病原体原发感染的检测
阅读：391发布：2020-06-17
专利汇可以提供病原体原发感染的检测专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及病原体原发感染的检测。本发明涉及适合用作病原体感染、尤其病原体原发感染的检测中的试验 抗原 的融合蛋白。另外，本发明涉及用于检测和差别化测定 抗体 、尤其由病原 生物 感染产生的IgM抗体的方法。此外，提供了用于实施这些方法的试验 试剂 。，下面是病原体原发感染的检测专利的具体信息内容。
1.融合多肽，其包含
(i)至少一个多聚化结构域，和
(ii)来自病原体的表位区段的多个拷贝。
2.权利要求1的多肽，其中所述多聚化结构域是二聚化结构域、三 聚化结构域或四聚化结构域。
3.权利要求1-2中任一项的多肽，其中所述多聚化结构域是原核或 真核蛋白伴侣，优选不依赖于ATP的蛋白伴侣。
4.权利要求1-3中任一项的多肽，其中所述多聚化结构域选自：来 自大肠杆菌的FkpA、Skp和SecB，或来自其它原核生物的直向同源物。
5.权利要求1-4中任一项的多肽，其包含所述含有表位的片段的至 少2个、优选2-10个和更优选2、3、4、5或6个拷贝。
6.权利要求1-5中任一项的多肽，其中表位区段的长度是5-120、 优选15-50个氨基酸。
7.权利要求1-6中任一项的多肽，其中所述表位区段被间隔序列隔 开。
8.权利要求7的多肽，其中所述间隔序列的长度是1-10个氨基酸， 且优选包含甘氨酸和/或丝氨酸残基。
9.权利要求1-8中任一项的多肽，其中所述表位区段包含被所述病 原体感染的早期或急性阶段产生的抗体特异性识别的表位，尤其被所述 病原体原发感染的早期或急性阶段产生的抗体特异性识别的表位。
10.权利要求1-8中任一项的多肽，其中所述表位区段包含被所述 病原体感染的晚期阶段或感染后产生的抗体特异性识别的表位。
11.权利要求1-8中任一项的多肽，其中所述表位区段包含被所述 病原体持续或复发性感染中产生的抗体特异性识别的表位。
12.权利要求1-11中任一项的多肽，其中所述包含表位的片段来自 病毒、细菌或原生动物病原体。
13.权利要求1-12中任一项的多肽，其中所述病原生物选自：
(i)疱疹病毒例如人单纯疱疹病毒1和2(HHV1和HHV2)、水 痘-带状疱疹病毒(HHV3)、EB病毒(HHV4/EBV)或人巨细胞病毒 (HHV5)和人疱疹病毒6、7和8；
(ii)风疹病毒；
(iii)肝炎病毒例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV) 和丙型肝炎病毒(HCV)；
(iv)副粘病毒例如麻疹病毒和腮腺炎病毒；
(v)弓形虫属生物和
(vi)疏螺旋体属生物。
14.权利要求13的多肽，其中所述病原体选自与妊娠危险有关的病 原体，尤其人巨细胞病毒、鼠弓形虫和风疹病毒。
15.权利要求1-14中任一项的多肽，其携带至少一个报道和/或偶联 基团。
16.权利要求15的多肽，其携带生物素偶联基团。
17.权利要求15的多肽，其携带电致化学发光报道基团，尤其钌报 道基团，或半抗原报道基团，尤其洋地黄毒苷报道基团。
18.权利要求1-17中任一项的融合多肽，其作为多聚体存在。
19.编码权利要求1-17中任一项的多肽的核酸分子。
20.权利要求19的核酸，其中编码相同表位区段的其部分具有在遗 传密码简并范围内的不同核苷酸序列。
21.表达载体，其包含与表达控制序列可操作地连接的至少一个权 利要求19或20的核酸。
22.用权利要求19或20的核酸分子或权利要求21的表达载体转染 或转化的宿主细胞。
23.制备权利要求1-17中任一项的融合多肽的方法，其包含下述步 骤：
(i)提供权利要求22的宿主细胞；
(ii)在表达融合多肽的条件下，培养所述宿主细胞，和
(iii)回收所述融合多肽。
24.制备权利要求18的多聚体融合多肽的方法，其包含在适合形成 多聚体的条件下，结合多个单体融合多肽。
25.权利要求1-18中任一项的融合多肽作为检测试剂在检测样品中 的抗体的方法中的用途。
26.权利要求25的用途，其中所述抗体是IgM抗体。
27.权利要求26的用途，其用于IgM抗体的差别化测定。
28.权利要求26或27中任一项的用途，其中所述抗体是在病原体 感染、尤其原发感染的早期或急性阶段中产生的IgM抗体。
29.权利要求1-18中任一项的融合多肽作为干扰消除试剂在检测样 品中的抗体的方法中的用途。
30.权利要求29的用途，其中所述抗体是IgG抗体。
31.用于检测样品中的抗体的试验试剂试剂盒，其包含至少一种权 利要求1-18中任一项的融合多肽和其它试验组分。
32.权利要求31的试验试剂，其中所述融合多肽是检测试剂。
33.权利要求31的试验试剂，其中所述融合多肽是干扰消除试剂。
34.检测样品中针对病原体的抗体的方法，其包含下述步骤：
(i)温育所述样品和试验试剂，所述试验试剂包含至少一种权利要 求1-18中任一项的融合多肽和其它试验组分，和
(ii)通过评价样品组分与所述试验试剂的反应，测定所述抗体在 所述样品中的存在和/或浓度。
35.权利要求34的方法，其中所述试验试剂包含检测试剂和至少一 种干扰消除试剂；且步骤(ii)包含测定所需样品组分与检测试剂的反 应，其中用至少一种干扰消除试剂捕获不需要的样品组分。
36.权利要求34或35的方法，其中所述待测抗体是在原发感染的 早期或急性阶段中产生的IgM抗体，且所述试验试剂包含至少一种权利 要求1-18中任一项的融合多肽，其携带报道和/或偶联基团。
37.权利要求36的方法，其中所述试验试剂还包含用于捕获IgG抗 体的干扰消除试剂，和/或用于捕获在感染晚期和/或复发性感染中产生 的IgM抗体的干扰消除试剂。
38.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述试验试剂包含携带 报道基团的第一种融合多肽和携带用于固定化到固相上的偶联基团的 第二种融合多肽，且其中通过用第一种和第二种融合多肽形成复合物、 并检测所述固相上的所述复合物，来测定抗体。
39.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述试验试剂包含携带 用于固定化到固相上的偶联基团的融合多肽和携带报道基团的识别待 测抗体的受体，且其中通过用融合多肽和受体在所述固相上形成复合 物，来测定抗体。
40.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述试验试剂包含携带 报道基团的融合多肽和携带用于固定化到固相上的偶联基团的识别待 测抗体的受体，且其中通过用融合多肽和受体在所述固相上形成复合 物，来测定抗体。
41.差别化检测样品中针对病原体的IgM抗体的方法，其中所述样 品可以包含选自干扰IgM抗体和/或干扰IgG抗体的干扰抗体，所述方 法包含下述步骤：
(a)温育所述样品和试验试剂，所述试验试剂包含：
(i)至少一个特异性结合IgM抗体的受体R1，
(ii)至少一个特异性结合要差别化检测的IgM抗体的受体R2， 其中R2携带报道基团，
(iii)任选地，至少一个特异性结合干扰IgM抗体的受体R3， 和
(iv)任选地，特异性结合IgG抗体的受体R4，
(b)允许形成下述复合物：
(i)包含R1、所述要差别化检测的IgM抗体和R2的复合物， 所述复合物携带报道基团，
(ii)任选地，包含R3和所述干扰IgM抗体的复合物，从而 消除所述干扰IgM抗体与R2的干扰结合，
(iii)任选地，包含R4和所述干扰IgG抗体的复合物，从而 消除所述干扰IgG抗体与R2的干扰结合，和
(c)测定通过R2结合到所述要差别化检测的IgM抗体上的所述报 道基团，作为所述样品中所述IgM抗体的度量。
42.权利要求41的方法，其中所述受体R4是单体受体。
43.权利要求41-42中任一项的方法，其中所述受体R2和R3是具 有不同有效表位密度或浓度的多聚体受体。
44.权利要求41-43中任一项的方法，其中所述待测IgM抗体是在 感染、优选原发感染的早期或急性阶段产生的IgM抗体，且其中所述干 扰IgM抗体是在感染晚期或感染后产生的IgM抗体，和/或在持续或复 发性感染中产生的IgM抗体。
45.权利要求44的方法，其中所述受体R2是多聚体受体，其包含 待测IgM抗体识别的至少6个拷贝、优选至少8个和更优选至少12个 表位拷贝。
46.权利要求44或45的方法，其中所述受体R3是多聚体受体， 其有效表位密度或浓度为受体R2的表位密度或浓度的至少1/2。
47.权利要求41-46中任一项的方法，其中所述受体R1携带用于固 定化到固相上的偶联基团。
48.权利要求41-46中任一项的方法，其中所述受体R3和R4如果 存在则与样品预温育，然后加入受体R1和/或R2。
49.权利要求41-48中任一项的方法，其中所述受体R2是权利要求 1-18中任一项的融合多肽。
50.用于差别化检测样品中针对病原体的IgM抗体的试验试剂，其 中所述样品可以包含选自干扰IgM抗体和/或干扰IgG抗体的干扰抗体， 其包含：
(i)至少一个特异性结合IgM抗体的受体R1，
(ii)至少一个特异性结合要差别化检测的IgM抗体的受体R2，其 中R2携带报道基团，
(iii)任选地，至少一个特异性结合干扰IgM抗体的受体R3，和
(iv)任选地，特异性结合IgG抗体的受体R4。
技术领域
本发明涉及适合用作病原体感染、尤其病原体原发感染的检测中的 试验抗原的融合多肽。另外，本发明涉及用于检测和差别化测定由病原 体感染产生的IgM抗体的方法。此外，提供了用于实现这些方法的试验 试剂。
背景技术
除了PCR技术以外，免疫试验仍然在感染血清学中起重要作用。通 过不同免疫球蛋白类别的特异性测定，免疫学使得分析疾病的病期成为 可能。通过测定针对某些病毒抗原的IgM和IgG效价，可能区分不同的 感染阶段，例如急性感染、复发性感染、慢性/持续感染或感染后疾病病 期。例如，针对病毒糖蛋白的IgG分子仅仅在巨细胞病毒感染的晚期产 生(Schoppel等JID(1997)175，533-544；Eggers等，J.Med.Virol. (2001)63，135-142)。
在有各个其它免疫球蛋白类别存在下可靠地特异性检测IgG和IgM 的重要方面是，检测抗原的有效表位浓度或有效表位密度。高度有效的 表位浓度是指，存在高表位密度，且所有表位都可用于抗体结合。与此 相反，多肽聚集体也具有高表位浓度，但是有效表位浓度低，因为表位 部分地或完全地被掩盖或隐藏，且因而不可用于抗体结合。高表位浓度 是特异性IgM识别的前提，而低表位浓度是特异性IgG识别的前提。在 应检测针对抗原A的IgM分子的经典夹心IgM试验中，将多聚体抗原A 用作固定化的捕获抗原。携带报道基团的相同多聚体抗原A用作检测抗 原。IgM分析物结合捕获抗原和检测抗原，从而将报道基团固定化在固 相(例如包被链霉抗生物素蛋白的珠子)上。为了避免针对A的IgG分 子的干扰，向试验中加入未标记的单体抗原A，作为干扰消除剂(WO 98/23955，US 6,489,129B1)。相应地，特异性的IgG夹心试验(WO 98/23961，US 6,645,732B1)可以包含用于检测IgG的单体抗原和避免 用IgM干扰的未标记的多聚体抗原。
允许IgM和IgG分子的特异性检测的原理基于它们各自的分子结 构。五聚体IgM具有10个相同的抗原结合互补位，而单体IgG每个分 子仅具有2个结合部位。IgG的检测基于对分析物的亲和力，而IgM的 检测基于亲合力(avidity)。在第一种情况下，通过表位和互补位(即 IgG抗原结合部位)之间的高亲和力相互作用来实现结合；在后一种情 况下，通过几种低亲和力相互作用的协同增强来实现结合(亲合力是指， 单个解离常数不是相加，而是相乘，即kD约10-5M的相对弱的相互作 用被2个独立的结合事件增加，以产生kD约10-10M的高亲和力相互作 用)。因而，可以说作为经验法则，单体抗原用于检测IgG，而寡聚体/ 多聚体抗原用于检测IgM。
通过同或异双功能交联剂化学交联单体抗原，可以实现抗原寡聚化 或多聚化。通常，可以通过调节反应条件(蛋白和交联剂的浓度、pH、 温度、搅拌速率、反应时间)来最优化寡聚化或多聚化，这是非常耗时 和费力的。尽管如此，在不同批次中可能得到不同的交联度，这需要随 后的分级分离和/或校准程序。此外，更高的交联度经常导致溶解度的降 低，这可能导致试验性能的问题。因而，需要发现改良的以确定的且可 再现的方式提供多聚体抗原的方法。
美国专利6,207,420描述了一种融合序列，其包含与靶异源肽或蛋 白融合的具有至少90％预测的溶解度可能性的载体蛋白，包括大肠杆菌 (E.coli)蛋白。优选地，异源肽或蛋白在细菌中表达时，通常不溶。
WO 03/000878描述了一种融合蛋白，其包含至少一个靶多肽和位 于其上游的至少一个FKBP蛋白伴侣，所述FKBP蛋白伴侣选自：FkpA、 SlyD和触发因子。靶多肽可以是哺乳动物基因产物或哺乳动物病原体基 因产物。
在有各个其它免疫球蛋白类别存在下可靠地特异性检测IgG和IgM 的重要方面是，检测抗原的有效表位浓度或有效表位密度。高度有效的 表位浓度是指，存在高表位密度，且所有表位都可用于抗体结合。与此 相反，多肽聚集体也具有高表位浓度，但是有效表位浓度低，因为表位 部分地或完全地被掩盖或隐藏，且因而不可用于抗体结合。高表位浓度 是特异性IgM识别的前提，而低表位浓度是特异性IgG识别的前提。在 应检测针对抗原A的IgM分子的经典夹心IgM试验中，将多聚体抗原A 用作固定化的捕获抗原。携带报道基团的相同多聚体抗原A用作检测抗 原。IgM分析物结合捕获抗原和检测抗原，从而将报道基团固定化在固 相(例如包被链霉抗生物素蛋白的珠子)上。为了避免针对A的IgG分 子的干扰，向试验中加入未标记的单体抗原A，作为干扰消除剂(WO 98/23955，US 6,489,129B1)。相应地，特异性的IgG夹心试验(WO 98/23961，US 6,645,732B1)可以包含用于检测IgG的单体抗原和避免 用IgM干扰的未标记的多聚体抗原。
允许IgM和IgG分子的特异性检测的原理基于它们各自的分子结 构。五聚体IgM具有10个相同的抗原结合互补位，而单体IgG每个分 子仅具有2个结合部位。IgG的检测基于对分析物的亲和力，而IgM的 检测基于亲合力(avidity)。在第一种情况下，通过表位和互补位(即 IgG抗原结合部位)之间的高亲和力相互作用来实现结合；在后一种情 况下，通过几种低亲和力相互作用的协同增强来实现结合(亲合力是指， 单个解离常数不是相加，而是相乘，即kD约10-5M的相对弱的相互作 用被2个独立的结合事件增加，以产生kD约10-10M的高亲和力相互作 用)。因而，可以说作为经验法则，单体抗原用于检测IgG，而寡聚体/ 多聚体抗原用于检测IgM。
通过同或异双功能交联剂化学交联单体抗原，可以实现抗原寡聚化 或多聚化。通常，可以通过调节反应条件(蛋白和交联剂的浓度、pH、 温度、搅拌速率、反应时间)来最优化寡聚化或多聚化，这是非常耗时 和费力的。尽管如此，在不同批次中可能得到不同的交联度，这需要随 后的分级分离和/或校准程序。此外，更高的交联度经常导致溶解度的降 低，这可能导致试验性能的问题。因而，需要发现改良的以确定的且可 再现的方式提供多聚体抗原的方法。
美国专利6,207,420描述了一种融合序列，其包含与靶异源肽或蛋 白融合的具有至少90％预测的溶解度可能性的载体蛋白，包括大肠杆菌 (E.coli)蛋白。优选地，异源肽或蛋白在细菌中表达时，通常不溶。
WO 03/000878描述了一种融合蛋白，其包含至少一个靶多肽和位 于其上游的至少一个FKBP蛋白伴侣，所述FKBP蛋白伴侣选自：FkpA、 SlyD和触发因子。靶多肽可以是哺乳动物基因产物或哺乳动物病原体基 因产物。
发明内容
本发明的第一个方面涉及融合多肽，其包含
(i)至少一个多聚化结构域，和
(ii)来自病原体的表位区段的多个拷贝。
所述融合多肽分子能形成多聚体。多聚体包含多个经由多聚化结构 域通过非共价相互作用结合到一起的单体亚基。多聚体可以通过例如在 合适条件下温育融合多肽分子来形成。
本发明的融合多肽是遗传融合体，其可以根据标准方法大量和以可 再现的质量生产。融合多肽和由其形成的多聚体具有高稳定性和溶解 度，且因而在检测由病原体感染产生的抗体的方法中是优良的试验抗 原。优选地，融合多肽用于测定IgM抗体，更优选地用于差别化测定IgM 抗体，最优选地用于差别化测定在急性和/或原发感染中产生的早期IgM 抗体。融合多肽可以携带报道基团和/或捕获基团，且因而可以用作检测 和/或捕获抗原。此外，融合多肽也适用作干扰消除剂。
本发明的融合多肽分子优选地包含1个或2个多聚化结构域、更优 选1个多聚化结构域。多聚化结构域优选地位于融合多肽的N-和/或C- 末端、更优选N-末端。多聚化结构域是支持单独融合多肽分子多聚化的 多肽序列，其中形成包含通过非共价相互作用结合到一起的多个单体亚 基的多聚体。复合物的单体亚基是遗传融合蛋白，其中所述单独氨基酸 残基通过肽键相连。多聚体的单体亚基优选地是相同的。
例如，多聚化结构域可以是二聚化结构域，即支持2个亚基的非共 价结合的结构域，支持3个亚基的非共价结合的三聚化结构域，四聚化 结构域或甚至更高的多聚化结构域。优选地，多聚化结构域是二聚化结 构域、三聚化结构域或四聚化结构域。
多聚化结构域可以选自原核或真核蛋白伴侣，优选不依赖于ATP 的蛋白伴侣。多聚化结构域的具体实例是来自大肠杆菌的蛋白FkpA、 Skp和SecB或来自其它原生生物的它们的直向同源物。FkpA是来自大 肠杆菌的不依赖于ATP的周质二聚化蛋白伴侣。Skp是来自大肠杆菌的 不依赖于ATP的周质三聚化蛋白伴侣。SecB是来自大肠杆菌的不依赖 于ATP的胞质四聚化蛋白伴侣。其它合适的多聚化结构域是来自真核或 原核生物的热激蛋白，例如Hsp25，即不依赖于ATP的真核胞质/核寡 聚体蛋白伴侣。其它合适的多聚化结构域是MIP(巨噬细胞感染性增强 剂)，在结构上与FkpA相关的不依赖于ATP的二聚化蛋白伴侣。依赖 于ATP的蛋白伴侣如GroEL(来自大肠杆菌的依赖于ATP的胞质七聚 化蛋白伴侣)或ClpB(来自大肠杆菌的依赖于ATP的六聚化蛋白伴侣) 或ClpX也是合适的。此外，多聚化结构域可以选自上述多肽的片段或 变体，它们保留其形成多聚体的能力。
本发明的融合多肽包含表位区段的多个拷贝。表位区段包含由抗体 识别的氨基酸序列。因而，所述多肽包含识别各个表位的抗体的多个结 合部位。优选地，单独表位区段的氨基酸序列是相同的或基本上相同的。 但是，一个或多个表位区段可能是不同的，只要这些差异不会负面地影 响待测抗体的识别即可。所述融合多肽包含表位区段的至少2个、优选 2-10个、更优选2-6个和最优选2、3、4、5或6个拷贝。
由多个单独融合多肽亚基组成的多聚体优选地包含表位区段的至 少4个、更优选至少6个和最优选至少8个拷贝。所述多聚体可以包含 例如表位区段的最高达40个、优选最高达30个和最优选最高达25个 拷贝。
通常，所述融合多肽包括仅一个表位区段的多个拷贝。在该情况下， 所述融合多肽具有一种抗体特异性。但是，在有些实施方案中，预见到 所述融合多肽包含2个或更多个不同表位区段、优选2个不同表位区段 的多个拷贝。在该情况下，所述融合多肽适用于检测几种类型的抗体特 异性。
表位区段的长度通常是至少5个氨基酸，优选至少6个氨基酸和更 优选至少8个氨基酸。表位区段的最大长度通常是100-120个氨基酸， 优选80个氨基酸和更优选70个氨基酸。最优选地，表位区段的长度是 15-50个氨基酸。
融合多肽的单独表位区段可以被间隔序列隔开。间隔序列优选地是 与表位区段的来源病原生物异源的序列。为了实践目的，间隔序列选自 几乎不在任何程序上妨碍该融合多肽作为测定抗体的试验抗原的应用 的序列。这意味着，间隔序列对待测抗体是非免疫反应性的。优选地， 间隔序列包含甘氨酸和/或丝氨酸残基。尤其优选的是聚甘氨酸间隔序 列。间隔序列的长度优选地是1-10个氨基酸、更优选2-5个氨基酸且最 优选3或4个氨基酸。尤其优选的是(Gly)3间隔序列。
此外，在多聚化结构域和表位区段之间可以存在间隔序列。该间隔 序列可以具有例如1-100个氨基酸的长度。优选地，该间隔序列与多聚 化结构域和表位区段异源。优选地，间隔序列如上所述。
融合多肽的表位区段是来自病原体的抗原序列，其能结合在病原体 感染的生物的免疫反应过程中产生的抗体。优选地选择表位序列，以被 在感染的特定阶段产生的抗体所识别，例如被早期感染状态期间的抗体 所优先识别的“早期”表位，或在晚期感染状态中优先识别的“晚期” 表位。在优选的实施方案中，表位区段包含被所述病原体感染的早期和 /或急性阶段产生的抗体特异性识别的表位。在尤其优选的实施方案中， 表位区段包含被所述病原体原发感染的早期和/或急性阶段产生的抗体 特异性识别的表位。在另一个实施方案中，表位区段包含被所述病原体 感染的晚期阶段或感染后产生的抗体特异性识别的表位。在另一个实施 方案中，表位区段包含被所述病原体持续或复发性感染中产生的抗体特 异性识别的表位。
表位区段可以源自任何病毒、细菌或原生动物(protozoic)病原体， 它能造成可检测的免疫反应，即作为感染的结果，产生抗体、尤其IgM 抗体。例如，所述病原体选自：
(i)疱疹病毒例如人单纯疱疹病毒1和2(HHV1和HHV2)、水 痘-带状疱疹病毒(HHV3)、EB病毒(HHV4/EBV)或人巨细胞病毒 (HHV5)和人疱疹病毒6、7和8；
(ii)风疹病毒；
(iii)肝炎病毒例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV) 和丙型肝炎病毒(HCV)；
(iv)副粘病毒例如麻疹病毒和腮腺炎病毒；
(v)弓形虫属(Toxoplasma)生物和
(vi)疏螺旋体属(Borrelia)生物。
来自这些病原体的合适表位的实例，已经在下面详述的许多文件中 描述。这些文件和其中引用的文献在本文中引作参考。
指示着早期感染的IgM分子的特异性检测，在临床上对人中的许多 病毒、细菌和原生动物感染是重要的。疱疹病毒科(herpesviridae)， 例如包含单纯疱疹病毒1和2(HHV1、HHV2)、水痘-带状疱疹病毒 (HHV3)、EB病毒(HHV4)、人巨细胞病毒(HHV5)和人疱疹病毒 6、7和8。人巨细胞病毒(HHV5)在妊娠常规诊断中起关键作用：当 没有针对该病毒的体液或细胞免疫的生育妇女在妊娠前三个月期间经 历原发感染时，它可以对胎儿造成毁坏性损害。
通过表位绘图，已经在不同疱疹抗原中鉴别出了许多重要的免疫决 定簇。例如，Greijer等，J.Clin.Microbiol.(1999)37(1)，179-188 总结了HCMV抗原pp150、p52、gB和pp28中的单独表位的抗体反应 性。Schoppel等，J.Infect.Dis.(1997)175(3)，533-544描述了其它 表位。至于单纯疱疹病毒，已经分别将优势免疫表位作图在来自HSV-2 的成熟糖蛋白G的序列552-578中(Marsden等，J.Med.Virol.(1998) 56，79-84；Liljeqvist等，J.Gen.Virol.(1998)79，1215-1224)和来自 HSV-1的糖蛋白G1的序列112-127(等，J.Gen.Virol.(2000) 81，1033-1040)。这些表位可以掺入本发明的融合多肽中。
作为妊娠筛选中的参数起突出作用，鼠弓形虫(Toxoplasma gondii) 和风疹病毒以及人巨细胞病毒和单纯疱疹病毒1型和2型构成TORCH 家族。这些病原体在妊娠前三个月对孕妇(缺少体液和细胞免疫)的原 发感染，可能导致对胎儿的严重损害。这迫切需要区分原发和复发性感 染的可靠的差别诊断。如上所述，在几种HCMV抗原内的免疫显性决 定簇从文献中可获知，例如来自pp150的序列595-636和1011-1048、来 自p52的序列266-293和295-312、来自糖蛋白B的序列792-809和60-81 和来自pp28的序列15-45和130-160(Greijer等，同上)。类似地，已 经在来自风疹病毒的免疫显性包膜蛋白E1上鉴别出了主要表位。例如， 氨基酸243-286之间的区域含有3个中和表位，如Terry等(Terry等， Arch.Virol.(1988)98，189-197)所报道的。另一种中和E1表位已经 在氨基酸213-239之间的区域表征(Mitchell等，J.Clin.Microbiol.(1992) 30(7)，1841-1847)。已经在第二种风疹包膜蛋白E2上，鉴别出具 有中和能力的至少一种优势免疫表位(Green&Dorsett，J.Virol(1986) 57(3)，893-898)。免疫显性的T-细胞表位和几种线性B-细胞表位已 经被定位在E2区域31-105(McCarthy等，J.Virol.(1993)67(2)， 673-681；Wolinsky等，J.Virol.(1991)65，3986-3994)。这些表位可 以掺入本发明的融合多肽中。
已经将来自鼠弓形虫的几种蛋白鉴别为免疫显性抗原：致密颗粒蛋 白GRA1(p24)、GRA2(p28)、GRA4(p41)、GRA6(p32)、GRA7 (p29)和GRA8(p35)，表面抗原SAG1(p30)和SAG2(p22)，棒 状体抗原ROP1(p66)和ROP2(p54)，基质蛋白MAG1(p65)和微 丝蛋白MIC3和MIC5(Pfrepper等，Clin Diagn.Lab.Immunol.(2005) 12(8)，977-982)。关于抗-弓形虫属IgM抗体的检测，以前已经提出 了GRA7、GRA8和ROP1的组合(Aubert等，J.Clin.Microbiol.(2000) 38：1144-1150)。这些表位可以掺入本发明的融合多肽中。
血清学的另一个重要领域覆盖了肝炎病毒例如HAV、HBV和HCV。 每种这样的病原体的免疫显性抗原和各自的优势免疫表位是众所周知 的。例如，HBV核壳蛋白是慢性乙型肝炎中宿主免疫应答的主要靶，且 已经表征了几种优势免疫表位。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)上的重要 B-细胞表位已经被定位在氨基酸74-89、130-138(Salfeld等，J.Virol. (1989)63，798-808)和107-118(Colucci等，J.Immunol.(1988)141， 4376-4380)。这些表位可以掺入本发明的融合多肽中。
已经表征了许多丙型肝炎抗原的优势免疫表位(总结在Carlos等， Clin.Immunol.(2004)111，22-27)。例如，已经定义了核心(7-18)、 E2(484-499)、NS3(1248-1265)和NS4(1767-1786)的免疫显性区 域的表位，以及来自E2HVR1基因型1a(386-406)、E2HVR2基因型 1a(472-485)、E2 HVR1基因型1b(386-406)和E2 HVR2基因型1b (472-485)的高变区的表位。这些和其它HCV表位可以掺入本发明的 融合多肽中，并应证实可用于开发根据本发明的差别IgM免疫测定。
其它重要的人病原体是麻疹病毒和腮腺炎病毒，它们二者都属于副 粘病毒科，且各自由6个结构蛋白组成。麻疹病毒的核壳蛋白N是体液 免疫应答的主要靶，且针对N的B-细胞应答在控制麻疹感染中是关键 的。最近，将优势免疫表位作图在氨基酸419和525之间的N抗原C- 末端内。具体地，线性表位可定位于440-448的序列内(Zvirbliene等， Arch.Virol.(2007)152，25-39)。类似地，来自腮腺炎病毒的核衣壳 结合的蛋白NP构成主要抗原决定簇，且NP的重组变体表现出高抗原 性，并非常适用于在腮腺炎血清学中特异性检测IgM(Samuel等，J.Med. Virol.(2002)66，123-130)。
疏螺旋体属(布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、嘎氏疏螺旋体(B. garinii)、阿氏疏螺旋体(B.afzelii))的免疫诊断引起了日益增长的 兴趣，这是因为该螺旋体的无情传播。由于尾随显著的气候变化的即将 到来的暖冬，假定疏螺旋体属的影响在不久的将来甚至会增加更多。已 经描述了布氏疏螺旋体VlsE抗原的免疫显性保守区，它非常适用于灵 敏的且特异性的血清诊断(Liang等，J.Clin.Microbiol.(1999)37(12)， 3990-3996)。所谓的IR6或C6区域(Liang&Philipp，Infect.Immun. (1999)67，6702-6706；Liang等，J.Immunol.(1999)163(10)5566-5573) 包含不变的26氨基酸区段，它可以掺入本发明的融合多肽中。
所述融合多肽优选地在检测样品中的抗体、尤其IgM抗体的方法中 用作试验试剂。为此目的，融合蛋白可以携带报道和/或偶联基团。合适 的报道基团的实例是通过视觉手段可检测的基团，例如荧光基团，发光 基团，例如化学发光基团，或微粒基团例如金属，例如金或胶乳粒子。 当然，其它报道基团例如酶基团、放射性基团、半抗原基团等也是合适 的。特别优选的是电致化学发光报道基团，尤其钌基团，例如钌(联吡 啶)3或钌(菲咯啉)3基团。尤其优选的也是半抗原报道基团，例如洋 地黄毒苷基团，其可以用抗-半抗原抗体例如抗-洋地黄毒苷抗体检测。
在另一个实施方案中，所述融合多肽可以携带至少一个偶联基团。 偶联基团是用于将融合多肽偶联到其它化合物或物质(例如固相或上面 定义的报道基团)上的基团。偶联基团可以是用于共价偶联或非共价偶 联的基团。优选地，偶联基团是特异性结合对的第一配偶体，它与结合 对的第二配偶体特异性地相互作用。优选的结合对是生物素/抗生物素蛋 白、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/抗生物素抗体、半抗原/抗-半抗 原抗体和碳水化合物/凝集素。优选地，偶联基团是生物素基团，包括生 物素衍生物，即结构上与生物素相关的化合物，其保持结合链霉抗生物 素蛋白和/或抗生物素蛋白的能力。
根据常规方式，可以将融合多肽结合到报道和/或偶联基团上。例如， 可以制备包含报道和/或偶联基团的缀合试剂。这些试剂还可以包含能与 多肽上存在的基团反应的基团，例如羟基、氨基、羧基和/或硫代基团。 偶联基团的具体实例是活性酯基团，例如N-羟基琥珀酰亚胺基团或马来 酰亚胺基团。
本发明还涉及编码上述融合多肽的核酸分子。所述核酸分子优选地 是DNA分子。为了增加核酸分子的稳定性，优选地编码单独表位区段 (它们优选地在氨基酸水平是相同的)的部分具有在遗传密码简并范围 内的不同核苷酸序列，其中使用编码相同氨基酸的不同核苷酸三联体密 码子。更优选地，编码单独相同表位区段的每个部分具有不同于其它部 分的核苷酸序列。
另外，本发明涉及表达载体，其包含至少一个可操作地连接到表达 控制序列上的上述核酸分子。所述表达载体可以是原核或真核载体，其 另外包含用于在各自宿主细胞中维持和繁殖的遗传元件，例如复制起点 和/或选择标记基因。所述表达控制序列可以是原核或真核表达控制序 列，其可以是组成型或诱导型的。选择表达控制序列，以允许在所需宿 主细胞中有效表达。合适的表达载体和表达控制序列的实例是技术人员 已知的，且记载在标准教科书中，例如Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbour Press，或可商业上得 到。
另外，本发明涉及用上述核酸分子或表达载体转染或转化的宿主细 胞。所述宿主细胞可以是原核细胞，例如革兰氏阴性细菌细胞，例如大 肠杆菌，或真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。宿主 细胞可以用于上述融合多肽的重组制备。优选地，重组生产包含下述步 骤：
(i)提供上述的宿主细胞，
(ii)在表达融合多肽的条件下，培养所述宿主细胞，和
(iii)分离所述融合多肽。
如上所述，本发明的融合多肽优选地用作检测样品中的抗体的方法 中的检测试剂。所述抗体优选是IgM抗体。更优选地，检测包含IgM抗 体的差别化测定。在尤其优选的实施方案中，抗体是在感染、尤其病原 体原发感染的早期或急性阶段中产生的IgM抗体。
在另一个实施方案中，所述融合多肽可以在检测样品中的抗体的方 法中用作干扰消除试剂。在该实施方案中，抗体优选是IgG抗体。
本发明也涉及用于检测样品中的抗体的试验试剂试剂盒，其包含至 少一种融合多肽和其它试验组分。所述试验试剂可以包含含有单一类型 表位的单一融合多肽，或含有2种或更多种不同类型表位的单一融合多 肽，或含有单一类型表位或2种或更多种不同类型表位的2种或更多种 融合多肽。本发明的融合多肽可以是检测试剂或干扰消除试剂。如果融 合多肽是检测试剂，则它优选包含如上所述的报道和/或偶联基团。如果 融合多肽是干扰消除试剂，则它优选不包含任何报道基团。所述干扰消 除试剂的特征在于，它的有效表位浓度或密度不同于检测试剂的有效表 位浓度。优选地，干扰消除试剂的表位浓度或表位密度低于检测试剂的 表位浓度或表位密度。
本发明也涉及检测样品中针对病原生物的抗体的方法，其包含下述 步骤：
(a)温育所述样品和包含至少一种上述融合多肽和其它试验组分 的试验试剂，和
(b)通过评价样品组分与试验试剂的反应，测定所述抗体在所述 样品中的存在和/或浓度。
所述试验试剂优选包含检测试剂和至少一种干扰消除试剂，且步骤 (b)包含测定所需样品组分(即待测抗体类型)与检测试剂的反应， 其中用至少一种干扰消除试剂，捕获不需要的样品组分，例如不同类别 的抗体，例如无关的感染阶段特有的IgG和/或IgM抗体。在优选的实 施方案中，待测抗体是IgM抗体，更优选在感染、尤其原发感染的早期 和/或急性阶段中产生的IgM抗体。在该情况下，试验试剂优选还包含 用于捕获IgG抗体的干扰消除试剂，和/或用于捕获在感染晚期和/或复 发性感染中产生的IgM抗体的干扰消除试剂，其中所述干扰消除试剂不 携带报道基团。所述干扰消除试剂的特征在于，它的有效表位浓度或密 度不同于检测试剂的有效表位浓度或密度。在提供检测试剂来差别化检 测在感染的早期和/或急性阶段产生的IgM抗体的情况下，干扰消除试 剂的有效表位浓度或密度更低。例如，干扰消除试剂的表位浓度或密度 不应当超过检测试剂表位密度的50％。
优选地，将样品与一种或多种干扰消除试剂预温育，然后接触检测 试剂。
IgG干扰消除试剂的实例是抗原，包括含有单体表位的片段。在优 选的实施方案中，IgG干扰消除试剂是融合多肽，其包含单体蛋白伴侣 结构域(例如来自大肠杆菌的SlyD)和来自病原体的包含表位的片段的 单个拷贝。在IgG干扰消除试剂中存在的表位可以与检测试剂中的表位 相同。
用于捕获并从而猝灭晚期IgM抗体的干扰消除试剂的实例是，包含 多个表位的多聚体抗原。但是，在该实施方案中，干扰消除试剂包含比 检测试剂更少数目的表位。优选地，干扰消除试剂包含至少2个表位和 最高达各个检测试剂表位的半数。令人惊奇地，发现这样的多聚体干扰 消除试剂能捕获并从而猝灭晚期IgM抗体，发现它们具有比待测早期抗 体更高的对表位的亲和力，且对所需早期IgM抗体的检测没有显著的负 面作用。因而，例如，IgM干扰消除试剂可以包含表位的2-6个、例如 2、3、4或6个拷贝，而早期IgM检测试剂可以包含含有表位的片段的 至少8个、例如至少12或16个拷贝。干扰消除试剂可以是例如，包含 单体蛋白伴侣结构域例如SlyD和多个表位的融合多肽，或包含多聚化 结构域和单个表位或2个表位拷贝的融合多肽。在IgM干扰消除试剂中 存在的表位优选可与检测试剂中的表位相同。
本发明的方法优选作为双抗原夹心试验来实现，其中所述试验试剂 包含2种如上所述的融合多肽，其中所述第一种融合多肽携带报道基团 或携带可以结合到报道基团上的偶联基团。第二种融合多肽结合在固相 上，或携带用于固定化到固相上的偶联基团。在该实施方案中，通过用 第一种和第二种融合多肽形成复合物，并检测所述固相上的所述复合 物，测定抗体分析物。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法可以作为间接试验来实 现，其中所述试验试剂包含一种融合多肽，其携带用于固定化到固相上 的偶联基团和识别待测抗体类别(例如抗-人IgM抗体)的受体，其中 所述受体携带报道基团，且其中通过在固相上用融合多肽和受体形成复 合物来测定抗体。或者，该间接试验可以包含使用固定化的或可固定化 的受体和包含报道基团的融合多肽。
如上所述，本发明允许差别诊断IgM抗体。因而，另一个实施方案 涉及特异性测定在感染晚期和/或复发性感染中产生的IgM抗体。在该 实施方案中，检测试剂包含至少一种具有上述低表位密度的多聚体抗 原，例如优选地包含2-6个、例如2、3、4或6个表位拷贝的融合多肽， 其可能适用作“早期”IgM抗体试验中的干扰消除试剂，但是携带报道 和/或偶联基团。另外，该试验优选包含捕获如上所述IgG抗体的干扰消 除试剂和/或捕获在感染早期阶段、尤其原发和/或急性感染早期阶段中 产生的IgM抗体的干扰消除试剂。优选地，“早期”IgM抗体的干扰消 除试剂对应着用于测定“早期”IgM抗体、但是没有报道基团的试验试 剂。或者，有差别的IgM测定可以通过差别分析来实现，即在有仅检测 一类IgM抗体(例如“早期”抗体)的试验试剂存在下的第一个试验和 使用检测所有IgM抗体的试验试剂的第二个试验。
在另一个实施方案中，待测抗体是IgG抗体。在该情况下，检测试 剂是单体抗原，例如上述的单体融合蛋白。另外，试验试剂包含用于捕 获IgM抗体的干扰消除试剂，它是包含如上所述的本发明融合多肽复合 物的多聚体抗原，其中每个融合多肽包含多聚化结构域和多个表位拷 贝。干扰消除试剂优选不含有报道基团。
本发明的另一个方面涉及差别化检测样品中的IgM抗体的方法，其 中所述样品可以包含选自干扰IgM抗体和/或干扰IgG抗体的干扰抗体。 根据该方法，使用包含多个抗原的试验试剂，所述抗原即包含待测抗体 可以结合的多个表位拷贝的抗原。优选地，试验抗原包含报道基团。
本发明的方法基于使用具有预选的有效表位密度和/或浓度的多聚 体试验抗原，它适合待测的IgM抗体类型。试验抗原优选地与干扰消除 试剂相组合，所述干扰消除试剂适合消除不需要的IgM抗体类型与试验 抗原的结合。
试验抗原的有效表位密度或浓度适合待测IgM抗体的类型，例如在 感染、优选原发感染的早期或急性阶段中产生的IgM抗体，或者在感染 晚期产生的IgM抗体，在感染后产生的IgM抗体和/或在持续或复发性 感染中产生的IgM抗体。优选地，差别化IgM抗体检测在有至少一种干 扰消除试剂存在下进行，其可以包含特异性结合干扰IgM抗体的抗原和 /或特异性结合干扰IgG抗体的抗原。
在优选的实施方案中，所述方法包含下述步骤：
(a)温育所述样品和试验试剂，所述试验试剂包含：
(i)至少一个特异性结合IgM抗体的受体R1，
(ii)至少一个特异性结合要差别化检测的IgM抗体的受体R2， 其中R2携带报道基团，
(iii)任选地，至少一个特异性结合干扰IgM抗体的受体R3， 和
(iv)任选地，特异性结合IgG抗体的受体R4，
(b)允许形成下述复合物：
(i)包含R1、所述要差别化检测的IgM抗体和R2的复合物， 所述复合物携带报道基团，
(ii)任选地，包含R3和所述干扰IgM抗体的复合物，从而 消除所述干扰IgM抗体与R2的干扰结合，
(iii)任选地，包含R4和所述干扰IgG抗体的复合物，从而 消除所述干扰IgG抗体与R2的干扰结合，和
(c)测定通过R2结合到所述要差别化检测的IgM抗体上的所述报 道基团，作为所述样品中所述IgM抗体的度量。
所述试验可以以双抗原夹心测定形式或如上所述的间接形式进行。 在双抗原夹心形式中，受体R1可以是多聚体抗原，其特异性结合待测 IgM抗体。在间接试验形式中，受体R1可以是特异性结合任意IgM、 尤其样品中的任意人IgM的受体，例如抗-人IgM抗体。优选地，在固 相上检测所需的IgM抗体类型的结合。为此目的，受体R1优选地携带 用于固定化到固相上的偶联基团，例如如上所述的偶联基团，优选生物 素。标记的受体R2的报道基团是如上所述的报道基团，优选电致化学 发光基团。当使用干扰消除试剂即受体R3和/或R4时，它们优选地与 样品预温育，然后加入受体R1和/或R2。
IgG干扰消除受体R4优选地是单体受体，即包含单个表位拷贝的 抗原。试验受体R2和IgM干扰消除受体R3是多聚体受体，即包含多 个表位拷贝的抗原。但是，R2和R3具有不同的有效表位密度或浓度， 且因而优先结合不同类型的IgM抗体。关于在感染、优选原发感染的早 期或急性阶段产生的IgM抗体的差别化测定，标记的受体R2可以包含 例如至少6个、优选至少8个和更优选至少12个由待测IgM抗体识别 的表位拷贝，最高达40个、优选最高达30个和最优选最高达25个表 位拷贝。与试验受体R2的表位密度或浓度相比，对“晚期”IgM抗体 特异性的干扰消除受体R3的有效表位密度或浓度，可以是例如至少1/2， 优选至少1/3，和最优选至少1/4或甚至更低。在该实施方案中，干扰消 除受体R3可以包含2-8个、优选3-6个表位拷贝。
多聚体试验受体R2优选地是本发明第一个方面的上述融合多肽。 多聚体干扰消除受体R3也可以是如上所述的融合多肽。但是，应当指 出，在本发明的该实施方案中，也可以使用常规多聚体试验抗原，例如 通过同或异双功能交联剂化学交联单体抗原或表位得到的多聚体抗原。 或者，多聚体抗原可以是载体分子，例如含有与其偶联的肽表位序列的 载体多肽或多聚体肽，例如在Lee等(Nature Biotechnology 23(2005)， 1517-1526)中所述的分支的多聚体肽，其内容在本文中引作参考。
本发明的另一个方面涉及用于差别化检测样品中针对病原体的IgM 抗体的试验试剂，其中所述样品可以包含选自干扰IgM抗体和/或干扰 IgG抗体的干扰抗体，其包含：
(i)至少一个特异性结合IgM抗体的受体R1，
(ii)至少一个特异性结合要差别化检测的IgM抗体的受体R2，其 中R2携带报道基团，
(iii)任选地，至少一个特异性结合干扰IgM抗体的受体R3，和
(iv)任选地，特异性结合IgG抗体的受体R4。
下面的附图和实施例进一步解释了本发明。
(i)至少一个多聚化结构域，和
(ii)来自病原体的表位区段的多个拷贝。
所述融合多肽分子能形成多聚体。多聚体包含多个经由多聚化结构 域通过非共价相互作用结合到一起的单体亚基。多聚体可以通过例如在 合适条件下温育融合多肽分子来形成。
本发明的融合多肽是遗传融合体，其可以根据标准方法大量和以可 再现的质量生产。融合多肽和由其形成的多聚体具有高稳定性和溶解 度，且因而在检测由病原体感染产生的抗体的方法中是优良的试验抗 原。优选地，融合多肽用于测定IgM抗体，更优选地用于差别化测定IgM 抗体，最优选地用于差别化测定在急性和/或原发感染中产生的早期IgM 抗体。融合多肽可以携带报道基团和/或捕获基团，且因而可以用作检测 和/或捕获抗原。此外，融合多肽也适用作干扰消除剂。
本发明的融合多肽分子优选地包含1个或2个多聚化结构域、更优 选1个多聚化结构域。多聚化结构域优选地位于融合多肽的N-和/或C- 末端、更优选N-末端。多聚化结构域是支持单独融合多肽分子多聚化的 多肽序列，其中形成包含通过非共价相互作用结合到一起的多个单体亚 基的多聚体。复合物的单体亚基是遗传融合蛋白，其中所述单独氨基酸 残基通过肽键相连。多聚体的单体亚基优选地是相同的。
例如，多聚化结构域可以是二聚化结构域，即支持2个亚基的非共 价结合的结构域，支持3个亚基的非共价结合的三聚化结构域，四聚化 结构域或甚至更高的多聚化结构域。优选地，多聚化结构域是二聚化结 构域、三聚化结构域或四聚化结构域。
多聚化结构域可以选自原核或真核蛋白伴侣，优选不依赖于ATP 的蛋白伴侣。多聚化结构域的具体实例是来自大肠杆菌的蛋白FkpA、 Skp和SecB或来自其它原生生物的它们的直向同源物。FkpA是来自大 肠杆菌的不依赖于ATP的周质二聚化蛋白伴侣。Skp是来自大肠杆菌的 不依赖于ATP的周质三聚化蛋白伴侣。SecB是来自大肠杆菌的不依赖 于ATP的胞质四聚化蛋白伴侣。其它合适的多聚化结构域是来自真核或 原核生物的热激蛋白，例如Hsp25，即不依赖于ATP的真核胞质/核寡 聚体蛋白伴侣。其它合适的多聚化结构域是MIP(巨噬细胞感染性增强 剂)，在结构上与FkpA相关的不依赖于ATP的二聚化蛋白伴侣。依赖 于ATP的蛋白伴侣如GroEL(来自大肠杆菌的依赖于ATP的胞质七聚 化蛋白伴侣)或ClpB(来自大肠杆菌的依赖于ATP的六聚化蛋白伴侣) 或ClpX也是合适的。此外，多聚化结构域可以选自上述多肽的片段或 变体，它们保留其形成多聚体的能力。
本发明的融合多肽包含表位区段的多个拷贝。表位区段包含由抗体 识别的氨基酸序列。因而，所述多肽包含识别各个表位的抗体的多个结 合部位。优选地，单独表位区段的氨基酸序列是相同的或基本上相同的。 但是，一个或多个表位区段可能是不同的，只要这些差异不会负面地影 响待测抗体的识别即可。所述融合多肽包含表位区段的至少2个、优选 2-10个、更优选2-6个和最优选2、3、4、5或6个拷贝。
由多个单独融合多肽亚基组成的多聚体优选地包含表位区段的至 少4个、更优选至少6个和最优选至少8个拷贝。所述多聚体可以包含 例如表位区段的最高达40个、优选最高达30个和最优选最高达25个 拷贝。
通常，所述融合多肽包括仅一个表位区段的多个拷贝。在该情况下， 所述融合多肽具有一种抗体特异性。但是，在有些实施方案中，预见到 所述融合多肽包含2个或更多个不同表位区段、优选2个不同表位区段 的多个拷贝。在该情况下，所述融合多肽适用于检测几种类型的抗体特 异性。
表位区段的长度通常是至少5个氨基酸，优选至少6个氨基酸和更 优选至少8个氨基酸。表位区段的最大长度通常是100-120个氨基酸， 优选80个氨基酸和更优选70个氨基酸。最优选地，表位区段的长度是 15-50个氨基酸。
融合多肽的单独表位区段可以被间隔序列隔开。间隔序列优选地是 与表位区段的来源病原生物异源的序列。为了实践目的，间隔序列选自 几乎不在任何程序上妨碍该融合多肽作为测定抗体的试验抗原的应用 的序列。这意味着，间隔序列对待测抗体是非免疫反应性的。优选地， 间隔序列包含甘氨酸和/或丝氨酸残基。尤其优选的是聚甘氨酸间隔序 列。间隔序列的长度优选地是1-10个氨基酸、更优选2-5个氨基酸且最 优选3或4个氨基酸。尤其优选的是(Gly)3间隔序列。
此外，在多聚化结构域和表位区段之间可以存在间隔序列。该间隔 序列可以具有例如1-100个氨基酸的长度。优选地，该间隔序列与多聚 化结构域和表位区段异源。优选地，间隔序列如上所述。
融合多肽的表位区段是来自病原体的抗原序列，其能结合在病原体 感染的生物的免疫反应过程中产生的抗体。优选地选择表位序列，以被 在感染的特定阶段产生的抗体所识别，例如被早期感染状态期间的抗体 所优先识别的“早期”表位，或在晚期感染状态中优先识别的“晚期” 表位。在优选的实施方案中，表位区段包含被所述病原体感染的早期和 /或急性阶段产生的抗体特异性识别的表位。在尤其优选的实施方案中， 表位区段包含被所述病原体原发感染的早期和/或急性阶段产生的抗体 特异性识别的表位。在另一个实施方案中，表位区段包含被所述病原体 感染的晚期阶段或感染后产生的抗体特异性识别的表位。在另一个实施 方案中，表位区段包含被所述病原体持续或复发性感染中产生的抗体特 异性识别的表位。
表位区段可以源自任何病毒、细菌或原生动物(protozoic)病原体， 它能造成可检测的免疫反应，即作为感染的结果，产生抗体、尤其IgM 抗体。例如，所述病原体选自：
(i)疱疹病毒例如人单纯疱疹病毒1和2(HHV1和HHV2)、水 痘-带状疱疹病毒(HHV3)、EB病毒(HHV4/EBV)或人巨细胞病毒 (HHV5)和人疱疹病毒6、7和8；
(ii)风疹病毒；
(iii)肝炎病毒例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV) 和丙型肝炎病毒(HCV)；
(iv)副粘病毒例如麻疹病毒和腮腺炎病毒；
(v)弓形虫属(Toxoplasma)生物和
(vi)疏螺旋体属(Borrelia)生物。
来自这些病原体的合适表位的实例，已经在下面详述的许多文件中 描述。这些文件和其中引用的文献在本文中引作参考。
指示着早期感染的IgM分子的特异性检测，在临床上对人中的许多 病毒、细菌和原生动物感染是重要的。疱疹病毒科(herpesviridae)， 例如包含单纯疱疹病毒1和2(HHV1、HHV2)、水痘-带状疱疹病毒 (HHV3)、EB病毒(HHV4)、人巨细胞病毒(HHV5)和人疱疹病毒 6、7和8。人巨细胞病毒(HHV5)在妊娠常规诊断中起关键作用：当 没有针对该病毒的体液或细胞免疫的生育妇女在妊娠前三个月期间经 历原发感染时，它可以对胎儿造成毁坏性损害。
通过表位绘图，已经在不同疱疹抗原中鉴别出了许多重要的免疫决 定簇。例如，Greijer等，J.Clin.Microbiol.(1999)37(1)，179-188 总结了HCMV抗原pp150、p52、gB和pp28中的单独表位的抗体反应 性。Schoppel等，J.Infect.Dis.(1997)175(3)，533-544描述了其它 表位。至于单纯疱疹病毒，已经分别将优势免疫表位作图在来自HSV-2 的成熟糖蛋白G的序列552-578中(Marsden等，J.Med.Virol.(1998) 56，79-84；Liljeqvist等，J.Gen.Virol.(1998)79，1215-1224)和来自 HSV-1的糖蛋白G1的序列112-127(等，J.Gen.Virol.(2000) 81，1033-1040)。这些表位可以掺入本发明的融合多肽中。
作为妊娠筛选中的参数起突出作用，鼠弓形虫(Toxoplasma gondii) 和风疹病毒以及人巨细胞病毒和单纯疱疹病毒1型和2型构成TORCH 家族。这些病原体在妊娠前三个月对孕妇(缺少体液和细胞免疫)的原 发感染，可能导致对胎儿的严重损害。这迫切需要区分原发和复发性感 染的可靠的差别诊断。如上所述，在几种HCMV抗原内的免疫显性决 定簇从文献中可获知，例如来自pp150的序列595-636和1011-1048、来 自p52的序列266-293和295-312、来自糖蛋白B的序列792-809和60-81 和来自pp28的序列15-45和130-160(Greijer等，同上)。类似地，已 经在来自风疹病毒的免疫显性包膜蛋白E1上鉴别出了主要表位。例如， 氨基酸243-286之间的区域含有3个中和表位，如Terry等(Terry等， Arch.Virol.(1988)98，189-197)所报道的。另一种中和E1表位已经 在氨基酸213-239之间的区域表征(Mitchell等，J.Clin.Microbiol.(1992) 30(7)，1841-1847)。已经在第二种风疹包膜蛋白E2上，鉴别出具 有中和能力的至少一种优势免疫表位(Green&Dorsett，J.Virol(1986) 57(3)，893-898)。免疫显性的T-细胞表位和几种线性B-细胞表位已 经被定位在E2区域31-105(McCarthy等，J.Virol.(1993)67(2)， 673-681；Wolinsky等，J.Virol.(1991)65，3986-3994)。这些表位可 以掺入本发明的融合多肽中。
已经将来自鼠弓形虫的几种蛋白鉴别为免疫显性抗原：致密颗粒蛋 白GRA1(p24)、GRA2(p28)、GRA4(p41)、GRA6(p32)、GRA7 (p29)和GRA8(p35)，表面抗原SAG1(p30)和SAG2(p22)，棒 状体抗原ROP1(p66)和ROP2(p54)，基质蛋白MAG1(p65)和微 丝蛋白MIC3和MIC5(Pfrepper等，Clin Diagn.Lab.Immunol.(2005) 12(8)，977-982)。关于抗-弓形虫属IgM抗体的检测，以前已经提出 了GRA7、GRA8和ROP1的组合(Aubert等，J.Clin.Microbiol.(2000) 38：1144-1150)。这些表位可以掺入本发明的融合多肽中。
血清学的另一个重要领域覆盖了肝炎病毒例如HAV、HBV和HCV。 每种这样的病原体的免疫显性抗原和各自的优势免疫表位是众所周知 的。例如，HBV核壳蛋白是慢性乙型肝炎中宿主免疫应答的主要靶，且 已经表征了几种优势免疫表位。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)上的重要 B-细胞表位已经被定位在氨基酸74-89、130-138(Salfeld等，J.Virol. (1989)63，798-808)和107-118(Colucci等，J.Immunol.(1988)141， 4376-4380)。这些表位可以掺入本发明的融合多肽中。
已经表征了许多丙型肝炎抗原的优势免疫表位(总结在Carlos等， Clin.Immunol.(2004)111，22-27)。例如，已经定义了核心(7-18)、 E2(484-499)、NS3(1248-1265)和NS4(1767-1786)的免疫显性区 域的表位，以及来自E2HVR1基因型1a(386-406)、E2HVR2基因型 1a(472-485)、E2 HVR1基因型1b(386-406)和E2 HVR2基因型1b (472-485)的高变区的表位。这些和其它HCV表位可以掺入本发明的 融合多肽中，并应证实可用于开发根据本发明的差别IgM免疫测定。
其它重要的人病原体是麻疹病毒和腮腺炎病毒，它们二者都属于副 粘病毒科，且各自由6个结构蛋白组成。麻疹病毒的核壳蛋白N是体液 免疫应答的主要靶，且针对N的B-细胞应答在控制麻疹感染中是关键 的。最近，将优势免疫表位作图在氨基酸419和525之间的N抗原C- 末端内。具体地，线性表位可定位于440-448的序列内(Zvirbliene等， Arch.Virol.(2007)152，25-39)。类似地，来自腮腺炎病毒的核衣壳 结合的蛋白NP构成主要抗原决定簇，且NP的重组变体表现出高抗原 性，并非常适用于在腮腺炎血清学中特异性检测IgM(Samuel等，J.Med. Virol.(2002)66，123-130)。
疏螺旋体属(布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、嘎氏疏螺旋体(B. garinii)、阿氏疏螺旋体(B.afzelii))的免疫诊断引起了日益增长的 兴趣，这是因为该螺旋体的无情传播。由于尾随显著的气候变化的即将 到来的暖冬，假定疏螺旋体属的影响在不久的将来甚至会增加更多。已 经描述了布氏疏螺旋体VlsE抗原的免疫显性保守区，它非常适用于灵 敏的且特异性的血清诊断(Liang等，J.Clin.Microbiol.(1999)37(12)， 3990-3996)。所谓的IR6或C6区域(Liang&Philipp，Infect.Immun. (1999)67，6702-6706；Liang等，J.Immunol.(1999)163(10)5566-5573) 包含不变的26氨基酸区段，它可以掺入本发明的融合多肽中。
所述融合多肽优选地在检测样品中的抗体、尤其IgM抗体的方法中 用作试验试剂。为此目的，融合蛋白可以携带报道和/或偶联基团。合适 的报道基团的实例是通过视觉手段可检测的基团，例如荧光基团，发光 基团，例如化学发光基团，或微粒基团例如金属，例如金或胶乳粒子。 当然，其它报道基团例如酶基团、放射性基团、半抗原基团等也是合适 的。特别优选的是电致化学发光报道基团，尤其钌基团，例如钌(联吡 啶)3或钌(菲咯啉)3基团。尤其优选的也是半抗原报道基团，例如洋 地黄毒苷基团，其可以用抗-半抗原抗体例如抗-洋地黄毒苷抗体检测。
在另一个实施方案中，所述融合多肽可以携带至少一个偶联基团。 偶联基团是用于将融合多肽偶联到其它化合物或物质(例如固相或上面 定义的报道基团)上的基团。偶联基团可以是用于共价偶联或非共价偶 联的基团。优选地，偶联基团是特异性结合对的第一配偶体，它与结合 对的第二配偶体特异性地相互作用。优选的结合对是生物素/抗生物素蛋 白、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/抗生物素抗体、半抗原/抗-半抗 原抗体和碳水化合物/凝集素。优选地，偶联基团是生物素基团，包括生 物素衍生物，即结构上与生物素相关的化合物，其保持结合链霉抗生物 素蛋白和/或抗生物素蛋白的能力。
根据常规方式，可以将融合多肽结合到报道和/或偶联基团上。例如， 可以制备包含报道和/或偶联基团的缀合试剂。这些试剂还可以包含能与 多肽上存在的基团反应的基团，例如羟基、氨基、羧基和/或硫代基团。 偶联基团的具体实例是活性酯基团，例如N-羟基琥珀酰亚胺基团或马来 酰亚胺基团。
本发明还涉及编码上述融合多肽的核酸分子。所述核酸分子优选地 是DNA分子。为了增加核酸分子的稳定性，优选地编码单独表位区段 (它们优选地在氨基酸水平是相同的)的部分具有在遗传密码简并范围 内的不同核苷酸序列，其中使用编码相同氨基酸的不同核苷酸三联体密 码子。更优选地，编码单独相同表位区段的每个部分具有不同于其它部 分的核苷酸序列。
另外，本发明涉及表达载体，其包含至少一个可操作地连接到表达 控制序列上的上述核酸分子。所述表达载体可以是原核或真核载体，其 另外包含用于在各自宿主细胞中维持和繁殖的遗传元件，例如复制起点 和/或选择标记基因。所述表达控制序列可以是原核或真核表达控制序 列，其可以是组成型或诱导型的。选择表达控制序列，以允许在所需宿 主细胞中有效表达。合适的表达载体和表达控制序列的实例是技术人员 已知的，且记载在标准教科书中，例如Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbour Press，或可商业上得 到。
另外，本发明涉及用上述核酸分子或表达载体转染或转化的宿主细 胞。所述宿主细胞可以是原核细胞，例如革兰氏阴性细菌细胞，例如大 肠杆菌，或真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。宿主 细胞可以用于上述融合多肽的重组制备。优选地，重组生产包含下述步 骤：
(i)提供上述的宿主细胞，
(ii)在表达融合多肽的条件下，培养所述宿主细胞，和
(iii)分离所述融合多肽。
如上所述，本发明的融合多肽优选地用作检测样品中的抗体的方法 中的检测试剂。所述抗体优选是IgM抗体。更优选地，检测包含IgM抗 体的差别化测定。在尤其优选的实施方案中，抗体是在感染、尤其病原 体原发感染的早期或急性阶段中产生的IgM抗体。
在另一个实施方案中，所述融合多肽可以在检测样品中的抗体的方 法中用作干扰消除试剂。在该实施方案中，抗体优选是IgG抗体。
本发明也涉及用于检测样品中的抗体的试验试剂试剂盒，其包含至 少一种融合多肽和其它试验组分。所述试验试剂可以包含含有单一类型 表位的单一融合多肽，或含有2种或更多种不同类型表位的单一融合多 肽，或含有单一类型表位或2种或更多种不同类型表位的2种或更多种 融合多肽。本发明的融合多肽可以是检测试剂或干扰消除试剂。如果融 合多肽是检测试剂，则它优选包含如上所述的报道和/或偶联基团。如果 融合多肽是干扰消除试剂，则它优选不包含任何报道基团。所述干扰消 除试剂的特征在于，它的有效表位浓度或密度不同于检测试剂的有效表 位浓度。优选地，干扰消除试剂的表位浓度或表位密度低于检测试剂的 表位浓度或表位密度。
本发明也涉及检测样品中针对病原生物的抗体的方法，其包含下述 步骤：
(a)温育所述样品和包含至少一种上述融合多肽和其它试验组分 的试验试剂，和
(b)通过评价样品组分与试验试剂的反应，测定所述抗体在所述 样品中的存在和/或浓度。
所述试验试剂优选包含检测试剂和至少一种干扰消除试剂，且步骤 (b)包含测定所需样品组分(即待测抗体类型)与检测试剂的反应， 其中用至少一种干扰消除试剂，捕获不需要的样品组分，例如不同类别 的抗体，例如无关的感染阶段特有的IgG和/或IgM抗体。在优选的实 施方案中，待测抗体是IgM抗体，更优选在感染、尤其原发感染的早期 和/或急性阶段中产生的IgM抗体。在该情况下，试验试剂优选还包含 用于捕获IgG抗体的干扰消除试剂，和/或用于捕获在感染晚期和/或复 发性感染中产生的IgM抗体的干扰消除试剂，其中所述干扰消除试剂不 携带报道基团。所述干扰消除试剂的特征在于，它的有效表位浓度或密 度不同于检测试剂的有效表位浓度或密度。在提供检测试剂来差别化检 测在感染的早期和/或急性阶段产生的IgM抗体的情况下，干扰消除试 剂的有效表位浓度或密度更低。例如，干扰消除试剂的表位浓度或密度 不应当超过检测试剂表位密度的50％。
优选地，将样品与一种或多种干扰消除试剂预温育，然后接触检测 试剂。
IgG干扰消除试剂的实例是抗原，包括含有单体表位的片段。在优 选的实施方案中，IgG干扰消除试剂是融合多肽，其包含单体蛋白伴侣 结构域(例如来自大肠杆菌的SlyD)和来自病原体的包含表位的片段的 单个拷贝。在IgG干扰消除试剂中存在的表位可以与检测试剂中的表位 相同。
用于捕获并从而猝灭晚期IgM抗体的干扰消除试剂的实例是，包含 多个表位的多聚体抗原。但是，在该实施方案中，干扰消除试剂包含比 检测试剂更少数目的表位。优选地，干扰消除试剂包含至少2个表位和 最高达各个检测试剂表位的半数。令人惊奇地，发现这样的多聚体干扰 消除试剂能捕获并从而猝灭晚期IgM抗体，发现它们具有比待测早期抗 体更高的对表位的亲和力，且对所需早期IgM抗体的检测没有显著的负 面作用。因而，例如，IgM干扰消除试剂可以包含表位的2-6个、例如 2、3、4或6个拷贝，而早期IgM检测试剂可以包含含有表位的片段的 至少8个、例如至少12或16个拷贝。干扰消除试剂可以是例如，包含 单体蛋白伴侣结构域例如SlyD和多个表位的融合多肽，或包含多聚化 结构域和单个表位或2个表位拷贝的融合多肽。在IgM干扰消除试剂中 存在的表位优选可与检测试剂中的表位相同。
本发明的方法优选作为双抗原夹心试验来实现，其中所述试验试剂 包含2种如上所述的融合多肽，其中所述第一种融合多肽携带报道基团 或携带可以结合到报道基团上的偶联基团。第二种融合多肽结合在固相 上，或携带用于固定化到固相上的偶联基团。在该实施方案中，通过用 第一种和第二种融合多肽形成复合物，并检测所述固相上的所述复合 物，测定抗体分析物。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法可以作为间接试验来实 现，其中所述试验试剂包含一种融合多肽，其携带用于固定化到固相上 的偶联基团和识别待测抗体类别(例如抗-人IgM抗体)的受体，其中 所述受体携带报道基团，且其中通过在固相上用融合多肽和受体形成复 合物来测定抗体。或者，该间接试验可以包含使用固定化的或可固定化 的受体和包含报道基团的融合多肽。
如上所述，本发明允许差别诊断IgM抗体。因而，另一个实施方案 涉及特异性测定在感染晚期和/或复发性感染中产生的IgM抗体。在该 实施方案中，检测试剂包含至少一种具有上述低表位密度的多聚体抗 原，例如优选地包含2-6个、例如2、3、4或6个表位拷贝的融合多肽， 其可能适用作“早期”IgM抗体试验中的干扰消除试剂，但是携带报道 和/或偶联基团。另外，该试验优选包含捕获如上所述IgG抗体的干扰消 除试剂和/或捕获在感染早期阶段、尤其原发和/或急性感染早期阶段中 产生的IgM抗体的干扰消除试剂。优选地，“早期”IgM抗体的干扰消 除试剂对应着用于测定“早期”IgM抗体、但是没有报道基团的试验试 剂。或者，有差别的IgM测定可以通过差别分析来实现，即在有仅检测 一类IgM抗体(例如“早期”抗体)的试验试剂存在下的第一个试验和 使用检测所有IgM抗体的试验试剂的第二个试验。
在另一个实施方案中，待测抗体是IgG抗体。在该情况下，检测试 剂是单体抗原，例如上述的单体融合蛋白。另外，试验试剂包含用于捕 获IgM抗体的干扰消除试剂，它是包含如上所述的本发明融合多肽复合 物的多聚体抗原，其中每个融合多肽包含多聚化结构域和多个表位拷 贝。干扰消除试剂优选不含有报道基团。
本发明的另一个方面涉及差别化检测样品中的IgM抗体的方法，其 中所述样品可以包含选自干扰IgM抗体和/或干扰IgG抗体的干扰抗体。 根据该方法，使用包含多个抗原的试验试剂，所述抗原即包含待测抗体 可以结合的多个表位拷贝的抗原。优选地，试验抗原包含报道基团。
本发明的方法基于使用具有预选的有效表位密度和/或浓度的多聚 体试验抗原，它适合待测的IgM抗体类型。试验抗原优选地与干扰消除 试剂相组合，所述干扰消除试剂适合消除不需要的IgM抗体类型与试验 抗原的结合。
试验抗原的有效表位密度或浓度适合待测IgM抗体的类型，例如在 感染、优选原发感染的早期或急性阶段中产生的IgM抗体，或者在感染 晚期产生的IgM抗体，在感染后产生的IgM抗体和/或在持续或复发性 感染中产生的IgM抗体。优选地，差别化IgM抗体检测在有至少一种干 扰消除试剂存在下进行，其可以包含特异性结合干扰IgM抗体的抗原和 /或特异性结合干扰IgG抗体的抗原。
在优选的实施方案中，所述方法包含下述步骤：
(a)温育所述样品和试验试剂，所述试验试剂包含：
(i)至少一个特异性结合IgM抗体的受体R1，
(ii)至少一个特异性结合要差别化检测的IgM抗体的受体R2， 其中R2携带报道基团，
(iii)任选地，至少一个特异性结合干扰IgM抗体的受体R3， 和
(iv)任选地，特异性结合IgG抗体的受体R4，
(b)允许形成下述复合物：
(i)包含R1、所述要差别化检测的IgM抗体和R2的复合物， 所述复合物携带报道基团，
(ii)任选地，包含R3和所述干扰IgM抗体的复合物，从而 消除所述干扰IgM抗体与R2的干扰结合，
(iii)任选地，包含R4和所述干扰IgG抗体的复合物，从而 消除所述干扰IgG抗体与R2的干扰结合，和
(c)测定通过R2结合到所述要差别化检测的IgM抗体上的所述报 道基团，作为所述样品中所述IgM抗体的度量。
所述试验可以以双抗原夹心测定形式或如上所述的间接形式进行。 在双抗原夹心形式中，受体R1可以是多聚体抗原，其特异性结合待测 IgM抗体。在间接试验形式中，受体R1可以是特异性结合任意IgM、 尤其样品中的任意人IgM的受体，例如抗-人IgM抗体。优选地，在固 相上检测所需的IgM抗体类型的结合。为此目的，受体R1优选地携带 用于固定化到固相上的偶联基团，例如如上所述的偶联基团，优选生物 素。标记的受体R2的报道基团是如上所述的报道基团，优选电致化学 发光基团。当使用干扰消除试剂即受体R3和/或R4时，它们优选地与 样品预温育，然后加入受体R1和/或R2。
IgG干扰消除受体R4优选地是单体受体，即包含单个表位拷贝的 抗原。试验受体R2和IgM干扰消除受体R3是多聚体受体，即包含多 个表位拷贝的抗原。但是，R2和R3具有不同的有效表位密度或浓度， 且因而优先结合不同类型的IgM抗体。关于在感染、优选原发感染的早 期或急性阶段产生的IgM抗体的差别化测定，标记的受体R2可以包含 例如至少6个、优选至少8个和更优选至少12个由待测IgM抗体识别 的表位拷贝，最高达40个、优选最高达30个和最优选最高达25个表 位拷贝。与试验受体R2的表位密度或浓度相比，对“晚期”IgM抗体 特异性的干扰消除受体R3的有效表位密度或浓度，可以是例如至少1/2， 优选至少1/3，和最优选至少1/4或甚至更低。在该实施方案中，干扰消 除受体R3可以包含2-8个、优选3-6个表位拷贝。
多聚体试验受体R2优选地是本发明第一个方面的上述融合多肽。 多聚体干扰消除受体R3也可以是如上所述的融合多肽。但是，应当指 出，在本发明的该实施方案中，也可以使用常规多聚体试验抗原，例如 通过同或异双功能交联剂化学交联单体抗原或表位得到的多聚体抗原。 或者，多聚体抗原可以是载体分子，例如含有与其偶联的肽表位序列的 载体多肽或多聚体肽，例如在Lee等(Nature Biotechnology 23(2005)， 1517-1526)中所述的分支的多聚体肽，其内容在本文中引作参考。
本发明的另一个方面涉及用于差别化检测样品中针对病原体的IgM 抗体的试验试剂，其中所述样品可以包含选自干扰IgM抗体和/或干扰 IgG抗体的干扰抗体，其包含：
(i)至少一个特异性结合IgM抗体的受体R1，
(ii)至少一个特异性结合要差别化检测的IgM抗体的受体R2，其 中R2携带报道基团，
(iii)任选地，至少一个特异性结合干扰IgM抗体的受体R3，和
(iv)任选地，特异性结合IgG抗体的受体R4。
下面的附图和实施例进一步解释了本发明。
附图说明
图1：通过SDS-PAGE证明的Skp-p52-X4的纯化。泳道1，来自 Invitrogen的未染色的蛋白标准标记12；泳道3，超量生产大肠杆菌株 BL21/DE 3的离液粗裂解物；泳道5，IMAC流通；泳道6，咪唑洗涤级 分，泳道8，咪唑洗脱级分；泳道9，凝胶过滤(Superdex 200)后的 Skp-p52-X4。在方法部分所述的简单的一步规程中，可以高得率地纯化 和重折叠Skp-p52-X4。
图2A-I：氨基酸序列(参考序列表)。
图2A-I：氨基酸序列(参考序列表)。
具体实施方式
序列表
SEQ ID NO.1：SlyD的氨基酸序列(AA 1-165)
SEQ ID NO.2：FkpA的氨基酸序列(AA 26-270)
SEQ ID NO.3：Skp的氨基酸序列(AA 21-161)
SEQ ID NO.4：Skp-ppUL32-X1的氨基酸序列(ppUL32＝HCMV pp150，AA 587-640)
SEQ ID NO.5：Skp-ppUL32-X4的氨基酸序列
SEQ ID NO.6：Skp-pp150-X1的氨基酸序列(pp150＝HCMV pp150， AA 999-1048)
SEQ ID NO.7：Skp-pp150-X4的氨基酸序列
SEQ ID NO.8：Skp-pp150-X1的氨基酸序列(p52＝HCMV p52，AA 254-293)
SEQ ID NO.9：Skp-p52的氨基酸序列，AA 254-293
实施例
实施例1：融合多肽试验试剂的生产
1.材料和方法
1.1.材料和试剂
氯化胍(guanidinum-Cl)(GdmCl)购自NIGU(Waldkraiburg，德 国)。无EDTA的蛋白酶抑制剂片剂、咪唑和EDTA购自Roche Diagnostics GmbH(Mannheim，德国)，所有其它化学试剂都是分析级 的，购自Merck(Darmstadt，德国)。超滤薄膜(YM10，YM30)购自 Amicon(Danvers，MA，USA)、微量透析膜(VS/0.025μm)和超滤 单元(biomax ultrafree filter devices)购自Millipore(Bedford，MA，USA)。 用于过滤粗裂解物的硝酸纤维素和醋酸纤维素膜(1.2μm/0.45μm/0.2 μm)购自Sartorius(德国)。
1.2表达盒的克隆
从SwissProt(UniProt)数据库得到Skp、FkpA和SlyD的序列(SkP： SwissProt登记号P11457；FkpA：SwissProt登记号P45523；SlyD：SwissProt 登记号P0A9K9)。通过PCR，从大肠杆菌株BL21(DE3)扩增大肠杆 菌Skp、FkpA和SlyD的基因，限制酶切后，连接进pET24a表达载体 (Novagen，Madison，Wisconsin，USA)。为了防止通过二硫键形成共 价加合物，去除SlyD的富半胱氨酸的C末端部分(166-196)，且将截 短的SlyD形式AA 1-165(SEQ ID NO.1)用作融合配偶体。为了确保 靶分子的胞质表达，省略了周质蛋白伴侣FkpA和Skp的信号序列。因 而，将FkpA形式AA 26-270(SEQ ID NO.2)和Skp形式AA 21-161(SEQ ID NO.3)用作融合多肽的模块。如Scholz等(J.Mol.Biol.345(2005)， 1229-1241)所述，设计融合蛋白的表达盒。使用QuikChange(Stratagene， La Jolla，USA)和标准的PCR技术来产生点突变、缺失和插入变体或 限制位点。所有重组蛋白变体都含有C-末端六组氨酸标签，以促进 Ni-NTA-辅助的纯化和重折叠。
1.3融合蛋白变体的表达、纯化和重折叠
使用实际上相同的规程，纯化所有多肽融合变体。在添加了卡那霉 素(30μg/ml)的LB培养基中，在37℃培养携带特定pET24a表达质粒 的大肠杆菌BL21(DE3)细胞至OD600为1.5，且通过加入1mM异丙 基-β-D-硫代半乳糖苷，诱导胞质超表达。诱导后3小时，通过离心(20 分钟，5000g)收获细胞，冷冻，且在-20℃保藏。对于细胞裂解，将冷 冻的沉淀重新悬浮于冷却的50mM磷酸钠pH 8.0，7.0M GdmCl，5mM 咪唑中，在冰上搅拌悬浮液2小时，以完成细胞裂解。离心和过滤(硝 酸纤维素膜，0.45μm/0.2μm)后，将裂解物应用于用包含5.0mM TCEP (三(2-羧乙基)膦)的裂解缓冲液平衡的Ni-NTA柱。使随后的洗涤 步骤适合各自的靶蛋白，且其范围为溶于50mM磷酸钠pH 8.0，7.0M GdmCl，5.0mM TCEP中的10-25mM咪唑(SlyD和FkpA融合蛋白) 至30mM咪唑(Skp融合蛋白)。应用至少10-15体积的洗涤缓冲液。 然后，将GdmCl溶液替换为50mM磷酸钠pH 7.8，100mM NaCl，10mM 咪唑，5.0mM TCEP，以诱导基质结合的蛋白的构象重折叠。为了避免 共纯化蛋白酶的再活化，将蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)( 无EDTA，Roche)包含在重折叠缓冲液中。在过夜反应中，应用共15-20 柱体积的重折叠缓冲液。然后，通过用3-5柱体积的50mM磷酸钠pH 7.8，100mM NaCl，40mM咪唑洗涤，取出TCEP和无EDTA 的抑制剂混合物。然后，用在相同缓冲液中的250mM咪唑，洗脱天然 蛋白。通过和von Jagow(Anal.Biochem.166(1987)，368-379) 所述的Tricine-SDS-PAGE，评判含有蛋白的级分的纯度，并合并。最后， 对蛋白进行大小排阻层析(Superdex HiLoad，Amersham Pharmacia)， 合并含有蛋白的级分，且在Amicon cell(YM10)中浓缩。
生产了下述Skp融合多肽：
Skp-ppUL32-X1(SEQ ID NO.4)和Skp-ppUL32-X4(SEQ ID NO.5)
这些融合多肽包含Skp融合模块和人巨细胞病毒(HMCV)表位 ppUL32的1个(X1)或4个(X4)拷贝。该表位对应着HCMV大结构 磷蛋白pp150(Uniprot ID P08318)的氨基酸587-640。
Skp-pp150-X1(SEQ ID NO.6)和Skp-pp 150-X4(SEQ ID NO.7)
这些融合多肽包含Skp融合模块和HMCV pp150表位的1个(X1) 或4个(X4)拷贝，该表位对应着HCMV pp150的氨基酸999-1048。
Skp-p52-X1(SEQ ID NO.8)和Skp-p52-X4(SEQ ID NO.9)
这些融合多肽包含Skp融合模块和HMCV p52表位的1个(X1) 或4个(X4)拷贝，该表位对应着HCMV聚合酶辅助蛋白p52(Uniprot ID P16790)的氨基酸254-293。
1.4分光镜测量
使用Uvikon XL双光束分光光度计，进行蛋白浓度测量。使用Pace 等(Protein Sci.4(1995)，2411-2423)所述的程序，测定摩尔消光系 数(ε280)。
1.5钌部分与融合蛋白的偶联
用N-羟基-琥珀酰亚胺激活的钌标记，在约10mg/ml的蛋白浓度， 修饰融合蛋白的赖氨酸ε-氨基。依赖于各自融合蛋白，标记：蛋白摩尔 比范围是2∶1至7∶1。反应缓冲液是150mM磷酸钾(pH 8.0)，50mM 氯化钾，1mM EDTA。反应在室温进行10分钟，且通过加入缓冲的L- 赖氨酸至终浓度10mM，终止反应。为了避免标记的水解灭活，在无水 DMSO(seccosolv quality，Merck，德国)中制备各自储备溶液。研究 的所有融合蛋白都良好耐受在反应缓冲液中最高达20％的DMSO浓度。 偶联反应后，通过使粗蛋白缀合物穿过凝胶过滤柱(Superdex 200 HiLoad)，去除未反应的游离标记和有机溶剂。
1.6蛋白伴侣融合蛋白的免疫反应性
将蛋白伴侣融合模块用于检测针对来自HMCV的抗原p52和pp150 的IgM抗体，它们在发作CMV感染时在人血清中大量产生。使用μ-捕 获形式(即，捕获总IgM集合，并通过特异性的抗-IgM IgG固定化到固 相上)，在自动化的2010分析仪中挑战免疫反应性。
在免疫测定中的信号检测基于电致化学发光。将生物素- 缀合的IgM捕获抗体固定化到链霉抗生物素蛋白-包被的磁珠表面上， 而信号传递抗原携带络合的钌阳离子作为发光部分。在有抗-p52/抗 -pp150IgM抗体存在下，生色的钌络合物被桥接在固相上，并在铂电极 激发后发出620nm光。信号输出按任意的光单位计算。就它们作为 抗原的用途而言，浓缩研究中的可溶p52/pp150融合蛋白，并用 N-羟基-琥珀酰亚胺激活的钌部分修饰，如上面Scholz等(2005)所述。 蛋白伴侣融合变体在免疫测定测量中的浓度是约20-100ng/ml。使用至 少5份阴性血清作为对照。为了使假阳性结果最小化，将化学聚合的未 标记的蛋白伴侣模块加入样品中，作为抗干扰物质。
2.结果
2.1高表达得率
在BL21(DE3)大肠杆菌株中大量超表达Skp、FkpA、SlyD和它 们的融合变体。由于高合成速率，靶蛋白作为内含体部分地积累在大肠 杆菌胞质中。基质偶联的重折叠成为以非常高的得率使Skp、FkpA、SlyD 和它们的融合变体复性的备选方法。基本上，复性规程遵循为SlyD融 合蛋白开发的方法(Scholz等(2005)，同上；Scholz等，Biochemistry 45(2006)，20-33)。在偶联的纯化和重折叠规程后，从1g大肠杆菌 湿细胞可以得到超过20mg靶蛋白。作为实例，通过SDS-PAGE证明的 Skp-p52-X4的纯化如图1所示。
实施例2：CMV IgM试验
开发了测定针对CMV的IgM抗体的试验。该试验允许区分急性/ 早期原发感染阶段和晚期感染阶段或复发性感染。检测试剂包含复合 物，每个复合物包含3个单位的融合多肽，每个融合多肽包含三聚化结 构域Skp和4个用钌(联吡啶)3(BPRu)标记的CMV表位(UL32或 150)。因而，检测试剂的多聚体分子包含12个表位拷贝。该试验在没 有或有干扰消除试剂存在下进行，所述干扰消除试剂即：单体IgG干扰 消除试剂lyD-X，其中X是UL32或150表位，二聚体或四聚体IgM干 扰消除试剂(FkpA-X)2和(FkpA-X2)2，其中FkpA是二聚化结构域， 且X是表位UL32或pp150，和三聚体或六聚体IgM干扰消除试剂 (Skp-X)3和(Skp-X2)3，其中Skp是三聚化结构域，且X是UL32 或pp150表位。
1.材料和方法
1.1组分
缓冲液B1
变体1：
50mM MES缓冲液pH 6.5，150mM NaCl；1mM EDTA，0.1％甲 基异噻唑酮(methylisothiazolone)和oxypyrione，prolidocanol和0.2％ 牛血清清蛋白(BSA)
1mg/L生物素化的单克隆Mab-抗人IgM。
变体2：
如变体1+2mg/L SlyD-pp(UL32)x1和2mg/ml SlyD-pp(150) x1
变体3：
如变体1+2mg/L FkpA-pp(UL32)x1和2mg/ml FkpA-pp(150) x1
变体4：
如变体1+2mg/L Skp-pp(UL32)x1和2mg/ml Skp-pp(150)x1
缓冲液B2
50mM MES缓冲液pH 6.5，150mM NaCl；1mM EDTA，0.1％甲 基异噻唑酮和oxypyrione，prolidocanol和0.2％牛血清清蛋白(BSA)。
B2中的免疫组分：钌化(ruthenylated)的CMV抗原。
40ng/ml Skp-(pp150)x4-BPRu和40ng/ml Skp-(UL32)x4-BPRu
2.Elecsys 2010仪器上的试验程序
10μl稀释的血清样品(用Elecsys Diluent Universal 1∶20稀释)+75 μl缓冲液B1。温育9分钟时间后，加入75μl缓冲液B2和40μl链霉抗 生物素蛋白包被的珠子。9分钟后，将混合物运输至测量室，并测量ECL 信号。
3.结果
试验结果如表1和2所示。
4.结果分析
对来自未感染的个体，来自患急性感染患者和感染后患者的血清， 进行基于所述μ-捕获形式的免疫测定。在表1中总结了结果。第一列(变 体1)阐明了在没有任何干扰消除试剂或猝灭模块下得到的信号。用 CMV-阴性人血清得到的计数是约700，且在阴性和阳性血清之间存在清 楚的区别。第二列(变体2)显示了在有单体猝灭模块SlyD-X存在下得 到的信号。如残余信号强度(按％计)所证实的，SlyD-X的猝灭作用对 于急性血清和感染后血清均是可忽略的。这与期望相一致，因为SlyD-X 作为单体不能有效地与多价IgM分子相互作用。
第三列(变体3)显示了在有二聚体猝灭模块FkpA-X存在下得到 的信号。残余信号强度证实了可忽略的FkpA-X对急性血清的猝灭作用， 和显著的FkpA-X对感染后血清的猝灭作用。该发现反映了与SlyD-X相 比，FkpA-X的更高的表位(X)密度。显然，FkpA-X与来自CMV感 染后的成熟IgM分子显著地相互作用，但是它与来自急性CMV感染的 未成熟的早期IgM分子相当弱地相互作用。
在倒数第二列(变体4)中，突出了三聚体干扰消除试剂Skp-X的 猝灭作用。在急性血清中发现了有些信号猝灭，但是在感染后血清中观 察到高得多的信号猝灭。这指示着猝灭模块Skp-X与早期和晚期IgM分 子的相互作用。因为Skp-X与晚期IgM分子的相互作用远高于与早期 IgM分子的相互作用，所以指示急性感染的早期IgM抗体的差别化检测 是可能的。
总之，SlyD-X、FkpA-X和Skp-X确实与针对表位X的IgM分子相 互作用，从而猝灭信号μ-捕获测定，其中Skp-X4用作信号传导抗原。 相对猝灭效率按照SlyD-X＜FkpA-X＜Skp-X的次序递增，这与有效表位 密度相对应。成熟的IgM分子(来自感染后)的猝灭效率高，且未成熟 的IgM分子(来自急性感染)的猝灭效率相当低。
我们的发现使得能清楚地区分早期和晚期感染，例如病毒感染。通 过使用标记的具有高表位密度的检测试剂例如Skp-X4检测模块(12个 表位拷贝)和未标记的具有更低SlyD-X(1个表位拷贝)、FkpA-X(2 个表位拷贝)或Skp-X(3个表位拷贝)类型的表位密度的猝灭模块， 可以区分早期和晚期感染，这在临床上是重要的。迄今为止，这样的区 分在不同IgM级分之间还是不可能的，但是已经通过进行IgG亲合力试 验进行了尝试：简而言之，在没有和有非变性浓度的离液剂例如脲或氯 化胍存在下，检测IgG。离液剂优先降低未成熟的(“早期”)IgG分 子的结合，但是它仅仅微弱影响成熟的、高亲和力(“晚期”)IgG分 子的结合性质。在有和没有离液剂存在下的信号高度比，产生高亲和力 (离液剂-抗性的)IgG分子的分数。亲合力试验中高百分比反映了高亲 和力IgG分子的优势分数，而低百分比反映了低亲和力(早期)IgG分 子的优势分数。因而，亲合力试验中高百分比指示着晚期感染，而低百 分比指示着早期感染。
表1和2中的最后一列总结了急性和感染后血清的结果，它们进行 了商业的IgG亲合力测定(RADIM)。结果清楚表明，急性血清表现出 低残余信号(＜20％)，而感染后血清表现出高残余信号(＞60％)。这 些结果与本发明的猝灭方法非常一致。这是值得注意的，因为本发明的 方法聚焦在IgM分子的差别化检测，而亲合力测定通常聚焦在IgG分子 的差别化检测。通过不同方法得到的信息是互补的：未成熟的免疫球蛋 白(伴随着早期免疫应答)导致IgG亲合力测定中的高猝灭(最后一列)， 但是导致本发明的Skp-X抑制测定中的相当低猝灭(倒数第二列)。
成熟的免疫球蛋白(伴随着感染后或复发性感染)导致IgG亲合力 测定中的低猝灭(最后一列)，但是导致本发明的Skp-X抑制测定中的 相当高的猝灭。未成熟的免疫球蛋白(伴随着急性或早期感染)导致IgG 亲合力测定中的高猝灭，但是导致本发明的Skp-X抑制测定中的低猝灭。 因而，每当区分感染的早期和晚期阶段和检测感染的早期阶段是重要的 时候，本发明的差别化检测IgM分子的方法为诊断领域添加了有价值的 信息。
序列表
<110>Roche Diagnostics GmbH
F.Hoffmann-La Roche AG
<120>病原体原发感染的检测
<130>39814P EP
<140>EP07008124
<141>2007-04-20
<160>9
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<213>人工的
<220>
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<220>
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<223>SlyD(1-165)
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Lys Asp Val Phe Met Gly Val Asp Glu Leu Gln Val Gly Met Arg Phe
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Val Ala Ser Arg Asn Gly Leu Phe Ala Val Glu
165 170 175
Asn Phe Leu Thr Glu Glu Pro Phe Gln Arg Gly Asp Pro Phe Asp Lys
180 185 190
Asn Tyr Val Gly Asn Ser Gly Lys Ser Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200 205
Leu Glu His His His His His His
210 215
<210>9
<211>345
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Skp-p52-X4
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(345)
<223>skp-p52-X4(p52254-293)
<400>9
Met Ala Asp Lys Ile Ala Ile Val Asn Met Gly Ser Leu Phe Gln Gln
1 5 10 15
Val Ala Gln Lys Thr Gly Val Ser Asn Thr Leu Glu Asn Glu Phe Arg
20 25 30
Gly Arg Ala Ser Glu Leu Gln Arg Met Glu Thr Asp Leu Gln Ala Lys
35 40 45
Met Lys Lys Leu Gln Ser Met Lys Ala Gly Ser Asp Arg Thr Lys Leu
50 55 60
Glu Lys Asp Val Met Ala Gln Arg Gln Thr Phe Ala Gln Lys Ala Gln
65 70 75 80
Ala Phe Glu Gln Asp Arg Ala Arg Arg Ser Asn Glu Glu Arg Gly Lys
85 90 95
Leu Val Thr Arg Ile Gln Thr Ala Val Lys Ser Val Ala Asn Ser Gln
100 105 110
Asp Ile Asp Leu Val Val Asp Ala Asn Ala Val Ala Tyr Asn Ser Ser
115 120 125
Asp Val Lys Asp Ile Thr Ala Asp Val Leu Lys Gln Val Lys Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Val Ala Ser Arg Asn Gly Leu Phe Ala Val Glu
165 170 175
Asn Phe Leu Thr Glu Glu Pro Phe Gln Arg Gly Asp Pro Phe Asp Lys
180 185 190
Asn Tyr Val Gly Asn Ser Gly Lys Ser Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200 205
Val Ala Ser Arg Asn Gly Leu Phe Ala Val Glu Asn Phe Leu Thr Glu
210 215 220
Glu Pro Phe Gln Arg Gly Asp Pro Phe Asp Lys Asn Tyr Val Gly Asn
225 230 235 240
Ser Gly Lys Ser Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Ala Ser Arg Asn
245 250 255
Gly Leu Phe Ala Val Glu Asn Phe Leu Thr Glu Glu Pro Phe Gln Arg
260 265 270
Gly Asp Pro Phe Asp Lys Asn Tyr Val Gly Asn Ser Gly Lys Ser Arg
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Ala Ser Arg Asn Gly Leu Phe Ala Val
290 295 300
Glu Asn Phe Leu Thr Glu Glu Pro Phe Gln Arg Gly Asp Pro Phe Asp
305 310 315 320
Lys Asn Tyr Val Gly Asn Ser Gly Lys Ser Arg Gly Gly Gly Gly Gly
325 330 335
Gly Leu Glu His His His His His His
340 345
SEQ ID NO.1：SlyD的氨基酸序列(AA 1-165)
SEQ ID NO.2：FkpA的氨基酸序列(AA 26-270)
SEQ ID NO.3：Skp的氨基酸序列(AA 21-161)
SEQ ID NO.4：Skp-ppUL32-X1的氨基酸序列(ppUL32＝HCMV pp150，AA 587-640)
SEQ ID NO.5：Skp-ppUL32-X4的氨基酸序列
SEQ ID NO.6：Skp-pp150-X1的氨基酸序列(pp150＝HCMV pp150， AA 999-1048)
SEQ ID NO.7：Skp-pp150-X4的氨基酸序列
SEQ ID NO.8：Skp-pp150-X1的氨基酸序列(p52＝HCMV p52，AA 254-293)
SEQ ID NO.9：Skp-p52的氨基酸序列，AA 254-293
实施例
实施例1：融合多肽试验试剂的生产
1.材料和方法
1.1.材料和试剂
氯化胍(guanidinum-Cl)(GdmCl)购自NIGU(Waldkraiburg，德 国)。无EDTA的蛋白酶抑制剂片剂、咪唑和EDTA购自Roche Diagnostics GmbH(Mannheim，德国)，所有其它化学试剂都是分析级 的，购自Merck(Darmstadt，德国)。超滤薄膜(YM10，YM30)购自 Amicon(Danvers，MA，USA)、微量透析膜(VS/0.025μm)和超滤 单元(biomax ultrafree filter devices)购自Millipore(Bedford，MA，USA)。 用于过滤粗裂解物的硝酸纤维素和醋酸纤维素膜(1.2μm/0.45μm/0.2 μm)购自Sartorius(德国)。
1.2表达盒的克隆
从SwissProt(UniProt)数据库得到Skp、FkpA和SlyD的序列(SkP： SwissProt登记号P11457；FkpA：SwissProt登记号P45523；SlyD：SwissProt 登记号P0A9K9)。通过PCR，从大肠杆菌株BL21(DE3)扩增大肠杆 菌Skp、FkpA和SlyD的基因，限制酶切后，连接进pET24a表达载体 (Novagen，Madison，Wisconsin，USA)。为了防止通过二硫键形成共 价加合物，去除SlyD的富半胱氨酸的C末端部分(166-196)，且将截 短的SlyD形式AA 1-165(SEQ ID NO.1)用作融合配偶体。为了确保 靶分子的胞质表达，省略了周质蛋白伴侣FkpA和Skp的信号序列。因 而，将FkpA形式AA 26-270(SEQ ID NO.2)和Skp形式AA 21-161(SEQ ID NO.3)用作融合多肽的模块。如Scholz等(J.Mol.Biol.345(2005)， 1229-1241)所述，设计融合蛋白的表达盒。使用QuikChange(Stratagene， La Jolla，USA)和标准的PCR技术来产生点突变、缺失和插入变体或 限制位点。所有重组蛋白变体都含有C-末端六组氨酸标签，以促进 Ni-NTA-辅助的纯化和重折叠。
1.3融合蛋白变体的表达、纯化和重折叠
使用实际上相同的规程，纯化所有多肽融合变体。在添加了卡那霉 素(30μg/ml)的LB培养基中，在37℃培养携带特定pET24a表达质粒 的大肠杆菌BL21(DE3)细胞至OD600为1.5，且通过加入1mM异丙 基-β-D-硫代半乳糖苷，诱导胞质超表达。诱导后3小时，通过离心(20 分钟，5000g)收获细胞，冷冻，且在-20℃保藏。对于细胞裂解，将冷 冻的沉淀重新悬浮于冷却的50mM磷酸钠pH 8.0，7.0M GdmCl，5mM 咪唑中，在冰上搅拌悬浮液2小时，以完成细胞裂解。离心和过滤(硝 酸纤维素膜，0.45μm/0.2μm)后，将裂解物应用于用包含5.0mM TCEP (三(2-羧乙基)膦)的裂解缓冲液平衡的Ni-NTA柱。使随后的洗涤 步骤适合各自的靶蛋白，且其范围为溶于50mM磷酸钠pH 8.0，7.0M GdmCl，5.0mM TCEP中的10-25mM咪唑(SlyD和FkpA融合蛋白) 至30mM咪唑(Skp融合蛋白)。应用至少10-15体积的洗涤缓冲液。 然后，将GdmCl溶液替换为50mM磷酸钠pH 7.8，100mM NaCl，10mM 咪唑，5.0mM TCEP，以诱导基质结合的蛋白的构象重折叠。为了避免 共纯化蛋白酶的再活化，将蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)( 无EDTA，Roche)包含在重折叠缓冲液中。在过夜反应中，应用共15-20 柱体积的重折叠缓冲液。然后，通过用3-5柱体积的50mM磷酸钠pH 7.8，100mM NaCl，40mM咪唑洗涤，取出TCEP和无EDTA 的抑制剂混合物。然后，用在相同缓冲液中的250mM咪唑，洗脱天然 蛋白。通过和von Jagow(Anal.Biochem.166(1987)，368-379) 所述的Tricine-SDS-PAGE，评判含有蛋白的级分的纯度，并合并。最后， 对蛋白进行大小排阻层析(Superdex HiLoad，Amersham Pharmacia)， 合并含有蛋白的级分，且在Amicon cell(YM10)中浓缩。
生产了下述Skp融合多肽：
Skp-ppUL32-X1(SEQ ID NO.4)和Skp-ppUL32-X4(SEQ ID NO.5)
这些融合多肽包含Skp融合模块和人巨细胞病毒(HMCV)表位 ppUL32的1个(X1)或4个(X4)拷贝。该表位对应着HCMV大结构 磷蛋白pp150(Uniprot ID P08318)的氨基酸587-640。
Skp-pp150-X1(SEQ ID NO.6)和Skp-pp 150-X4(SEQ ID NO.7)
这些融合多肽包含Skp融合模块和HMCV pp150表位的1个(X1) 或4个(X4)拷贝，该表位对应着HCMV pp150的氨基酸999-1048。
Skp-p52-X1(SEQ ID NO.8)和Skp-p52-X4(SEQ ID NO.9)
这些融合多肽包含Skp融合模块和HMCV p52表位的1个(X1) 或4个(X4)拷贝，该表位对应着HCMV聚合酶辅助蛋白p52(Uniprot ID P16790)的氨基酸254-293。
1.4分光镜测量
使用Uvikon XL双光束分光光度计，进行蛋白浓度测量。使用Pace 等(Protein Sci.4(1995)，2411-2423)所述的程序，测定摩尔消光系 数(ε280)。
1.5钌部分与融合蛋白的偶联
用N-羟基-琥珀酰亚胺激活的钌标记，在约10mg/ml的蛋白浓度， 修饰融合蛋白的赖氨酸ε-氨基。依赖于各自融合蛋白，标记：蛋白摩尔 比范围是2∶1至7∶1。反应缓冲液是150mM磷酸钾(pH 8.0)，50mM 氯化钾，1mM EDTA。反应在室温进行10分钟，且通过加入缓冲的L- 赖氨酸至终浓度10mM，终止反应。为了避免标记的水解灭活，在无水 DMSO(seccosolv quality，Merck，德国)中制备各自储备溶液。研究 的所有融合蛋白都良好耐受在反应缓冲液中最高达20％的DMSO浓度。 偶联反应后，通过使粗蛋白缀合物穿过凝胶过滤柱(Superdex 200 HiLoad)，去除未反应的游离标记和有机溶剂。
1.6蛋白伴侣融合蛋白的免疫反应性
将蛋白伴侣融合模块用于检测针对来自HMCV的抗原p52和pp150 的IgM抗体，它们在发作CMV感染时在人血清中大量产生。使用μ-捕 获形式(即，捕获总IgM集合，并通过特异性的抗-IgM IgG固定化到固 相上)，在自动化的2010分析仪中挑战免疫反应性。
在免疫测定中的信号检测基于电致化学发光。将生物素- 缀合的IgM捕获抗体固定化到链霉抗生物素蛋白-包被的磁珠表面上， 而信号传递抗原携带络合的钌阳离子作为发光部分。在有抗-p52/抗 -pp150IgM抗体存在下，生色的钌络合物被桥接在固相上，并在铂电极 激发后发出620nm光。信号输出按任意的光单位计算。就它们作为 抗原的用途而言，浓缩研究中的可溶p52/pp150融合蛋白，并用 N-羟基-琥珀酰亚胺激活的钌部分修饰，如上面Scholz等(2005)所述。 蛋白伴侣融合变体在免疫测定测量中的浓度是约20-100ng/ml。使用至 少5份阴性血清作为对照。为了使假阳性结果最小化，将化学聚合的未 标记的蛋白伴侣模块加入样品中，作为抗干扰物质。
2.结果
2.1高表达得率
在BL21(DE3)大肠杆菌株中大量超表达Skp、FkpA、SlyD和它 们的融合变体。由于高合成速率，靶蛋白作为内含体部分地积累在大肠 杆菌胞质中。基质偶联的重折叠成为以非常高的得率使Skp、FkpA、SlyD 和它们的融合变体复性的备选方法。基本上，复性规程遵循为SlyD融 合蛋白开发的方法(Scholz等(2005)，同上；Scholz等，Biochemistry 45(2006)，20-33)。在偶联的纯化和重折叠规程后，从1g大肠杆菌 湿细胞可以得到超过20mg靶蛋白。作为实例，通过SDS-PAGE证明的 Skp-p52-X4的纯化如图1所示。
实施例2：CMV IgM试验
开发了测定针对CMV的IgM抗体的试验。该试验允许区分急性/ 早期原发感染阶段和晚期感染阶段或复发性感染。检测试剂包含复合 物，每个复合物包含3个单位的融合多肽，每个融合多肽包含三聚化结 构域Skp和4个用钌(联吡啶)3(BPRu)标记的CMV表位(UL32或 150)。因而，检测试剂的多聚体分子包含12个表位拷贝。该试验在没 有或有干扰消除试剂存在下进行，所述干扰消除试剂即：单体IgG干扰 消除试剂lyD-X，其中X是UL32或150表位，二聚体或四聚体IgM干 扰消除试剂(FkpA-X)2和(FkpA-X2)2，其中FkpA是二聚化结构域， 且X是表位UL32或pp150，和三聚体或六聚体IgM干扰消除试剂 (Skp-X)3和(Skp-X2)3，其中Skp是三聚化结构域，且X是UL32 或pp150表位。
1.材料和方法
1.1组分
缓冲液B1
变体1：
50mM MES缓冲液pH 6.5，150mM NaCl；1mM EDTA，0.1％甲 基异噻唑酮(methylisothiazolone)和oxypyrione，prolidocanol和0.2％ 牛血清清蛋白(BSA)
1mg/L生物素化的单克隆Mab-抗人IgM。
变体2：
如变体1+2mg/L SlyD-pp(UL32)x1和2mg/ml SlyD-pp(150) x1
变体3：
如变体1+2mg/L FkpA-pp(UL32)x1和2mg/ml FkpA-pp(150) x1
变体4：
如变体1+2mg/L Skp-pp(UL32)x1和2mg/ml Skp-pp(150)x1
缓冲液B2
50mM MES缓冲液pH 6.5，150mM NaCl；1mM EDTA，0.1％甲 基异噻唑酮和oxypyrione，prolidocanol和0.2％牛血清清蛋白(BSA)。
B2中的免疫组分：钌化(ruthenylated)的CMV抗原。
40ng/ml Skp-(pp150)x4-BPRu和40ng/ml Skp-(UL32)x4-BPRu
2.Elecsys 2010仪器上的试验程序
10μl稀释的血清样品(用Elecsys Diluent Universal 1∶20稀释)+75 μl缓冲液B1。温育9分钟时间后，加入75μl缓冲液B2和40μl链霉抗 生物素蛋白包被的珠子。9分钟后，将混合物运输至测量室，并测量ECL 信号。
3.结果
试验结果如表1和2所示。
4.结果分析
对来自未感染的个体，来自患急性感染患者和感染后患者的血清， 进行基于所述μ-捕获形式的免疫测定。在表1中总结了结果。第一列(变 体1)阐明了在没有任何干扰消除试剂或猝灭模块下得到的信号。用 CMV-阴性人血清得到的计数是约700，且在阴性和阳性血清之间存在清 楚的区别。第二列(变体2)显示了在有单体猝灭模块SlyD-X存在下得 到的信号。如残余信号强度(按％计)所证实的，SlyD-X的猝灭作用对 于急性血清和感染后血清均是可忽略的。这与期望相一致，因为SlyD-X 作为单体不能有效地与多价IgM分子相互作用。
第三列(变体3)显示了在有二聚体猝灭模块FkpA-X存在下得到 的信号。残余信号强度证实了可忽略的FkpA-X对急性血清的猝灭作用， 和显著的FkpA-X对感染后血清的猝灭作用。该发现反映了与SlyD-X相 比，FkpA-X的更高的表位(X)密度。显然，FkpA-X与来自CMV感 染后的成熟IgM分子显著地相互作用，但是它与来自急性CMV感染的 未成熟的早期IgM分子相当弱地相互作用。
在倒数第二列(变体4)中，突出了三聚体干扰消除试剂Skp-X的 猝灭作用。在急性血清中发现了有些信号猝灭，但是在感染后血清中观 察到高得多的信号猝灭。这指示着猝灭模块Skp-X与早期和晚期IgM分 子的相互作用。因为Skp-X与晚期IgM分子的相互作用远高于与早期 IgM分子的相互作用，所以指示急性感染的早期IgM抗体的差别化检测 是可能的。
总之，SlyD-X、FkpA-X和Skp-X确实与针对表位X的IgM分子相 互作用，从而猝灭信号μ-捕获测定，其中Skp-X4用作信号传导抗原。 相对猝灭效率按照SlyD-X＜FkpA-X＜Skp-X的次序递增，这与有效表位 密度相对应。成熟的IgM分子(来自感染后)的猝灭效率高，且未成熟 的IgM分子(来自急性感染)的猝灭效率相当低。
我们的发现使得能清楚地区分早期和晚期感染，例如病毒感染。通 过使用标记的具有高表位密度的检测试剂例如Skp-X4检测模块(12个 表位拷贝)和未标记的具有更低SlyD-X(1个表位拷贝)、FkpA-X(2 个表位拷贝)或Skp-X(3个表位拷贝)类型的表位密度的猝灭模块， 可以区分早期和晚期感染，这在临床上是重要的。迄今为止，这样的区 分在不同IgM级分之间还是不可能的，但是已经通过进行IgG亲合力试 验进行了尝试：简而言之，在没有和有非变性浓度的离液剂例如脲或氯 化胍存在下，检测IgG。离液剂优先降低未成熟的(“早期”)IgG分 子的结合，但是它仅仅微弱影响成熟的、高亲和力(“晚期”)IgG分 子的结合性质。在有和没有离液剂存在下的信号高度比，产生高亲和力 (离液剂-抗性的)IgG分子的分数。亲合力试验中高百分比反映了高亲 和力IgG分子的优势分数，而低百分比反映了低亲和力(早期)IgG分 子的优势分数。因而，亲合力试验中高百分比指示着晚期感染，而低百 分比指示着早期感染。
表1和2中的最后一列总结了急性和感染后血清的结果，它们进行 了商业的IgG亲合力测定(RADIM)。结果清楚表明，急性血清表现出 低残余信号(＜20％)，而感染后血清表现出高残余信号(＞60％)。这 些结果与本发明的猝灭方法非常一致。这是值得注意的，因为本发明的 方法聚焦在IgM分子的差别化检测，而亲合力测定通常聚焦在IgG分子 的差别化检测。通过不同方法得到的信息是互补的：未成熟的免疫球蛋 白(伴随着早期免疫应答)导致IgG亲合力测定中的高猝灭(最后一列)， 但是导致本发明的Skp-X抑制测定中的相当低猝灭(倒数第二列)。
成熟的免疫球蛋白(伴随着感染后或复发性感染)导致IgG亲合力 测定中的低猝灭(最后一列)，但是导致本发明的Skp-X抑制测定中的 相当高的猝灭。未成熟的免疫球蛋白(伴随着急性或早期感染)导致IgG 亲合力测定中的高猝灭，但是导致本发明的Skp-X抑制测定中的低猝灭。 因而，每当区分感染的早期和晚期阶段和检测感染的早期阶段是重要的 时候，本发明的差别化检测IgM分子的方法为诊断领域添加了有价值的 信息。
序列表
<110>Roche Diagnostics GmbH
F.Hoffmann-La Roche AG
<120>病原体原发感染的检测
<130>39814P EP
<140>EP07008124
<141>2007-04-20
<160>9
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>165
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>SlyD
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>SlyD(1-165)
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Thr Glu Asp Gly Val Leu Val Asp Glu Ser Pro Val Ser Ala Pro Leu
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20 25 30
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<223>Skp-ppUL32-X4
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<222>(1)..(400)
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