一种快速检测梅花鹿粘膜病病毒的免疫胶体金试纸条
专利汇可以提供一种快速检测梅花鹿粘膜病病毒的免疫胶体金试纸条专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种快速检测梅花鹿粘膜病病毒的胶体金 试纸 条，其特征在于：试纸条由样品垫、结合垫、 硝酸 纤维 素膜、吸收垫依次粘附在不吸 水 的 支撑 薄片上；其中结合垫上包被有胶体金标记的BVDV单克隆 抗体 ；硝酸 纤维素 膜上分别包被有BVDV纯化的多克隆抗体构成的检测线T线和葡萄球菌蛋白A(SPA)构成的质控线C线。其具有特异性强、灵敏度高、操作简单和诊断快速的显著优点，可用于梅花鹿粘膜病病毒的快速检测及疫病诊断。，下面是一种快速检测梅花鹿粘膜病病毒的免疫胶体金试纸条专利的具体信息内容。
1.一种快速检测梅花鹿粘膜病病毒的胶体金试纸条，其特征在于：试纸条由样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)依次粘附在不吸水的支撑薄片(5)上；其中结合垫(2)上包被有胶体金标记的单克隆抗体；硝酸纤维素膜(3)上分别包被有纯化的BVDV多克隆抗体构成的检测线T线(6)和构成的质控线葡萄球菌蛋白A(SPA)C线(7)。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测梅花鹿粘膜病病毒的胶体金试纸条，其特征在于所述的结合垫(2)上包被的胶体金标记的单克隆抗体；其制备方法如下：
(1) 单克隆抗体的制备：使用灭活抗原对小鼠进行免疫，通过免疫鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合培养，产生杂交瘤细胞株；使用杂交瘤细胞对小鼠进行腹腔注射，取腹水加以纯化；
(2) 试剂条制备：采用柠檬酸三钠还原法制备蛋白标记胶体金，将结合垫浸泡于封闭液即2% BSA、0.5%吐温-20、2.5%蔗糖、0.05%叠氮钠、0.01M PBS中30min，37℃烘干；然后将制备好的金标抗体均匀喷涂于结合垫上，每毫升铺20平方厘米，冻干、保存。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测梅花鹿粘膜病病毒的胶体金试纸条，其特征在于所述的纯化BVDV多克隆抗体检测线T线(7)是将BVDV1型2型血清抗体混合后，用辛酸-硫酸铵法粗提IgG，用DU-800核酸/蛋白分析仪测定蛋白含量，将其稀释至2mg/ml；调整机器划线为T线，即为对照线靠近吸收垫，距吸收垫端约3mm；两线距离5-8mm，在硝酸纤维素膜NC膜上的检测线上，可与金标抗原结合，以此检验试纸条的有效性。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测梅花鹿粘膜病病毒的胶体金试纸条，其特征在于所述的硝酸纤维素膜(3)上包被有葡萄球菌蛋白A(SPA)构成的质控线C线(6)是选用一种能够与IgG分子Fc片段特异性结合的蛋白(SPA)喷涂于质控线上，用包被缓冲液将SPA稀释到50ug/ml，调整机器划线为C线，即为质控线靠近结合垫，距结合垫一端约5mm。
一种快速检测梅花鹿粘膜病病毒的免疫胶体金试纸条
技术领域
发明内容
2、 特异性强，胶体金试纸条金标抗体均为敏感性和特异性较好的单克隆抗体，因此提高了检测的敏感性和特异性；
3、生产成本低，金标单抗可由相应的杂交瘤细胞系通过注射Balb/c小鼠腹腔，诱生腹水，兔抗BVDV多抗可由鹿粘膜全病毒免疫新西兰白兔产生，二者通过辛酸-硫酸铵纯化而大量获得；
4、 其可快速检测即5-10min；不需要特殊仪器和设备，可适用于现场操作；操作简单，一步完成，无需专业人员操作；检测成本低；储存方便。
附图说明
具体实施方式
30min，弃上清，沉淀中加入20ml 0.8%氯化钠溶液；待沉淀溶解后，缓慢加入10ml饱和硫酸铵溶液，使成33%饱和度的硫酸铵溶液。4℃静止30min取出，4℃ 3000rpm离心30min，弃上清，沉淀中加入1ml 0.8%氯化钠溶液，装入透析袋内用0.8%氯化钠溶液透析除盐。用
2%氯化钡溶液检测硫酸铵是否透析完全。透析完全后，蛋白溶液用PEG20000浓缩至适当体积，4℃ 12000rpm离心10min，取上清，测定蛋白质含量，即为粗提的兔抗BVDV IgG。
先使用弗氏完全佐剂将纯化的BVDV完全乳化，再取6-8周龄健康Balb/C小鼠5只，共采取3次免疫，一免将完全乳化的免疫原，每只小鼠进行腹腔注射，大约100μg 左右，在
14d后实施加强免疫。二免以及三免以弗氏不完全佐剂将纯化的BVDV乳化，之后将对每只小鼠进行腹腔注射，大约100μg。在三免后15d，取100μg纯化的病毒蛋白进行腹腔注射。
在融合前3～4d左右，取50μg 纯化的病毒蛋白进行尾静脉注射。
6
1×10 个细胞/只阳性杂交瘤细胞，待小鼠腹部膨大后 （约7d-10d）抽取腹水，以5000rpm离心5min，取上清液于-80℃保存备用。 用蛋白A/G单克隆抗体纯化试剂盒对腹水进行纯化。
10min，转移上清至另一离心管中，离心30min，小心弃去上清，用5ml 50mmol/LPBS重悬沉淀。将5×300mm 的玻璃纤维棉浸泡于金标McAb溶液中，取出真空抽干后避光保存。
用自动喷膜机将2mg/ml纯化的BVDV多抗点在硝酸纤维膜上，划为T线，即为检测线靠近结合垫。将1mg/ml SPA点在硝酸纤维膜上，划为C线。即为质控线靠近吸收垫。点样速度为0.75 uL/cm。37℃干燥2h后，4℃密封保存。
用试纸条检测BVDV阳性样品，结果均为阳性，检测其它病毒阳性样品，结果均为阴性。
结果如表1，证明试剂条较为特异。
分别用试纸条 和RT-PCR检测不同稀释度 的BVDV阳性样品，结果表明
试纸条检测极限为1:160稀释的样品，试纸条相当于荧光RT-PCR的64倍。
结果如表2。
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