酯水解酶(carboxylic ester hydrolase)”(CEH)和如对本领域技术人员而言从信息来源(例如“GeneCards”(www.genecards.org))可用的许多其他别名和描述。从乳汁(和胰)中已鉴定到许多人BSSL的天然氨基酸序列和同工型，并且已描述了许多不同的氨基酸序列(通常从cDNA或基因组序列中预测)；本文中所有的这些都涵盖在术语“人胆盐刺激脂肪酶”内。例如，人胆盐刺激脂肪酶首先天然地产生为包含20至26个氨基酸信号序列以及描述为具有722至733个氨基酸的蛋白质成熟全长形式(例如参见，Nilsson等，1990；WO91/15234；WO91/18923；the polypeptide predicted from cDNA sequence GenBank submission ID：X54457；GenBank ID：CAA38325.1；GeneCards entry for″CEL/BSSL″；
GenBank ID：AAH42510.1；RefSeq ID：NP_001798.2；Swiss-Prot ID：P19835)。在另一些实例中，在Venter等(2001；Science，291：1304-1351)；GenBnk ID：AAC71012.1；Pasqualini等 (1998；J Biol Chem，273：28208-28218)；GenBank ID：EAW88031.1；WO94/20610 和Blackberg等(1995；Eur J Biochem，228：817-821)中描述了人胆盐刺激脂肪酶的其他较短同工型。
GenBank ID：AAH42510.1；RefSeq ID：NP_001798.2；Swiss-Prot ID：P19835)。在另一些实例中，在Venter等(2001；Science，291：1304-1351)；GenBnk ID：AAC71012.1；Pasqualini等 (1998；J Biol Chem，273：28208-28218)；GenBank ID：EAW88031.1；WO94/20610 和Blackberg等(1995；Eur J Biochem，228：817-821)中描述了人胆盐刺激脂肪酶的其他较短同工型。
[0058] 在一些特定的实施方案中，人胆盐刺激脂肪酶包含这样的蛋白质，其具有包含SEQ ID.NO.1的氨基酸序列或者具有如其所示的氨基酸序列。在另一些特定的实施方案中，(重组)人胆盐刺激脂肪酶具有选自在以下中公开的BSSL成熟或前体形式的氨基酸序列：Nilsson等，1990；WO91/15234，WO91/18923；RefSeq ID：NP_001798.2；GenBank ID：AAH42510.1；GenBank ID：CAA38325.1；GeneCards entry for″CEL/BSSL″；Swiss-Prot ID：P19835。在另一些此类实施方案中，所述(重组)人胆盐刺激脂肪酶包含具有这样氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列是任何在前述参考文献中公开的或SEQ ID.NO.1的序列的至少720个连续氨基酸。在另一些实施方案中，(重组)人胆盐刺激脂肪酶包含这样的蛋白质，所述蛋白质至少具有SEQ ID.NO.1.或WO91/15234中公开的1位至101位的氨基酸序列，或者至少具有SEQ ID.NO.1中公开的1位至535位的氨基酸序列，例如在Hansson等，1993；J Biol Chem，35：26692-26698中公开的“变体A”，其中此类蛋白质具有胆盐结合和/或胆盐依赖性脂肪酶活性，例如可通过在Blackberg等(1995；Eur J Biochem228：
817-821)中公开的方法进行确定。
817-821)中公开的方法进行确定。
[0059] 因此，现在将对本领域技术人员而言显而易见的是，在本发明的某些实施方案中，(重组)人胆盐刺激脂肪酶的一种或更多种这些描述形式可用于本发明的多个方面。另外，对技术人员来说很清楚，具有胆盐依赖性脂肪分解活性(例如，可通过Blackberg等，1995中公开的方法确定)并且在氨基酸序列上与本文中描述、定义或提及的那些多肽序列类似的其他(重组)蛋白质也可用于本发明，因此也被术语“人胆盐刺激脂肪酶”所涵盖。在某些此类的实施方案中，蛋白质在至少约30、50、100、250、500、600、700、711、720、722、733或750个氨基酸上显示出与本文中描述、定义或提及的序列多于90％、95％、98％、99％、99.5％的序列同一性。在另一些实施方案中，可对本文中公开、定义或提及的BSSL多肽序列之一进行一个或更多个氨基酸替换。例如，可对SEQ ID.NO.1中公开的序列进行1、2、3、
4、5或多达10个氨基酸替换、缺失或添加。此类氨基酸变化可以是中性变化(例如中性氨基酸替换)，和/或它们可以以一些(期望的)方式影响蛋白质的糖基化、结合、催化活性或其他特性。只要具有此类替换的蛋白质具有胆盐依赖性脂肪分解活性，那么在本发明的意义上本领域技术人员也将把它们认为是“人胆盐刺激脂肪酶”。
4、5或多达10个氨基酸替换、缺失或添加。此类氨基酸变化可以是中性变化(例如中性氨基酸替换)，和/或它们可以以一些(期望的)方式影响蛋白质的糖基化、结合、催化活性或其他特性。只要具有此类替换的蛋白质具有胆盐依赖性脂肪分解活性，那么在本发明的意义上本领域技术人员也将把它们认为是“人胆盐刺激脂肪酶”。
[0060] 在另一些实施方案中，人胆盐刺激脂肪酶可由具有合适核酸序列的核酸表达或以其他形式编码。作为非限制性实例，所述脂肪酶由下述核酸表达或以其他形式编码，即所述核酸包含SEQ ID.NO.2的151位至2316位的序列或者在WO94/20610或Nilsson等(1990)中所公开的。如本领域技术人员还将了解的，“合适核酸序列”也将涵盖前述核酸序列的变体。例如，不改变由三联体密码子编码之氨基酸的一个或更多个核苷酸碱基的变化(例如在第三密码子位)也将是“合适的”。如果此类核酸序列的亚片段编码如本文中描述的人胆盐刺激脂肪酶的(短)同工型，那么它们也将是“合适的”。另外，编码具有由SEQ ID.NO.1示出的氨基酸序列之变体的蛋白质的核酸序列(例如上述的那些)也将是“合适的”。因此，本发明设想下述实施方案，即其中(重组)人胆盐刺激脂肪酶是可由下述核酸表达或以其他方式编码的蛋白质，所述核酸即与包含SEQ ID.NO.2的151位至2316位序列的核酸或者与包含151位至755位序列的核酸相杂交的核酸，并且其中所述蛋白质具有胆盐依赖性脂肪分解活性。在某些此类的实施方案中，在严格条件下进行杂交，例如本领域技术人员将已知以及通常例如在Joe Sambrook和David Russell的″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″的教材(text book)(CSHL Press)中有所描述。
[0061] 在一个特定的实施方案中，(重组)人胆盐刺激脂肪酶产生自本文中描述、定义或提及的核酸的表达。
[0062] 在本发明的背景下，本文中描述、定义或提及的人胆盐刺激脂肪酶是重组胆盐刺激脂肪酶(rhBSSL)；即其中由非人来源(例如非人有机体)产生或从其中分离所述人脂肪酶，使其适应或修饰(例如通过重组基因技术)以产生此类脂肪酶。在一些特定的实施方案中，使用无细胞和/或体外转录-翻译技术从本文中描述、定义或提及的分离核酸分子产生rhBSSL。或者，使用重组非人有机体，其中所述非人有机体包括此核酸的至少一个拷贝，并且其中所述核酸可由所述非人有机体表达以产生期望蛋白质：rhBSSL。例如，可使用重组细菌、藻类、酵母或其他真核细胞，并且在某些实施方案中从此类重组细胞的培养物中产生rhBSSL。在另一些实施方案中，可由经修饰的或特定选择的人细胞的身体外培养物(例如通过其体外培养物)产生rhBSSL。在又一些实施方案中，由从转基因动物的乳中的分离物产生rhBSSL；例如转基因牛、绵羊、山羊或兔子。本领域技术人员了解可用于使用重组技术产生人胆盐刺激脂肪酶的许多技术。
[0063] 已经显示可从包括大肠杆菌(E.coli)、小鼠和仓鼠(Hansson等，1993)以及巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)(Trimple等，2004；Glycobiol，14：265-274)细胞的培养物在内的重组细胞培养物中产生重组人胆盐刺激脂肪酶。还已经显示可从转基因小鼠的乳(Stromqvist等，1996；Transgen Res，5：475-485)和从转基因绵羊的乳(WO99/54443)中产生和分离重组人胆盐刺激脂肪酶。在本发明的某些实施方案中，从此类重组细胞的培养物中或从此类转基因动物的乳中分离重组人胆盐刺激脂肪酶。在一个可替换的实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶不是从转基因绵羊或转基因小鼠的乳中分离的酶。
[0064] 在本发明的一个特定的实施方案中，从重组中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的表达产物中分离、由重组CHO细胞系产生、或者可由重组CHO细胞系表达或可从其中分离重组人胆盐刺激脂肪酶。将重组CHO细胞系表达系统用于产生此类脂肪酶可产生展现特定结构、活性或例如本文中描述一种或更多种其他特征性质的rhBSSL。作为非限制性实例，可使用与本文中实施例类似的或基本如本文中实施例描述的过程和/或展现特征来分离用于本发明的rhBSSL。
[0065] 在本发 明的某 些实 施方案 中，由国 际非专 有名称 (International Non-proprietary Name，INN)词干(stem)“bucelipase”标识重组人胆盐刺激脂肪酶(参见WHO Drug Information，21：62，2007)，例如因为其具有本文中示出的氨基酸序列。当参考SEQ ID.NO.1的重组人胆盐刺激脂肪酶用于本发明时在Cys64-Cys80和Cys246-Cys257位可具有一个或更多个二硫键(disulfide bridge)，和/或在Asn-187、Thr-538、Thr-549、Thr-559、Thr-576、Thr-587、Thr-598、Thr-609、Thr-620、Thr-631和Thr-642的一个或更多个可能的糖基化位点处糖基化(在一个此类的实施方案中，图1.1中图示)。在某些此类的实施方案中，rhBSSL是糖型(glycoform)并且可例如具有“布塞脂酶α(bucelipase α)”的INN。
[0066] 在本发明的另一些特定的实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶具有不同于天然人胆盐刺激脂肪酶(BSSL-MAM)的和/或与由从转基因绵羊的乳中的分离物产生的与BSSL-MAM不同形式的重组胆盐刺激脂肪酶(rhBSSL-OVI)(例如在WO99/54443中描述的)的结构、组成和/或其他特性。
[0067] 因此，在某些此类实施方案中，用于本发明的重组人胆盐刺激脂肪酶是(基本)不含其他乳蛋白质或乳组分。如基于本发明的公开将明显的是，在某些实施方案中，在向人婴儿施用之前将rhBSSL添加至基于乳的婴儿食物中。因此，在一些此类实施方案中，“不含其他乳蛋白质或乳组分”将应用至在将重组胆盐刺激脂肪酶添加至所述基于乳的婴儿食品前不久(例如紧接之前)存在的所述脂肪酶的形式、组合物或制剂。例如，在一些此类实施方案中，本发明的药物组合物或试剂盒组分(包含rhBSSL或准备用于添加至任何婴儿配方食品和/或巴氏消毒乳汁而提供的rhBSSL的量)不含此类基于乳的杂质。在某些此类实施方案中，rhBSSL不含乳的酪蛋白和乳清蛋白(例如乳铁蛋白)，或者不含对乳来说天然的其他杂质，尤其是其中此类乳来源蛋白质和其他杂质来源于人、绵羊或小鼠的乳。在这些实施方案中，“不含”任何特定此类蛋白质或杂质意指通过常规检测方法无法检测到实质量的此类蛋白质或其他杂质。或者，任何此类特定杂质可以以低于约5％例如低于约2％、1％、0.5％或0.1％的水平存在或者基本上或实质上缺乏，或者所有此类乳源蛋白质或其他杂质总体上以低于约5％例如低于约2％、1％、0.5％或0.1％的水平存在或者基本或实质上缺乏。如本领域技术人员将理解的，从细胞培养物例如从重组CHO细胞中产生和分离的重组人胆盐刺激脂肪酶将被认为“不含”此类基于乳的杂质。
[0068] 在本发明的另一些此类实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶具有大于约70％的纯度，例如大于约80％、90％或95％的纯度。在一些特定的实施方案中，此类百分比纯度是总体蛋白质的百分比纯度。如上所述，在一些可应用的实施方案中，纯度度量是在添加至任何婴儿食物或其他施用介质之前的含有所述脂肪酶之组合物的纯度度量。可通过RP-HPLC、SE-HPLC或SDS-PAGE(采用SyproRuby或银染色)技术确定此类纯度值。
[0069] 在本发明的另一些实施方案中，尤其是如果使用(表达自)重组CHO细胞产生重组人胆盐刺激脂肪酶，那么rhBSSL在用于本发明时可通过以下来表征：一个或更多个结构、活性或其他特性，例如以下描述的那些。
[0070] 在本发明的另一些此类实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶具有的(整体/总体)糖基化水平低于天然人胆盐刺激脂肪酶(BSSL-MAM)的糖基化水平和/或具有的(整体/总体)糖基化水平高于从转基因绵羊的乳中分离的重组人胆盐刺激脂肪酶(rhBSSL-OVI)的糖基化水平。可使用具有脉冲电流检测器的高pH阴离子交换色谱(high pH anion exchange chromatography with pulsed amperiometric detection，HPAEC-PAD)测量糖基化水平，例如BSSL(或其样品)的单糖和/或唾液酸含量的水平。在本发明的一些特定的实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶的总体单糖含量(摩尔单糖/摩尔rhBSSL)是约20至100、约25至65或约25至55，例如约40至45摩尔/(摩尔rhBSSL)，在本发明的某些实施方案中，rhBSSL的总体唾液酸含量(摩尔唾液酸/摩尔rhBSSL)是约20至35，例如约25至30摩尔/(摩尔rhBSSL)。
[0071] 在本发明的又一些此类实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶具有例如O-聚糖的糖基化模式，其不同于BSSL-MAM的和/或rhBSSL-OVI的模式。可使用采用激光诱导荧光检测器的毛细管电泳(capillary electrophoresis with laser induced fluorescence detection，CE-LIF)和/或HPAEC-PAD检测此类差异。在本发明的一些特定的实施方案中，rhBSSL可具有每摩尔rhBSSL约20至50摩尔的N-乙酰神经氨酸(N-acetyl neuraminic acid，NANA＝Neu5Ac)[摩尔/(摩尔rhBSSL)]，例如约25至40摩尔/(摩尔rhBSSL)。用于本发明的rhBSSL可具有每摩尔rhBSSL少于约5摩尔N-糖基神经氨酸(N-glycosyl neuraminic acid，NGNA＝Neu5Gc)，例如少于约2摩尔/(摩尔rhBSSL)，或者其中基本检测不到NGNA。用于本发明的rhBSSL可具有每摩尔rhBSSL少于约20摩尔岩藻糖，例如少于约10、少于约5、少于或约2摩尔/(摩尔rhBSSL)，以及在某些实施方案中基本检测不到岩藻糖。用于本发明的rhBSSL可具有每摩尔rhBSSL约5至25摩尔半乳糖胺，例如约10至
20或约15至18摩尔/(摩尔rhBSSL)。用于本发明的rhBSSL可具有每摩尔rhBSSL少于约10摩尔葡萄糖胺，例如少于约5、少于约3或约2摩尔/(摩尔rhBSSL)。用于本发明的rhBSSL可具有每摩尔rhBSSL约5至25摩尔半乳糖，例如约10至20或约15至18摩尔/(摩尔rhBSSL)。用于本发明的rhBSSL可具有每摩尔rhBSSL少于约5摩尔葡萄糖，例如少于约2摩尔/(摩尔rhBSSL)或其中基本检测不到葡萄糖。用于本发明的rhBSSL可具有每摩尔rhBSSL约2至8摩尔甘露糖，例如约4至6摩尔/(摩尔rhBSSL)。在本发明的一些特定的实施方案中，rhBSSL可具有关于如或基本如表1.1中所示的单糖和/或唾液酸的特征谱。
20或约15至18摩尔/(摩尔rhBSSL)。用于本发明的rhBSSL可具有每摩尔rhBSSL少于约10摩尔葡萄糖胺，例如少于约5、少于约3或约2摩尔/(摩尔rhBSSL)。用于本发明的rhBSSL可具有每摩尔rhBSSL约5至25摩尔半乳糖，例如约10至20或约15至18摩尔/(摩尔rhBSSL)。用于本发明的rhBSSL可具有每摩尔rhBSSL少于约5摩尔葡萄糖，例如少于约2摩尔/(摩尔rhBSSL)或其中基本检测不到葡萄糖。用于本发明的rhBSSL可具有每摩尔rhBSSL约2至8摩尔甘露糖，例如约4至6摩尔/(摩尔rhBSSL)。在本发明的一些特定的实施方案中，rhBSSL可具有关于如或基本如表1.1中所示的单糖和/或唾液酸的特征谱。
[0072] 在本发明的另一些实施方案中，用于本发明的重组人胆盐刺激脂肪酶与在凝集素结合或Lewis-抗原结合试验的特征谱或量(例如分别在Blackberg等(1995)和Landberg等(1997)中描述的那些测定和谱)上与BSSL-MAM和与rhBSSL-OVI不同。此类凝集素结合或Lewis-抗原结合试验可表明BSSL的这些不同形式之间的糖基化模式的差异。另一些技术可用于鉴定和/或表征可用于本发明的重组人胆盐刺激脂肪酶。例如，可通过下述方式表征rhBSSL(和/或与BSSL-MAM或rhBSSL-OVI相区分)：内切蛋白酶Lys-C消化，然后采用具有定量UV检测(214nm处)的反相HPLC分析所得肽，接着记录/检查所得色谱图。所得色谱图的差异可能是由于-因此还反映了-包含rhBSSL的特定肽的糖基化的独特性质，其具有特定的保留时间差异。
[0073] 在本发明的又一些此类实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶具有的分子量是90KDa至75KDa。在一些特定的此类实施方案中，所述脂肪酶的分子量是约84KDa至86KDa，例如约85KDa。可通过包括MALDI-MS在内的常规技术确定分子量。使用同一检测技术，通过比较，BSSL-MAM的分子量测量为显著较大(例如，约100KDa)并且rhBSSL-OVI的分子量测量为显著较小(例如，约78KDa)。
[0074] 在本发明的又一些此类实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶可包含具有不同氨基酸长度之序列的重组人胆盐刺激脂肪酶分子的群体。在某些此类实施方案中，与最长或(预测)全长形式(例如由SEQ ID.NO.1所示)相比，以C末端短1、2、3、4、5或多达10个氨基酸的形式存在的脂肪酶分子的量比以此类最长或(预测)全长形式存在的脂肪酶分子的量多了50％。在某些此类实施方案中，最长(或预测全长)脂肪酶分子的量的100％至500％是作为较短脂肪酶分子(例如从C末端短1或2个氨基酸)存在的量。在一些特定的此类实施方案中，最长(或预测全长)分子(例如由SEQ ID.NO.1所示)的量的200％至400％(例如约300％)是作为较短脂肪酶分子(例如从C末端短1或2个氨基酸)存在的量。在一些特定的实施方案或前述中，最长(或预测全长)所述脂肪酶分子的量的低于1％是作为短2个氨基酸的脂肪酶分子存在的量。在另一些实施方案中，以从C末端比最长(或预测)所述脂肪酶分子短1、2、3、4、5或多达10个氨基酸的形式存在是此类最长(或预测)分子的数目的2至5倍(例如约3倍)。
[0075] 在本发明的又一些此类实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶比从乳汁中分离的BSSL和/或rhBSSL-OVI具有更大的比活性。例如，rhBSSL的比活性可比BSSL-MAM和/或rhBSSL-OVI的比活性高约15％至35％，例如约20％或25％(基于质量)。测量人BSSL的比活性的技术将为本领域技术人员所知并且包括使用如本文实施例中通常描述的丁酸4-硝基苯酯(PNPB)测定。已知BSSL的其他体外测定，例如通过将阿拉伯树胶中乳化的甘油三油酸酯用作BSSL的底物和将胆酸钠(10mM)用作激活胆酸盐(例如，由Blackberg和Hernell，1981；Eur J Biochem，116：221-225描述的)。在一些特定的实施方案中，在测量比活性之前，例如可通过使用肝素亲和色谱法和尺寸排阻色谱法的技术将BSSL纯化至高纯度。
[0076] 如本领域技术人员将理解的是，用于本发明的重组人胆盐刺激脂肪酶可通过本文中描述或定义的多于一个显著性质来表征，例如上述那些。例如，2个或更多个(例如3、4、5或更多个)此类性质的组合可一起表征用于本发明的重组人胆盐刺激脂肪酶的一个特定实施方案。
[0077] 在本发明中，向人婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的量可以多种多样。在某些实施方案中，所述脂肪酶的量是有效量，例如当向根据本发明的婴儿施用所述脂肪酶时有效提高人婴儿之生长速度的量。可在任何给定天数中向婴儿施用的重组人胆盐刺激脂肪酶的合适量可以是1至100mg所述脂肪酶/Kg婴儿体重的每天的量。在一些特定的实施方案中，一天可施用5至50mg所述脂肪酶/Kg婴儿体重或15至40mg所述脂肪酶/Kg婴儿体重，例如每天每Kg体重婴儿施用约22.5至27mg所述脂肪酶。作为非限制性实例，以25mg/Kg/天剂量施用的1.5Kg婴儿每天可施用总体约37.5mg人胆盐刺激脂肪酶。在本发明的某些实施方案中，本文中使用或提及的rhBSSL的质量作为活性rhBSSL分子的质量给出，而不是作为绝对质量给出。因为rhBSSL的不同产品或贮存批次在酶活性上可变，所以可为了补偿此类活性变化而改变施用的rhBSSL的绝对质量并因此以提供更均匀量的活性rhBSSL。参考活性标准BSSL分子，可使用本文中描述的PNPB测定简单地确定rhBSSL的活性。活性rhBSSL的合适质量在上述给出的质量范围内。由于复合物蛋白质(例如rhBSSL)的分子量可变，例如由于糖基化的差异，所以所述脂肪酶的量可以以除质量以外的方式(例如(活性)摩尔量的方面)来定义。本领域技术人员将轻易地能够进行从特定的mg量到对应微摩尔量的其他转换。或者，重组人胆盐刺激脂肪酶的量可表示为酶活性形式的酶单位(U)，例如定义为在测定的条件(例如本文中描述的BSSL活性的体外测定中确定的)下每分钟催化形成1微摩尔产物的所述脂肪酶的量。
[0078] 如本领域技术人员将了解的，人婴儿通常(除非例如进行葡萄糖滴注)定期喂食含有脂肪来源(例如甘油三酯)的营养基础。可经口或经由管喂食向婴儿喂食营养基础。营养基础(食物或食品)通常是婴儿配方食品或人乳。因此，在本发明的某些实施方案中，向接受含有脂肪来源(例如甘油三酯)之营养基础的人婴儿施用重组人胆盐刺激脂肪酶。
在一些特定的此类实施方案中，所述营养基础是婴儿配方食品和/或巴氏消毒乳汁；本领域技术人员已知二者包含显著比例的甘油三酯形式的脂肪。在本发明的多个此类实施方案中，可在所述婴儿接受营养基础之前、之后或伴随其肠施用rhBSSL。如果在接受营养基础之前或之后施用，那么可在所述婴儿接受营养基础的约1小时内(例如约30分钟、15分钟或5分钟内)或者在婴儿接受营养基础的少于约2分钟的时间内施用rhBSSL。如果接受营养基础与施用rhBSSL之间的时间在约1分钟内，那么可实际认为向接受含脂肪的营养基础(例如婴儿配方食品和/或巴氏消毒乳汁)的所述婴儿伴随施用rhBSSL。如果将rhBSSL首先添加至婴儿配方食品或乳汁，之后向人婴儿喂食，那么将发生此类伴随(或共)施用。
在一些特定的此类实施方案中，所述营养基础是婴儿配方食品和/或巴氏消毒乳汁；本领域技术人员已知二者包含显著比例的甘油三酯形式的脂肪。在本发明的多个此类实施方案中，可在所述婴儿接受营养基础之前、之后或伴随其肠施用rhBSSL。如果在接受营养基础之前或之后施用，那么可在所述婴儿接受营养基础的约1小时内(例如约30分钟、15分钟或5分钟内)或者在婴儿接受营养基础的少于约2分钟的时间内施用rhBSSL。如果接受营养基础与施用rhBSSL之间的时间在约1分钟内，那么可实际认为向接受含脂肪的营养基础(例如婴儿配方食品和/或巴氏消毒乳汁)的所述婴儿伴随施用rhBSSL。如果将rhBSSL首先添加至婴儿配方食品或乳汁，之后向人婴儿喂食，那么将发生此类伴随(或共)施用。
[0079] 如通常已知的是，优选纯喂食来自婴儿自己母亲的新鲜乳汁。然而，出于许多原因，婴儿可喂食来自其他母亲(例如来自乳汁库)的巴氏消毒乳汁。或者，婴儿可喂食(如常见)替代或添加至(非新鲜)乳汁的婴儿配方食品。本文中别处描述了非胸喂(或停止胸喂)人婴儿的普遍性。可能由于一个或更多个原因，人婴儿不喂食其母亲的新鲜乳，而是这些替代物之一。例如：(i)母亲由于健康原因(例如之前的乳腺手术或催乳素缺乏)而可能不产生足够的乳汁；(ii)母亲可能患乳腺炎、湿疹或乳导管阻塞而使得胸喂疼痛；(iii)婴儿可能遭受口的疾患，例如唇颚裂(cleft lip or palate)；(iv)母亲可能没有足够的胸喂知识，可能不选择喂食新鲜乳汁，例如出于文化或便利的原因；或(v)母亲可能被建议不喂食她自己的新鲜乳汁以保护婴儿免受母亲自己乳汁的潜在有害组分，包括传播传染物(例如HIV病毒、CMV病毒、T细胞嗜淋巴细胞病毒或结核分枝杆菌)、危险药剂或药(或其代谢物)(例如来自使用非法药、逆转录病毒或化疗药治疗)，或者如果母亲经受放射治疗。最后，婴儿可能太虚弱不能胸喂，这可能是早产或体重不足婴儿的特定问题。
[0080] 因此，在本发明的某些实施方案中，人婴儿不纯喂食新鲜母亲乳，例如婴儿不纯喂食自己母亲的新鲜乳，例如通过纯胸喂或喂食新鲜挤出乳汁。不纯胸喂或不纯喂食其自己母亲之挤出(新鲜)乳汁来喂食的婴儿将接受其他来源(例如婴儿配方食品或者来自乳汁库的巴氏消毒和/或(之前)冷冻人乳)的乳。在本发明的一些特定的实施方案中，婴儿不喂食新鲜母亲乳，例如婴儿纯喂食婴儿配方食品、巴氏消毒和/或冷冻人乳(例如来自乳汁库)。这可根据出生而立即进行，即人婴儿从未接受其母亲的新鲜人乳或在出生后(例如出生的第一天、第二天、第三天、第四天、第五天或第六天内)很快不接受。在另一些实施方案中，人婴儿可在出生的约1周、2周或3周内或者出生的约1个月、2个月、3个月或多达6个月内停止喂食其母亲的新鲜乳。
[0081] 根据本发明可通过包括经口施用在内的多种方式肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶。例如，可使用糊剂、糖浆、药糖剂(electuary)、大丸剂(bolus)、粉剂、颗粒剂、酏剂、混悬剂、溶液或脂肪酶的其他液体形式进行施用。经口施用可包括口腔和舌下施用脂肪酶。肠施用的其他形式可包括这样的方法：直接将脂肪酶施用至胃肠道，例如通过使用胃造口管胃喂食直接施用至胃或使用十二指肠喂食管放入小肠。对于尤其矮小、早产或虚弱婴儿，此类基于管形式的施用可更实际或可需要用于施用根据本发明的重组人胆盐刺激脂肪酶。
[0082] 依据肠施用的特定方法，其中施用重组人胆盐刺激脂肪酶的制剂可有所不同。用于肠施用rhBSSL的液体剂型包括可药用乳剂、微乳剂、溶液、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除rhBSSL之外，液体剂型可包含一般用于本领域的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂(emulsifier)，以及其混合物。除惰性稀释剂之外，用于肠施用的组合物还可包含添加剂，例如润湿剂、乳化剂(emulsifying)和悬浮剂、填充剂以及稳定剂。除了本发明的一种或更多种活性抑制剂之外，混悬剂可包含悬浮剂。
[0083] 同时，用于对人婴儿肠施用的最合适的方式和制剂对于特定的环境可有所不同，施用重组人胆盐刺激脂肪酶的尤其合适的方式是经口或通过管喂食向所述人婴儿施用作为常规食物一部分的所述脂肪酶。因此，在本发明的一个特定的实施方案中，将重组人胆盐刺激脂肪酶首先添加至婴儿配方食品或添加至非新鲜(例如[之前]经巴氏消毒的)乳汁，之后向所述婴儿喂食。由此，向婴儿喂食该改良婴儿配方食品或改良非新鲜乳汁提供了所述脂肪酶的肠施用。该施用方式特别重要，因为其提供了基于乳的食物中所包含的脂质与(共)施用的rhBSSL在胃肠道中以相同的时间和位置存在。在本发明的某些特定的实施方案中，将重组人胆盐刺激脂肪酶例如通过在向所述婴儿喂食之前首先添加至婴儿配方食品来与配方食品(共)施用。婴儿配方食品可具有与本文中别处公开的类似或基本类似的组合物。
[0084] 如本领域技术人员将理解的是，通过使用配有适当奶嘴或乳头的奶瓶(以模仿天然乳头并因此提供更有效喂食)一般将向所述婴儿喂食通过添加重组人胆盐刺激脂肪酶而改良的配方食品制剂或(之前)经巴氏消毒的乳汁。或者，可使用其他方式喂食改良婴儿配方食品或改良非新鲜乳汁；例如，如果婴儿具有嘴畸形，例如可需要通过使用滴管、注射器、勺子或浸透的布。在某些实施方案中，例如极其体重不足、早产或虚弱婴儿，可经由胃管、胃造口管或十二指肠管直接喂食至胃肠道。
[0085] 在本发明的某些实施方案中，添加有重组人胆盐刺激脂肪酶的非新鲜乳汁是巴氏消毒乳汁。在另一些实施方案中，例如在巴氏消毒之后将乳汁冷冻。在一些特定的实施方案中，用于本发明的乳汁来自乳汁库。乳汁库可包括National Milk Bank(NMB)，收集捐赠乳汁、确保乳安全和质量并且使其可用于有需要之婴儿的全国性组织，或者1985年在北美洲成立的以对建立和操作乳库制定标准或促进其的非营利性捐赠人乳汁库协会Human Milk Banking Association of North America(HMBANA)。
[0086] 如本领域技术人员将了解的，尤其合适的是本发明所用乳汁为人乳汁。然而，在一些可替换的实施方案中，特别是具有较大婴儿的，从家养大型动物(例如母牛、绵羊、山羊或马)中获得乳汁。可在某些文化或国家中实施此类实施方案，所述文化或国家不总是喂食人乳汁或婴儿配方食品，而是可(至少部分地)采用从此类动物中获得的乳喂食人婴儿。此类乳可不包含足够的动物BSSL以在人婴儿中辅助脂肪酶消化-当然会不包含人BSSL-无论乳是否巴氏消毒。因此，乳汁在用于本发明的此类实施方案时可包括新鲜动物乳汁，即没有热处理和/或冷冻的乳。
[0087] 在本发明的又一个可替换的实施方案中，将重组人胆盐刺激脂肪酶添加至婴儿TM TM配方食品。技术人员将知道许多市售的婴儿配方食品，其包括Enfamil 、Pregestimil 、TM TM TM TM
Nutramigen 和Nutramigen AA (所有由Mead Johnson销售或制造)；Similac 、Isomil 、TM TM
Alimentum 和EleCare (所有由Abbott Laboratories，Ross division销售或制造)；世TM
界最大的配方食品生产商Nestlé：12％制造的GoodStart (由Nestle/Gerber Products TM TM
Company销售或制造)；Farexl 和Farex2 (由Wockhardt Nutrition销售或制造)。对于早产婴儿，其他婴儿配方食品例如Similac Neosure、Entramil Premature、Similac Special Care、Cow & Gate Nutriprem2和Entramil Enfacare对于含有脂质来源(其为脂肪酶(例如rhBSSL)的底物)的所有婴儿配方食品也是可用的。在一个特定的实施方案中，婴儿配方食品具有通常与Exhibit A所示规格或由ESPGHAN Coordinated International Expert Group推荐的规格一致或基本如其的组合物(添加rhBSSL之前)(Koletzko等，2005；J Ped Gastro Nutr41：584-599)。在某些实施方案中，婴儿配方食品包含以展示B(Exhibit B)所示近似水平的一种或更多种成分。在一些尤其有利的实施方案中，婴儿配方食品包含至少
0.5％(总体脂肪)的DHA和/或AA，并且在另一些此类实施方案中，其中AA的浓度应达到至少DHA的浓度，和/或如果添加二十碳五烯酸(eicosapentaenonic acid)(C20:5 n-3)，其浓度不超过DHA的含量。
Nutramigen 和Nutramigen AA (所有由Mead Johnson销售或制造)；Similac 、Isomil 、TM TM
Alimentum 和EleCare (所有由Abbott Laboratories，Ross division销售或制造)；世TM
界最大的配方食品生产商Nestlé：12％制造的GoodStart (由Nestle/Gerber Products TM TM
Company销售或制造)；Farexl 和Farex2 (由Wockhardt Nutrition销售或制造)。对于早产婴儿，其他婴儿配方食品例如Similac Neosure、Entramil Premature、Similac Special Care、Cow & Gate Nutriprem2和Entramil Enfacare对于含有脂质来源(其为脂肪酶(例如rhBSSL)的底物)的所有婴儿配方食品也是可用的。在一个特定的实施方案中，婴儿配方食品具有通常与Exhibit A所示规格或由ESPGHAN Coordinated International Expert Group推荐的规格一致或基本如其的组合物(添加rhBSSL之前)(Koletzko等，2005；J Ped Gastro Nutr41：584-599)。在某些实施方案中，婴儿配方食品包含以展示B(Exhibit B)所示近似水平的一种或更多种成分。在一些尤其有利的实施方案中，婴儿配方食品包含至少
0.5％(总体脂肪)的DHA和/或AA，并且在另一些此类实施方案中，其中AA的浓度应达到至少DHA的浓度，和/或如果添加二十碳五烯酸(eicosapentaenonic acid)(C20:5 n-3)，其浓度不超过DHA的含量。
[0088] 出于特定的原因，例如出于方便、安全和有效配送，可将重组人胆盐刺激脂肪酶添加至处于中央位置(例如在乳库)的大量(非新鲜)乳汁中，之后贮存和/或配送至婴儿。类似地，可将rhBSSL例如通过婴儿配方食品的制造商添加至大量的婴儿配方食品中，之后包装并配送(例如通过销售)至人婴儿的父母或护理提供者。当改良配方食品(包含rhBSSL)可作为干粉贮存和运送时，该特定实施方案具有特定效用。或者，并且尤其应期望婴儿特定剂量，可在喂食前不久以足够此类喂食的量或针对特定婴儿的特别比例和量将重组人胆盐刺激脂肪酶添加至婴儿配方食品或乳汁中。例如，可将适当量的rhBSSL添加至喂食之量的非新鲜乳汁或添加至婴儿配方食品中。
[0089] 本发明婴儿食物中的重组人胆盐刺激脂肪酶和其他组分的量之间的合适比例为：其中将所述脂肪酶添加到婴儿配方食品或(之前)经巴氏消毒的和/或经冷冻的乳汁至终浓度为约0.03至0.5g/L配方食品或乳。例如，可将所述脂肪酶添加至婴儿配方食品或非新鲜乳汁至终浓度为约0.05至0.3g/L配方食品或乳。在一些特定的实施方案中，将重组人胆盐刺激脂肪酶添加至终浓度为约0.1和0.2g/L配方食品或乳，例如约0.15g/L配方食品或乳。如将从某些较早实施方案的描述中了解的，可调整合适(绝对)浓度以提供活性rhBSSL的给定浓度(在上述给出的那些范围内的合适量)，和/或可替换地此类浓度可表示为(活性)摩尔(或微摩尔)量rhBSSL/单位体积乳(例如在所述乳中的所得的rhBSSL摩尔浓度(M))或者酶活性(U)/单位体积乳(例如U/mL)。在本发明的一些特定的实施方案中，以约15至300单位、约50至150单位rhBSSL/mL婴儿配方食品或乳(U/mL)、约80至
90或约87U/mL婴儿配方食品或乳，施用rhBSSL。
90或约87U/mL婴儿配方食品或乳，施用rhBSSL。
[0090] 在本发明的一些特定的实施方案中，人婴儿是体重不足人婴儿。人婴儿可以是出生时体重不足的，例如出生时称重低于2,500g的低出生体重(LBW)婴儿，出生时称重低于1,500g的非常低出生体重(VLBW)婴儿或以低于1000g出生的极其低出生体重(ELBW)婴儿。或者，体重不足婴儿可具有低出生质量(对于给定孕龄而言低于平均出生体重的婴儿)或小于孕龄(SGA)(对给定孕龄而言质量低于出生体重的百分之十)。或者，婴儿可因为不是以通常速率生长而体重不足，例如是发育滞后(failing to thrive，FTT)的婴儿。
[0091] 本文中别处描述了体重不足婴儿的多种可能的原因和发生率。尤其，婴儿常常因为早产而体重不足。但是，并非所有的早产婴儿都体重不足，早产婴儿尚未完全发育其胰腺和肝功能，并且可常常不与足月婴儿一样正常发育。因此，在本发明的另一个特定的实施方案中，所述人婴儿是早产人婴儿，即在持续约40周的正常妊娠之前出生的婴儿，或尤其是在妊娠约37周之前出生的婴儿。在某些此类实施方案中，所述早产人婴儿是在妊娠约37周至约32周出生的婴儿。在一些特定的此类实施方案中，所述早产人婴儿是在妊娠约32周至约25周出生的婴儿，或在妊娠约25周至约22周出生的婴儿。在另一些特定的此类实施方案中，所述早产婴儿是妊娠约37周之前但是21周、22周或23周之后出生的婴儿。
[0092] 如本领域技术人员将了解的，一般通过从母亲末次月经期(last menstrual period，LMP)开始计数来计算孕龄，但是在某些环境中，例如体外受精，可使用称为受精龄、胚龄、受孕计年龄或子宫内发育(intrauterine developmental，IUD)年龄的方法从怀孕的日期起计算孕龄。该方法使得婴儿出现的比如果通过更常用的LMP方法计算的妊娠晚2周。
[0093] 在本发明的一些特定的实施方案中，所述人婴儿是0至200天的产后年龄(postpartum age)。例如，基于出生当天，在出生1、2、3、4、5或6天内，或者出生后多达约6个月可首次施用重组人胆盐刺激脂肪酶。在某些此类的实施方案中，基于首次使用根据本发明的重组人胆盐刺激脂肪酶，所述人婴儿年龄小于4周，例如小于约3、2或1周的产后年龄。在另一些此类实施方案中，基于首次施用根据本发明的重组人胆盐刺激脂肪酶，所述人婴儿的年龄是约1至2个月或年龄是约2至4个月，例如年龄是约5个月。
[0094] 在本发明的某些实施方案中，一旦首次施用，在多于1天里至少每天一次(例如与至少一次喂食)施用重组人胆盐刺激脂肪酶。例如，根据本发明，可在持续至少约4天的时间里每天至少一次施用rhBSSL。在某些此类实施方案中，在至少约5天、例如在持续至少约7天的时间里至少每天一次(例如与至少一次喂食)施用重组人胆盐刺激脂肪酶。在一些特定的此类实施方案中，在任何给定天数中随大多数给予的喂食(或作为其一部分)向所述婴儿施用重组人胆盐刺激脂肪酶，例如每天约4至12次喂食，例如每天约4至10次喂食，例如每天约6、7或8次喂食。在另一个非限制性实施方案中，有时可在不(共)施用重组人胆盐刺激脂肪酶的情况下喂食婴儿(例如，每天1次、2次或3次)。在一些可替换的此类实施方案中，将重组人胆盐刺激脂肪酶与向婴儿给定的每次喂食(共)施用婴儿；即，对于每天的所有喂食向婴儿施用rhBSSL。
[0095] 在某些实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶的施用方案持续至少约1或2周的时间。在一些特定的此类实施方案中，所述时间是至少约3周，例如至少约4周。在本发明的一些可替换的实施方案中，施用重组人胆盐刺激脂肪酶，例如医学治疗过程的一部分，直到人婴儿转出重症监护，直到出院，直到不再医学护理或督导或者直到所述婴儿获得医学上可接受体重。
[0096] 如本领域技术人员将了解的，为了调查、监测、随访和/或检查生长速度的提高或者其他改善或增强，可通过任何常见或可接受方法监测人婴儿的生长。例如，为了本发明的目的，通过或可通过常规测量并记录(例如每天)头围、身体质量(体重)、体长或腿长(例如膝盖至足跟长度)来监测人婴儿的生长速度。通常已知测量人婴儿的尺寸和/或生长的其他方法。此类常规测量可容易转换成生长速度；即在单位时间(例如每天)中生长的量。在本发明的某些实施方案中，人婴儿之生长速度的所述提高是或测量为(或监测为)所述婴儿之体重增加速率的提高，例如表示为克/天的生长率，表示为克/Kg身重/天(g/Kg/天)的生长率，表示为克/天/100Kcal消耗量(g/天/100kcal)的生长率，或表示为克/天/100mL消耗乳/配方食品(g/天/100mL)的生长率。测量身体质量(体重)是特定便捷的监测婴儿生长的方法，，因为经同一时间较大婴儿通常比较小婴儿在体重上增加了较大的绝对量，所以力图对不同大小婴儿的绝对生长率进行归一化的用于表示生长率的第二方法(g/Kg/天)具有特定的效用。因此，在某些此类的实施方案中，施用rhBSSL时所述婴儿实现的、在其中观察到的或期望的体重增长的速率是约10至30g体重增加/Kg所述婴儿体重/天(g/Kg/天)。在一些特定的此类实施方案中，此类体重增长的速率是约15至25g/Kg/天，例如约20g/Kg/天或约18g/Kg/天。
[0097] 在本发明的另一些实施方案中，在施用重组人胆盐刺激脂肪酶的人婴儿中生长速度的提高比没有施用rhBSSL的人婴儿体重增长了1g/Kg/天至8g/Kg/天，例如约2、3、4或5g/Kg/天。在本发明的一个可替换的实施方案中，生长速度的提高为体重增加相比于没有施用rhBSSL的人婴儿之生长速度值高约5％至40％，例如高约10％至30％或约15％至
25％，包括约20％。
25％，包括约20％。
[0098] 如将了解的，人婴儿的体重可出于多种原因(包括与施用rhBSSL无关的那些)而每天波动。因此，不可每天通过所述人婴儿实现、在其中观察到或从其期望本文中所述作为每天量(或相对或百分比)的生长速度，并且可仅通过以下实现、在以下中观察到或从以下期望：如果经数天(例如经3、5或7天)或者经较长时间(例如2、3或4周)或者例如经在婴儿施用rhBSSL或接受医学护理(例如在NICU内)期间的时间测量或评估。
[0099] 在本发明的另一些实施方案中，生长的增加测量(或监测)为腿长的增加；例如膝盖至足跟长度的增加，如可表示为在单位时间(例如周)中的mm生长。在本发明的又一个实施方案中，相对于人婴儿自身的尺寸例如通过使用能够使得参考WHO全球儿童成长与营养不良数据库(Global Database on Child Growth and Malnutrition of the WHO)监测婴儿生长的婴儿体重-身高百分比(Weight-for-Height percentage，W/H％)或标准偏差(Standard Deviation，SD)分数(也称为Z分数)来监测其生长速度。
[0100] 如本文中别处描述的，本发明人观察到本发明-如通过两个对照临床试验示例并来自这两个实验的组合数据的分析-导致施用重组胆盐刺激脂肪酶的人婴儿的生长率提高，同时仅观察到如通过整体CFA(脂肪吸收系数(coefficient of fat absorption))测量的(即全部或最丰富)脂肪酸的整体吸收系数的有限增加。如在以下实施例内详细陈述的，相比于安慰剂在施用rhBSSL后，符合方案数据组(per-protocol data-set，PP)中的婴儿显示生长速度的统计学显著性提高(LS平均差异是2.08g/Kg/天；p＝0.019)，但是整体CFA较不明显且非显著性提高(LS平均差异是3.56％；p＝0.069)。在作用的相对(％)提高(在PP数据组)方面，与安慰剂的LS平均作用相比，施用rhBSSL使生长速度提高了13.8％(17.15相比15.06g/Kg/天)，但是整体CFA仅增加了5.4％(69.06相比65.50％CFA)。这样的观察结果在采用婴儿配方食品喂食的婴儿子集(PP)中更明显；显示出，与安慰剂相比，在施用rhBSSL后生长速度的高且统计上显著的提高(LS平均差异是2.30g/Kg/天；p＝0.038)，但是在整体CFA很少伴随(并且非显著)增加(LS平均差异是2.08％；p＝0.462)；以及与安慰剂的LS平均作用相比，在针对配方食品喂食婴儿的rhBSSL施用后，相对(％)增加使生长速度提高了14.9％(17.75相比15.45g/Kg/天)，但是总体CFA仅增加了3.1％(69.46相比67.38％CFA)。另外，并且也在本文中实施例内详细陈述，个体婴儿的生长速度的个体内差异(rhBSSL-安慰剂)与其对应的整体CFA的差异之间有非常
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低(非显著)的相关性(R 线性＝0.041；p＝0.177)，在生长速度的个体内差异中观察到的变化几乎对对应个体的整体CFA值增加的变化没有贡献(根据线性回归的ANOVA)。其他分析手段或方法可用于进一步调查和/或呈现来自本文中公开的两个临床试验的结果，包括调查和/或呈现这样的结果的分析手段或方法，该结果涉及施用重组胆盐刺激脂肪酶的婴儿的生长速度的提高和整体CFA的增加之间的有限伴随。
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低(非显著)的相关性(R 线性＝0.041；p＝0.177)，在生长速度的个体内差异中观察到的变化几乎对对应个体的整体CFA值增加的变化没有贡献(根据线性回归的ANOVA)。其他分析手段或方法可用于进一步调查和/或呈现来自本文中公开的两个临床试验的结果，包括调查和/或呈现这样的结果的分析手段或方法，该结果涉及施用重组胆盐刺激脂肪酶的婴儿的生长速度的提高和整体CFA的增加之间的有限伴随。
[0101] 本文中别处公开了测量生长速度的方法。可通过本领域中已知的多种方式调查、监测或观察脂肪吸收。例如，通过研究总脂肪酸的脂肪输入和脂肪排泄之间的脂肪平衡，其是通过使用脂肪酸的重量分析(例如Andersson &其同事(2007)使用的)定量的。或者，可使用气相色谱的方法(例如本文中实施例(Exemplification)描述的)进行各种脂肪酸的定量。Sidisky &其同事(1996；The Reporter[Supelco/Sigma-Aldrich]，15(1)：1-4)描述了多种毛细管柱的特性以辅助选择合适的柱用于分离并因此检测关键脂肪酸甲酯。通过对各种脂肪酸(例如以下实施例中详细描述的)的值的适当求和，脂肪吸收的程度可定量地表示为对于任何个别、类似或相关脂肪酸的亚组或者对于全部/整体脂肪酸的脂肪吸收系数(CFA)。如其他的方法实例，对于个体人婴儿(或其组)，可例如通过分析随时间或在治疗期间血浆或血红细胞膜磷脂的绝对或相对脂肪酸含量来调查、监测、追踪和/或检查脂肪酸吸收(例如DHA或AA的吸收)的改善(Carlson等，1996；Pediatr Res，39：
882-888；Boehm等，1996；Eur J Pediatr155：410-416)，包括使用色谱(GC)分离各种脂肪酸，然后例如通过使用质谱鉴定/定量。
882-888；Boehm等，1996；Eur J Pediatr155：410-416)，包括使用色谱(GC)分离各种脂肪酸，然后例如通过使用质谱鉴定/定量。
[0102] 从本文中公开的临床试验还注意的是，尽管生长速度的平均提高与其他婴儿生长研究的相当(例如，参见Andersson等，2007)，但是观察到的平均整体CFA值(在PP数据组中平均整体CFA：rhBSSL为69.08％和安慰剂为65.66％)比在其他婴儿CFA研究(对于综述，参见Lindquist和Hernell，2010)中通常观察到的值更低。然而，个体婴儿的整体CFA值的变异(在PP中的标准差：rhBSSL是14.68％，安慰剂是16.13％和个体内差异是13.19％)通常符合在其他婴儿CFA研究中通常观察到的那些值(Williamson等，1978；Morgan等，1998；Acta Paediatr87：318-324；Andersson等，2007)。已知BSSL为宽谱(broad spectrum)脂肪酶，其可水解许多类型的脂质和脂质样分子(对于综述，参见Lindquist和Hernell，2010)，因为婴儿可用的超过一半的能量来自水解乳中含有的脂质，所以本领域技术人员可期望最显著的结果是整体CFA的增加-并且生长速度的任何提高不与整体CFA的增加一样显著(因为期望强烈地依赖于整体CFA的增加)。
[0103] 因此，在本发明的某些实施方案中，在所述人婴儿中没有观察到和/或实现整体脂肪吸收系数(即对于全部或最丰富脂肪酸)的伴随增加的情况下如此实现、观察到或期望在所述婴儿中实现、观察到或期望的生长速度提高。在本发明的一些特定的此类实施方案中，所述生长速度的提高不伴随、表明和/或关联整体脂肪吸收系数(即对于全部或最丰富脂肪酸)的增加。在另一些特定此类实施方案中，生长速度的提高可不完全解释为(或归因于)整体CFA的增加。例如，整体CFA的提高可少于可引起的(例如积极地、卡路里上、数目上(例如通过百分比提高)或统计上引起的)生长速度的提高。
[0104] 在本发明的另一些实施方案中，施用重组人胆盐刺激脂肪酶的人婴儿的整体CFA(即全部或最丰富脂肪酸)的任何差异相比于没有施用rhBSSL之人婴儿的绝对整体CFA的任何提高小约5％个百分点，大了例如低于约4％、3％、2％或1％个百分点。在本发明的一个可替换的实施方案中，施用rhBSSL之人婴儿的整体CFA的任何相对提高是这样的值：小于未施用rhBSSL之人婴儿的CFA值的约106％，例如小于未施用rhBSSL之人婴儿的绝对CFA值的约105％、104％、103％、102％或101％。
[0105] 在本发明的另一个特定的实施方案中，施用重组人胆盐刺激脂肪酶之人婴儿的生长速度与未施用rhBSSL之人婴儿的生长速度相比的相对提高(例如百分比提高)大于施用rhBSSL之人婴儿的整体CFA(即全部或最丰富脂肪酸)与未施用rhBSSL之人婴儿的整体CFA相比的相对提高(例如百分比提高)。在某些此类实施方案中，施用rhBSSL之人婴儿的生长速度的相对提高(与未施用rhBSSL之婴儿相比)是施用rhBSSL之人婴儿的整体CFA(即全部或最丰富脂肪酸)(与未施用rhBSSL之人婴儿的整体CFA相比)的相对提高的约10倍，例如约5倍、3倍或2倍。例如，在一个特定的非限制性实例中，施用rhBSSL之人婴儿的生长速度的相对提高可以是约15％(与未施用rhBSSL之婴儿的绝对生长速度相比)，但是在施用rhBSSL之人婴儿中的整体CFA的相对增加可以仅为约3％(与未施用rhBSSL之婴儿的绝对CFA相比)。
[0106] 如本文中别处描述的是，遭受早产和/或LBW婴儿的一般病理状况是跨粘膜坏死(transmucosal necrosis，NEC)，其特征是粘膜和跨粘膜坏死和发炎，一般涉及末端回肠或结肠。炎症和粘膜完整性的丧失常常伴随肠壁破裂和败血症。尽管改进了该疾病的诊断和治疗，但是NEC仍然是在护理早产和LBW婴儿的托儿所中发病率和死亡率的主要原因(Foglia等，1995；Curr Probl Surg，32：757-823；Grosfeld等，1996；Surgery，120：650-656；Uceda等，J Pediatr Surg，30：1314-1316)。
[0107] 实验提示，乳-BSSL在婴儿中的重要性可能不仅仅是辅助脂肪酸的吸收。例如，Miller&Lowe(2008；J Nutr138：927-930)观察到，在CEL-(BSSL)缺陷小鼠中，只有在缺乏母乳和胰二者CEL(BSSL)产物时产生吸收不良；仅缺乏母乳CEL(BSSL)不影响膳食脂肪吸收的效率，并且甚至随着排泄脂肪的增加，CEL-(BSSL)缺陷小鼠幼兽具有正常的体重增加。另外并且尤其是，Howies及其同事(1999；Am J Physiol，277：G653-G661)推测-根据使用CEL-(BSSL)缺陷小鼠的实验-CEL(BSSL)可预防新生小鼠中的脂肪源肠损伤，尤其是由于过量脂质在远端小肠之上皮中的积累所引起的(还参见，Lindquist等，2007；J Pediatr Gastroenterol Nutr44：E335，as reported by Lindquist & Hernell，2010)。
[0108] 已经显示膳食脂肪影响肠上皮的形态和功能二者。数位调查人员发现，脂质在配方食品和乳中的类型和量显著影响了新生肠上皮的转运特性和渗透性以及肠上皮增殖和成熟的速率(Neu等，1987；Pediatr Res22：330-334；Udall等，1981；Pediatr Res.15：245-249；Weaver等，1987；Pediatr Res，22：675-678)。在跨粘膜坏死的新生猪模型中，Crissinger &其同事(Crissinger等，1994；Gastroenterology，106：1215-1222)表明，渗透性和肠损伤的程度直接与脂肪在各种新生配方食品中的存在和类型直接相关。还发现Luminal脂质加剧了NEC大鼠模型中的肠损伤(Bhatia等，1996；J Surg Res63：152-156)。
[0109] 实际上，在本文公开的临床实验中观察到，采用婴儿配方食品喂食的婴儿(在PP数据组中)(平均总脂肪暴露：对于rhBSSL是29.12g脂肪和对于安慰剂是28.50g脂肪)与采用喂食乳汁的婴儿(对于rhBSSL是19.00g脂肪和对于安慰剂是20.51g脂肪)相比在每次治疗期的食品示踪物标志物之间暴露更大量的总脂肪(并在其粪便中排泄更多的脂肪)[未对于体重的任何差异校正数据]。
[0110] 因此，在一个可替换的方面中，本发明还涉及一种用于保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤的方法，所述方法包括向所述婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的步骤。在一个相关方面中，本发明还涉及一种用于保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质之有害作用的方法，所述方法包括向所述婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的步骤。在另一个相关方面中，本发明涉及一种限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中积累的方法，所述方法包括向所述婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的步骤。在这些方面的某些实施方案中，所述人婴儿是早产婴儿，通过肠管或胃管喂食和/或喂食婴儿配方食品。
[0111] 在本发明这些方面的情况下，术语“保护”将为本领域技术人员所理解并且包括本发明这些方面的实施方案，其中施用所述脂肪酶预防或降低在所述婴儿中非期望作用的可能性、严重性和/或发生率。施用重组人胆盐刺激脂肪酶的保护作用或其限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中积累的作用还可得到人婴儿中另外的临床研究结果的支持。例如，可通过分析来自向人婴儿施用rhBSSL之临床试验的安全数据来调查婴儿之肠损伤的发生率或由其引起的死亡率-例如由坏死性小肠结肠炎或回肠穿孔引起的发生率或死亡率。在另一些临床研究中，可通过人婴儿的内窥镜、活组织检查或尸检分析来进一步调查在施用rhBSSL后的此类作用。在可替换的和较少侵入性的方法中，可通过追随指示性生物标志物来调查rhBSSL的这些有利作用，所述指示生物标志物例如可存在于人婴儿的血液或血浆中，并且所述标志物的存在/缺乏或水平/浓度与本文中列出的一个或更多个有害作用的开始、诊断、存在或严重性有关。还可使用其他医学技术(例如婴儿腹部的操作、婴儿的体温和/或行为/睡眠模式)监测此类有害作用的开始、诊断、存在或严重性。尤其，可通过腹部放射或使用Bell坏死性小肠结肠炎分期系统(Bell′s necrotizing enterocolitis staging system)(Bell等，1978；Ann Surg，187：1-7)诊断和/或评估-作为临床试验的一部分或作为医学检查的一部分-坏死性小肠结肠炎。或者，粪便样式、潜隐血的存在或特定病原体的存在可用作NEC风险的指示物，或者胃残留物可用作坏死性小肠结肠炎的预测物。
[0112] 本文中通过本发明人的公开-在向人婴儿施用重组人胆盐刺激脂肪酶的临床试验中，所述婴儿的生长速度比整体脂肪吸收系数(即全部或最丰富脂肪酸)的增加更加显著-表明除了rhBSSL的脂质消化机制之外的机制可以是解释此结果的因素。喂食婴儿配方食品的人婴儿与喂食乳汁的人婴儿相比暴露增加量的总脂肪，在施用rhBSSL后，人婴儿之生长速度的提高和其整体CFA的任何增加之间的不一致性更加明显。如临床试验(尤其在从婴儿配方食品中摄取更多脂肪的那些婴儿中)的这些数据提供的间接证据可支持的，向人婴儿施用重组人胆盐刺激脂肪酶可使得更多的脂质能够被消化-导致更少的不完全消化的和/或过量的脂肪/脂质，因此引起更少的对其下段肠(例如其下段肠的微绒毛)的损伤(由不完全消化的和/或过量的脂肪/脂质所引起)。更少损伤的肠将更能够吸收来自婴儿食品的除了脂肪酸之外的营养物，例如碳水化合物、蛋白质及其消化产物(包括单糖和氨基酸)。因此碳水化合物和蛋白质(以及脂肪也向人婴儿提供大部分能量需求)可在消化后更容易被吸收，因此这样的婴儿可显示出增加的生长(例如，由于通常更健康的下段肠)，所述增加的生长不能仅由rhBSSL消化TG和所得脂肪酸吸收的增加来解释。
[0113] 在本发明这些方面的某些实施方案中，向所述婴儿施用重组人胆盐刺激脂肪酶保护小肠粘膜免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质(来源于婴儿配方食品和/或来源于巴氏消毒乳汁)的有害作用。
[0114] 在本发明的另一些某些实施方案中，所述人婴儿喂食婴儿配方食品和/或巴氏消毒乳汁，并且在某些此类实施方案中，婴儿不喂食新鲜的母亲乳汁。
[0115] 在本发明的这些方面的一些特定的实施方案中，施用重组人胆盐刺激脂肪酶保护所述婴儿的空肠和/或回肠的粘膜(并且尤其保护婴儿的绒毛上皮)免受损伤。
[0116] 在本发明的另一些特定的实施方案中，施用重组人胆盐刺激脂肪酶保护所述婴儿的小肠粘膜免受粘膜和/或跨粘膜坏死和/或炎症。
[0117] 在另一个特定的实施方案中，施用所述脂肪酶保护所述婴儿免受某些病理状况，例如坏死性小肠结肠炎和/或回肠穿孔。在某些此类实施方案中，施用rhBSSL预防或降低在所述婴儿中坏死性小肠结肠炎和/或回肠穿孔的可能性、严重性和/或发生率。
[0118] 一贯地，NEC的诱发因素是早产、LBW和肠喂食，说明这些婴儿的未成熟肠粘膜不能承受与加工复杂饮食相关的压力(Kliegman等，1993；Pediatr Res34：701-708)。因此，在本发明这些方面的某些实施方案中(并且也对于本发明的另一些方面的某些实施方案)，通过肠(或胃)管喂食人婴儿。尤其，通过肠(或胃)管喂食的婴儿可以是早产和/或LBW出生的婴儿。
[0119] 如对于本领域技术人员来说十分清楚的，之前描述的一个或更多个任何实施方案-例如描述多种重组人胆盐刺激脂肪酶、剂量、施用方式和/或方案、婴儿亚群体以及施用rhBSSL可引起生长速度的提高和整体CFA有限增加-也可进一步表征本发明的那些保护性(或限制积累的)方法。例如，此类保护性(或限制积累)方法可使用从重组仓鼠卵巢细胞的表达产物中分离的rhBSSL，和/或可以以每天1至100mg所述脂肪酶/Kg婴儿体重的量施用，例如在婴儿配方食品中向妊娠约37周之前出生的早产婴儿施用。
[0120] 在本发明多个方面的某些实施方案中，在至少一种其他食品补充剂和/或乳强化剂之前、之后或伴随其施用重组人胆盐刺激脂肪酶。数种此类食品补充剂和/或乳强化剂被批准、销售或使用以帮助增加人婴儿生长或使人婴儿获益并且为本领域技术人员所公知。作为非限制性实例，此类食品补充剂和/或乳强化剂包括Nutriprem、Milupa、Eoprotin、Enfamil Human Milk Fortifier和Similac Human Milk Fortifier。在本发明的另一些实施方案中，在至少一种其他脂肪酶(例如另一种重组人脂肪酶)之前、之后或伴随其施用重组人胆盐刺激脂肪酶。
[0121] 在一些可替换的实施方案中，在不施用额外的食品补充剂和/或乳强化剂(例如本文中描述的或定义的那些)的情况下或不施用任何其他脂肪酶的情况下施用重组人胆盐刺激脂肪酶。
[0122] 如将了解的，可实施本发明的相对便利性-在一个实施方案中，仅通过将重组人胆盐刺激脂肪酶添加至婴儿配方食品用于向人婴儿经口喂食来施用-使得在没有医学干预、监督、支持或建议的情况下在婴儿家中实施本发明。例如，通常可作为膳食补充剂销售重组人胆盐刺激脂肪酶以协助婴儿生长或总体健康，例如以提高婴儿的生长速度(其中在培养上期望婴儿达到其自己的生长潜力)，用于保护对小肠粘膜的损伤或者用于限制不完全消化的和/或过量的脂肪/脂质的积累。如本发明的实施方案的又一个非限制性实例，可制造并配送已包含适当量rhBSSL的婴儿配方食品用于家用。因此，在某个方面中，本发明涉及一种用于提高人婴儿之生长速度的非医学方法，或涉及上述的一种保护性(或限制积累的)方法。
[0123] 或者，可通过合格的医务人员或者在医学干预、监督或建议下或具有医学干预、监督或建议(例如在医院或医疗诊所中，例如在护理体重不足、LBW和/或早产人婴儿的重症监护室中)来实施或指导实施本发明。因此，在此类一个可替换的方面中，本方法涉及一种用于提高人婴儿之生长速度的医学方法，或涉及上述的一种保护性(或限制积累的)方法的医学方法。在一个此类方面中，婴儿可以是有提高生长速度(例如体重)的医学需要，有保护对小肠粘膜之损伤的需要，或有限制不完全消化的或过量的脂肪/脂质之积累的需要，并且重组人胆盐刺激脂肪酶的量可以是治疗有效量。
[0124] 因此，在涉及以上的又一个方面中，本发明还涉及一种用于治疗遭受体重不足或早产之人婴儿的治疗性方法，所述方法包括向有医学需要的婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶。尤其需要此类医学干预的婴儿可以是小于孕龄(SGA)、低出生体重(LBW)婴儿、遭受发育滞后(FTT)的那些和/或在妊娠约37周之前出生的婴儿；在每种情况下如本文中别处描述的或定义的。或者，本发明的又一个方面还涉及一种或更多种治疗性方法，其用于(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；用于(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或用于(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累；在每种情况中所述方法包括向有医学需要的婴儿肠施用重组人胆盐刺激脂肪酶的步骤。
[0125] 为了实施本发明的某些实施方案，首先制备含有重组人胆盐刺激脂肪酶的婴儿食物是有用的。因此，在另一个方面中，本发明涉及一种制备含有rhBSSL的改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁的方法，所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁用于提高人婴儿的生长速度。在一些特定的实施方案中，此类方法包括以下步骤：
[0126] i.提供第一量的重组人胆盐刺激脂肪酶和第二量的未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁；以及
[0127] ii.将一定量的所述脂肪酶添加至所述未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁中，从而以形成改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，
[0128] 从而以形成改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其包含当通过如本文中别处描述的或定义的施用方案向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁时有效提高所述婴儿之生长速度之量的脂肪酶。
[0129] 在一个可替换的方面中，本发明还涉及与上述方法类似的方法，其中，分别地，改良婴儿配方食品或改良乳汁可用于以及其中rhBSSL量有效地用于：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
[0130] 在本发明的某些实施方案中，以适于贮存、配送和/或掺入本发明的改良婴儿配方食品或改良乳的形式提供重组人胆盐刺激脂肪酶。例如，在某些实施方案中，所述脂肪酶以冻干制剂形式提供。通常，所述脂肪酶的冻干制剂将在便利尺寸的容器中(例如小瓶(vial)中)提供，并且所述制剂可包含适当量的重组人胆盐刺激脂肪酶。在某些此类实施方案中，容器是无菌容器，其包括是无菌小瓶。当作为冻干制剂提供时，rhBSSL可在添加至婴儿配方食品或乳之前用例如无菌水溶解，或者可替换地，可直接在所述婴儿配方食品或乳中溶解rhBSSL的冻干制剂。
[0131] 出于方便或其他原因，例如出于无菌或安全，在本发明的某些实施方案中，所述重组人胆盐刺激脂肪酶以单位剂量提供。单位剂量可提供如在独立单位或容器中单次施用所需的足够的(或稍多的)rhBSSL。或者，少量此类独立单位或容器一起(例如2至5个此类独立单位或容器)提供了如单次施用所需的足够的(或稍多的)rhBSSL。在某些此类实施方案中，单位剂量形式包含1.5至75mg脂肪酶量的重组人胆盐刺激脂肪酶。在一些特定的此类实施方案中，rhBSSL的量是5至45mg，或约20mg所述脂肪酶。
[0132] 在另一个实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶以溶液形式提供。rhBSSL在此类溶液中的浓度可以是1.5至150mg/mL，并且在某些此类实施方案中可以是7.5至30mg/mL的浓度，例如约15mg/mL的浓度。
[0133] 在本发明的一些特定的实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶以组合物或药物制剂(例如冻干或溶液组合物)的形式提供，其包含一种或更多种可药用载体以及rhBSSL。合适的可药用载体(如果需要的话)将为技术人员所知并且包括本文中别处描述的那些。
[0134] 在本发明该方面的一些特定实施方案中，此制备包含rhBSSL之改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁的方法包括向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁(通过本发明如此制备的)从而通过肠施用向所述婴儿施用rhBSSL的另外步骤。在某些此类实施方案中，通过本文中别处描述的或定义的施用方案向所述婴儿喂食改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁。
[0135] 本发明人在本文中已公开了，包含rhBSSL的婴儿食物(配方食品或巴氏消毒乳汁)在含对照临床试验条件下显示出提高人婴儿之生长速度的作用。因此，在另一个方面中，本发明涉及改良婴儿配方食品，其包含有效提高人婴儿生长速度之量的重组人胆盐刺激脂肪酶；例如，当通过本文中别处描述的或定义的施用方案向所述婴儿喂食所述改良婴儿配方食品时。
[0136] 在此类方面的某些实施方案中，已经制备了用于喂食的改良婴儿配方食品。在另一些实施方案中，在向所述婴儿喂食之前将改良婴儿配方食品进行处理。例如，可将配方食品溶于水中和/或升温至例如37℃的适当温度用于喂食。在特定的此类实施方案中，改良婴儿配方食品以粉末或颗粒的形式提供，或者以即用型(ready-to-use)液体或者浓缩悬液或溶液的形式提供。
[0137] 在一个类似的方面中，本发明还涉及改良巴氏消毒乳汁，其包含有效提高人婴儿生长速度之量的重组人胆盐刺激脂肪酶；例如，当向所述婴儿喂食所述改良巴氏消毒乳汁时，在至少约4天中每天至少一次喂食、通过本文中别处描述的或定义的施用方案每天至少一次喂食。
[0138] 在此类方面的某些实施方案中，已经制备了用于喂食的改良乳汁。在另一些实施方案中，在向所述婴儿喂食之前将改良乳汁进行处理。例如，可将改良乳汁从冷冻状态解冻和/或升温至例如37℃的适当温度用于喂食。
[0139] 在另一些方面中，本发明还涉及：包含重组人胆盐刺激脂肪酶的改良巴氏消毒乳汁；包含重组人胆盐刺激脂肪酶的改良婴儿配方食品；包含重组人胆盐刺激脂肪酶的药物组合物；或涉及重组人胆盐刺激脂肪酶本身，在每种情况中用于：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。此类方面的一些特定实施方案在每种情况中用于：(V)保护所述婴儿的小肠粘膜免受粘膜和/或跨粘膜坏死和/或炎症；和/或(W)保护人婴儿免受坏死性小肠结肠炎和/或回肠穿孔，和/或预防或降低在所述婴儿中坏死性小肠结肠炎和/或回肠穿孔的可能性、严重性和/或发生率。在此类方面的某些实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶适于肠施用至所述婴儿。在所有此类方面的另一些实施方案中，所述人婴儿是通过肠(或胃)管喂食的和/或是早产出生的。
[0140] 在另一个方面中，本发明还涉及重组人胆盐刺激脂肪酶用于制造药物的用途，所述药物用于：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。此类方面的一些特定的实施方案在每种情况中用于：(V)保护所述婴儿的小肠粘膜免受粘膜和/或跨粘膜坏死和/或炎症；和/或(W)保护人婴儿免受坏死性小肠结肠炎和/或回肠穿孔，和/或预防或降低在所述婴儿中坏死性小肠结肠炎和/或回肠穿孔的可能性、严重性和/或发生率。在此类用途方面的某个实施方案中，重组人胆盐刺激脂肪酶适于肠施用至所述婴儿。在所有此类方面的另一些实施方案中，所述人婴儿是通过肠(或胃)管喂食的和/或是早产出生的。
[0141] 如从上述公开中对本领域技术人员来说将是明显的，较早描述的一个或更多个任何实施方案-例如描述多种重组人胆盐刺激脂肪酶、剂量、施用方式和/或方案、婴儿亚群体以及rhBSSL的施用可引起生长速度的提高和整体CFA的有限增加-也可进一步表征本发明的这些组合物和/或用途方面。例如，此类组合物和/或用途可使用从重组仓鼠卵巢细胞的表达产物中分离的rhBSSL，和/或可以以每天1至100mg所述脂肪酶/Kg婴儿体重的量施用，例如在婴儿配方食品中向妊娠约37周之前出生的早产婴儿施用。
[0142] 本发明的一个特定实施的方面涉及一种用于制备含有rhBSSL之改良婴儿配方食品或改良乳汁的试剂盒，所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁用于提高人婴儿的生长速度。在某些实施方案中，所述试剂盒包含以下组件：
[0143] a.至少一个第一容器，其包含第一量的例如冻干或溶液制剂形式的重组人胆盐刺激脂肪酶；和
[0144] b.至少一个第二容器，其区别于第一容器，所述第二容器包含第二量的未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁，
[0145] 其中所述脂肪酶与所述未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁各自分别为足以制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁的量，所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁分别包含有效提高人婴儿生长速度之量的所述脂肪酶；例如当通过本文中别处描述的或定义的施用方案向所述婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁时。
[0146] 在一个可替换的方面中，本发明还涉及与上述试剂盒类似的试剂盒，其中，分别地，所述改良婴儿配方食品或改良乳汁可用于以及其中一定量的rhBSSL有效用于：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
[0147] 在某些实施方案中，试剂盒还包含使用说明。此类使用说明可描述如何使用所述试剂盒或所述试剂盒的特定组件。例如，所述使用说明可描述以下步骤：
[0148] i.制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，例如通过将一定量重组人胆盐刺激脂肪酶添加至未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁中，从而分别形成改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁；
[0149] ii.向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁；例如通过本文中别处描述的或定义的施用方案。
[0150] 在该方面的另一些实施方案中，所述使用说明还描述了待施用重组人胆盐刺激脂肪酶的人婴儿是体重不足或LBW婴儿，早产出生的婴儿和/或通过肠(或胃)管进行喂食的婴儿。例如，婴儿可以是属于在本文中别处描述的或定义的体重不足或早产类别的婴儿。
[0151] 在另一个方面中，本发明涉及提高人婴儿之生长速度的方法，所述方法包括以下步骤：
[0152] i.制备或以其他方式提供改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其在每种情况中包含rhBSSL或者通过上述方法或使用上述试剂盒所制备；
[0153] ii.向所述婴儿喂食如此制备或以其他方式提供的改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁；和
[0154] iii.通过本文中描述的或定义的施用方案重复前述步骤。
[0155] 在一个可替换的方面中，本发明还涉及方法，其用于(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累；在每种情况中所述方法包括在前述方法中所述的三个步骤。
[0156] 本发明在本文中提供的用于医学或治疗应用的特定用途是又一个方面，其涉及以单位剂量的药物组合物，所述单位剂量包含0.1至100mg重组人胆盐刺激脂肪酶。单位剂量将容易为本领域技术人员所理解并且包括例如本文中别处描述的或定义的那些。在此类方面的某些实施方案中，单位剂量包含1.5至75mg rhBSSL。在一些特定的此类实施方案中，单位剂量包含5至45mg所述rhBSSL，例如约10、15、20或25mg所述脂肪酶。
[0157] 如从上述对酶量的讨论中将了解的，在本发明的某些实施方案中，可以以多种方式表示重组人胆盐刺激脂肪酶的单位剂量，包括以rhBSSL绝对质量的形式，或者以活性rhBSSL质量的形式。或者(或此外)，rhBSSL的量可以表示为酶单位(U)的形式。因此，在一些特定实施方案中，单位剂量包括约2,000至20,000单位rhBSSL(U)、约5,000至约15,000、例如约7,000至10,000单位rhBSSL的量。
[0158] 在本发明的某些实施方案中，药物组合物适于肠施用和/或适于施用至人婴儿，例如其中所述单位剂量尤其适于对人婴儿肠施用。例如，所述单位剂量是适于添加至或者制备成婴儿配方食品或乳汁食物之量和/或制剂的重组人胆盐刺激脂肪酶的冻干量、溶解量或冷冻量。在另一些实施方案中，可以以本文中别处描述的或定义的rhBSSL之形式、容器或量提供单位剂量。
[0159] 在另一个特定的方面中，本发明还涉及含有0.1至100mg重组人胆盐刺激脂肪酶的药物组合物，其中所述脂肪酶不是从转基因绵羊的乳中分离。
[0160] 如本领域技术人员现在将了解的，构成任何试剂盒或药物组合物或者用于任何方法的重组人胆盐刺激脂肪酶可以是本文中别处描述的或定义的任何重组人胆盐刺激脂肪酶。
[0161] 在一个相关方面中，本发明另外涉及包含药物组合物的经包装药用产品，所述药物组合物包含一定量的重组人胆盐刺激脂肪酶，其中所述经包装药用产品还包含描述以下步骤的使用说明：
[0162] i.制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其含有当在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次喂食向人婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁时有效提高所述婴儿生长速度之量的rhBSSL；和
[0163] ii.通过本文中描述的或定义的施用方案喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁来向人婴儿肠施用所述量的rhBSSL。
[0164] 在一个可替换的实施方案中，本发明还涉及类似的经包装药用产品，其中，其中的使用说明描述了步骤(i.)：制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁，其含有有效用于以下之量的rhBSSL：在在至少约4天中每天至少一次喂食、在至少约5天中每天至少一次喂食或在至少约7天中每天至少一次向所述婴儿喂食所述改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁的每种情况下，(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制在人婴儿回肠中不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的积累。
[0165] 在本发明的另一些实施方案中，经包装药用产品还包含婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁。所述婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁可包含在经包装药用产品中作为与重组人胆盐刺激脂肪酶分开的组分；即其可以是未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁。在一个可替换的此类实施方案中，经包装药用产品可包含已经含有重组人胆盐刺激脂肪酶的婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁；即其可以是改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁。在此类实施方案之一中，婴儿配方食品可以用于溶解的干燥颗粒或粉末形式提供，或者可以在合适容器中液体(以适当浓度或作为浓缩物)或冷冻样品的形式提供。
[0166] 在这些经包装药用产品的某些实施方案中，药物组合物是本文中别处描述或定义的药物组合物。
[0167] 在另一些某些实施方案中，经包装药用产品的使用说明描述了待施用重组人胆盐刺激脂肪酶的人婴儿确实遭受或应遭受体重不足、LBW、早产出生和/或通过肠(或胃)管喂食。例如，所述婴儿可遭受本文中描述的体重或早产抚养或适应症中的一种或更多种。
[0168] 在本发明的一些特定的实施方案中，经包装药用产品或试剂盒的使用说明描述了改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁或者重组人胆盐刺激脂肪酶用于、有效用于或已经显示/证明在临床试验中有效且安全地用于：(A)提高人婴儿的生长速度；和/或(B)：(X)保护人婴儿的小肠粘膜免受损伤；(Y)保护人婴儿的未成熟肠上皮免受不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质的有害作用；和/或(Z)限制不完全消化的和/或过量的脂肪和/或脂质在人婴儿回肠中的积累。
[0169] 关于本发明，在任何需要制备或提供改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁或者其包含描述此类制备或提供之使用说明的试剂盒或经包装药用产品的其方法中，在此类方面的某些实施方案中，可能需要在制备改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁之前解冻和/或溶解重组人胆盐刺激脂肪酶和/或未改良婴儿配方食品或未改良巴氏消毒乳汁。此类制备或提供可包括将重组人胆盐刺激脂肪酶添加至未改良婴儿配方食品(例如，提供为干燥预混料(dried-premix))或未改良巴氏消毒冷冻乳汁。在另一些实施方案中，此类制备或提供可包括首先将改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁解冻和/或将其升温至用于喂食人婴儿的适当温度，例如至37℃。在另一些实施方案中，首先将未改良冷冻母乳解冻，之后添加rhBSSL，接着，例如，如果所述脂肪酶以冻干粉末或颗粒形式提供的话，则进行溶解。
[0170] 如本领域技术人员将基于本文中本发明的公开所了解的，本发明的改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁或者试剂盒经包装药用产品、rhBSSL或药物组合物不必须为满足整个治疗方案之需要的数量、规格或量。例如，可从本发明的试剂盒或药物组合物制备新鲜数量的改良婴儿配方食品或改良巴氏消毒乳汁用于向人婴儿的每次施用，使得在治疗方案的过程期间使用多个试剂盒或药物组合物。
[0171] 应理解的是，鉴于本文中包含的教导，本发明对于特定问题或环境的教导的应用将在本领域技术人员的能力内。本发明的产品、组合物、包装或试剂盒以及用于其制备或用途的代表性方法或过程的实例在以下出现。
[0172] 本文中引用的所有参考文献、专利和出版物通过引用以其全部并入本文。实施例
[0173] 以下实施例(包括进行的实验和完成的结果)还举例说明了本发明的多种目前的特定实施方案，以及提供用于仅举例说明目的并且不解释为限制本发明。
[0174] 章节1：试验药产品的原料药、其特征和制备
[0175] 根据标准过程，通过由含有核酸表达系统(包含编码人BSSL的核苷酸序列)的重组中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞进行表达产生了具有SEQ ID.NO.1所示的预测氨基酸序列的原料药(人胆盐刺激脂肪酶)。简要地，从pS146中获得了编码包含前导序列(如Nilsson等，1990；Eur J Biochem，192：543-550描述的)的全长hBSSL的2.3KbcDNA序列(Hansson等，1993；J Biol Chem，268：26692-26698)并且将其克隆至表达载体pAD-CMV1(Boehringer Ingelheim)中-包含CMV启动子/SV40polyA信号(用于基因表达)和dhfr基因(用于选择/扩增)的基于pBR的质粒-以形成pAD-CMV-BSSL。之后，将pAD-CMV-BSSL用于转染DHFR阴性CHOss细胞(Boehringer Ingelheim)-与编码新霉素抗性的质粒pBR3127SV/Neo pA一起共转染以对遗传霉素(G418)抗性进行选择-以形成产BSSL的DHFR阳性CHO细胞。在表达较大数量rhBSSL的条件和规模下培养所得CHO细胞。
例如，在接种700L产品生物反应器(其中BSSL在分批进料过程中连续表达和产生)之前，解冻来自主细胞库(master cell bank，MCB)的细胞，使用无谷氨酰胺和葡萄糖(SAFC)的Ex-Cell302培养基，之后补充谷氨酰胺和葡萄糖，在摇瓶中扩增，然后在15和100L的生物反应器中培养。将培养物作为单一批次收获，经由多个下游步骤(包括离子交换色谱步骤)从细胞、细胞碎片和其他杂质中纯化成熟rhBSSL多肽(即没有前导序列)。可通过低pH处理和干热处理步骤对污染病毒灭活。对rhBSSL原料药(Drug Substance，DS)进行透析过滤(diafilter)并浓缩成适当制剂。配制后，将材料分成1至3个批次用于冻干和加热处理，从而产生1至3个DS批次。
例如，在接种700L产品生物反应器(其中BSSL在分批进料过程中连续表达和产生)之前，解冻来自主细胞库(master cell bank，MCB)的细胞，使用无谷氨酰胺和葡萄糖(SAFC)的Ex-Cell302培养基，之后补充谷氨酰胺和葡萄糖，在摇瓶中扩增，然后在15和100L的生物反应器中培养。将培养物作为单一批次收获，经由多个下游步骤(包括离子交换色谱步骤)从细胞、细胞碎片和其他杂质中纯化成熟rhBSSL多肽(即没有前导序列)。可通过低pH处理和干热处理步骤对污染病毒灭活。对rhBSSL原料药(Drug Substance，DS)进行透析过滤(diafilter)并浓缩成适当制剂。配制后，将材料分成1至3个批次用于冻干和加热处理，从而产生1至3个DS批次。
[0176] rhBSSL在该哺乳动物细胞表达系统中的生产产生了具有SEQ ID.NO.1所示之预测氨基酸序列和图1.1(也标示了潜在的糖基化位点)图示之结构的rhBSSL。
[0177] rhBSSL的该形式似乎展现了与人乳中发现的天然rhBSSL(BSSL-MAM)不同也与rhBSSL-OVI(从转基因绵羊中产生)不同的糖基化。例如，使用具有脉冲电流检测器的高pH阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)，确定所产生并用于本文所述临床试验的CHO来源rhBSSL(rhBSSL-CHO)的单糖和唾液酸糖基化水平，发现其具有的总体糖基化水平低于BSSL-MAM，但是高于rhBSSL-OVI(参见表1.1)。这些糖基化整体水平与每种形式BSSL的整体分子量相关联，通过MALDI-MS所确定的分子量为，rhBSSL-CHO是约85KDa，相比之下BSSL-MAM和rhBSSL-OVI分别是100KDa和78KDa。如表1.1所示，与rhBSSL-MAM和rhBSSL-OVI相比，rhBSSL-CHO的可能糖基化位点(尤其是O-聚糖)处糖基化(单糖和唾液酸)的模式或特征谱不同(使用具有激光诱导荧光检测器的毛细管电泳[CE-LIF])和/或HPAEC-PAD的检测)。
[0178] 表1.1：rhBSSL-CHO、rhBSSL-OVI和hBSSL-MAM的单糖和唾液酸含量[摩尔/(摩尔BSSL)]
[0179]
[0180] ＊当对rhBSSL-OVI材料中的葡萄糖胺进行分析时，在色谱图中看见小峰。然而，由于校准曲线的较大交叉点，因为如此低量计算为阴性值而没有报道该值，减去该值。估计的绝对/未校正值是1.8摩尔葡萄糖胺/摩尔BSSL。＊＊包含(绝对/未校正)葡萄糖胺的总和是12摩尔/摩尔BSSL。
[0181] rhBSSL-CHO与BSSL-MAM和与rhBSSL-OVI，不仅是糖基化的程度和分布不同，而且通过C端氨基酸序列(例如，通过内切蛋白Glu-C肽作图和使用液相色谱法串联电喷雾电离质谱(liquid chromatography in combination with electrospray ionization mass spectrometry[LC-ESI-MS-MS])的序列鉴定来确定)发现大部分脂肪酶分子比(预测)全长多肽分子短1(偶尔是2)个氨基酸。对于采用全长C端测序的每个分子，检测到具有最后氨基酸截短之C端的3个分子。小部分C端序列检测为截短最后2个氨基酸。例如，(近全长)脂肪酶分子的该群体的约25％是全长的，约75％短一个氨基酸以及小于1％短2个氨基酸。
[0182] 在rhBSSL-CHO与BSSL-MAM之间以及与rhBSSL-OVI之间观察到功能特性的差异。观察到rhBSSL-CHO的比活性比其他形式的BSSL更高。基于质量，BSSL-MAM和rhBSSL-OVI的比活性仅是rhBSSL-CHO的80％。在确定比活性之前，通过HA-HPLC和SE-HPLC特别地纯化每个样品。对于BSSL，使用丁酸4-硝基苯酯(4-nitrophenyl ester butyric acid，PNPB)作为底物并测定4-硝基苯酚的释放，来确定比活性。简要地，在具有0.1％BSA的PBS中制备rhBSSL的一系列稀释物(例如，20至160ng活性/mL)。将200μl这些rhBSSL溶液添加至25μl激活溶液(含有20mM在具有0.1％BSA之PBS中的胆酸钠(作为胆盐激活剂))。将这些溶液在分光光度计中于27℃预孵育5分钟。在临测量之前，添加25μl良好混合的含有5mM在PBS-Tween中PNPB的底物溶液。可通过在400nm处的吸光度检测
4-硝基苯酚的形成，并且在90秒期间测量吸光度的增加。使用rhBSSL参照标准品的标准曲线确定BSSL的活性量。
4-硝基苯酚的形成，并且在90秒期间测量吸光度的增加。使用rhBSSL参照标准品的标准曲线确定BSSL的活性量。
[0183] 从溶解于注射用水的冻干原料药中制备研究用药物产品。将溶液预过滤(10μm)，然后用注射用水调节至终(活性)浓度。通过0.22μm过滤器过滤产品，然后填充至预灭菌的10mL玻璃小瓶中。用无菌塞子(stopper)塞住小瓶并用铝盖密封。
[0184] 章节2：对来自rhBSSL的两个二期研究之组合数据的简短报告
[0185] 方案号：BVT.BSSL-020
[0186] EUDRACT号：2007-002423-33
[0187] 临床试验政府标识号：NCT00658905
[0188] 在32周孕龄之前出生的早产婴儿中1周治疗期间对添加至婴儿配方食品的0.15g/L rhBSSL与安慰剂进行比较的预期随机双盲交叉研究。
[0189] 和
[0190] 方案号：BVT.BSSL-021
[0191] EUDRACT号：2007-002434-10
[0192] 临床试验政府标识号：NCT00659243
[0193] 在32周孕龄之前出生的早产婴儿中1周治疗期间对添加至巴氏消毒乳汁的0.15g/L rhBSSL与安慰剂进行比较的预期随机双盲交叉研究。
[0194] 缩写列表
[0195] AA 花生四烯酸(Arachidonic Acid)
[0196] AE 不良事件(Adverse Event)
[0197] ANCOVA 协方差分析(Analysis of Covariance)
[0198] ANOVA 方差分析(Analysis of Variance)
[0199] BSSL 胆盐刺激脂肪酶(Bile-salt-stimulated Lipase)
[0200] CFA 脂肪吸收系数(Coefficient of Fat Absorption)
[0201] CRF 病历报告表(Case Report Form)
[0202] DHA 二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid)
[0203] FA 脂肪酸(Fatty acid)
[0204] FAS 全分析组(Full Analysis Set)
[0205] g 克(Gram)
[0206] ICH 国际协调会议(International Conference on Harmonization)[0207] kg 千克(Kilogram)
[0208] MedDRA 药事管理医学词典(Medical Dictionary for Regulatory Activites)[0209] mm 毫米(Millimeter)
[0210] N/A 不适用(Not Applicable)
[0211] PP 符合方案(Per-Protocol)
[0212] PT 优选术语(Preferred Term)
[0213] rhBSSL 重组人胆盐刺激脂肪酶(Recombinant human bile-salt-stimulated lipase)[0214] SAE 严重不良事件(Serious Adverse Event)
[0215] SAP 统计分析计划(Statistical Analysis Plan)
[0217] SD 标准差(Standard Deviation)
[0218] SOC 系统器官分类(System Organ Class)
[0219] TEAE 紧急治疗不良事件(Treatment-Emergent Adverse Event)[0220] TLF 表、数据列表和图(Tables，Data Listings，and Figures)[0221] 1介绍
[0222] 在早产婴儿中采用rhBSSL进行两个二期研究，研究BVT.BSSL-020和-021。在这两个研究中，主要目的是将使用在配方食品(研究-020)或巴氏消毒乳汁(研究-021)中施用的rhBSSL进行治疗后早产婴儿中的脂肪吸收(脂肪吸收系数，CFA)与采用安慰剂进行比较。次要目的是将使用在婴儿配方食品/巴氏消毒乳汁中施用的rhBSSL进行治疗后早产婴儿的身长和体重与采用安慰剂进行比较，以及研究rhBSSL当在婴儿配方食品/巴氏消毒乳汁中施用时的安全性。
[0223] 每个研究中的样品大小估算是基于在治疗期之间CFA单位的估计10％差异以及15％标准差，具有90％检验效能和5％显著水平。预计CFA的10％差异引起生长速度的
2g/kg/天差异。然而，没有研究期望具有足够的检验效能以证明改善生长，这是由于每个研究中的患者数目少(32)和治疗期短(1周)。因此，在分开的统计分析计划(statistical analysis plan，SAP)中描述了两个研究(主要目的是证明当在婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁中施用时与安慰剂相比采用rhBSSL治疗后改善了生长)的预定义组合分析。在两个研究任一的临床数据库的数据库锁定和破盲之前进行并完成组合数据的SAP。
2g/kg/天差异。然而，没有研究期望具有足够的检验效能以证明改善生长，这是由于每个研究中的患者数目少(32)和治疗期短(1周)。因此，在分开的统计分析计划(statistical analysis plan，SAP)中描述了两个研究(主要目的是证明当在婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁中施用时与安慰剂相比采用rhBSSL治疗后改善了生长)的预定义组合分析。在两个研究任一的临床数据库的数据库锁定和破盲之前进行并完成组合数据的SAP。
[0224] 另外，也已经进行了一些事后分析(post hoc analyse)(没有在任何SAP中描述)并在这里报道。
[0226] 这两个研究均根据ICH GCP指导方针和赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)进行。这两个试验均通过适当的独立伦理委员会(Independent Ethics Committee)批准并且所有包括的患者的监护人均签署了知情同意书。
[0227] 2组合分析的分析目的
[0228] 2.1主要目的
[0229] 组合分析的主要目的是证明当在婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁中施用时与安慰剂相比采用重组人胆盐刺激脂肪酶(rhBSSL)治疗后改善生长。
[0230] 2.2次要目的
[0231] 次要目的如下：
[0232] ·证明在早产婴儿中当在婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁中施用时与安慰剂相比采用rhBSSL治疗后改善脂肪吸收。
[0233] ·比较在早产婴儿中当在婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁中施用时采用rhBSSL治疗与安慰剂治疗后的膝盖至足跟长度。
[0234] ·评估在早产婴儿中当在婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁中施用时rhBSSL的安全性和耐受性。
[0235] 3研究设计
[0236] 两个研究的研究设计和程序除了喂食方案(配方食品用于研究BVT.BSSL-020和巴氏消毒乳用于研究BVT.BSSL-021)之外均相同，因此来自两个研究的数据的组合是合适的。每个研究计划招募32位患者以获得26位可评估的患者。
[0237] 在最初7天里将患者随机化地给予补充有0.15g/L终浓度之rhBSSL的婴儿配方食品/巴氏消毒乳汁或者给予“补充”有无菌注射用水(作为安慰剂)的婴儿配方食品/巴氏消毒乳汁。在2天的清除期后，在第二个7天治疗期期间将患者“交叉”用于另一个治疗方案。在每个治疗期的最后3天(72小时)期间进行CFA评估粪便样品收集。
[0238] 在满足全部的纳入标准并且没有排除标准后，在新生儿重症监护室招募并随机化患者至这些研究中。在020研究中，招募之前接受其他婴儿配方食品的婴儿在招募当天从其当前配方食品转换成研究配方食品。在021研究中，对于接受除了Eoprotin之外的乳强化剂的患者，要求在首次服药之前至少2天中止乳强化剂和/或转换成Eoprotin。
[0239] 研究设计示于图2.1中。
[0240] 以下在表2.1中提供研究评估的计划表。
[0241] 表2.1.研究评估计划表
[0242]
[0243] ＊访问1和访问2可同时进行。在研究药施用之前在CRF中进行并记录所有的基线评估。
[0244] ＊＊从出现第一染料开始进行粪便收集并持续直到第二染料出现。不收集含有第二标志物的粪便。
[0245] ＊＊＊摄入研究配方食品或乳持续到在粪便中出现第二染料。
[0246] #仅在常规护理内可用时记录。不获取额外血液样品或ECG用于研究。
[0247] ##如果需要，访问17延长超过第16天，直到第二示踪物染料出现。
[0248] ###每天收集生命体征直到第二染料出现
[0249] 4患者选择
[0250] 选择用于这些研究的患者是32周孕龄之前出生的婴儿并且其在招募时为≤32周零6天的妊娠期(推测年龄)。在这些研究中招募的婴儿不接受肠外营养物(除了葡萄糖)。
[0251] 4.1纳入标准
[0252] 为了纳入本研究，患者必须满足以下标准：
[0253] 1.妊娠32周之前出生的早产婴儿并且其在招募时为≤32周零6天的妊娠期(推测年龄)
[0254] 2.适于孕龄的早产婴儿(每个站点应使用其自己的生长曲线或程序并且在调查人员的文件中保留所使用的曲线或程序的拷贝。同一生长曲线在一个站点应用于所有患者)
[0255] 3.其母亲不打算提供乳汁的接受婴儿配方食品的早产婴儿
[0256] 4.接受经口或肠营养物(奶瓶或鼻管)的早产婴儿
[0257] 4.2排除标准
[0258] 存在任何以下条件将从本研究的纳入中排除患者：
[0259] 1.接受肠外营养物(除了葡萄糖)的患者
[0260] 2. 对 于 BvT.BSSL-020：接 受 乳 强 化 剂 ( 例 如，Enfamil、Nutriprem、)的婴儿
[0261] ·另外，如果在首次服药之前2天中止使用强化剂，那么可招募接受乳强化剂的合格婴儿
[0262] 对于BVT.BSSL-021：接受除了 之外的乳强化剂(例如，Enfamil、Nutriprem)的婴儿
[0263] ·另外，如果在首次服药之前2天中止使用强化剂，那么可招募接受除之外的乳强化剂的合格婴儿；
[0264] 3.需要机械通气(mechanical ventilation)的婴儿
[0265] 4.小于其孕龄(SGA)的婴儿
[0266] 5.需要≥30％O2的婴儿
[0267] 6.接受光疗(可承认具有完整光疗等的有本研究资格的婴儿)的婴儿
[0268] 7.患有严重脑疾病的婴儿，包括III或IV级脑室周围或脑室内出血、脑膜炎或脑积水、III或IV级颅内出血、脑室周围白质软化
[0269] 8.可影响生长和发育的严重畸形和先天异常
[0270] 9.患有血流动力学显著动脉导管未闭(persistent ductus arteriosus，PDA)的婴儿
[0271] 10.败血症的临床证据(包括低或高白细胞计数和/或低血小板计数，以及细菌学证明的系统感染证据)
[0272] 11.记录的先天性感染(例如CMV)
[0273] 12.存在坏死性小肠结肠炎
[0274] 13.出血性肺事件
[0275] 14.采用皮质类固醇(氢化可的松除外)的在先或伴随治疗
[0276] 15.据调查人员认为使得患者不适于纳入的任何条件
[0277] 16.从筛选访问2天内至完成随访期间招募到另一个并行临床研究中
[0278] 4.3从治疗或评估中移除对象
[0279] 在调查人员看来，如果是医学需要必需或如果患者父母或法定监护人期望，那么患者从研究药中退出。对于从治疗中退出的其他原因可包括以下：
[0280] ·不正确进入研究
[0281] ·主要方案违反
[0282] ·不良事件
[0283] 5治疗
[0284] 5.1施用治疗
[0285] 所给予的配方食品或乳的量是基于每天早晨在CRF上记录的患者体重。rhBSSL在配方食品或巴氏消毒乳汁中的浓度以0.15g/L保持恒定。患者依赖于随机化时间表接受具有或没有rhBSSL的配方食品(研究020)或巴氏消毒乳汁(研究021)，共7天。当患者分配至安慰剂时，将匹配量的无菌注射用水(water for injection，WFI)添加至没有rhBSSL的巴氏消毒乳汁。在CRF上记录每天给出的配方食品/乳的量。
[0286]
[0287] ＊婴儿每天接受约150至180mL乳/kg体重。对于以特定婴儿为基础的mL/kg的喂食量对于两个治疗期保持恒定。
[0288] 5.2研究用产品的身份
[0289] 如实施例的章节1(上述)所述，制备重组人BSSL原料药和研究用药物产品(investigational medicinal product，IMP)。
[0290] 在10mL玻璃小瓶中以冷冻经口溶液的形式递送重组人BSSL。强度为15mg/mL和填充体积为1.3mL。研究药物冷冻贮存(-25℃至-15℃)于研究中心中未授权人员无法进入的地方。
[0291] 施用前，使冷冻溶液解冻并且将0.9mL等分试样的rhBSSL溶液转移至90mL配方食品(研究020)或巴氏消毒乳汁(研究021)以在食物中给出0.15g/L的终浓度。以同一方式制备安慰剂配方食品/或乳，其中用0.9mL无菌水替代rhBSSL溶液。
[0292] 两批IMP用于这两个研究。
[0293] 在整个研究021(乳汁)中，仅允许添加强化剂 作为补充剂；然而，的量必须在治疗期间保持恒定。
[0294] 5.3浓度选择
[0295] 基于在乳汁中正常存在的0.1-0.2g/L的水平选择待添加至巴氏消毒乳和配方食品的rhBSSL的浓度。
[0296] 5.4盲性
[0297] Biovitrum指定人员将随机化时间表保存在安全的闭锁处，并且不会透露给任何医院人员、调查人员、Biovitrum人员或父母，直到数据库已完成锁定。由不了解治疗分配并且未参与患者评估的药剂师或指定人员将rhBSSL/安慰剂添加至配方食品或巴氏消毒乳汁。
[0298] 5.5在先和伴随治疗
[0299] 根据研究人员的判断可给予认为对患者利益来说必需的其他治疗。所有此类治疗都在CRF上记录。在研究期间禁止伴随施用肠外营养物(除葡萄糖除外)、乳强化剂(在研究021中除了Eoprotin之外，如上述)(首次服用研究药物2天至最后服药后2天内)、皮质类固醇(氢化可的松除外)。在研究中，没有其他药物与研究药物伴随使用。患者不允许同时参与另一个临床研究。
[0300] 早产婴儿常常经历需要治疗干预的并发症。只要药物不干涉喂食即可接受。如果伴随药物导致需要肠胃外喂食，那么患者将退出研究。类似地，影响肠内营养物之吸收的并发症的发生(例如坏死性小肠结肠炎或腹阻塞(abdominal obstruction))要求患者停止参与该研究。
[0301] 在72小时的粪便收集期间禁止使用用于治疗皮肤刺激的膏剂。在72小时的收集期期间频繁更换尿布以保持皮肤干燥。患有严重导致中止粪便收集的皮疹的患者将退出本研究。
[0302] 6对组合数据分析的研究评估
[0303] 6.1在每个研究中的效能评估
[0304] 6.1.1体重
[0305] 每天使用称以克计记录患者的体重并且精确度为至少+/-5克，然后记在CRF上。尽可能每天在约同一时间测量体重。
[0306] 6.1.2样品收集
[0307] 在研究BVT.BSSL-021中，在第4-7天和第13-16天在添加rhBSSL或安慰剂之前取得乳汁等分试样。
[0308] 在每次治疗期将结束的72小时中在对应于脂肪(即，配方食品或乳)摄取的时间进行用于确定CFA的粪便收集。将为每个站点提供的尿布用于粪便收集。在两个治疗期期间，分别在第4天和第13天，将胭脂红示踪物染料作为标志物与食物(约在下午)一起给予，然后在粪便中出现第一胭脂红标志物时开始收集粪便。收集合有第一标志物的粪便并在CRF上记录收集的第一粪便的日期和时间。在施用第一红标志物之后72小时，给予第二胭脂红标志物，并且持续粪便收集，直到第二胭脂红标志物出现。不收集含有第二标志物的粪便，但是在CRF上记录第二标志物出现的日期和时间。在尿布更换前和移除后进行称重并且在CRF上记录体重的差异。还在CRF上记录每次收集时间和整个收集期耗去的时间。在粪便收集期间禁止使用用于治疗皮肤刺激的膏剂。在收集期期间频繁更换尿布以保持皮肤干燥。患有严重导致中止粪便收集的皮疹的患者将退出本研究。在单独的实验室手册中提供特定的收集方法。如果可行，称重来自两个治疗期之粪便收集期的呕吐物。称重小的布/亚麻制品(linen)并放置在每个婴儿的头下。当布/亚麻制品被呕吐物弄脏时，将其移除并再称重。如果使用额外的布从婴儿移除呕吐物，那么也在使用前后称重该布。在CRF上记录呕吐物的重量(总重量减去布/亚麻制品的重量)。测量所有其他的食物损失(例如，瓶中留下的配方食品或乳)并且计算该量占每次喂食时消费的配方食品之体积。
[0309] 收集在每个收集期期间使用的所有尿布和餐巾纸。将它们置于密封袋中，标记患者ID以及日期和时间，并贮存在-20℃直到运送至分析实验室。
[0310] 6.1.3样品分析
[0311] 由中心实验室分析粪便样品、配方食品(研究020)和乳等分试样(研究021)。在通过Folch方法提取之后通过气相色谱法在粪便和食物中定量各个脂肪酸(包括长链多不饱和脂肪酸DHA和AA)。在这两个研究中，使用Omegawax250柱(Supelco)分离脂肪酸。然而，由于DHA与神经酸(C24:1)(仅存在于乳汁)共洗脱，所以为了对来自研究021的那些样品的DHA进行定量，还使用SP-2380柱(Supelco)分析来自研究021的符合方案分析组之患者的样品。该柱提供了DHA和C24:1的良好分离，但是较不适于整体分离配方食品和乳中的其他脂肪酸；因此，使用(分开地)SP-2380柱(对于DHA)和Omegawax250柱(对于全部其他脂肪酸)分离和分析来自研究021(乳汁)之这些样品的各个脂肪酸。总脂质计算为各个脂肪酸的总和(参见章节7.5.1)。同一分析原理用于确定在本研究中使用的各批次配方食品和各份乳汁中的脂质。
[0312] 6.1.4膝盖至足跟长度
[0313] 使用为站点提供的膝高测量器(knemometer)从膝盖至足跟测量患者腿的长度。在CRF上以毫米记录膝盖至足跟的长度。尽可能在每天的约同一时间并且通过同一人测量长度。进行三次测量并且在CRF上记录平均值。
[0314] 6.2安全评估：不良事件
[0315] 每个研究中的不良事件(adverse event，AE)报告期从施用研究用药物的第一剂(第1天)开始到随访(最后研究药物摄取最后一剂之后的1周±3天)结束。不论事件是否被认为与药物/产品相关，对不良事件报告期期间患者中发生的所有AE进行报告。另外，在AE报告期之后发生的任何已知不幸事件(调查人员评估为与试验产品可能、大概或明确有关)也被报告为AE。
[0316] 7统计方法
[0317] 7.1分析群体
[0318] ·安全性分析组：全部随机化患者，所述患者接受至少一个剂量的随机化研究药物(rhBSSL或安慰剂)。使用安全性分析组进行安全性变量的分析。
[0319] ·全分析组(Full Analysis Set，FAS)∶所有随机化患者，所述患者接受至少一个剂量的随机化研究药物，并且在两个治疗期中具有基线和至少一次基线后重量估计。
[0320] ·按方案分析组(Per-Protocol Analysis Set，PP)∶在FAS中包括的所有患者，所述患者具有合理的依从性并且没有其他主要的方案违反。
[0321] 在各自研究的数据库锁定和破盲之前进行对每个研究内PP分析组合格的患者的评估。对于FAS和PP二者，组合数据组确切包括与各自研究中的相同患者。
[0322] 7.2组合分析的统计学目的
[0323] 7.2.1主要有效性目的和假设
[0324] 分析对来自两个研究之组合数据的主要目的是证明当在婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁中施用时与安慰剂相比采用rhBSSL的治疗改善了生长。
[0325] 零假设预先假定治疗之间生长速度没有差异。可替换的假设如下：当在婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁中施用时与安慰剂相比rhBSSL改善了生长速度。
[0326] 7.2.2次要有效性目的
[0327] 分析对来自两个研究之组合数据的次要有效性目的如下：
[0328] ·以证明在早产婴儿中当在婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁中施用时与安慰剂相比采用rhBSSL治疗改善脂肪吸收。
[0329] ·以比较在早产婴儿中当在婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁中施用时采用rhBSSL治疗与安慰剂的膝盖至足跟长度。
[0330] 关于CFA，零假设预先假定在治疗之间没有差异。可替换的假设如下：当在婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁中施用时与安慰剂相比rhBSSL改善了脂肪吸收。
[0331] 关于膝盖至足跟长度没有进行统计学假设检验。
[0332] 7.2.3安全性目的
[0333] 分析对来自两个研究之组合数据的安全性分析是评估rhBSSL在早产婴儿中当在婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁中施用时的安全性和耐受性。
[0334] 7.3患者安排
[0335] 患者安排概述为治疗顺序并且基于在两个研究中所有的随机化患者。总结表包括了随机化患者的数目、完成每个研究的患者的数目(％)、从每个研究中中止的患者的数目(％)以及出于各个原因中止的患者的数目(％)。总结表还报告了在安全性、FAS和PP分析组中包括的患者的数目(％)以及完成每个治疗期的患者的数目(％)。
[0336] 7.4患者人口统计和基线特征
[0337] 人口统计特征包括在首次服用研究药物当天的实际年龄和推测孕龄、出生时的孕龄、性别、民族以及种族。基线特征包括膝盖至足跟长度和体重。对于人口统计和基线特征，提供两个总结表。第一个表提供了按照治疗顺序划分的组合数据总结，第二个表提供了按照研究划分的人口统计和基线特征总结。通过患者数目、平均值、标准差(standard deviation，SD)、中值、最小值和最大值总结了连续变量。通过患者在每个分类中的数目和百分比总结了分类变量。
[0338] 7.5有效性分析
[0339] 对于每个研究和组合分析使用描述性统计总结了在这两个研究中收集的所有有效性数据。根据个体试验的有效性目的对其进行有效性分析，如介绍中描述的(这些分析的结果没有在本报告中呈现)。
[0340] 分析对来自两个研究之组合数据的主要分析是基于使用α显著性水平为0.05的双侧检验(2-sided test)。逐步顺序检验程序(stepwise sequential testing procedure)用于确保0.05的多显著性水平(multiple level of significance)。
[0341] ·第一步骤：使用α显著性水平为0.05检验关于生长速度在治疗之间没有差异的零假设。如果拒绝零假设，那么进行顺序检验程序的第二步骤。
[0342] ·第二步骤：使用α显著性水平为0.05检验关于CFA在治疗之间没有差异的零假设。如果拒绝零假设，那么也关于CFA进行确认性声称。
[0343] 该多重比较程序控制了多显著性水平不大于5％。
[0344] 主要和次要有效性分析和探索性分析报告了每个治疗之点估计值以及所述估计值周围的95％置信区间以及伴随相应95％置信区间的治疗之间的估计差异。对于除了上述生长速度和CFA的变量不进行假设检验。
[0345] 使用n、平均值、SD、中值、最小值和最大值总结连续变量。使用患者在每个分类中的数目和百分比总结分类变量。
[0346] 如果当在一个时间期间计算生长速度时最终评估不可用，那么在最后可用的评估时计算生长速度并携带至最后一天。否则，不进行缺失数据的插补(imputation)。
[0347] 7.5.1分析的有效性变量
[0348] 主有效性变量是：
[0349] ·生长速度(g/kg/天)：对于第一时期，生长速度定义为(在第一时期中最后评估时的体重减去第1天的体重)除以[第1天的体重加上(在第一时期中最后评估的天数减去1)]，对于第二时期，(在第二时期中最后评估时的体重减去第10天的体重)除以[第10天的体重加(第二时期中最后评估的天数减去10)]。
[0350] 次有效性变量是：
[0351] ·CFA，其为在每个治疗期的最后3天(72小时)期间在示踪标志物之间收集的食品和粪便样品中测量的。
[0352] CFA计算为[食物中的脂肪(g/时期)-粪便中的脂肪(g/时期)]/[食物中的脂肪(g/时期)]＊100
[0353] 食物中的脂肪计算为([食物(mL)-呕吐物(mL)]＊[食物中的脂肪含量(g/100mL)]/100。该式是基于以下假设：(a)呕吐物中的脂肪含量与食物中的脂肪含量一样；(b)呕吐物的密度与食物的密度一样。
[0354] 使用与粪便分析所用相同的方法测定食物(配方食品或巴氏消毒乳汁)的脂肪含量，并由同一实验室进行该测定。食物(mL)和呕吐物(mL)计算为记录的或者在第一示踪物摄取之后和第二示踪物摄取之前的食物或呕吐物的总量。在CRF上记录以克计的呕吐物。因此呕吐物(mL)计算为呕吐物(g)/密度。
[0355] 两个研究之间在计算粪便中的脂肪(g/时期)和食物中的脂肪含量(g/100mL)上有一个差异。该差异涉及脂肪酸在乳和配方食品中的不同含量，如下所述：
[0356] BVT.BSSL-020：
[0357] 粪便中的脂肪(g/时期)计算为以下脂肪酸的总和除以1000，因为实验室以mg提供每种脂肪酸：C12:0、C14:0、C16:0、C18:0、C18:1、C18:2n-6、C18:3n-3、C20:4n-6和C22:6n-3。
[0358] 以g/100mL提供食物中的每种脂肪酸。食物中的脂肪含量(g/100mL)计算为与粪便中相同脂肪酸的总和。
[0359] BVT.BSSL-021：
[0360] 粪便中的脂肪(g/时期)计算为以下脂肪酸的总和除以1000，因为实验室以mg提供每种脂肪酸：C12:0、C14:0、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2n-6、C18:3n-3、C18:3n-6、C20:1、C20:2n-3、C20:3n-6、C20:4n-6、C22:6n-3和C24:1。
[0361] 以g/100mL提供食物中的每种脂肪酸。食物中的脂肪含量(g/100mL)计算为与粪便中相同脂肪酸的总和。
[0362] 组合分析：
[0363] CFA数据的组合统计分析使用针对来自两个研究之每个的每个婴儿/治疗-期所计算的整体CFA值。
[0364] ·长度变化(mm)：长度变化定义为在第一时期的第1天至第7天和第二时期的第10天至第16天从膝盖至足跟的长度变化。
[0365] 7.5.2有效性分析方法
[0366] 主要和次要有效性分析是基于来自两个研究的组合数据的FAS。支持性有效性分析是基于来自两个研究的组合数据的PP分析组。另外，由FAS的研究和PP分析组的研究提供每个有效性变量的分析。
[0367] 通过使用治疗、方案(巴氏消毒乳汁或婴儿配方食品)、时期、顺序以及方案和顺序内嵌套的患者作为因素的方差分析(analysis of variance，ANOVA)来分析主要有效性结局：生长速度。针对来自ANOVA模型的剩余均方(residual mean square)检验所有的主要作用。
[0368] 使用Shapiro-Wilk检验来检验基于组合数据的生长速度分布之正态假设。如果没有满足正态假设，那么将排列值(ranked value)用于ANOVA。
[0369] 以与生长速度同样的方式(通过使用治疗、方案(巴氏消毒乳汁或婴儿配方食品)、时期、顺序以及方案和顺序内嵌套的患者作为因素的方差分析(ANOVA))分析来自每个治疗时期的最后3天的次要有效性结局(CFA)。
[0370] 提供了按照治疗划分的食物中脂肪总量和粪便中脂肪总量的描述性统计。
[0371] 通过使用治疗、方案、时期、顺序以及方案和顺序内嵌套的患者作为因素、使用基线值作为协变量的协方差分析(analysis of covariance，ANCOVA)来分析另一个次要有效性结局(膝盖至足跟长度的变化)。
[0372] 7.6安全性分析：不良事件
[0373] 所有不良事件(AE)分析都是基于来自两个研究的组合数据的安全性分析组。使用描述性统计呈现结果。不进行假设检验。
[0374] 通过系统器官类(system organ class，SOC)和优选术语(preferred term，PT)将MedDRA字典第10.0版用于分类任一研究期间报告的所有AE。所有总结表都包括了具有治疗出现不良事件(treatment-emergent adverse events，TEAE)的患者的计数。在每个各自的研究中进行TEAE评估。TEAE定义为如下所述的AE，即其在研究药物开始时或其后并且在最后一剂研究药物之后不多于14天(对于严重的AE是30天)发生，或者在研究药物开始时正在发生并且在治疗期期间对严重性增加或者与研究药物的关系更密切。通过MedDRA SOC、PT和治疗总结了全部TEAE(治疗相关TEAE(明确、大概或可能)、SAE和导致研究药撤回的TEAE)。总结了每种TEAE的发生率(患者的比例)和数目二者。另外，按照最大严重性(轻度、中度或严重)总结了TEAE。按照治疗顺序划分给出TEAE的整体总结，并且对于每个治疗顺序总体和呈现具有TEAE的患者数目(％)分配至(1)仅BSSL；(2)仅安慰剂；(3)BSSL和安慰剂二者；以及(4)无治疗。
[0375] 8.结果
[0376] 8.1患者的安排
[0377] 表2.2示出患者在两个研究中按照治疗顺序划分的安排的总结。还收集并总结了按照研究划分的患者安排(在该报告中未显示)。
[0378] 表2.2.患者安排
[0379]
[0380] a安全性分析组包括所有接受至少一个剂量的随机化研究药物的患者。
[0381] b全分析组包括所有接受至少一个剂量的随机化研究药物以及在两个治疗期中具有基线和至少一次基线后重量评估的随机化患者。
[0382] c符合方案分析组包括FAS中具有合理的依从性并且没有其他主要的方案违反的患者。
[0383] d完成了过程(completed period)定义为在治疗期中接受研究药物7天的患者。
[0384] 总共65位患者随机化为两个研究：BVT.BSSL-020中的33位患者和BVT.BSSL-021中的32位患者。总共63位患者接受至少一个剂量的随机化研究药物并包括在安全性分析组中：BVT.BSSL-020中的33位患者和BVT.BSSL-021中的30位患者。FAS包括总共60位患者，其在安全性分析组中并且在两个治疗期中具有基线和至少一次基线后重量评估：BVT.BSSL-020中的33位患者和BVT BSSL-021中的27位患者。总共46位患者包括在PP分析组中：BVT.BSSL-020中的26位患者和BVT.BSSL-021中的20位患者。由于不完全或不正确的粪便收集，所以有14位患者没有包括在PP分析组中。
[0385] 安全性分析组中的总共63位患者，31位患者随机化至rhBSSL/安慰剂治疗顺序和32位患者随机化至安慰剂/rhBSSL。总共61位患者完成了过程1和总共59位患者完成了过程2。除了4位患者的所有患者完成了研究；由于AE，所以这4位患者中止。
[0386] 8.2人口统计和基线特征
[0387] 以下在表2.3中示出了在按照治疗顺序划分的两个研究中的组合数据的人口统计和基线特征。还收集并总结了按照研究划分的人口统计和基线特征(在该报告中未示出)。
[0388] 表2.3.人口统计和基线特征
[0389]
[0390] 在组合分析中，与随机化至安慰剂/rhBSSL的患者的平均年龄(3.60周)相比，随机化至rhBSSL/安慰剂的患者的首次给药日平均年龄(4.14周)更大。在治疗顺序之间，其他人口统计和基线特征相当。
[0391] 首次给药日的平均年龄的差异在两个研究之间也显而易见：与BVT.BSSL-021中的平均年龄(4.39周)相比，BVT.BSSL-020中的患者的平均年龄(3.39周)更低。出生时的平均胎龄，BVT.BSSL-020(29.18周)中的比BVT.BSSL-021(28.13周)高了约1周。然而，首次给药日的胎龄在两个研究中类似。在两个研究之间还观察到了族裔的差异：与BVT.BSSL-021(16.7％)相比，BVT.BSSL-020(63.6％)中的西班牙或拉丁美洲患者的百分比更高。在研究之间的其他人口统计和基线特征相当。
[0392] 8.3治疗依从性
[0393] 研究BVT.BSSL-020中的治疗依从性总结于下表2.4中和研究BVT.BSSL-021总结于表2.5中。
[0394] 表2.4按照治疗划分的治疗依从性
[0395] 研究BVT.BSSL.020
[0396]
[0397] 表2.5按照治疗划分的治疗依从性
[0398] 研究BVT.BSSL.021
[0399]
[0400] 8.4有效性分析
[0401] 8.4.1主要有效性变量
[0402] 在组合分析中的主要有效性变量是生长速度。表2.6中示出了基于FAS和PP分析组中两个临床研究之组合分析的生长速度的组合结果。表2.7a和2.7b分别示出了基于FAS和PP分析组的按照研究划分的生长速度分析结果。
[0403] 表2.6在FAS和PP分析组中生长速度(g/kg/天)的分析
[0404]
[0405] 在FAS和PP分析组二者中，与安慰剂治疗期间相比，两个临床研究的组合结果显示rhBSSL治疗期间的生长速度显著提高。在FAS中，生长速度LS平均值是：rhBSSL为16.86g/kg/天和安慰剂为13.93g/kg/天。rhBSSL和安慰剂之间的生长速度的差异统计上显著：LS平均差异(rhBSSL-安慰剂)是2.93g/kg/天(p＜0.001)。在PP分析组中，
2.08g/kg/天的LS平均差异(rhBSSL-安慰剂)也统计上显著(p＝0.019)。
2.08g/kg/天的LS平均差异(rhBSSL-安慰剂)也统计上显著(p＝0.019)。
[0406] 下表2.7a展现了对于两个临床研究中的每个而言在FAS分析组中的生长速度结果，以及表2.7b展现了对PP分析组而言的生长速度结果。
[0407] 表2.7a.在FAS分析组中按照研究划分的生长速度(g/kg/天)的分析
[0408]
[0409] 与安慰剂相比，在rhBSSL治疗期间的生长速度改善在研究BVT.BSSL-020比在研究BVT.BSSL-021中更明显。基于FAS，在BVT.BSSL-020研究中，LS平均差异(rhBSSL-安慰剂)是3.74g/kg/天(p＝0.001)，而在BVT.BSSL-021研究中，其为1.95g/kg/天(p＝0.119)。在PP分析组中观察到了按照研究划分的类似结果(参见表2.7b)。
[0410] 来自表2.7a的其他观察结果是，使用配方食品的患者比使用巴氏消毒乳汁的患者更容易增长体重。在FAS中，在BVT.BSSL-020和BVT.BSSL-021中rhBSSL治疗期间平均生长速度分别是18.06和15.54g/kg/天，并且在各自研究中安慰剂治疗期间分别是14.29和13.63g/kg/天。在PP分析组中观察到了类似的结果(参见表2.7b)。
[0411] 使用Shapiro-Wilk检验来检验基于组合数据的生长速度分布之正态假设。正态性的检验在FAS中显著(p值＜0.001)，说明不满足正态性假定。(对于PP分析组看到类似结果。)因此，还进行使用排列值(ranked value)的生长速度的分析。该灵敏度分析的结果与所得p值＜0.001的主分析一致，说明，与安慰剂相比，rhBSSL治疗期间的生长显著改善。
[0412] 表2.7b在PP分析组中按照研究划分的生长速度(g/kg/天)的分析
[0413]
[0414] 8.4.2次要有效性变量
[0415] 次要有效性变量是CFA和每个治疗期开始和结束之间的膝盖至足跟长度的变化。
[0416] CFA
[0417] 仅在PP分析中的患者具有完整的/正确的粪便收集，这对确定CFA是必要的。因此，本报告中的陈述限于PP分析组的数据，除了下表2.8a，该表显示了对于FAS和PP分析组二者而言两个临床研究之组合分析的CFA结果。在表2.8b中提供了基于PP分析的按照研究划分的CFA分析结果。
[0418] 表2.8a.在FAS和PP分析组中的CFA(％)的分析
[0419]
[0420] ＊研究020中的一个患者在粪便收集期之前退出。
[0421] 在FAS和PP分析组中，与安慰剂相比，在rhBSSL中两个临床研究的组合结果显示了CFA的数值增加。在PP分析组中，rhBSSL治疗期间LS平均CFA是69.1％和对于安慰剂是65.5％；LS平均差异(rhBSSL-安慰剂)是3.56％(p＝0.069)。
[0422] 与BVT.BSSL-020相比，在BVT.BSSL-021中与安慰剂相比的rhBSSL治疗期间CFA的改善更高。在PP中，在BVT.BSSL-021中LS平均差异(rhBSSL-安慰剂)是4.86％(p＝0.073)和在BVT.BSSL-020中是2.08％(p＝0.462)。在FAS分析组中按照研究划分观察到类似结果(参见表2.8b)。
[0423] 表2.8b.在PP分析组中按照研究划分的CFA(％)的分析
[0424]
[0425] 表2.9a提供了在组合分析(PP分析组)中按照研究划分的食物示踪物标志物之间消耗的食物中的脂肪总量和来自粪便中示踪物标志物之间收集的粪便样品的粪便中的脂肪总量。在表2.9b中提供了按照治疗划分的用于组合分析的数据。
[0426] 表2.9a.在PP分析组中按照研究划分的食物中的脂肪总量和粪便中的脂肪总量。
[0427]
[0428] 使用配方食品的患者比使用巴氏消毒乳汁的患者从食物中消耗更多的脂肪。在PP中，在BVT.BSSL-020和BVT.BSSL-021中rhBSSL治疗期间(72小时收集期)消耗的食物中平均脂肪总量分别是29.12g和19.00g，以及在各自研究中安慰剂治疗期间是28.50g和20.51g。使用配方食品的患者比使用巴氏消毒乳汁的患者还排泄更多的脂肪。在BVT.BSSL-020和BVT.BSSL-021中rhBSSL治疗期间粪便中排泄的平均脂肪总量分别是8.53g和6.16g，以及在各自研究中安慰剂治疗期间是8.97g和7.56g。
[0429] 表2.9b总结了对于PP和分析组中的组合结果在72小时收集间隔期间食物中的脂肪总量和粪便中的脂肪总量。对于两个治疗，脂肪摄入和脂肪排泄相当。在来自两个研究的组合数据中，在PP中，rhBSSL治疗期间消耗的食物中的平均脂肪量是24.72g，安慰剂期间消耗的平均量是25.03g。在粪便中排泄的脂肪量分别是7.50g和8.36g。
[0430] 表2.9b.在PP分析组中组合数据的食物中的脂肪总量和粪便中的脂肪总量。
[0431]
[0432] 在不同研究之间摄取的婴儿配方食品或乳汁的平均体积或者采用rhBSSL或采用安慰剂治疗期之间摄取的体积之间差异很小。
[0433] 生长速度和脂肪吸收之间的相关性
[0434] 图2.2显示了在来自两个研究的PP分析组的数据的组合分析中生长速度的差异(rhBSSL-安慰剂)以及CFA的差异(rhBSSL-安慰剂)。
[0435] 如该图显示，在rhBSSL对生长速度和脂肪吸收(CFA)的作用之间没有统计上显著相关性(p值为0.177)。
[0436] 膝盖至足跟长度的变化
[0437] 对于来自FAS和PP分析中的两个研究的组合分析，收集并总结了膝盖至足跟长度的变化的结果(在该报告中未示出)。
[0438] 在来自两个研究的组合数据的FAS或PP分析组中或按照研究划分，在关于膝盖至足跟长度测量的平均变化的治疗之间没有观察到明显差异。
[0439] 8.5安全性分析：不良事件
[0440] 8.5.1暴露程度
[0441] 下表2.19提供了治疗暴露(以治疗天数的形式)的总结。
[0442] 表2.19.治疗暴露的程度-安全性分析组
[0443]
[0444] [1]治疗的天数＝治疗期的最后一天-治疗期的第一天+1
[0445] 治疗暴露的程度在治疗之间相当。98.4％的患者具有7天的rhBSSL治疗和96.8％的患者具有7天的安慰剂治疗。一位患者在第二时期期间安慰剂治疗3天后从BVT.BSSL-020中中止。在BVT.BSSL-021中三(3)位患者在第一治疗期期间中止：2位患者分别在安慰剂治疗6和7天后中止以及一位患者在rhBSSL治疗3天后中止。
[0446] 下表2.20提供了暴露rhBSSL的总结。
[0447] 表2.20.暴露于rhBSSL的程度-安全性分析组
[0448]
[0449] [1]rhBSSL的总量＝0.15g/L＊(rhBSSL治疗期期间摄取的食物的总量(L)-rhBSSL治疗期期间呕吐物的总量(L))。在第1、2、3、10、11和12天不收集呕吐物。
[0450] 注意：根据本方案，rhBSSL在食物中的浓度是0.15g/L。
[0451] 在组合分析结果中，消耗的rhBSSL的平均(SD)量是0.27g(0.052g)。
[0452] 8.5.2不良事件的小结
[0453] 以下在表2.21中示出TEAE的整体发生率。
[0454] 表2.21.治疗出现不良事件的整体总结-安全性分析组
[0455]
[0456] 相关包括明确、大概或可能相关的研究药物。
[0457] 在这两个研究中通过63位患者中的45位(71.4％)经历了总共134件治疗出现不良事件(TEAE)。在具有治疗之间的TEAE的患者的比例中没有观察到明显的差异。研究之间具有TEAE的患者的比例相当：在BVT.BSSL-020中23位(69.7％)患者经历了AE和在BVT.BSSL-021中有22位(73.3％)。然而，与BVT.BSSL.020(53件事件)相比，TEAE的总数在BVT.BSSL.021(81件事件)中更高(在该报告中未示出列表数据。)
[0458] 在两个研究中，安慰剂治疗期间2位(3.2％)患者报告了一件严重的TEAE，4位(6.3％)患者报告了一件引起中止研究的TEAE(1位患者在rhBSSL治疗期间和3位患者在安慰剂治疗期间)，8位(12.7％)患者报告了至少一件认为与治疗相关的TEAE(5位患者在rhBSSL治疗期间，4位患者在安慰剂治疗期间，其中这些患者中的1位在这两个时期期间都具有相关的TEAE)，和一位患者在安慰剂治疗期间死亡。
[0459] 8.5.3不良事件展示
[0460] 以下在表2.22中提供最常见报告的TEAE的总结(在＞＝4％的患者中报告的)。收集并总结所有报告的TEAE的总结(在该报告中未示出)。
[0461] 表2.22.最常见报告的治疗出现不良事件-安全性分析组
[0462]
[0463] 注意：该表包括在＞＝4％的患者中报告的AE。如果患者对特定优选术语具有多于一个计数，那么该患者对该优选术语计数一次。
[0464] 在对于两个研究的组合结果中的最常见的TEAE是由21位(33.3％)患者报告的尿布皮炎。该事件的发生率在治疗之间相当。其他最常报告的TEAE是8位(12.7％)患者中的贫血、6位(9.5％)患者中的心脏杂音、各由5位(7.9％)患者报告的心动过缓和低钾血症以及各由3位(4.8％)患者报告的新生儿贫血、血小板增多和尿路感染。在两个治疗中报告了所有的最常见的TEAE，除了仅在安慰剂中报告的血小板增多。另外，在两个研究中报告了所有最常见的TEAE，除了仅在BVT.BSSL-020中报告了尿路感染和仅在BVS.BSSL-021中报告的低钾血症。
[0465] 9结论
[0466] 组合分析的结果与各自研究的结果一致，并支持以下结论：
[0467] ·在接受巴氏消毒乳汁或婴儿配方食品的早产婴儿中，与安慰剂相比，rhBSSL显著改善了生长。
[0468] ·与安慰剂相比，根据rhBSSL治疗，数量上但是并不显著地改善脂肪吸收。
[0469] ·与安慰剂相比，在rhBSSL治疗1周后没有观察到关于膝盖至足跟长度的变化的差异。
[0470] ·很好地耐受添加至婴儿配方食品或巴氏消毒乳汁的rhBSSL。
[0471] ·与安慰剂相比，没有观察到在rhBSSL治疗期间安全性特征谱中的明显差异。
[0472] ·使用配方食品的患者比使用巴氏消毒乳汁的患者消耗更多的脂肪并增长更多的体重。
[0473] 展示品A
[0474] 提出的婴儿配方食品的组成要求-ESPGHAN推荐标准(摘自Koletzko等2005)：
[0475]
[0476] ＊基于非水解牛乳蛋白作为蛋白质的配方食品的蛋白质含量的确定应基于测量真实蛋白质含量在1.8至2.0g/100kcal([总N减去NPN]×6.25)
[0477] 应临床测试基于水解乳蛋白作为蛋白质(含量低于2.25g/100kcal)的配方食品。
[0478] 不应将蔗糖和果糖添加至婴儿配方食品。
[0480] & 1mgα-TE(α生育酚当量)＝1mg d-α-生育酚
[0481] {维生素E含量应是至少0.5mgα-TE/g PUFA，使用以下等价因素使最小维生素E含量适于配方食品中脂肪酸双键的数目：0.5mgα-TE/g亚油酸(18:2n-6)；0.75mgα-TE/gα-亚麻酸(18:3n-3)；1.0mgα-TE/g花生四烯酸(20:4n-6)；1.25mgα-TE/g十二碳五烯酸(20:5n-3)；1.5mgα-TE/g二十二碳六烯酸(22:6n-3)。
[0482] #烟酸指预成烟酸。
[0483] ＊＊在婴儿处于铁缺乏风险的群体中，铁含量高于0.3mg/100kcal的最低水平，这可能是适当的并且在国家水平上是推荐的。
[0484] NS，未标明
[0485] 展示品B
[0486] 任选成分(如果添加)的建议水平-ESPGHAN推荐标准(摘自Koletzko等2005)：
[0487]
[0488] ＊如果将二十二碳六烯酸(22:6n-3)添加至婴儿配方食品中，那么花生四烯酸(20:4n-6)含量应达到最少与DHA相同的浓度。二十碳五烯酸(20:5n-3)的含量不应超过二十二碳六烯酸的含量。
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