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MMP-8活化产物及其测定和用途

阅读：246发布：2020-10-01

专利汇可以提供MMP-8活化产物及其测定和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种新的MMP-8活化产物，例如MMP-8中间部分活化产物。本发明还涉及在来源于受试者的生物样品中检测这种MMP-8活化产物或活化的MMP-8 片段，并且涉及其用于诊断疾病的用途，这些疾病涉及活化MMP-8的异常或升高的水平。，下面是MMP-8活化产物及其测定和用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种MMP-8活化产物，其特征在于，优选为MMP-8中间部分活化产物的所述MMP-8活化产物包括一个或多个MMP-8的活化片段，并且大小为20kDa-35kDa之间，优选为约20kDa、
25kDa、30kDa或35kDa。
2.根据权利要求1所述的MMP-8活化产物，其中，所述活化产物的大小对应于通过使用APMA活化天然MMP-8而获得的活化产物。
3.根据权利要求1所述的MMP-8活化产物，其中，所述活化产物的大小对应于通过蛋白水解去除或通过利用氧化活化的化学修饰、优选通过NaOCl活化天然MMP-8而获得的活化产物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的MMP-8活化产物，其中，所述活化产物包括序列SEQ ID NO:1。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的MMP-8活化产物，其中，所述活化产物包括序列SEQ ID NO:2。
6.一种确定样品中的MMP-8活化的方法，所述方法包括：
a)提供来自受试者的生物样品；
b)检测所述生物样品中一个或多个MMP-8活化产物、优选为MMP-8中间部分活化产物的存在，所述一个或多个MMP-8活化产物包括一个或多个MMP-8的活化片段，并且大小为5kDa-
35kDa之间，优选为10kDa-30kDa，更优选为约10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa或35kDa；
c)可选地将所述样品中的MMP-8活化产物的存在与活性MMP-8的存在相关联；和/或d)可选地将所述样品中的MMP-8活化产物的存在与其他更大部分活性MMP-8的存在相关联；
其中所述生物样品中的所述MMP-8活化产物的存在表明、确定和/或预示所述样品中活性MMP-8的存在。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述样品来自于口腔、龈沟液、种植体周围龈沟液、口腔斑块、牙菌斑、漱口液、漱口水、唾液、根管液、伤口渗出液、脓水PUS、口腔生物膜、组织活检、口腔液交换、口腔病变血液。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述样品来自于羊水、血清、血浆、阴道冲洗液、鼻腔冲洗液、鼻窦、内耳、窦、尿液、滑膜液、脑脊液、排泄物、交换液、泪液、灌洗液(肺)、组织活检和/或汗液。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中，所述活化产物的所述大小对应于通过使用APMA活化天然MMP-8而获得的活化产物。
10.根据权利要求6至9中任一项所述的方法，其中，所述活化产物的所述大小对应于通过蛋白水解去除或通过利用氧化活化的化学修饰(优选通过NaOCl)活化天然MMP-8而获得的活化产物。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的方法，其中，所述活化产物包括序列SEQ ID NO:1。
12.根据权利要求6至11中任一项所述的方法，其中，所述活化产物包括序列SEQ ID NO:2。
13.根据权利要求6至12中任一项所述的方法，其中，所述MMP-8活化产物的所述存在通过使用用于检测所述生物样品中MMP-8片段的配体系统来确定。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述配体系统包括：一个或多个抗体、抗体对和/或抗体片段，并且其中测定是定量、半定量或定性的免疫分析，优选地选自由以下各项组成的组：蛋白质印迹法、IFMA、EIA、IEMA、ELISA、侧向层析、表面等离子体共振测定和电化学测定。
15.根据权利要求6至14中任一项所述的方法，其中，所述MMP-8活化产物的所述存在通过使用所述生物样品中的所述MMP-8中间部分活化产物的直接蛋白检测技术来确定。
16.根据权利要求6至15中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括：将在步骤b)中获得的结果与参考样品进行比较，从而诊断出疾病或疾病进展的倾向或风险，其中：
a)所述参考样品来源于目前已知具有正常水平的MMP-8的受试者或患者组，因而所述生物样品和所述参考样品的相似的结果表示：所述受试者不具有或不易患所述疾病，或者不具有或不易具有所述疾病发生或进展的风险；以及与所述参考样品相比，在所述生物样品中的所述MMP-8活化产物的水平升高表示：所述受试者具有所述疾病或易患所述疾病，或者易具有所述疾病发生或进展的风险增加；或者
b)所述参考样品来源于目前已知具有所述疾病或易患所述疾病的受试者或患者组，因而所述生物样品和所述参考样品的相似的结果表示：所述受试者具有或易患所述疾病，或者具有或易具有所述疾病发生或进展的风险。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述疾病是：牙周炎症、牙周组织缺损(退化)、牙龈炎、牙周炎、种植体周围炎、种植体周围粘膜炎、牙齿缺损、牙种植体的缓解、牙槽骨缺损、粘膜炎、粘膜改变、根尖周炎症、根管炎症、龋齿、垂直颌骨断裂、正畸牙移动、过敏性炎症反应和/或口腔细菌引起的菌血症。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中，所述MMP-8活化产物的所述存在表明或预示牙周病，例如慢性或急性牙周炎或种植体周围炎，并且这些口腔疾病表明或增强系统性疾病或病症或是针对系统性疾病或病症的已知风险因素，这些系统性疾病或病症例如是I型糖尿病、II型糖尿病、慢性阻塞性肺疾病COPD、风湿性疾病、关节炎/关节炎疾病、骨质疏松症、骨科疾病、自身免疫性疾病、组织移植疾病、关节炎、端假体感染或缓解，心血管疾病例如中风、心肌梗死、动脉硬化，妊娠相关风险例如早产、低出生体重，生殖风险例如勃起功能障碍、精子数量减少和精子细胞的较低迁移率。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述疾病是：妇科疾病，例如羊膜内炎症、母体炎症、新生儿疾病、早产、低出生体重和羊膜病变；癌症疾病，例如恶性肿瘤、乳腺癌和白血病；关节炎/风湿性疾病，例如风湿性关节炎、关节病；糖尿病，包括各种形式的糖尿病、肾脏疾病、肾病、非愈合性糖尿病伤口；眼部疾病，例如圆锥角膜、角膜的透明性边缘变性；耳鼻喉疾病(例如，来自内耳、鼻窦)；感染或者炎症，例如莱姆疏螺旋体病、脓毒病、系统性炎症反应综合征(SIRS)、HIV、幽门杆菌感染、系统性炎症、系统性轻度炎症、肺部感染和炎症例如支气管炎、支气管炎扩张、慢性阻塞性肺疾病COPD、小儿感染/炎症；神经系统感染、炎症和疾病例如脑膜炎、克罗恩病；心血管疾病，例如血管疾病、动脉粥样硬化例如动脉内斑块的炎症、栓塞和中风；伤口，例如致命伤口、非愈合性伤口和烧伤皮肤；肠道疾病(来自排泄物检测)；在创伤或意外之后的疾病；和/或代谢综合征和肥胖症。

说明书全文

MMP-8活化产物及其测定和用途

技术领域

[0001] 本发明总体上涉及诊断学领域。具体地，本发明涉及一种MMP-8活化产物，优选为MMP-8中间部分活化产物，涉及检测来源于受试者的生物样品中的MMP-8活化、MMP-8活化产物或活化的MMP-8片段，以及涉及测定疾病或疾病进展的倾向或风险。本发明还涉及MMP-8活化产物用于诊断与活化的MMP-8的异常或升高水平相关的疾病的用途。

背景技术

[0002] 牙周病是人牙列中的主要问题。事实上，由于牙周病而缺失的牙齿比龋齿导致缺失的牙齿要多。因此，极需可靠的用于牙周病的诊断测试；特别地，需要对疾病的发作进行早期诊断，甚至在早期的牙龈炎阶段，即，在组织破坏的可见迹象发生之前对开始组织破坏的早期阶段进行诊断。

[0003] 牙周病包括一系列炎性病症，由侵袭支撑牙齿的龈(牙龈)和齿槽颌骨结构的感染所引起。

[0004] 引起牙周病的主要原因是附着于牙齿的菌斑和细菌生物膜。在牙周病中它们导致牙龈发炎，这可以引起对实际的牙齿支撑结构和骨骼的破坏。在牙龈线的上面(龈上)和下面(龈下)通常积聚了大量的菌斑和细菌生物膜。

[0005] 牙龈炎(牙龈发炎)与牙周炎的区别在于：在牙龈炎中，牙龈发炎但检测不到深(>4mm)的牙周袋；因此，软硬(多骨)牙齿支撑结构的不可逆破坏与牙龈炎是不相关的。牙周炎的特征在于发炎的牙龈和软硬(多骨)牙齿支撑结构的破坏；然而，牙周炎可能在临床上外观健康的牙龈中被忽略。

[0006] 虽然过去20年内在改进诊断系统方面已经进行了大量研究和开发，这体现在出版物的增加上(例如，Pubmed检索2010年4月/2013年7月：MMP-8 640/891引文，在牙周病学/移植学中的MMP-8 95/136引文)，但牙种植体周围炎中的牙周病及其后继症仍导致了数十亿的牙科治疗费用。

[0007] 虽然在治疗上有越来越多的认识和重大努力，同时具有能够在椅旁或通过实验室测试来鉴别疾病的改进的测试系统可用，但这种疾病正在工业化国家例如德国大肆蔓延/成长(Deutsche Mund Gesundheits Studie IV，2006)。

[0008] “根据考虑到近中颊和远中舌的CDC定义，在两个年龄组中牙周炎的发病率为70.9％和87.4％，分别有四分之一和二分之一呈现严重形式。”(B.Holtfreter等人，2010)[0009] 在过去的25年中，通过可代替在几年前由于牙周炎和其它原因已缺失的牙齿的牙种植体的发展，已在修复技术方面取得了显著进展。

[0010] 然而，相同或类似的病理学适用于牙种植体，如同其适用于牙周炎中的天然牙齿。

[0011] 如上面针对天然牙齿所述，牙周炎主要由附着于种植体表面的生物膜中的病原体导致，发作于种植体与基牙之间的连接以及假体上的结构，引发牙种植体周围组织的类似宿主反应：由细菌碎片引发(LPS)，诱发可能超出控制的炎性反应，并且在其过程中将释放大量蛋白酶，主要为MMP-8。

[0012] 类似于天然牙齿，MMP-8的非平衡活化可导致种植体周围龈沟液(PISF)中活性MMP-8(aMMP-8)的超活化和极高浓度(Ma J等人，2000，Xu L等人，2008)，并且可能在单独不可预测的时间内导致牙槽骨(种植体周围炎)的显著缺失，从而导致种植体缺失。

[0013] 一旦处于种植体周围炎阶段，对于治疗该疾病就几乎没有选择。等同于种植体周围炎临床诊断中的牙周炎(Ma J等人：2000、Xu L等人2008)，意味着对该疾病已经引起的破坏等级的测定，例如，通过探测附着缺失或X射线检查来测定。已证明类似分析蛋白质的其它方法并不是足够特定的，或者通过椅旁诊断方法无法获取参数，或者相关生物样品不够稳定不能送至专门实验室用于常规诊断。

[0014] 因此，对于牙科专业人员、医疗专家甚至患者的家用监测，仍然主要关心的是开发能够不仅识别活性蛋白酶(如MMP-8)而且识别已经开始的活化过程的测试系统，尤其是快速椅旁测试。这可允许改进对个体牙周病状况的预测判断或预后分析，这在自然牙列情况下对于即将到来或现有的牙周病是重要的，并且在种植体情况下对于种植体周围病症风险的早期检测是重要的。

[0015] 这将使医生能够提示风险患者尽早拜访牙科专业人员，并且将使牙科专业人员能够应用更早期预防性治疗，并且这将促进患者施行更好的口腔卫生。牙周病/病症的早期检测和随后的预防性治疗——如卫生保健系统在龋齿预防方面先前已了解的——可帮助节约数十亿的治疗和修复费用。

[0016] 此外，今天已经证实，(慢性)牙周炎与众多系统性疾病相互作用，并且被认为是众多系统性疾病的重要风险因素，这些众多系统性疾病例如是糖尿病、心肌梗塞(MI)、中风和其它心血管和神经疾病(CVD)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、风湿性关节炎(RA)、克罗恩病(MC)、败血症、HIV、莱姆疏螺旋体病和其它系统性轻度炎症、代谢综合征、肥胖症、肾病、组织移植、矫形外科病症以及早产(PTD)、低出生体重、以及生殖风险例如勃起功能障碍、精子量减少和精子细胞的较低迁移率。

[0017] 例如，患有牙周炎的患者与患有糖尿病的牙周健康患者的(死亡率)优势比增加7.7，对于PTD为7.5，对于中风为8.5。牙周炎是公认的MI、糖尿病和中风的风险因素。许多这些研究也已表明MMP-8作为牙周病的全身和局部(口腔)生物标记的相关性。

[0018] 因此，利用预后测试系统来诊断牙周病的早期发作的能力以及鉴别处于将患上或正患上牙周病症风险的患者的能力，不仅在牙科行业/领域内是非常重要的，而且事实上对整个医疗行业/领域和卫生保健系统也是非常重要的。美国卫生保健保险协会AETNA已证明，已进行牙周治疗的例如糖尿病患者的总体保健费用与没有进行牙周治疗的患者的总体保健费用相比减少了16％，表明口腔疾病的重要性和影响，并且给出理由来思考：改进后的与预防性治疗相结合的牙周风险的早期检测将来对于患者和总体卫生保健费用可能意味着什么。

[0019] 系统性MMP-8在其它疾病中也起作用。有文献记录，MMP-8在细胞外基质代谢、炎性反应的调节和其它生理过程中起主导作用，MMP-8涉及大范围的病理学，并且MMP-8在一些炎性病症和癌症进展中作为药物靶标或疾病标记的角色。MMP-8经描述为大范围炎性病症的可能药物靶标，并且在患者中，升高的MMP-8水平常常与炎性疾病的进展相关联(Dejonckheere E等人，2011)。

[0020] 已发现，早期高血清MMP-8水平在脓毒性感染和心血管疾病中预示致死性后果。此外，已显示，患有细菌性脑膜炎(BM)的患者脑脊髓液(CSF)中的MMP-8水平高或升高，并且还发现，对于患有BM的儿童，非存活者的CSF中MMP-8水平显著高于存活者的CSF中MMP-8水平。

[0021] 还已知，羊水中的炎症和/或感染是早产和不良新生儿后果的风险因素。MMP-8已用作预测和诊断感染/炎症的标记，并且还用于早产和新生儿并发症的发展的标记。

发明内容

[0022] 本发明的一个目的是提供一种测定导致与牙周或种植体周围组织降解、牙周或种植体周围炎症有关的疾病的增加的风险、倾向或活性过程的新方法。

[0023] 本发明的另一目的是提供一种检测来源于受试者的生物样品中MMP-8活化或活化过程的新方法。

[0024] 本发明的另一目的是提供一种检测来源于不同患者组的样品中MMP-8种类的存在的新方法。

[0025] 本发明的另一目的是开发用于诊断与MMP-8的形成、存在、增加的浓度或活化，尤其是MMP-8活化产物(例如MMP-8中间部分活化产物)的形成、存在、增加的浓度、或活化相关的疾病的新方法。

[0026] 还可进行组合测定，其中MMP-8中间部分活化产物经单独检测或按组检测，或与更大活性MMP-8种类一起检测。组合测定在以下情况下尤其有用：当由抗体识别的表位是活化产物和活性MMP-8二者中存在于两个或若干个分子中的共同表位时；和/或当表位多重存在于MMP-8的活化产物(与更大活性MMP-8分子相比)中时；和/或当在活化过程期间从单个MMP-8分子创建了MMP-8的多个活化产物(一种称为立体增殖效应的现象)时。

[0027] 本发明的一方面涉及MMP-8活化产物，例如大小为5-35kDa，优选为10-30kDa，更优选为20-35kDa，适宜地大约为5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa、16kDa、17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、
26kDa、27kDa、29kDa、30kDa、31kDa、32kDa、33kDa、34kDa和/或35kDa的MMP-8中间部分活化产物，或者涉及检测样品中的这种MMP-8活化产物。

[0028] 本发明的另一方面涉及一种测定样品中MMP-8活化的方法，所述方法包括：提供来自受试者的生物样品；检测样品中一个或多个MMP-8活化产物、尤其是MMP-8中间部分活化产物的存在；以及可选地将样品中MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的存在与样品中更大部分活性MMP-8的存在相关联，其中，样品中MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的存在表明、预示和/或确定样品中活性MMP-8的存在，并且，例如，这在测定中增强了活性MMP-8的分析检测及其预测力。例如，反复或缓慢升高的口腔液MMP-8活化产物预示治疗反应，并且表明部位和/或患者处于疾病进展风险中，例如牙周炎中的附着损失。

[0029] 本发明的另一方面涉及进一步诊断疾病或疾病进展的存在或倾向，其包括：

[0030] 确定获自受试者的生物样品中一个或多个MMP-8活化产物例如MMP-8中间部分活化产物的存在；

[0031] 将检测结果与参考样品进行比较，从而诊断出疾病的存在或倾向，其中，[0032] a)参考样品来源于已知具有正常水平的MMP-8的受试者或者患者组，因而生物样品和参考样品的相似结果表示：受试者目前不具有或不易患疾病，或者不具有或不易具有疾病发生或进展的风险；以及与参考样品相比，在生物样品中的MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的水平升高表示：受试者目前(测试时)具有疾病或易患疾病，或者易具有疾病发生或进展的风险增加；或者

[0033] b)参考样品来源于已知目前患有疾病或易患疾病的受试者或者患者组，生物样品和参考样品的相似结果表示：受试者具有或易患疾病，或者具有或易具有疾病发生或者进展的风险。

[0034] 在随附权利要求书中给出了本发明的特征性特征。

[0035] 本发明的另一个目的是找出表示MMP-8活化片段的MMP-8分子种类与利用时间分辨免疫荧光分析(IFMA)和免疫-ELISA法(IEMA，ELISA)分析的MMP-8免疫反应性水平以及与不同牙周炎症负担水平的关系。附图说明

[0036] 图1A显示了当考虑牙齿数量时，根据吸烟状况，在研究组1-4(实例1)中MMP-8IFMA水平，而图1B显示了MMP-8IEMA水平。在组1-4中非吸烟者的IFMA(p＝0.010)和IEMA(p＝0.028)的趋势是显著的。

[0037] 图2A显示了MMP-8种类及其组合。森林图表示MMP-8kDa种类患病率的优势比(95％置信水平，cl)。因变量：在第4组中IFMA水平(由牙齿数量调节)>中值水平(强牙周炎症负担)。关联性是显著的。图2B显示了MMP-8种类及其组合。森林图表示MMP-8kDa种类患病率的优势比(95％cl)。因变量：吸烟。关联性是显著的。

[0038] 图2C显示了MMP-8种类及其组合。森林图表示MMP-8kDa种类患病率的优势比(95％cl)。因变量：吸烟。关联性是显著的。

[0039] 图3显示了用于评价MMP-8IFMA和IEMA水平的诊断敏感度和特异性(图3A)以及具有强牙周炎症负担的25+35kDa MMP-8种类组4的患病率作为状态变量(图3B)的受试者工作特征(ROC)曲线分析。对于ROC曲线下面积，95％置信区间和p值参见实例1。

[0040] 图4显示了重组人MMP-8(Proteaimmun)的有机汞APMA(图4A)和氧化NaOCl(图4B)活化剂的作用的SDS-PAGE(10％)分析。示出了rhMMP-8量和温育时间。通过活化，APMA和NaOCl都引发低分子量MMP-8种类的产生。尤其观察到由箭头指示的与时间相关的形成20-30kDa活化片段。图4C显示了利用来自三个不同来源(Proteaimmun、Merck和Invent)的经APMA和NaOCl活化的rhMMP-8、人体体液以及血清进行的蛋白免疫印迹分析。条带1：
Proteaimmun rMMP-8；条带2：同条带1，外加APMA；条带3：同条带1，外加NaOCl；条带4：Merck rh MMP-8；条带5：同条带4，外加APMA；条带6：同条带4，外加NaOCl；条带7：Invent MMP-8抗原；条带8：同条带7，外加APMA；条带9：同条带7，外加NaOCl；条带10：人牙周炎龈沟液(GCF)；
条带11：人种植体周围炎龈沟液(PISF)；条带12：人正畸处理牙齿的龈沟液；条带13：人牙周炎唾液；条带14：人牙周炎漱口液；条带15：感染的人羊水；条带16：人脑膜炎脑脊液；条带
17：人败血症血清。箭头表示MMP-8活化后所形成的常见20-30kDa片段。参见实例2。

[0041] 图5显示具有不同的MMP-8抗体和不同浓度的MMP-8的未感染(#16)和感染(#12、#13和#19)的人羊水样品的蛋白免疫印迹分析。

[0042] 图6显示了采用不同温育时间的由APMA活化的重组人MMP-8(Proteaimmun)的SDS-PAGE分析。图中显示了用于测序的条带。

[0043] 图7显示了纯化的活性MMP-8的多种部分的SDS-PAGE。样品从左到右；分子量标记PAGE尺，1)-4)纯化的hMMP-8的多种部分，分子量标记Spectra Multicolor。

[0044] 图8显示了各种等份的利用抗-hMMP-8-MoAb 1491-E6-F7染色的纯化的人aMMP-8的蛋白质印迹。样品从左到右；分子量标记Dual Xtra；1)-4)纯化的hMMP-8的多种部分，5)纯化前的胎盘提取物。

[0045] 序列表

[0046] SEQ ID NO:1在图6的条带3、4、5和6的MMP-8活化产物中发现的、例如在具有大小25kDa的条带3中发现的MMP-8中间部分序列

[0047] SEQ ID NO:2在图6的条带2、3、4、5和8的MMP-8活化产物中发现的、例如在具有大小21kDa的条带4中发现的MMP-8中间部分序列

具体实施方式

[0048] 本申请的发明人令人吃惊地发现，可通过检测新发现的MMP-8活化产物，例如大小为5-35kDa，优选为约10-30kDa，更优选为约20-35kDa的MMP-8中间部分活化产物，能够在多种生物样品中检测到活化MMP-8的存在。片段化MMP-8以多种限定的分子形式存在，其大小为5kDa、6kDa、7kDa、8kDa、9kDa、10kDa、11kDa、12kDa、13kDa、14kDa、15kDa、16kDa、17kDa、18kDa、19kDa、20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、25kDa、26kDa、27kDa、29kDa、30kDa、
31kDa、32kDa、33kDa、34kDa和35kDa，并包括序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

[0049] 在一个方面中，片段的不同分子种类可与样品类型相关，并且片段的特定组合可用于表示在样品所源自的受试者中存在的某种状态或疾病或发展疾病的风险。

[0050] 通过使用本领域已知的任意方法可检测到样品中的MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物(包括MMP-8的至少一个片段)。测定可为定性的、半定量的或定量的免疫测定。根据本发明的适合的检测方法的非限制性实例包括蛋白质印迹、IFMA、EIA、ELISA、侧向层析、Dip-stick测定、表面等离子体共振测定、电化学测定或任何其它已知的配体结合或直接检测测定系统。直接检测测定系统或技术意指不基于分析用的配体结合的任何方法，即技术等；尺寸排阻色谱[SEC]，例如高压液相色谱[HPLC]或凝胶渗透色谱(GPC)例如SDS-PAGE；或分子光谱法，例如核磁共振光谱(NMR)、UV/VIS-光谱、电喷雾-电离(ESI)等。

[0051] 除非另外指出，在说明书和权利要求书中所用的术语具有诊断学领域所用的常见含义。具体地讲，以下术语具有以下指出的含义。

[0052] MMP-8活化产物指包括在体内或体外活化MMP-8期间自然形成的基质金属蛋白酶8(MMP-8)的一个或多个片段的产物。MMP-8活化产物可内源性产生(即自活化)或通过使用活化制剂或活化剂(例如但不限于APMA、NaOCl、其它氧化剂和/或来源于宿主和来源于微生物的蛋白酶)产生。

[0053] MMP-8中间部分活化产物指包括基质金属蛋白酶8(MMP-8)的至少一个片段的产物，该基质金属蛋白酶8(MMP-8)包括来自整个MMP-8序列的中间区域的一个或多个序列，该一个或多个序列实质上不是C-端部或N-端部的一部分，即不完全是C-端或N-端的一部分。例如，序列可从全长蛋白的氨基酸Asn119延伸过Ala132或从氨基酸Ile151延伸过Asp165。

[0054] 活性MMP-8指与其原体或前体形式不同的活化胶原酶的不同形式。

[0055] MMP-8活化指将MMP-8的预先形式转化为活性/活化的MMP-8的生物或生化过程。

[0056] 本发明者令人惊讶地发现，通过检测MMP-8活化产物，例如MMP-8中间部分活化产物，而不是活性MMP-8的高分子量种类，可增强活性MMP-8的检测。不受限于任何理论，认为MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的绝对浓度更高或在生物样品中的表位数量比具有55-95kDa典型尺寸的更大活性MMP-8分子的数量更多。因此，通过将较低分子量MMP-8中间部分活化产物用作生物标记，更容易在免疫测定中利用捕获抗体实现预后或诊断值。

[0057] 并不完全明白，为什么检测MMP-8的更小片段以用于诊断和预测目的比检测活化MMP-8的高分子量种类更有效。不受限于任何解释性模型，初步观察表明由细菌引发并由环境、获得性和遗传因素支持对生物膜PMN中病原体的免疫宿主反应并使细菌部分的MMP-8的85kDa酶原攻击并活化85kDa酶原。因此将酶原85kDa转化为64kDa片段，以及64kDa结合胶原和细菌/生物膜并引起牙龈组织和牙槽骨的胶原溶解。如果产生的64kDa比可结合胶原的更多，则过量的64kDa将结合TIMP，TIMP为MMP体系的天然调节剂。

[0058] 如果随后仍形成过量的64kDa，这些内源性、和/或通过氧化剂和来源于宿主和/或来源于微生物的蛋白酶通过自溶片段化为40kDa片段和24kDa片段以及也可能片段化为多个小的MMP-8片段，例如5kDa、9kDa、14kDa等。

[0059] 已知40kDa片段引发并支持85kDa酶原的进一步活化，但是活性下降。

[0060] 生理情况看起来，首先，在阶段I中，大多数最初活化的64kDa结合牙周损伤中的1型胶原以及生物膜中的细菌以胶原溶解。

[0061] 随后，在阶段II中，如果可得到过量64kDa，它们可结合TIMP(TIMP1和TIMP2)并开始片段化为40kDa，40kDa也将结合TIMP。64kDa和40kDa均形成摩尔比为约1：1的复合物以利用TIMP1/TIMP2抑制。因为结合牙龈基质和生物膜，所以64kDa和40kDa在如龈沟液(GCF)和种植体周围炎龈沟液(PISF)或溶解在唾液或漱口水中的GCF的样品中不大可能得到。但是，如24kDa和其它小的MMP-8片段的“游离的”未结合片段可以以更高的或高浓度得到，这表明并反映了MMP-8的早期活化过程的阶段。

[0062] 在阶段III中，如果85kDA继续活化成64kDa产生了过量64kDa，这些将被自溶成40kDa片段(其将支持活化并使情况更加糟糕)以及其它片段，包括小的MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物。在样品中会得到更小的片段，即可能所有的其它片段5kDa至
35kDa，这表明、反映或表示快速软和硬组织分解的高风险阶段。

[0063] 对于诊断/生物标记信息，这则意指当“结合的”或“抑制的”64kDa的自然平衡失去或已经失去平衡时，体内自溶形成的这些更小的片段只在临床环境中表现出高浓度并且过量的64kDa可用于自溶或进一步片段化，这表示疾病形成或进展的风险增加。

[0064] 本发明的实施例1提供了一种MMP-8活化产物，优选为MMP-8中间部分活化产物，其特征在于：所述MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物包括MMP-8的活化片段，并且大小为20kDa-35kDa之间，优选为约20kDa、25kDa、30kDa或35kDa。

[0065] 实施例2提供了根据实施例1的MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物，其中所述活化产物和所述活化产物的大小对应于通过使用APMA活化天然MMP-8而获得的活化产物。

[0066] 实施例3提供了根据实施例1的MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物，其中所述活化产物和所述活化产物的大小对应于通过蛋白水解去除或通过利用次氯酸钠(NaOCl)或活性氧类氧化活化的化学修饰而获得的活化产物。

[0067] 实施例4提供了根据实施例1至3中任一个的MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物，其中所述活化产物包括作为MMP-8的中间部分区域(非C-末端或N-末端)的序列SEQ ID NO:1。

[0068] 实施例5提供了根据实施例1至4的MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物，其中所述活化产物包括作为MMP-8的中间部分区域(非C-末端或N-末端)的序列SEQ ID NO:2。

[0069] 本发明的进一步实施例提供了一种确定样品中的MMP-8活化的方法，其包括：

[0070] A.提供来自受试者的生物样品；

[0071] B.检测生物样品中一个或多个MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的存在，所述一个或者多个MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物包括一个或多个MMP-8的活化片段，并且大小为5kDa-35kDa之间，优选为10kDa-30kDa，更优选为约10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa或35kDa；以及

[0072] C.可选地将样品中MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的存在与活化MMP-8的存在相关联；和/或

[0073] D.可选地将样品中MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的存在与样品中其他更大部分活性MMP-8的存在相关联；

[0074] 其中生物样品中一个或多个MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的存在表明和/或确定和/或预示样品中活性MMP-8的存在，并且在测定中增强了活性MMP-8的分析检测和/或其预测力。

[0075] 一个或者多个MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的存在通常通过使用用于检测生物样品中的MMP-8活化产物的配体系统来确定。优选地，该配体系统包括：一个或多个抗体、抗体对和/或抗体片段，以及其中该测定是一种定量、半定量或者定性的免疫分析，例如蛋白质印迹、IFMA、EIA、ELISA、侧向层析、Dip-stick测定、表面等离子体共振测定、电化学测定或任何其它已知的配体结合测定系统。根据本发明的不同方面来使用的抗体可以是单克隆的和/或多克隆的，可选地为重组体。

[0076] 根据本发明的另一方面，一个或多个MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的存在通常通过使用生物样品中MMP-8活化产物的直接蛋白检测技术来确定。

[0077] 根据本发明的一个实施例，所述方法用于诊断疾病或疾病进展的倾向或风险，其包括：

[0078] I.确定获自受试者的生物样品中MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的存在；

[0079] II.将在步骤I中所获得的结果与参考样品进行比较，从而诊断出疾病或疾病进展的倾向或风险，其中

[0080] a)参考样品来源于目前已知具有正常水平的MMP-8的受试者或患者组，生物样品和参考样品的相似的结果表示：受试者目前不具有或不易患疾病，或者不具有或不易处于疾病发生或进展的风险；以及因而与参考样品相比，在生物样品中的MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的水平升高表示：受试者目前具有疾病或易患疾病，或者易具有疾病发生或进展的风险增加；或者

[0081] b)参考样品来源于目前已知具有疾病或易患疾病的受试者或患者组，生物样品和参考样品的相似的结果表示：受试者具有或易患疾病，或者具有或易具有疾病发生或进展的风险。

[0082] 根据本发明的不同实施例，样品通常从以下获得：龈沟液、种植体周围龈沟液、口腔斑块、牙菌斑、漱口液、漱口水、唾液、根管液、伤口渗出液、脓水(PUS)、口腔生物膜、组织活检、口腔液交换、口腔病变血液，或者可替代地，样品不来自于口腔，而是来自于羊水、血清、血浆、阴道冲洗液、鼻腔冲洗液、鼻窦、内耳、窦、尿液、滑膜液、脑脊液、排泄物、交换液、泪液、灌洗液(肺)、痰液、组织活检、伤口渗出液和/或汗液。

[0083] 在本发明的优选实施例中，疾病是以下中的一种或者多种：牙周炎症、牙周组织缺损(退化)、牙龈炎、牙周炎、种植体周围炎、牙齿缺损、牙种植体的缓解、牙槽骨缺损、粘膜炎、粘膜改变、根尖周炎症、根管炎症、龋齿、垂直颌骨断裂、正畸牙移动、过敏性炎症反应和/或口腔细菌引起的菌血症。

[0084] 根据本发明的进一步实施例，一个或多个MMP-8活化产物或者MMP-8中间部分活化产物的存在表明或预示：牙周病例如慢性或急性牙周炎或种植体周围炎，其中这些口腔疾病进一步表明或增强系统性疾病或病症或是针对系统性疾病或病症的已知风险因素，这些系统性疾病或病症例如是I型糖尿病、II型糖尿病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、代谢综合征、肥胖症、风湿性疾病、关节炎/关节炎疾病、骨质疏松症、骨科疾病、自身免疫性疾病、组织移植疾病、关节炎、端假体感染或缓解、心血管疾病例如中风、心肌梗塞、动脉硬化，妊娠相关风险例如但不限于早产、低出生体重、生殖风险例如勃起功能障碍、精子量减少和精子细胞的较低迁移率。

[0085] 根据本发明的进一步实施例，所述疾病是：

[0086] a)妇科疾病，例如羊膜内炎症、母体炎症、新生儿疾病、早产、低出生体重和羊膜病变；

[0087] b)癌症疾病，例如恶性肿瘤，例如乳腺癌和白血病；

[0088] c)关节炎/风湿性疾病，例如风湿性关节炎和关节病；

[0089] d)糖尿病，包括各种形式的糖尿病、肾脏疾病、肾病和非愈合性糖尿病伤口；

[0090] e)眼部疾病(例如来自泪液)，例如圆锥角膜和角膜的透明性边缘变性；

[0091] f)耳鼻喉疾病(例如，来自内耳、鼻窦)；

[0092] g)感染和炎症，例如莱姆疏螺旋体病、脓毒病、系统性炎症反应综合征(SIRS)、HIV、幽门杆菌感染、系统性炎症、系统性轻度炎症；肺部感染和炎症，例如支气管炎、支气管炎扩张、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、小儿感染/炎症、神经系统感染；炎症和疾病，例如脑膜炎(例如，来自脑脊液)和克罗恩病；

[0093] h)心血管疾病，例如血管疾病、动脉粥样硬化、例如动脉内斑块的炎症、栓塞和中风；

[0094] i)伤口(例如，来自伤口渗出液)，例如致命伤口、慢性伤口、非愈合性伤口和烧伤皮肤；

[0095] j)肠道疾病(来自排泄物检测)；

[0096] k)在创伤或意外之后的疾病；和/或

[0097] l)代谢综合征和肥胖症。

[0098] 本发明的各个实施例也提供用于系统和计算机可读介质，用于使计算机系统基于确定MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物或序列信息来执行用于确定个体是否具有特定疾病或病症、或易患有(上文所限定的)特定疾病或病症的方法。

[0099] 具体地，本发明进一步涉及一种用于分析生物样品的系统，其包括：

[0100] a)确定模块，所述确定模块配置为接收生物样品，并且用于确定：

[0101] MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物，其中所述MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物包括MMP-8的活化片段，并且大小为5kDa-35kDa之间；和/或

[0102] b)序列信息，其中所述序列信息包括SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2；

[0103] c)存储装置，所述存储装置配置为存储来自确定模块的序列信息；

[0104] d)比较模块，所述比较模块适用于将存储在所述存储装置中的序列信息与参考数据进行比较，并且适用于提供比较结果，其中所述比较结果来源于参考样品，所述参考样品来源于：

[0105] 目前已知具有正常水平的MMP-8的受试者或患者组，因而生物样品和参考样品的相似结果表示：受试者目前不具有或不易患疾病，或者不具有或不易具有疾病发生或进展的风险；和/或

[0106] 已知具有疾病或易患疾病的受试者或患者组，因而生物样品和参考样品的相似结果表示：受试者具有或易患疾病，或者具有或易具有疾病发生或进展的风险；以及[0107] e)显示模块，所述显示模块用于向用户显示部分基于比较结果的内容，其中内容是表示以下的信号：与表示受试者目前具有疾病或易患疾病、或者易具有疾病发生或进展的风险增加的参考样品相比，生物样品中的MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的存在或升高的水平。

[0108] 根据本发明的另一实施例，本发明可以进一步利用其上记录有计算机可读指令的计算机可读介质，来限定包括比较模块和显示模块的软件模块，以在计算机上实施方法，所述方法包括：

[0109] a)将存储在存储装置中的数据模块与参考数据进行比较，以提供比较结果，其中所述比较结果，即与参考样品相比生物样品中的MMP-8活化产物或MMP-8中间部分活化产物的存在或者升高的水平，表示受试者目前具有疾病或易患疾病，或者易具有疾病发生或进展的风险增加；以及

[0110] b)向用户显示部分基于比较结果的内容，其中

[0111] 所述内容是表示以下的信号：具有疾病或易患疾病，或者易具有疾病发生或进展的风险增加。

[0112] 实例

[0113] 给出以下实例仅仅用于阐明本发明的各个实施例的目的，并且它们无意以任何方式限制本发明。本领域技术人员将容易认识到，本发明由所附权利要求书所限定，适用于实现各种目标并且获得上文提及的各种结果和优点。

[0114] MMP-8的免疫荧光测定

[0115] MMP-8浓度通过时间分辨免疫荧光测定法(IFMA)确定。单克隆MMP-8-片段特异性抗体1491-E6-F7和1492-B3-C11(芬兰考尼埃宁，MEDIX Biochemica公司)分别用作捕捉抗体和示踪抗体。示踪抗体用铕螯合物标记( 等人，1984年)。测定缓冲液含有20mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.5M NaCl、5mM CaCl2、50μM ZnCl2，0.5％BSA、0.05％叠氮化钠和20mg/l二乙烯三胺五乙酸(DTPA)。样品在测定缓冲液中稀释，并温育一小时，然后与示踪抗体温育一小时。加入增强液，5分钟后，使用1234Delfia研究荧光仪(芬兰图尔库，Wallac公司)测定荧光。单克隆抗体对MMP-8的特异性对应于多克隆MMP-8的特异性。

[0116] 蛋白免疫印迹

[0117] 根据由制造商(英国阿默舍姆，GE Healthcare公司)推荐的方案，MMP-8的分子形式由改性的ECL蛋白质印迹试剂盒检测。所指示的重组人MMP-8和指示的体液/分泌物和血清样品与Laemmli的缓冲液混合，不加任何还原剂，加热5分钟，然后用11％十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质分离。电泳后，将蛋白质电转移到硝酸纤维素膜(德国达塞尔，Whatman公司，Protran)上。非特异性结合用TBST缓冲液(10mM Tris-HCl，pH值7.5，含22mM NaCl和0.05％Triton-X)中的5％乳粉(芬兰赫尔辛基维利奥有限公司)阻断1小时。然后将膜与第一抗体1491-E6-F7(芬兰考尼埃宁MEDIX Biochemica公司)温育过夜，随后与辣根过氧化物酶联第二抗体(英国白金汉郡，GE Healthcare公司)温育1小时。将膜在每个步骤之间用TBST洗涤4次持续15分钟。蛋白质用增强的化学发光(ECL)系统(GE Healthcare公司)可视化。

[0118] 密度计分析

[0119] 使用GS-700成像密度仪扫描仪(美国加利福尼亚赫拉克勒斯，Bio-Rad公司)和Bio-Rad Quantity One程序，通过校正背景值，对不同分子量形式的MMP-8的强度进行扫描和分析。

[0120] 测序

[0121] 蛋白质鉴定和蛋白质组数据分析根据Turunen等人(2012年)描述的方法进行。

[0122] 匹配MDmAb免疫染色的离体凝胶带用乙腈(ACN)洗涤和脱水。蛋白质用20mM二硫苏糖醇还原并于56℃下温育30分钟，然后在黑暗中室温下与55mM碘乙酰胺-0.1M 碳酸氢铵(NH4HCO3)进行烷化反应15分钟。用0.1M NH4HCO3洗涤和用ACN脱水后，凝胶片在0.1M NH4HCO3在10-15μl测序级改性胰蛋白酶(美国Promega公司)中再水合，直至0.01μg/μl胰蛋白酶的终浓度，并在37℃下温育过夜以消化。胰蛋白酶肽通过依次在室温下在25mM NH4HCO3中、然后在5％甲酸中温育两次，每次15分钟，从凝胶片中洗脱。所得的胰蛋白酶消化肽使用Zip TipμC-18反相柱(美国Millipore公司)脱盐并用50％ACN-0.1％三氟乙酸(TFA)直接洗脱到MALDI靶盘。加入33％ACN-0.1％TFA中的α氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)的饱和基质溶液(美国Sigma公司)。

[0123] 用配备了SmartBeamTM激光(355nm)、以正离子/反射模式操作的Autoflex III(德国不来梅，Bruker Daltonics公司)进行MALDI-TOF分析。通常情况下，质谱由2000次激光照射的累积光谱获得，而MS/MS光谱则要高达10000次。使用肽校准基准(德国莱比锡，Bruker Daltonics公司)对分子的分配进行外部校准。使用胰蛋白酶自溶肽质量来检查或更正校准。这些自溶肽和与角蛋白衍生肽，当存在时，会在搜索提交前去除。蛋白质的鉴定是通过组合文件(源自同一点的PMF以及少量Lift谱(MSMS))，并比对SwissProtS数据库搜索进行。“其它细菌”使用Matrix Science公司的Mascot(英国Matrix Science公司)在分类学领域(超过42100序列)中进行选择。使用FlexAnalysisTM v3.0和BiotoolsTM v3.1软件(Bruker Daltonics公司)来分配分子同位素质量给MS谱的峰值，并分别作为质量列表数据传输和在Mascot服务器中数据库之间的搜索引擎界面。为搜索分别设定以下参数：为合并MS和MS/MS搜索的0.1Da前体耐受性和0.5或1Da MS/MS片段耐受性，考虑固定和可变的改性(分别为脲基甲基化半胱氨酸和氧化蛋氨酸)，允许一个胰蛋白酶错过的裂解。通过比较所计算的和观察到的分子量，以及MS/MS质谱的质量和它们匹配于所识别肽的氨基酸序列，进一步评估蛋白质鉴定。

[0124] 实例1

[0125] 材料和方法

[0126] 随机抽取192位牙科公共卫生诊所患者进入该代表性研究。该研究实验报告已由Leppilahti JM等人(2011年)详细提出。简明地说，口腔检查包括由Florida探针的腔洞探诊深度(PPD)的测量值以及由两名校准的普通牙医做出的出血探测(BOP)的测量值。通过问卷调查收集所有患者的背景特征，并记录其口腔漱液样品。所有患者均提供了知情同意书，研究实验报告已由赫尔辛基大学牙科研究所和赫尔辛基大学中心医院的伦理委员会接受。

[0127] 基于研究患者的牙周发炎负担水平，通过结合牙周炎性负担指数(Lindy O等人，2008年)和BOP％(Leppilahti JM等人，2011年)，将研究患者分类为四组。形成的患者组为：
1)31例牙周健康受试者，无加深(≥4mm)牙周袋和BOP<10％(第1组)；2)17例患者，BOP≥
10％，但无加深牙周袋，被认为有轻度牙周发炎负担(第2组)；3)97例患者，PIBIxBOP≤100(中度牙周发炎负担水平；第3组)；以及4)47例患者，PIBIxBOP>100(重度牙周发炎水平；第4组)。

[0128] 口腔漱液样品

[0129] 通过一次性塑料移液管将1ml自来水放入患者口中，漱口1min后收集漱液到管中。将样品立即冷冻用于进一步的分析(Leppilahti JM等人，2011年)。

[0130] MMP-8分析

[0131] 口腔漱液样品解冻后，如Hanemaaijer R等人(1997年)描述的通过时间分辨免疫荧光测定法(IFMA)，分析MMP-8水平。简而言之，单克隆MMP-8-片段特异性抗体1491-E6-F7和1492-B3-C11分别用作捕捉抗体和示踪抗体。示踪抗体用铕螯合物标记( 等人，1984年，Europium as a label in time-resolved immunofluorometric assays，Anal Biochem 137∶335-343)。测定缓冲液含有20mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.5M NaCl、5mM CaCl2、
50μM ZnCl2，0.5％牛血清白蛋白、0.05％叠氮化钠和20mg/升DTPA。样品在测定缓冲液中稀释，并温育1小时，然后与示踪抗体温育1小时。加入增强液，5分钟后，用1234Delfia研究荧光仪(芬兰图尔库，Wallac公司)测定荧光。

[0132] 口腔漱液样品的MMP-8水平也通过上述IEMA法进行分析。另外，利用IFMA法的示踪抗体(1492-B3-C11)，通过上述免疫印迹分析样品，通过扫描图像分析，鉴定MMP-8不同的分子形式(21kDa、25kDa、35kDa、45kDa、55kDa和60-70kDa)。

[0133] 数据分析

[0134] 从扫描图像分析不同MMP-8分子形式的患病率及MMP-8占总数的比例，并对所有患者进行计算。通过非参数检验(用于成对比较的Mann-Whitney检验、用于多个组的Kruskall-Walllis检验、以及用于有序替代物趋势的Joncheere-Terpstra检验)在不同的研究组之间和在吸烟者与非吸烟者之间比较MMP-8IFMA和IEMA水平、每种MMP-8分子形式的绝对量和它们的比例以及组合。通过卡方检验分析不同的MMP-8kDa种类在不同研究组中的患病率/表达。

[0135] 以下逻辑回归作为未调节和多元调节的性质运行：

[0136] 1)IFMA和IEMA水平与不同MMP-8kDa种类的患病率(因变量)的关联；在多元调节逻辑回归分析中，齿数、BOP％和4-5mm和≥6mm的牙周袋数作为连续变量，而吸烟作为二分(是/否)变量，

[0137] 2)MMP-8kDa种类的患病率、比例和绝对扫描单位及其组合，与高IFMA和IEMA水平(≥中位数IFMA或IEMA，考虑到第4组的牙齿水平n具有重度牙周发炎负担)之间的关联；在多元调节模型中，BOP％和4-5mm和≥6mm的牙周袋数作为连续变量，而吸烟作为二分(是/否)变量，

[0138] 3)MMP-8kDa种类与重度牙周发炎负担水平(第4组)之间的关联；在多调节模型中，BOP％和4-5mm和≥6mm的牙周袋数作为连续变量，而吸烟作为二分(是/否)变量，4)MMP-8kDa种类与吸烟之间的关联；在多元调节模型中，齿数、BOP和4-5mm和≥6mm的牙周袋数作为连续变量。

[0139] 使用向前逐步逻辑回归分析来完成用于识别患有重度牙周发炎负担患者的模型。IFMA和IEMA水平(考虑到牙齿n)、BOP％和吸烟状况(是/否)，连同21kDa、25kDa和35kDa MMP-8种类的患病率、绝对量和比例，逐个以及组合地进行检验。

[0140] 进行受试者工作特征(ROC)分析，以评估研究组中MMP-8IFMA和IEMA水平的诊断敏感性和特异性以及25+35kDa种类的患病率。

[0141] P值<0.05被认为是统计意义上显著的。统计学分析由IBM SPSS统计版本20完成。

[0142] 结果

[0143] 表1显示基于牙周发炎负担的四个研究组的特征。在第1组和第2组，只有4位(12.9％)和3位(17.6％)吸烟者，他们都吸烟≤10支/天。在第3组和第4组，吸烟者就比较多[分别为20位(20.6％)和23位(48.9％)]，其中第3组有10位(50％)患者、第4组有17位(73.9％)患者吸烟>10支/天。男性患者的数量随着牙周发炎负担(p＝0.011)的增加而增加。

[0144] 表1研究组的特征(1-4组)

[0145]

[0146]

[0147] *卡方检验**ANOVA§Kruskall-Wallis检验

[0148] MMP-8kDa种类的患病率、绝对量和比例

[0149] 表3中给出了所有研究组的不同MMP-8kDa种类的患病率和绝对量(扫描单元)的中位数(IQR)水平。在所有研究组之间显示出显著差异的那些MMP-8分子形式，即25kDa和35kDa种类，其患病率和绝对量在表2中进一步呈现，吸烟者和非吸烟者分开计算。

[0150] 在第4组中，25、35和25+35kDa种类的患病率和绝对量在吸烟者中显著较高。25kDa种类的患病率在所有组之间都差异显著(p＝0.025)，而25+35kDa的患病率在第4组的吸烟者(p＝0.011)和非吸烟者(p＝0.046)中都较高。在非吸烟者中，35kDa种类的总量在所有研究组之间差异显著。当合并第1-3组与第4组之间进行差异对比分析时，第4组吸烟者的25、35和25+35kDa种类患病率分别显著较高(p值分别为0.011、0.038和0.005)。

[0151] 表2研究第1至4组中吸烟者和非吸烟者的25和35kDa MMP-8种类的患病率和绝对量。由Pearson卡方计的患病率P值；由Kruskall-Wallis检验(几个独立组)，以及由Mann-Whitney检验(两个独立的组)计的绝对量

[0152]

[0153] 表3第1-4组中MMP-8kDa分子形式的患病率、绝对扫描单位和比例。代表第1-4组显著差异的数字以粗体显示[35kDa(p＝0.031)、25kDa(p＝0.006)以及25+35kDa(p＝0.002)种类(卡方检验)的患病率；35kDa种类(p＝0.042)(Kruskall-Wallis检验)的绝对量]。

[0154]

[0155] 表4采用IFMA和IEMA对所有研究组进行分析所得的MMP-8中位数(IQR)，考虑齿数以及吸烟状况。NS表示非吸烟者，S表示吸烟者。

[0156]

[0157] *第1-4组的Kruskall-Wallis检验

[0158] **组合后的第1-3组对第4组之间的Mann-Whitney检验

[0159] §第1-4组的Joncheere-Terpstra检验

[0160] MMP-8IFMA和IEMA水平

[0161] IFMA和IEMA分析结果之间的相关性非常好(显著性水平为p<0.01时，Pearson相关系数为0.954)。显著性水平为p<0.01时，当前和先前的IFMA分析结果(Leppilahti等人，2011年)之间的Pearson相关系数为0.627。

[0162] 表4表示采用IFMA和IEMA对所有研究组进行分析所得的MMP-8水平，考虑齿数以及吸烟状况。当对有序替代(p＝0.035)进行测试时，第1-4组具有MMP-8水平增加的显著趋势，而对于IEMA，则具有达到显著性的趋势(p＝0.058)。当考虑齿数时，第1-4组的IFMA和IEMA的趋势都非常显著(分别为p＝0.016和p＝0.025)。当第4组的水平与第1-3组的水平进行比较时，所有比较值均具有显著性结果，p值为0.035、0.033、0.013、0.011。第1-3组的水平相近(p值分别为0.643、0.822、0.647和0.816)。

[0163] 当考虑吸烟时，其趋势对非吸烟者更强：对于IFMA，p＝0.020，对于IEMA，p＝0.038，而且，当还考虑齿数时，对于IFMA，p＝0.010，对于IEMA，p＝0.028(表4、图1)。未发现吸烟者有明显趋势。当第4组的吸烟者和非吸烟者水平在考虑齿数的情况下与第1-3组的吸烟者和非吸烟者水平进行比较时，非吸烟的第4组患者的IFMA和IEMA水平均显著高于其它研究组(p值分别为0.009和0.013)。然而，当第3组和第4组的研究对象被分为非吸烟者、患者吸烟≤10支/天或>10支/天时，虽然未发现统计显著性，但>10支/天的吸烟者要比≤10支/天的吸烟患者分布更广，且尤其类似于第4组的非吸烟者(图1)。

[0164] 与不同MMP-8kDa种类相关的IFMA和IEMA水平

[0165] 在21kDa MMP-8种类的阳性患者(p值分别为0.011和0.003；对于非吸烟者，p值分别为0.005和0.002；对于吸烟者，差异不显著)中，IFMA和IEMA水平显著较高。然而，吸烟对于21kDa种类的患病率并无显著影响。

[0166] 在多元调节逻辑回归分析中，IFMA和IEMA水平与21kDa(对于IFMA，OR＝1，95％CI 1-1.001，p＝0.008；对于IEMA，OR＝1，95％CI 1-1.001，p＝0.004)、以及21与25kDa的组合(对于IFMA，OR＝1，95％CI 1-1.001，p＝0.002；对于IEMA，OR＝1，95％CI 1-1.001，p＝
0.001)、以及与25和35kDa种类合起来(21-35kDa)(对于IFMA，OR＝1，95％CI 1-1.001，p＝
0.002；对于IEMA，OR＝1，95％CI 1-1.001，p＝0.001)的患病率相关联，但与单独的25和
35kDa种类的患病率无关。同样，在未调节的逻辑回归分析中，21+45kDa种类的组合与IFMA和IEMA水平相关联(对于OR＝1，95％CI 1-1.001，p＝0.028)。对于多元调节逻辑回归分析中的其它协变量，当IFMA或IEMA均为协变量时，吸烟与25、35、25+35、21+35kDa种类显著相关联，BOP与45、21+45、21-45、25+45和35+45kDa显著相关联。

[0167] 进一步，对MMP-8kDa种类及其组合的患病率、占总数的比例、以及绝对扫描单位与高IFMA水平(≥第4组的中位数水平，考虑齿数)的相关性进行分析。21kDa(p＝0.011)、25kDa(p＝0.050)、21+25kDa(p＝0.011)、21+35kDa(p＝0.006)、21+45kDa(p＝0.012)、21-
35kDa(p＝0.009)和21-45kDa(p＝0.010)的绝对量(对于多元调节回归分析，括号内的p值)，以及在未调节和多元调节回归分析中与高IFMA水平(图2A)相关联的MMP-8总量(p＝
0.010)。

[0168] 对于高IEMA水平，进行类似的测试；在多元调节回归分析中，21kDa(p＝0.013)、25kDa(p＝0.044)、21+25kDa(p＝0.011)、21+35kDa(p＝0.006)、21+45kDa(p＝0.014)、21-
35kDa(p＝0.007)、和21-45kDa(p＝0.008)的总量以及MMP-8(p＝0.007)的总量均显著。

[0169] 相对于21kDa种类的其它MMP-8分子形式的患病率

[0170] 对于21kDa种类的阳性和阴性受试者，对25和35kDa种类的患病率进行分析。当对所有的研究受试者一起进行分析时，21kDa阳性患者(89.6％)比阴性患者(56.5％)中的35kDa种类患病率显著更高(p<0.001)。当21kDa种类为阳性/阴性(p<0.001)时，发现第3组的25kDa类型有显著差异，为88.3％/44.3％；在第4组中，当21kDa种类为阳性/阴性时，
35kDa种类的值分别为94.7％/71.4％(p＝0.046)，25kDa种类的值分别为100％/71.4％(p＝0.011)。

[0171] IFMA、IEMA和MMP-8分子形式与重度牙周发炎负担的关联性

[0172] 在未调节的分析中，25kDa(OR 2.566，95％CI 1.114-5.909，p＝0.027)、25+35kDa(OR 2.586，95％CI 1.221-5.477，p＝0.013)、以及21-45kDa(OR 3.10，95％CI 1.121-8.568，p＝0.029)种类的患病率与重度牙周发炎负担显著相关联(第4组)。然而，在多元调节分析中，该关联性并不显著(25+35kDa种类组合达到显著性，p＝0.053)。

[0173] 在未调节的分析中，IFMA和IEMA水平均与第4组的重度牙周发炎负担相关联；对于IFMA，OR 1，95％CI 1.0-1.001，p＝0.029，对于IEMA，OR 1，95％CI 1.0-1.001，p＝0.046。

[0174] 相反，协变量BOP％和吸烟与第4组的重度牙周发炎负担相关联，对于协变量BOP％，p值<0.001，在所有分析中，对于吸烟，p值从<0.001到0.002。

[0175] IFMA和MMP-8kDa与吸烟的相关性

[0176] 在未调节和调节的逻辑回归分析中，35和25+35kDa MMP-8种类的患病率与吸烟显著相关联，在多元调节模式下，p值分别为0.033和0.008。在未调节的分析中，45kDa种类并不显著，但在调节的模型中，其显示为保护状态(p＝0.033)(图3B)。

[0177] 另外，35kDa(p<0.001)的比例、以及25+35(p<0.001)、25-45(0.003)、35+45(0.010)、21-45(p＝0.012)和21+35(p＝0.002)kDa种类的组合的比例与吸烟相关联(图3C)(每个提到的MMP-8种类后面括号内的多元调节模型的各自p值)。任何MMP-8种类的绝对量与吸烟并无显著关联性。在所有多元调节回归分析中，4-5mm牙周袋的数量与吸烟显著相关联。

[0178] BOP％与不同MMP-8种类之间的关联性

[0179] 在所有研究受试者中，BOP≥25％的患者比BOP<25％的患者的45kDa种类的患病率更高(p＝0.003，卡方检验)。对于45kDa类型(p＝0.002)的绝对量，以及在非吸烟者当中(p＝0.001)，差异在统计上显著。然而，探测过程出血患病率≥25％的情况在第1组中为零，在第2组和第3组中均为9.1％，在第4组中为81.8％。因此，多数BOP≥25％的病例主要属于第4组。在第4组，BOP≥25％的患者比BOP<25％的患者在45kDa种类的绝对量、患病率和比例方面均显著更高(p值分别为0.009、0.022、0.037)。未发现第4组的吸烟者和非吸烟者之间有显著差异。

[0180] 在未调节的逻辑回归分析中，45kDa类型MMP-8的患病率与BOP％≥25％相关联，其中OR 3.66，95％CI 1.523-8.797，p＝0.004。在多元调节逻辑回归分析中，45kDa类型的患病率与BOB≥25％相关联，其中OR 3.36，95％CI 1.309-8.634，p＝0.012。其它协变量并不显著。无其它MMP-8分子形式与BOP≥25％相关联。

[0181] 建模和受试者工作特征分析

[0182] 通过向前逐步逻辑回归分析，执行从口腔漱液样品识别具有重度牙周发炎负担的患者的模型(第4组)。与IFMA和IEMA(考虑齿数)一起，对BOP％、吸烟状况(是/否)患病率、21kDa、25kDa和35kDa种类的绝对量和比例进行逐个测试和组合测试。最佳模型是BOP％、吸烟状况与25+35kDa类型的组合，p值分别为<0.001、0.006和0.044。

[0183] 进行受试者工作特征(ROC)分析，以评估MMP-8IFMA和IEMA的诊断灵敏度和特异性、以及研究组中25+35kDa种类的患病率。第4组的IFMA、IEMA和25+35kDa种类为状态变量(图4)，差异显著。对于第4组中的IFMA，ROC曲线下方的面积为0.602，95％的置信区间(CI)为0.507-0.698，p值为0.035；对于IEMA，ROC曲线下方的面积为0.604，95％的置信区间(CI)为0.507-0.698，p值为0.033；对于25+35kDa的患病率，ROC曲线下方的面积为0.604，95％的置信区间(CI)为0.514-0.693，p值为0.033；对于BOP％，ROC曲线下方的面积为0.880，95％的置信区间(CI)为0.832-0.928，p值为0.025。ROC分析显示，25+35kDa MMP-8活化产物，以及IFMA和IEMA分析，鉴定出牙周炎患者与不执行此分析的55-70kDa MMP-8种类明显不同。

[0184] 实例2

[0185] 根据Kiili M等人(2002)进行SDS-PAGE(10％)分析。

[0186] 图4中示出了rhMMP-8的量以及温育时间。图4A示出了有机汞APMA的效应，以及图4B示出了具氧化的NaOCl活化剂对重组人MMP-8的效应(德国Proteaimmun公司)。通过活化，APMA和NaOCl均诱发低分子量MMP-8种类的产生。箭头指出了20-30kDa活化片段的取决于时间的形成。

[0187] 采用上述蛋白免疫印迹法进行蛋白免疫印迹分析。图4C示出了通过APMA和NaOCl以及不同的人体体液和血清，采用活化的rhMMP-8(Proteaimmun、Merck和Invent公司MMP-8抗原)1491-E6-F7-单克隆MMP-8抗体进行的蛋白免疫印迹分析。

[0188] 人牙周炎龈沟液(GCF)；人种植体周围炎龈沟液(PISF)；人正畸处理牙齿的龈沟液(GCF)；人牙周炎唾液；人牙周炎漱口液；人羊水的感染样本；人脑膜炎脑脊液和人败血症血清用于条带10至条带17中，如下所示。

[0189] 条带1：Proteaimmun公司的rMMP-8；

[0190] 条带2：同条带1，外加APMA；

[0191] 条带3：同条带1，外加NaOCl；

[0192] 条带4：Merck公司的rh MMP-8；

[0193] 条带5：同条带4，外加APMA；

[0194] 条带6：同条带4，外加NaOCl；

[0195] 条带7：Invent公司的MMP-8抗原；

[0196] 条带8：同条带7，外加APMA；

[0197] 条带9：同条带7，外加NaOCl；

[0198] 条带10：人牙周炎龈沟液(GCF)；

[0199] 条带11：人种植体周围炎龈沟液(PISF)；

[0200] 条带12：人正畸处理牙齿的龈沟液(GCF)；

[0201] 条带13：人牙周炎唾液；

[0202] 条带14：人牙周炎漱口液；

[0203] 条带15：感染的人羊水；

[0204] 条带16：人脑膜炎脑脊液；

[0205] 条带17：人败血症血清。

[0206] 箭头所示为MMP-8活化的情况下，所形成的常见20-30kDa片段。

[0207] 实例3

[0208] 采用未感染的(#16)和感染的(#12、#13和#19)人羊水样本，采用上述蛋白免疫印迹方法进行蛋白免疫印迹分析。下面示出了对每一条带进行分析所用的不同样本和使用IFMA评估的MMP-8不同浓度。所用凝胶为11％。采用三种不同的抗体，单克隆MMP-8特异性抗体1491-E6-F7(7.)和1492-B3-C11(4.)(芬兰Kauniainen，Medix Biochemica公司)和多克隆抗体(3.)(Lauhio A等人，1994)进行测试。在其它方面，对于所用的所有抗体，各条带均相同，但对于多克隆抗体MMP-8，条带8和10中没有样品。图5中示出了结果。MMP-8片段25kDa+35kDa的水平与使用IFMA评估的MMP-8水平相关联。

[0209] 条带1.标准

[0210] 条带2.#16，210μg/l MMP-8(14μl x 15μg/l)/孔

[0211] 条带3.#12，210μg/l MMP-8

[0212] 条带4.#12，2000μg/l MMP-8

[0213] 条带5.#12，40000μg/l MMP-8

[0214] 条带6.#12，76160μg/l MMP-8(14μl x 5440μg/l)/孔

[0215] 条带7.#13，210μg/l MMP-8

[0216] 条带8.#13，2000μg/l MMP-8

[0217] 条带9.#13，40000μg/l MMP-8

[0218] 条带10.#13，186088μg/l MMP-8(14μl x 13292μg/l)/孔

[0219] 条带11.#19，210μg/l MMP-8

[0220] 条带12.#19，2000μg/l MMP-8

[0221] 条带13.#19，40000μg/l MMP-8

[0222] 条带14.#19，127666μg/l MMP-8(14μl x 9119μg/l)/孔

[0223] 实例4

[0224] 根据Kiili M等人(2002)进行SDS-PAGE(10％)分析。

[0225] 通过APMA活化重组人MMP-8(Proteaimmun公司)，并在下文指出rhMMP-8的量和温育时间。用于测序的条带如图6所示。

[0226] 条带1.1.5μl分子量标准(Bio-Rad)

[0227] 条带2.2μl分子量标准(Bio-Rad)

[0228] 条带3.1μl MMP-8(0.15μg/μl)+3μl TNC缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.8：0.2M NaCl：0,75mM CaCl2)

[0229] 条带4.空

[0230] 条带5.1μl MMP-8(0.15μg/μl)+4μl 2mM APMA+3μl TNC缓冲液，温育时间为2小时(37℃)

[0231] 条带6.空

[0232] 条带7.1μl MMP-8(0.15μg/μl)+4μl 2mM APMA+3μl TNC缓冲液，温育时间为5.5小时(37℃)

[0233] 根据上述测序法进行测序。对图6的凝胶条带1至8进行测序。各条带的大小为：

[0234] 条带2＝32kDa

[0235] 条带3＝25kDa

[0236] 条带4＝21kDa

[0237] 条带5＝25kDa

[0238] 条带6＝21kDa

[0239] 条带7＝12kDa

[0240] 条带8＝5kDa

[0241] 条带3、4、5和8包括SEQ ID NO:1，并且条带2、3、4、5和6包括SEQ ID NO:2。条带7识别出MMP-8的其它片段。在带1中未识别出MMP-8片段。带3、4和5的MMP-8活化产物包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2两者。SEQ ID NO:1的氨基酸119-132和SEQ ID NO:2的氨基酸151-165来自整个MMP-8序列的中间区域结构。

[0242] 实例5

[0243] 对提取自人胎盘的纯化人aMMP-8进行SDS PAGE分析和蛋白质印迹分析，使用实例2和实例3中的单克隆抗体以示出片段。

[0244] 抗-hMMP-8-Ab(小鼠抗-hMMP8MoAB 1491-E6-F7(Medix Biochemica公司))结合至用于亲和层析柱(30ml琼脂糖凝胶柱(Bio Rad公司)的NHS-琼脂糖凝胶(NHS-活化琼脂糖凝胶4倍快速流动(GE Healthcare公司)。通过离心浓缩器( 涡轮15和 2(Sartorius公司))来进行胎盘原材料(人MMP-8-胎盘提取物(in.vent.Diagnostica公司))的浓缩。每次运行使用浓缩的生胎盘提取物10ml(凝胶电泳“Mini Protean 3cell”和绘图仪“Mini Trans-Blot cell”(Bio Rad))来进行亲和层析。通过柠檬酸缓冲液pH2.2来进行酸性洗脱。收集5ml的馏分。在离心浓缩器中合并和浓缩馏分。调节缓冲组合物(迷你型透析器MD 1000(Scienova公司))，以获得纯化人aMMP-8。进行SDS-PAGE(Pierce银染试剂盒(Thermo Scientific公司))并使用Protein-standards Precision Plus Protein Dual Xtra(BioRad公司))进行蛋白质印迹法(免疫印迹PVDF膜0.2μm，7x8.4cm(Bio Rad公司))。
对于SDS-PAGE和WB SDS-凝胶而言，其中利用了12％分离胶和4％收集胶。

[0245] 图7中示出了SDS-PAGE的结果，图8示出了SDS-凝胶印迹的结果。

[0246] SDS-Page银染胶显示在所有样品中的可比较的带，主要显示10kDa至15kDa的片段以及20kDa至35kDa的片段，连同到目前为止已知的35kDa以上的片段一起。圈出的蛋白质印迹较弱，然而，在原始的印迹上看得见。分子量标记的带“*”标记的75kDa和25kDa的条带为红色，并且在原始的印迹上清晰可见。免疫染色放大了10至15kDa，并且也在更高的浓缩样品中标记出20至35kDa片段。

[0247] 该结果符合并且证实了在实例2和实例3中示出的结果。

[0248] 参考文献

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MMP-8活化产物及其测定和用途

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