一种检测乙酰辅酶A羧化酶活性的方法专利检索-免疫测定诊断设备和程序专利检索查询-专利查询网

一种检测乙酰辅酶A羧化酶活性的方法

阅读：7发布：2021-12-01

专利汇可以提供一种检测乙酰辅酶A羧化酶活性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种检测乙酰辅酶A羧化酶活性的方法，属于生物化学和分子生物学领域。乙酰辅酶A羧化酶活性检测的原理主要是通过酶促反应体系中丙二酸单酰辅酶A或ADP浓度的变化反映酶的活性。已有的方法由于涉及到放射性同位素的使用，以及受到ATP酶的潜在影响，存在安全性、特异性差等问题。本方法的特征在于制备含有乙酰辅酶A羧化酶的蛋白制品或样品上清液后，与乙酰辅酶A、ATP及NaHCO3等构成体外反应系统，再通过酶联免疫吸附分析的方法检测一定时间内丙二酸单酰辅酶A浓度的变化，从而计算样品中酶活性的大小。本方法不使用放射性同位素、特异性高、易操作，适用于各种生物样品中乙酰辅酶A羧化酶活性的分析。，下面是一种检测乙酰辅酶A羧化酶活性的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种检测乙酰辅酶A羧化酶活性的方法，其特征在于所述酶促反应中产物浓度的变化是通过酶联免疫吸附分析的方法测定的。
2.根据权利要求1所述的酶活性的检测方法，其特征在于所述酶促反应的产物为乙酰辅酶A羧化酶的专一性产物丙二酸单酰辅酶A。
3.根据权利要求1、2所述的酶活性的检测方法，其特征在于
1)样品处理：称取一定量新鲜材料，经捣碎、液氮研磨，或组织匀浆后，加入一定体积的提取缓冲液，或采用超声波破碎；处理液离心10分钟(11000rpm)，弃去残渣，上清液即为粗酶提取液；上清液也可根据需要进一步分离纯化，获得酶制品。以上过程均在0～4℃下进行；
2)建立酶促反应体系：100微升反应液中，含适量酶液，1mmol/L乙酰辅酶A，1mmol/L ATP，1mmol/L NaHCO3，30℃温育15分钟后，冰浴，并采用超滤离心的方法使酶与底物分开，终止反应；
3)采用丙二酸单酰辅酶A酶联免疫分析试剂盒测定反应液中丙二酸单酰辅酶A的浓度，如果测定样品为粗酶提取液，还应设立粗酶提取液对照；
4)酶标仪在450nm 波长下分别测定样品孔与对照孔的吸光度(OD值)，根据标准曲线分别求得样品孔与对照孔丙二酸单酰辅酶A的浓度，从而计算其单位时间内的生成速度。
4.根据权利要求1、2、3所述的酶活性的检测方法，其特征在于不仅适用于乙酰辅酶A羧化酶纯品酶活性的检测，也适用于粗制品以及样品提取液中酶活性的检测。
5.根据权利要求1、2、3、4所述的酶活性的检测方法，其特征在于适用于多种生物样品乙酰辅酶A羧化酶活性的检测。
6.根据权利要求3所述的酶活性的检测方法，其特征在于提取缓冲液为：60mmol/LTricine-KOH缓冲液，5％甘油，3.5mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，2mmol/L EDTA，pH 8.0。
7.根据权利要求3所述的酶活性的检测方法，其特征在于酶促反应的终止是通过低温及超滤离心的方法实现的。

说明书全文

一种检测乙酰辅酶A羧化酶活性的方法

一技术领域

[0001] 本发明属于生物化学和分子生物学领域，具体涉及到利用酶联免疫吸附方法分析生物样品中乙酰辅酶A羧化酶的活性。二背景技术

[0002] 乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)是脂肪酸生物合成的关键酶或限速酶，在生物体内催化乙酰辅酶A羧化形成丙二酸单酰辅酶A，为脂肪酸和许多次生代谢产物的合成提供底物，是碳流进入脂肪酸生物合成的重要调控位点。

[0003] 根据结构的不同，目前已知的乙酰辅酶A羧化酶可分成两大类。一类为同质型，简称ACCaseI，也称为真核型ACCase，存在于动物、藻类、酵母以及植物的细胞质中。该类型的ACCase是一条多肽链，活性状态下以同型二聚体的形式出现，结构稳定难以解离，分子量为220～260kDa。另一类为异质型，简称ACCase II，又称为原核型ACCase，多存在于细菌及双子叶植物和禾本科单子叶植物的质体中，是一个多亚基复合体，最大亚基分子量约为50kDa。尽管结构不同，这两类酶都包括三个功能部分，分别是生物素羧化酶(biotincarboxylase，BC)、生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein，BCCP)、羧基转移酶(carboxyltransferase，CT)。在整个反应中BC和CT各催化两个独立的半反应，BCCP则作为活化羧基的供体，在BC和CT之间摆动以传递羧基。整个反应过程分为以下两个步骤：

[0004] 酶-生物素+HCO3-+ATP→酶-生物素-CO2-+ADP+Pi

[0005] 酶-生物素-CO2-+乙酰辅酶A→酶-生物素+丙二酸单酰辅酶A

[0006] 由于在脂肪酸合成代谢中所发挥的重要作用，乙酰辅酶A羧化酶在农业和医学等领域具有重要的研究价值。不仅可作为除草剂作用的靶标，其活性变化规律对于油料作物、产油微生物的育种改良，对于肥胖症、糖尿病等代谢性疾病发病机理和治疗方法的研究也有重要的意义。

[0007] 目前乙酰辅酶A羧化酶活性的检测主要有以下方法。一是建立体外酶促反应体14
系，常规方法制取酶液后，加入一定浓度的乙酰辅酶A、ATP和(C )NaHCO3，温育半小时后，盐酸终止反应。液闪仪测定其中的酸稳定产物的放射活性，减去无乙酰辅酶A的对照反应的放射活性，即可求出酶的活性大小。该方法通过单位时间内丙二酸单酰辅酶A浓度的变化反映酶的活性，特异性较好，但由于涉及放射性同位素，很大程度上限制了其应用。

[0008] 另一种方法是通过荧光系统检测体外反应体系中ADP浓度的变化来反映酶的活性。该方法不受放射性同位素的制约，但仅适用于纯酶制品活性的测定，因为酶提取液或粗酶制品中的ATP酶会产生干扰。也有人根据乙酰辅酶A羧化酶的催化反应与脂肪酸合成相偶联的原理，通过测定细胞悬液中脂肪酸浓度的变化来反映酶的活性。该方法快速、不需制备酶提取液，也不存在反馈抑制和线粒体酶干扰等优点，但仅限于对肝细胞酶活性的检测，且使用放射性同位素。

[0009] 针对以上方法存在的问题，建立一种特异性好、安全、灵敏、易于推广的检测方法显得十分必要。丙二酸单酰辅酶A是乙酰辅酶A羧化酶的专一性产物，是酶活性检测所不可或缺的研究对象。由于放射性同位素存在的问题，丙二酸单酰辅酶A的非放射性同位素测量是建立新的酶活性检测方法的关键。酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种检测技术，具有特异性强、灵敏度高、干扰小、简便、快速、操作安全、无污染、测试成本低等特点，在生物医学检验、药物残留分析、环境污染物检测等领域得到了广泛应用。高亲和力抗体的制备是ELISA建立的关键。尽管丙二酸单酰辅酶A作为一种小分子化合物，不能单独激发人或动物产生抗体，是一种半抗原，但近年来，随着人们对药物、毒素、环境污染物等小分子化合物的抗体制备所进行的大量探索和研究，逐渐建立了成熟的小分子半抗原的抗体制备技术，可通过化学方法把半抗原与某种载体蛋白分子结合，使载体蛋白获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。Chappey等研究表明，分子量超过300的半抗原都能通过这种方法获得较高亲和力的抗体。丙二酸单酰辅酶A分子量为863.58，具有氨基、羧基、羟基等多个活性基团，并具有复杂的分子结构，能够制备出高亲和力的抗体。据此开发的应用于人、牛、鼠等的丙二酸单酰辅酶A检测试剂盒，为乙酰辅酶A羧化酶活性的酶联免疫吸附分析方法的研究打下了基础。
三发明内容

[0010] 本发明提供了一种检测生物样品中乙酰辅酶A羧化酶活性的方法，可以解决目前已有方法所存在的操作性差、不易推广等问题。通过ELISA检测酶促反应中单位时间内乙酰辅酶A羧化酶的特异性产物丙二酸单酰辅酶A生成的速度，即可计算出酶的活性水平。该方法不需要大量生物样品，也不需要制备酶的纯品。

[0011] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

[0012] 1.样品处理：称取一定量新鲜材料，捣碎、液氮研磨，或组织匀浆后后，加入一定体积的提取缓冲液，或经超声波破碎；处理液离心10分钟(11000rpm)，弃去残渣，上清液即为粗酶提取液。上清液也可根据需要进一步分离纯化，获得酶制品。以上过程均在0～4℃下进行。

[0013] 2.酶活性的测定

[0014] 1)建立体外酶促反应体系：在1.5mL的离心管中加入100μL反应液，其中含适量粗酶液，1mmol/L乙酰辅酶A，1mmol/L ATP，1mmol/L NaHCO3，30℃温育15分钟后，冰浴离心管，选择截留分子量为10kDa规格的0.5mL超滤管4℃离心反应液，使酶与底物分开，终止反应。

[0015] 2)采用丙二酸单酰辅酶A酶联免疫分析试剂盒测定反应液中丙二酸单酰辅酶A的浓度，并设立酶提取液对照孔。反应液可进行适当的稀释，以保证其浓度在试剂盒的检测范围内。

[0016] 3)酶标仪在450nm 波长下分别测定样品孔与对照孔的吸光度(OD值)，根据标准曲线分别求得样品孔与对照孔丙二酸单酰辅酶A的浓度，从而计算单位时间内的生成速度。

[0017] 本发明的优点：

[0018] 1.本发明将ELISA法应用于乙酰辅酶A羧化酶酶促反应产物的检测，提高了检测的特异性和灵敏性，避免了放射性同位素的使用，安全可靠，适合在普通实验室推广应用；同时，不受粗酶制品或酶提取液中杂酶的干扰，不必进行酶纯品的制备，从而避免了酶分离纯化的繁琐程序，简化了操作步骤。

[0019] 2.本发明适合不同物种生物样品中乙酰辅酶A羧化酶活性的检测。四具体实施方式

[0020] 以下为本发明的具体实施例，其作用在于对本发明的内容做进一步详细的说明，使阅读者更易理解，但不构成对本发明所要求的保护范围的限定或限制。

[0021] 实施例1

[0022] 1.离心收集自养培养一周的小球藻细胞100毫克，加入1mL提取缓冲液(60mmol/LTricine-KOH缓冲液，5％甘油，3.5mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，2mmol/L EDTA，pH8.0)，冰浴，超声破碎(功率100W，工作时间与间歇时间5秒，处理1小时)，离心5分钟(11000rpm，4℃)，上清即为粗酶提取液。

[0023] 2.在1.50mL离心管中，加入粗酶提取液50μL，并依次加入乙酰辅酶A(1mmol/L)、ATP(1mmol/L)和NaHCO3(1mmol/L)，总体积为100μL，30℃温育15分钟后，冰浴离心管，并选择Millipore的截留分子量为10kDa的0.5mL滤管离心(11000rpm，4℃)15分钟，收集滤液。

[0024] 3.选择市售的牛丙二酸单酰辅酶A酶联免疫分析试剂盒测定反应液中丙二酸单酰辅酶A的浓度。

[0025] 1)首先按说明书要求在酶标包被板上将标准品进行梯度稀释，浓度范围从0至900pg/mL。

[0026] 2)分别设空白孔、待测样品孔。其中空白孔加样品稀释液100μL；待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品，即滤液10μL，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上覆膜，37℃反应30分钟。

[0027] 3)弃去液体，甩干，洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μL，温育，洗板，37℃显色15分钟后，即可依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。

[0028] 4)用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(0D值)。

[0029] 5)绘制标准曲线，从标准曲线中查得样品孔和对照孔产物浓度，计算出浓度差，规定1min内催化生成10pg丙二酸单酰辅酶A的酶量为一个酶活性单位(U)。

[0030] 4.结果：从标准曲线查得产物浓度差为210pg/mL，则100μL反应体系中的浓度为2100pg/mL，所测反应体系中酶的活力单位是1.4U，每克样品(湿重)所含的酶的活力单位是280U。

[0031] 实施例2

[0032] 1.称取100克波菜幼苗叶片，置于液氮中冷冻，转至研钵中快速研碎后加入100mL预冷的提取缓冲液(同上)，在低温状态下继续研磨。

[0033] 2.将研磨浆液转入到高速冷冻离心机中离心10分钟(6000rpm，4℃)，弃去沉淀，保留上清液。

[0034] 3.按70％饱和度称取8.0克硫酸铵固体于研钵中研磨成细粉，然后将其慢慢加入到冰浴的小烧杯中，并轻轻搅拌，可见白色絮状沉淀，冰浴静止20分钟。

标题	发布/更新时间	阅读量
一种基于间接竞争酶联免疫法定量检测油胺枝接聚琥珀酰亚胺高分子纳米药物载体的方法	2021-09-03	2
预测肌萎缩的生物标志物、方法和用途	2022-04-05	4
一种甲拌磷残留的酶联免疫检测方法	2021-06-17	3
一种检测乙酰辅酶A羧化酶活性的方法	2021-12-01	7
一种荧光假单胞菌免疫磁珠-酶联免疫检测方法	2021-06-11	5
一种电化学免疫传感器及其制备与应用	2021-01-19	7
模块化现场护理装置及其应用	2021-07-24	7
用于表征关节炎疾患的组合物和方法	2021-12-18	7
血清特异性IgE生物学活性检测方法及其所使用的试剂盒	2021-04-05	5
基于微流控芯片检测总三碘甲状腺原氨酸TT3试剂盒及制备和检测方法	2020-11-29	5

一种检测乙酰辅酶A羧化酶活性的方法

一种检测乙酰辅酶A羧化酶活性的方法

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：