肉毒梭菌(Clostridium botulinum)是一种厌氧生长的产孢子菌，其产 生高度毒性的蛋白。这些所谓的肉毒毒素(botulinum toxin)是肉毒中毒 (botulism)(一种食物中毒)的原因，如果没有强力的医疗措施，会导致 肉毒中毒患者的死亡。已经区别出7个血清型(A-G型，缩略语为BoNT/A、 BoNT/B等)，其具有类似的氨基酸序列，但能诱导不同的抗体应答。所述 毒素(下文中也称为神经毒素和肉毒毒素)由两条功能链组成，轻链(～50kDa) 和重链(～100kDa)，其在合适的梭菌属(Clostridium)菌株中由单链前体蛋 白的蛋白水解切割产生。其他的菌株不具有相应的蛋白酶，因此所述链的 切割在患者的胃肠道中发生(例如通过胰蛋白酶)。在双链形式下，亚单位 (即重链和轻链)通过二硫键彼此连接(此外，例如BoNT/A还存在分子 内二硫键，即在重链的两个半胱氨酸残基之间)。
纯神经毒素在体内在酸性条件下并不以游离形式存在，而是与其他梭 菌蛋白形成复合物，即所谓的(肉毒梭菌)毒素复合物。不同的具有血球凝集 特性以及其它特性的蛋白参与这些复合物。所述复合物的组成根据血清型 而不同。整合到复合物中使得神经毒素在通过胃肠道时受到保护。这些其 他的梭菌蛋白(分别为络合和复合蛋白)可能在神经毒素的吸收中也起作用。 这样，整合到复合物中使得神经毒素可以经口服生物利用，从而导致食物 中毒。神经毒素的效应位点为运动神经肌肉终板；在这里，肌肉被神经活 化。运动神经元释放乙酰胆碱，以激活肌肉。该释放被肉毒毒素抑制。所 述抑制效应通过三个相继步骤发生：结合、转运(translocation)、蛋白酶解。 肉毒毒素的重链与运动神经元高度特异性结合，随后被神经细胞吸收入内 体。结合结构域位于重链的C末端，在其上游、在重链的N末端部分是转 运结构域，其通过某种未知机制使得将轻链输送至神经细胞细胞溶胶 (cytosol)中、或者是转运成为可能。在细胞溶胶中轻链活化成为高度特异 性切割所谓SNARE蛋白的蛋白酶。表1列出了各个肉毒毒素类型(type) 的蛋白酶解特异性。所述SNARE蛋白负责载有乙酰胆碱的分泌小泡与运动 神经元细胞膜的融合。这些SNARE蛋白其中之一被蛋白酶解切割后，抑制 了融合复合物的形成，从而抑制了乙酰胆碱的进一步释放。受累的肌肉不 再被活化，先前活动亢进的肌肉变得麻痹。
表1
  肉毒毒素类型                           蛋白酶活性的 SNARE蛋白                 底物         大鼠SNARE序列的切割位 点                                          A型 SNAP 25 EANQ197RATK B型 VAMP 2 GASQ76FETS C型     突触融合蛋白 (Syntaxin)   SNAP 25      DTKK254AVKY ANQR198ATK  D型 VAMP 2 RDQK61LSED E型 SNAP 25 QIDR180IMEK F型 VAMP 2 ERDQ60KLSE G型 VAMP 2 ETSA83AKLK
该作用机理用于治疗多种肌张力障碍(dystonia)和痉挛，其特征在于 乙酰胆碱不受控制的释放(例如睑痉挛(blepharospasm)、斜颈(torticollis)、 痉挛状态(spasticity))。向活动亢进肌肉注入极低剂量(pg至ng范围)的 神经毒素用于治疗肌张力障碍。神经毒素向运动终板扩散，到达神经元的 细胞溶胶，在那里抑制了乙酰胆碱的释放。肌肉在1-2天后麻痹。
皮肤下肌肉的痉挛可以产生多种脸部皱纹，所述痉挛同样由乙酰胆碱 不受控制的释放导致。这样本文中肉毒毒素可用于美容：注射极低量的肉 毒毒素后约3个月，皱纹消失。
目前已有4种含有肉毒毒素的制剂通过了药品监管部门的批准： (Allergan)、(Merz)、(Ipsen)和(Solstice Neurosciences)。和为A型肉毒毒素冻干剂(分别 为复合物、神经毒素和复合物)。和每支注射安瓿100单位， 500单位。含有B型肉毒毒素(复合物形式)，分别为 5000和10000单位的液体制剂。
除了NeuroBloc以外，所述制剂为冻干剂形式，用生理盐水重溶，其 根据制剂和适应症以符合的剂量注射入受累肌肉中。所治疗的肌肉将在48 小时内麻痹。效果持续约3个月，此后如果肌肉还需要进一步麻痹，即还 需要治疗肌张力障碍，则再一次进行注射。目前为止究竟何种进程控制所 述效应的降低还未阐明。只要轻链具有蛋白酶活性，相应的SNARE蛋白即 被切割(例如SNAP25被A型神经毒素的轻链切割)。随后，在这些条件下， 分泌小泡和质膜的融合以及随后乙酰胆碱的释放被抑制，肌肉保持麻痹状 态。如果能使轻链的蛋白酶活性在细胞中保留更长的时间，相应药物的作 用时间也会延长。
与许多低分子量活性物质相反，蛋白质活性物质的稳定性显著较低。 某些蛋白活性物质在血液循环中的半衰期(HL)仅为几分钟，因此(治疗) 作用时间受到很大限制，必须在很短的间隔内重新注射。如果能成功保护 蛋白不受降解和清除作用，半衰期就能延长。一种理论上可能的途径特别 在于对于真核蛋白而言的较高糖基化(更多碳水化合物残基)，以及使碳水 化合物结构适应人糖蛋白结构。另一种已经被用于一系列已获批准的活性 物质的途径是将蛋白质与聚乙二醇(PEG)偶联。PEG可与不同氨基酸的残基 共价结合，例如赖氨酸残基(氨基官能团)或半胱氨酸残基(SH官能团)。 PEG提高蛋白分子量，不产生免疫原性结构，后者能诱导抗该活性物质的 抗体。相反的，PEG化降低了活性物质的免疫原性。通过分子量的增加， 蛋白消除得更加缓慢，血清半衰期显著延长。为了维持特定的所需血清水 平，药物的注射次数也相应减少。
PEG化的蛋白质活性物质已用于一些批准的药物(见表2)。部分小蛋 白(例如干扰素α2a，分子量＝19.3kDa)在原始(即未修饰)状态下的使用 显示，这些蛋白在血清中迅速清除。PEG化导致分子量显著增加，从而显 著延长血清半衰期。例如干扰素α2a的半衰期为9h；用40kDa的PEG链 PEG化后，分子量显著增加，半衰期也从9h增加到72h。
表2
  商品名 起始活性物质 PEG偶联 Pegasys 干扰素α 2a 支链PEG-N-羟基琥珀酰亚胺； 与4个赖氨酸残基偶联        Neulasta G-CSF PEG-醛；与N末端甲硫氨酸偶联 Peglutron 干扰素α 2b 琥珀酰亚胺基碳酸酯-PEG；与组 氨酸和赖氨酸残基偶联         Somavest 生长激素拮抗剂 4-6个PEG；与赖氨酸残基和N 末端偶联                  Oncaspar 天冬酰胺酶 N-羟基琥珀酰亚胺活化的PEG
然而与一条或多条PEG链的连接具有以下限制：
1.优选(与未修饰的天然蛋白比较)PEG链完全不降低或仅轻微降低 所修饰蛋白的生物活性(根据本发明，修饰蛋白生物活性的轻微降低应当 理解为相应于未修饰的天然蛋白生物活性的至少20％、优选30-40％或 50-70％或甚至为75-95％)。活性降低在许多情况下是可以耐受的：PEG化 的干扰素抗病毒活性为非PEG化干扰素Aα 2b的例如25-35％。PEG化的 干扰素α 2a仅具有非PEG化形式活性的1-7％。
2.由于许多用于治疗的蛋白通过与特定的受体结合发挥其活性，优选 PEG化不影响或仅轻微影响其与受体的相互作用(即，所述相互作用可被 结合结构域的空间位阻或蛋白空间结构的改变直接影响，所述空间结构的 改变对结合结构域产生影响，进而影响结合)。
3.当治疗性蛋白的药理学效应(也)通过酶活性介导时(例如通过天 冬酰胺酶)，优选的，PEG化不降低或仅轻微降低所述酶活性。
肉毒毒素的PEG化优选符合这三个标准。同时所述肉毒毒素的PEG修 饰优选(a)既不影响重链的结合结构域，(b)也不影响轻链的酶活性，即：PEG 链优选不抑制轻链催化结构域与底物(SNARE蛋白)的相互作用。与其他 切割短肽的蛋白酶相反，肉毒毒素需要更长的肽作为底物。作为B型肉毒 毒素底物的肽优选具有SNARE蛋白VAMP2的约40个氨基酸残基的序列。 具有更短SNARE序列的肽也可被切割，但是效率显著较低。具有与识别顺 序相当的40个氨基酸残基长度的肉毒毒素轻链切割结构域优选未受到PEG 链影响。而且，应当考虑的是，除了直接负责底物(SNARE蛋白和具有约 40个氨基酸残基的SNARE序列的肽)与轻链接触的裂解结构域外，轻链 上额外的远离催化结构域的接触位点对于肉毒毒素的最佳活性也是需要 的。已经证明A型肉毒毒素的轻链上具有5个额外的底物SNAP25接触位 点：4个“α外位点”(α exosite)(AS 102-113、310-321、335-348、351-358) 和1个“β外位点”(β exosite)(AS 242-259)。优选的，所述接触不受或仅 轻微受到轻链与PEG偶联作用的阻碍。而且，重链的C末端部分的转运结 构域必须是有功能的，即必须保证轻链从内体转运至细胞溶胶中。这一对 于功效来说绝对必要的转运过程同样可被PEG化轻链的空间位阻所抑制， 尤其是转运结构域可能在内体膜上形成孔洞，而“庞大”的PEG化轻链无法 通过的时候。
美国专利申请(2002/0197278)中描述了PEG与肉毒毒素的偶联。所述偶 联导致抗原性和免疫原性的降低，并且分子量的提高导致扩散降低。对于 PEG化合适位点(抗原决定簇)和氨基酸残基的选择，参见Bavari等人的 论文(Vaccine 16：1850-1856，1998)。该文中给出了诱导中和抗体的肉毒毒素 重链序列。上述专利申请中仅提到(1)PEG化必须分别在一个或多个作为重 要表位起作用的位点附近进行，但远离催化区域(即远离轻链)，以及(2)PEG 可与游离的末端羧基或氨基、或赖氨酸侧链上的氨基偶联。(3)作为向毒素 中插入PEG的另一个可能性，建议采用天然存在的或特别插入的半胱氨酸 残基上的SH基团；然而上述论文中否定了该选择(3)，因为肉毒毒素重链 和轻链之间二硫键在该分子的空间构型上起作用。没有公开PEG化的神经 毒素结构或向哪个氨基酸残基上加入特定长度的PEG分子的例子。
另一项专利申请(WO 02/40506)中涉及到稳定性的变化。建议对肉毒 毒素的体内糖基化、体内磷酸化以及主要是体内豆蔻酰化的位点进行插入、 修饰或切除，以任选的增加或降低肉毒毒素的稳定性。指定了一整套的可 能修饰位点，其远离神经毒素轻链的N和C末端。为此还必须在多肽链中 插入额外的序列，在其上，碳水化合物链或磷酸和豆蔻酸残基通过细胞酶 与轻链偶联，然而没有给出相应的修饰神经毒素或其制备的详细内容。
在另一项美国专利申请(2003/0027752)中，具有所谓亮氨酸基序(例如 XEXXXLL)的肽残基被插入到神经毒素或轻链中，以增加轻链在神经细胞 中的稳定性。通过用该基序修饰轻链，使得其在膜上定位于其底物附近。 此外，所谓的“基于酪氨酸的基序”(YXXHy，Y＝酪氨酸，Hy＝疏水氨基酸) 显示，在将其插入轻链后，应该提高了其持久性。最后该专利申请提供了 一种修饰的A型肉毒毒素，其中所述轻链被突变(427和428位的丙氨酸突 变为亮氨酸)。
根据上述现有技术，本发明人提出本发明的目的在于提供任何类型(优 选为A、B和C1型)肉毒毒素的另一种的或精确描述的稳定形式。与此同 时，本发明人的任务在于提供天然肉毒毒素的稳定变体/类似物，其与未修 饰的肉毒毒素相比展示出体内稳定性增加。这意味着，首先，肉毒毒素变 体/类似物的生物活性在所有情况下应该仅稍微下降(根据上述定义)、优选 根本没有下降(根据本发明，生物活性定义为总的活性，其包括轻链的酶促/ 催化活性以及对神经毒素与靶细胞结合和轻链转运至靶细胞所需的活性)； 以及其次，尽管被修饰，所述轻链还是转运至其作用位点——运动神经元 细胞溶胶内。
与前述US20020197278相反，本申请所基于的目的并不是阻断抗原决 定簇、降低毒素的抗原性或限制其从注射位点的扩散。
本申请的发明人令人惊讶地发现，肉毒毒素的轻链可通过插入至少一 个半胱氨酸残基而特异性地在其N末端被PEG化，而没有同时损伤或抑制 肉毒毒素的生物活性(根据上述定义)。所述PEG化的肉毒毒素的特点在于 其体内的稳定性有了令人惊讶的提高(半衰期显著上升)并因此(药理) 作用时间延长。
患者中天然肉毒毒素的(治疗)作用时间依赖于血清型。A型肉毒毒 素作用时间最长，约为3个月。C型肉毒毒素的作用时间与A型类似，而B 型肉毒毒素作用时间较短。E型和F型肉毒毒素的效应仅各自持续了2周， 这两种亚型的短暂作用时间使得其不可用于临床治疗肌张力障碍。本发明 允许(1)所有肉毒毒素的临床应用，甚至那些具有如此短期活性的，以及(2) 采用已知用于治疗的A型和B型毒素进行更为有利的治疗，使得其不必每 3个月施用一次，而只需每半年施用一次。
附图和序列说明
图1：用于克隆重组毒素和毒素片段的寡核苷酸(SEQ ID NO：1-14)。限 制性内切酶的识别序列加下划线。长序列SEQ ID NOs：16和15为组氨酸标 记物(包括10个组氨酸)N末端附着有半胱氨酸残基的重组(突变)A型 肉毒神经毒素，和编码它的DNA的例子。单顺反子表达和翻译的天然毒素 的N末端脯氨酸残基(位置1)被丙氨酸残基取代，以在载体多克隆位点 (MCS)中建立切割位点。所述载体包括恰好位于该MCS 5’端附近的组氨酸 标记物的编码序列。此外，轻链和重链之间的天然环已被一段被E.coli细 胞所识别的序列替换，于是天然前体肽(prepeptide)(N-轻链-环-重链-C)在 神经毒素的重组生产过程中不需要添加外源性蛋白酶的情况下被切割成活 性双链神经毒素，并由此获得活性双链神经毒素。
图2：PEG化C-H10-BoNT/A和对照批次的C-H10-BoNT/A(实施例5) 在非还原条件下的SDS聚丙烯酰胺凝胶分析。条带1：分子量标记；条带2： 对照批次；条带3：PEG化批次。
发明详述
为了达到所述的目的(见上文)，发明人开发了修饰的肉毒毒素。因此 本发明的一个方面和主题涉及修饰的肉毒毒素，其展示天然的重链和修饰 的轻链，其中对轻链的修饰在于：其(1)在其N末端展示链的延长，所述延 长在N端至C端末端的方向上具有-(C)n-(标记物)m-(X)l-结构，其中
C表示半胱氨酸残基；
标记物表示任意标记物，例如链霉抗生物素标记物或组氨酸标记物； 以及
X表示任何天然存在的氨基酸残基；
n是1-50的一个整数；
m是0或1；以及
l是0或1-50的一个整数；
以及(2)链的延长中的至少一个半胱氨酸残基与至少一条PEG链偶联。 经过如此修饰的肉毒毒素下文中也同样称为PEG化的突变肉毒毒素或神经 毒素。
根据一项优选的实施方案，适用下述条件：
n＝1、2或3，m＝0或1，l＝0或l≠0；
n＝1，m＝1，l＝0；n＝2，m＝1，l＝0；n＝3，m＝1，l＝0；
n＝1，m＝0，l＝0；n＝2，m＝0，l＝0；n＝3，m＝0，l＝0；
n＝1，m＝1，l≠0；n＝2，m＝1，l≠0；n＝3，m＝1，l≠0；
n＝1，m＝0，l≠0；n＝2，m＝0，l≠0；n＝3，m＝0，l≠0；
其中每分子毒素与1、2或3分子PEG偶联，取决于n是1、2还是3。
因此优选的所述修饰的肉毒毒素(尤其是A、B和C1型)落入上文中提 到的本发明修饰的肉毒毒素范围内，其轻链通过如下方式修饰：在其N末 端具有链的延长，其中所述延长链具有以下序列：
-(C)1-(标记物)1-(X)0-、-(C)2-(标记物)1-(X)0-、-(C)3-(标记物)1-(X)0-、 -(C)4-(标记物)1-(X)0-、-(C)5-(标记物)1-(X)0-、
-(C)1-(标记物)1-(X)1-、-(C)2-(标记物)1-(X)1-、-(C)3-(标记物)1-(X)1-、 -(C)4-(标记物)1-(X)1-、-(C)5-(标记物)1-(X)1-、
-(C)1-(标记物)1-(X)2-、-(C)2-(标记物)1-(X)2-、-(C)3-(标记物)1-(X)2-、 -(C)4-(标记物)1-(X)2-、-(C)5-(标记物)1-(X)2-、
-(C)1-(标记物)1-(X)3-、-(C)2-(标记物)1-(X)3-、-(C)3-(标记物)1-(X)3-、 -(C)4-(标记物)1-(X)3-、-(C)5-(标记物)1-(X)3-、
-(C)1-(标记物)1-(X)4-、-(C)2-(标记物)1-(X)4-、-(C)3-(标记物)1-(X)4-、 -(C)4-(标记物)1-(X)4-、-(C)5-(标记物)1-(X)4-等。
其中在上述列出的25个实施方案的任何一个中，m同样可为0而不是 1，和/或在每个例子中在轻链延长链上存在的所有半胱氨酸残基都被PEG 化。
当然l也可是11-50或大于50的任何整数，特别为大于100或大于250。 然而，l越大，轻链也越长，但是酶促/催化活性和(总)生物活性(见上文 所定义)并不受所设定的轻链长度上限的影响。然而出于实用性考虑，优 选l上限为10-20，从而l的优选值为1-10的范围，只要l不为0，而这也 是尤其优选的。
相应的考虑也适用于n，鉴于实用和经济的原因其根据本发明的上限被 设定为50。优选的n为1-10的范围，更好地为1-5，以不插入、或不必须 插入太多的PEG分子(因为优选所有插入的半胱氨酸残基为PEG化的)； 也不会使所得到的PEG化的突变肉毒毒素/神经毒素失去如前述定义的生物 活性。如果插入太多的半胱氨酸和PEG残基，或太多的半胱氨酸和PEG残 基插入错误位点，这可以很容易地发生；因为尽管毒素与靶细胞结合，轻 链也不能转运至靶细胞中。
A型肉毒毒素的结构在Lacy & Stevens 1998(Nat.Struct.Biol.5， 898-902)中公开，B型肉毒毒素的结构在Swaninathan & Eswaramoorthy(Nat. Struct.Biol 7，693-699(2000))中公开。因此轻链的结构是已知的，可以分别 确定重链和轻链的哪个区域位于蛋白的表面，可用于与PEG偶联。最常选 择策略，即：将合适的活化PEG(例如PEG-琥珀酰亚胺基丙酸盐 (PEG-succinimidylpropionate))与赖氨酸残基上的ε-氨基相结合，对于发明 人来说并非适用。活化的PEG可以与大量的赖氨酸残基反应——甚至在重 链的结合结构域，试验证明其能导致显著的灭活。
与此相反，本发明的发明人鉴定了轻链上的氨基酸残基，其首先适于 被至少一个半胱氨酸残基替换，随后在至少一个插入的半胱氨酸残基上被 PEG化。这些在下文中还要被详细叙述的经修饰的肉毒毒素同样为本发明 的一个优选的实施例，其作为与PEG的偶联物展示足够的生物(包括酶促/ 催化)活性(其定义为相当于未修饰蛋白生物活性的至少20％、优选30-40％， 50-70％或甚至为75-95％)，同时稳定性增加(与相应的天然神经毒素相比)， 在下文中同样称为本发明的PEG化的突变肉毒毒素或神经毒素。
刚刚提到的本发明的修饰的肉毒毒素同样为突变的肉毒毒素与PEG的 偶联物。所述修饰的肉毒毒素同样通过分开插入的半胱氨酸残基与PEG偶 联。为此，各个肉毒毒素轻链N末端前20个氨基酸残基中的至少一个、但 任选2、3、4、5、10或甚至所有的20个氨基酸残基可被半胱氨酸残基所 取代。这些修饰的肉毒毒素同样展示天然的重链和修饰的轻链，其中轻链 的修饰为：至少一个至最多20个天然位于其N末端的氨基酸残基突变为半 胱氨酸残基。任选其包含额外的N末端延长链，这样所述轻链的序列在N 端至C端方向上具有以下结构：
-(标记物)m-(X)l-BoNT(X1-20C)，其中
C表示半胱氨酸残基；
标记物表示任何标记物，例如链霉抗生物素标记物或组氨酸标记物； 以及
X表示任何天然存在的氨基酸残基；
m为0或1；以及
l为0或1-50的一个整数；
N末端最多20个半胱氨酸残基中至少一个与至少一条PEG链相偶联。
BoNT/A产生如下突变体，其特征为下列氨基酸残基取代中的至少一 个、至多20个，使得所插入的半胱氨酸残基能进行PEG化：
P1C、F2C、V3C、N4C、K5C、Q6C、F7C、N8C、Y9C、K10C、D11C、 P12C、V13C、N14C、G15C、V16C、D17C、I18C、A19C、Y20C。
根据一项优选的实施方案，采用下述条件
m＝1，l＝0，20个N端氨基酸残基中仅有1个被半胱氨酸残基取代， 尤其仅在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位的残基被取代；
m＝0，l＝0，20个N端氨基酸残基中仅有1个被半胱氨酸残基取代， 尤其仅在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位的残基被取代；
m＝1，l≠0，20个N端氨基酸残基中仅有1个被半胱氨酸残基取代， 尤其仅在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位的残基被取代；
m＝0，l≠0，20个N端氨基酸残基中仅有1个被半胱氨酸残基取代， 尤其仅在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10位的残基被取代；
m＝1，l＝0，20个N端氨基酸残基中仅有2个被半胱氨酸残基取代， 尤其是仅1和3位、1和4位、2和4位、1和5位、2和5位、3和5位、 1和6位、2和6位、3和6位、或4和6位的残基被取代；
m＝0，l＝0，20个N端氨基酸残基中仅有2个被半胱氨酸残基取代， 尤其是仅1和3位、1和4位、2和4位、1和5位、2和5位、3和5位、 1和6位、2和6位、3和6位、或4和6位的残基被取代；
m＝1，l≠0，20个N端氨基酸残基中仅有2个被半胱氨酸残基取代， 尤其是仅1和3位、1和4位、2和4位、1和5位、2和5位、3和5位、 1和6位、2和6位、3和6位、或4和6位的残基被取代；
m＝0，l≠0，20个N端氨基酸残基中仅有2个被半胱氨酸残基取代， 尤其是仅1和3位、1和4位、2和4位、1和5位、2和5位、3和5位、 1和6位、2和6位、3和6位、或4和6位的残基被取代；
m＝1，l＝0，20个N端氨基酸残基中仅有2个被半胱氨酸残基取代， 尤其是仅1和2位、2和3位、3和4位、4和5位或5和6位的残基被取 代；
m＝0，l＝0，20个N端氨基酸残基中仅有2个被半胱氨酸残基取代， 尤其是仅1和2位、2和3位、3和4位、4和5位或5和6位的残基被取 代；
m＝1，l≠0，20个N端氨基酸残基中仅有2个被半胱氨酸残基取代， 尤其是仅1和2位、2和3位、3和4位、4和5位或5和6位的残基被取 代；
m＝0，l≠0，20个N端氨基酸残基中仅有2个被半胱氨酸残基取代， 尤其是仅1和2位、2和3位、3和4位、4和5位或5和6位的残基被取 代；
其中每个毒素分子与一个或两个PEG分子偶联，取决于一个还是两个 半胱氨酸残基被半胱氨酸残基N端取代。
因此属于上文中所述的修饰的肉毒毒素的优选为如下肉毒毒素(尤其 是A、B和C1型)，其轻链被如下修饰：在其N段具有链的延长，所述延 长的轻链的N端展示以下序列之一：
-(标记物)1-(X)0-BoNT(P1C)、-(标记物)1-(X)0-BoNT(F2C)、-(标记 物)1-(X)0-BoNT(V3C)、-(标记物)1-(X)0-BoNT(N4C)、(标记物)1-(X)0- BoNT(K5C)，
-(标记物)1-(X)1-BoNT(P1C)、-(标记物)1-(X)1-BoNT(F2C)、-(标记物)1 -(X)1-BoNT(V3C)、-(标记物)1-(X)1-BoNT(N4C)、-(标记物)1-(X)1- BoNT(K5C)，
-(标记物)1-(X)2-BoNT(P1C)、-(标记物)1-(X)2-BoNT(F2C)、-(标记 物)1-(X)2-BoNT(V3C)、-(标记物)1-(X)2-BoNT(N4C)、-(标记物)1-(X)2 -BoNT(K5C)，
-(标记物)1-(X)3-BoNT(P1C)、-(标记物)1-(X)3-BoNT(F2C)、-(标记 物)1-(X)3-BoNT(V3C)、-(标记物)1-(X)3-BoNT(N4C)、-(标记物)1-(X)3- BoNT(K5C)，
-(标记物)1-(X)4-BoNT(P1C)、-(标记物)1-(X)4-BoNT(F2C)、-(标记 物)1-(X)4-BoNT(V3C)、-(标记物)1-(X)4-BoNT(N4C)、-(标记物)1-(X)4 -BoNT(K5C)等，
其中上述25个优选的实施方案的任何一个中，m也可为0而不是1， 和/或所有N末端插入的半胱氨酸残基都是PEG化的。
当然l也可是11-50的任何整数，或大于50，特别为大于100或大于 250。然而，l越大，轻链也越长，但是酶促/催化活性和(总)生物活性(见 上文所定义)并不受所设定的轻链长度上限的影响。然而出于实用考虑， 优选l上限为10-20，从而l的优选值为1-10的范围，只要l不为0，而这 也是尤其优选的。
除非特别提到，下述解释适用于本发明的修饰的肉毒毒素，不论其是 否为轻链N末端链的延长中插入半胱氨酸残基的变体，还是轻链N末端带 有插入的半胱氨酸残基的变体。
优选的，所述修饰的肉毒毒素为衍生自BoNT/A、BoNT/B或BoNT/C1 的修饰的肉毒毒素，但其同样可以为D、E、F或G型肉毒毒素。同样优选 的，一方面所有人工插入的半胱氨酸残基(优选插入1-10个半胱氨酸残基) 展示至少一个PEG链，但另一方面任何天然的肉毒毒素重链或轻链的半胱 氨酸残基均未被PEG化。
对于本领域技术人员显而易见的是，标记物(tag)(m＝1)在方便地纯 化重组(例如在E.coli中)制备的本发明修饰的肉毒毒素中的重要性。这样， 所述标记物对于增加神经毒素的稳定性或其生物活性不是必需的，而是为 了从细菌培养物中简单地、并接近定量地分离修饰的肉毒毒素。
在n的合适选择(在轻链N末端延长链中插入半胱氨酸残基的变体的 情况下)以及被半胱氨酸残基取代的氨基酸数目和位置(在轻链N末端中 插入半胱氨酸残基的变体情况下)的问题上，应该考虑到，优选仅插入进 行PEG化所需的半胱氨酸残基数(同样适用于l≠0、至少一个氨基酸残基 X为半胱氨酸残基的情况)。这些插入的半胱氨酸残基优选都是PEG化的以 及完全PEG化的，同时没有一个天然的重链或轻链半胱氨酸残基被PEG化， 这也是发明人令人惊讶的发现(除了一个分子内和一个分子间二硫键之外， 例如A型肉毒毒素在重链中含有3个额外的半胱氨酸残基(C791、C967、 C1060)，在轻链中含有2个额外的半胱氨酸残基(C134和C165))。这样就可以 获得PEG化突变肉毒毒素形式的一致(均质)产品。而且，避免插入太多 的半胱氨酸或PEG残基或在错误的位置插入太多的半胱氨酸或PEG残基是 合理的，原因在于：(i)所述毒素可能变得体积太大，以致于不能与靶细胞 结合，和/或(ii)尽管毒素与靶细胞结合，所述轻链不能或不能充分转运到 靶细胞内。换句话说，在这个或那个变体中仅插入一个半胱氨酸残基及其 PEG化通常能实现本发明的目的，因此是特别优选的。
因此，本发明的PEG化的突变的肉毒毒素/神经毒素与其相应的天然 (自然的)肉毒毒素/神经毒素一样，是生物学和酶促(催化)活跃的，或 在前述定义的意义上来说，展示最小程度的生物和酶促/催化活性降低，但 比天然前体毒素(本发明的PEG化的突变的肉毒毒素/神经毒素衍生自这些 前体毒素)更稳定，部分甚至稳定得多。而且，优选一种PEG化的突变肉 毒毒素，其PEG化突变(修饰)的轻链在运动神经元细胞溶胶中表现出比 相应天然肉毒毒素的未修饰轻链更高的稳定性。
如上文所述，轻链的PEG化使得其相对于未修饰轻链稳定性提高。根 据本发明，所述PEG链与轻链连接，这样首先其酶活性不变或至多稍微降 低(根据前文所定义)，其次，修饰的轻链与未修饰的轻链一样转运入运动 神经元的细胞溶胶中。
所述组氨酸标记物与其他标记物例如链霉抗生物素标记物一样，使得 突变的神经毒素可以从转化细菌(例如E.coli)的裂解液中直接分离。在 DNA水平中，其通常简单连接于所述神经毒素编码区域的5’端。在组氨酸 标记物的情况下，在Ni-NTA-Sepharose上采用亲和层析分离。下一步中， 采用所述方法分离的突变神经毒素与活化的PEG偶联。Nektar Therapeutics 公司提供了一系列的活化的PEG衍生物，例如PEG-马来酰亚胺、PEG-乙 烯基砜(vinylsulfon)、PEG-碘乙酰胺以及PEG-邻吡啶基-二硫化物和PEG 化的说明。根据本发明，这些PEG衍生物可能包含不同的链长，例如分子 量5000道尔顿、10000道尔顿、20000道尔顿和30000道尔顿的PEG衍生 物可从商业上获得，可用于本发明。
为了测定突变的并随后PEG化的肉毒毒素的蛋白酶活性，定量记录了 与血清型相应的SNARE蛋白的切割。所述活性随后任选与(i)天然神经毒素 (相应血清型的天然神经毒素)、(ii)带有用于进行方便分离的标记物的突变 神经毒素、和/或(iii)无所述标记物的突变神经毒素进行了比较。根据本发明， 突变的神经毒素和PEG化突变的神经毒素的活性与天然(未突变)的神经 毒素类似(即，根据本发明的突变神经毒素和修饰的神经毒素的生物活性(按 前文所定义)与天然神经毒素的生物活性相比，从前面所给出的定义来说 最多只稍微降低)。
所述PEG化的神经毒素的总活性首先在离体(ex vivo)模型，即所谓 的隔膜(diaphragm)或半隔膜(hemidiaphragm)测定中测定。此处所述麻 痹活性通过神经肌肉样品测定。根据本发明，所述修饰的、和突变的、以 及随后PEG化的神经毒素的生物活性是未修饰(天然)蛋白生物活性的至 少20％、优选30-40％或50-70％或甚至75-95％(生物活性同样理解为依 照前述的定义)。
本发明所述的PEG化突变神经毒素的毒性可用小鼠LD50-测定进行测 定，其中剂量确定为腹腔给药后一组中半数小鼠致死的剂量。
本发明所述的PEG化突变神经毒素的作用时间同样在小鼠中体内测 定。在后爪腓肠肌注射亚致死剂量的本发明A型PEG化突变的肉毒毒素或 相应天然肉毒毒素后，测定肌肉保持麻痹的时间，麻痹效果采用尺度进行 分级。作用时间在小鼠中比人类中短，其通过采用修饰的A型肉毒毒素， 延长了30-150％(相对于未PEG化和未突变的A型肉毒毒素)。
本发明所述的PEG化突变肉毒毒素可以加工成合适的制剂以完成药品 的制备，其包括治疗剂量范围内的剂量(或整数倍数的剂量)(例如每注射安 瓿100LD50-单位)。根据一项优选的实施方案，所述药物组合物不用添加人 血清白蛋白(HSA)即是稳定的。然而，其同样可以采用人血清白蛋白(HSA) 稳定。在这方面尤其优选的是采用无HAS成分以稳定蛋白活性物质，如 WO2005/007185中所述。根据另一项实施方案，本发明的药物组合物为冻 干剂形式或液体，这两种剂型都适合任选采用合适的溶剂接纳后注射入所 治疗的肌肉内。
具有更高的稳定性和半衰期的所述PEG化突变肉毒毒素或展示这些 PEG化突变肉毒毒素的药用制剂可用于治疗多种肌张力障碍，例如痉挛性 肌张力障碍(spasmodic dystonia)、喉肌张力障碍(laryngeal dystonia)、颈 肌张力障碍(cervical dystonia)、手局部肌肉肌张力障碍(focal hand dystonia)、睑痉挛(blepharospasm)、斜视(strabism)、大脑轻瘫(cerebral paresis)、半面痉挛(hemifacial spasms)、痉挛状态(spasticity)、痉挛性结 肠炎(spasmodic colitis)、肛门痉挛(anismus)、抽搐(tics)、震颤(tremors)、 夜磨牙症(bruxism)、肛门裂(achalasia)、失弛缓症(achalasia)、吞咽困 难(dysphagia)、多汗(hyperhidrosis)以及脸部皱纹去除。
本研究的其他方面涉及(1)编码上述稳定性增加的修饰肉毒毒素的核 酸(特别的，所述核酸为DNA)；(2)包含(1)所述核酸的载体；以及(3)宿主 细胞，其包含(2)所述的载体(特别的宿主细胞为原核的，尤其是E.coli宿 主细胞)。
以下实施例对本发明进行详述，但并非将本发明限制在其中所列举的 特定参数内。
实施例
实施例1：A型肉毒神经毒素(BoNT/A)的克隆和表达
为了克隆轻链和转运结构域的DNA序列，从A型肉毒梭菌培养物(菌 株ATCC 3502)中分离染色体DNA。采用引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2 进行PCR扩增，获得编码带修饰的环序列的BoNT/A轻链的基因片段。PCR 扩增产物通过Nco I和Bgl II的限制性酶切位点克隆入表达质粒pQE-H10， 其衍生自pQE-60，在克隆位点的5’侧编码组氨酸标记物(由10个组氨酸残 基组成)。通过该克隆方法产生质粒pQE-H10-BoNT/A-L。采用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4进行PCR扩增，获得编码BoNT/A重链的基因片段。 其通过Stu I和Bgl II的限制性酶切位点克隆至pQE-H10-BoNT/A-L中轻链 环序列的3’末端(质粒pQE-H10-BoNT/A)。大肠杆菌表达菌株M15[pREP4] (Qiagen)用质粒pQE-H10-BoNT/A转化。重组毒素的表达在25℃下用500μM (最终浓度)IPTG分级诱导过夜来完成。所述细胞在pH8.0下，在50mM 含300mMNaCl的磷酸缓冲液中用溶菌酶和超声处理来裂解。裂解液离心后 在室温下孵育5h，其间于-20℃存储，然后于Ni-NTA琼脂糖柱上层析。 最后，洗脱级分用偶联缓冲液(100mM磷酸二氢钠，pH7.5，150mM NaCl， 10mM EDTA)透析，测定蛋白浓度。SDS聚丙烯酰胺凝胶分析显示，在还 原条件下，在约50kDa和100kDa处的两条强条带和150kDa处的一条弱条 带被考马斯亮蓝染色。而在非还原条件下，仅在约150kDa处观察到一条条 带，其相应于以占优势的双链二硫键桥接结构存在的A型肉毒神经毒素条 带样式。
实施例2：B型肉毒神经毒素(BoNT/B)的克隆和表达
类似于A型毒素，进行N末端带有组氨酸标记物(由10个组氨酸残 基组成)的B型肉毒神经毒素的克隆和表达。使用引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8从B型肉毒梭菌(菌株Okra)染 色体DNA中扩增轻链和重链。
实施例3：C1型肉毒神经毒素(BoNT/C1)的克隆和表达
类似于A型毒素，进行N末端带有组氨酸标记物(由10个组氨酸残 基组成)的C1型肉毒神经毒素的克隆和表达。使用引物SEQ ID NO：9和 SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12从C型肉毒梭菌(菌株205) 的染色体DNA中扩增轻链和重链。
实施例4：C-H10-BoNT/A的克隆和表达
为了能进行N末端的PEG化，在组氨酸标记物(由10个组氨酸残基 组成)N末端的氨基酸序列上连接半胱氨酸残基。其可以通过对 pQE-H10-BoNT/A编码组氨酸标记物的序列区域进行定点诱变而产生。采用 Stratagene的QuickChange定点诱变试剂盒。诱变反应采用引物SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14进行。所述DNA序列中的核酸变化通过分离克隆 的DNA测序验证。所述突变毒素的表达和纯化类似实施例1进行。
实施例5：C-H10-BoNT/A的PEG化
将1.2mg C-H10-BoNT/A在1mM DTT中孵育30分钟，以还原二硫键 连接的二聚体。为去除还原剂，通过PD-10柱进行缓冲液交换，换成偶联 缓冲液。毒素溶液通过超滤浓缩至3.6mg/ml。少部分未处理作为对照样本， 剩下的溶液与5倍摩尔过量的mPEG-Mal-5000(Nektar Therapeutics)混合， 在环境温度下旋转过夜。为了避免SDS-Page样品制备过程中其他半胱氨酸 残基的衍生化反应，所述PEG化试剂用5倍过量的L-半胱氨酸饱和。SDS 凝胶电泳显示，在非还原条件下，与对照批次相比，出现了一条额外的强 条带，迁移率轻微下降，而原始的150kDa处的毒素条带强度则显著下降(图 2)。
实施例6：体外活性测定
PEG化的突变的BoNT/A衍生物的特异性蛋白酶活性(即，无结合或 转运的催化活性)采用ELISA方法测定。为此克隆重组多肽，其在N末端带 有常用的融合配偶体谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和C末端肽序列，所述肽序 列包含SNAP-25的C末端17个氨基酸残基。所述17个氨基酸残基代表了 BoNT/A特异性切割的底物蛋白SNAP-25的区域。微孔板用融合蛋白涂布 后，用作为参比试样的H10-BoNT/A、或用PEG化和非PEG化形式的突变 体进行孵育。每种情况下产生的切割产物用抗体检测，所述抗体特异性识 别新形成的C末端。表3列出了非PEG化和PEG化形式的C-H10-BoNT/A、 以及BoNT/A(参比试样)的值。考虑到测定的波动范围，可以观察到，通过 插入突变和随后的PEG化反应，所述肉毒毒素的催化活性并没有降低，反 而升高。
表3
  相对活性[％] H10-BoNT/A 100 C-H10-BoNT/A 100 mPEG-C-H10-BoNT/A 121.1
比活按照蛋白酶单位/ng蛋白测定。
实施例7：用半隔膜(hemidiaphragm)测定来确定离体活性
为了测定毒素衍生物的总活性，即修饰的神经毒素与靶细胞受体的结 合以及转运入神经细胞并蛋白酶解SNARE底物，测量了中毒后小鼠神经肌 肉标本的麻痹时间。再一次采用H10-BoNT/A作为参比试样。表4列出了相 对活性的值。本发明所述修饰的肉毒毒素活性相较参比样品下降20-30％显 然是基于毒素与靶细胞的结合能力下降，以及毒素转运入靶细胞的能力下 降。
表4
  相对活性[％] H10-BoNT/A 100 C-H10-BoNT/A 22.5 mPEG-C-H10-BoNT/A 30
实施例8：PEG化的A型肉毒毒素的作用时间
PEG化的突变的肉毒毒素(mPEG-C-H10-BoNT/A)的作用时间采用CD 1-小鼠进行测定。10只小鼠分别经后爪腓肠肌肌内注射(2 x 0.05mL)的(i)突 变的肉毒毒素、(ii)PEG化突变的肉毒毒素、或(iii)天然肉毒毒素，剂量为 0.4或0.6LD50-单位/小鼠(在生理盐水+1mg/mL HSA中)。然后按照尺度(最 小、轻度、重度麻痹)每天评价肌肉的麻痹状态。在用天然神经毒素处理 的动物中，25天后就观察不到肌肉麻痹了。在用突变的或PEG化的突变的 肉毒毒素处理的动物中，其作用时间延长了7-20天。
序列表
<110>比奥泰康医疗有限责任公司(BioteCon Therapeutics GmbH)
<120>聚乙二醇化的突变的肉毒梭菌毒素
<130>BIO-009 PCT
<140>未知
<141>2007-03-15
<150>EP 06 005 300.6
<151>2006-03-15
<160>16
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1

<210>2
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2

<210>3
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3

<210>4
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<212>DNA
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<223>引物
<400>4

<210>5
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<223>引物
<400>6

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<223>引物
<400>7

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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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<212>DNA
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<223>引物
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>44
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<213>人工序列
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<223>引物
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<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
<400>13

<210>14
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<213>人工序列
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<223>引物
<400>14

<210>15
<211>3939
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>突变的A型肉毒神经毒素
<400>15


<210>16
<211>1312
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变的A型肉毒神经毒素
<400>16