治疗神经障碍的组合物和方法
阅读：201发布：2021-05-19
专利汇可以提供治疗神经障碍的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 大体上提供用于 治疗 神经障碍、包括管理 疼痛 的载体、组合物和其使用方法。所述组合物和方法包括使用G蛋白偶联受体和配体 门 控离子通道来治疗包括疼痛、 癫痫 症和饱腹感障碍的神经病学适应症。所述组合物和方法进一步包括在所述神经 疾病 的治疗中使用合成配体激活所述G蛋白偶联受体和配体门控离子通道。，下面是治疗神经障碍的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种治疗神经疾病的方法，其包含向患有所述神经疾病的受试者施用生物惰性剂或药物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者异源性表达G蛋白偶联受体或配体门控离子通道LGIC。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者同源性表达G蛋白偶联受体或LGIC。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者异位表达G蛋白偶联受体或LGIC。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体是由设计者药物专门激活的设计者受体DREADD。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述DREADD是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物惰性剂是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,
4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述DREADD是hM4Di；其中所述生物惰性剂是氯氮平-N-氧化物；并且其中所述神经疾病不是癫痫症。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体或所述LGIC由所述生物惰性剂或所述药物激活。
10.根据权利要求2所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体或所述LGIC是开关受体。
11.根据权利要求2所述的方法，其进一步包含在所述施用之前，向所述受试者递送编码所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的核酸分子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸分子是在病毒载体中递送给所述受试者。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒AAV载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒HSV载体。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述AAV载体包含SEQ ID NO:1。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸分子是利用非病毒方法递送给所述受试者。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述非病毒方法是脂质体转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经疾病是疼痛。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经疾病是饱腹感障碍。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述饱腹感障碍是肥胖、神经性厌食症或神经性贪食症。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述神经疾病是阿尔茨海默氏病、帕金森病、创伤后应激障碍PTSD、胃食管逆流病GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、尿失禁、发作性睡病、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。
23.根据权利要求2所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体是Gi偶联或Gq偶联的。
24.根据权利要求2所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体或所述LGIC在可兴奋细胞中选择性表达。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述可兴奋细胞是神经元或肌细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述神经元是背根神经节或感觉神经元。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述施用包含口服、鞘内或局部施用。
28.根据权利要求11所述的方法，其中所述递送包含鞘内、神经节内、颅内、皮下、脊柱内、小脑延髓池或神经内递送。
29.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物惰性剂或所述药物在所述递送后至少一周施用。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物惰性剂或所述药物以0.001μg/kg到
10mg/kg的剂量施用。
31.根据权利要求11所述的方法，其中所述核酸分子包含突触蛋白、TRPV1、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、CamKII、NSE或Advillin启动子。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人类。
33.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是家畜动物。
34.一种治疗神经疾病的方法，所述方法包含向异源性表达G蛋白偶联受体或LGIC的受试者施用激活所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的药物，其中所述药物是生物惰性剂或合成配体。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体是DREADD。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述DREADD是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体或所述LGIC是开关受体。
38.根据权利要求34所述的方法，其中所述生物惰性剂是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
39.根据权利要求34所述的方法，其中所述施用包含口服、鞘内或局部施用。
40.根据权利要求34所述的方法，其进一步包含在所述施用之前，向所述受试者递送编码所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的核酸分子。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述编码所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的核酸分子利用病毒载体递送。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒AAV载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒HSV载体。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。
44.根据权利要求42所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。
45.根据权利要求40所述的方法，其中所述核酸分子是利用非病毒方法递送给所述受试者。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述非病毒方法是脂质体转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。
47.根据权利要求34所述的方法，其中所述神经疾病是疼痛。
48.根据权利要求34所述的方法，其中所述神经疾病是饱腹感障碍。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述饱腹感障碍是肥胖、神经性厌食症或神经性贪食症。
50.根据权利要求34所述的方法，其中所述神经疾病是阿尔茨海默氏病、帕金森病、创伤后应激障碍PTSD、胃食管逆流病GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、发作性睡病、尿失禁、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。
51.根据权利要求40所述的方法，其中所述核酸分子包含突触蛋白、TRPV1、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、CamKII、NSE或Advillin启动子。
52.一种治疗神经疾病的方法，所述方法包含：向异源性表达G蛋白偶联受体或LGIC的受试者施用激活所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的药物，其中所述药物不是所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的内源性配体。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平、哌拉平、氟哌拉平、阿洛司琼、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
55.根据权利要求52所述的方法，其进一步包含在所述施用之前，向所述受试者递送编码所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的核酸分子。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体或所述LGIC在可兴奋细胞中选择性表达。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述可兴奋细胞包含神经元或肌细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述神经元包含感觉神经元、背根神经节或三叉神经节。
59.根据权利要求55所述的方法，其中所述核酸分子利用病毒载体递送。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒AAV载体。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。
63.根据权利要求55所述的方法，其中所述核酸分子是利用非病毒方法递送给所述受试者。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述非病毒方法是脂质体转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。
65.根据权利要求52所述的方法，其中所述药物是合成配体。
66.根据权利要求52所述的方法，其中所述药物以0.001μg/kg到10mg/kg的剂量施用。
67.根据权利要求52所述的方法，其中所述神经疾病是阿尔茨海默氏病、帕金森病、疼痛、肥胖、厌食症、PTSD、GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、发作性睡病、尿失禁、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。
68.一种治疗神经疾病的方法，其包含：向受试者递送编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子，其中所述受试者异源性表达所述G蛋白偶联受体或所述LGIC，并且向所述受试者施用激活所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的药物，由此治疗所述受试者的所述神经疾病，其中所述药物在递送所述编码所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的核酸分子后至少一周施用给所述受试者。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述编码所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的核酸分子是利用病毒载体递送给所述受试者。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体、慢病毒载体或腺相关AAV病毒载体。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述AAV载体是AAV-6或AAV-9。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。
73.根据权利要求68所述的方法，其中所述核酸分子是利用非病毒方法递送给所述受试者。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述非病毒方法是脂质体转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。
75.根据权利要求68所述的方法，其中所述神经疾病是阿尔茨海默氏病、帕金森病、疼痛、癫痫症、肥胖、厌食症、PTSD、GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、发作性睡病、尿失禁、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。
76.根据权利要求68所述的方法，其中所述药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平、哌拉平、氟哌拉平、阿洛司琼、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
77.根据权利要求68所述的方法，其中所述药物以0.001μg/kg到10mg/kg的剂量施用。
78.根据权利要求68所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体或所述LGIC在可兴奋细胞中选择性表达。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述可兴奋细胞是神经元或肌细胞。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述神经元是感觉神经元、背根神经节或三叉神经节。
81.根据权利要求68所述的方法，其进一步包含每天施用所述药物持续至少连续三天。
82.一种治疗神经疾病的方法，其包含：向异源性表达G蛋白偶联受体或LGIC的受试者施用激活所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的药物，其中所述药物不是所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的内源性配体，其中所述药物不是κ-阿片受体KOR结合药物。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体是除κ-阿片受体KOR以外的G蛋白偶联受体。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述异源G蛋白偶联受体是DREADD。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述DREADD是hM4Di、hM3Dq或AlstR。
86.根据权利要求82所述的方法，其中所述药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平、哌拉平、氟哌拉平、阿洛司琼、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
87.根据权利要求82所述的方法，其进一步包含在所述施用之前，向所述受试者递送编码所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的核酸分子。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体或所述LGIC利用病毒载体递送。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒AAV载体、腺病毒载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒HSV载体。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述AAV载体是AAV-6或AAV-9。
91.根据权利要求89所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。
92.根据权利要求87所述的方法，其中所述核酸分子是利用非病毒方法递送给所述受试者。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述非病毒方法是脂质体转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。
94.根据权利要求82所述的方法，其中所述神经疾病是疼痛。
95.根据权利要求82所述的方法，其中所述神经疾病是饱腹感障碍。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述饱腹感障碍是肥胖、神经性厌食症或神经性贪食症。
97.根据权利要求82所述的方法，其中所述神经疾病是阿尔茨海默氏病、帕金森病、疼痛、癫痫症、肥胖、厌食症、PTSD、GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、发作性睡病、尿失禁、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。
98.根据权利要求82所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体或所述LGIC在可兴奋细胞中选择性表达。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述可兴奋细胞是神经元或肌细胞。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述神经元是感觉神经元、背根神经节或三叉神经节。
101.根据权利要求82所述的方法，其中所述施用包含口服、鞘内或局部施用。
102.一种治疗神经疾病的方法，其包含向异源性表达G蛋白偶联受体或LGIC的受试者施用激活所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的药物，其中所述药物不是所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的内源性配体，且其中所述G蛋白偶联受体或所述LGIC在感觉神经元、背根神经节、三叉神经节、迷走神经、大脑或肌细胞中选择性表达。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体是DREADD。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述DREADD是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。
105.根据权利要求102所述的方法，其中所述药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平、哌拉平、氟哌拉平、阿洛司琼、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
106.根据权利要求102所述的方法，其进一步包含在所述施用之前，向所述受试者递送编码所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的核酸分子。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述核酸分子是在病毒载体中递送给所述受试者。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒AAV载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒HSV载体。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。
110.根据权利要求108所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。
111.根据权利要求106所述的方法，其中所述核酸分子是利用非病毒方法递送给所述受试者。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述非病毒方法是脂质体转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。
113.根据权利要求102所述的方法，其中所述神经疾病是疼痛。
114.根据权利要求102所述的方法，其中所述神经疾病是癫痫症。
115.根据权利要求102所述的方法，其中所述神经疾病是饱腹感障碍。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述饱腹感障碍是肥胖、神经性厌食症或神经性贪食症。
117.根据权利要求102所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体是Gi偶联或Gq偶联的。
118.根据权利要求102所述的方法，其中所述施用包含口服、鞘内或局部施用。
119.根据权利要求106所述的方法，其中所述递送包含鞘内、神经节内、颅内、皮下、脊柱内、小脑延髓池或神经内递送。
120.根据权利要求102所述的方法，其中所述药物在所述递送后至少一周施用。
121.根据权利要求102所述的方法，其中所述药物以0.001μg/kg到10mg/kg的剂量施用。
122.根据权利要求102所述的方法，其中所述核酸分子包含突触蛋白、TRPV1、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、CamKII、NSE或Advillin启动子。
123.根据权利要求102所述的方法，其中所述受试者是人类。
124.一种治疗受试者的神经疾病的方法，其包含向所述受试者递送编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子，并且向所述受试者施用激活所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的药物，其中所述药物是FDA批准的，但不是FDA批准用于治疗所述神经疾病的。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体或所述LGIC在所述受试者中表达。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体或所述LGIC在所述受试者中异源性表达。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体或所述LGIC在所述受试者中同源性表达。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体或所述LGIC在所述受试者中异位表达。
129.根据权利要求124所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体是DREADD。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述DREADD是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。
131.一种治疗神经疾病的方法，其包含向异源性表达G蛋白偶联受体或LGIC的受试者施用激活所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的药物，其中所述药物以0.001μg/kg到10mg/kg的剂量施用。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平、哌拉平、氟哌拉平、阿洛司琼、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
133.一种治疗神经疾病的方法，其包含向受试者递送编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子，并且向所述受试者施用激活所述G蛋白偶联受体或所述LGIC的药物，其中所述药物每天施用给所述受试者持续至少连续三天。
134.根据权利要求133所述的方法，其中所述药物在所述递送后至少一周施用给所述受试者。
135.一种治疗神经疾病的方法，其包含向异源性表达配体门控离子通道的受试者施用激活所述配体门控离子通道的药物。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述药物不是甘氨酸、β-丙氨酸或牛磺酸。
137.根据权利要求135所述的方法，其中所述配体门控离子通道包含离子传导孔结构域和配体结合结构域，所述离子传导孔结构域和配体结合结构域通过融合最初编码独立多肽的两个或更多个多核苷酸序列而形成。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述多核苷酸序列包含cys环受体基因家族的两个或更多个成员。
139.根据权利要求137所述的方法，其中所述离子传导孔结构域传导阴离子。
140.根据权利要求137所述的方法，其中所述离子传导孔结构域传导阳离子。
141.根据权利要求137所述的方法，其中所述配体结合结构域通过氯氮平-N-氧化物、氯氮平、哌拉平、奥氮平、阿洛司琼、氟哌拉平或N4'-烷基取代的CNO类似物的结合而被激活。
142.根据权利要求137所述的方法，其中所述配体结合结构域通过尼古丁、伐尼克兰或加兰他敏的结合而被激活。
143.根据权利要求1、34、52、68、82、102、124、131、133和135中任一权利要求所述的方法，其中所述配体门控离子通道是GlyR-M、GluCl、PSAM-5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。
144.根据权利要求135到143中任一权利要求所述的方法，其中所述药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。
145.根据权利要求135所述的方法，其进一步包含在所述施用之前，向所述受试者递送编码所述配体门控离子通道的核酸分子。
146.根据权利要求145所述的方法，其中所述核酸分子是利用病毒载体递送给所述受试者。
147.根据权利要求146所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒AAV载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒HSV载体。
148.根据权利要求147所述的方法，其中所述AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。
149.根据权利要求147所述的方法，其中所述AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。
150.根据权利要求147所述的方法，其中所述AAV载体包含SEQ ID NO:1。
151.根据权利要求145所述的方法，其中所述核酸分子是利用非病毒方法递送给所述受试者。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述非病毒方法是脂质体转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。
153.根据权利要求135所述的方法，其中所述神经疾病是疼痛。
154.根据权利要求135所述的方法，其中所述神经疾病是癫痫症。
155.根据权利要求135所述的方法，其中所述神经疾病是饱腹感障碍。
156.根据权利要求155所述的方法，其中所述饱腹感障碍是肥胖、神经性厌食症或神经性贪食症。
157.根据权利要求135所述的方法，其中所述神经疾病是阿尔茨海默氏病、帕金森病、创伤后应激障碍PTSD、胃食管逆流病GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、尿失禁、发作性睡病、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。
158.根据权利要求135所述的方法，其中所述配体门控离子通道在可兴奋细胞中选择性表达。
159.根据权利要求158所述的方法，其中所述可兴奋细胞是神经元或肌细胞。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述神经元是背根神经节、感觉神经元或三叉神经节。
161.根据权利要求135所述的方法，其中所述施用包含口服、鞘内或局部施用。
162.根据权利要求145所述的方法，其中所述递送包含鞘内、神经节内、颅内、皮下、脊柱内、小脑延髓池或神经内递送。
163.根据权利要求135所述的方法，其中所述药物在所述递送后至少一周施用。
164.根据权利要求145所述的方法，其中所述核酸分子包含突触蛋白、TRPV1、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、CamKII、NSE或Advillin启动子。
165.根据权利要求135所述的方法，其中所述受试者是人类。
166.根据权利要求135所述的方法，其中所述受试者是家畜动物。
167.一种治疗神经疾病的方法，其包含向异源性表达配体门控离子通道的受试者施用激活所述配体门控离子通道的药物，其中所述药物以0.001μg/kg到10mg/kg的剂量施用。
168.根据权利要求167所述的方法，其中所述配体门控离子通道是GlyR-M、GluCl、PSAM-5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。
169.根据权利要求167所述的方法，其中所述药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。
170.根据权利要求167所述的方法，其中所述神经疾病是疼痛、饱腹感障碍、阿尔茨海默氏病、帕金森病、癫痫症、肥胖、厌食症、PTSD、GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、发作性睡病、尿失禁、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。
171.根据权利要求170所述的方法，其中所述疼痛得到缓解。
172.一种AAV载体，其包含在神经元细胞中可操作的启动子，其中所述启动子可操作地连接于编码开关受体的多核苷酸。
173.根据权利要求172所述的AAV载体，其中所述启动子是神经元特异性启动子。
174.根据权利要求173所述的AAV载体，其中所述神经元特异性启动子是在三叉神经节TGG神经元或背根神经节DRG神经元中可操作的启动子。
175.根据权利要求173或权利要求174所述的AAV载体，其中所述神经元特异性启动子是hSYN1启动子、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II a启动子、微管蛋白αI启动子、神经元特异性烯醇酶启动子、血小板衍生生长因子β链启动子、TRPV1启动子、Nav1.7启动子、Nav1.8启动子、Nav1.9启动子或Advillin启动子。
176.根据权利要求173到175中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述神经元特异性启动子是hSYN1启动子。
177.根据权利要求172或权利要求173所述的AAV载体，其中所述启动子是组成型启动子。
178.根据权利要求177所述的AAV载体，其中所述组成型启动子是巨细胞病毒CMV立即早期启动子、病毒猿病毒40 SV40、莫洛尼鼠白血病病毒MoMLV LTR启动子、劳斯肉瘤病毒RSV LTR、单纯疱疹病毒HSV(胸苷激酶)启动子、来自牛痘病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长反应1 EGR1、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶GAPDH、真核翻译起始因子4A1 EIF4A1、热休克70kDa蛋白5 HSPA5、热休克蛋白
90kDaβ成员1 HSP90B1、热休克蛋白70kDa HSP70、β-驱动蛋白β-KIN、人ROSA 26启动子、泛素C启动子UBC、磷酸甘油酸激酶-1 PGK启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白CAG启动子或β-肌动蛋白启动子。
179.根据权利要求172或权利要求173所述的AAV载体，其中所述启动子是诱导型启动子。
180.根据权利要求179所述的AAV载体，其中所述诱导型启动子是四环素反应启动子、蜕皮激素反应启动子、cumate反应启动子、糖皮质激素反应启动子和雌激素反应启动子、PPAR-γ启动子或RU-486反应启动子。
181.根据权利要求172到180中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含配体门控离子通道或G偶联蛋白受体。
182.根据权利要求172到181中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体的活性受细胞外配体调节。
183.根据权利要求182所述的AAV载体，其中所述配体是非天然存在的或合成的。
184.根据权利要求182或权利要求183所述的AAV载体，其中当所述细胞外配体结合所述开关受体时，表达所述开关受体的细胞的活性增加，任选地其中所述活性是电生理学活性。
185.根据权利要求172到184中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体选自由以下组成的群组：hM3Dq、GsD、PSAM-5HT3HC、PSAM-nAChR或TRPV1。
186.根据权利要求182到185中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述配体选自由以下组成的群组：PSEM22S、PSEM9S、辣椒素、氯氮平、哌拉平、阿洛司琼、氟哌拉平、奥氮平、氯氮平-N-氧化物、氯氮平-N-氧化物类似物：3-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、4-(8-氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓和11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
187.根据权利要求182或权利要求183所述的AAV载体，其中当所述细胞外配体结合所述开关受体时，表达所述开关受体的细胞的活性降低，任选地其中所述活性是电生理学活性。
188.根据权利要求187所述的AAV载体，其中所述开关受体选自由以下组成的群组：
AlstR、hM4Di、KORD、GluCl、PSAM-GlyR、GlyR-M和GABA。
189.根据权利要求172到188中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含甘氨酸受体(GlyR)多肽的一或多个亚基。
190.根据权利要求172到189中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)多肽。
191.根据权利要求189或权利要求190所述的AAV载体，其中所述GlyRα1多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
192.根据权利要求189到191中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述GlyRα1多肽包含氨基酸取代：
(a)F207A和A288G；
(b)A-1'E、F207A和A228G；或
(c)A-1'E、P-2'Δ、T13'V、F207A和A228G。
193.根据权利要求189到192中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述配体选自由以下组成的群组：依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁和莫西菌素。
194.根据权利要求193所述的AAV载体，其中所述配体是依维菌素。
195.根据权利要求172到188中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含GluClα或GluClβ多肽。
196.根据权利要求195所述的AAV载体，其中所述GluClα或GluClβ多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
197.根据权利要求195或权利要求196所述的AAV载体，其中所述配体选自由以下组成的群组：依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁和莫西菌素。
198.根据权利要求172到188中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含PSAM-5HT3HC多肽。
199.根据权利要求198所述的AAV载体，其中所述PSAM-5HT3HC多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
200.根据权利要求198或权利要求199所述的AAV载体，其中所述配体是PSEM22S。
201.根据权利要求172到188中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含PSAM-GlyR多肽。
202.根据权利要求201所述的AAV载体，其中所述PSAM-GlyR多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
203.根据权利要求201或权利要求202所述的AAV载体，其中所述配体是PSEM89S。
204.根据权利要求172到188中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含PSAM-nAChR多肽。
205.根据权利要求204所述的AAV载体，其中所述PSAM-nAChR多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
206.根据权利要求204或权利要求205所述的AAV载体，其中所述配体是PSEM9S。
207.根据权利要求172到188中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含TRPV1多肽。
208.根据权利要求207所述的AAV载体，其中所述TRPV1多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
209.根据权利要求207或权利要求208所述的AAV载体，其中所述配体是辣椒素。
210.根据权利要求172到188中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含GABAA多肽。
211.根据权利要求210所述的AAV载体，其中所述GABAA多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
212.根据权利要求210或权利要求211所述的AAV载体，其中所述配体是唑吡坦。
213.根据权利要求172到188中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含AlstR多肽。
214.根据权利要求213所述的AAV载体，其中所述AlstR多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
215.根据权利要求213或权利要求214所述的AAV载体，其中所述配体是咽侧体抑制素。
216.根据权利要求172到188中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含hM4Di多肽。
217.根据权利要求216所述的AAV载体，其中所述hM4Di多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
218.根据权利要求216或权利要求217所述的AAV载体，其中所述配体选自由以下组成的群组：CNO、纳呋拉啡、氯氮平、哌拉平、奥氮平、阿洛司琼、氟哌拉平和N4'-烷基取代的CNO类似物。
219.根据权利要求218所述的AAV载体，其中所述N4'-烷基取代的CNO类似物选自由以下组成的群组：3-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、4-(8-氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-1-基)-
5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、和11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
220.根据权利要求172到188中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含KORD多肽。
221.根据权利要求220所述的AAV载体，其中所述KORD多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
222.根据权利要求220或权利要求221所述的AAV载体，其中所述配体是鼠尾草素B。
223.根据权利要求172到188中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含hM3Dq多肽。
224.根据权利要求223所述的AAV载体，其中所述hM3Dq多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
225.根据权利要求223或权利要求224所述的AAV载体，其中所述配体选自由以下组成的群组：CNO、纳呋拉啡、氯氮平、哌拉平、奥氮平、阿洛司琼、氟哌拉平和N4'-烷基取代的CNO类似物。
226.根据权利要求225所述的AAV载体，其中所述N4'-烷基取代的CNO类似物选自由以下组成的群组：3-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、4-(8-氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-1-基)-
5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、和11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
227.根据权利要求172到188中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述开关受体包含GsD多肽。
228.根据权利要求227所述的AAV载体，其中所述GsD多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
229.根据权利要求227或权利要求228所述的AAV载体，其中所述配体选自由以下组成的群组：CNO、纳呋拉啡、氯氮平、哌拉平、奥氮平、阿洛司琼、氟哌拉平和N4'-烷基取代的CNO类似物。
230.根据权利要求229所述的AAV载体，其中所述N4'-烷基取代的CNO类似物选自由以下组成的群组：3-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、4-(8-氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-1-基)-
5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、和11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
231.根据权利要求172到230中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述载体进一步包含编码表位标签的多核苷酸。
232.根据权利要求231所述的AAV载体，其中所述表位标签选自由以下组成的群组：麦芽糖结合蛋白“MBP”、谷胱甘肽S转移酶GST、HIS6、MYC、FLAG、V5、VSV-G和HA。
233.根据权利要求172到230中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述载体进一步包含聚(A)序列。
234.根据权利要求233所述的AAV载体，其中所述聚(A)序列是SV40聚(A)序列、牛生长激素聚(A)序列bGHpA或兔β-球蛋白聚(A)序列rβgpA。
235.根据权利要求233或权利要求234所述的AAV载体，其中所述聚(A)序列是bGHpA。
236.根据权利要求172到235中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含一或多个AAV2反向末端重复ITR。
237.根据权利要求172到236中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含选自由以下组成的群组的血清型：AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3(Y705+731F)、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3变异体Y705F/Y731F/T492V)、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变异体Y731F)、AAV10(Y733F)和AAV-ShH10。
238.根据权利要求172到237中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含选自由以下组成的群组的血清型：AAV1、AAV5、AAV6、AAV6(Y705F/Y731F/T492V)、AAV8、AAV9和AAV9(Y731F)。
239.根据权利要求172到238中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含选自由以下组成的群组的血清型：AAV6、AAV6(Y705F/Y731F/T492V)、AAV9和AAV9(Y731F)。
240.根据权利要求172到239中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含AAV6或AAV6(Y705F/Y731F/T492V)血清型。
241.根据权利要求172所述的AAV载体，其中所述启动子在DRG神经元或TGG神经元中可操作，并且所述开关受体包含GlyRα1多肽。
242.根据权利要求172所述的AAV载体，其中所述启动子是hSYN-1启动子，并且所述开关受体包含进一步包含氨基酸取代F207A和A288G的GlyRα1多肽。
243.根据权利要求172所述的AAV载体，其中所述AAV血清型是AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3(Y705+731F)、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3变异体Y705F/Y731F/T492V)、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变异体Y731F)、AAV10(Y733F)或AAV-ShH10，所述启动子是hSYN-1启动子，并且所述开关受体包含进一步包含氨基酸取代F207A和A288G的GlyRα1多肽。
244.一种AAV载体，其包含一或多个AAV2ITR、AAV6血清型、hSYN-1启动子和编码GlyRα1多肽的多核苷酸，所述GlyRα1多肽进一步包含以下氨基酸取代：
(a)F207A和A288G；
(b)A-1'E、F207A和A228G；或
(c)A-1'E、P-2'Δ、T13'V、F207A和A228G。
245.一种AAV载体，其包含一或多个AAV2ITR、AAV6(Y705F/Y731F/T492V)血清型、hSYN-
1启动子和编码进一步包含氨基酸取代F207A和A288G的GlyRα1多肽的多核苷酸。
246.根据权利要求242到245中任一权利要求所述的AAV载体，其进一步包含bGHpA。
247.根据权利要求242到246中任一权利要求所述的AAV载体，其进一步包含FLAG表位标签。
248.根据权利要求172到247中任一权利要求所述的AAV载体，其中所述AAV载体是自身互补的AAV scAAV载体。
249.根据权利要求172所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含SEQ ID NO:1。
250.一种组合物，其包含根据权利要求172到249中任一权利要求所述的载体。
251.一种管理、预防或治疗受试者的神经疾病的方法，其包含向所述受试者施用根据权利要求172到249中任一权利要求所述的AAV载体。
252.根据权利要求251所述的方法，其中所述神经疾病是饱腹感障碍、阿尔茨海默氏病、帕金森病、癫痫症、肥胖、厌食症、PTSD、GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、发作性睡病、尿失禁、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。
253.一种管理、预防或治疗受试者的疼痛的方法，其包含向所述受试者施用根据权利要求172到249中任一权利要求所述的AAV载体。
254.一种向患有疼痛的受试者提供镇痛的方法，其包含向所述受试者施用根据权利要求172到249中任一权利要求所述的AAV载体。
255.根据权利要求253或权利要求254所述的方法，其中所述疼痛是急性疼痛或慢性疼痛。
256.根据权利要求253到255中任一权利要求所述的方法，其中所述疼痛是慢性疼痛。
257.根据权利要求253到255中任一权利要求所述的方法，其中所述疼痛是急性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛、伤害感受性疼痛、痛觉异常、炎性疼痛、炎性痛觉过敏、神经病变、神经痛、糖尿病性神经病变、人类免疫缺乏病毒相关的神经病变、神经损伤、类风湿性关节炎疼痛、骨关节炎疼痛、烧伤、背痛、眼痛、内脏疼痛、癌症疼痛(例如骨癌疼痛)、牙痛、头痛、偏头痛、腕管综合症、纤维肌痛、神经炎、坐骨神经痛、盆腔超敏反应、盆腔疼痛、疱疹后神经痛、手术后疼痛、中风后疼痛或月经疼痛。
258.根据权利要求253到255中任一权利要求所述的方法，其中所述疼痛是伤害感受性疼痛。
259.根据权利要求253到255中任一权利要求所述的方法，其中所述疼痛是选自由以下组成的群组的伤害感受性疼痛：中枢神经系统创伤、拧伤/扭伤、烧伤、心肌梗塞和急性胰腺炎、手术后疼痛(在任何类型的外科手术之后的疼痛)、创伤后疼痛、肾绞痛、癌症疼痛和背痛。
260.根据权利要求253到255中任一权利要求所述的方法，其中所述疼痛是神经性疼痛。
261.根据权利要求260所述的方法，其中所述神经性疼痛的病因选自由以下组成的群组：外周神经病变、糖尿病性神经病变、疱疹后神经痛、三叉神经痛、背痛、癌症神经病变、HIV神经病变、幻肢痛、腕管综合症、中枢性中风后疼痛和与慢性酒精中毒相关的疼痛、甲状腺功能减退症、尿毒症、多发性硬化症、脊髓损伤、帕金森病、癫痫症和维生素缺乏症。
262.根据权利要求260所述的方法，其中所述神经性疼痛与选自由以下组成的群组的疼痛病症有关：关节炎、痛觉异常、典型的三叉神经痛、三叉神经痛、躯体形式障碍、假体、痛觉过敏、神经痛、神经炎、神经性疼痛、镇痛、痛性感觉缺失、灼痛、坐骨神经疼痛病症、退行性关节病症、纤维肌痛、内脏疾病、慢性疼痛病症、偏头痛/头痛、慢性疲劳综合症、复合性区域疼痛综合症、神经营养不良、足底筋膜炎或与癌症相关的疼痛。
263.根据权利要求253到255中任一权利要求所述的方法，其中所述疼痛是炎性疼痛。
264.根据权利要求253到255中任一权利要求所述的方法，其中所述疼痛与肌肉骨骼病症、肌痛、纤维肌痛、脊椎炎、血清阴性(非类风湿)关节病、非关节风湿病、营养不良、肝糖病、多发性肌炎和脓性肌炎；心脏和血管疼痛、由心绞痛、心肌梗塞、二尖瓣狭窄、心包炎、雷诺氏现象、硬化症和骨骼肌缺血引起的疼痛；头痛、偏头痛、丛集性头痛、紧张型头痛、混合性头痛和与血管疾病相关的头痛；口面疼痛、牙痛、耳部疼痛、灼口综合症和颞下颌肌筋膜疼痛。
265.根据权利要求253到255中任一权利要求所述的方法，其中将根据权利要求172到
249中任一权利要求所述的AAV载体或根据权利要求250所述的组合物鞘内施用受试者。
266.根据权利要求253到255中任一权利要求所述的方法，其中将根据权利要求172到
249中任一权利要求所述的AAV载体或根据权利要求250所述的组合物神经节内施用受试者。
267.根据权利要求253到255中任一权利要求所述的方法，其中将根据权利要求172到
249中任一权利要求所述的AAV载体或根据权利要求250所述的组合物经神经内施用受试者。
治疗神经障碍的组合物和方法
[0001] 本申请要求2015年9月17日提交的美国临时专利申请号62/220,077和2015年9月17日提交的美国临时专利申请号62/220,087的优先权和权益。这两个申请的全部内容通过
引用并入本文。
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技术领域
背景技术
[0005] 全世界有数亿人受到神经障碍的影响。目前估计有600多种不同的神经障碍会影响人。每年大约有620万人因中风死亡，中低收入国家死亡人数超过80％。全世界有超过
5000万人患有癫痫症。据估计，全球有3560万痴呆患者，每年有770万新病例。阿尔茨海默病是痴呆最常见的原因，并可能导致60-70％的病例。全球偏头痛患病率超过10％。超过1.1亿
美国人患慢性疼痛。神经障碍的经济负担是显著的。仅在美国，治疗神经障碍的费用估计每
年就超过8000亿美元。到2030年，治疗神经障碍的全球成本估计将超过6万亿美元。
5000万人患有癫痫症。据估计，全球有3560万痴呆患者，每年有770万新病例。阿尔茨海默病是痴呆最常见的原因，并可能导致60-70％的病例。全球偏头痛患病率超过10％。超过1.1亿
美国人患慢性疼痛。神经障碍的经济负担是显著的。仅在美国，治疗神经障碍的费用估计每
年就超过8000亿美元。到2030年，治疗神经障碍的全球成本估计将超过6万亿美元。
[0006] 慢性疼痛是一种神经障碍。未缓解的慢性疼痛是美国和全世界的重要健康问题。医学研究所的一份报告估计，有1.16亿美国人患有持续数周至数年的疼痛，导致年度成本
超过5.6亿美元。对于慢性疼痛患者没有足够的长期疗法，导致社会和个人的显著成本。疼
痛通常会导致残疾，即使不残疾，也会对生活质量产生深远的影响。即使护理服务的情况最
佳，如细心的、训练有素的医生；随时可以使用阿片类药物(opioids)；使用辅助镇痛药；患者自控镇痛的可用性；以及神经阻滞和IT泵等程序的循证使用，疼痛治疗也经常失败。
超过5.6亿美元。对于慢性疼痛患者没有足够的长期疗法，导致社会和个人的显著成本。疼
痛通常会导致残疾，即使不残疾，也会对生活质量产生深远的影响。即使护理服务的情况最
佳，如细心的、训练有素的医生；随时可以使用阿片类药物(opioids)；使用辅助镇痛药；患者自控镇痛的可用性；以及神经阻滞和IT泵等程序的循证使用，疼痛治疗也经常失败。
[0007] 慢性疼痛最常用的疗法是应用阿片类止痛药和非甾体类抗炎药，但这些药物可能导致成瘾并可能引起副作用，如药物依赖、耐受、呼吸抑制、镇静、认知障碍、幻觉和其它系统性副作用。尽管药物的使用范围很广，但其缓解疼痛的有效性成功率却惊人地低。一项针
对各种药物的大型随机研究发现，每两到三名患者中只有一人获得至少50％的疼痛缓解
(费内卢浦(Finnerup)等人,2005)。使用最成熟的药物治疗的后续研究发现了相同的结果，
表明疼痛药物疗效没有改善(费内卢浦(Finnerup)等人,疼痛(Pain),150(3):573-81,
2010)。
对各种药物的大型随机研究发现，每两到三名患者中只有一人获得至少50％的疼痛缓解
(费内卢浦(Finnerup)等人,2005)。使用最成熟的药物治疗的后续研究发现了相同的结果，
表明疼痛药物疗效没有改善(费内卢浦(Finnerup)等人,疼痛(Pain),150(3):573-81,
2010)。
[0008] 用于治疗疼痛的更多侵入性选择包括神经阻滞和电刺激。神经阻滞通常是脊髓局部麻醉注射，以阻断脑部的疼痛信号，其作用仅持续数周至数月。在大多数情况下，神经阻
滞不是推荐的治疗选择(迈里斯(Mailis)和陶泽(Taenzer),疼痛研究管理(Pain Res
Manag.)17(3):150–158,2012)。电刺激涉及提供电流来阻断疼痛信号。虽然效果可能会比
神经阻滞持续更长时间，但电导线本身会出现并发症：脱位、感染、破损或电池耗尽。一篇综述发现，40％用神经电刺激治疗的患者经历了这些设备问题中的一或多个(沃尔特
(Wolter),2014)。
滞不是推荐的治疗选择(迈里斯(Mailis)和陶泽(Taenzer),疼痛研究管理(Pain Res
Manag.)17(3):150–158,2012)。电刺激涉及提供电流来阻断疼痛信号。虽然效果可能会比
神经阻滞持续更长时间，但电导线本身会出现并发症：脱位、感染、破损或电池耗尽。一篇综述发现，40％用神经电刺激治疗的患者经历了这些设备问题中的一或多个(沃尔特
(Wolter),2014)。
[0009] 用于控制疼痛的最具侵入性且最不优选的方法是完全手术切除引起疼痛的神经或其部分。只有当患者用尽了前述方法和其它侵入性较小的治疗方法并且发现它们无效时
才推荐该选项。射频神经消融利用热量来摧毁有问题的神经，并提供比神经阻滞更长的疼
痛缓解。然而，一项研究发现，对照组和治疗组在部分射频消融DRG治疗慢性腰骶神经根性
疼痛方面无差异(格兹(Geurts)等人,2003)。用于手术去除疼痛神经的其它手术方法具有
类似的缺点并且长期具有严重的副作用，包括感觉或运动缺陷，或者在其它地方引起疼痛。
才推荐该选项。射频神经消融利用热量来摧毁有问题的神经，并提供比神经阻滞更长的疼
痛缓解。然而，一项研究发现，对照组和治疗组在部分射频消融DRG治疗慢性腰骶神经根性
疼痛方面无差异(格兹(Geurts)等人,2003)。用于手术去除疼痛神经的其它手术方法具有
类似的缺点并且长期具有严重的副作用，包括感觉或运动缺陷，或者在其它地方引起疼痛。
[0010] 治疗神经障碍的方法应该安全，有效并且有成本效益。基因治疗可以为各种神经疾病提供非侵入性治疗选择，包括控制疼痛。然而，迄今为止，基因治疗方法尚未广泛用于
治疗神经疾病。基因治疗的关键是选择安全和高效的基因递送系统，它可以递送治疗基因
来过度表达或抑制特定细胞类型中的相关靶点。
治疗神经疾病。基因治疗的关键是选择安全和高效的基因递送系统，它可以递送治疗基因
来过度表达或抑制特定细胞类型中的相关靶点。
[0011] 但是，很少有递送系统被证明是安全和有效的；因此，用于治疗神经障碍(包括控制疼痛)的基因治疗的希望尚未实现。
发明内容
[0012] 本发明提供了用于神经障碍和疾病的基因治疗的多核苷酸、载体和相关组合物。在一个实施例中，神经障碍是疼痛(例如慢性或急性疼痛)。
[0013] 在一个方面，提供了一种用于治疗神经疾病的方法，其包括向患有神经疾病的受试者施用生物惰性药剂或药物。在一些实施例中，神经疾病不是癫痫症。在一些情况下，受
试者异源表达G蛋白偶联受体或配体门控离子通道(LGIC)。在一些情况下，受试者同源表达
G蛋白偶联受体或LGIC。在一些情况下，受试者异位表达G蛋白偶联受体或LGIC。在某些情况
下，G蛋白偶联受体是由设计者药物(DREADD)独家激活的设计者受体。在一些实例中，
DREADD是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。在一些情况下，LGIC是GlyR-M、GluCl、PSAM-
5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。在一些情况下，生物惰性剂是氯氮平-N-氧化物(CNO)、纳呋拉啡(nalfurafine)(C28H32N2O5)、鼠尾草素B(salvinorin B)、咽侧体抑制素(allatostatin)、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二
氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。在一些情况下，药物是依维菌
素(ivermectin)、赛拉菌素(selamectin)、多拉菌素(doramectin)、埃玛菌素(emamectin)、依普菌素(eprinomectin)、阿巴美丁(abamectin)、莫西菌素(moxidectin)、PSEM22S、
PSEM89S、PSEM9S、辣椒素(capsaicin)或唑吡坦(zolpidem)。在一些实施例中，提供了一种治疗非癫痫症的神经疾病的方法，其包括向患有所述神经疾病的受试者施用为氯氮平-N-氧
化物的生物惰性剂，其中所述受试者表达hM4Di。在某些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC被生
物惰性剂或药物激活。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC是开关受体。在一些情况下，所述方法还包括在所述施用之前将编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子递送至受试者。在
一些情况下，将核酸分子在病毒载体中递送给受试者。在某些情况下，病毒载体是腺病毒载
体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些实例中，AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。在一些实例中，AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或
AAV-7m8。在一些实施例中，AAV载体包含SEQ ID NO:1。在一些情况下，将核酸分子通过非病毒方法递送给受试者。在一些实例中，非病毒方法是脂质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。在某些情况下，神经疾病是疼痛。在某些情况下，神经疾病是饱腹感障碍。在一些情况下，饱腹感障碍是肥胖症、神经性厌食症或神经性贪食症。在某些情
况下，神经疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、创伤后应激障碍(PTSD)、胃食管反流病(GERD)、成瘾、焦虑、抑郁、记忆丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、尿失禁、嗜睡症、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。在一些情况下，G蛋白偶联受体是Gi或Gq偶联的。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC在可兴奋细胞中选择性表达。在某些情况下，可兴奋细胞是神经元或肌
细胞。在某些情况下，神经元是背根神经节或感觉神经元。在一些情况下，施用包括口服、鞘内或局部施用。在一些情况下，递送包括鞘内、神经节内、颅内、皮下、脊柱内、脑池内或神经内递送。在一些情况下，生物惰性剂或药物在所述递送后至少一周施用。在一些情况下，生
物惰性剂或药物以0.001μg/kg至10mg/kg的剂量施用。在一些情况下，核酸分子包含突触蛋
白、TRPV1、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、CamKII、NSE或Advillin启动子。在某些情况下，受试者是人。在某些情况下，受试者是家畜动物。
试者异源表达G蛋白偶联受体或配体门控离子通道(LGIC)。在一些情况下，受试者同源表达
G蛋白偶联受体或LGIC。在一些情况下，受试者异位表达G蛋白偶联受体或LGIC。在某些情况
下，G蛋白偶联受体是由设计者药物(DREADD)独家激活的设计者受体。在一些实例中，
DREADD是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。在一些情况下，LGIC是GlyR-M、GluCl、PSAM-
5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。在一些情况下，生物惰性剂是氯氮平-N-氧化物(CNO)、纳呋拉啡(nalfurafine)(C28H32N2O5)、鼠尾草素B(salvinorin B)、咽侧体抑制素(allatostatin)、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二
氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。在一些情况下，药物是依维菌
素(ivermectin)、赛拉菌素(selamectin)、多拉菌素(doramectin)、埃玛菌素(emamectin)、依普菌素(eprinomectin)、阿巴美丁(abamectin)、莫西菌素(moxidectin)、PSEM22S、
PSEM89S、PSEM9S、辣椒素(capsaicin)或唑吡坦(zolpidem)。在一些实施例中，提供了一种治疗非癫痫症的神经疾病的方法，其包括向患有所述神经疾病的受试者施用为氯氮平-N-氧
化物的生物惰性剂，其中所述受试者表达hM4Di。在某些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC被生
物惰性剂或药物激活。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC是开关受体。在一些情况下，所述方法还包括在所述施用之前将编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子递送至受试者。在
一些情况下，将核酸分子在病毒载体中递送给受试者。在某些情况下，病毒载体是腺病毒载
体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些实例中，AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。在一些实例中，AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或
AAV-7m8。在一些实施例中，AAV载体包含SEQ ID NO:1。在一些情况下，将核酸分子通过非病毒方法递送给受试者。在一些实例中，非病毒方法是脂质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。在某些情况下，神经疾病是疼痛。在某些情况下，神经疾病是饱腹感障碍。在一些情况下，饱腹感障碍是肥胖症、神经性厌食症或神经性贪食症。在某些情
况下，神经疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、创伤后应激障碍(PTSD)、胃食管反流病(GERD)、成瘾、焦虑、抑郁、记忆丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、尿失禁、嗜睡症、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。在一些情况下，G蛋白偶联受体是Gi或Gq偶联的。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC在可兴奋细胞中选择性表达。在某些情况下，可兴奋细胞是神经元或肌
细胞。在某些情况下，神经元是背根神经节或感觉神经元。在一些情况下，施用包括口服、鞘内或局部施用。在一些情况下，递送包括鞘内、神经节内、颅内、皮下、脊柱内、脑池内或神经内递送。在一些情况下，生物惰性剂或药物在所述递送后至少一周施用。在一些情况下，生
物惰性剂或药物以0.001μg/kg至10mg/kg的剂量施用。在一些情况下，核酸分子包含突触蛋
白、TRPV1、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、CamKII、NSE或Advillin启动子。在某些情况下，受试者是人。在某些情况下，受试者是家畜动物。
[0014] 另一方面，提供了一种治疗神经疾病的方法，所述方法包括向异源表达G蛋白偶联受体或LGIC的受试者施用激活G蛋白偶联受体或LGIC的药物，其中所述药物是生物惰性剂
或合成配体。在某些方面，神经疾病不是癫痫症。在某些情况下，G蛋白偶联受体是DREADD。
在某些情况下，DREADD是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。在一些情况下，LGIC是GlyR-M、GluCl、PSAM-5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC是开关受体。在一些情况下，生物惰性剂是氯氮平-N-氧化物(CNO)、纳呋拉啡
(C28H32N2O5)、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。在一些情况
下，药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、
PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。在一些情况下，施用包含口服、鞘内或局部施用。
在一些情况下，所述方法还包括在所述施用之前将编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子
递送至受试者。在一些情况下，编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子通过病毒载体递送。
在某些情况下，病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或单纯疱疹病
毒(HSV)载体。在一些实例中，AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。在一些实例中，AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。在一些实施例中，AAV载体包含SEQ ID NO:1。
在一些情况下，将核酸分子通过非病毒方法递送给受试者。在一些情况下，非病毒方法是脂
质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。在某些情况下，神经疾病是疼痛。在某些情况下，神经疾病是饱腹感障碍。在一些实例中，饱腹感障碍是肥胖症、神经性厌食症或神经性贪食症。在其它情况下，神经疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、创伤后应
激障碍(PTSD)、胃食管反流病(GERD)、成瘾、焦虑、抑郁症、记忆丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、嗜睡症、尿失禁、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。在一些情况下，核酸分子包含突触蛋白、TRPV1、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、CamKII、NSE或Advillin启动子。
或合成配体。在某些方面，神经疾病不是癫痫症。在某些情况下，G蛋白偶联受体是DREADD。
在某些情况下，DREADD是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。在一些情况下，LGIC是GlyR-M、GluCl、PSAM-5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC是开关受体。在一些情况下，生物惰性剂是氯氮平-N-氧化物(CNO)、纳呋拉啡
(C28H32N2O5)、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。在一些情况
下，药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、
PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。在一些情况下，施用包含口服、鞘内或局部施用。
在一些情况下，所述方法还包括在所述施用之前将编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子
递送至受试者。在一些情况下，编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子通过病毒载体递送。
在某些情况下，病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或单纯疱疹病
毒(HSV)载体。在一些实例中，AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。在一些实例中，AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。在一些实施例中，AAV载体包含SEQ ID NO:1。
在一些情况下，将核酸分子通过非病毒方法递送给受试者。在一些情况下，非病毒方法是脂
质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。在某些情况下，神经疾病是疼痛。在某些情况下，神经疾病是饱腹感障碍。在一些实例中，饱腹感障碍是肥胖症、神经性厌食症或神经性贪食症。在其它情况下，神经疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、创伤后应
激障碍(PTSD)、胃食管反流病(GERD)、成瘾、焦虑、抑郁症、记忆丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、嗜睡症、尿失禁、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。在一些情况下，核酸分子包含突触蛋白、TRPV1、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、CamKII、NSE或Advillin启动子。
[0015] 在另一方面，提供了一种用于治疗神经疾病的方法，所述方法包括：向异源表达G蛋白偶联受体或LGIC的受试者施用激活G蛋白偶联受体或LGIC的药物，其中所述药物不是G
蛋白偶联受体或LGIC的内源性配体。在某些情况下，神经疾病不是癫痫症。在一些情况下，G蛋白偶联受体是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。在一些情况下，LGIC是GlyR-M、GluCl、PSAM-5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。在一些情况下，药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡(C28H32N2O5)、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平(olanzapine)、哌拉平(perlapine)、氟哌拉平(fluperlapine)、阿洛司琼(alosetron)、8-氯-11-[4-(1,1-二氘
代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e]
[1,4]二氮杂卓。在一些情况下，药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。在一些情况下，所述方法还包括在所述施用之前将编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子递送至受试者。在一些情
况下，G蛋白偶联受体或LGIC在可兴奋细胞中选择性表达。在某些情况下，可兴奋细胞包含
神经元或肌细胞。在某些情况下，神经元包含感觉神经元、背根神经节或三叉神经节。在一
些情况下，核酸分子通过病毒载体递送。在一些实例中，病毒载体是腺病毒载体、慢病毒载
体或腺相关病毒(AAV)载体。在一些实例中，AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。在一些情况下，
AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。在一些情况下，将核酸分子通
过非病毒方法递送给受试者。在一些情况下，非病毒方法是脂质转染、纳米粒子递送、粒子
轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。在某些情况下，药物是合成配体。在一些情况下，药物以0.001μg/kg至10mg/kg的剂量施用。在一些情况下，神经疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、疼痛、肥胖症、厌食症、PTSD、GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、发作性睡病、尿失禁、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。
蛋白偶联受体或LGIC的内源性配体。在某些情况下，神经疾病不是癫痫症。在一些情况下，G蛋白偶联受体是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。在一些情况下，LGIC是GlyR-M、GluCl、PSAM-5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。在一些情况下，药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡(C28H32N2O5)、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平(olanzapine)、哌拉平(perlapine)、氟哌拉平(fluperlapine)、阿洛司琼(alosetron)、8-氯-11-[4-(1,1-二氘
代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e]
[1,4]二氮杂卓。在一些情况下，药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。在一些情况下，所述方法还包括在所述施用之前将编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子递送至受试者。在一些情
况下，G蛋白偶联受体或LGIC在可兴奋细胞中选择性表达。在某些情况下，可兴奋细胞包含
神经元或肌细胞。在某些情况下，神经元包含感觉神经元、背根神经节或三叉神经节。在一
些情况下，核酸分子通过病毒载体递送。在一些实例中，病毒载体是腺病毒载体、慢病毒载
体或腺相关病毒(AAV)载体。在一些实例中，AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。在一些情况下，
AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。在一些情况下，将核酸分子通
过非病毒方法递送给受试者。在一些情况下，非病毒方法是脂质转染、纳米粒子递送、粒子
轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。在某些情况下，药物是合成配体。在一些情况下，药物以0.001μg/kg至10mg/kg的剂量施用。在一些情况下，神经疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、疼痛、肥胖症、厌食症、PTSD、GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、发作性睡病、尿失禁、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。
[0016] 在又一方面，提供了一种用于治疗神经疾病的方法，其包括：将编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子递送给受试者，其中所述受试者异源表达G蛋白偶联受体或LGIC，并且
向受试者施用激活G蛋白偶联受体或LGIC的药物，由此治疗受试者中的神经疾病，其中所述
药物在递送编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子后的至少一周递送给受试者。在一些情
况下，编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子通过病毒载体递送给受试者。在一些情况下，
病毒载体是腺病毒载体、慢病毒载体或腺相关(AAV)病毒载体。在一些实例中，AAV载体是
AAV-6或AAV-9。在一些实例中，AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-
7m8。在一些情况下，将核酸分子通过非病毒方法递送给受试者。在一些情况下，非病毒方法是脂质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。在一些情况下，神经疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、疼痛、癫痫症、肥胖症、厌食症、PTSD、GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、嗜睡症、尿失禁、运动障碍、心房纤颤或脑癌。在一些情况下，药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡(C28H32N2O5)、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平、哌拉平、氟哌拉平、阿洛司琼、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-
5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。在一
些情况下，药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。在一些情况下，药物以0.001μg/kg至10mg/kg的剂量施用。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC在可兴奋细胞中选择性表达。在某些情
况下，可兴奋细胞是神经元或肌细胞。在某些情况下，神经元是感觉神经元、背根神经节或
三叉神经节。在一些情况下，所述方法进一步包括每天施用药物至少连续三天。
向受试者施用激活G蛋白偶联受体或LGIC的药物，由此治疗受试者中的神经疾病，其中所述
药物在递送编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子后的至少一周递送给受试者。在一些情
况下，编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子通过病毒载体递送给受试者。在一些情况下，
病毒载体是腺病毒载体、慢病毒载体或腺相关(AAV)病毒载体。在一些实例中，AAV载体是
AAV-6或AAV-9。在一些实例中，AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-
7m8。在一些情况下，将核酸分子通过非病毒方法递送给受试者。在一些情况下，非病毒方法是脂质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。在一些情况下，神经疾病是阿尔茨海默病、帕金森病、疼痛、癫痫症、肥胖症、厌食症、PTSD、GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、嗜睡症、尿失禁、运动障碍、心房纤颤或脑癌。在一些情况下，药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡(C28H32N2O5)、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平、哌拉平、氟哌拉平、阿洛司琼、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-
5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。在一
些情况下，药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。在一些情况下，药物以0.001μg/kg至10mg/kg的剂量施用。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC在可兴奋细胞中选择性表达。在某些情
况下，可兴奋细胞是神经元或肌细胞。在某些情况下，神经元是感觉神经元、背根神经节或
三叉神经节。在一些情况下，所述方法进一步包括每天施用药物至少连续三天。
[0017] 在又一方面，提供了一种用于治疗神经疾病的方法，其包括：向异源表达G蛋白偶联受体或LGIC的受试者施用激活G蛋白偶联受体或LGIC的药物，其中所述药物不是G蛋白偶
联受体或LGIC的内源性配体。在一些实施例中，药物不是κ-阿片类受体-(KOR)结合药物。在某些情况下，神经疾病不是癫痫症。在某些情况下，G蛋白偶联受体是除κ-阿片类受体(KOR)以外的G蛋白偶联受体。在某些情况下，异源G蛋白偶联受体是DREADD。在一些实例中，
DREADD是hM4Di、hM3Dq或AlstR。在一些情况下，LGIC是GlyR-M、GluCl、PSAM-5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。在一些情况下，药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡
(C28H32N2O5)、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平、哌拉平、氟哌拉平、阿洛司琼、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-
基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。在一些情况下，药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌
素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。在一些情况下，所述方法还包括在所述施用之前将编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子递
送至受试者。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC通过病毒载体递送。在一些情况下，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些
实例中，AAV载体是AAV-6或AAV-9。在一些实例中，AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。在一些情况下，将核酸分子通过非病毒方法递送给受试者。在一些情况
下，非病毒方法是脂质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。在某些情况下，神经疾病是疼痛。在其它情况下，神经疾病是饱腹感障碍。在一些实例中，饱腹感障碍是肥胖症、神经性厌食症或神经性贪食症。在其它情况下，神经疾病是阿尔茨海默病、
帕金森病、疼痛、癫痫、肥胖、厌食、PTSD、GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、嗜睡症、尿失禁、运动障碍、心房纤颤或脑癌。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC在可兴奋细胞中选择性表达。在一些实例中，可兴奋细胞是神经元或肌细胞。在某些
情况下，神经元是感觉神经元、背根神经节或三叉神经节。在一些情况下，施用包括口服、鞘内或局部施用。
联受体或LGIC的内源性配体。在一些实施例中，药物不是κ-阿片类受体-(KOR)结合药物。在某些情况下，神经疾病不是癫痫症。在某些情况下，G蛋白偶联受体是除κ-阿片类受体(KOR)以外的G蛋白偶联受体。在某些情况下，异源G蛋白偶联受体是DREADD。在一些实例中，
DREADD是hM4Di、hM3Dq或AlstR。在一些情况下，LGIC是GlyR-M、GluCl、PSAM-5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。在一些情况下，药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡
(C28H32N2O5)、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平、哌拉平、氟哌拉平、阿洛司琼、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-
基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。在一些情况下，药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌
素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。在一些情况下，所述方法还包括在所述施用之前将编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子递
送至受试者。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC通过病毒载体递送。在一些情况下，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些
实例中，AAV载体是AAV-6或AAV-9。在一些实例中，AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。在一些情况下，将核酸分子通过非病毒方法递送给受试者。在一些情况
下，非病毒方法是脂质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。在某些情况下，神经疾病是疼痛。在其它情况下，神经疾病是饱腹感障碍。在一些实例中，饱腹感障碍是肥胖症、神经性厌食症或神经性贪食症。在其它情况下，神经疾病是阿尔茨海默病、
帕金森病、疼痛、癫痫、肥胖、厌食、PTSD、GERD、成瘾、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、嗜睡症、尿失禁、运动障碍、心房纤颤或脑癌。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC在可兴奋细胞中选择性表达。在一些实例中，可兴奋细胞是神经元或肌细胞。在某些
情况下，神经元是感觉神经元、背根神经节或三叉神经节。在一些情况下，施用包括口服、鞘内或局部施用。
[0018] 另一方面，提供了一种治疗神经疾病的方法，包括向异源表达G蛋白偶联受体或LGIC的受试者施用激活G蛋白偶联受体或LGIC的药物，其中所述药物不是G蛋白偶联受体或
LGIC的内源性配体，并且其中G蛋白偶联受体或LGIC在感觉神经元、背根神经节、三叉神经
节、迷走神经、脑或肌细胞中选择性表达。在某些情况下，G蛋白偶联受体是DREADD。在一些实例中，DREADD是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。在一些情况下，LGIC是GlyR-M、GluCl、PSAM-5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。在一些情况下，药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡(C28H32N2O5)、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平、哌拉平、氟哌拉平、阿洛司琼、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或
11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。在一些情况下，药物是依维菌素、赛拉菌
素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。在一些情况下，所述方法还包括在所述施用之前将编码G蛋白偶联受体或LGIC的核
酸分子递送至受试者。在一些情况下，将核酸分子在病毒载体中递送给受试者。在某些情况
下，病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒(HSV)载
体。在一些实例中，AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。在一些实例中，AAV载体是AAV6(Y705+
731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。在一些情况下，将核酸分子通过非病毒方法递送给
受试者。在一些情况下，非病毒方法是脂质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。在某些情况下，神经疾病是疼痛。在其它情况下，神经疾病是癫痫。在另外一些情况下，神经疾病是饱腹感障碍。在一些实例中，饱腹感障碍是肥胖症、神经性厌食症或
神经性贪食症。在一些情况下，G蛋白偶联受体是Gi或Gq偶联的。在一些情况下，施用包含口服、鞘内或局部施用。在其它情况下，递送包含鞘内、神经节内、颅内、皮下、脊柱内、脑池内或神经内神经递送。在一些情况下，药物在递送后至少一周施用。在一些情况下，药物以
0.001μg/kg至10mg/kg的剂量施用。在一些情况下，核酸分子包含突触蛋白、TRPV1、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、CamKII、NSE或Advillin启动子。在某些情况下，受试者是人。
LGIC的内源性配体，并且其中G蛋白偶联受体或LGIC在感觉神经元、背根神经节、三叉神经
节、迷走神经、脑或肌细胞中选择性表达。在某些情况下，G蛋白偶联受体是DREADD。在一些实例中，DREADD是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。在一些情况下，LGIC是GlyR-M、GluCl、PSAM-5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。在一些情况下，药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡(C28H32N2O5)、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平、哌拉平、氟哌拉平、阿洛司琼、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或
11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。在一些情况下，药物是依维菌素、赛拉菌
素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。在一些情况下，所述方法还包括在所述施用之前将编码G蛋白偶联受体或LGIC的核
酸分子递送至受试者。在一些情况下，将核酸分子在病毒载体中递送给受试者。在某些情况
下，病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒(HSV)载
体。在一些实例中，AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。在一些实例中，AAV载体是AAV6(Y705+
731F+T492V)、AAV9(Y731F)或AAV-7m8。在一些情况下，将核酸分子通过非病毒方法递送给
受试者。在一些情况下，非病毒方法是脂质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理或显微注射。在某些情况下，神经疾病是疼痛。在其它情况下，神经疾病是癫痫。在另外一些情况下，神经疾病是饱腹感障碍。在一些实例中，饱腹感障碍是肥胖症、神经性厌食症或
神经性贪食症。在一些情况下，G蛋白偶联受体是Gi或Gq偶联的。在一些情况下，施用包含口服、鞘内或局部施用。在其它情况下，递送包含鞘内、神经节内、颅内、皮下、脊柱内、脑池内或神经内神经递送。在一些情况下，药物在递送后至少一周施用。在一些情况下，药物以
0.001μg/kg至10mg/kg的剂量施用。在一些情况下，核酸分子包含突触蛋白、TRPV1、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、CamKII、NSE或Advillin启动子。在某些情况下，受试者是人。
[0019] 在又一个方面，提供了一种治疗受试者的神经疾病的方法，包括向受试者递送编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子，并且向受试者施用激活G蛋白偶联受体或LGIC的药
物，其中所述药物是经过FDA批准的，但未经FDA批准用于治疗神经疾病。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC在受试者中表达。在一些情况下，G蛋白偶联受体在受试者中异源表达。
在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC在受试者中同源表达。在一些情况下，G蛋白偶联受体
或LGIC在受试者中异位表达。在某些情况下，G蛋白偶联受体是DREADD。在一些实例中，
DREADD是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。在一些情况下，LGIC是GlyR-M、GluCl、PSAM-
5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。
物，其中所述药物是经过FDA批准的，但未经FDA批准用于治疗神经疾病。在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC在受试者中表达。在一些情况下，G蛋白偶联受体在受试者中异源表达。
在一些情况下，G蛋白偶联受体或LGIC在受试者中同源表达。在一些情况下，G蛋白偶联受体
或LGIC在受试者中异位表达。在某些情况下，G蛋白偶联受体是DREADD。在一些实例中，
DREADD是hM4Di、hM3Dq、AlstR或KOR-DREADD。在一些情况下，LGIC是GlyR-M、GluCl、PSAM-
5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。
[0020] 另一方面，提供了一种治疗神经疾病的方法，其包含向异常表达G蛋白偶联受体或LGIC的受试者施用激活G蛋白偶联受体或LGIC的药物，其中所述药物以0.001μg/kg至10mg/
kg的剂量施用。在一些情况下，药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡(C28H32N2O5)、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平、哌拉平、氟哌拉平、阿洛司琼、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]
二氮杂卓。在一些情况下，药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。
kg的剂量施用。在一些情况下，药物是氯氮平-N-氧化物、纳呋拉啡(C28H32N2O5)、鼠尾草素B、咽侧体抑制素、氯氮平、奥氮平、哌拉平、氟哌拉平、阿洛司琼、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]
二氮杂卓。在一些情况下，药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。
[0021] 另一方面，提供了一种治疗神经疾病的方法，其包括向受试者递送编码G蛋白偶联受体或LGIC的核酸分子，并向受试者施用激活G蛋白偶联受体或LGIC，其中所述药物每天施
用给受试者至少连续三天。在一些情况下，药物在递送后至少一周施用于受试者。
用给受试者至少连续三天。在一些情况下，药物在递送后至少一周施用于受试者。
[0022] 在又一方面，提供了一种治疗神经疾病的方法，其包括向异源表达配体门控离子通道的受试者施用激活配体门控离子通道的药物。在某些情况下，药物不是甘氨酸、β-丙氨酸或牛磺酸。在一些方面，配体门控离子通道包含离子传导孔结构域和配体结合结构域，所
述离子传导孔结构域和配体结合结构域通过融合最初编码分离的多肽的两个或更多个多
核苷酸序列而形成。在一些实施例中，多核苷酸序列包含cys环受体基因家族的两个或更多
个成员。在一个实施例中，离子传导孔结构域传导阴离子。在另一个实施例中，离子传导孔
结构域传导阳离子。在一些情况下，配体结合结构域通过氯氮平-N-氧化物、氯氮平、哌拉
平、奥氮平、阿洛司琼、氟哌拉平或N4'-烷基取代的CNO类似物的结合而被激活。在某些方
面，配体结合结构域被尼古丁、伐尼克兰(varenicline)或加兰他敏(galantamine)的结合
所激活。
述离子传导孔结构域和配体结合结构域通过融合最初编码分离的多肽的两个或更多个多
核苷酸序列而形成。在一些实施例中，多核苷酸序列包含cys环受体基因家族的两个或更多
个成员。在一个实施例中，离子传导孔结构域传导阴离子。在另一个实施例中，离子传导孔
结构域传导阳离子。在一些情况下，配体结合结构域通过氯氮平-N-氧化物、氯氮平、哌拉
平、奥氮平、阿洛司琼、氟哌拉平或N4'-烷基取代的CNO类似物的结合而被激活。在某些方
面，配体结合结构域被尼古丁、伐尼克兰(varenicline)或加兰他敏(galantamine)的结合
所激活。
[0023] 在一些情况下，配体门控离子通道是GlyR-M、GluCl、PSAM-5HT3HC、PSAM-GlyR、PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。在一些情况下，药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌
22S 89S 9S
素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM 、PSEM 、PSEM 、辣椒素或唑吡坦。在一些情况下，所述方法还包括在施用之前将编码配体门控离子通道的核酸分子递送至受试者。在一
些情况下，通过病毒载体将核酸分子递送至受试者。在某些情况下，病毒载体是腺病毒载
体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些实例中，AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。在一些实例中，AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或
AAV-7m8。在一些方面，AAV载体包含SEQ ID NO:1。在一些情况下，将核酸分子通过非病毒方法递送给受试者。在一些情况下，非病毒方法是脂质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿
孔、超声处理或显微注射。在某些情况下，神经疾病是疼痛。在其它情况下，神经疾病是癫
痫。在其它情况下，神经疾病是饱腹感障碍。在一些实例中，饱腹感障碍是肥胖症、神经性厌食症或神经性贪食症。在其它一些情况下，神经疾病是阿尔茨海默氏病、帕金森病、创伤后
应激障碍(PTSD)、胃食管反流病(GERD)、成瘾、焦虑、抑郁、记忆丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、尿失禁、发作性睡病、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。在一些情况下，配体门控离子通道在可兴奋细胞中选择性表达。在某些情况下，可兴奋细胞是神经元或肌细胞。在
某些情况下，神经元是背根神经节、感觉神经元或三叉神经节。在一些情况下，施用包含口
服、鞘内或局部施用。在其它情况下，递送包含鞘内、神经节内、颅内、皮下、脊柱内、脑池内或神经内神经递送。在一些情况下，药物在递送后至少一周施用。在一些情况下，核酸分子
包含突触蛋白、TRPV1、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、CamKII、NSE或Advillin启动子。在某些情况下，受试者是人。在某些情况下，受试者是家畜动物。
22S 89S 9S
素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM 、PSEM 、PSEM 、辣椒素或唑吡坦。在一些情况下，所述方法还包括在施用之前将编码配体门控离子通道的核酸分子递送至受试者。在一
些情况下，通过病毒载体将核酸分子递送至受试者。在某些情况下，病毒载体是腺病毒载
体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体或单纯疱疹病毒(HSV)载体。在一些实例中，AAV载体来源于AAV-6或AAV-9。在一些实例中，AAV载体是AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV9(Y731F)或
AAV-7m8。在一些方面，AAV载体包含SEQ ID NO:1。在一些情况下，将核酸分子通过非病毒方法递送给受试者。在一些情况下，非病毒方法是脂质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿
孔、超声处理或显微注射。在某些情况下，神经疾病是疼痛。在其它情况下，神经疾病是癫
痫。在其它情况下，神经疾病是饱腹感障碍。在一些实例中，饱腹感障碍是肥胖症、神经性厌食症或神经性贪食症。在其它一些情况下，神经疾病是阿尔茨海默氏病、帕金森病、创伤后
应激障碍(PTSD)、胃食管反流病(GERD)、成瘾、焦虑、抑郁、记忆丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、尿失禁、发作性睡病、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤或脑癌。在一些情况下，配体门控离子通道在可兴奋细胞中选择性表达。在某些情况下，可兴奋细胞是神经元或肌细胞。在
某些情况下，神经元是背根神经节、感觉神经元或三叉神经节。在一些情况下，施用包含口
服、鞘内或局部施用。在其它情况下，递送包含鞘内、神经节内、颅内、皮下、脊柱内、脑池内或神经内神经递送。在一些情况下，药物在递送后至少一周施用。在一些情况下，核酸分子
包含突触蛋白、TRPV1、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、CamKII、NSE或Advillin启动子。在某些情况下，受试者是人。在某些情况下，受试者是家畜动物。
[0024] 另一方面，提供了一种治疗神经疾病的方法，包括向异常表达配体门控离子通道的受试者施用激活配体门控离子通道的药物，其中所述药物以0.001μg/kg至10mg/kg的剂
量施用。在一些情况下，配体门控离子通道是GlyR-M、GluCl、PSAM-5HT3HC、PSAM-GlyR、
PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。在一些情况下，药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。在某些情况下，神经疾病是疼痛。在某些情况下，疼痛得到缓解。
量施用。在一些情况下，配体门控离子通道是GlyR-M、GluCl、PSAM-5HT3HC、PSAM-GlyR、
PSAM-nAChR、TRPV1或GABAA。在一些情况下，药物是依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿巴美丁、莫西菌素、PSEM22S、PSEM89S、PSEM9S、辣椒素或唑吡坦。在某些情况下，神经疾病是疼痛。在某些情况下，疼痛得到缓解。
[0025] 在多个实施例中，本发明部分涵盖包含可在神经元细胞中操作的启动子的AAV载体，其中所述启动子与编码开关受体的多核苷酸可操作地连接。
[0026] 在具体的实施例中，启动子是神经元特异性启动子。
[0027] 在一些实施例中，神经元特异性启动子是在三叉神经节(TGG)神经元或背根神经节(DRG)神经元中可操作的启动子。
[0028] 在其它实施例中，神经元特异性启动子是hSYN1启动子、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIa启动子、微管蛋白αI启动子、神经元特异性烯醇酶启动子、血小板衍生生长因子β链启动子、TRPV1启动子、Nav1.7启动子、Nav1.8启动子、Nav1.9启动子或Advillin启动子。
[0029] 在具体的实施例中，神经元特异性启动子是hSYN1启动子。
[0030] 在另外的实施例中，启动子是组成型启动子。
[0031] 在具体的实施例中，组成型启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒猿病毒40(SV40)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病
毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自痘苗病毒的H5、P7.5或P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启
动子、早期生长反应1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶
(GAPDH)、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ
成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人ROSA26启动子、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启
动子或β-肌动蛋白启动子。
毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来自痘苗病毒的H5、P7.5或P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启
动子、早期生长反应1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶
(GAPDH)、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ
成员1(HSP90B1)、热休克蛋白70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人ROSA26启动子、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启
动子或β-肌动蛋白启动子。
[0032] 在一些实施例中，启动子是诱导型启动子。
[0034] 在另外的实施例中，开关受体包含配体门控离子通道或G偶联蛋白受体。
[0035] 在具体的实施例中，开关受体的活性受细胞外配体调节。
[0036] 在具体的实施例中，配体是非天然存在的或合成的。
[0037] 在其它实施例中，当细胞外配体结合开关受体时，表达开关受体的细胞的活性增加，任选地其中活性是电生理学活性。
[0038] 在某些实施例中，开关受体选自由hM3Dq、GsD、PSAM-5HT3HC、PSAM-nAChR或TRPV1组成的群组。
[0039] 在一些实施例中，所述配体选自由以下组成的群组：PSEM22S、PSEM9S、辣椒素、氯氮平、哌拉平、阿洛司琼、氟哌拉平、纳呋拉啡(C28H32N2O5)、奥氮平、氯氮平-N-氧化物、氯氮平-N-氧化物类似物：3-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、4-(8-
氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-
1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二
苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓和11-(4-乙基
哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-
1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二
苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓和11-(4-乙基
哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
[0040] 在具体的实施例中，当细胞外配体结合开关受体时，表达开关受体的细胞的活性降低，任选地其中活性是电生理学活性。
[0041] 在另外的实施例中，开关受体选自由以下组成的群组：AlstR、hM4Di、KORD、GluCl、PSAM-GlyR、GlyR-M和GABA。
[0042] 在某些实施例中，开关受体包含甘氨酸受体(GlyR)多肽的一或多个亚基。
[0043] 在一些实施例中，开关受体包含甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)多肽。
[0044] 在另外的实施例中，GlyRα1多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
[0045] 在具体的实施例中，GlyRα1多肽包含氨基酸取代F207A和A288G。在一些实施例中，开关受体包含包含一或多个以下氨基酸取代的GlyRα1亚基：A-1'E、P-2'Δ、T13'V、R19'E、F207A和A228G(参见伊斯兰(Islam)等人,ACS化学神经科学(ACS Chem.Neurosci.),DOI:
10.1021/acschemneuro.6b00168(2016))。在一个实施例中，开关受体包含包含氨基酸取代
A-1'E、F207A和A228G的GlyRα1亚基，并特异性结合配体依维菌素。在另一个实施例中、开关受体包含包含氨基酸取代A-1'E、P-2'Δ、T13'V、F207A和A228G的GlyRα1亚基，并特异性结合配体依维菌素。
10.1021/acschemneuro.6b00168(2016))。在一个实施例中，开关受体包含包含氨基酸取代
A-1'E、F207A和A228G的GlyRα1亚基，并特异性结合配体依维菌素。在另一个实施例中、开关受体包含包含氨基酸取代A-1'E、P-2'Δ、T13'V、F207A和A228G的GlyRα1亚基，并特异性结合配体依维菌素。
[0046] 在某些实施例中，配体选自由以下组成的群组：依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿维菌素和莫西菌素。
[0047] 在具体的实施例中，配体是依维菌素。
[0048] 开关受体包含GluClα或GluClβ多肽。
[0049] 在另外的实施例中，GluClα或GluClβ多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
[0050] 在另外的实施例中，配体选自由以下组成的群组：依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素、阿维菌素和莫西菌素。
[0051] 在具体的实施例中，开关受体包含PSAM-5HT3HC多肽。
[0052] 在具体的实施例中，PSAM-5HT3HC多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
[0053] 在一些实施例中，配体是PSEM22S。
[0054] 在某些实施例中，开关受体包含PSAM-GlyR多肽。
[0055] 在另外的实施例中，PSAM-GlyR多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
[0056] 在具体的实施例中，配体是PSEM89S。
[0057] 在一些实施例中，开关受体包含PSAM-nAChR多肽。
[0058] 在具体的实施例中，PSAM-nAChR多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
[0059] 在某些实施例中，配体是PSEM9S。
[0060] 在某些实施例中，开关受体包含TRPV1多肽。
[0061] 在另外的实施例中，TRPV1多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
[0062] 在其它实施例中，配体是辣椒素。
[0063] 在另外的实施例中，开关受体包含GABAA多肽。
[0064] 在其它实施例中，GABAA多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
[0065] 在具体的实施例中，配体是唑吡坦。
[0066] 在另外的实施例中，开关受体包含AlstR多肽。
[0067] 在一些实施例中，AlstR多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
[0068] 在其它实施例中，配体是咽侧体抑制素。
[0069] 在某些实施例中，开关受体包含hM4Di多肽。
[0070] 在其它实施例中，hM4Di多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
[0071] 在具体的实施例中，配体选自由以下组成的群组：CNO、氯氮平、哌拉平、奥氮平、阿洛司琼、氟哌拉平、纳呋拉啡(C28H32N2O5)和N4'-烷基取代的CNO类似物。
[0072] 在具体的实施例中，N4'-烷基取代的CNO类似物选自由以下组成的群组：3-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、4-(8-氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮
杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并
二氮杂卓、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、
11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓和11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,
e][1,4]二氮杂卓。
杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并
二氮杂卓、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、
11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓和11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,
e][1,4]二氮杂卓。
[0073] 在一些实施例中，开关受体包含KORD多肽。
[0074] 在另外的实施例中，KORD多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
[0075] 在一些实施例中，配体是鼠尾草素B。
[0076] 在某些实施例中，开关受体包含hM3Dq多肽。
[0077] 在另外的实施例中，hM3Dq多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
[0078] 在一些实施例中，配体选自由以下组成的群组：CNO、氯氮平、哌拉平、奥氮平、阿洛司琼、氟哌拉平、纳呋拉啡(C28H32N2O5)和N4'-烷基取代的CNO类似物。
[0079] 在具体的实施例中，N4'-烷基取代的CNO类似物选自由以下组成的群组：3-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、4-(8-氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮
杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并
二氮杂卓、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、
11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓和11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,
e][1,4]二氮杂卓。
杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并
二氮杂卓、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、
11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓和11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,
e][1,4]二氮杂卓。
[0080] 在某些实施例中，开关受体包含GsD多肽。
[0081] 在其它实施例中，GsD多肽包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代。
[0082] 在一些实施例中，配体选自由以下组成的群组：CNO、氯氮平、哌拉平、奥氮平、阿洛司琼、氟哌拉平、纳呋拉啡(C28H32N2O5)和N4'-烷基取代的CNO类似物。
[0083] 在另外的实施例中，N4'-烷基取代的CNO类似物选自由以下组成的群组：3-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、4-(8-氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮
杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并
二氮杂卓、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、
11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓和11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,
e][1,4]二氮杂卓。
杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并
二氮杂卓、8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、
11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓和11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,
e][1,4]二氮杂卓。
[0084] 在具体的实施例中，载体还包含编码表位标签的多核苷酸。
[0085] 在其它实施例中，表位标签选自由以下组成的群组：麦芽糖结合蛋白(“MBP”)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、HIS6、MYC、FLAG、V5、VSV-G和HA。
[0086] 在具体的实施例中，载体还包含聚(A)序列。
[0087] 在另外的实施例中，聚(A)序列是SV40聚(A)序列、牛生长激素聚(A)序列(bGHpA)或兔β-球蛋白聚(A)序列(rβgpA)。
[0088] 在具体的实施例中，聚(A)序列是bGHpA。
[0089] 在某些实施例中，AAV载体包含一或多个AAV2反向末端重复序列(ITR)。
[0090] 在一些实施例中，AAV载体包含选自由以下组成的群组的血清型：AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3(Y705+731F)、AAV5、AAV5(Y436+693+
719F)、AAV6、AAV6(VP3变体Y705F/Y731F/T492V)、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变体Y731F)、AAV10(Y733F)和AAV-ShH10。
719F)、AAV6、AAV6(VP3变体Y705F/Y731F/T492V)、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变体Y731F)、AAV10(Y733F)和AAV-ShH10。
[0091] 在另外的实施例中，AAV载体包含选自由AAV1、AAV5、AAV6、AAV6(Y705F/Y731F/T492V)、AAV8、AAV9和AAV9(Y731F)组成的群组的血清型。
[0092] 在某些实施例中，AAV载体包含选自由AAV6、AAV6(Y705F/Y731F/T492V)、AAV9和AAV9(Y731F)组成的群组的血清型。
[0093] 在其它实施例中，AAV载体包含AAV6或AAV6(Y705F/Y731F/T492V)血清型。
[0094] 在某些实施例中，启动子可在DRG神经元或TGG神经元中操作，并且开关受体包含GlyRα1多肽。
[0095] 在一些实施例中，启动子是hSYN-1启动子并且开关受体包含进一步包含氨基酸取代F207A和A288G的GlyRα1多肽。
[0096] 在特定的实施例中，AAV血清型是AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3(Y705+731F)、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3变体Y705F/Y731F/T492V)、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变体Y731F)、AAV10(Y733F)或AAV-ShH10，启动子是hSYN-1启动子，并且开关受体包含进一步包含氨基酸取代F207A和
A288G的GlyRα1多肽。
A288G的GlyRα1多肽。
[0097] 在多个实施例中，本发明部分涵盖包含一或多种AAV2ITR、AAV6血清型、hSYN-1启动子和编码进一步包含氨基酸取代F207A和A288G的GlyRα1多肽的多核苷酸的AAV载体。
[0098] 在多个实施例中，本发明部分涵盖包含一或多种AAV2ITR、AAV6(Y705F/Y731F/T492V)血清型、hSYN-1启动子和编码进一步包含氨基酸取代F207A和A288G的GlyRα1多肽的
多核苷酸的AAV载体。在一些方面，AAV载体包含SEQ ID NO:1。
多核苷酸的AAV载体。在一些方面，AAV载体包含SEQ ID NO:1。
[0099] 在一些实施例中，AAV载体还包含bGHpA。
[0100] 在某些实施例中，AAV载体还包含FLAG表位标签。
[0101] 在某些实施例中，AAV载体是自我互补的AAV(scAAV)载体。
[0102] 在各种实施例中，本发明部分涵盖包含一或多种本文所述载体的组合物。
[0103] 在各种实施例中，本发明部分涵盖一种管理、预防或治疗受试者疼痛的方法，其包含向受试者施用本文所述的AAV载体。
[0104] 在各种实施例中，本发明部分涵盖一种为患有疼痛的受试者提供止痛的方法，其包含向受试者施用本文所述的AAV载体。
[0105] 在其它实施例中，疼痛是急性疼痛或慢性疼痛。
[0106] 在一些实施例中，疼痛是慢性疼痛。
[0107] 在具体的实施例中，疼痛是急性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛、异常性疼痛、炎症性疼痛、炎性痛觉过敏、神经病、神经痛、糖尿病性神经病、人免疫缺陷病毒相关性神经病、神经损伤、类风湿性关节炎疼痛、骨关节炎疼痛、烧伤、背痛、眼痛、内脏痛、癌症疼痛(例如骨癌疼痛)、牙痛、头痛、偏头痛、腕管综合症、纤维肌痛、神经炎、坐骨神经痛、骨盆过敏症、骨盆疼痛、疱疹后神经痛、术后疼痛、中风后疼痛或月经疼痛。
[0108] 在另外的实施例中，疼痛是伤害性疼痛。
[0109] 在某些实施例中，疼痛是选自由以下组成的群组的伤害性疼痛：中枢神经系统创伤、拉伤/扭伤、烧伤、心肌梗塞和急性胰腺炎、手术后疼痛(任何类型的外科手术后的疼
痛)、创伤后疼痛、肾绞痛、癌症疼痛和背痛。
痛)、创伤后疼痛、肾绞痛、癌症疼痛和背痛。
[0110] 在一些实施例中，疼痛是神经性疼痛。
[0111] 在另外的实施例中，神经性疼痛的病因学选自由以下组成的群组：周围神经病、糖尿病性神经病、疱疹后神经痛、三叉神经痛、背痛、癌症神经病、HIV神经病、幻肢痛、腕管综合症、中枢性中风后疼痛和与慢性酒精中毒有关的疼痛、甲状腺功能减退症、尿毒症、多发
性硬化症、脊髓损伤、帕金森病、癫痫症和维生素缺乏症。
性硬化症、脊髓损伤、帕金森病、癫痫症和维生素缺乏症。
[0112] 在具体的实施例中，神经性疼痛与选自以下的疼痛疾病有关：关节炎、异常性疼痛、典型的三叉神经痛、三叉神经痛、躯体形式障碍、假性、痛觉过敏、神经痛、神经炎、神经原性疼痛、止痛、麻醉性麻醉、疼痛、坐骨神经痛、精神障碍、纤维肌痛、内脏疾病、慢性疼痛、偏头痛/头痛、慢性疲劳综合症、复杂区域疼痛综合症、神经营养不良、足底筋膜炎或与癌症相关的疼痛。
[0113] 在其它实施例中，疼痛是炎性疼痛。
[0114] 在某些实施例中，疼痛与肌肉骨骼病症、肌痛、纤维肌痛、脊柱炎、血清阴性(非类风湿)关节病、非关节风湿病、肌营养不良症、糖原分解、多肌炎和肌炎有关、心脏和血管疼痛、由心绞痛、心肌梗塞、二尖瓣狭窄、心包炎、雷诺氏现象、硬化症和骨骼肌缺血引起的疼痛、头痛、偏头痛、丛集性头痛、紧张型头痛、混合性头痛和与血管疾病相关的头痛、口面疼痛、牙痛、耳部疼痛、灼口综合症和颞下颌肌筋膜疼痛。
[0115] 在具体的实施例中，方法包括鞘内施用本文涵盖的AAV载体或组合物。
[0116] 在具体的实施例中，方法包括神经节内施用本文涵盖的AAV载体或组合物。
[0118] 图1描绘了利用本文揭示的组合物的本发明的方法。图1描绘了本发明的治疗性‘开关’受体(例如，G蛋白偶联受体或配体门控离子通道)经由病毒载体进入与损伤的周围
神经相关的背根神经节的遗传插入以及激活‘开关’与生物惰性化合物沉默神经沟通与中
枢神经系统，从而有效地提供镇痛和阻止痛苦的感觉。
神经相关的背根神经节的遗传插入以及激活‘开关’与生物惰性化合物沉默神经沟通与中
枢神经系统，从而有效地提供镇痛和阻止痛苦的感觉。
[0119] 图2A-2C描绘了用于递送本发明的开关受体的AAV转移载体系统结构的非限制性实例，其包括(图2A)驱动hM4Di表达的人突触蛋白(hSYN)启动子、(图2B)hSYN-hM3Dq和(图
2C)hSYN-hGlyR(F207A/A288G)。
2C)hSYN-hGlyR(F207A/A288G)。
[0120] 图3描绘了可以用于使用本文所述的方法和组合物治疗神经疾病的经过FDA批准的药物的非限制性实例。
[0121] 图4描绘了本文涵盖的示例性基因治疗载体的图。
[0122] 图5描述了hSYN1-GlyRα1F207A/A288G基因治疗载体的图。
[0123] 图6描绘了脊髓和皮肤以及深部组织中疼痛神经元和路径的图。图6还显示免疫组织化学分析在脊髓内，神经节内和鞘内三种给药途径之后在背角和背根神经节神经元中表
达hSYN-hGlyRM(F207A/A288G)的AAV6(Y705+731F+T492V)注射后小鼠中的数周。
达hSYN-hGlyRM(F207A/A288G)的AAV6(Y705+731F+T492V)注射后小鼠中的数周。
[0124] 图7描绘了小鼠中的遗留神经损伤(SNI)模型的图。图7还描绘了图，其显示与未损伤的对侧对照相比，注射SWB001(表达hSYN-hGlyRM(F207A/A288G)的AAV6载体)的小鼠SNI
模型中机械超敏反应测定(Von Frey)的结果。在神经损伤后7-10天，在神经损伤后腹膜内
注射单次剂量依维菌素(15mg/kg)以提供镇痛。
模型中机械超敏反应测定(Von Frey)的结果。在神经损伤后7-10天，在神经损伤后腹膜内
注射单次剂量依维菌素(15mg/kg)以提供镇痛。
[0125] 图8描绘了图，其显示与未损伤的对侧对照相比，注射SWB001(表达hSYN-hGlyRM(F207A/A288G)的AAV6载体)的小鼠SNI模型中机械超敏反应测定(Von Frey)的结果。在图7
描述的实验中冲洗依维菌素后，疼痛阈值恢复至基线水平后，腹膜内注射重复剂量的依维
菌素(10mg/kg)以在神经损伤后14天提供镇痛。
描述的实验中冲洗依维菌素后，疼痛阈值恢复至基线水平后，腹膜内注射重复剂量的依维
菌素(10mg/kg)以在神经损伤后14天提供镇痛。
[0127] 图10描绘了显示实例22中描述的热撤回潜伏期测定的平均受试者结果的图。左侧显示依维菌素治疗前结果，右侧显示依维菌素治疗后结果。
具体实施方式
[0128] A.概述
[0129] 本发明提供了用于治疗神经疾病和病症的组合物和方法。所述组合物通常包括在本文中称为“开关受体”的治疗性受体。在一些实例中，开关受体是G蛋白偶联受体(GPCR)或配体门控离子通道(LGIC)。本文的组合物和方法可以特别用作例如治疗神经疾病的基因治
疗。在一些情况下，所述方法提供将组合物施用给有需要的受试者。有需要的受试者可以是
患有神经疾病的受试者。在一些情况下，开关受体在患有神经疾病的受试者中表达。所述方
法进一步提供用激活表达的开关受体的配体治疗受试者。用配体处理可以改变例如表达开
关受体的可兴奋细胞(例如神经元、肌肉细胞)的电生理学活性，由此治疗神经疾病。
疗。在一些情况下，所述方法提供将组合物施用给有需要的受试者。有需要的受试者可以是
患有神经疾病的受试者。在一些情况下，开关受体在患有神经疾病的受试者中表达。所述方
法进一步提供用激活表达的开关受体的配体治疗受试者。用配体处理可以改变例如表达开
关受体的可兴奋细胞(例如神经元、肌肉细胞)的电生理学活性，由此治疗神经疾病。
[0130] 在一些实施例中，本发明一般涉及用于管理疼痛的基因治疗。本文涵盖的基因治疗组合物和方法提供了对疼痛路径中涉及的神经元细胞的精确时空控制，并且因此与现有
疗法相比还提供了许多优点。不希望受任何特定理论束缚，预期递送靶向神经元细胞的基
因治疗可以在延长的持续时间内介导疼痛缓解，减少副作用并通过将患者从外部泵和危险
程序中解放来改善生活质量。此外，与常规药物等效物相比，基因治疗还提供了许多有效负
载优点，例如某些较大的蛋白质可能不能作为重组产物或小分子类似物获得，但可以作为
治疗基因在载体中被编码和递送。
疗法相比还提供了许多优点。不希望受任何特定理论束缚，预期递送靶向神经元细胞的基
因治疗可以在延长的持续时间内介导疼痛缓解，减少副作用并通过将患者从外部泵和危险
程序中解放来改善生活质量。此外，与常规药物等效物相比，基因治疗还提供了许多有效负
载优点，例如某些较大的蛋白质可能不能作为重组产物或小分子类似物获得，但可以作为
治疗基因在载体中被编码和递送。
[0131] 在各种实施例中，提供了包含一或多种能够在神经元细胞中表达转录物的表达控制序列的病毒载体，所述表达控制序列与编码开关受体的多核苷酸可操作地连接。本发明
涵盖结合外源提供的和/或非天然存在的配体的开关受体可以使用病毒载体递送至神经元
细胞，并且可以用于调节神经元细胞的活性，例如电生理学活性，以安全且有效地管理受试
者的疼痛。
涵盖结合外源提供的和/或非天然存在的配体的开关受体可以使用病毒载体递送至神经元
细胞，并且可以用于调节神经元细胞的活性，例如电生理学活性，以安全且有效地管理受试
者的疼痛。
[0132] 在具体的实施例中，提供包括腺相关病毒(AAV)载体的细小病毒载体，所述腺相关病毒(AAV)载体包含在神经元细胞中有活性的表达控制元件，其与包含配体门控离子通道、
g蛋白偶联受体(GPCR)或亚基和/或其突变蛋白的开关受体可操作地连接。
g蛋白偶联受体(GPCR)或亚基和/或其突变蛋白的开关受体可操作地连接。
[0133] 本文考虑的载体和组合物用于减弱受试者的疼痛感。在各种实施例中，疼痛是急性疼痛或慢性疼痛。慢性疼痛可以是伤害性疼痛或神经性疼痛。在一个实施例中，疼痛是神
经性疼痛。疼痛也可以是孤立的疼痛，或者疼痛可以与特定的疾病相关联。
经性疼痛。疼痛也可以是孤立的疼痛，或者疼痛可以与特定的疾病相关联。
[0134] 因此，本发明解决了改善基因治疗在疼痛管理中的安全性和有效性的未满足的临床需求。
[0135] 除非明确指示为相反，否则本发明的实践将采用本技术内的分子生物学和重组DNA技术的常规方法，下文中出于说明的目的对其中许多进行了描述。在文献中全面解释了
这些技术。参见例如桑布鲁克(Sambrook)等人,分子克隆：实验室手册(Molecular
Cloning:A Laboratory Manual)(第2版,1989)；马尼亚蒂斯(Maniatis)等人,分子克隆：实
验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(1982)；DNA克隆：实用方法(DNA
Cloning:A Practical Approach),第I和II卷(D.格拉夫(D.Glover)编辑)；寡核苷酸合成
(Oligonucleotide Synthesis)(N.盖特(N.Gait)编辑,1984)；核酸杂交(Nucleic Acid
Hybridization)(B.哈马斯(B.Hames)和S.希金斯(S.Higgins)编辑,1985)；转录和翻译
(Transcription and Translation)(B.哈马斯(B.Hames)和S.希金斯(S.Higgins)编辑,
1984)；动物细胞培养(Animal Cell Culture)(R.弗雷什尼(R.Freshney)编辑,1986)；分子
克隆的实用指导(A Practical Guide to Molecular Cloning)(B.培波尔(B.Perbal)编
辑,1984)；哈洛和兰恩(Harlow and Lane)编辑(1988)抗体，实验室手册：酶学的系列方法
(Antibodies,A Laboratory Manual；the series Methods In Enzymology)(美国学术出
版社(Academic Press,Inc.))；PCR 2：实用方法(PCR 2:A Practical Approach)
(M.J.MacPherson,B.D.哈姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995)).
这些技术。参见例如桑布鲁克(Sambrook)等人,分子克隆：实验室手册(Molecular
Cloning:A Laboratory Manual)(第2版,1989)；马尼亚蒂斯(Maniatis)等人,分子克隆：实
验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(1982)；DNA克隆：实用方法(DNA
Cloning:A Practical Approach),第I和II卷(D.格拉夫(D.Glover)编辑)；寡核苷酸合成
(Oligonucleotide Synthesis)(N.盖特(N.Gait)编辑,1984)；核酸杂交(Nucleic Acid
Hybridization)(B.哈马斯(B.Hames)和S.希金斯(S.Higgins)编辑,1985)；转录和翻译
(Transcription and Translation)(B.哈马斯(B.Hames)和S.希金斯(S.Higgins)编辑,
1984)；动物细胞培养(Animal Cell Culture)(R.弗雷什尼(R.Freshney)编辑,1986)；分子
克隆的实用指导(A Practical Guide to Molecular Cloning)(B.培波尔(B.Perbal)编
辑,1984)；哈洛和兰恩(Harlow and Lane)编辑(1988)抗体，实验室手册：酶学的系列方法
(Antibodies,A Laboratory Manual；the series Methods In Enzymology)(美国学术出
版社(Academic Press,Inc.))；PCR 2：实用方法(PCR 2:A Practical Approach)
(M.J.MacPherson,B.D.哈姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995)).
[0136] 本文引用的所有出版物、专利和专利申请以全文引用方式并入本文。
[0137] B.定义
[0138] 除非另外规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本发明本领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。为了本发明的目的，下文定义以下术语。
[0139] 冠词“一(a)”、“一(an)”和“所述”在本文中用于指该冠词的一个或多于一个(即至少一个)的语法对象。举例来说，“一元件”是指一个元件或多于一个元件。
[0140] 替代物(例如，“或”)的使用应理解为是指这些替代物中的任一个、两者或其任何组合。
[0141] 术语“和/或”应被理解为是指一个或两个替代物。
[0142] 如本文所使用的，术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比变化多达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比约±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±
1％的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。
1％的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。
[0143] 在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包括所陈述的步骤或要素或步骤或
要素组，但不排除任何其它步骤或要素或步骤或要素组。在特定实施例中，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”被同义使用。
要素组，但不排除任何其它步骤或要素或步骤或要素组。在特定实施例中，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”被同义使用。
[0144] “由……组成”打算包括并且限于短语“由……组成”之后的任何事物。因此，短语“由……组成”指示所列要素为需要或必需的，并且不能存在其它要素。
[0145] “基本上由……组成”打算包括短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响本发明中规定的所列要素的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”表示列
出的要素是必需的或强制性的，但是没有其它要素是任选的并且可能存在或可能不存在，
这取决于它们是否影响所列要素的活性或作用。
出的要素是必需的或强制性的，但是没有其它要素是任选的并且可能存在或可能不存在，
这取决于它们是否影响所列要素的活性或作用。
[0146] 贯穿本说明书对“一个实施例”、“实施例”、“特定实施例”、“相关实施例”、“某个实施例”、“附加实施例”或“另一个实施例”或其组合的引用意味着结合该实施例描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施例中。因此，贯穿本说明书在各个地方出现的前述短语不一定都指的是相同的实施例。此外，在一个或一个以上实例中，特定特征、
结构或特性可以任何合适方式组合。
结构或特性可以任何合适方式组合。
[0147] 如本文所用，术语“分离的”是指大体上或基本上不含通常伴随其天然状态的组分的物质。在具体的实施例中，术语“获得的”或“衍生的”与“分离的”同义地使用。
[0148] 术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文中可互换使用，指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括(但不限于)鼠类、猿猴、人类、农畜、运动动物以及宠物。也涵盖体内获得的或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。如本文所用，“受试者”、“患者”或“个体”包括表现出可用本文涵盖的载体、组合物和方法治疗的疼痛的任何动物。合适的受试者(例如患者)包括实验室动物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物
(例如猫或狗)。包括非人类灵长类动物，并且优选地人类患者。
(例如猫或狗)。包括非人类灵长类动物，并且优选地人类患者。
[0149] 如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括与疼痛减轻相关的任何有益的或期望的效果，并且可以甚至包括最小程度的疼痛减轻。治疗可以任选地包括减
轻或缓解疼痛，或延迟疼痛的进展。“治疗”不一定表示完全根除或治愈疾病或病症或其相
关症状。
轻或缓解疼痛，或延迟疼痛的进展。“治疗”不一定表示完全根除或治愈疾病或病症或其相
关症状。
[0150] 如本文所用，“预防(prevent)”以及诸如“预防(prevented)”、“预防(preventing)”等类似词语表示用于预防、抑制或减少疼痛发生或复发的可能性的方法。它
也指延迟疾病或病症的发作或复发或延迟疼痛症状的发生或复发。如本文所用，“预防”和
类似的词语还包括在发作或复发之前减轻疼痛的强度、效果、症状和/或负担。
也指延迟疾病或病症的发作或复发或延迟疼痛症状的发生或复发。如本文所用，“预防”和
类似的词语还包括在发作或复发之前减轻疼痛的强度、效果、症状和/或负担。
[0151] 如本文所用，“管理”或“控制”疼痛是指使用本文涵盖的组合物或方法，通过为患有疼痛的受试者提供镇痛来改善个体的生活质量。
[0152] 如本文所用，术语“量”是指病毒实现有益或期望的预防或治疗结果，包括临床结果的“有效的量(an amount effective)”或“有效量(an effective amount)”。
[0153] “预防有效量”是指有效获得所需预防结果的病毒量。典型地但未必，因为预防性剂量在疾病之前或在疾病的较早阶段用于受试者，所以预防有效量小于治疗有效量。
[0154] 病毒的“治疗有效量”可根据诸如疾病状态、年龄、性别和个体体重等因素以及干细胞和祖细胞在个体中引起期望的反应的能力而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果
超过病毒的任何毒性或有害作用的量。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”受试者(例如患者)的量。
超过病毒的任何毒性或有害作用的量。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”受试者(例如患者)的量。
[0155] 生理学反应(例如电生理学活性或细胞活性)的“增加”或“增强”量通常是“统计学显著”量，并且可以包括比未处理细胞中的活性水平增加1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如500、1000倍)(包括之间和超过1的所有整数和小数点，例如
1.5、1.6、1.7、1.8等)。
1.5、1.6、1.7、1.8等)。
[0156] 生理学反应(例如电生理学活性或细胞活性)的“增加”或“增强”量通常是“统计学显著”量，并且可以包括比未处理细胞中的活性水平增加1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如500、1000倍)(包括之间和超过1的所有整数和小数点，例如
1.5、1.6、1.7、1.8等)。
1.5、1.6、1.7、1.8等)。
[0157] “维持(maintain)”或“保持(preserve)”或“维持(maintenance)”或“无变化”或“无显著变化”或“无显著减少”通常是指与由任一媒剂或对照分子/组合物引起的反应相当的生理反应。相当的反应是与参考反应并无显著不同或可测量不同的反应。
[0158] 如本文所用，术语“可兴奋细胞”是指由于门控离子通道而经历其膜电位波动的细胞。本文涵盖的可兴奋细胞的说明性实例包括但不限于肌细胞、神经元细胞等。
[0159] 在具体的实施例中，神经元细胞是感觉神经元。感觉神经元的说明性实例包括但不限于背根神经节(DRG)神经元和三叉神经节(TGG)神经元。在一个实施例中，神经元细胞
是外周感觉神经元。在一个实施例中，神经元细胞是抑制性中间神经元。
是外周感觉神经元。在一个实施例中，神经元细胞是抑制性中间神经元。
[0160] “G蛋白偶联受体”或“GPCR”意指这样的受体，其在其天然肽或非肽配体结合和受体激活后，转导G蛋白介导的信号，导致生理性细胞反应(例如细胞增殖或分泌)。G蛋白偶联
受体形成进化上的相关蛋白的大家族。作为G蛋白偶联受体家族成员的蛋白质通常由7个推
定的跨膜结构域组成。G蛋白偶联受体在本领域中也称为“七跨膜片段(7TM)受体”和“七螺
旋受体”。
受体形成进化上的相关蛋白的大家族。作为G蛋白偶联受体家族成员的蛋白质通常由7个推
定的跨膜结构域组成。G蛋白偶联受体在本领域中也称为“七跨膜片段(7TM)受体”和“七螺
旋受体”。
[0161] “配体门控离子通道”是指一大组固有跨膜蛋白质，允许特定化学物质激活后离子通过。大多数内源性配体与不同于离子传导孔的位点结合，并且结合直接引起通道的打开
或关闭。内源性配体可以在细胞外结合，例如谷氨酸、ACh和GABA，或在细胞内结合，例如Ca2+激活的钾通道上的Ca2+。重要的是，要注意配体本身不被穿过膜转运。配体结合引起通道对
一或多个特定离子的渗透性的剧烈变化；当它无效时，有效地没有离子可以通过通道，但最
多每秒107个离子可以在配体结合时被允许通过。
或关闭。内源性配体可以在细胞外结合，例如谷氨酸、ACh和GABA，或在细胞内结合，例如Ca2+激活的钾通道上的Ca2+。重要的是，要注意配体本身不被穿过膜转运。配体结合引起通道对
一或多个特定离子的渗透性的剧烈变化；当它无效时，有效地没有离子可以通过通道，但最
多每秒107个离子可以在配体结合时被允许通过。
[0162] “受体-配体结合”、“配体结合”和“结合”在本文中可互换使用以表示受体(例如，G蛋白偶联受体)与配体(例如天然配体(例如，肽配体)或合成配体(例如合成小分子配体))的物理相互作用。配体结合可以通过本领域已知的多种方法测量(例如，检测与放射性标记
的配体的缔合)。
的配体的缔合)。
[0163] “结合亲和力”通常是指受体的单个结合位点和配体之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如受体和配体)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常
数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的那些方法。
数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的那些方法。
[0164] 如本文所用，术语“特异性结合亲和力(specific binding affinity)”或“特异性结合(specifically binds)”或“特异性结合(specifically bound)”或“特异性结合
(specific binding)”在整个说明书和权利要求书中可互换使用，并且指在配对物种分子
例如受体和配体之间发生的结合。当两种物种的相互作用产生非共价结合的复合物时，发
生的结合通常是静电结合、氢键结合或亲脂相互作用的结果。在各种实施例中，一或多种物
种之间的特异性结合是直接的。在一个实施例中，特异性结合的亲和力比背景结合(非特异
性结合)高约2倍，比背景结合高约5倍，比背景结合高约10倍，比背景结合高约20倍，比背景结合高约50倍，比背景结合高约100倍，或者比背景结合高约1000倍或更高倍数。
(specific binding)”在整个说明书和权利要求书中可互换使用，并且指在配对物种分子
例如受体和配体之间发生的结合。当两种物种的相互作用产生非共价结合的复合物时，发
生的结合通常是静电结合、氢键结合或亲脂相互作用的结果。在各种实施例中，一或多种物
种之间的特异性结合是直接的。在一个实施例中，特异性结合的亲和力比背景结合(非特异
性结合)高约2倍，比背景结合高约5倍，比背景结合高约10倍，比背景结合高约20倍，比背景结合高约50倍，比背景结合高约100倍，或者比背景结合高约1000倍或更高倍数。
[0165] “信号传导”是指由于配体结合(例如，由于配体与开关受体结合)而产生的生物化学或生理学反应。
[0166] 术语“触发”是指在物理或化学刺激之后打开受体以允许离子被动地通过受体从较高离子浓度的区域递送到较低浓度的区域。
[0167] 通常，“序列同一性”或“序列同源性”分别指两个多核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的对应关系。通常，用于确定序列同一性的技术包括确定多核苷酸的核苷酸序列和/或确定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二核苷酸或
氨基酸序列进行比较。可以通过确定它们的“百分比同一性”来比较两个或更多个序列(多
核苷酸或氨基酸)。两个序列(无论是核酸还是氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序
列之间精确匹配的数量除以较短序列的长度并乘以100。例如，还可以通过使用可从美国国
家健康研究所(National Institutes of Health)获得的高级BLAST计算机程序(包括版本
2.2.9)比较序列信息来确定同一性百分比。BLAST程序是基于卡林和阿特休尔(Karlin and
Altschul),美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:2264-2268(1990)的比对
方法并且在阿特休尔(Altschul)等人,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215:403-410
(1990)；卡林和阿特休尔(Karlin and Altschul),美国国家科学院院刊
(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 90:5873-5877(1993)；和阿特休尔(Altschul)等人,核酸研究
(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402(1997)有所描述。简而言之，BLAST程序将同一性定义
为相同比对的符号(通常为核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短者的总符号数。该
程序可用于确定所比较蛋白质的整个长度上的百分比同一性。默认参数被提供来优化用例
如blastp程序中的短查询序列的搜索。所述程序还允许使用SEG过滤器遮蔽查询序列的段，
如由伍顿和费德恒(Wootton and Federhen),计算机和化学(Computers and Chemistry)
17:149-163(1993)的SEG程序所确定的。序列同一性的期望程度的范围约为80％至100％以
及其间的整数值。通常，公开的序列和要求保护的序列之间的同一性百分比为至少80％、至
少85％、至少90％、至少95％或至少98％。
氨基酸序列进行比较。可以通过确定它们的“百分比同一性”来比较两个或更多个序列(多
核苷酸或氨基酸)。两个序列(无论是核酸还是氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序
列之间精确匹配的数量除以较短序列的长度并乘以100。例如，还可以通过使用可从美国国
家健康研究所(National Institutes of Health)获得的高级BLAST计算机程序(包括版本
2.2.9)比较序列信息来确定同一性百分比。BLAST程序是基于卡林和阿特休尔(Karlin and
Altschul),美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87:2264-2268(1990)的比对
方法并且在阿特休尔(Altschul)等人,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215:403-410
(1990)；卡林和阿特休尔(Karlin and Altschul),美国国家科学院院刊
(Proc.Natl.Acad.Sci.)USA 90:5873-5877(1993)；和阿特休尔(Altschul)等人,核酸研究
(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402(1997)有所描述。简而言之，BLAST程序将同一性定义
为相同比对的符号(通常为核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中较短者的总符号数。该
程序可用于确定所比较蛋白质的整个长度上的百分比同一性。默认参数被提供来优化用例
如blastp程序中的短查询序列的搜索。所述程序还允许使用SEG过滤器遮蔽查询序列的段，
如由伍顿和费德恒(Wootton and Federhen),计算机和化学(Computers and Chemistry)
17:149-163(1993)的SEG程序所确定的。序列同一性的期望程度的范围约为80％至100％以
及其间的整数值。通常，公开的序列和要求保护的序列之间的同一性百分比为至少80％、至
少85％、至少90％、至少95％或至少98％。
[0168] 如本文所用，术语“生物药物”是指包括可用作药物或治疗剂的生物或生物医学产品的任何组合物。生物制剂可以是任何可用作治疗剂的生物制剂。生物制剂可以是从生物
来源制造、提取或半合成的任何药剂。生物制剂可以包括但不限于蛋白质、核酸分子、细胞、组织、疫苗、血液或血液成分、过敏原、基因治疗、重组蛋白质和重组核酸分子。生物药物可以包括另外的药剂，包括但不限于另外的治疗剂(生物或合成的化学药剂)、赋形剂等。
来源制造、提取或半合成的任何药剂。生物制剂可以包括但不限于蛋白质、核酸分子、细胞、组织、疫苗、血液或血液成分、过敏原、基因治疗、重组蛋白质和重组核酸分子。生物药物可以包括另外的药剂，包括但不限于另外的治疗剂(生物或合成的化学药剂)、赋形剂等。
[0169] 术语“外源的”在本文中用于指源自生物体外部的任何分子，包括核酸、蛋白质或肽、小分子化合物等。相反，术语“内源的”是指源自生物体内部(即，由生物体天然产生)的任何分子。
[0170] 术语“异源表达”和“异源地表达”在本文中用于指通常不表达所述蛋白质的受试者中的蛋白质表达。异源表达还可以指受试者中蛋白质的表达，其中蛋白质来源于表达蛋
白质的受试者以外的物种。异源表达可涉及通过本领域技术人员已知的任何方式将外源核
酸分子递送至受试者，包括病毒载体递送、电穿孔、感染、转染等。
白质的受试者以外的物种。异源表达可涉及通过本领域技术人员已知的任何方式将外源核
酸分子递送至受试者，包括病毒载体递送、电穿孔、感染、转染等。
[0171] 术语“同源表达”和“同源地表达”在本文中用于指通常表达所述蛋白质的受试者中蛋白质的过表达。同源表达可以包括“异位表达”，其在本文中用于指蛋白质的同源表达，其中蛋白质在通常不表达所述蛋白质的受试者的宿主细胞中表达(例如，仅在受试者的心
肌细胞中发现的蛋白质在受试者的脑细胞中表达)。
肌细胞中发现的蛋白质在受试者的脑细胞中表达)。
[0172] 术语“野生型”在本文中用于指与自然界中发现的蛋白质相同或基本相同的分子，通常为蛋白质。一般以与通常在自然界中发现的蛋白质的序列同一性或同源性的百分比来
测量蛋白质的身份。因此，可以将野生型蛋白质想象为与通常在自然界中发现的蛋白质具
有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％的序列同源性的蛋白质。
测量蛋白质的身份。因此，可以将野生型蛋白质想象为与通常在自然界中发现的蛋白质具
有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％的序列同源性的蛋白质。
[0173] C.组合物
[0174] 在一些方面，本文的揭示内容提供了用于治疗神经疾病或病症的组合物。本文设想的组合物通常包括可用于治疗神经疾病的治疗剂。本发明的治疗剂可以是递送给受试者
的任何分子(例如蛋白质、RNA、DNA)。在某些情况下，受试者是患有神经疾病或病症的患者。
治疗剂可用于治疗神经疾病或可用于缓解神经疾病的症状。在某些情况下，受试者是健康
的，并且治疗剂被用作预防性治疗以预防神经疾病的发作。通常，将治疗剂递送给受试者以
在受试者中引起治疗反应。在一些实施例中，组合物用于治疗疼痛。
的任何分子(例如蛋白质、RNA、DNA)。在某些情况下，受试者是患有神经疾病或病症的患者。
治疗剂可用于治疗神经疾病或可用于缓解神经疾病的症状。在某些情况下，受试者是健康
的，并且治疗剂被用作预防性治疗以预防神经疾病的发作。通常，将治疗剂递送给受试者以
在受试者中引起治疗反应。在一些实施例中，组合物用于治疗疼痛。
[0175] D.开关受体
[0176] 在各种示例性实施例中，本发明部分涵盖了编码开关受体的多核苷酸和包含其的载体以及这些组合物用于调节神经元细胞活性的用途。如本文所用，术语“开关受体”是指G蛋白偶联受体(GPCR)、仅由合成配体(RASSL)激活的受体、由设计者药物(DREADD)专门激活
的设计者受体和/或配体门控离子通道(LGIC)和/或其突变蛋白。在一些方面，开关受体的
一或多个亚基已被工程化以特异性结合异源配体、外源配体和/或合成配体。在具体的实施
例中，“开关受体”是指工程化为特异性结合异源、外源和/或合成配体的GPCR、RASSL、
DREADD或LGIC或其突变蛋白的一或多个亚基。本文考虑的开关受体被设计成激活、抑制、去
极化和/或超极化神经元细胞。
的设计者受体和/或配体门控离子通道(LGIC)和/或其突变蛋白。在一些方面，开关受体的
一或多个亚基已被工程化以特异性结合异源配体、外源配体和/或合成配体。在具体的实施
例中，“开关受体”是指工程化为特异性结合异源、外源和/或合成配体的GPCR、RASSL、
DREADD或LGIC或其突变蛋白的一或多个亚基。本文考虑的开关受体被设计成激活、抑制、去
极化和/或超极化神经元细胞。
[0177] 在具体的实施例中，开关受体被设计为特异性结合不可检测地结合天然存在的受体的异源、外源和/或合成配体。在某些实施例中，异源、外源和/或合成配体特异性结合开
关受体以调节表达开关受体的可兴奋细胞的活性，并可检测地结合天然存在的受体，但在
结合天然存在的受体时不引起生理学可测量的变化。
关受体以调节表达开关受体的可兴奋细胞的活性，并可检测地结合天然存在的受体，但在
结合天然存在的受体时不引起生理学可测量的变化。
[0178] 在具体的实施例中，使用本文考虑的载体将开关受体引入神经元细胞中。在特定情况下，将编码开关受体的核酸分子递送至受试者，使得开关受体在至少一个宿主细胞中
被表达。在一些情况下，开关受体被直接递送给受试者(即，作为蛋白质)。开关受体可以来
自与神经元细胞相同的物种或来自不同物种。开关受体可以在受试者中异源表达或同源表
达。在具体的实施例中，开关受体包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代以允许开关受体被
异源和/或合成配体触发并降低、减少或消除对内源配体的敏感性。在各种实施例中，选择
使用的开关受体将(i)携带合适极性和/或离子组合物的电流，并且(ii)直接被(iii)不用
作神经系统中的神经递质的配体直接选通(特别是在要被激活的细胞是神经元细胞的情况
下)。
被表达。在一些情况下，开关受体被直接递送给受试者(即，作为蛋白质)。开关受体可以来
自与神经元细胞相同的物种或来自不同物种。开关受体可以在受试者中异源表达或同源表
达。在具体的实施例中，开关受体包含一或多个氨基酸插入、缺失或取代以允许开关受体被
异源和/或合成配体触发并降低、减少或消除对内源配体的敏感性。在各种实施例中，选择
使用的开关受体将(i)携带合适极性和/或离子组合物的电流，并且(ii)直接被(iii)不用
作神经系统中的神经递质的配体直接选通(特别是在要被激活的细胞是神经元细胞的情况
下)。
[0179] 在一个实施例中，开关受体被工程化以特异性结合不可检测地结合天然存在的受体的异源、外源和/或合成配体。开关受体的细胞外配体结合结构域的原子结构可以使用本
领域已知的方法来确定或预测。可以使用高分辨率结构来指导受体配体结合结构域中的突
变的“合理设计”，其消除对内源配体的敏感性。然后可以对内源性配体进行“第二位点”置换以补充受体中的这些突变并恢复功能性(但完全非天然的)受体-配体对。在另一个实施
例中，对接算法可用于模拟合成配体与突变受体的配体结合结构域的结合。在一个具体的
实施例中，也可以使用较少靶向或甚至随机突变来产生对天然激动剂缺乏亲和力的开关受
体的突变物种。然后可以使用已知的“定向进化”方法筛选潜在激动剂化合物的文库以鉴定
有用的非天然激动剂。
领域已知的方法来确定或预测。可以使用高分辨率结构来指导受体配体结合结构域中的突
变的“合理设计”，其消除对内源配体的敏感性。然后可以对内源性配体进行“第二位点”置换以补充受体中的这些突变并恢复功能性(但完全非天然的)受体-配体对。在另一个实施
例中，对接算法可用于模拟合成配体与突变受体的配体结合结构域的结合。在一个具体的
实施例中，也可以使用较少靶向或甚至随机突变来产生对天然激动剂缺乏亲和力的开关受
体的突变物种。然后可以使用已知的“定向进化”方法筛选潜在激动剂化合物的文库以鉴定
有用的非天然激动剂。
[0180] 类似的化学遗传方法也可用于改变开关受体的传导性质，例如离子选择性。化学遗传方法可用于改变配体结合、物理激活性质或开关受体的传导性质。在一个非限制性实
例中，可以设计开关受体以增加钾离子的流出或增加阴离子如氯离子的流入，而不是增加
钠或钙离子的流入。当这种开关受体在神经元细胞中表达并通过配体结合触发时，工程化
受体会超极化并使神经元细胞失活。
例中，可以设计开关受体以增加钾离子的流出或增加阴离子如氯离子的流入，而不是增加
钠或钙离子的流入。当这种开关受体在神经元细胞中表达并通过配体结合触发时，工程化
受体会超极化并使神经元细胞失活。
[0181] “异源”配体是指来自与表达开关受体的细胞种类不同物种的多肽或小分子。异源配体可以从天然来源分离，重组产生或合成。
[0182] “天然存在的配体”是指可以在自然界中发现的生物分子，该生物分子结合天然GPCR或配体门控离子通道。
[0183] “合成配体”是指天然不存在并且通过天然或化学手段合成的多肽或小分子。合成配体可以是独特的或已知的。
[0184] “小分子”是指分子量小于约5kD、小于约4kD、小于约3kD、小于约2kD、小于约1kD或小于约0.5kD的组合物。小分子可以是核酸、肽、多肽、肽模拟物、拟肽、碳水化合物、脂质或其它有机或无机分子。
[0185] 在特定实例中，本文考虑的开关受体也可以被设计为例如通过改变起始和偏移动力学(在毫秒、秒、分钟或小时的量级)来提供可变的时间控制，并且通过使用不同的空间分
辨率病毒载体和/或改变递送方法和/或递送部位。
辨率病毒载体和/或改变递送方法和/或递送部位。
[0186] 1.G蛋白偶联受体(GPCR)
[0187] G蛋白偶联受体(GPCR)是介导细胞对外界刺激的反应的蛋白质受体的一个多元化家族。在具体的实施例中，开关受体是GPCR或其突变蛋白、RASSL或DREADD。在一些方面，
GPCR或其突变蛋白、RASSL或DREADD的一或多个亚基已被工程化以特异性结合异源配体、外
源配体和/或合成配体。特异性地结合配体、RASSL和DREADD并且适用于鉴别和制造的具体
实施例和方法中的GPCR的说明性实例已经在康克林(Conklin)等人,2008；裴(Pei)等人,
2008；尼科尔斯和罗斯(Nichols and Roth),2009；和董(Dong)等人,2010a进行了描述，并
且在罗根和罗斯(Rogan and Roth),2011中进行了评论，其中的每一个的全部内容通过引
用并入本文。
GPCR或其突变蛋白、RASSL或DREADD的一或多个亚基已被工程化以特异性结合异源配体、外
源配体和/或合成配体。特异性地结合配体、RASSL和DREADD并且适用于鉴别和制造的具体
实施例和方法中的GPCR的说明性实例已经在康克林(Conklin)等人,2008；裴(Pei)等人,
2008；尼科尔斯和罗斯(Nichols and Roth),2009；和董(Dong)等人,2010a进行了描述，并
且在罗根和罗斯(Rogan and Roth),2011中进行了评论，其中的每一个的全部内容通过引
用并入本文。
[0188] 本发明的组合物可以包括编码GPCR的核酸分子。在某些情况下，GPCR在受试者中异源表达。在其它情况下，GPCR在受试者中同源表达。在特定情况下，GPCR异位表达(例如，在神经元中)。GPCR可以包括野生型GPCR或突变型GPCR。GPCR可以来源于其中正常表达GPCR
的任何生物体，包括但不限于：哺乳动物，包括人，小鼠，大鼠；昆虫包括果蝇；包括秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的线虫；和酵母。使用本文所述的方法，GPCR可以在受试者
中表达以治疗神经疾病。在一些实例中，受试者中表达的GPCR来源于不同于受试者的物种。
例如，使用本文揭示的方法可以在人体中表达通常在小鼠中表达的GPCR。在组合物中使用
的GPCR将与野生型GPCR基本上同源(即共享序列同一性)，例如至少85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％相同。
的任何生物体，包括但不限于：哺乳动物，包括人，小鼠，大鼠；昆虫包括果蝇；包括秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的线虫；和酵母。使用本文所述的方法，GPCR可以在受试者
中表达以治疗神经疾病。在一些实例中，受试者中表达的GPCR来源于不同于受试者的物种。
例如，使用本文揭示的方法可以在人体中表达通常在小鼠中表达的GPCR。在组合物中使用
的GPCR将与野生型GPCR基本上同源(即共享序列同一性)，例如至少85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％相同。
[0189] GPCR可以根据它们与之相互作用的信号传导蛋白进行分类。不希望受理论束缚，GPCR与下游信号传导分子(例如G蛋白)偶联以转导细胞外信号。G蛋白可以是兴奋性的(例
如Gs、Gq/11、G12/13)或抑制性的(例如Gi/o)。在一些情况下，与下游G蛋白偶联的GPCR的激活可以改变可兴奋细胞(例如肌细胞，神经元)的电生理学活性。GPCR可以基于它们所偶联的G蛋
白的种类来选择。本领域技术人员将清楚，将选择GPCR以基于期望的下游信号传导路径来
执行本发明的方法。在一个具体实例中，可以选择抑制性GPCR(即，与Gi/o偶联)来治疗疼痛。
如Gs、Gq/11、G12/13)或抑制性的(例如Gi/o)。在一些情况下，与下游G蛋白偶联的GPCR的激活可以改变可兴奋细胞(例如肌细胞，神经元)的电生理学活性。GPCR可以基于它们所偶联的G蛋
白的种类来选择。本领域技术人员将清楚，将选择GPCR以基于期望的下游信号传导路径来
执行本发明的方法。在一个具体实例中，可以选择抑制性GPCR(即，与Gi/o偶联)来治疗疼痛。
[0190] 在一些情况下，GPCR可以是组成型活性的(即在细胞中持续激活)。在这个实例中，GPCR可能不需要配体激活。在更具体的情况下，GPCR被配体激活。配体可以是内源性或外源
性配体。在一些实例中，GPCR被内源性配体(即受试者天然产生的配体)激活。在其它实例
中，GPCR由外源性配体(即通过例如注射递送至受试者的配体)激活。配体可以是任何激活
GPCR的分子，包括蛋白质、脂质、合成分子、核酸等。在特定情况下，将配体递送至异源表达GPCR的受试者以治疗神经疾病。在一个实例中，GPCR是源自黑腹果蝇(Drosophila
melanogaster)的咽侧体抑制素受体(AlstR)，配体是咽侧体抑制素。
性配体。在一些实例中，GPCR被内源性配体(即受试者天然产生的配体)激活。在其它实例
中，GPCR由外源性配体(即通过例如注射递送至受试者的配体)激活。配体可以是任何激活
GPCR的分子，包括蛋白质、脂质、合成分子、核酸等。在特定情况下，将配体递送至异源表达GPCR的受试者以治疗神经疾病。在一个实例中，GPCR是源自黑腹果蝇(Drosophila
melanogaster)的咽侧体抑制素受体(AlstR)，配体是咽侧体抑制素。
[0191] 适合如本文所述使用的GPCR的非限制性实例包括：CHRM1；GNRHR；GPR73；GPR45；PTHR1；CHRM2；GNRHR2；GPR73；GPR63；PTHR2；CHRM3；HRH1；GPR10；GPR83；SCTR；CHRM4；HRH2；
F2R；PGR15；ADCYAP1R1；CHRM5；HRH3；F2RL1；PGR15L；VIPR1；ADORA1；HRH4；F2RL2；GPR103；
VIPR2；ADORA2A；FSHR 93；F2RL3；GPR103L；BAI1；ADORA2B；LHCGR；P2RY1；GRCA；BAI2；
ADORA3；TSHR；P2RY2；PGR1；BAI3；P2RY12；GPR54；P2RY4；HGPCR11；CD97；GPR105；LTB4R；
P2RY6；SALPR；EMR1；GPR86；LTB4R2；P2RY11；MAS1；EMR2；GPR87；MRGX1；LGR7；GPR90；EMR3；
ADRA1A；MRGX2；LGR8；P2Y5；PGR16；ADRA1B；MRGX3；RGR；GPR23；LEC1；ADRA1D；MRGX4；HTR1A；
P2Y10 275；LEC2；ADRA2A；MRGD；HTR1B；FKSG79；LEC3；ADRA2B；MrgA1；HTR1D；PGR2；CELSR1；
ADRA2C；MrgA2；HTR1E；PGR3；CELSR2；ADRB1；MrgA3；HTR1F；AGR9；CELSR3；ADRB2 21；MrgA4；
HTR2A；CMKLR1；GPR64；ADRB3；MrgA5；HTR2B；EBI2；PGR17；ADMR；MrgA6；HTR2C；GPCR150；
DJ287G14；C3AR1；MrgA7；HTR4；GPR1；KIAA0758；C5R1；MrgA8；HTR5A；GPR15；PGR18；GPR77；
MrgA9；HTR5B；GPR17；PGR19；AGTR1；MrgA10；HTR6；GPR18；PGR20；AGTR2；MrgA11；HTR7；
GPR19；TEM5；AGTRL1；MrgA12；SSTR1；GPR20；KIAA1828；BRS3；MrgA13；SSTR2；GPR22；PGR21；
GRPR 31；MrgA14；SSTR3；GPR25；ETL；NMBR；MrgA15；SSTR4；GPR30；FLJ14454；BDKRB1；
MrgA16；SSTR5；GPR31；GPR56；BDKRB2；MrgA19；G2A；GPR32；OA1；CNR1；MrgB1；GPR4；GPR33；
PGR22；CNR2；MrgB2；GPR65；GPR34；PGR23；CCR1；MrgB3；GPR68；GPR35；PGR24；CCR2；MrgB4；
EDG1；GPR39；PGR25；CCR3；MrgB5；EDG2；GPR40；PGR26；CCR4；MrgB6；EDG3；GPR44；PGR27；CCR5
41；MrgB8；EDG4；GPR55；VLGR1；CCR6；MrgB10；EDG5；GPR61；CCR7 43；MrgB11；EDG6；GPR62；
CCR8；MrgB13；EDG7；GPR75；CCR9；GPR24；EDG8；GPR80；GPR2；SLT；TACR1；GPR82；CASR；CCRL1；
MC1R；TACR2；GPR84；GABBR1；CCRL2；MC2R；TACR3；GPR88；GPR51；CCBP2；MC3R；TRHR；GPR91；
GPRC5B；CMKBR1L1；MC4R；TRHR2；GPR92；GPRC5C；CMKBR1L2；MC5R；GPR57；GPR101；GPRC5D；
CCXCR1；MTNR1A；GPR58；H963；RAI3；CX3CR1；MTNR1B；PNR；HGPCR2；GRM1；IL8RA；GPR50；TAR1；
HGPCR19；GRM2；IL8RB；GPR66；TAR2；HUMNPIIY20；GRM3；GPR9；NMU2R；TAR3；MRG；GRM4；CXCR4；
NPFF1R；TAR4；MRGE；GRM5；BLR1；GPR74；GPR102；MRGF；GRM6；CXCR6；GPR7；TA7；MRGG；GRM7；
CCKAR；GPR8；TA8；OPN3；GRM8；CCKBR；NPY1R；TA10；OPN4；GPRC6A；CYSLT1；NPY2R；TA11；PGR4；
PGR28；CYSLT2；PPYR1；TA12；PGR5；DRD1；NPY5R；TA14；PGR6；DRD2；NPY6R；TA15；PGR7；DRD3；
NTSR1；GPR14；PGR8；DRD4；NTSR2；AVPR1A；PGR10；FZD1；DRD5；OPRD1；AVPR1B；PGR11；FZD2；
FY；OPRK1；AVPR2；PGR12；FZD3；TG1019；OPRM1；OXTR；PGR13；FZD4；HM74；OPRL1；GPR48；
PGR14；FZD5；GPR81；OPN1LW；GPR49；RDC1；FZD6；EDNRA；OPN1MW；LGR6；RE2；FZD7；EDNRB；
OPN1SW；GPR27；RRH；FZD8；FPR1；RHO；GPR85；FZD9；FPRL1；HCRTR1；SREB3；FZD10；FPRL2；
HCRTR2；GPR3；SMOH；FPR-RS1；PTAFR；GPR6；CALCR；FPR-RS2；PTGDR；GPR12；CALCRL；FPR-RS3；
PTGER1；GPR21；CRHR1；FPR-RS4；PTGER2；GPR52；CRHR2；GALR1；PTGER3；GPR26；GIPR；TM7SF1；
GALR2；PTGER4；GPR78；GCGR；TM7SF1L1；GALR3；PTGFR；GPR37；GLP1R；TM7SF1L2；GHSR；PTGIR；
GPR37L1；GLP2R；TM7SF3；GPR38；TBXA2R；GPR41；GHRHR；TPRA40；和GPR43。
F2R；PGR15；ADCYAP1R1；CHRM5；HRH3；F2RL1；PGR15L；VIPR1；ADORA1；HRH4；F2RL2；GPR103；
VIPR2；ADORA2A；FSHR 93；F2RL3；GPR103L；BAI1；ADORA2B；LHCGR；P2RY1；GRCA；BAI2；
ADORA3；TSHR；P2RY2；PGR1；BAI3；P2RY12；GPR54；P2RY4；HGPCR11；CD97；GPR105；LTB4R；
P2RY6；SALPR；EMR1；GPR86；LTB4R2；P2RY11；MAS1；EMR2；GPR87；MRGX1；LGR7；GPR90；EMR3；
ADRA1A；MRGX2；LGR8；P2Y5；PGR16；ADRA1B；MRGX3；RGR；GPR23；LEC1；ADRA1D；MRGX4；HTR1A；
P2Y10 275；LEC2；ADRA2A；MRGD；HTR1B；FKSG79；LEC3；ADRA2B；MrgA1；HTR1D；PGR2；CELSR1；
ADRA2C；MrgA2；HTR1E；PGR3；CELSR2；ADRB1；MrgA3；HTR1F；AGR9；CELSR3；ADRB2 21；MrgA4；
HTR2A；CMKLR1；GPR64；ADRB3；MrgA5；HTR2B；EBI2；PGR17；ADMR；MrgA6；HTR2C；GPCR150；
DJ287G14；C3AR1；MrgA7；HTR4；GPR1；KIAA0758；C5R1；MrgA8；HTR5A；GPR15；PGR18；GPR77；
MrgA9；HTR5B；GPR17；PGR19；AGTR1；MrgA10；HTR6；GPR18；PGR20；AGTR2；MrgA11；HTR7；
GPR19；TEM5；AGTRL1；MrgA12；SSTR1；GPR20；KIAA1828；BRS3；MrgA13；SSTR2；GPR22；PGR21；
GRPR 31；MrgA14；SSTR3；GPR25；ETL；NMBR；MrgA15；SSTR4；GPR30；FLJ14454；BDKRB1；
MrgA16；SSTR5；GPR31；GPR56；BDKRB2；MrgA19；G2A；GPR32；OA1；CNR1；MrgB1；GPR4；GPR33；
PGR22；CNR2；MrgB2；GPR65；GPR34；PGR23；CCR1；MrgB3；GPR68；GPR35；PGR24；CCR2；MrgB4；
EDG1；GPR39；PGR25；CCR3；MrgB5；EDG2；GPR40；PGR26；CCR4；MrgB6；EDG3；GPR44；PGR27；CCR5
41；MrgB8；EDG4；GPR55；VLGR1；CCR6；MrgB10；EDG5；GPR61；CCR7 43；MrgB11；EDG6；GPR62；
CCR8；MrgB13；EDG7；GPR75；CCR9；GPR24；EDG8；GPR80；GPR2；SLT；TACR1；GPR82；CASR；CCRL1；
MC1R；TACR2；GPR84；GABBR1；CCRL2；MC2R；TACR3；GPR88；GPR51；CCBP2；MC3R；TRHR；GPR91；
GPRC5B；CMKBR1L1；MC4R；TRHR2；GPR92；GPRC5C；CMKBR1L2；MC5R；GPR57；GPR101；GPRC5D；
CCXCR1；MTNR1A；GPR58；H963；RAI3；CX3CR1；MTNR1B；PNR；HGPCR2；GRM1；IL8RA；GPR50；TAR1；
HGPCR19；GRM2；IL8RB；GPR66；TAR2；HUMNPIIY20；GRM3；GPR9；NMU2R；TAR3；MRG；GRM4；CXCR4；
NPFF1R；TAR4；MRGE；GRM5；BLR1；GPR74；GPR102；MRGF；GRM6；CXCR6；GPR7；TA7；MRGG；GRM7；
CCKAR；GPR8；TA8；OPN3；GRM8；CCKBR；NPY1R；TA10；OPN4；GPRC6A；CYSLT1；NPY2R；TA11；PGR4；
PGR28；CYSLT2；PPYR1；TA12；PGR5；DRD1；NPY5R；TA14；PGR6；DRD2；NPY6R；TA15；PGR7；DRD3；
NTSR1；GPR14；PGR8；DRD4；NTSR2；AVPR1A；PGR10；FZD1；DRD5；OPRD1；AVPR1B；PGR11；FZD2；
FY；OPRK1；AVPR2；PGR12；FZD3；TG1019；OPRM1；OXTR；PGR13；FZD4；HM74；OPRL1；GPR48；
PGR14；FZD5；GPR81；OPN1LW；GPR49；RDC1；FZD6；EDNRA；OPN1MW；LGR6；RE2；FZD7；EDNRB；
OPN1SW；GPR27；RRH；FZD8；FPR1；RHO；GPR85；FZD9；FPRL1；HCRTR1；SREB3；FZD10；FPRL2；
HCRTR2；GPR3；SMOH；FPR-RS1；PTAFR；GPR6；CALCR；FPR-RS2；PTGDR；GPR12；CALCRL；FPR-RS3；
PTGER1；GPR21；CRHR1；FPR-RS4；PTGER2；GPR52；CRHR2；GALR1；PTGER3；GPR26；GIPR；TM7SF1；
GALR2；PTGER4；GPR78；GCGR；TM7SF1L1；GALR3；PTGFR；GPR37；GLP1R；TM7SF1L2；GHSR；PTGIR；
GPR37L1；GLP2R；TM7SF3；GPR38；TBXA2R；GPR41；GHRHR；TPRA40；和GPR43。
[0192] 在某些情况下，开关受体是仅由合成配体(RASSL)激活的受体。RASSL可能是专门针对合成小分子配体而设计的GPCR。RASSL可以由任何GPCR骨架组成，已经提供了其实例。
在某些情况下，RASSL被设计为由合成配体激活。在这种情况下，RASSL可能对内源性配体没
有反应或者基本上不太反应。不希望受理论束缚，所述方法可以提供对RASSL的时间控制，
使得RASSL仅在合成配体存在下被激活。RASSL对内源性配体的反应性可小于5％、小于
10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于86％、小于
87％、小于88％、小于89％、小于90％、小于91％、小于92％、小于93％、小于94％、小于95％、小于96％、小于97％、小于98％、小于99％或小于100％。在某些情况下，RASSL是由最初编码分离蛋白质的两个或更多个基因(或部分基因)的连接产生的融合蛋白。在某些情况下，
RASSL至少与野生型GPCR部分同源。在一些情况下，RASSL与野生型GPCR共有至少50％、至少
55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％的氨基酸同源性。
在某些情况下，RASSL被设计为由合成配体激活。在这种情况下，RASSL可能对内源性配体没
有反应或者基本上不太反应。不希望受理论束缚，所述方法可以提供对RASSL的时间控制，
使得RASSL仅在合成配体存在下被激活。RASSL对内源性配体的反应性可小于5％、小于
10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于86％、小于
87％、小于88％、小于89％、小于90％、小于91％、小于92％、小于93％、小于94％、小于95％、小于96％、小于97％、小于98％、小于99％或小于100％。在某些情况下，RASSL是由最初编码分离蛋白质的两个或更多个基因(或部分基因)的连接产生的融合蛋白。在某些情况下，
RASSL至少与野生型GPCR部分同源。在一些情况下，RASSL与野生型GPCR共有至少50％、至少
55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少
96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％的氨基酸同源性。
[0193] 在一些方面，本发明的开关受体是由设计者药物(DREADD)专门激活的设计者受体。在某些情况下，DREADD是RASSL。DREADD可以是由生物惰性配体激活的任何GPCR。如本文所用的术语“生物惰性的”是指对野生型受体具有低亲和力，从而产生低反应性的配体-受
体相互作用，但可以对开关受体(例如DREADD)具有高亲和力的任何配体(例如蛋白质、小分
子、脂质等)。一般来说，生物惰性的任何配体通常会在剂量通常被递送的情况下在不存在
开关受体的情况下对生物体具有很少或不具有生理效应。然而，在开关受体存在下，生物惰
性配体可能对生物体具有显著的生理作用(例如，缓解疼痛)。由于例如副作用的低风险和
脱靶效应，使用生物惰性小分子可能适合于通过本文揭示的方法治疗神经疾病。DREADD尤
其可用于执行本文描述的方法，因为DREADD可以暂时由在其它方面对受试者没有影响的生
物学惰性的分子控制。可以使用上述任何GPCR骨架来设计DREADD(例如，通过定向进化或合
理设计)。在某些情况下，DREADD对内源性配体没有反应或基本上不太反应，因此它主要被
合成配体激活。DREADD的实例包括但不限于如安布鲁斯特(Armbruster)等人,PNAS,2007所
述的设计在毒蕈碱乙酰胆碱受体(例如，hM1Dq、hM2Di、hM3Dq、hM4Di和hM5Dq)上的那些和如瓦迪(Vardy)等人,神经元(Neuron),2015所述的设计在κ阿片类受体上的那些，所述参考文献
以引用的方式并入本文。在一些情况下，DREADD由氯氮平-N-氧化物(例如hM1Dq、hM2Di、
hM3Dq、hM4Di和hM5Dq受体)激活。在一些情况下，生物惰性化合物是N4'-烷基取代的CNO类似物，例如陈(Chen)等人,ACS化学神经科学(ACS Chem.Neurosci.),2015所揭示的任何化合
物，包括化合物4b(3-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓)；化合物6
(4-(8-氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物)；化合物
11(3-氯-6-(哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓)；化合物13(8-氯-11-[4-(1,1-
二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓)；和化合物21(11-(哌嗪-1-基)-
5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓；11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂
卓)。在其它情况下，DREADD被鼠尾草素B激活(例如KOR-DREADD)。应该理解，任何GPCR都可
以设计为DREADD，并且本发明不限于所揭示的DREADD。合成配体可以基本上是生物惰性的
任何分子。
体相互作用，但可以对开关受体(例如DREADD)具有高亲和力的任何配体(例如蛋白质、小分
子、脂质等)。一般来说，生物惰性的任何配体通常会在剂量通常被递送的情况下在不存在
开关受体的情况下对生物体具有很少或不具有生理效应。然而，在开关受体存在下，生物惰
性配体可能对生物体具有显著的生理作用(例如，缓解疼痛)。由于例如副作用的低风险和
脱靶效应，使用生物惰性小分子可能适合于通过本文揭示的方法治疗神经疾病。DREADD尤
其可用于执行本文描述的方法，因为DREADD可以暂时由在其它方面对受试者没有影响的生
物学惰性的分子控制。可以使用上述任何GPCR骨架来设计DREADD(例如，通过定向进化或合
理设计)。在某些情况下，DREADD对内源性配体没有反应或基本上不太反应，因此它主要被
合成配体激活。DREADD的实例包括但不限于如安布鲁斯特(Armbruster)等人,PNAS,2007所
述的设计在毒蕈碱乙酰胆碱受体(例如，hM1Dq、hM2Di、hM3Dq、hM4Di和hM5Dq)上的那些和如瓦迪(Vardy)等人,神经元(Neuron),2015所述的设计在κ阿片类受体上的那些，所述参考文献
以引用的方式并入本文。在一些情况下，DREADD由氯氮平-N-氧化物(例如hM1Dq、hM2Di、
hM3Dq、hM4Di和hM5Dq受体)激活。在一些情况下，生物惰性化合物是N4'-烷基取代的CNO类似物，例如陈(Chen)等人,ACS化学神经科学(ACS Chem.Neurosci.),2015所揭示的任何化合
物，包括化合物4b(3-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓)；化合物6
(4-(8-氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-1-鎓碘化物)；化合物
11(3-氯-6-(哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓)；化合物13(8-氯-11-[4-(1,1-
二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓)；和化合物21(11-(哌嗪-1-基)-
5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓；11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂
卓)。在其它情况下，DREADD被鼠尾草素B激活(例如KOR-DREADD)。应该理解，任何GPCR都可
以设计为DREADD，并且本发明不限于所揭示的DREADD。合成配体可以基本上是生物惰性的
任何分子。
[0194] 基于DREADD激活特定G蛋白和特定信号传导路径的能力，可以选择DREADD作为开关受体来执行本文所述的方法。可选择信号传导路径来专门治疗相关神经疾病。例如，使用
偶联抑制性G蛋白Gi的DREADD可能适合于治疗例如疼痛。偶联到Gi的DREADD的一个非限制性
实例是hM4Di。在某些情况下，hM4Di被氯氮平-N-氧化物激活。可激活hM4Di的配体的其它非
限制性实例包括氯氮平、哌拉平和奥氮平。在另一个实例中，与兴奋性G蛋白Gq偶联的
DREADD可能适合于治疗例如疼痛。与Gq偶联的DREADD的一个非限制性实例是hM3Dq。在某些
情况下，hM3Dq由氯氮平-N-氧化物、氯氮平、哌拉平或奥氮平激活。
偶联抑制性G蛋白Gi的DREADD可能适合于治疗例如疼痛。偶联到Gi的DREADD的一个非限制性
实例是hM4Di。在某些情况下，hM4Di被氯氮平-N-氧化物激活。可激活hM4Di的配体的其它非
限制性实例包括氯氮平、哌拉平和奥氮平。在另一个实例中，与兴奋性G蛋白Gq偶联的
DREADD可能适合于治疗例如疼痛。与Gq偶联的DREADD的一个非限制性实例是hM3Dq。在某些
情况下，hM3Dq由氯氮平-N-氧化物、氯氮平、哌拉平或奥氮平激活。
[0195] 特异性地结合配体、RASSL和DREADD的GPCR的说明性实例可以衍生自任何GPCR，包括但不限于：5-羟色胺受体、乙酰胆碱受体(毒蕈碱)、腺苷受体、粘附类GPCR、肾上腺素受
体、血管紧张素受体、爱帕琳肽(Apelin)受体、胆汁酸受体、铃蟾肽受体、缓激肽受体、降钙素受体、钙敏感受体、大麻素受体、Chemerin受体、趋化因子受体、胆囊收缩素受体、
Frizzled类GPCR、补体肽受体、促肾上腺皮质素释放因子受体、多巴胺受体、内皮缩血管肽
受体、雌激素(G蛋白偶联)受体、甲酰肽受体、游离脂肪酸受体、GABAB受体、甘丙肽受体、饥饿激素(Ghrelin)受体、胰高血糖素受体家族、糖蛋白激素受体、促性腺激素释放激素受体、GPR18、GPR55和GPR119、组胺受体、羟基羧酸受体、Kisspeptin受体、白细胞三烯受体、溶血磷脂(LPA)受体、溶血磷脂(S1P)受体、黑色素浓集激素受体、黑皮质素受体、褪黑素受体、代谢型谷氨酸受体、胃动素(Motilin)受体、神经介素U受体、神经肽FF/神经肽AF受体、神经肽S受体、神经肽W/神经肽B受体、神经肽Y受体、神经降压素受体、阿片受体、食欲素(Orexin)受体、氧代戊二酸受体、P2Y受体、甲状旁腺激素受体、肽P518受体、血小板激活因子受体、前动力蛋白受体、催乳素释放肽受体、前列腺素类(Prostanoid)受体、蛋白酶激活受体、松弛
素家族肽受体、生长抑素受体、琥珀酸受体、速激肽受体、促甲状腺激素释放激素受体、痕量胺受体、尾加压素受体、加压素和催产素受体、以及VIP和PACAP受体。
体、血管紧张素受体、爱帕琳肽(Apelin)受体、胆汁酸受体、铃蟾肽受体、缓激肽受体、降钙素受体、钙敏感受体、大麻素受体、Chemerin受体、趋化因子受体、胆囊收缩素受体、
Frizzled类GPCR、补体肽受体、促肾上腺皮质素释放因子受体、多巴胺受体、内皮缩血管肽
受体、雌激素(G蛋白偶联)受体、甲酰肽受体、游离脂肪酸受体、GABAB受体、甘丙肽受体、饥饿激素(Ghrelin)受体、胰高血糖素受体家族、糖蛋白激素受体、促性腺激素释放激素受体、GPR18、GPR55和GPR119、组胺受体、羟基羧酸受体、Kisspeptin受体、白细胞三烯受体、溶血磷脂(LPA)受体、溶血磷脂(S1P)受体、黑色素浓集激素受体、黑皮质素受体、褪黑素受体、代谢型谷氨酸受体、胃动素(Motilin)受体、神经介素U受体、神经肽FF/神经肽AF受体、神经肽S受体、神经肽W/神经肽B受体、神经肽Y受体、神经降压素受体、阿片受体、食欲素(Orexin)受体、氧代戊二酸受体、P2Y受体、甲状旁腺激素受体、肽P518受体、血小板激活因子受体、前动力蛋白受体、催乳素释放肽受体、前列腺素类(Prostanoid)受体、蛋白酶激活受体、松弛
素家族肽受体、生长抑素受体、琥珀酸受体、速激肽受体、促甲状腺激素释放激素受体、痕量胺受体、尾加压素受体、加压素和催产素受体、以及VIP和PACAP受体。
[0196] 表1中列出了适用于治疗本文中涵盖的神经疾病的具体实施例的GPCR-配体对的说明性实例。
[0197] 表1.用于治疗神经疾病的GPCR-配体组合的非限制性实例
[0198]
[0199] *陈(Chen)等人,ACS化学神经科学(ACS Chem.Neurosci.)2015中描述的N4'-烷基取代的氯氮平-N-氧化物(CNO)类似物、PMID 25587888，包括：3-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-
5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、4-(8-氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓-11-基)-1,1-二
甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、8-氯-11-
[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、11-(哌嗪-1-基)-5H-
二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、4-(8-氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓-11-基)-1,1-二
甲基哌嗪-1-鎓碘化物、3-氯-6-(哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓、8-氯-11-
[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓、11-(哌嗪-1-基)-5H-
二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓或11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓。
[0200] 2.配体门控离子通道
[0201] 在具体的实施例中，开关受体是配体门控离子通道(LGIC)或其突变蛋白。LGIC可以是任何跨膜蛋白质，其响应于配体的结合而控制穿过细胞膜的离子(例如，Na+、K+、Ca++、Cl-)通量。不希望受理论束缚，LGIC的激活可改变可兴奋细胞的电生理学活性(即去极化、
超极化)。LGIC可以控制阳离子、阴离子或其组合通过膜的通量。可以基于通道的离子选择
性来选择LGIC。在一些情况下，LGIC控制通过膜的氯离子(Cl-)通量，并且可能适合于治疗
例如疼痛。在一些方面，LGIC或其突变蛋白的一或多个亚基已经工程化以特异性地结合异
源配体、外源配体和/或合成配体。适用于特定实施例的LGIC的说明性实例包括但不限于5-
HT3受体、酸感应(质子门控)离子通道(ASIC)、上皮钠通道(ENaC)、GABAA受体、甘氨酸受体、亲离子谷氨酸受体、IP3受体、烟碱乙酰胆碱受体、P2X受体、Ryanodine受体和锌激活通道
(ZAC)。
超极化)。LGIC可以控制阳离子、阴离子或其组合通过膜的通量。可以基于通道的离子选择
性来选择LGIC。在一些情况下，LGIC控制通过膜的氯离子(Cl-)通量，并且可能适合于治疗
例如疼痛。在一些方面，LGIC或其突变蛋白的一或多个亚基已经工程化以特异性地结合异
源配体、外源配体和/或合成配体。适用于特定实施例的LGIC的说明性实例包括但不限于5-
HT3受体、酸感应(质子门控)离子通道(ASIC)、上皮钠通道(ENaC)、GABAA受体、甘氨酸受体、亲离子谷氨酸受体、IP3受体、烟碱乙酰胆碱受体、P2X受体、Ryanodine受体和锌激活通道
(ZAC)。
[0202] 在一些方面，配体门控离子通道包含离子传导孔结构域和配体结合结构域，所述离子传导孔结构域和配体结合结构域通过融合最初编码分离的多肽的两个或更多个多核
苷酸序列而形成。在一些实施例中，多核苷酸序列包含cys环受体基因家族的两个或更多个
成员。在一个实施例中，离子传导孔结构域传导阴离子。在另一个实施例中，离子传导孔结
构域传导阳离子。
苷酸序列而形成。在一些实施例中，多核苷酸序列包含cys环受体基因家族的两个或更多个
成员。在一个实施例中，离子传导孔结构域传导阴离子。在另一个实施例中，离子传导孔结
构域传导阳离子。
[0203] 在某些情况下，LGIC被工程化或修饰为可被合成配体激活。适合于执行本文所述方法的LGIC的非限制性实例包括：经工程改造以对合成配体依维菌素作出反应的谷氨酸盐
门控氯化物通道(弗雷泽(Frazier)等人,生物化学杂志(Journal of Biological
Chemistry),2012)；由药理学选择性效应分子(PSEM)激活的药理学选择性致动器模块
(PSAM)，包括：由合成配体PSEM22S激活的PSAM-5HT3HC、由合成配体PSEM89S激活的PSAM-
GlyR和由合成配体PSEM9S激活的PSAM-nAChR(玛格纳斯(Magnus)等人,科学(Science),
2011)；由辣椒素激活的TRPV1；由合成配体依维菌素激活的GlyR-M(林纳格和林奇(Lynagh
and Lynch),生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry),2010)；和由合成配体唑
吡坦激活的GABA-A。
门控氯化物通道(弗雷泽(Frazier)等人,生物化学杂志(Journal of Biological
Chemistry),2012)；由药理学选择性效应分子(PSEM)激活的药理学选择性致动器模块
(PSAM)，包括：由合成配体PSEM22S激活的PSAM-5HT3HC、由合成配体PSEM89S激活的PSAM-
GlyR和由合成配体PSEM9S激活的PSAM-nAChR(玛格纳斯(Magnus)等人,科学(Science),
2011)；由辣椒素激活的TRPV1；由合成配体依维菌素激活的GlyR-M(林纳格和林奇(Lynagh
and Lynch),生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry),2010)；和由合成配体唑
吡坦激活的GABA-A。
[0204] 适用于本文所述方法的LGIC的其它非限制性实例包括：HTR3A；HTR3B；HTR3C；HTR3D；HTR3E；ASIC1；ASIC2；ASIC3；SCNN1A；SCNN1B；SCNN1D；SCNN1G；GABRA1；GABRA2；
GABRA3；GABRA4；GABRA5；GABRA6；GABRB1；GABRB2；GABRB3；GABRG1；GABRG2；GABRG3；GABRD；
GABRE；GABRQ；GABRP；GABRR1；GABRR2；GABRR3；GLRA1；GLRA2；GLRA3；GLRA4；GLRB；GRIA1；
GRIA2；GRIA3；GRIA4；GRID1；GRID2；GRIK1；GRIK2；GRIK3；GRIK4；GRIK5；GRIN1；GRIN2A；
GRIN2B；GRIN2C；GRIN2D；GRIN3A；GRIN3B；ITPR1；ITPR2；ITPR3；CHRNA1；CHRNA2；CHRNA3；
CHRNA4；CHRNA5；CHRNA6；CHRNA7；CHRNA9；CHRNA10；CHRNB1；CHRNB2；CHRNB3；CHRNB4；CHRNG；
CHRND；CHRNE；P2RX1；P2RX2；P2RX3；P2RX4；P2RX5；P2RX6；P2RX7；RYR1；RYR2；RYR3；和ZACN。
GABRA3；GABRA4；GABRA5；GABRA6；GABRB1；GABRB2；GABRB3；GABRG1；GABRG2；GABRG3；GABRD；
GABRE；GABRQ；GABRP；GABRR1；GABRR2；GABRR3；GLRA1；GLRA2；GLRA3；GLRA4；GLRB；GRIA1；
GRIA2；GRIA3；GRIA4；GRID1；GRID2；GRIK1；GRIK2；GRIK3；GRIK4；GRIK5；GRIN1；GRIN2A；
GRIN2B；GRIN2C；GRIN2D；GRIN3A；GRIN3B；ITPR1；ITPR2；ITPR3；CHRNA1；CHRNA2；CHRNA3；
CHRNA4；CHRNA5；CHRNA6；CHRNA7；CHRNA9；CHRNA10；CHRNB1；CHRNB2；CHRNB3；CHRNB4；CHRNG；
CHRND；CHRNE；P2RX1；P2RX2；P2RX3；P2RX4；P2RX5；P2RX6；P2RX7；RYR1；RYR2；RYR3；和ZACN。
[0205] TRPV1、TRPM8和P2X2是大型LGIC家族的成员，它们共享结构特征以及选通原则。例如，与TRPV1类似，TRPV4也由热引发，但不是由辣椒素引发；和P2X3，由ATP触发，但比P2X2更快速地脱敏。因此，TRPV1、TRPM8和P2X2是适用于特定实例的LGIC的非限制性实例。
[0206] 在一个实施例中，开关受体是TRPV1或TRPM8受体或其突变蛋白。TRPV1和TRPM8是由周围神经系统的伤害性神经元表达的类香草醇和薄荷醇受体。这两种通道都被认为是非
选择性的钠和钙渗透性同型四聚体。此外，中枢神经系统几乎不存在两种通道及其主要激
动剂–分别是辣椒素和清凉化合物，如薄荷醇。辣椒素和一些清凉化合物，包括薄荷醇和
icilin，含有光敏阻断基团的潜在受体位点。具有这种受体的光不稳定阻断基团的缔合将
导致配体门控离子通道，其中光通过释放活性配体而作为间接触发。
选择性的钠和钙渗透性同型四聚体。此外，中枢神经系统几乎不存在两种通道及其主要激
动剂–分别是辣椒素和清凉化合物，如薄荷醇。辣椒素和一些清凉化合物，包括薄荷醇和
icilin，含有光敏阻断基团的潜在受体位点。具有这种受体的光不稳定阻断基团的缔合将
导致配体门控离子通道，其中光通过释放活性配体而作为间接触发。
[0207] 在一个实施例中，开关受体是P2X2受体或其突变蛋白。P2X2是一种ATP门控非选择性阳离子通道，其脱敏速度较慢。P2X2可用作去极化电流的选择性寻址源，并为产生完全缺
乏天然激动剂的工程化通道-配体组合提供平台。
乏天然激动剂的工程化通道-配体组合提供平台。
[0208] 表2中列出了适用于治疗神经疾病的具体实施例的LGIC-配体对的说明性实例。
[0209] 表2.用于治疗神经疾病的LGIC-配体组合的非限制性实例
[0210]
[0211]
[0212] 3.甘氨酸受体
[0213] 在具体的实施例中，开关受体是甘氨酸受体(GlyR)或其突变蛋白。在一些方面，GlyR或其突变蛋白的一或多个亚基已经工程化以特异性地结合异源配体、外源配体和/或
合成配体。GlyR是介导中枢神经系统(CNS)中快速神经递送的配体门控离子型受体的烟碱
类超家族的成员。然而，仅人α1亚基的异源表达足以重建具有与天然通道的药理学性质基
本相同的活性甘氨酸门控通道。因此，在各种示例性实施例中，开关受体包含GlyR的亚基
(例如，α1、α2、α3、α4或β)，并且优选包含哺乳动物来源的亚基或所述亚基的突变蛋白。在美国专利号8,957,036中描述了适用于特定实施例的GlyR的说明性实例，其全部内容通过引
用并入本文。
合成配体。GlyR是介导中枢神经系统(CNS)中快速神经递送的配体门控离子型受体的烟碱
类超家族的成员。然而，仅人α1亚基的异源表达足以重建具有与天然通道的药理学性质基
本相同的活性甘氨酸门控通道。因此，在各种示例性实施例中，开关受体包含GlyR的亚基
(例如，α1、α2、α3、α4或β)，并且优选包含哺乳动物来源的亚基或所述亚基的突变蛋白。在美国专利号8,957,036中描述了适用于特定实施例的GlyR的说明性实例，其全部内容通过引
用并入本文。
[0214] 具有改变活性的突变形式的GlyR亚基(突变蛋白)也是已知的，并且可以在特定的实施例中使用。例如，GlyR蛋白的某些突变蛋白导致改变的离子通道性质，例如导致阳离子
性离子通道(例如，Δ250A251E；克拉米达斯(Keramidas)等人,基因生理学杂志
(J.Gen.Physiol.),119,393(2002))。其它GlyR突变蛋白缺乏锌增强或锌抑制的位点(赫泽
尔(Hirzel)等人,神经元(Neuron),52,679-90(2006))、对变构调节剂的亲和力(例如麻醉
增强(海明斯(Hemmings)等人,药理学趋势(Trends Pharmacol.Sci.),26,503-10(2005))
或对配体的亲和力(拉简达(Rajendra)等人,神经元(Neuron),14,169-175(1995)；史尼登
(Schrnieden)等人,科学(Science),262,256-258(1993))。GlyR亚基的突变还可以选择性
地改变离子渗透(例如阴离子或阳离子选择性通道)，并重新设计受体亚基的配体结合口袋
以识别异源或合成配体。例如，为了改变GlyR蛋白对特定配体的敏感性和选择性，可以在
GlyRα1亚基中进行点突变，预期所述点突变使剂量反应曲线左移或右移(即对甘氨酸的特
异性更低或更高)。其它突变可以改变GlyR蛋白对某些麻醉剂(例如乙醇)的敏感性。例如，
其中287位的甲硫氨酸(M)变为亮氨酸(L)(M297L)的小鼠甘氨酸α1受体亚单位突变导致对
挥发性麻醉安氟醚的敏感性大大提高。在特定的实施例中，这种GlyR突变蛋白可以用作
GlyR蛋白。
性离子通道(例如，Δ250A251E；克拉米达斯(Keramidas)等人,基因生理学杂志
(J.Gen.Physiol.),119,393(2002))。其它GlyR突变蛋白缺乏锌增强或锌抑制的位点(赫泽
尔(Hirzel)等人,神经元(Neuron),52,679-90(2006))、对变构调节剂的亲和力(例如麻醉
增强(海明斯(Hemmings)等人,药理学趋势(Trends Pharmacol.Sci.),26,503-10(2005))
或对配体的亲和力(拉简达(Rajendra)等人,神经元(Neuron),14,169-175(1995)；史尼登
(Schrnieden)等人,科学(Science),262,256-258(1993))。GlyR亚基的突变还可以选择性
地改变离子渗透(例如阴离子或阳离子选择性通道)，并重新设计受体亚基的配体结合口袋
以识别异源或合成配体。例如，为了改变GlyR蛋白对特定配体的敏感性和选择性，可以在
GlyRα1亚基中进行点突变，预期所述点突变使剂量反应曲线左移或右移(即对甘氨酸的特
异性更低或更高)。其它突变可以改变GlyR蛋白对某些麻醉剂(例如乙醇)的敏感性。例如，
其中287位的甲硫氨酸(M)变为亮氨酸(L)(M297L)的小鼠甘氨酸α1受体亚单位突变导致对
挥发性麻醉安氟醚的敏感性大大提高。在特定的实施例中，这种GlyR突变蛋白可以用作
GlyR蛋白。
[0215] 在特别优选的实施例中，开关受体包含GlyRα1亚基，其包含一或多个氨基酸缺失、插入或取代，其消除GlyR与其天然配体的结合并赋予GlyR突变蛋白与异源或合成配体的特
异性结合。在一个优选的实施例中，开关受体包含在F207和/或A228中包含氨基酸插入、缺
失或取代的GlyRα1亚基。在一个优选的实施例中，开关受体包含包含氨基酸取代F207A和/
或A228G的GlyRα1亚基。在又一个优选的实施例中，开关受体包含包含氨基酸取代F207A和
A228G的GlyRα1亚基并且特异性结合配体依维菌素。
异性结合。在一个优选的实施例中，开关受体包含在F207和/或A228中包含氨基酸插入、缺
失或取代的GlyRα1亚基。在一个优选的实施例中，开关受体包含包含氨基酸取代F207A和/
或A228G的GlyRα1亚基。在又一个优选的实施例中，开关受体包含包含氨基酸取代F207A和
A228G的GlyRα1亚基并且特异性结合配体依维菌素。
[0216] 在另一个优选的实施例中，开关受体包含包含氨基酸取代F207A和A228G的GlyRα1亚基并且特异性结合阿维菌素(avermectin)(作为一大类)，阿维菌素除了莫西菌素(米尔
倍霉素(milbemycin))及其类似物之外还包括依维菌素类似物赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌
素、依普菌素和阿巴美丁。
倍霉素(milbemycin))及其类似物之外还包括依维菌素类似物赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌
素、依普菌素和阿巴美丁。
[0217] 在一些实施例中，开关受体包含包含一或多个以下氨基酸取代的GlyRα1亚基：A-1'E、P-2'Δ、T13'V、R19'E、F207A和A228G(参见伊斯兰(Islam)等人,ACS化学神经科学(ACS Chem.Neurosci.),DOI:10.1021/acschemneuro.6b00168(2016))。在一个实施例中，开关受
体包含包含氨基酸取代A-1'E、F207A和A228G的GlyRα1亚基，并特异性结合配体依维菌素。
在另一个实施例中，开关受体包含包含氨基酸取代A-1'E、P-2'Δ、T13'V、F207A和A228G的
GlyRα1亚基，并特异性结合配体依维菌素。
体包含包含氨基酸取代A-1'E、F207A和A228G的GlyRα1亚基，并特异性结合配体依维菌素。
在另一个实施例中，开关受体包含包含氨基酸取代A-1'E、P-2'Δ、T13'V、F207A和A228G的
GlyRα1亚基，并特异性结合配体依维菌素。
[0218] 适用于本文考虑的具体实施例的阿维菌素类似物的说明性实例包括但不限于PubChem化合物数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)中的现有类似物。
[0219] E.配体
[0220] 适用于治疗神经疾病(例如疼痛)的配体可以包括可以如本文所述激活开关受体的任何分子。配体可以是核酸、小分子化合物、蛋白质或肽、脂质、光子等。适用于激活本发明的GPCR衍生的开关受体的配体的非限制性实例包括：咽侧体抑制素；纳法拉芬
(C28H32N2O5)、氯氮平-N-氧化物(CNO)；氯氮平；奥氮平；哌拉平；鼠尾草素B；阿洛司琼；氟哌拉平；和陈(Chen)等人,ACS化学神经科学(ACS Chem.Neurosci.),2015中所揭示的N4'-烷
基取代的CNO类似物，包括：化合物4b(3-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并
二氮杂卓)；化合物6(4-(8-氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-
1-鎓碘化物)；化合物11(3-氯-6-(哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓)；化合物13
(8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓)；和化合物
21(11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓；11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并
[b,e][1,4]二氮杂卓)。适用于激活本发明的LGIC衍生的开关受体的配体的非限制性实例
包括：阿维菌素家族的成员，包括：依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素和阿巴美丁；米尔倍霉素家族的成员、包括：米尔倍菌素、莫西菌素和奈马克丁(nemadectin)；咪唑并吡啶类，包括：唑吡坦、阿吡坦(alpidem)、沙立吡旦(saripidem)、奈可吡旦
(necopidem)、法西普隆(fasiplon)和DS-1；辣椒素类(capsaicinoids)，包括：辣椒素、二氢辣椒碱、去甲二氢辣椒素、高二氢辣椒碱、高辣椒素和香草酰胺；药理学选择性效应分子
(PSEM)，包括：PSEM22S、PSEM89S和PSEM9S；和ATP。在一些情况下，配体结合结构域被氯氮平-N-氧化物、氯氮平、哌拉平、奥氮平、阿洛司琼、氟哌拉平、纳呋拉啡(C28H32N2O5)或N4'-烷基取代的CNO类似物的结合激活。在某些方面，配体结合结构域被尼古丁、伐尼克兰或加兰
他敏的结合所激活。在一些情况下，配体不是甘氨酸、β-丙氨酸或牛磺酸。
(C28H32N2O5)、氯氮平-N-氧化物(CNO)；氯氮平；奥氮平；哌拉平；鼠尾草素B；阿洛司琼；氟哌拉平；和陈(Chen)等人,ACS化学神经科学(ACS Chem.Neurosci.),2015中所揭示的N4'-烷
基取代的CNO类似物，包括：化合物4b(3-氯-6-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并
二氮杂卓)；化合物6(4-(8-氯-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓-11-基)-1,1-二甲基哌嗪-
1-鎓碘化物)；化合物11(3-氯-6-(哌嗪-1-基)-5H-苯并[b][1,4]苯并二氮杂卓)；化合物13
(8-氯-11-[4-(1,1-二氘代乙基)哌嗪-1-基]-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓)；和化合物
21(11-(哌嗪-1-基)-5H-二苯并[b,e][1,4]二氮杂卓；11-(4-乙基哌嗪-1-基)-5H-二苯并
[b,e][1,4]二氮杂卓)。适用于激活本发明的LGIC衍生的开关受体的配体的非限制性实例
包括：阿维菌素家族的成员，包括：依维菌素、赛拉菌素、多拉菌素、埃玛菌素、依普菌素和阿巴美丁；米尔倍霉素家族的成员、包括：米尔倍菌素、莫西菌素和奈马克丁(nemadectin)；咪唑并吡啶类，包括：唑吡坦、阿吡坦(alpidem)、沙立吡旦(saripidem)、奈可吡旦
(necopidem)、法西普隆(fasiplon)和DS-1；辣椒素类(capsaicinoids)，包括：辣椒素、二氢辣椒碱、去甲二氢辣椒素、高二氢辣椒碱、高辣椒素和香草酰胺；药理学选择性效应分子
(PSEM)，包括：PSEM22S、PSEM89S和PSEM9S；和ATP。在一些情况下，配体结合结构域被氯氮平-N-氧化物、氯氮平、哌拉平、奥氮平、阿洛司琼、氟哌拉平、纳呋拉啡(C28H32N2O5)或N4'-烷基取代的CNO类似物的结合激活。在某些方面，配体结合结构域被尼古丁、伐尼克兰或加兰
他敏的结合所激活。在一些情况下，配体不是甘氨酸、β-丙氨酸或牛磺酸。
[0221] 在一些情况下，配体是FDA批准用于一或多种适应症的药物，不包括本文所设想的神经疾病或病症。换言之，患有神经障碍的受试者可以用FDA批准的但未经FDA批准用于治
疗神经障碍(即“标示外(off-label)”适应症)的药物治疗。图3提供了FDA批准的药物的非
限制性实例，其可用于治疗所述药物未经FDA批准使用的神经障碍。例如，在申请时，氯氮平是FDA批准用于治疗精神分裂症的药物，并且也被用于“标示外”治疗焦虑症。可以预见的
是，使用本文所述的组合物和方法，氯氮平可用于治疗例如胃食管反流病症(GERD)。在另一
个非限制性实例中，哌拉平是可用于治疗肥胖症的催眠药。在又一个非限制性实例中，依维
菌素是可用于治疗慢性疼痛的抗寄生虫剂。
疗神经障碍(即“标示外(off-label)”适应症)的药物治疗。图3提供了FDA批准的药物的非
限制性实例，其可用于治疗所述药物未经FDA批准使用的神经障碍。例如，在申请时，氯氮平是FDA批准用于治疗精神分裂症的药物，并且也被用于“标示外”治疗焦虑症。可以预见的
是，使用本文所述的组合物和方法，氯氮平可用于治疗例如胃食管反流病症(GERD)。在另一
个非限制性实例中，哌拉平是可用于治疗肥胖症的催眠药。在又一个非限制性实例中，依维
菌素是可用于治疗慢性疼痛的抗寄生虫剂。
[0222] F.多核苷酸
[0223] 在多个说明性实施例中，本发明部分涵盖了多核苷酸、编码开关受体多肽的多核苷酸(包括但不限于GPCR、RASSL、DREADD、LGIC、及其亚单位和突变蛋白)，以及融合多肽、病毒载体多核苷酸和包含其的组合物。参见例如SEQ ID NO:1(表4)和图2A-2C。
[0224] 如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”或“核酸”可互换使用。它们指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸
的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区，由连锁分析、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含一或多个修饰的核苷酸，例如
甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，那么可在聚合物组装之前或之后赋予对核苷
酸结构的修饰。核苷酸序列可以间杂有非核苷酸组分。多核苷酸可在聚合后例如通过与标
记组分结合而经进一步修饰。多核苷酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或DNA/
RNA杂合体。多核苷酸可以是单链或双链的。多核苷酸包括但不限于：前信使RNA(前mRNA)、
信使RNA(mRNA)、RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、合成
RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、合成RNA、基因组DNA(gDNA)、PCR扩增DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA或重组DNA。多核苷酸是指核苷酸的至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少
500、至少1000、至少5000、至少10000或至少15000或更多个核苷酸、核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类核苷酸的修饰形式，以及所有中间长度。将容易理解的是，在这种情况下，“中间长度”是指在所引用的值之间的任何长度，例如6、7、8、9等；101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。在具体的实施例中，多核苷酸或变体与本文描述的或本领域已知的参考序列具有至少或约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，通常其中变体维持参考序列的至少一种生物学活性。
的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区，由连锁分析、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含一或多个修饰的核苷酸，例如
甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，那么可在聚合物组装之前或之后赋予对核苷
酸结构的修饰。核苷酸序列可以间杂有非核苷酸组分。多核苷酸可在聚合后例如通过与标
记组分结合而经进一步修饰。多核苷酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或DNA/
RNA杂合体。多核苷酸可以是单链或双链的。多核苷酸包括但不限于：前信使RNA(前mRNA)、
信使RNA(mRNA)、RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、合成
RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、合成RNA、基因组DNA(gDNA)、PCR扩增DNA、互补DNA(cDNA)、合成DNA或重组DNA。多核苷酸是指核苷酸的至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少
500、至少1000、至少5000、至少10000或至少15000或更多个核苷酸、核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类核苷酸的修饰形式，以及所有中间长度。将容易理解的是，在这种情况下，“中间长度”是指在所引用的值之间的任何长度，例如6、7、8、9等；101、102、103等；151、152、153等；201、202、203等。在具体的实施例中，多核苷酸或变体与本文描述的或本领域已知的参考序列具有至少或约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，通常其中变体维持参考序列的至少一种生物学活性。
[0225] 如本文所用，术语“基因”可以指包含增强子、启动子、内含子、外显子等的多核苷酸序列。在具体的实施例中，术语“基因”是指编码多肽的多核苷酸序列，而不管该多核苷酸序列是否与编码该多肽的基因组序列相同。
[0226] “调节转录的基因组序列”或“调节转录的基因组序列”或“指与基因转录相关的多核苷酸序列。在一个实施例中，基因组序列调节转录，因为它是抑制或降低转录的多肽的结合位点或与有助于转录抑制的转录因子结合位点相关的多核苷酸序列。
[0227] “调节转录的顺式作用序列”或“调节转录的顺式作用核苷酸序列”或等价物是指与基因转录相关的多核苷酸序列。在一个实施例中，顺式作用序列调节转录，因为它是抑制
或降低转录的多肽的结合位点或与有助于转录抑制的转录因子结合位点相关的多核苷酸
序列。
或降低转录的多肽的结合位点或与有助于转录抑制的转录因子结合位点相关的多核苷酸
序列。
[0228] “调控元件”或“顺式作用序列”或其等同物是指包含与编码多肽的多核苷酸序列的转录或表达相关的多核苷酸序列的表达控制序列。
[0229] “可诱导表达的调控元件”是指与待表达的多核苷酸可操作连接的是启动子，增强子或其功能片段的多核苷酸序列。用于诱导表达的调控元件响应于结合元件的分子的存在
或不存在以增加(打开)或减少(关闭)与其可操作连接的多核苷酸的表达。用于诱导表达的
说明性调控元件包括但不限于四环素反应启动子、蜕皮激素反应启动子、cumate反应启动
子、糖皮质激素反应启动子、雌激素反应启动子、RU-486反应启动子、PPAR-γ启动子和过氧化物诱导型启动子。
或不存在以增加(打开)或减少(关闭)与其可操作连接的多核苷酸的表达。用于诱导表达的
说明性调控元件包括但不限于四环素反应启动子、蜕皮激素反应启动子、cumate反应启动
子、糖皮质激素反应启动子、雌激素反应启动子、RU-486反应启动子、PPAR-γ启动子和过氧化物诱导型启动子。
[0230] “用于瞬时表达的调节元件”是指可用于短暂或暂时表达多核苷酸核苷酸序列的多核苷酸序列。在特定的实施例中，用于瞬时表达的一或多种调控元件可以用于限制多核
苷酸的持续时间。在某些实施例中，多核苷酸表达的优选持续时间在数分钟、数小时或数天
的量级。用于瞬时表达的说明性调控元件包括但不限于核酸酶靶位点，重组酶识别位点和
抑制性RNA靶位点。另外，在某些程度上，在具体的实施方式中，用于诱导表达的调控元件也可以有助于控制多核苷酸表达的持续时间。
苷酸的持续时间。在某些实施例中，多核苷酸表达的优选持续时间在数分钟、数小时或数天
的量级。用于瞬时表达的说明性调控元件包括但不限于核酸酶靶位点，重组酶识别位点和
抑制性RNA靶位点。另外，在某些程度上，在具体的实施方式中，用于诱导表达的调控元件也可以有助于控制多核苷酸表达的持续时间。
[0231] 如本文所用，术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示出实质序列同一性的多核苷酸或在下文所定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括通过添加、缺失、取代或修饰至少一个核苷酸而与参考多核苷酸不同的多核苷
酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一或多个核苷酸已被添加或缺失，或被修饰或被不同核苷酸置换的多核苷酸。在这点上，在本领域中充分理解，可以对参考多核苷酸
进行包括突变、添加、缺失和取代的某些改变，由此改变的多核苷酸保持参考多核苷酸的生
物功能或活性。
酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一或多个核苷酸已被添加或缺失，或被修饰或被不同核苷酸置换的多核苷酸。在这点上，在本领域中充分理解，可以对参考多核苷酸
进行包括突变、添加、缺失和取代的某些改变，由此改变的多核苷酸保持参考多核苷酸的生
物功能或活性。
[0232] 在一个实施例中，多核苷酸包含在严格条件下与靶核酸序列杂交的核苷酸序列。在“严格条件”下杂交描述杂交方案，其中彼此至少60％相同的核苷酸序列保持杂交。严格
条件通常被选为比规定离子强度和pH下的特异性序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm为50％的
与靶序列互补的探针与靶序列在均衡状态下杂交的温度(在规定的离子强度、pH和核酸浓
度下)。因为目标序列在Tm下一般过量存在，所以平衡状态下占据50％探针。
条件通常被选为比规定离子强度和pH下的特异性序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm为50％的
与靶序列互补的探针与靶序列在均衡状态下杂交的温度(在规定的离子强度、pH和核酸浓
度下)。因为目标序列在Tm下一般过量存在，所以平衡状态下占据50％探针。
[0233] 如本文所用，叙述“序列一致性”或例如包含“与……50％一致的序列”是指比较窗上逐核苷酸计或逐氨基酸计的序列相同程度。因此，可以如下计算“序列同一性百分比”：在比较窗上比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中存在的相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同的氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗中的总位置数量(即，窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”和“大体一致性”。“参考序列”的长度是至少12个、但常是15到18个、并且通常是至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸
可以各自包含(1)两个多核苷酸之间相似的序列(即仅完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)
两个多核苷酸之间不同的序列，因此两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过比
较两个多核苷酸在“比较窗”上的序列来鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行。“比较
窗”是指至少6个、通常约50到约100个、更通常约100到约150个连续位置的概念性区段，其
中在将两个序列最优比对后，将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列比较。与参考
序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗可以包含约20％或更少的添加或缺失(即缺口)，
用于两个序列的最佳比对。用于比对比较窗的序列的最佳比对可通过算法的计算机化实施
(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和
TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)或通过检查和通
过选择的各种方法产生的最佳比对(即在比较窗中产生最高的百分比同源性)进行。也可参
考BLAST家族的程序，例如由阿特休尔(Altschul)等人,1997,核酸研究(Nucl.Acids Res.)
25:3389揭示。序列分析的详细论述可以见于奥苏伯尔(Ausubel)等人,最新分子生物学实
验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology),约翰·威利父子公司(John
Wiley&Sons Inc),1994-1998,第15章的单元19.3中。
可以各自包含(1)两个多核苷酸之间相似的序列(即仅完整多核苷酸序列的一部分)，和(2)
两个多核苷酸之间不同的序列，因此两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过比
较两个多核苷酸在“比较窗”上的序列来鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行。“比较
窗”是指至少6个、通常约50到约100个、更通常约100到约150个连续位置的概念性区段，其
中在将两个序列最优比对后，将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列比较。与参考
序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗可以包含约20％或更少的添加或缺失(即缺口)，
用于两个序列的最佳比对。用于比对比较窗的序列的最佳比对可通过算法的计算机化实施
(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和
TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)或通过检查和通
过选择的各种方法产生的最佳比对(即在比较窗中产生最高的百分比同源性)进行。也可参
考BLAST家族的程序，例如由阿特休尔(Altschul)等人,1997,核酸研究(Nucl.Acids Res.)
25:3389揭示。序列分析的详细论述可以见于奥苏伯尔(Ausubel)等人,最新分子生物学实
验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology),约翰·威利父子公司(John
Wiley&Sons Inc),1994-1998,第15章的单元19.3中。
[0234] 如本文所用，“分离的多核苷酸”是指已经从天然存在状态的侧接序列中纯化的多核苷酸，例如从通常与片段相邻的序列中去除的DNA片段。在具体的实施例中，“分离的多核苷酸”是指互补DNA(cDNA)、重组DNA或其它在自然界中不存在且由人工制造的多核苷酸。
[0235] 描述多核苷酸方向的术语包括：5'(通常是具有游离磷酸基团的多核苷酸的末端)和3'(通常多核苷酸的末端具有游离羟基(OH)基团)。多核苷酸序列可以以5'至3'方向或3'
至5'方向标注。对于DNA和mRNA，5'到3'链被命名为“有义”、“正”或“编码”链，因为它的序列与前信使序列(premRNA)相同[RNA中的尿嘧啶(U)除外，而不是DNA中的胸腺嘧啶(T)]。对于
DNA和mRNA，由RNA聚合酶转录的链的互补3'至5'链被称为“模板”、“反义”、“负”或“非编码”链。如本文所用，术语“反向”是指以3'至5'方向书写的5'至3'序列或以5'至3'方向书写的
3'至5'序列。
至5'方向标注。对于DNA和mRNA，5'到3'链被命名为“有义”、“正”或“编码”链，因为它的序列与前信使序列(premRNA)相同[RNA中的尿嘧啶(U)除外，而不是DNA中的胸腺嘧啶(T)]。对于
DNA和mRNA，由RNA聚合酶转录的链的互补3'至5'链被称为“模板”、“反义”、“负”或“非编码”链。如本文所用，术语“反向”是指以3'至5'方向书写的5'至3'序列或以5'至3'方向书写的
3'至5'序列。
[0236] 术语“侧接”是指相对于序列位于上游多核苷酸序列和/或下游多核苷酸序列之间的多核苷酸序列，即5'和/或3'。例如，由两个其它元件(例如ITR)“侧接”的序列指示一个元件位于序列的5'，另一个位于序列的3'；然而，它们之间可能存在中间序列。
[0237] 术语“互补”和“互补性”是指由碱基配对规则关联的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，DNA序列5'A G T C A T G 3'的互补链是3'T C A G T A C 5'。后面的序列通常写成左侧是5'端和右侧是3'端的反向互补序列5'C A T G A C T 3'。与其反向互补序列相等的序
列被称为回文序列。互补可以“部分”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或，核酸之间可以存在“完全”或“全部”互补性。
列被称为回文序列。互补可以“部分”，其中仅一些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或，核酸之间可以存在“完全”或“全部”互补性。
[0238] 如本文所用的术语“核酸盒”或“表达盒”是指较大的多核苷酸例如载体内的多核苷酸序列，其足以自多核苷酸表达一或多个RNA。表达的RNA可以翻译成蛋白质，可以用作引
导RNA或抑制性RNA以靶向其它多核苷酸序列以进行切割和/或降解。在一个实施例中，核酸
盒含有一或多个相关多核苷酸。在另一个实施例中，核酸盒含有与一或多个相关多核苷酸
可操作连接的一或多个表达控制序列。多核苷酸包括相关多核苷酸。如本文所用，术语“相
关多核苷酸”是指编码多肽或融合多肽的多核苷酸或用作抑制性多核苷酸转录模板的多核
苷酸，例如如本文所设想的GPCR、RASSL、DREADD、LGIC和其亚基和突变蛋白。在一个具体的实施例中，相关多核苷酸编码具有一或多种酶活性如核酸酶活性和/或染色质重塑或表观
遗传修饰活性的多肽或融合多肽。
导RNA或抑制性RNA以靶向其它多核苷酸序列以进行切割和/或降解。在一个实施例中，核酸
盒含有一或多个相关多核苷酸。在另一个实施例中，核酸盒含有与一或多个相关多核苷酸
可操作连接的一或多个表达控制序列。多核苷酸包括相关多核苷酸。如本文所用，术语“相
关多核苷酸”是指编码多肽或融合多肽的多核苷酸或用作抑制性多核苷酸转录模板的多核
苷酸，例如如本文所设想的GPCR、RASSL、DREADD、LGIC和其亚基和突变蛋白。在一个具体的实施例中，相关多核苷酸编码具有一或多种酶活性如核酸酶活性和/或染色质重塑或表观
遗传修饰活性的多肽或融合多肽。
[0239] 载体可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核酸盒。在本发明的优选实施例中，核酸盒包含与编码开关受体的多核苷酸(例如GPCR、RASSL、DREADD、LGIC或其亚基或突变蛋白)可操作地连接的一或多种表达控制序列(例如，在神经元细胞中可操作的启动子
或增强子)。盒可以作为单个单位从其它多核苷酸序列(例如质粒或病毒载体)中去除或插
入其中。
或增强子)。盒可以作为单个单位从其它多核苷酸序列(例如质粒或病毒载体)中去除或插
入其中。
[0240] 在一个实施例中，本文考虑的多核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个核酸盒，其中任何数目或其组合可以处于相同或相反的取向。
[0241] 此外，本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在许多可编码如本文所考虑的多肽或其变体片段的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核
苷酸序列携有最小同源性。尽管如此，本发明具体来说涵盖归因于密码子使用差异而变化
的多核苷酸，例如针对人类和/或灵长类动物密码子选择而优化的多核苷酸。在一个实施例
中，提供了包含特定等位基因序列的多核苷酸。等位基因是由于一或多个突变(例如核苷酸
的缺失、添加和/或取代)而改变的内源多核苷酸序列。
苷酸序列携有最小同源性。尽管如此，本发明具体来说涵盖归因于密码子使用差异而变化
的多核苷酸，例如针对人类和/或灵长类动物密码子选择而优化的多核苷酸。在一个实施例
中，提供了包含特定等位基因序列的多核苷酸。等位基因是由于一或多个突变(例如核苷酸
的缺失、添加和/或取代)而改变的内源多核苷酸序列。
[0242] 在某个实施例中，相关多核苷酸编码抑制性多核苷酸，所述抑制性多核苷酸包括但不限于siRNA、miRNA、shRNA、核酶或另一种抑制性RNA或用于抑制RNA的系统，例如
CRISPR/CAS9系统。在具体的实施例中，相关多核苷酸是靶向与增加的对疼痛的敏感性相关
的分子的抑制性RNA，例如TNFα、Nav1.1、Nav1.3、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPC、TRPP、ACCN1、ACCN2、TRPM8、TRPA1、P2XR3、P2RY、BDKRB1、BDKRB2、Htr3A、ACCNs、KCNQ、HCN2、HCN4、CSF-1、CACNA1A-S、CACNA2D1、IL1、IL6、IL12、IL18、COX-2、NTRK1、NGF、GDNF、LIF、CCL2、CNR2、TLR2、TLR4、P2RX4、P2RX7、CCL2、CX3CR1和BDNF。
CRISPR/CAS9系统。在具体的实施例中，相关多核苷酸是靶向与增加的对疼痛的敏感性相关
的分子的抑制性RNA，例如TNFα、Nav1.1、Nav1.3、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPC、TRPP、ACCN1、ACCN2、TRPM8、TRPA1、P2XR3、P2RY、BDKRB1、BDKRB2、Htr3A、ACCNs、KCNQ、HCN2、HCN4、CSF-1、CACNA1A-S、CACNA2D1、IL1、IL6、IL12、IL18、COX-2、NTRK1、NGF、GDNF、LIF、CCL2、CNR2、TLR2、TLR4、P2RX4、P2RX7、CCL2、CX3CR1和BDNF。
[0243] 如本文所用，术语“siRNA”或“短干扰RNA”是指介导动物中的序列特异性转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表观遗传RNAi的过程的短多核苷酸序列(扎摩尔(Zamore)等人,2000,细胞(Cell),101,25-33；法尔(Fire)等人,1998,自然,391,806；汉密尔顿
(Hamilton)等人,1999,科学,286,950-951；林(Lin)等人,1999,自然,402,128-129；夏普
(Sharp),1999,基因与发育(Genes&Dev.),13,139-141；和斯特劳斯(Strauss),1999,科学,
286,886)。在某些实例中，siRNA包含具有相同数目核苷的第一链和第二链；然而，第一与第二链偏移，使得第一和第二链上的两个末端核苷与互补链上的残基不配对。在某些情况下，
不配对的两个核苷是胸苷残基。siRNA应包括与靶基因具有充足同源性的区并且就核苷酸
来说具有充足长度，使得siRNA或其片段可以介导靶基因的下调。因此，siRNA包括与靶RNA
至少部分互补的区。siRNA与标靶之间不必存在完美互补性，但对应性必须足以使得siRNA
或其裂解产物能够导引序列特异性沉默，例如通过靶RNA的RNAi裂解。与标靶链的互补性或
同源性程度对于反义链最为关键。虽然通常需要尤其反义链中的完美互补性，但一些实例
相对于靶RNA包括一或多个、但优选10、8、6、5、4、3、2个或更少的错配。错配在末端区域中是最容忍的，并且如果存在的话，优选存在于例如5'和/或3'末端的6、5、4或3个核苷酸内的一或多个末端区域中。有义链仅需要与反义链足够互补以维持分子的整体双链特征。每个
siRNA链的长度可以等于或少于30、25、24、23、22、21或20个核苷酸。链的长度优选是至少19个核苷酸。举例来说，每个链的长度可以在21与25个核苷酸之间。优选的siRNA具有17、18、
19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对的双螺旋体区，和一或多个2-3个核苷酸的突出端、优选一个或两个2-3个核苷酸的3^突出端。
(Hamilton)等人,1999,科学,286,950-951；林(Lin)等人,1999,自然,402,128-129；夏普
(Sharp),1999,基因与发育(Genes&Dev.),13,139-141；和斯特劳斯(Strauss),1999,科学,
286,886)。在某些实例中，siRNA包含具有相同数目核苷的第一链和第二链；然而，第一与第二链偏移，使得第一和第二链上的两个末端核苷与互补链上的残基不配对。在某些情况下，
不配对的两个核苷是胸苷残基。siRNA应包括与靶基因具有充足同源性的区并且就核苷酸
来说具有充足长度，使得siRNA或其片段可以介导靶基因的下调。因此，siRNA包括与靶RNA
至少部分互补的区。siRNA与标靶之间不必存在完美互补性，但对应性必须足以使得siRNA
或其裂解产物能够导引序列特异性沉默，例如通过靶RNA的RNAi裂解。与标靶链的互补性或
同源性程度对于反义链最为关键。虽然通常需要尤其反义链中的完美互补性，但一些实例
相对于靶RNA包括一或多个、但优选10、8、6、5、4、3、2个或更少的错配。错配在末端区域中是最容忍的，并且如果存在的话，优选存在于例如5'和/或3'末端的6、5、4或3个核苷酸内的一或多个末端区域中。有义链仅需要与反义链足够互补以维持分子的整体双链特征。每个
siRNA链的长度可以等于或少于30、25、24、23、22、21或20个核苷酸。链的长度优选是至少19个核苷酸。举例来说，每个链的长度可以在21与25个核苷酸之间。优选的siRNA具有17、18、
19、29、21、22、23、24或25个核苷酸对的双螺旋体区，和一或多个2-3个核苷酸的突出端、优选一个或两个2-3个核苷酸的3^突出端。
[0244] 如本文所用，术语“miRNA”或“微RNA”是指20-22个核苷酸的小的非编码RNA，通常从称为pre-miRNA的～70个核苷酸折返RNA前体结构切除。miRNA取决于与标靶之间的互补性程度以两种方式之一负调节其标靶。首先，以完美或几乎完美的互补性结合到蛋白质编
码mRNA序列的miRNA诱导RNA介导的干扰(RNAi)途径。通过结合到其mRNA标靶的3'非翻译区
(UTR)内的不完美互补位点来发挥其调节效果的miRNA通过与用于RNAi途径者类似或可能
相同的RISC复合物明显在翻译水平下抑制转录后靶基因表达。与翻译控制一致，使用此机
制的miRNA降低其靶基因的蛋白质水平，但这些基因的mRNA水平仅最低限度地受影响。
miRNA涵盖天然存在的miRNA以及可以特异性靶向任何mRNA序列的人工经设计的miRNA两
者。例如，在一个实施例中，本领域技术人员可以设计表达为人miRNA(例如，miR-30或miR-
21)初级转录物或“mishRNA”的短发夹RNA构建体。此设计向发夹构建体增添了Drosha加工
位点并且据显示可极大地增加基因敲落效率(浦西(Pusch)等人,2004)。发夹茎由22-nt的
dsRNA(例如与所要标靶具有完美互补性的反义链)和来自人miR的15-19-nt的环组成。当与
不具有微RNA的常规shRNA设计相比时，在发夹的任一侧或两侧上添加miR环和miR30侧接序
列导致所表达发夹的Drosha和切酶加工有大于10倍的增加。增加的Drosha和切酶加工转换
成更大的siRNA/miRNA产生和所表达发夹的更大效力。
码mRNA序列的miRNA诱导RNA介导的干扰(RNAi)途径。通过结合到其mRNA标靶的3'非翻译区
(UTR)内的不完美互补位点来发挥其调节效果的miRNA通过与用于RNAi途径者类似或可能
相同的RISC复合物明显在翻译水平下抑制转录后靶基因表达。与翻译控制一致，使用此机
制的miRNA降低其靶基因的蛋白质水平，但这些基因的mRNA水平仅最低限度地受影响。
miRNA涵盖天然存在的miRNA以及可以特异性靶向任何mRNA序列的人工经设计的miRNA两
者。例如，在一个实施例中，本领域技术人员可以设计表达为人miRNA(例如，miR-30或miR-
21)初级转录物或“mishRNA”的短发夹RNA构建体。此设计向发夹构建体增添了Drosha加工
位点并且据显示可极大地增加基因敲落效率(浦西(Pusch)等人,2004)。发夹茎由22-nt的
dsRNA(例如与所要标靶具有完美互补性的反义链)和来自人miR的15-19-nt的环组成。当与
不具有微RNA的常规shRNA设计相比时，在发夹的任一侧或两侧上添加miR环和miR30侧接序
列导致所表达发夹的Drosha和切酶加工有大于10倍的增加。增加的Drosha和切酶加工转换
成更大的siRNA/miRNA产生和所表达发夹的更大效力。
[0245] 如本文所用，术语“shRNA”或“短发夹RNA”是指通过单一自互补RNA链形成的双链结构。含有与靶基因的编码或非编码序列的一部分相同的核苷酸序列的shRNA构建体优选
用于抑制。相对于靶序列具有插入、缺失和单点突变的RNA序列也被发现可有效用于抑制。
抑制性RNA与靶基因部分之间的大于90％序列一致性或甚至100％序列一致性是优选的。在
某些优选的实施例中，shRNA的双链体形成部分的长度为至少20、21或22个核苷酸长度，例
如，在尺寸上与通过切酶依赖性裂解产生的RNA产物相当。在某些实例中，shRNA构建体的长
度是至少25、50、100、200、300或400个碱基。在某些实例中，shRNA构建体的长度是400-800个碱基。shRNA构建体充分容许环序列和环大小的变化。
用于抑制。相对于靶序列具有插入、缺失和单点突变的RNA序列也被发现可有效用于抑制。
抑制性RNA与靶基因部分之间的大于90％序列一致性或甚至100％序列一致性是优选的。在
某些优选的实施例中，shRNA的双链体形成部分的长度为至少20、21或22个核苷酸长度，例
如，在尺寸上与通过切酶依赖性裂解产生的RNA产物相当。在某些实例中，shRNA构建体的长
度是至少25、50、100、200、300或400个碱基。在某些实例中，shRNA构建体的长度是400-800个碱基。shRNA构建体充分容许环序列和环大小的变化。
[0246] 如本文所用，术语“核酶”是指能够使靶mRNA位点特异性裂解的催化活性RNA分子。已经描述了若干亚型，例如锤头和发夹核酶。核酶催化活性和稳定性可以通过在非催化碱
基处用脱氧核糖核苷酸取代核糖核苷酸而改进。虽然在位点特异性识别序列处使mRNA裂解
的核酶可以用以破坏特定mRNA，但使用锤头核酶是优选的。锤头核酶在由与靶mRNA形成互
补碱基对的侧接区指定的位置处使mRNA裂解。唯一要求是靶mRNA具有两种碱基的以下序
列：5′-UG-3′。锤头核酶的构建和产生在本领域中是熟知的。
基处用脱氧核糖核苷酸取代核糖核苷酸而改进。虽然在位点特异性识别序列处使mRNA裂解
的核酶可以用以破坏特定mRNA，但使用锤头核酶是优选的。锤头核酶在由与靶mRNA形成互
补碱基对的侧接区指定的位置处使mRNA裂解。唯一要求是靶mRNA具有两种碱基的以下序
列：5′-UG-3′。锤头核酶的构建和产生在本领域中是熟知的。
[0247] 无论编码序列本身的长度如何，本文考虑的多核苷酸可与其它DNA序列例如表达控制序列、调控元件、启动子和/或增强子、非翻译区(UTR)、Kozak序列、聚腺苷酸化信号、额外的限制酶位点、多克隆位点、内部核糖体进入位点(IRES)、重组酶识别位点(例如LoxP、
FRT和Att位点)、指导RNA靶位点、终止密码子、转录终止信号和编码自裂解的多核苷酸多
肽、表位标签组合，如本文别处或如本领域已知的，使得它们的总长度可以显著变化。因此
设想可以利用几乎任何长度的多核苷酸片段，总长度优选受预期重组DNA方案的制备和使
用便利性限制。
FRT和Att位点)、指导RNA靶位点、终止密码子、转录终止信号和编码自裂解的多核苷酸多
肽、表位标签组合，如本文别处或如本领域已知的，使得它们的总长度可以显著变化。因此
设想可以利用几乎任何长度的多核苷酸片段，总长度优选受预期重组DNA方案的制备和使
用便利性限制。
[0248] 多核苷酸可以使用本领域中已知并且可用的多种公认技术中的任一种制备、操纵和/或表达。为了表达期望的多肽，可将编码多肽的核苷酸序列插入合适的载体如病毒载体
中。在优选的实施例中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
中。在优选的实施例中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。
[0249] 存在于表达载体中的“表达控制序列”、“控制元件”或“调控序列”是载体的那些非翻译区-复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)内含子、聚腺苷酸化序列、5'和3'非翻译区，它们与宿主细胞蛋白质相互作用以进行转录和翻译。所述元件可以在其强度和特异性方面变化。取决于所用的载体系统和宿主，可以
使用多种适合转录与翻译元件，包括遍在启动子和诱导型启动子。
使用多种适合转录与翻译元件，包括遍在启动子和诱导型启动子。
[0250] 在具体的实施例中，用于实施本发明的多核苷酸是载体，包括但不限于表达载体和病毒载体，并且包括外源的、内源的或异源的控制序列，例如启动子和/或增强子。“内源”控制序列是天然地与基因组中的既定基因连接的控制序列。“外源”控制序列是借助于遗传
操纵(即，分子生物技术)与基因并接定位使得所述基因的转录通过所连接的增强子/启动
子导引的控制序列。“异源”控制序列是来自与所遗传操纵的细胞不同的物种的外源序列。
操纵(即，分子生物技术)与基因并接定位使得所述基因的转录通过所连接的增强子/启动
子导引的控制序列。“异源”控制序列是来自与所遗传操纵的细胞不同的物种的外源序列。
[0251] 如本文所用，术语“启动子”是指RNA聚合酶所结合到的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶起始并且转录可操作地连接到启动子的多核苷酸。在特定实例中，在哺
乳动物细胞中可操作的启动子包含位于转录起始位点上游约25到30个碱基处的富AT区，
和/或见于转录起始上游70到80个碱基处的另一序列，N可以是任何核苷酸的CNCAAT区。在
具体的实施例中，载体包含一或多种RNA pol II和/或RNA pol III启动子。
乳动物细胞中可操作的启动子包含位于转录起始位点上游约25到30个碱基处的富AT区，
和/或见于转录起始上游70到80个碱基处的另一序列，N可以是任何核苷酸的CNCAAT区。在
具体的实施例中，载体包含一或多种RNA pol II和/或RNA pol III启动子。
[0252] 适用于特定实施例的RNA pol II启动子的说明性实例包括但不限于神经元特异性启动子。
[0253] 术语“增强子”是指含有能够提供增强的转录的序列并且在一些情况下可以独立于其相对于另一控制序列的定向起作用的一段DNA。增强子可以与启动子和/或其它增强元
件协作地或叠加地起作用。术语“启动子/增强子”是指含有能够提供启动子和增强子功能
两者的序列的一段DNA。
件协作地或叠加地起作用。术语“启动子/增强子”是指含有能够提供启动子和增强子功能
两者的序列的一段DNA。
[0254] 术语“可操作地连接”是指并置，其中所描述的组件处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系中。在一个实施例中，该术语是指核酸表达控制序列(例如启动子和/或增强
子)或调控元件与第二多核苷酸序列(例如相关多核苷酸)之间的功能性连接，其中表达控
制序列控制序列或调控元件指导对应于第二序列的核酸的转录。
子)或调控元件与第二多核苷酸序列(例如相关多核苷酸)之间的功能性连接，其中表达控
制序列控制序列或调控元件指导对应于第二序列的核酸的转录。
[0255] 如本文所用，术语“组成型表达控制序列”是指不断地或连续地引起可操作地连接的序列转录的启动子、增强子或启动子/增强子。组成型表达控制序列可以是允许在多种细
胞和组织类型中表达的“遍在”启动子、增强子或启动子/增强子，或允许分别在多种限定细胞和组织类型中表达的“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子、增强子或启动子/增强子。
胞和组织类型中表达的“遍在”启动子、增强子或启动子/增强子，或允许分别在多种限定细胞和组织类型中表达的“细胞特异性”、“细胞类型特异性”、“细胞谱系特异性”或“组织特异性”启动子、增强子或启动子/增强子。
[0256] 适用于本发明具体实施例的说明性普遍存在的表达控制序列包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、病毒猿病毒40(SV40)(例如早期或晚期)、莫洛尼鼠白血病病
毒(MoMLV)LTR启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来
自痘苗病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长反应1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核翻译起始因子4A1
(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ、成员1(HSP90B1)、热休克蛋白
70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人ROSA26基因座(伊里翁斯(Irions)等人,自然生物技术(Nature Biotechnology)25,1477-1482(2007))、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1
(PGK)启动子和巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。
毒(MoMLV)LTR启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子、来
自痘苗病毒的H5、P7.5和P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长反应1(EGR1)、铁蛋白H(FerH)、铁蛋白L(FerL)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、真核翻译起始因子4A1
(EIF4A1)、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)、热休克蛋白90kDaβ、成员1(HSP90B1)、热休克蛋白
70kDa(HSP70)、β-驱动蛋白(β-KIN)、人ROSA26基因座(伊里翁斯(Irions)等人,自然生物技术(Nature Biotechnology)25,1477-1482(2007))、泛素C启动子(UBC)、磷酸甘油酸激酶-1
(PGK)启动子和巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。
[0257] 本文所述的组合物和方法可用于在细胞或组织中选择性表达开关受体。术语“选择性表达”和“靶标特异性表达”在本文中可互换使用并且指特定细胞或组织类型中蛋白质
或核酸的表达。选择性表达可能涉及使用一或多个启动子。编码开关受体的核酸分子可以
包括一或多种将开关受体的表达引导至特定细胞或组织类型的启动子。
或核酸的表达。选择性表达可能涉及使用一或多个启动子。编码开关受体的核酸分子可以
包括一或多种将开关受体的表达引导至特定细胞或组织类型的启动子。
[0258] 在特定的实施例中，可能需要使用组织特异性启动子来实现所需多核苷酸序列的细胞类型特异性，谱系特异性或组织特异性表达。根据某些实施例，细胞类型特异性启动子
对脑中发现的细胞类型(例如神经元，神经胶质细胞)具有特异性。组织特异性启动子的说
明性实例包括但不限于：胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(星形胶质细胞表达)、突触蛋白
启动子(神经元表达)和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(神经元表达)、微管蛋白αI(神经元
表达)、神经元特异性烯醇化酶(神经元表达)、血小板衍生生长因子β链(神经元表达)、
TRPV1启动子(神经元表达)、Nav1.7启动子(神经元表达)、Nav1.8启动子(神经元表达)、
Nav1.9启动子(神经元表达)或Advillin启动子(神经元表达)。
对脑中发现的细胞类型(例如神经元，神经胶质细胞)具有特异性。组织特异性启动子的说
明性实例包括但不限于：胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(星形胶质细胞表达)、突触蛋白
启动子(神经元表达)和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(神经元表达)、微管蛋白αI(神经元
表达)、神经元特异性烯醇化酶(神经元表达)、血小板衍生生长因子β链(神经元表达)、
TRPV1启动子(神经元表达)、Nav1.7启动子(神经元表达)、Nav1.8启动子(神经元表达)、
Nav1.9启动子(神经元表达)或Advillin启动子(神经元表达)。
[0259] 在一些情况下，开关受体在一或多个神经元或一组神经元中选择性表达。一或多个神经元中的选择性表达可能涉及使用一或多个神经元特异性启动子。神经元特异性启动
子的非限制性实例包括：人突触蛋白-1(SYN-1)启动子、钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIA
(CaMKIIA)启动子、微管蛋白α1启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子、衍生生长因子β链启动子(PDGFB)、TRPV1启动子、Nav1.7启动子、Nav1.8启动子、Nav1.9启动子、Advillin启动子、果蝇单一同系物1(SIM1)启动子、催产素(OXT)启动子、(AgRP)启动子、蛋白激酶C-δ(PKC-δ)启动子或生长素释放肽启动子。在某些情况下，开关受体选择性表达在感觉神经元
中。在一些情况下、开关受体在背根神经节、三叉神经节、A-β纤维、A-δ纤维、C纤维、TRPV1+神经元、Nav1.7+神经元、Nav1.8+神经元或Nav1.9+神经元。其它示例性实例包括但不限于
迷走神经、前皮质蓝细胞皮质素(POMC)神经元、下丘脑的室旁核(PVH)、下丘脑的弓形核、杏仁核中央核的外侧细分、C6星状神经节、食管下括约肌迷走神经、肌间神经丛、丘脑底核
(STN)等。开关受体可以在一或多个中间神经元、兴奋性神经元或抑制性神经元中表达。在
一些实例中，开关受体，特别是LGIC衍生的开关受体可以在一或多种可兴奋细胞或可兴奋
细胞组中表达。可兴奋的细胞是由于穿过细胞膜的离子通量而经历膜电位波动的任何细
胞。可兴奋细胞可以包括神经元细胞、肌细胞等。
子的非限制性实例包括：人突触蛋白-1(SYN-1)启动子、钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIA
(CaMKIIA)启动子、微管蛋白α1启动子、神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子、衍生生长因子β链启动子(PDGFB)、TRPV1启动子、Nav1.7启动子、Nav1.8启动子、Nav1.9启动子、Advillin启动子、果蝇单一同系物1(SIM1)启动子、催产素(OXT)启动子、(AgRP)启动子、蛋白激酶C-δ(PKC-δ)启动子或生长素释放肽启动子。在某些情况下，开关受体选择性表达在感觉神经元
中。在一些情况下、开关受体在背根神经节、三叉神经节、A-β纤维、A-δ纤维、C纤维、TRPV1+神经元、Nav1.7+神经元、Nav1.8+神经元或Nav1.9+神经元。其它示例性实例包括但不限于
迷走神经、前皮质蓝细胞皮质素(POMC)神经元、下丘脑的室旁核(PVH)、下丘脑的弓形核、杏仁核中央核的外侧细分、C6星状神经节、食管下括约肌迷走神经、肌间神经丛、丘脑底核
(STN)等。开关受体可以在一或多个中间神经元、兴奋性神经元或抑制性神经元中表达。在
一些实例中，开关受体，特别是LGIC衍生的开关受体可以在一或多种可兴奋细胞或可兴奋
细胞组中表达。可兴奋的细胞是由于穿过细胞膜的离子通量而经历膜电位波动的任何细
胞。可兴奋细胞可以包括神经元细胞、肌细胞等。
[0260] 在一些情况下，开关受体组成性表达(即，连续表达；非特异性表达)。在这些实例中，开关受体的表达可通过选择性递送或直接施用载体来控制特定细胞或组织类型。例如，
编码在组成型启动子控制下的开关受体的载体可以被直接递送到背根神经节或三叉神经
神经元。在一些情况下，开关受体的广泛表达可以通过例如在组成型启动子的控制下全身
施用编码开关受体的载体来实现。合适组成型启动子的非限制性实例包括：巨细胞病毒
(CMV)立即早期启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)LTR启动子、
劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶启动子、来自痘苗病毒的H5启动子、
来自痘苗病毒的P7.5启动子、来自痘苗病毒的P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长反应1(EGR1)启动子、铁蛋白H(FerH)启动子、铁蛋白L(FerL)启动子、甘油醛3-磷酸脱
氢酶(GAPDH)启动子、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)启动子、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)启
动子、热休克蛋白90kDaβ、成员1(HSP90B1)启动子、HSP70启动子、β-驱动蛋白(β-KIN)启动子、人ROSA26启动子、泛素C(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子和β-肌动蛋白启动子。
编码在组成型启动子控制下的开关受体的载体可以被直接递送到背根神经节或三叉神经
神经元。在一些情况下，开关受体的广泛表达可以通过例如在组成型启动子的控制下全身
施用编码开关受体的载体来实现。合适组成型启动子的非限制性实例包括：巨细胞病毒
(CMV)立即早期启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)LTR启动子、
劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶启动子、来自痘苗病毒的H5启动子、
来自痘苗病毒的P7.5启动子、来自痘苗病毒的P11启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、早期生长反应1(EGR1)启动子、铁蛋白H(FerH)启动子、铁蛋白L(FerL)启动子、甘油醛3-磷酸脱
氢酶(GAPDH)启动子、真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)启动子、热休克70kDa蛋白5(HSPA5)启
动子、热休克蛋白90kDaβ、成员1(HSP90B1)启动子、HSP70启动子、β-驱动蛋白(β-KIN)启动子、人ROSA26启动子、泛素C(UBC)启动子、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子和β-肌动蛋白启动子。
[0261] 在一些情况下，开关受体的表达可以是诱导型的(即由诱导物的存在控制)。适合使用的诱导型启动子的非限制性实例包括：四环素反应启动子、蜕皮激素反应启动子、
cumate反应启动子、糖皮质激素反应启动子、雌激素反应启动子或RU-486反应启动子。
cumate反应启动子、糖皮质激素反应启动子、雌激素反应启动子或RU-486反应启动子。
[0262] 如本文所用，“条件表达”可以指任何类型的条件表达，包括(但不限于)诱导型表达；阻抑型表达；在具有特定生理、生物或疾病状态的细胞或组织中的表达；等。此定义不打算排除细胞类型或组织特异性表达。本发明的某些实施例提供了相关多核苷酸的条件表
达，例如通过使细胞、组织、生物等经受引起多核苷酸表达或导致增加的治疗或病症来控制
表达或由相关多核苷酸编码的多核苷酸的表达降低。
达，例如通过使细胞、组织、生物等经受引起多核苷酸表达或导致增加的治疗或病症来控制
表达或由相关多核苷酸编码的多核苷酸的表达降低。
[0263] 诱导型启动子/系统的说明性实例包括(但不限于)类固醇诱导型启动子，例如用于编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(通过用相应激素处理而诱导)；金属硫蛋
白启动子(通过用各种重金属处理而诱导)；MX-1启动子(通过干扰素诱导)；“基因开关
(GeneSwitch)”米非司酮可调节系统(斯林(Sirin)等人,2003,基因(Gene),323:67)；
cumate诱导型基因开关(WO 2002/088346)；四环素依赖性调节系统等。
白启动子(通过用各种重金属处理而诱导)；MX-1启动子(通过干扰素诱导)；“基因开关
(GeneSwitch)”米非司酮可调节系统(斯林(Sirin)等人,2003,基因(Gene),323:67)；
cumate诱导型基因开关(WO 2002/088346)；四环素依赖性调节系统等。
[0264] 适用于特定实施例的启动子的说明性实例包括但不限于神经元特异性启动子。
[0265] 在具体的实施例中，本文考虑的多核苷酸包含神经元特异性启动子或在神经元细胞中有效的启动子。
[0266] 在具体的实施例中，本文考虑的多核苷酸包含可在三叉神经节(TGG)神经元或背根神经节(DRG)神经元中操作的神经元特异性启动子。
[0267] 在具体的实施例中，本文考虑的多核苷酸包含选自钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II启动子、微管蛋白αI启动子、神经元特异性烯醇酶启动子、血小板衍生生长因子β链启动子、hSYN1启动子、TRPV1启动子、Nav1.7启动子、Nav1.8启动子、Nav1.9启动子和Advillin启动子。
[0268] 在一个实施例中，与编码开关受体的多核苷酸可操作连接的神经元特异性启动子是人突触蛋白1(SYN1)启动子。
[0269] 在具体的实施例中，本文考虑的多核苷酸包含至少一个(通常两个)用于由位点特异性重组酶介导的重组的位点。如本文所用，术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”包括参与涉及一或多个重组位点(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)的重组反应的切合或整合蛋白、酶、辅因子或相关蛋白(参见兰迪(Landy),生物技术中的当前意见(Current Opinion
in Biotechnology)3:699-707(1993))，或其突变体、衍生物(例如含有重组蛋白质序列或
其片段的融合蛋白(例如，融合蛋白))、片段和变体。适用于本发明具体实施例的重组酶的
示例性实例包括但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gln、ΦC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gln、SpCCE1和ParA。
in Biotechnology)3:699-707(1993))，或其突变体、衍生物(例如含有重组蛋白质序列或
其片段的融合蛋白(例如，融合蛋白))、片段和变体。适用于本发明具体实施例的重组酶的
示例性实例包括但不限于：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gln、ΦC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gln、SpCCE1和ParA。
[0270] 多核苷酸可以包含用于多种位点特异性重组酶的任一种的一或多个重组位点。如本文所用，术语“重组序列”、“重组位点”或“位点特异性重组位点”是指重组酶所识别并且结合的特定核酸序列。
[0271] 例如，Cre重组酶的一个重组位点是loxP，其是包含8个碱基对核心序列侧接的两个13碱基对反向重复(充当重组酶结合位点)的34碱基对序列(参见索尔,B(Sauer,B.),生
物技术中的当前意见(Current Opinion in Biotechnology)5:521-527(1994)的图1)。其
它示例性的loxP位点包括但不限于：lox511(胡斯(Hoess)等人,1996；贝斯克和索尔
(Bethke and Sauer),1997)、lox5171(李和塞托(Lee and Saito),1998)、lox2272(李和塞
托(Lee and Saito),1998)、m2(朗格(Langer)等人,2002)、lox71(阿尔伯特(Albert)等人,
1995)和lox66(阿尔伯特(Albert)等人,1995)。
物技术中的当前意见(Current Opinion in Biotechnology)5:521-527(1994)的图1)。其
它示例性的loxP位点包括但不限于：lox511(胡斯(Hoess)等人,1996；贝斯克和索尔
(Bethke and Sauer),1997)、lox5171(李和塞托(Lee and Saito),1998)、lox2272(李和塞
托(Lee and Saito),1998)、m2(朗格(Langer)等人,2002)、lox71(阿尔伯特(Albert)等人,
1995)和lox66(阿尔伯特(Albert)等人,1995)。
[0272] 适用于FLP重组酶的识别位点包括但不限于：FRT(麦克莱德(McLeod)等人,1996)、F1、F2、F3(史莱克和博得(Schlake and Bode),1994)、F4、F5(史莱克和博得(Schlake and Bode),1994)、FRT(LE)(斯尼科夫(Senecoff)等人,1988)、FRT(RE)(斯尼科夫(Senecoff)等
人,1988)。
人,1988)。
[0273] 识别序列的其它实例是被重组酶λ整合酶识别的attB、attP、attL和attR序列，例如phi-c31。 SSR仅在异源位点attB(长度为34bp)和attP(长度为39bp)之间介导重组
(格罗斯(Groth)等人,2000)。分别针对细菌和噬菌体基因组上的噬菌体整合酶的连接位点
而命名的attB和attP都含有很可能与 同源二聚体结合的不完美反向重复序列(格罗
斯(Groth)等人,2000)。产物位点attL和attR对进一步 介导的重组实际上是惰性的
(贝尔特基(Belteki)等人,2003)，使得反应不可逆。对于催化插入，已经发现，与attP位点
插入到基因组attB位点中相比，携有attB的DNA更容易插入到基因组attP位点中(西格若简
(Thyagarajan)等人,2001；贝尔特基(Belteki)等人,2003)。因此，典型策略通过同源重组
将携有attP的“对接位点”安置到规定基因座中，所述基因座然后与携有attB的进入序列搭
配用于插入。
(格罗斯(Groth)等人,2000)。分别针对细菌和噬菌体基因组上的噬菌体整合酶的连接位点
而命名的attB和attP都含有很可能与 同源二聚体结合的不完美反向重复序列(格罗
斯(Groth)等人,2000)。产物位点attL和attR对进一步 介导的重组实际上是惰性的
(贝尔特基(Belteki)等人,2003)，使得反应不可逆。对于催化插入，已经发现，与attP位点
插入到基因组attB位点中相比，携有attB的DNA更容易插入到基因组attP位点中(西格若简
(Thyagarajan)等人,2001；贝尔特基(Belteki)等人,2003)。因此，典型策略通过同源重组
将携有attP的“对接位点”安置到规定基因座中，所述基因座然后与携有attB的进入序列搭
配用于插入。
[0274] 在具体的实施例中，本文考虑的多核苷酸包括编码一或多种多肽的一或多种多核苷酸。在特定实例中，为了实现多种多肽中的每一种的高效翻译，多核苷酸序列可以通过一
或多个编码自裂解多肽的IRES序列或多核苷酸序列隔开。
或多个编码自裂解多肽的IRES序列或多核苷酸序列隔开。
[0275] 如本文所用，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指促进直接内部核糖体进入到顺反子(蛋白质编码区)的起始密码子(例如ATG)，由此导致基因的帽非依赖性翻译的元件。参见例如杰克逊(Jackson)等人,1990.生物化学趋势(Trends Biochem Sci)15(12):477-83)
以及杰克逊和卡明斯基(Jackson and Kaminski).1995.RNA 1(10):985-1000。本领域技术
人员通常采用的IRES的实例包括在美国专利号6,692,736中描述的那些。本领域已知的
“IRES”的其它实例包括但不限于可从小核糖核酸病毒(杰克逊(Jackson)等人,1990)获得
的IRES和可从病毒或细胞mRNA来源获得的IRES，例如免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)、血管
内皮生长因子(VEGF)(休兹(Huez)等人1998.分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)18(11):
6178-6190)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)和胰岛素样生长因子(IGFII)、翻译起始因子
eIF4G和酵母转录因子TFIID和HAP4、脑炎性心肌炎病毒(EMCV)(其可从Novagen商购获得
(杜克(Duke)等人,1992.病毒学杂志(J.Virol)66(3):1602-9)和VEGF IRES(休兹(Huez)等
人,1998.分子细胞生物学(Mol Cell Biol)18(11):6178-90)。还在小核糖核酸病毒科、逆
转录病毒科和黄病毒科病毒基因组中以及HCV、弗里德鼠白血病病毒(FrMLV)和莫洛尼鼠白
血病病毒(MoMLV)中报道了IRES。
以及杰克逊和卡明斯基(Jackson and Kaminski).1995.RNA 1(10):985-1000。本领域技术
人员通常采用的IRES的实例包括在美国专利号6,692,736中描述的那些。本领域已知的
“IRES”的其它实例包括但不限于可从小核糖核酸病毒(杰克逊(Jackson)等人,1990)获得
的IRES和可从病毒或细胞mRNA来源获得的IRES，例如免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)、血管
内皮生长因子(VEGF)(休兹(Huez)等人1998.分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)18(11):
6178-6190)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)和胰岛素样生长因子(IGFII)、翻译起始因子
eIF4G和酵母转录因子TFIID和HAP4、脑炎性心肌炎病毒(EMCV)(其可从Novagen商购获得
(杜克(Duke)等人,1992.病毒学杂志(J.Virol)66(3):1602-9)和VEGF IRES(休兹(Huez)等
人,1998.分子细胞生物学(Mol Cell Biol)18(11):6178-90)。还在小核糖核酸病毒科、逆
转录病毒科和黄病毒科病毒基因组中以及HCV、弗里德鼠白血病病毒(FrMLV)和莫洛尼鼠白
血病病毒(MoMLV)中报道了IRES。
[0276] 在一个实施例中，本文考虑的多核苷酸中使用的IRES是EMCV IRES。
[0277] 在具体的实施例中，编码多肽的多核苷酸包含共有Kozak序列。如本文所用，术语“Kozak序列”是指极大地促进mRNA与核糖体的小亚单位的初始结合并且增加翻译的短核苷
酸序列。共有的Kozak序列是(GCC)RCCATGG(SEQ ID NO:2)，其中R是嘌呤(A或G)(科扎克
(Kozak),1986.细胞(Cell).44(2):283-92,和科扎克(Kozak),1987.核酸研究(Nucleic
Acids Res.)15(20):8125-48)。
酸序列。共有的Kozak序列是(GCC)RCCATGG(SEQ ID NO:2)，其中R是嘌呤(A或G)(科扎克
(Kozak),1986.细胞(Cell).44(2):283-92,和科扎克(Kozak),1987.核酸研究(Nucleic
Acids Res.)15(20):8125-48)。
[0278] 在具体的实施例中，多核苷酸包含编码待表达多肽的多核苷酸的聚腺苷酸化序列3'。聚腺苷酸化序列可以通过添加polyA尾到编码序列的3′端而提升mRNA稳定性，并且因此
促进翻译效率增加。裂解和聚腺苷酸化是由RNA中的poly(A)序列引导的。哺乳动物前体
mRNA的核心聚(A)序列具有位于裂解-聚腺苷酸化位点两侧的两个识别元件。通常，几乎不
变的AAUAAA六聚体位于富含U或GU残基的更可变元件上游20-50个核苷酸处。新生转录物的
裂解发生在这两个元件之间，并且与5'裂解产物添加多达250个腺苷相结合。在具体的实施
例中，核心聚(A)序列是理想的聚A序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)。在具体的实施例
中，聚(A)序列是本领域已知的SV40polyA序列、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白聚A序列(rβgpA)或另一合适的异源或内源polyA序列。
促进翻译效率增加。裂解和聚腺苷酸化是由RNA中的poly(A)序列引导的。哺乳动物前体
mRNA的核心聚(A)序列具有位于裂解-聚腺苷酸化位点两侧的两个识别元件。通常，几乎不
变的AAUAAA六聚体位于富含U或GU残基的更可变元件上游20-50个核苷酸处。新生转录物的
裂解发生在这两个元件之间，并且与5'裂解产物添加多达250个腺苷相结合。在具体的实施
例中，核心聚(A)序列是理想的聚A序列(例如，AATAAA、ATTAAA、AGTAAA)。在具体的实施例
中，聚(A)序列是本领域已知的SV40polyA序列、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白聚A序列(rβgpA)或另一合适的异源或内源polyA序列。
[0279] G.多肽
[0280] 本发明部分涵盖包含开关受体多肽的组合物，所述开关受体多肽包括但不限于GPCR、RASSL、DREADD和LGIC多肽及其亚基和突变蛋白、表达编码多肽的多核苷酸的多肽、融合多肽和载体。
[0281] “多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，除非有相反说明，并且根据常规含义，即作为任何长度的氨基酸序列或聚合物。在一个实施例中，“多肽”包括融合多肽和其它变体。可以使用多种众所周知的重组和/或合成技术中的任何一种来制备多肽。多肽不限于特定长度，例如它们可以包含全长蛋白质序列、全长蛋白质片段或融合蛋白质，并且可
以包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等，以及本领域已知的其它修饰，包括天然存在的和非天然存在的。多肽可以是任何蛋白质、肽、蛋白质片段或其组分。多肽
可以是天然存在于自然界中的蛋白质或通常在自然界中未发现的蛋白质。多肽可以主要由
标准的二十种蛋白质构建氨基酸组成，或者其可以被修饰以掺入非标准氨基酸。通常通过
添加任何数量的生化功能基团，包括磷酸化、乙酰化、酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、脂质添加(例如棕榈酰化、肉豆蔻酰化、异戊烯化等)和碳水化合物添加(例如N-连接和O-连接糖基
化等)。多肽可以在宿主细胞中发生结构改变，例如形成二硫桥或蛋白水解裂解。
以包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等等，以及本领域已知的其它修饰，包括天然存在的和非天然存在的。多肽可以是任何蛋白质、肽、蛋白质片段或其组分。多肽
可以是天然存在于自然界中的蛋白质或通常在自然界中未发现的蛋白质。多肽可以主要由
标准的二十种蛋白质构建氨基酸组成，或者其可以被修饰以掺入非标准氨基酸。通常通过
添加任何数量的生化功能基团，包括磷酸化、乙酰化、酰化、甲酰化、烷基化、甲基化、脂质添加(例如棕榈酰化、肉豆蔻酰化、异戊烯化等)和碳水化合物添加(例如N-连接和O-连接糖基
化等)。多肽可以在宿主细胞中发生结构改变，例如形成二硫桥或蛋白水解裂解。
[0282] 如本文所用，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指体外分离、纯化、重组产生或从细胞环境合成肽或多肽分子，以及来自与其它组分细胞，即它与体内物质没有显著关联。
[0283] 多肽包括具有生物活性的“多肽片段”。如本文所用，术语“生物活性片段”或“最小生物活性片段”是指保留至少100％、至少90％、至少80％、至少70％、至少60％至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％的天然存在的多肽活性。多肽片段是指可以是单体或多聚体的多肽，其具有天然存在的或重组产生的多肽的氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失或取代一或多个氨基酸。在某些实施例中，多肽片段可以包含长度为
至少5至约1700个氨基酸的氨基酸链。应该理解的是，在某些实施例中，片段长度是至少5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、
900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700或更多氨基酸。
至少5至约1700个氨基酸的氨基酸链。应该理解的是，在某些实施例中，片段长度是至少5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、
90、95、100、110、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、
900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700或更多氨基酸。
[0284] 多肽包括“多肽变体”。多肽变体与天然存在的多肽的不同在于一或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入。这样的变体可以是天然存在的，或者可以通过例如修饰开关受体多肽序列的一或多个氨基酸而合成产生(工程化)。例如，在特定实施例中，可能需要通过引
入一或多个取代、缺失、添加和/或插入至多肽中改进开关受体多肽的生物学性质或开关受
体对异源和/或合成配体的结合特异性。优选地，多肽变体包括具有至少约65％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸同一性以转换本文考虑的受体多肽。
入一或多个取代、缺失、添加和/或插入至多肽中改进开关受体多肽的生物学性质或开关受
体对异源和/或合成配体的结合特异性。优选地，多肽变体包括具有至少约65％、70％、
71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、
86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸同一性以转换本文考虑的受体多肽。
[0285] 如上所述，本文考虑的多肽可以以各种方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。在具体的实施例中，开关多肽的一或多个氨基酸被改变以赋予开关受体独特的配体
结合性质。用于此类操控的方法在本领域中一般已知。举例来说，参考多肽的氨基酸序列变
体可以通过DNA中的突变制备。突变诱发和核苷酸序列改变的方法在本领域中众所周知。例
如参见孔克尔(Kunkel)(1985,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)82:488-
492)、孔克尔(Kunkel)等人(1987,酶学方法(Methods in Enzymol),154:367-382)、美国专
利号4,873,192、沃森,J.D.(Watson,J.D.)等人(基因分子生物学(Molecular Biology of
the Gene),第4版,Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)和其中引用的参考文
献。关于不影响相关蛋白质的生物学活性的适当氨基酸替代的指导可以在戴霍夫
(Dayhoff)等人,(1978)蛋白质序列和结构的图册(Atlas of Protein Sequence and
Structure)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)发现。
结合性质。用于此类操控的方法在本领域中一般已知。举例来说，参考多肽的氨基酸序列变
体可以通过DNA中的突变制备。突变诱发和核苷酸序列改变的方法在本领域中众所周知。例
如参见孔克尔(Kunkel)(1985,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)82:488-
492)、孔克尔(Kunkel)等人(1987,酶学方法(Methods in Enzymol),154:367-382)、美国专
利号4,873,192、沃森,J.D.(Watson,J.D.)等人(基因分子生物学(Molecular Biology of
the Gene),第4版,Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)和其中引用的参考文
献。关于不影响相关蛋白质的生物学活性的适当氨基酸替代的指导可以在戴霍夫
(Dayhoff)等人,(1978)蛋白质序列和结构的图册(Atlas of Protein Sequence and
Structure)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)发现。
[0286] 在某些实施例中，变体将含有一或多个保守取代。“保守取代”为氨基酸经另一个具有类似特性的氨基酸取代，使得肽化学方法领域的技术人员将预期多肽的二级结构和亲
水性质大体上不变。可以对本发明的多核苷酸和多肽的结构进行修饰，并且仍获得编码具
有期望特征的变体或衍生多肽的功能分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以产生等同的或
甚至改进的本发明的变体多肽时，例如，本领域技术人员可以改变编码DNA的一或多个密码
子序列，例如根据表3。
水性质大体上不变。可以对本发明的多核苷酸和多肽的结构进行修饰，并且仍获得编码具
有期望特征的变体或衍生多肽的功能分子。当期望改变多肽的氨基酸序列以产生等同的或
甚至改进的本发明的变体多肽时，例如，本领域技术人员可以改变编码DNA的一或多个密码
子序列，例如根据表3。
[0287] 表3.氨基酸密码子
[0288]
[0289] 可以使用本领域熟知的计算机程序(例如DNASTARTM软件)找到确定哪些氨基酸残基可被取代、插入或缺失而不消除生物活性的指导。优选地，本文揭示的蛋白质变体中的氨
基酸变化是保守性氨基酸变化，即具有类似电荷或不具有电荷的氨基酸的取代。保守的氨
基酸改变包括取代其侧链相关的氨基酸家族之一。天然存在的氨基酸通常分为四类：酸性
(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时会共同分类为芳香族氨基酸。在肽或蛋白质中，合适的氨基酸保守取代是本领域技术人员已知的，并且通常
可以在不改变所得分子的生物学活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，通常，多肽的
非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性(参见例如沃森(Watson)等人基
因分子生物学(Molecular Biology of the Gene),第4版,1987,The Benjamin/Cummings
Pub.Co.,第224页)。
基酸变化是保守性氨基酸变化，即具有类似电荷或不具有电荷的氨基酸的取代。保守的氨
基酸改变包括取代其侧链相关的氨基酸家族之一。天然存在的氨基酸通常分为四类：酸性
(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时会共同分类为芳香族氨基酸。在肽或蛋白质中，合适的氨基酸保守取代是本领域技术人员已知的，并且通常
可以在不改变所得分子的生物学活性的情况下进行。本领域技术人员认识到，通常，多肽的
非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性(参见例如沃森(Watson)等人基
因分子生物学(Molecular Biology of the Gene),第4版,1987,The Benjamin/Cummings
Pub.Co.,第224页)。
[0290] 在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。本领域中一般理解亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物功能中的重要性(凯特和杜利特尔(Kyte and
Doolittle),1982，以引用的方式并入本文中)。根据其疏水性和电荷特性，每种氨基酸都被
赋予亲水指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些值是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨
酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；
甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-
1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；
赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
Doolittle),1982，以引用的方式并入本文中)。根据其疏水性和电荷特性，每种氨基酸都被
赋予亲水指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些值是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨
酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；
甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-
1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；
赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
[0291] 本领域已知，某些氨基酸可被具有相似亲水指数或得分的其它氨基酸取代，并仍然产生具有相似生物学活性的蛋白质，即仍获得生物功能等价蛋白质。在进行这种改变时，
亲水指数在±2以内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的氨基酸是特别优选的，在±0.5
以内的那些是甚至更特别优选的。本领域中还应理解可以基于亲水性有效进行类似的氨基
酸取代。
亲水指数在±2以内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的氨基酸是特别优选的，在±0.5
以内的那些是甚至更特别优选的。本领域中还应理解可以基于亲水性有效进行类似的氨基
酸取代。
[0292] 如美国专利第4,554,101号所详述，以下亲水性值已归属于氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+
0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-
1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应理解，氨基酸可以是经具有类似亲水性值的另一个氨基酸取代并且仍获得生物等效蛋白质，并且尤其免疫等效蛋白质。在这
样的变化中，亲水性值在±2以内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的氨基酸是特别优
选的，在±0.5以内的那些是甚至更特别优选的。
0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-
1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应理解，氨基酸可以是经具有类似亲水性值的另一个氨基酸取代并且仍获得生物等效蛋白质，并且尤其免疫等效蛋白质。在这
样的变化中，亲水性值在±2以内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的氨基酸是特别优
选的，在±0.5以内的那些是甚至更特别优选的。
[0293] 如上所述，氨基酸取代可以基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。
[0294] 多肽变体还包括糖基化形式，与其它分子的聚集缀合物，以及与不相关化学部分(例如聚乙二醇化分子)的共价缀合物。如本领域已知的，共价变体可通过将功能性连接至
在氨基酸链中或在N-或C-末端残基处发现的基团来制备。变体还包括等位变体，物种变体
和突变蛋白。不影响蛋白质功能活性的区域的截短或缺失也是变体。
在氨基酸链中或在N-或C-末端残基处发现的基团来制备。变体还包括等位变体，物种变体
和突变蛋白。不影响蛋白质功能活性的区域的截短或缺失也是变体。
[0295] 本发明的多肽包括融合多肽。在具体的实施例中，提供了融合多肽和编码融合多肽的多核苷酸。融合多肽和融合蛋白是指具有至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个多肽片段的多肽。
[0296] 融合多肽可以包含一或多个多肽结构域或片段，包括但不限于细胞渗透性肽结构域(CPP)、锌指DNA结合结构域、核酸酶结构域、染色质重塑结构域、组蛋白修饰结构域和表
观遗传修饰结构域、表位标签(例如麦芽糖结合蛋白(“MBP”)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、
HIS6、MYC、FLAG、V5、VSV-G和HA))、多肽连接子和多肽裂解信号。融合多肽通常连接C端至N端，尽管它们也可以连接C端至C端、N端至N端或N端至C端。融合蛋白的多肽可以采取任何顺
序。融合多肽或融合蛋白也可以包括保守修饰的变体、多态性变体、等位基因、突变体、子序列和种间同源物，只要融合多肽的所需转录活性被保留即可。融合多肽可以通过化学合成
方法或通过两个部分之间的化学连接来产生，或者可以通常使用其它标准技术来制备。如
本文其它地方所述，包含融合多肽的连接的DNA序列可操作地连接至合适的转录或翻译控
制元件。
观遗传修饰结构域、表位标签(例如麦芽糖结合蛋白(“MBP”)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、
HIS6、MYC、FLAG、V5、VSV-G和HA))、多肽连接子和多肽裂解信号。融合多肽通常连接C端至N端，尽管它们也可以连接C端至C端、N端至N端或N端至C端。融合蛋白的多肽可以采取任何顺
序。融合多肽或融合蛋白也可以包括保守修饰的变体、多态性变体、等位基因、突变体、子序列和种间同源物，只要融合多肽的所需转录活性被保留即可。融合多肽可以通过化学合成
方法或通过两个部分之间的化学连接来产生，或者可以通常使用其它标准技术来制备。如
本文其它地方所述，包含融合多肽的连接的DNA序列可操作地连接至合适的转录或翻译控
制元件。
[0297] 融合多肽可以任选地包含可用于连接一或多个多肽的连接子。肽连接子序列可用于将任何两种或更多种多肽组分分离足够的距离以确保每种多肽折叠成其适当的二级和
三级结构以便允许多肽域发挥其期望的功能。使用本领域的标准技术将此类肽连接子序列
掺入融合多肽中。可以基于以下因素来选择合适的肽连接子序列：(1)它们采用柔性延伸构
象的能力；(2)它们不能采用可与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；和
(3)缺少可能与多肽功能性表位反应的疏水性或带电残基。优选的肽连接子序列含有Gly、
Asn和Ser残基。其它接近中性的氨基酸，例如Thr和Ala也可用于连接子序列中。可以有用地
用作连接子的氨基酸序列包括马拉泰阿(Maratea)等人,基因(Gene)40:39-46,1985；墨菲
(Murphy)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83:8258-8262,1986；美国
专利号4,935,233和美国专利号4,751,180中揭示的那些。当特定融合多肽片段含有可用于
分离功能结构域并防止空间干扰的非必需N端氨基酸区域时，不需要连接子序列。优选的连
接子通常是作为重组融合蛋白的一部分合成的柔性氨基酸亚序列。连接子多肽的长度可以
在1至200个氨基酸之间，长度在1至100个氨基酸之间，或长度在1至50个氨基酸之间，包括
两者之间的所有整数值。
三级结构以便允许多肽域发挥其期望的功能。使用本领域的标准技术将此类肽连接子序列
掺入融合多肽中。可以基于以下因素来选择合适的肽连接子序列：(1)它们采用柔性延伸构
象的能力；(2)它们不能采用可与第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；和
(3)缺少可能与多肽功能性表位反应的疏水性或带电残基。优选的肽连接子序列含有Gly、
Asn和Ser残基。其它接近中性的氨基酸，例如Thr和Ala也可用于连接子序列中。可以有用地
用作连接子的氨基酸序列包括马拉泰阿(Maratea)等人,基因(Gene)40:39-46,1985；墨菲
(Murphy)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83:8258-8262,1986；美国
专利号4,935,233和美国专利号4,751,180中揭示的那些。当特定融合多肽片段含有可用于
分离功能结构域并防止空间干扰的非必需N端氨基酸区域时，不需要连接子序列。优选的连
接子通常是作为重组融合蛋白的一部分合成的柔性氨基酸亚序列。连接子多肽的长度可以
在1至200个氨基酸之间，长度在1至100个氨基酸之间，或长度在1至50个氨基酸之间，包括
两者之间的所有整数值。
[0298] 示例性连接子包括但不限于以下氨基酸序列：DGGGS(SEQ ID NO:3)；TGEKP(SEQID NO:4)(参见例如刘(Liu)等人,PNAS 5525-5530(1997))；GGRR(SEQ ID NO:5)(波梅兰茨
(Pomerantz)等人1995,上文)；(GGGGS)n(SEQ ID NO:6)(金(Kim)等人,PNAS 93,1156-1160
(1996.)；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO:7)(肖德哈利(Chaudhary)等人,1990,美国国家科学
院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:
8)(伯德(Bird)等人,1988,科学(Science)242:423-426),GGRRGGGS(SEQ ID NO:9)；
LRQRDGERP(SEQ ID NO:10)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO:11)；LRQKd(GGGS)2ERP(SEQ ID NO:
12)。或者，可以使用能够模拟DNA结合位点和肽本身(德拉斯和博格(Desjarlais&Berg),
PNAS 90:2256-2260(1993),PNAS 91:11099-11103(1994))的计算机程序或通过噬菌体展
示方法合理设计柔性连接子。
(Pomerantz)等人1995,上文)；(GGGGS)n(SEQ ID NO:6)(金(Kim)等人,PNAS 93,1156-1160
(1996.)；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO:7)(肖德哈利(Chaudhary)等人,1990,美国国家科学
院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87:1066-1070)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:
8)(伯德(Bird)等人,1988,科学(Science)242:423-426),GGRRGGGS(SEQ ID NO:9)；
LRQRDGERP(SEQ ID NO:10)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO:11)；LRQKd(GGGS)2ERP(SEQ ID NO:
12)。或者，可以使用能够模拟DNA结合位点和肽本身(德拉斯和博格(Desjarlais&Berg),
PNAS 90:2256-2260(1993),PNAS 91:11099-11103(1994))的计算机程序或通过噬菌体展
示方法合理设计柔性连接子。
[0299] 融合多肽可以进一步包含本文所述的每个多肽域之间的多肽裂解信号。另外，可以将多肽位点放入任何连接子肽序列中。示例性的多肽裂解信号包括多肽裂解识别位点，
例如蛋白酶裂解位点、核酸酶裂解位点(例如稀有限制性酶识别位点、自裂解核酶识别位
点)和自裂解病毒寡肽(参见德菲利普和瑞恩(deFelipe and Ryan),2004.通行(Traffic),
5(8)；6162004)。
例如蛋白酶裂解位点、核酸酶裂解位点(例如稀有限制性酶识别位点、自裂解核酶识别位
点)和自裂解病毒寡肽(参见德菲利普和瑞恩(deFelipe and Ryan),2004.通行(Traffic),
5(8)；6162004)。
[0300] 合适的蛋白酶裂解位点和自裂解肽是本领域技术人员已知的(参见例如瑞恩(Ryan)等人,1997.普通病毒学杂志(J.Gener.Virol.)78,699-722；西姆扎克(Scymczak)等
人(2004)自然生物技术(Nature Biotech.)5,589-594)。示例性的蛋白酶裂解位点包括但
不限于马铃薯Y病毒NIa蛋白酶(例如烟草蚀纹病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯
Y病毒P1(P35)蛋白酶、byovirus NIa蛋白酶、byovirus RNA-2编码的蛋白酶、口蹄疫病毒L
蛋白酶、肠道病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、微小RNA病毒3C蛋白酶、豇豆花叶病毒
(comovirus)24K蛋白酶、线虫传多面体病毒(nepovirus)24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球形
病毒(rice tungro spherical virus))3C样蛋白酶、PYVF(欧洲防风黄点病毒(parsnip
yellow fleck virus))3C样蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa和肠激酶的裂解位点。由于其高
裂解严格性，在一个实施例中，优选TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶裂解位点，例如EXXYXQ(G/S)
(SEQ ID NO:13)，例如ENLYFQG(SEQ ID NO:14)和ENLYFQS(SEQ ID NO:15)，其中X代表任何
氨基酸(通过TEV裂解发生在Q和G或Q和S之间)。
人(2004)自然生物技术(Nature Biotech.)5,589-594)。示例性的蛋白酶裂解位点包括但
不限于马铃薯Y病毒NIa蛋白酶(例如烟草蚀纹病毒蛋白酶)、马铃薯Y病毒HC蛋白酶、马铃薯
Y病毒P1(P35)蛋白酶、byovirus NIa蛋白酶、byovirus RNA-2编码的蛋白酶、口蹄疫病毒L
蛋白酶、肠道病毒2A蛋白酶、鼻病毒2A蛋白酶、微小RNA病毒3C蛋白酶、豇豆花叶病毒
(comovirus)24K蛋白酶、线虫传多面体病毒(nepovirus)24K蛋白酶、RTSV(水稻东格鲁球形
病毒(rice tungro spherical virus))3C样蛋白酶、PYVF(欧洲防风黄点病毒(parsnip
yellow fleck virus))3C样蛋白酶、肝素、凝血酶、因子Xa和肠激酶的裂解位点。由于其高
裂解严格性，在一个实施例中，优选TEV(烟草蚀纹病毒)蛋白酶裂解位点，例如EXXYXQ(G/S)
(SEQ ID NO:13)，例如ENLYFQG(SEQ ID NO:14)和ENLYFQS(SEQ ID NO:15)，其中X代表任何
氨基酸(通过TEV裂解发生在Q和G或Q和S之间)。
[0301] 在某些实施例中，自裂解多肽位点包含2A或2A样位点、序列或结构域(唐纳利(Donnelly)等人,2001.普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)82:1027-1041)。在一个具体的实
施例中，病毒2A肽是口蹄疫病毒2A肽、马铃薯Y病毒2A肽或心脏病毒2A肽。在一个实施例中，病毒2A肽选自：口蹄疫病毒(FMDV)2A肽、马鼻炎A病毒(ERAV)2A肽、明脉扁刺蛾β四体
(Thosea asigna)病毒(TaV)2A肽、猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1(PTV-1)2A肽、泰
勒病毒(Theilovirus)2A肽和脑心肌炎病毒2A肽。
施例中，病毒2A肽是口蹄疫病毒2A肽、马铃薯Y病毒2A肽或心脏病毒2A肽。在一个实施例中，病毒2A肽选自：口蹄疫病毒(FMDV)2A肽、马鼻炎A病毒(ERAV)2A肽、明脉扁刺蛾β四体
(Thosea asigna)病毒(TaV)2A肽、猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1(PTV-1)2A肽、泰
勒病毒(Theilovirus)2A肽和脑心肌炎病毒2A肽。
[0302] H.病毒载体
[0303] 在一些方面，将编码开关受体的核酸分子递送至受试者。在一些情况下，通过载体将编码开关受体的核酸分子递送至受试者。在各种实施例中，载体包含本文考虑的一或多
种多核苷酸序列。术语“载体”在本文中用以指能够转移或输送另一核酸分子的核酸分子。
通常将转移的核酸连接至例如插入载体核酸分子中。载体可以包括在细胞中直接自主复制
的序列，或可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。载体可以将靶核酸递送至生物
体、细胞或细胞组分。在某些情况下，药物是合成配体。如本文所用的“表达载体”是指能够促进表达以及掺入其中的核酸的复制的载体，例如质粒。通常，待表达的核酸与启动子和/
或增强子“可操作地连接”，并受到启动子和/或增强子的转录调控控制。在特定情况下，使用载体将编码本发明的开关受体的核酸分子递送至受试者。
种多核苷酸序列。术语“载体”在本文中用以指能够转移或输送另一核酸分子的核酸分子。
通常将转移的核酸连接至例如插入载体核酸分子中。载体可以包括在细胞中直接自主复制
的序列，或可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。载体可以将靶核酸递送至生物
体、细胞或细胞组分。在某些情况下，药物是合成配体。如本文所用的“表达载体”是指能够促进表达以及掺入其中的核酸的复制的载体，例如质粒。通常，待表达的核酸与启动子和/
或增强子“可操作地连接”，并受到启动子和/或增强子的转录调控控制。在特定情况下，使用载体将编码本发明的开关受体的核酸分子递送至受试者。
[0304] 在具体的实施例中，可以使用适于将编码开关受体的表达盒或多核苷酸引入神经元细胞的任何载体。合适载体的说明性实例包括例如质粒(例如DNA质粒或RNA质粒)、转座
子、粘粒、细菌人造染色体和病毒载体。在一些情况下，载体是环状核酸，例如质粒、BAC、PAC、YAC、粘粒、福斯粘粒(fosmid)等。在一些情况下，环形核酸分子可用于将编码开关受体的核酸分子递送至受试者。例如，可将编码开关受体的质粒DNA分子引入受试者的细胞中，
由此将编码开关受体的DNA序列转录成mRNA并将mRNA“信息”翻译成蛋白质产物。环状核酸
载体通常将包括调控靶蛋白表达的调节元件。例如，环状核酸载体可以包括任何数量的启
动子、增强子、终止子、剪接信号、复制起点、起始信号等。
子、粘粒、细菌人造染色体和病毒载体。在一些情况下，载体是环状核酸，例如质粒、BAC、PAC、YAC、粘粒、福斯粘粒(fosmid)等。在一些情况下，环形核酸分子可用于将编码开关受体的核酸分子递送至受试者。例如，可将编码开关受体的质粒DNA分子引入受试者的细胞中，
由此将编码开关受体的DNA序列转录成mRNA并将mRNA“信息”翻译成蛋白质产物。环状核酸
载体通常将包括调控靶蛋白表达的调节元件。例如，环状核酸载体可以包括任何数量的启
动子、增强子、终止子、剪接信号、复制起点、起始信号等。
[0305] 在某些情况下，载体可以包含复制子。复制子可以是能够自我复制的任何核酸分子。在一些情况下，复制子是从病毒衍生的RNA复制子。可以获得多种合适的病毒(例如RNA
病毒)，包括但不限于甲病毒、小核糖核酸病毒、黄病毒、冠状病毒、瘟病毒、风疹病毒、杯状病毒(calcivirus)和肝炎病毒。
病毒)，包括但不限于甲病毒、小核糖核酸病毒、黄病毒、冠状病毒、瘟病毒、风疹病毒、杯状病毒(calcivirus)和肝炎病毒。
[0306] 在一个实施例中，载体是病毒载体。在某些情况下，病毒载体来自复制缺陷型病毒。适用于将本发明的核酸分子递送至受试者的病毒载体的非限制性实例包括衍生自腺病
毒、逆转录病毒(例如慢病毒)、腺相关病毒(AAV)和单纯疱疹-1(HSV-1))的那些。合适的病
毒载体的说明性实例包括但不限于逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)、基于疱疹病毒的载
体和基于细小病毒的载体(例如基于腺相关病毒(AAV)的载体、AAV-腺病毒嵌合载体和基于
腺病毒的载体)。
毒、逆转录病毒(例如慢病毒)、腺相关病毒(AAV)和单纯疱疹-1(HSV-1))的那些。合适的病
毒载体的说明性实例包括但不限于逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)、基于疱疹病毒的载
体和基于细小病毒的载体(例如基于腺相关病毒(AAV)的载体、AAV-腺病毒嵌合载体和基于
腺病毒的载体)。
[0307] 如本文所用的术语“细小病毒”涵盖所有细小病毒，包括自主复制的细小病毒和病毒依赖病毒。自主细小病毒包括细小病毒、红细胞病毒、浓核病毒、艾特拉病毒
(Iteravirus)和康特拉病毒(Contravirus)属的成员。示例性的自主细小病毒包括但不限
于小鼠微小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫白细胞减少症病毒、猫细小病
毒、鹅细小病毒和B19病毒。其它自主细小病毒是本领域技术人员已知的。参见例如菲尔兹
(Fields)等人,1996病毒学(Virology),第2卷,第69章(第3版,Lippincott-Raven
Publishers)。
(Iteravirus)和康特拉病毒(Contravirus)属的成员。示例性的自主细小病毒包括但不限
于小鼠微小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫白细胞减少症病毒、猫细小病
毒、鹅细小病毒和B19病毒。其它自主细小病毒是本领域技术人员已知的。参见例如菲尔兹
(Fields)等人,1996病毒学(Virology),第2卷,第69章(第3版,Lippincott-Raven
Publishers)。
[0308] 依赖病毒属包含腺相关病毒(AAV)，包括但不限于AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和绵羊AAV。
[0309] 在一个优选的实施例中，载体是AAV载体。在特定情况下，病毒载体是AAV-6或AAV9载体。在一些实施例中，AAV载体包含SEQ ID NO:1。
[0310] 所有已知的AAV血清型的基因组组织是相似的。AAV的基因组是长度小于约5,000个核苷酸(nt)的线性单链DNA分子。倒转末端重复序列(ITRs)侧接非结构复制(Rep)蛋白和
结构(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列。VP蛋白(VP1、-2和-3)形成衣壳并有助于病毒的向
性。末端145nt ITR是自我互补的，并且被组织成使得可以形成能量上稳定的分子内双链
体，从而形成T形发夹。这些发夹结构作为病毒DNA复制的起点，充当细胞DNA聚合酶复合物
的引物。在哺乳动物细胞中野生型(wt)AAV感染后，Rep基因在病毒基因组复制中表达并起
作用。
结构(VP)蛋白的独特编码核苷酸序列。VP蛋白(VP1、-2和-3)形成衣壳并有助于病毒的向
性。末端145nt ITR是自我互补的，并且被组织成使得可以形成能量上稳定的分子内双链
体，从而形成T形发夹。这些发夹结构作为病毒DNA复制的起点，充当细胞DNA聚合酶复合物
的引物。在哺乳动物细胞中野生型(wt)AAV感染后，Rep基因在病毒基因组复制中表达并起
作用。
[0311] 在一些情况下，病毒载体的外部蛋白“衣壳”在自然界中发生，例如AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10。在特定情况下，衣壳被合成地工程化(例如通过定向进化或合理设计)以具有某些在自然界中不存在的独特特征，例如改变的向性，增加的转导效率或免疫逃避。合理设计的衣壳的实例是VP3病毒衣壳蛋白上一或多
个表面暴露的酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和赖氨酸(K)残基的突变。其VP3衣壳蛋白
已经合成工程改造并且可用于本文提供的组合物和方法的病毒载体的非限制性实例包括：
AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3(Y705+731F)、AAV5(Y436+693
+719F)、AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV8(Y733F)、AAV9(Y731F)和AAV10(Y733F)。已经通过定向进化工程化并适用于本文提供的组合物和方法的病毒载体的非限制性实例包括AAV-7m8
和AAV-ShH10。
个表面暴露的酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和赖氨酸(K)残基的突变。其VP3衣壳蛋白
已经合成工程改造并且可用于本文提供的组合物和方法的病毒载体的非限制性实例包括：
AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3(Y705+731F)、AAV5(Y436+693
+719F)、AAV6(Y705+731F+T492V)、AAV8(Y733F)、AAV9(Y731F)和AAV10(Y733F)。已经通过定向进化工程化并适用于本文提供的组合物和方法的病毒载体的非限制性实例包括AAV-7m8
和AAV-ShH10。
[0312] 本文中的“重组细小病毒或AAV载体”(或“rAAV载体”)是指包含一或多个本文涵盖的多核苷酸的载体，其侧接一或多个AAV ITR。当存在于表达AAV rep和cap基因产物(即AAV
Rep和Cap蛋白)的昆虫宿主细胞中时，可将这种rAAV载体复制并包装入感染性病毒颗粒中。
当将rAAV载体并入较大的核酸构建体(例如，在染色体中或用于另一载体如用于克隆或转
染的质粒或杆状病毒中)时，则rAAV载体通常称为“原载体”在AAV包装功能和必要的辅助功
能的存在下，可以通过复制和包装进行“拯救”。
Rep和Cap蛋白)的昆虫宿主细胞中时，可将这种rAAV载体复制并包装入感染性病毒颗粒中。
当将rAAV载体并入较大的核酸构建体(例如，在染色体中或用于另一载体如用于克隆或转
染的质粒或杆状病毒中)时，则rAAV载体通常称为“原载体”在AAV包装功能和必要的辅助功
能的存在下，可以通过复制和包装进行“拯救”。
[0313] 在具体的实施例中，任何AAV ITR可用于AAV载体，包括来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVl 1、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16。在一个优选的实施例中，本文涵盖的AAV载体包含一或多种AAV2 ITR。
[0314] 包含两个ITR的rAAV载体具有约4.4kB的有效载荷容量。自我互补的rAAV载体含有第三个ITR并包装载体重组部分的两条链，对本文考虑的多核苷酸仅留下约2.1kB。在一个
实施例中，AAV载体是scAAV载体。
实施例中，AAV载体是scAAV载体。
[0315] 使用双重rAAV载体策略已经实现了大约是rAAV包装容量(约9kB)的两倍的扩展包装容量。可用于产生本文考虑的rAAV的双载体策略包括但不限于剪接(反式剪接)、同源重
组(重叠)或两者(杂合体)的组合。在双重AAV反式剪接策略中，剪接供体(SD)信号位于5'-
半载体的3'末端，并且剪接受体(SA)信号位于3'-半载体的5'末端。通过双AAV载体和两个
半部分的反向末端重复(ITR)介导的头尾连接共同感染同一细胞时，反式剪接导致产生成
熟的mRNA和全长蛋白(严(Yan)等人,2000)。反式剪接已成功用于表达肌肉和视网膜中的大
型基因(瑞奇(Reich)等人,2003；赖(Lai)等人,2005)。或者，包含在双重AAV载体中的大型
转基因表达盒的两半可含有同源重叠序列(在5'-半载体的3'末端和3'-半载体的5'末端，
双重AAV重叠)，其将通过同源重组介导重建单个大基因组(段(Duan)等人,2001)。这个策略
取决于转基因重叠序列的重组性质(戈什(Ghosh)等人,2006)。第三种双重AAV策略(杂交)
基于将来自外源基因(即，碱性磷酸酶；戈什(Ghosh)等人,2008,戈什(Ghosh)等人,2011)的
高度重组基因区域添加至反式剪接载体。添加的区域位于5'-半载体中SD信号的下游和3'-
半载体中SA信号的上游以增加双重AAV之间的重组。
组(重叠)或两者(杂合体)的组合。在双重AAV反式剪接策略中，剪接供体(SD)信号位于5'-
半载体的3'末端，并且剪接受体(SA)信号位于3'-半载体的5'末端。通过双AAV载体和两个
半部分的反向末端重复(ITR)介导的头尾连接共同感染同一细胞时，反式剪接导致产生成
熟的mRNA和全长蛋白(严(Yan)等人,2000)。反式剪接已成功用于表达肌肉和视网膜中的大
型基因(瑞奇(Reich)等人,2003；赖(Lai)等人,2005)。或者，包含在双重AAV载体中的大型
转基因表达盒的两半可含有同源重叠序列(在5'-半载体的3'末端和3'-半载体的5'末端，
双重AAV重叠)，其将通过同源重组介导重建单个大基因组(段(Duan)等人,2001)。这个策略
取决于转基因重叠序列的重组性质(戈什(Ghosh)等人,2006)。第三种双重AAV策略(杂交)
基于将来自外源基因(即，碱性磷酸酶；戈什(Ghosh)等人,2008,戈什(Ghosh)等人,2011)的
高度重组基因区域添加至反式剪接载体。添加的区域位于5'-半载体中SD信号的下游和3'-
半载体中SA信号的上游以增加双重AAV之间的重组。
[0316] “杂交AAV”或“杂交rAAV”是指与不同AAV血清型(并且优选地，与一或多种AAV ITR不同的血清型)的衣壳包装的rAAV基因组，并且可以另外称为假型rAAV。例如，rAAV型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16基因组可以包装在AAV型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15或16衣壳或其变体中，条件是AAV衣壳和基因组(并且优选地，一或多种AAV ITR)具有不同的血清型。在某些实施例中，假型rAAV颗粒可以称为“x/y”型，其中“x”指示ITR来源，“y”指示衣壳血清型，例如2/5rAAV颗粒具有来自AAV2的ITR和来自AAV6的衣壳。
11、12、13、14、15或16衣壳或其变体中，条件是AAV衣壳和基因组(并且优选地，一或多种AAV ITR)具有不同的血清型。在某些实施例中，假型rAAV颗粒可以称为“x/y”型，其中“x”指示ITR来源，“y”指示衣壳血清型，例如2/5rAAV颗粒具有来自AAV2的ITR和来自AAV6的衣壳。
[0317] 在一个说明性实施例中，AAV载体包含一或多种AAV ITR和一或多种来自AAV血清型的衣壳蛋白，所述AAV血清型选自由AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2(Y444+500+730F
+T491V)、AAV3(Y705+731F)、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3变体Y705F/
Y731F/T492V)、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变体Y731F)、AAV10(Y733F)和AAV-ShH10组成的群组。
+T491V)、AAV3(Y705+731F)、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3变体Y705F/
Y731F/T492V)、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变体Y731F)、AAV10(Y733F)和AAV-ShH10组成的群组。
[0318] 在一个说明性实施例中，AAV载体包含一或多种AAV2ITR和一或多种选自AAV血清型的衣壳蛋白，所述AAV血清型选自由AAV1,AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2(Y444+500+730F
+T491V)、AAV3(Y705+731F)、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3变体Y705F/
Y731F/T492V)、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变体Y731F)、AAV10(Y733F)和AAV-ShH10组成的群组。
+T491V)、AAV3(Y705+731F)、AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3变体Y705F/
Y731F/T492V)、AAV-7m8、AAV8、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变体Y731F)、AAV10(Y733F)和AAV-ShH10组成的群组。
[0319] 在一个说明性实施例中，AAV载体包含一或多种AAV2ITR和一或多种选自AAV血清型的衣壳蛋白，所述AAV血清型选自由AAV1、AAV5、AAV6、AAV6(VP3变体Y705F/Y731F/
T492V)、AAV8、AAV9和AAV9(VP3变体Y731F)组成的群组。
T492V)、AAV8、AAV9和AAV9(VP3变体Y731F)组成的群组。
[0320] 在另一个说明性实施例中，AAV载体包含一或多种AAV2ITR和一或多种来自AAV血清型的衣壳蛋白，所述AAV血清型选自由AAV6、AAV6(VP3变体Y705F/Y731F/T492V)、AAV9和
AAV9(VP3变体Y731F)组成的群组。
AAV9(VP3变体Y731F)组成的群组。
[0321] 在一个说明性实施例中，AAV载体包含一或多种AAV2ITR和一或多种来自AAV血清型的衣壳蛋白，所述AAV血清型选自由AAV9和AAV9(VP3变体Y731F)组成的群组。
[0322] 在一个说明性实施例中，AAV载体包含一或多种AAV2ITR和一或多种来自AAV血清型的衣壳蛋白，所述AAV血清型选自由AAV6和AAV6(VP3变体Y705F/Y731F/T492V)组成的群
组。
组。
[0323] 在一个示例性实施例中，AAV载体包含一或多种AAV2ITR和一或多种来自AAV6血清型的衣壳蛋白。
[0324] 在一个说明性实施例中，AAV载体包含一或多种AAV2ITR和一或多种来自AAV6(VP3变体Y705F/Y731F/T492V)血清型的衣壳蛋白。
[0325] “宿主细胞”包括用本发明的重组载体或多核苷酸体内、离体或体外转染、感染或转导的细胞。宿主细胞可以包括产生病毒的细胞和被病毒载体感染的细胞。在具体的实施
例中，用本文考虑的病毒载体感染体内宿主细胞。在某些实施例中，术语“靶细胞”可与宿主细胞互换使用，并且是指所需细胞类型的感染细胞。
例中，用本文考虑的病毒载体感染体内宿主细胞。在某些实施例中，术语“靶细胞”可与宿主细胞互换使用，并且是指所需细胞类型的感染细胞。
[0326] 可以使用本领域已知的技术生产高滴度AAV调配物，例如在美国专利号5,658,776；6,566,118；6,989,264；和6,995,006；U.S.2006/0188484；WO98/22607；WO2005/
072364；和WO/1999/011764；和用于基因治疗的病毒载体：方法和实验方案(Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and Protocols),町田(Machida)编辑,胡马纳出版社(Humana
Press),2003；萨穆尔斯基(Samulski)等人,(1989)病毒学杂志(J.Virology)63,3822；肖
(Xiao)等人,(1998)病毒学杂志(J.Virology)72,2224；井上(lnoue)等人,(1998)病毒学杂
志(J.Virol.)72,7024中描述。还报道了生产假型AAV载体的方法(例如WO00/28004)，以及
AAV载体的各种修饰或制剂，以在体内施用时降低它们的免疫原性(参见例如WO01/23001；
WO00/73316；WO04/1 12727；WO05/005610；WO99/06562)。
072364；和WO/1999/011764；和用于基因治疗的病毒载体：方法和实验方案(Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and Protocols),町田(Machida)编辑,胡马纳出版社(Humana
Press),2003；萨穆尔斯基(Samulski)等人,(1989)病毒学杂志(J.Virology)63,3822；肖
(Xiao)等人,(1998)病毒学杂志(J.Virology)72,2224；井上(lnoue)等人,(1998)病毒学杂
志(J.Virol.)72,7024中描述。还报道了生产假型AAV载体的方法(例如WO00/28004)，以及
AAV载体的各种修饰或制剂，以在体内施用时降低它们的免疫原性(参见例如WO01/23001；
WO00/73316；WO04/1 12727；WO05/005610；WO99/06562)。
[0327] I.组合物和制剂
[0328] 本发明还包括各种药物组合物，其包含本文考虑的多核苷酸、载体和多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可用于治疗神经疾病或病症(例如疼痛)。如本文所用，
“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，包括药学上可接受的细胞培养基。医药上可接受的载剂包
括无菌水溶液或分散液以及即用制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和药
剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除了任何常规介质或试剂与本文考虑的
载体不相容之外，还考虑将其用于本发明的药物组合物中。
“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，包括药学上可接受的细胞培养基。医药上可接受的载剂包
括无菌水溶液或分散液以及即用制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和药
剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除了任何常规介质或试剂与本文考虑的
载体不相容之外，还考虑将其用于本发明的药物组合物中。
[0329] 本发明的组合物可以包含一或多种如本文所述的多肽、多核苷酸和包含其的载体、感染的细胞等，其配制在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中，以单独施用给细
胞或动物，或与一或多种其它治疗方式相结合。还应理解的是，如果需要，本发明的组合物
也可以与其它药剂组合施用，例如细胞因子，例如抗炎细胞因子、生长因子、激素、小分子或各种药学上可接受的活性剂。对组合物中也可以包含的其它组分实际上没有限制，条件是
其它试剂不会不利地影响组合物递送预期基因治疗的能力。
胞或动物，或与一或多种其它治疗方式相结合。还应理解的是，如果需要，本发明的组合物
也可以与其它药剂组合施用，例如细胞因子，例如抗炎细胞因子、生长因子、激素、小分子或各种药学上可接受的活性剂。对组合物中也可以包含的其它组分实际上没有限制，条件是
其它试剂不会不利地影响组合物递送预期基因治疗的能力。
[0330] 在一些情况下，编码开关受体的核酸通过非病毒或载体方式递送至受试者。本领域技术人员已知的任何方法可用于将本发明的核酸分子递送至受试者。这些方法包括但不
限于脂质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理和显微注射。
限于脂质转染、纳米粒子递送、粒子轰击、电穿孔、超声处理和显微注射。
[0331] 在一些方面，组合物包含用于例如激活本发明的开关受体的配体。在一些方面，固体制剂可以包括编码开关受体(例如GPCR或LGIC)的核酸分子(例如，载体)。在一些方面，组
合物是固体制剂，特别可用于例如对有需要的受试者口服给药。在一些情况中，载体或配体
可以例如约0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约
60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约120μg、约140μg、约160μg、约180μg、约200μg、约
220μg、约240μg、约260μg、约280μg、约300μg、约320μg、约340μg、约360μg、约380μg、约400μg、约420μg、约440μg、约460μg、约480μg、约500μg、约520μg、约540μg、约560μg、约580μg、约
600μg、约620μg、约640μg、约660μg、约680μg、约700μg、约720μg、约740μg、约760μg、约780μg、约800μg、约820μg、约840μg、约860μg、约880μg、约900μg、约920μg、约940μg、约960μg、约
980μg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约20mg、约
30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约120mg、约140mg、约
160mg、约180mg、约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约
340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg、约500mg、约
520mg、约540mg、约560mg、约580mg、约600mg、约620mg、约640mg、约660mg、约680mg、约
700mg、约720mg、约740mg、约760mg、约780mg、约800mg、约820mg、约840mg、约860mg、约
880mg、约900mg、约920mg、约940mg、约960mg、约980mg、约1000mg或大于1000mg的量存在于组合物中。
合物是固体制剂，特别可用于例如对有需要的受试者口服给药。在一些情况中，载体或配体
可以例如约0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg、0.9μg、1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约
60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约120μg、约140μg、约160μg、约180μg、约200μg、约
220μg、约240μg、约260μg、约280μg、约300μg、约320μg、约340μg、约360μg、约380μg、约400μg、约420μg、约440μg、约460μg、约480μg、约500μg、约520μg、约540μg、约560μg、约580μg、约
600μg、约620μg、约640μg、约660μg、约680μg、约700μg、约720μg、约740μg、约760μg、约780μg、约800μg、约820μg、约840μg、约860μg、约880μg、约900μg、约920μg、约940μg、约960μg、约
980μg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约20mg、约
30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约120mg、约140mg、约
160mg、约180mg、约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约
340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg、约500mg、约
520mg、约540mg、约560mg、约580mg、约600mg、约620mg、约640mg、约660mg、约680mg、约
700mg、约720mg、约740mg、约760mg、约780mg、约800mg、约820mg、约840mg、约860mg、约
880mg、约900mg、约920mg、约940mg、约960mg、约980mg、约1000mg或大于1000mg的量存在于组合物中。
[0332] 如本文所述的组合物可包含液体制剂、固体制剂或其组合。调配物的非限制性实例可以包括片剂、胶囊、凝胶、糊剂、液体溶液、贴剂、棒棒糖、乳膏或气雾剂(即喷雾剂)。在一些情况下，治疗剂或药物可以是结晶形式。固体调配物可适用于将组合物口服给予有需
要的受试者。在一些情况下，可以制备用于口服给药的缓释调配物，以实现与胃肠道中的体
液接触的活性剂的受控释放，并且在血浆中提供基本上恒定和有效水平的活性剂。为此目
的，可将晶体形式嵌入生物可降解聚合物、水溶性聚合物或两者的混合物的聚合物基质中，
以及任选合适的表面活性剂。在这种情况下，嵌入意味着将微粒结合到聚合物基体中。控释
调配物也可通过已知的分散或乳化涂层技术通过分散的微粒或乳化的微滴包封获得。
要的受试者。在一些情况下，可以制备用于口服给药的缓释调配物，以实现与胃肠道中的体
液接触的活性剂的受控释放，并且在血浆中提供基本上恒定和有效水平的活性剂。为此目
的，可将晶体形式嵌入生物可降解聚合物、水溶性聚合物或两者的混合物的聚合物基质中，
以及任选合适的表面活性剂。在这种情况下，嵌入意味着将微粒结合到聚合物基体中。控释
调配物也可通过已知的分散或乳化涂层技术通过分散的微粒或乳化的微滴包封获得。
[0333] 本发明的组合物可以进一步包含任何数量的赋形剂。赋形剂可以包括任何和所有溶剂、涂层、调味剂、着色剂、润滑剂、崩解剂、防腐剂、甜味剂、粘合剂、稀释剂和媒介物(或载体)。通常，赋形剂与本发明的治疗组合物相容。
[0334] 在本文考虑的药物组合物中，药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制对于本领域技术人员来说是公知的，如开发用于在各种治疗中使用本文所述的特定组合物的合适剂
量和治疗方案，包括例如口服、肠胃外、静脉内、鼻内、肌内、鞘内、神经内、神经节内和心室内给药和调配物。
量和治疗方案，包括例如口服、肠胃外、静脉内、鼻内、肌内、鞘内、神经内、神经节内和心室内给药和调配物。
[0335] 在某些情况下，希望将本文揭示的组合物肠胃外、静脉内、肌内、腹腔、鞘内、神经内、神经节内或心室内递送。作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在与表面活性剂如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。分散液也可以在甘油、液体聚乙二
醇及其混合物和油中制备。在一般储存和使用条件下，这些调配物含有防腐剂以防止微生
物生长。
醇及其混合物和油中制备。在一般储存和使用条件下，这些调配物含有防腐剂以防止微生
物生长。
[0336] 适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于即时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末(美国专利号5,466,468，其全部内容通过引用并入本文)。在所有情
况下，所述形式应该是无菌的，并且应该是流动的，以便容易注射。其应在制造和储存的条
件下稳定并且应被保存以免遭微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、
乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、甘露糖醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散的情况下维持所需的
粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对
羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等可以促进微生物作用的预防。在许多情况
下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬
脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。
况下，所述形式应该是无菌的，并且应该是流动的，以便容易注射。其应在制造和储存的条
件下稳定并且应被保存以免遭微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、
乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、甘露糖醇和液体聚乙二醇等)，其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散的情况下维持所需的
粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对
羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等可以促进微生物作用的预防。在许多情况
下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬
脂酸铝和明胶来延长可注射组合物的吸收。
[0337] 例如，对于在水溶液中的施用，如果需要，溶液应适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下、腹腔
鞘内、神经内、神经节内和心室内给药。就此而言，根据本发明，可以使用的无菌水性介质将为本领域技术人员所知。例如，可将一个剂量溶于1ml等渗NaCl溶液中，并加入到1000ml皮
下灌注液中或在建议的输注部位注射(参见例如雷明顿：药学的科学与实践(Remington:
The Science and Practice of Pharmacy),第20版.Baltimore,MD:Lippincott
Williams&Wilkins,2000)。取决于所治疗受试者的状况，剂量的一些变化将必然发生。负责
施用的人员将在任何情况下确定个别个体的合适剂量。此外，对于人体给药，调配物应满足
FDA生物制剂标准所要求的无菌性、热原性和一般安全性和纯度标准。
鞘内、神经内、神经节内和心室内给药。就此而言，根据本发明，可以使用的无菌水性介质将为本领域技术人员所知。例如，可将一个剂量溶于1ml等渗NaCl溶液中，并加入到1000ml皮
下灌注液中或在建议的输注部位注射(参见例如雷明顿：药学的科学与实践(Remington:
The Science and Practice of Pharmacy),第20版.Baltimore,MD:Lippincott
Williams&Wilkins,2000)。取决于所治疗受试者的状况，剂量的一些变化将必然发生。负责
施用的人员将在任何情况下确定个别个体的合适剂量。此外，对于人体给药，调配物应满足
FDA生物制剂标准所要求的无菌性、热原性和一般安全性和纯度标准。
[0338] 无菌可注射溶液可通过将所需量的活性成分与上文列举的各种其它成分从根据需要掺入适当溶剂中，然后过滤除菌来制备。一般来说，通过将各种灭菌活性成分并入含有
碱性分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。
在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥技
术，其由先前的无菌过滤溶液得到活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
碱性分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。
在无菌粉末用于制备无菌可注射溶液的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥技
术，其由先前的无菌过滤溶液得到活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
[0339] 本文公开的组合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(用蛋白质的自由氨基形成)和用例如盐酸或磷酸的无机酸或如乙酸、乙二酸、酒石酸、扁桃
酸等等的有机酸形成的酸加成盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如钠、钾、
铵、钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制时，溶液将以与剂量配制物相容的方式并且以治疗有效的量施用。该调配物易于以多种剂型如可注射溶
液，药物释放胶囊等给药。
酸等等的有机酸形成的酸加成盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如钠、钾、
铵、钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制时，溶液将以与剂量配制物相容的方式并且以治疗有效的量施用。该调配物易于以多种剂型如可注射溶
液，药物释放胶囊等给药。
[0340] 如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、载体、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、混悬剂、胶体等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗组合物中。还可将补充性活性成分并入到组合物中。
[0341] 短语“药学上可接受的”是指当施用于人时不会产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活性成分的含水组合物的制备在本领域中是很好理解
的。典型地，这些组合物被制备成可注射剂，或者作为液体溶液或混悬剂；也可以制备适合
于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。调配物也可以被乳化。
的。典型地，这些组合物被制备成可注射剂，或者作为液体溶液或混悬剂；也可以制备适合
于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。调配物也可以被乳化。
[0342] 在某些实施例中，组合物可以通过鼻内喷雾剂、吸入剂和/或其它气雾剂递送载体递送。通过鼻腔气溶胶喷雾将基因、多核苷酸和肽组合物直接递送至肺的方法已有描述，例
如美国专利号5,756,353和美国专利号5,804,212(各自的全部内容特别通过引用并入本
文)。同样，使用鼻内微粒树脂(竹永(Takenaga)等人,1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国
专利号5,725,871，其全部内容通过引用并入本文)在制药领域也是众所周知的。同样地，以
聚四氟乙烯支撑基质形式的透粘膜药物递送描述于美国专利号5,780,045(其全部内容特
别通过引用并入本文)。
如美国专利号5,756,353和美国专利号5,804,212(各自的全部内容特别通过引用并入本
文)。同样，使用鼻内微粒树脂(竹永(Takenaga)等人,1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国
专利号5,725,871，其全部内容通过引用并入本文)在制药领域也是众所周知的。同样地，以
聚四氟乙烯支撑基质形式的透粘膜药物递送描述于美国专利号5,780,045(其全部内容特
别通过引用并入本文)。
[0343] 在某些实施例中，可以通过使用脂质体、纳米胶囊、微粒、微球体、脂质颗粒、囊泡，任选与CPP多肽混合等来将递送用于将本发明的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，本发明的组合物可以配制用于递送，或者封装在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球、纳米颗粒等中。这种运载工具的配制和使用可以使用已知和常规技术来进行。本发明的调配物和组合
物可以包含一或多种阻抑剂和/或激活剂，其包含如本文所述的任何数量的多肽，多核苷酸
和小分子的组合，配制在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液(例如培养基)用于单独
施用于细胞或动物，或与一或多种其它治疗形式组合施用。还应理解的是，如果需要，本发
明的组合物也可以与其它试剂组合给药，例如细胞，其它蛋白质或多肽或各种药物活性剂。
物可以包含一或多种阻抑剂和/或激活剂，其包含如本文所述的任何数量的多肽，多核苷酸
和小分子的组合，配制在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液(例如培养基)用于单独
施用于细胞或动物，或与一或多种其它治疗形式组合施用。还应理解的是，如果需要，本发
明的组合物也可以与其它试剂组合给药，例如细胞，其它蛋白质或多肽或各种药物活性剂。
[0344] 在一个具体的实施例中，根据本发明的调配物或组合物包含与本文考虑的任意数量的多肽，多核苷酸和病毒载体的组合接触的细胞。
[0345] 在某些方面，本发明提供适合于递送病毒载体例如rAAV的调配物或组合物。
[0346] 用于离体递送的示例性调配物还可以包括使用本领域已知的各种转染剂，例如磷酸钙、电穿孔、热休克和各种脂质体调配物(即脂质介导的转染)。如下文更详细描述的，脂
质体是包封一部分含水流体的脂质双分子层。DNA自发地与阳离子脂质体的外表面结合(由
于其电荷)，并且这些脂质体将与细胞膜相互作用。
质体是包封一部分含水流体的脂质双分子层。DNA自发地与阳离子脂质体的外表面结合(由
于其电荷)，并且这些脂质体将与细胞膜相互作用。
[0347] 在某些方面，本发明提供了药学上可接受的组合物，其包含与一或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂(例如药学上可接受的盐)一起配制的治疗有效量的一或
多种如本文所述的多核苷酸或多肽可接受的细胞培养基)。
多种如本文所述的多核苷酸或多肽可接受的细胞培养基)。
[0348] 本发明的具体实施例可以包含其它调配物，例如制药领域熟知的那些调配物，并且描述于例如雷明顿：药学的科学与实践(Remington:The Science and Practice of
Pharmacy),第20版Baltimore,MD:Lippincott Williams&Wilkins,2000。
Pharmacy),第20版Baltimore,MD:Lippincott Williams&Wilkins,2000。
[0349] J.方法和适应症
[0350] 本文揭示的组合物和方法可用于治疗神经疾病或病症。在一些方面，本文揭示的载体或组合物用于制造用于治疗神经疾病或病症的药物。
[0351] 在一些情况下，本发明的方法和组合物用于治疗癫痫。本文所述的组合物可用于预防或控制癫痫发作。癫痫发作可分为强直性阵挛性、强直性、阵挛性、肌阵挛性、缺席或无力性癫痫发作。在一些情况下，本文的组合物和方法可以预防或减少受试者经历的癫痫发
作的数量约5％、约10％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或100％。
作的数量约5％、约10％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或100％。
[0352] 在一些情况下，本发明的方法和组合物用于治疗进食障碍。进食障碍可能是由不正常的饮食行为定义的精神障碍，其对受试者的身体或心理健康有负面影响。在某些情况
下，进食障碍是神经性厌食症。在其它情况下，进食障碍是神经性贪食症。在一些情况下，进食障碍是异食癖、反刍障碍、回避/限制性食物摄取障碍、暴食症(BED)、其它特定的进食和
饮食障碍(OSFED)、强迫性暴食、糖尿病、神经性偏头痛、选择性进食障碍、醉酒性缺乏、孕期厌食症或贪食综合症(Gourmand syndrome)。在一些情况下，组合物包含G蛋白偶联受体，其
增加或减少与进食障碍相关的一或多种分子的产生。在其它情况下，组合物包含配体门控
离子通道，其改变与进食障碍相关的一或多种分子的产生。与进食障碍相关的一或多种分
子可包括但不限于下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的分子，包括加压素、促肾上腺皮质素释放
激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇、肾上腺素、或去甲肾上腺素；以及血清素、多巴胺、神经肽Y、瘦蛋白或生长素释放肽。
下，进食障碍是神经性厌食症。在其它情况下，进食障碍是神经性贪食症。在一些情况下，进食障碍是异食癖、反刍障碍、回避/限制性食物摄取障碍、暴食症(BED)、其它特定的进食和
饮食障碍(OSFED)、强迫性暴食、糖尿病、神经性偏头痛、选择性进食障碍、醉酒性缺乏、孕期厌食症或贪食综合症(Gourmand syndrome)。在一些情况下，组合物包含G蛋白偶联受体，其
增加或减少与进食障碍相关的一或多种分子的产生。在其它情况下，组合物包含配体门控
离子通道，其改变与进食障碍相关的一或多种分子的产生。与进食障碍相关的一或多种分
子可包括但不限于下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的分子，包括加压素、促肾上腺皮质素释放
激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇、肾上腺素、或去甲肾上腺素；以及血清素、多巴胺、神经肽Y、瘦蛋白或生长素释放肽。
[0353] 在一些情况下，所述组合物和方法用于治疗创伤后应激障碍(PTSD)、胃食管反流疾病(GERD)、成瘾(例如酒精、药物)、焦虑、抑郁、记忆力丧失、痴呆、睡眠呼吸暂停、中风、尿失禁、发作性睡病、特发性震颤、运动障碍、心房纤颤、癌症(例如脑瘤)、帕金森病或阿尔茨海默氏病。可用本文的组合物和方法治疗的神经疾病或障碍的其它非限制性实例包括：意
志力丧失、失写症、酒精中毒、失读症、动脉瘤、一过性黑矇、健忘症、肌萎缩性侧索硬化
(ALS)、天使综合症(Angelman syndrome)、失语症、失用症、蛛网膜炎、阿诺德-基亚里畸形(Arnold-Chiari malformation)、阿斯佩各综合症(Asperger syndrome)、共济失调、共济
失调毛细血管扩张、注意力缺陷多动症、听觉处理障碍、自闭症谱系病、躁郁症、贝耳麻痹
(Bell's palsy)、臂丛神经损伤、脑损坏、脑损伤、脑肿瘤、卡纳万病(Canavan disease)、卡普格拉妄想症(Capgras delusion)、腕管综合症、灼性神经痛、中枢性疼痛综合症、脑桥中
央髓鞘溶解、中央核性肌病、头部障碍、脑动脉瘤、脑动脉硬化症、脑萎缩、常染色体显性遗传性脑血管病伴皮层下梗死和白质脑病(CADASIL)、大脑性巨人症、大脑性瘫痪、脑血管炎、颈椎管狭窄、夏科-马里-图思病(Charcot-Marie-Tooth disease)、小脑扁桃体下疝畸形、
舞蹈症、慢性疲乏综合症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性疼痛、考芬-洛瑞综合症(Coffin-Lowry syndrome)、昏迷、复杂性区域疼痛综合症、压迫性神经病、先天性面瘫、皮质基底节变性、颅动脉炎、颅缝早闭、库贾氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、累积创伤失调、库欣综合症(Cushing's syndrome)、循环情感性障碍、巨细胞包涵体病(CIBD)、
巨细胞病毒感染、丹迪-沃克综合症(Dandy-Walker syndrome)、道森病(Dawson disease)、
德摩西埃综合症(De Morsier's syndrome)、德热里纳-克隆普克综合症(Dejerine-
Klumpke palsy)、德热里纳-索塔斯病(Dejerine-Sottas disease)、睡眠时相延迟综合症、
痴呆、皮肌炎、发育性共济障碍、糖尿病神经病变、弥漫性硬皮病、复视、唐氏综合症(Down syndrome)、德拉维特综合症(Dravet syndrome)、杜兴氏肌营养不良(Duchenne muscular
dystrophy)、构音障碍、家族性自主神经异常、计算障碍、书写困难、运动障碍、诵读困难、张力障碍、空蝶鞍综合症、脑炎、脑膨出、脑三叉神经血管瘤病、大便失禁、遗尿、癫痫、女性癫痫-智力障碍、厄博麻痹(Erb's palsy)、红斑性肢痛病、爆炸声感综合症、法布瑞氏症
(Fabry's disease)、法尔综合症(Fahr's syndrome)、昏厥、家族性痉挛性麻痹、热性惊厥、菲希尔综合症(Fisher syndrome)、弗里德赖希氏共济失调(Friedreich's ataxia)、纤维
肌痛、福维尔氏综合症(Foville's syndrome)、胎儿酒精综合症、脆性X综合症、脆性X相关
震颤/共济失调综合症(FXTAS)、高歇病(Gaucher's disease)、全面性癫痫伴热性惊厥附加
症、格斯特曼综合症(Gerstmann syndrome)、巨细胞性动脉炎、巨细胞性包涵体病、球形细
胞脑白质营养不良、灰质异位、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barré syndrome)、广泛性焦虑
症、HTLV-1相关的脊髓病、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、颅脑损伤、头痛、面肌痉挛、遗传性痉孪性截瘫、多神经炎型遗传性共济失调、耳部带状疱疹、带状疱
疹、平山综合症(Hirayama syndrome)、赫希施普龙氏病(Hirschsprung’s diesease)、霍-
艾二氏综合症(Holmes-Adie syndrome)、前脑无裂畸形、亨廷顿病(Huntington's
disease)、水脑畸形、脑水肿、皮质醇增多症、组织缺氧、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿雷弗素姆病(Infantile Refsum disease)、婴儿痉挛症、炎性肌病、颅内
囊肿、颅内压增高、等臂双着丝粒15(Isodicentric 15)、朱伯特综合症(Joubert
syndrome)、卡拉克综合症(Karak syndrome)、卡恩斯-塞尔综合症(Kearns-Sayre
syndrome)、金斯伯恩综合症(Kinsbourne syndrome)、克莱恩-莱文综合症(Kleine-Levin
Syndrome)、克利佩尔-费尔综合症(Klippel Feil syndrome)、克拉伯病(Krabbe
disease)、拉福拉病(Lafora disease)、兰伯特-伊顿肌无力综合症(Lambert-Eaton
myasthenic syndrome)、兰多-克莱夫纳综合症(Landau-Kleffner syndrome)、延髓背外侧
(瓦伦贝格(Wallenberg)综合症、学习障碍、雷氏病(Leigh’s disease)、伦诺克斯-加斯托
综合症(Lennox-Gastaut syndrome)、莱施-奈恩综合症(Lesch-Nyhan syndrome)、脑白质
营养不良、白质消失的脑白质病、路易体痴呆、无脑回、闭锁综合症、椎间盘病变、腰椎管狭窄症、莱姆病-神经后遗症、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph)(脊髓小脑性共济失调3
型)、巨脑、视物显大症、上陆后综合症(Mal de debarquement)、巨脑性脑白质病伴皮质下
囊肿、巨脑、梅-罗综合症(Melkersson-Rosenthal syndrome)、美尼尔症(Menieres
disease)、脑膜炎、门克斯病(Menkes disease)、异染性脑白质病变、头小畸型、视物显小
症、偏头痛、米勒-费希尔综合症(Miller Fisher syndrome)、小中风(短暂性脑缺血发作)、恐音症、线粒体肌病、默比厄斯综合症(Mobius syndrome)、单肢肌萎缩、运动技能障碍、烟雾病、粘多糖贮积症、多发梗死性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化、多系统萎缩症、肌肉萎缩症、肌痛性脑脊髓炎、重症肌无力、髓鞘脱失弥漫性硬化(Myelinoclastic diffuse
sclerosis)、婴儿肌阵挛性脑病、肌阵挛、肌病、肌管性肌病、先天性肌强直、嗜眠发作、纽罗-布切病(Neuro- disease)、多发性神经纤维瘤、神经阻滞剂恶性综合症、AIDS的
神经系统表现、狼疮的神经后遗症、神经性肌强直、神经元蜡样脂褐质症、神经元移行异常、神经病、神经机能病、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、非24小时睡眠觉醒障碍、非语言学习障碍、奥沙利文-麦克莱德综合症(O'Sullivan-McLeod syndrome)、枕神经痛、隐性
脊柱神经管闭合不全症、大田原综合症(Ohtahara syndrome)、橄榄体脑桥小脑萎缩、眼阵
挛-肌阵挛综合症、视神经炎、直立性低血压、耳硬化症、过度使用综合症、持续后像、感觉异常、帕金森氏症、先天性肌强直病、副肿瘤性疾病、阵发性发作、帕罗综合症(Parry-Romberg syndrome)、PANDAS、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、周期性麻
痹、周围神经病、广泛性发育障碍、旋光性喷嚏反射、植烷酸贮积病、皮克氏病(Pick's
disease)、神经挟捏、垂体瘤、PMG、多神经病、小儿麻痹症、多小脑回、多肌炎、脑穿通畸形、小儿麻痹症后期综合症、疱疹后神经痛(PHN)、体位性低血压、普拉德-威利综合症(Prader-
Willi syndrome)、原发性侧索硬化、朊病毒疾病、进行性面偏侧萎缩症、进行性多灶性白质脑病、进行性核上麻痹、面容失认症、假脑瘤、象限盲、四肢麻痹、狂犬病、神经根病、I型拉姆塞亨特综合症(Ramsay Hunt syndrome type I)、II型拉姆塞亨特综合症、III型拉姆塞亨
特综合症、拉斯马森脑炎(Rasmussen encephalitis)、反射神经血管营养不良、雷弗素姆病
(Refsum disease)、REM睡眠行为障碍、重复性压力损伤、多动腿综合症、逆转录酶病毒相关脊髓病、莱特综合症(Rett syndrome)、雷依氏综合症(Reye's syndrome)、节律性运动障
碍、龙贝里综合症(Romberg syndrome)、圣维特斯舞蹈病(Saint Vitus dance)、山德霍夫
氏病(Sandhoff disease)、希尔德氏病(Schilder's disease)、脑裂、感官处理失调、中隔-视神经发育不良、摇晃婴儿综合症、带状疱疹、夏-德综合症(Shy-Drager syndrome)、舍格
伦综合症( syndrome)、睡眠呼吸暂停、昏睡病、饱食喷嚏反射(Snatiation)、索托
斯综合症(Sotos syndrome)、僵直、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩、脊髓延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑性共济失调、裂脑、斯-里-奥三氏综合症(Steele-Richardson-
Olszewski syndrome)、僵人综合症、中风、斯特奇-韦伯综合症(Sturge-Weber syndrome)、结巴、亚急性硬化性全脑炎、动脉硬化性皮层下脑病(Subcortical arteriosclerotic
encephalopathy)、表面铁沉积症、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、昏厥、共感觉、脊髓空洞症、跗管综合症、迟发性运动障碍、迟发性精神障碍、塔罗囊肿(Tarlov cyst)、泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)、颞动脉炎、颞叶性癫痫、破伤风、脊髓栓系综合症、肌强直性白内障、胸廓出口综合症、三叉神经痛、托德氏麻痹(Todd's paralysis)、杜尔雷斯综合
症(Tourette syndrome)、中毒性脑病、短暂性脑缺血发作、传染性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、外伤性脑损伤、震颤、拔毛发癖、三叉神经痛、热带痉挛性瘫痪、锥虫病、结节性脑硬化、翁-伦病(Unverricht-Lundborg disease)、希佩尔-林道综合症(Von Hippel-Lindau
disease；VHL)、维柳斯克脑脊髓炎(Viliuisk Encephalomyelitis；VE)、瓦伦伯格氏综合症(Wallenberg's syndrome)、韦斯特综合症(West syndrome)、颈部挥鞭症(Whiplash)、威廉
斯综合症(Williams syndrome)、威尔逊氏病(Wilson's disease)或者泽维格综合症
(Zellweger syndrome)。
志力丧失、失写症、酒精中毒、失读症、动脉瘤、一过性黑矇、健忘症、肌萎缩性侧索硬化
(ALS)、天使综合症(Angelman syndrome)、失语症、失用症、蛛网膜炎、阿诺德-基亚里畸形(Arnold-Chiari malformation)、阿斯佩各综合症(Asperger syndrome)、共济失调、共济
失调毛细血管扩张、注意力缺陷多动症、听觉处理障碍、自闭症谱系病、躁郁症、贝耳麻痹
(Bell's palsy)、臂丛神经损伤、脑损坏、脑损伤、脑肿瘤、卡纳万病(Canavan disease)、卡普格拉妄想症(Capgras delusion)、腕管综合症、灼性神经痛、中枢性疼痛综合症、脑桥中
央髓鞘溶解、中央核性肌病、头部障碍、脑动脉瘤、脑动脉硬化症、脑萎缩、常染色体显性遗传性脑血管病伴皮层下梗死和白质脑病(CADASIL)、大脑性巨人症、大脑性瘫痪、脑血管炎、颈椎管狭窄、夏科-马里-图思病(Charcot-Marie-Tooth disease)、小脑扁桃体下疝畸形、
舞蹈症、慢性疲乏综合症、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性疼痛、考芬-洛瑞综合症(Coffin-Lowry syndrome)、昏迷、复杂性区域疼痛综合症、压迫性神经病、先天性面瘫、皮质基底节变性、颅动脉炎、颅缝早闭、库贾氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、累积创伤失调、库欣综合症(Cushing's syndrome)、循环情感性障碍、巨细胞包涵体病(CIBD)、
巨细胞病毒感染、丹迪-沃克综合症(Dandy-Walker syndrome)、道森病(Dawson disease)、
德摩西埃综合症(De Morsier's syndrome)、德热里纳-克隆普克综合症(Dejerine-
Klumpke palsy)、德热里纳-索塔斯病(Dejerine-Sottas disease)、睡眠时相延迟综合症、
痴呆、皮肌炎、发育性共济障碍、糖尿病神经病变、弥漫性硬皮病、复视、唐氏综合症(Down syndrome)、德拉维特综合症(Dravet syndrome)、杜兴氏肌营养不良(Duchenne muscular
dystrophy)、构音障碍、家族性自主神经异常、计算障碍、书写困难、运动障碍、诵读困难、张力障碍、空蝶鞍综合症、脑炎、脑膨出、脑三叉神经血管瘤病、大便失禁、遗尿、癫痫、女性癫痫-智力障碍、厄博麻痹(Erb's palsy)、红斑性肢痛病、爆炸声感综合症、法布瑞氏症
(Fabry's disease)、法尔综合症(Fahr's syndrome)、昏厥、家族性痉挛性麻痹、热性惊厥、菲希尔综合症(Fisher syndrome)、弗里德赖希氏共济失调(Friedreich's ataxia)、纤维
肌痛、福维尔氏综合症(Foville's syndrome)、胎儿酒精综合症、脆性X综合症、脆性X相关
震颤/共济失调综合症(FXTAS)、高歇病(Gaucher's disease)、全面性癫痫伴热性惊厥附加
症、格斯特曼综合症(Gerstmann syndrome)、巨细胞性动脉炎、巨细胞性包涵体病、球形细
胞脑白质营养不良、灰质异位、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barré syndrome)、广泛性焦虑
症、HTLV-1相关的脊髓病、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、颅脑损伤、头痛、面肌痉挛、遗传性痉孪性截瘫、多神经炎型遗传性共济失调、耳部带状疱疹、带状疱
疹、平山综合症(Hirayama syndrome)、赫希施普龙氏病(Hirschsprung’s diesease)、霍-
艾二氏综合症(Holmes-Adie syndrome)、前脑无裂畸形、亨廷顿病(Huntington's
disease)、水脑畸形、脑水肿、皮质醇增多症、组织缺氧、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿雷弗素姆病(Infantile Refsum disease)、婴儿痉挛症、炎性肌病、颅内
囊肿、颅内压增高、等臂双着丝粒15(Isodicentric 15)、朱伯特综合症(Joubert
syndrome)、卡拉克综合症(Karak syndrome)、卡恩斯-塞尔综合症(Kearns-Sayre
syndrome)、金斯伯恩综合症(Kinsbourne syndrome)、克莱恩-莱文综合症(Kleine-Levin
Syndrome)、克利佩尔-费尔综合症(Klippel Feil syndrome)、克拉伯病(Krabbe
disease)、拉福拉病(Lafora disease)、兰伯特-伊顿肌无力综合症(Lambert-Eaton
myasthenic syndrome)、兰多-克莱夫纳综合症(Landau-Kleffner syndrome)、延髓背外侧
(瓦伦贝格(Wallenberg)综合症、学习障碍、雷氏病(Leigh’s disease)、伦诺克斯-加斯托
综合症(Lennox-Gastaut syndrome)、莱施-奈恩综合症(Lesch-Nyhan syndrome)、脑白质
营养不良、白质消失的脑白质病、路易体痴呆、无脑回、闭锁综合症、椎间盘病变、腰椎管狭窄症、莱姆病-神经后遗症、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph)(脊髓小脑性共济失调3
型)、巨脑、视物显大症、上陆后综合症(Mal de debarquement)、巨脑性脑白质病伴皮质下
囊肿、巨脑、梅-罗综合症(Melkersson-Rosenthal syndrome)、美尼尔症(Menieres
disease)、脑膜炎、门克斯病(Menkes disease)、异染性脑白质病变、头小畸型、视物显小
症、偏头痛、米勒-费希尔综合症(Miller Fisher syndrome)、小中风(短暂性脑缺血发作)、恐音症、线粒体肌病、默比厄斯综合症(Mobius syndrome)、单肢肌萎缩、运动技能障碍、烟雾病、粘多糖贮积症、多发梗死性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化、多系统萎缩症、肌肉萎缩症、肌痛性脑脊髓炎、重症肌无力、髓鞘脱失弥漫性硬化(Myelinoclastic diffuse
sclerosis)、婴儿肌阵挛性脑病、肌阵挛、肌病、肌管性肌病、先天性肌强直、嗜眠发作、纽罗-布切病(Neuro- disease)、多发性神经纤维瘤、神经阻滞剂恶性综合症、AIDS的
神经系统表现、狼疮的神经后遗症、神经性肌强直、神经元蜡样脂褐质症、神经元移行异常、神经病、神经机能病、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)、非24小时睡眠觉醒障碍、非语言学习障碍、奥沙利文-麦克莱德综合症(O'Sullivan-McLeod syndrome)、枕神经痛、隐性
脊柱神经管闭合不全症、大田原综合症(Ohtahara syndrome)、橄榄体脑桥小脑萎缩、眼阵
挛-肌阵挛综合症、视神经炎、直立性低血压、耳硬化症、过度使用综合症、持续后像、感觉异常、帕金森氏症、先天性肌强直病、副肿瘤性疾病、阵发性发作、帕罗综合症(Parry-Romberg syndrome)、PANDAS、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、周期性麻
痹、周围神经病、广泛性发育障碍、旋光性喷嚏反射、植烷酸贮积病、皮克氏病(Pick's
disease)、神经挟捏、垂体瘤、PMG、多神经病、小儿麻痹症、多小脑回、多肌炎、脑穿通畸形、小儿麻痹症后期综合症、疱疹后神经痛(PHN)、体位性低血压、普拉德-威利综合症(Prader-
Willi syndrome)、原发性侧索硬化、朊病毒疾病、进行性面偏侧萎缩症、进行性多灶性白质脑病、进行性核上麻痹、面容失认症、假脑瘤、象限盲、四肢麻痹、狂犬病、神经根病、I型拉姆塞亨特综合症(Ramsay Hunt syndrome type I)、II型拉姆塞亨特综合症、III型拉姆塞亨
特综合症、拉斯马森脑炎(Rasmussen encephalitis)、反射神经血管营养不良、雷弗素姆病
(Refsum disease)、REM睡眠行为障碍、重复性压力损伤、多动腿综合症、逆转录酶病毒相关脊髓病、莱特综合症(Rett syndrome)、雷依氏综合症(Reye's syndrome)、节律性运动障
碍、龙贝里综合症(Romberg syndrome)、圣维特斯舞蹈病(Saint Vitus dance)、山德霍夫
氏病(Sandhoff disease)、希尔德氏病(Schilder's disease)、脑裂、感官处理失调、中隔-视神经发育不良、摇晃婴儿综合症、带状疱疹、夏-德综合症(Shy-Drager syndrome)、舍格
伦综合症( syndrome)、睡眠呼吸暂停、昏睡病、饱食喷嚏反射(Snatiation)、索托
斯综合症(Sotos syndrome)、僵直、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩、脊髓延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑性共济失调、裂脑、斯-里-奥三氏综合症(Steele-Richardson-
Olszewski syndrome)、僵人综合症、中风、斯特奇-韦伯综合症(Sturge-Weber syndrome)、结巴、亚急性硬化性全脑炎、动脉硬化性皮层下脑病(Subcortical arteriosclerotic
encephalopathy)、表面铁沉积症、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、昏厥、共感觉、脊髓空洞症、跗管综合症、迟发性运动障碍、迟发性精神障碍、塔罗囊肿(Tarlov cyst)、泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)、颞动脉炎、颞叶性癫痫、破伤风、脊髓栓系综合症、肌强直性白内障、胸廓出口综合症、三叉神经痛、托德氏麻痹(Todd's paralysis)、杜尔雷斯综合
症(Tourette syndrome)、中毒性脑病、短暂性脑缺血发作、传染性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、外伤性脑损伤、震颤、拔毛发癖、三叉神经痛、热带痉挛性瘫痪、锥虫病、结节性脑硬化、翁-伦病(Unverricht-Lundborg disease)、希佩尔-林道综合症(Von Hippel-Lindau
disease；VHL)、维柳斯克脑脊髓炎(Viliuisk Encephalomyelitis；VE)、瓦伦伯格氏综合症(Wallenberg's syndrome)、韦斯特综合症(West syndrome)、颈部挥鞭症(Whiplash)、威廉
斯综合症(Williams syndrome)、威尔逊氏病(Wilson's disease)或者泽维格综合症
(Zellweger syndrome)。
[0354] 在一些情况下，本文揭示的组合物和方法可用于治疗脑癌或脑肿瘤。可适于用本文所述载体和组合物治疗的脑癌或肿瘤的非限制性实例包括：神经胶质瘤，包括间变性星
形细胞瘤(III级胶质瘤)、星形细胞瘤(II级神经胶质瘤)、脑干胶质瘤、室管膜瘤、神经节胶质瘤、神经节瘤、成胶质细胞瘤(IV级胶质瘤)、胶质瘤、幼年毛细胞性星形细胞瘤(JPA)、低级星形细胞瘤(LGA)、髓母细胞瘤、混合胶质瘤、少突胶质细胞瘤、视神经胶质瘤、毛细胞性星形细胞瘤(I级胶质瘤)和原始神经外胚层瘤(PNET)；颅底肿瘤，包括听神经瘤(前庭神经
鞘瘤)、肢端肥大症、腺瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、颅咽管瘤、表皮瘤、颈静脉球瘤、幕下脑膜瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、拉特克裂囊肿(Rathke’s cleft cyst)；转移癌，包括脑转移，转移性脑瘤；其它脑瘤，包括脑囊肿、脉络丛乳头状瘤、CNS淋巴瘤、胶质囊肿、囊性肿瘤、皮样瘤、生殖细胞瘤、淋巴瘤、鼻咽癌、鼻咽肿瘤、松果体瘤、松果体母细胞瘤、成松果体细胞瘤、幕上脑膜瘤和血管瘤；脊髓肿瘤，包括星形细胞瘤、室管膜瘤、脑膜瘤和神经鞘瘤。
形细胞瘤(III级胶质瘤)、星形细胞瘤(II级神经胶质瘤)、脑干胶质瘤、室管膜瘤、神经节胶质瘤、神经节瘤、成胶质细胞瘤(IV级胶质瘤)、胶质瘤、幼年毛细胞性星形细胞瘤(JPA)、低级星形细胞瘤(LGA)、髓母细胞瘤、混合胶质瘤、少突胶质细胞瘤、视神经胶质瘤、毛细胞性星形细胞瘤(I级胶质瘤)和原始神经外胚层瘤(PNET)；颅底肿瘤，包括听神经瘤(前庭神经
鞘瘤)、肢端肥大症、腺瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、颅咽管瘤、表皮瘤、颈静脉球瘤、幕下脑膜瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、拉特克裂囊肿(Rathke’s cleft cyst)；转移癌，包括脑转移，转移性脑瘤；其它脑瘤，包括脑囊肿、脉络丛乳头状瘤、CNS淋巴瘤、胶质囊肿、囊性肿瘤、皮样瘤、生殖细胞瘤、淋巴瘤、鼻咽癌、鼻咽肿瘤、松果体瘤、松果体母细胞瘤、成松果体细胞瘤、幕上脑膜瘤和血管瘤；脊髓肿瘤，包括星形细胞瘤、室管膜瘤、脑膜瘤和神经鞘瘤。
[0355] 在一些方面，揭示了用于治疗受试者的神经疾病或病症的方法。在一些情况下，一种方法涉及向患有神经疾病或病症的受试者施用生物惰性剂。在一些情况下，受试者可以
异源表达G蛋白偶联受体。在另一种情况下，受试者可以异源表达配体门控离子通道。所述
方法可以进一步包括在施用生物惰性剂之前将编码GPCR或LGIC的核酸分子递送至受试者。
在具体实例中，GPCR或LGIC通过本发明中所述的病毒载体递送至受试者。在某些情况下，受
试者会治疗疼痛。在其它情况下，受试者治疗饱腹感障碍(即，进食障碍)。在某些情况下，受试者没有治疗癫痫。
异源表达G蛋白偶联受体。在另一种情况下，受试者可以异源表达配体门控离子通道。所述
方法可以进一步包括在施用生物惰性剂之前将编码GPCR或LGIC的核酸分子递送至受试者。
在具体实例中，GPCR或LGIC通过本发明中所述的病毒载体递送至受试者。在某些情况下，受
试者会治疗疼痛。在其它情况下，受试者治疗饱腹感障碍(即，进食障碍)。在某些情况下，受试者没有治疗癫痫。
[0356] 在其它情况下，所述方法包括向患有神经疾病的受试者递送编码GPCR或LGIC的核酸分子，其中所述受试者异源表达GPCR或LGIC。所述方法进一步包括向受试者施用激活
GPCR或LGIC从而治疗神经疾病的药物。在一些情况下，药物在递送编码GPCR或LGIC的核酸
后至少一周施用于受试者。在进一步的情况下，药物每天至少连续三天施用于受试者。在一
些实施例中，所述方法包括递送给患有非癫痫症的神经疾病的受试者GPCR和生物惰性剂，
GPCR是hM4Di，生物惰性剂是氯氮平-N-氧化物。
GPCR或LGIC从而治疗神经疾病的药物。在一些情况下，药物在递送编码GPCR或LGIC的核酸
后至少一周施用于受试者。在进一步的情况下，药物每天至少连续三天施用于受试者。在一
些实施例中，所述方法包括递送给患有非癫痫症的神经疾病的受试者GPCR和生物惰性剂，
GPCR是hM4Di，生物惰性剂是氯氮平-N-氧化物。
[0357] 在其它情况下，所述方法包括向异源表达GPCR或LGIC的受试者施用激活GPCR或LGIC的药物，其中所述药物不是GPCR或LGIC的内源配体。在某些情况下，该药不是κ-阿片受体(KOR)结合药物。在其它情况下，神经疾病不是癫痫。在又一些情况下，GPCR是除κ-阿片受体(KOR)之外的GPCR。
[0358] 在其它情况下，所述方法包括通过向异源表达GPCR或LGIC的受试者施用激活GPCR或LGIC的药物来治疗神经疾病。在一些情况下，GPCR或LGIC在感觉神经元、背根神经节或三
叉神经节中选择性表达。
叉神经节中选择性表达。
[0359] 在其它情况下，所述方法包括通过向异源表达GPCR或LGIC的受试者施用激活GPCR或LGIC的药物来治疗神经疾病，其中所述药物经FDA批准但未经FDA批准用于治疗神经疾
病。
病。
[0360] 在其它情况下，所述方法包括通过向异源表达GPCR或LGIC的受试者施用激活GPCR或LGIC的药物来治疗神经疾病，其中所述药物以0.001μg/kg-10mg/kg的剂量施用。
[0361] 在一些方面，本发明考虑颅内注射AAV-hSYN-GlyRM到受试者的海马中，并用依维菌素治疗受试者以可逆沉默神经元网络，例如与记忆相关的网络(参见奥本赫斯
(Obenhaus)等人,前端分子神经科学(Front Mol Neurosci).2016；9:75)。在一些实施例
中，GlyRM蛋白包含F207A和A288G突变。
(Obenhaus)等人,前端分子神经科学(Front Mol Neurosci).2016；9:75)。在一些实施例
中，GlyRM蛋白包含F207A和A288G突变。
[0362] 在一些情况下，本发明包括治疗受试者的帕金森病的方法，包括向受试者施用选自AAV-hSYN-rM3DS、AAV-hSYN-hM3Dq和AAV-hSYN-KORD的AAV载体，并向受试者施用CNO。在
一些情况下，用AAV载体转导移植的多巴胺神经元(参见阿德林-科克(Aldrin-Kirk)等人,
神经元(Neuron.)2016,90(5):955-968)。
一些情况下，用AAV载体转导移植的多巴胺神经元(参见阿德林-科克(Aldrin-Kirk)等人,
神经元(Neuron.)2016,90(5):955-968)。
[0363] 在一些情况下，本发明包括治疗受试者的阿尔茨海默病的方法，包括向受试者施用选自AAV-CAG-hM4D和AAV-CAG-hM3D的AAV载体，并向受试者施用CNO。在一些实施例中，将
AAV载体注射到蛛网膜下腔或CA1中(参见袁(Yuan)等人,神经科学杂志(J Neurosci.)
2016,36(2):632-641)。
AAV载体注射到蛛网膜下腔或CA1中(参见袁(Yuan)等人,神经科学杂志(J Neurosci.)
2016,36(2):632-641)。
[0364] 在某些方面，本发明包括治疗受试者的恐惧和/或焦虑的方法，其包括向受试者施用AAV载体(例如AAV-CamKII-hM3Dq)，并向受试者施用CNO。在一些实施例中，将AAV载体注
射入杏仁核(参见森古普塔(Sengupta)等人,神经科学杂志(The Journal of
Neuroscience),2016,36(2):385-395)。
射入杏仁核(参见森古普塔(Sengupta)等人,神经科学杂志(The Journal of
Neuroscience),2016,36(2):385-395)。
[0365] 本发明部分涵盖用于控制、管理、预防或治疗受试者疼痛的组合物和方法。“疼痛”是指受试者体内的不舒服感和/或不愉快的感觉。疼痛的感觉可以从轻微到偶尔到严重和恒定。疼痛可分为急性疼痛或慢性疼痛。疼痛可以是伤害性疼痛(即由组织损伤引起的疼
痛)、神经性疼痛或心因性疼痛。在某些情况下，疼痛是由疾病(例如癌症、关节炎、糖尿病)引起或与之相关的。在其它情况下，疼痛是由伤害引起的(例如运动损伤、创伤)。适合用本
文组合物和方法治疗的疼痛的非限制性实例包括：神经性疼痛，包括周围神经病、糖尿病性
神经病、疱疹后神经痛、三叉神经痛、背痛、与癌症相关的神经病、与HIV/AIDS相关的神经
病、幻肢痛、腕管综合症、中枢性中风后疼痛、与慢性酒精中毒相关的疼痛、甲状腺功能减退症、尿毒症、与多发性硬化症相关的疼痛、与脊髓损伤相关的疼痛、与帕金森病相关的疼痛、癫痫、骨关节炎疼痛、类风湿性关节炎疼痛、内脏疼痛和与维生素缺乏有关的疼痛；和伤害
性疼痛，包括与中枢神经系统创伤、拉伤/扭伤和烧伤相关的疼痛；心肌梗塞、急性胰腺炎、手术后疼痛、创伤后疼痛、肾绞痛、与癌症相关的疼痛、与纤维肌痛有关的疼痛、与腕管综合症相关的疼痛和背痛。
痛)、神经性疼痛或心因性疼痛。在某些情况下，疼痛是由疾病(例如癌症、关节炎、糖尿病)引起或与之相关的。在其它情况下，疼痛是由伤害引起的(例如运动损伤、创伤)。适合用本
文组合物和方法治疗的疼痛的非限制性实例包括：神经性疼痛，包括周围神经病、糖尿病性
神经病、疱疹后神经痛、三叉神经痛、背痛、与癌症相关的神经病、与HIV/AIDS相关的神经
病、幻肢痛、腕管综合症、中枢性中风后疼痛、与慢性酒精中毒相关的疼痛、甲状腺功能减退症、尿毒症、与多发性硬化症相关的疼痛、与脊髓损伤相关的疼痛、与帕金森病相关的疼痛、癫痫、骨关节炎疼痛、类风湿性关节炎疼痛、内脏疼痛和与维生素缺乏有关的疼痛；和伤害
性疼痛，包括与中枢神经系统创伤、拉伤/扭伤和烧伤相关的疼痛；心肌梗塞、急性胰腺炎、手术后疼痛、创伤后疼痛、肾绞痛、与癌症相关的疼痛、与纤维肌痛有关的疼痛、与腕管综合症相关的疼痛和背痛。
[0366] 本文的组合物和方法可用于改善受试者的疼痛水平。在一些情况下，受试者的疼痛水平改善了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％至少
40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％至少90％、至少95％、至少99％或100％。受试者的疼痛程度可以通过多种方法进
行评估。在某些情况下，通过自我报告来评估疼痛程度(即，人类受试者表达他/她正在经历
的疼痛程度的口头报告)。在某些情况下，通过疼痛的行为指标来评估疼痛程度，例如面部
表情、肢体运动、发声、不安和保护。例如，当受试者不能自我报告时(例如，婴儿、无意识的受试者、非人类受试者)，这些类型的评估可能是有用的。与使用该组合物治疗之前受试者
所经历的疼痛水平相比，可以在用本发明的组合物治疗后评估疼痛水平。
40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％至少90％、至少95％、至少99％或100％。受试者的疼痛程度可以通过多种方法进
行评估。在某些情况下，通过自我报告来评估疼痛程度(即，人类受试者表达他/她正在经历
的疼痛程度的口头报告)。在某些情况下，通过疼痛的行为指标来评估疼痛程度，例如面部
表情、肢体运动、发声、不安和保护。例如，当受试者不能自我报告时(例如，婴儿、无意识的受试者、非人类受试者)，这些类型的评估可能是有用的。与使用该组合物治疗之前受试者
所经历的疼痛水平相比，可以在用本发明的组合物治疗后评估疼痛水平。
[0367] 在各种实施方式中，用于控制、管理、预防或治疗受试者疼痛的方法包括向受试者施用有效量的本文考虑的载体。不希望受任何具体理论的束缚，本发明考虑使用本文揭示
的载体调节神经元活性以减轻受试者的疼痛。
的载体调节神经元活性以减轻受试者的疼痛。
[0368] 在各种实施例中，向一或多种减少疼痛感觉的神经元细胞(例如抑制性中间神经元)施用(或引入)激活或去极化神经元细胞的编码开关受体的载体。在配体存在的情况下，
表达开关受体的神经元细胞被激活并且降低对增强刺激这些神经元细胞的镇痛作用的疼
痛的敏感性。
表达开关受体的神经元细胞被激活并且降低对增强刺激这些神经元细胞的镇痛作用的疼
痛的敏感性。
[0369] 在各种实施例中，将增强神经元细胞失活或超极化的开关受体的编码载体施用于(或引入)一或多种增加对疼痛的疼痛感觉或敏感性的神经元细胞，例如伤害感受器、外周
感觉神经元、C-纤维、Aδ纤维、Aβ纤维、DRG神经元、TGG神经元等。在配体存在下，表达开关受体的神经元细胞失活并降低对疼痛的敏感性并增强镇痛作用。
感觉神经元、C-纤维、Aδ纤维、Aβ纤维、DRG神经元、TGG神经元等。在配体存在下，表达开关受体的神经元细胞失活并降低对疼痛的敏感性并增强镇痛作用。
[0370] 将开关受体的表达靶向至伤害感受器的亚群可通过以下一或多种来实现：选择载体(例如AAV1、AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3(Y705+731F)、
AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3变体Y705F/Y731F/T492V)、AAV-7m8、AAV8、
AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变体Y731F)、AAV10(Y733F)和AAV-ShH10)；选择启动子；和递送手段。
AAV5、AAV5(Y436+693+719F)、AAV6、AAV6(VP3变体Y705F/Y731F/T492V)、AAV-7m8、AAV8、
AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变体Y731F)、AAV10(Y733F)和AAV-ShH10)；选择启动子；和递送手段。
[0371] 在具体的实施例中，本文考虑的组合物和方法在减轻疼痛方面有效。
[0372] 适合用本文考虑的载体，组合物和方法治疗的疼痛的说明性实例包括但不限于急性疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛、异常性疼痛、炎症性疼痛、炎性痛觉过敏、神经病、神经痛、糖尿病性神经病、人类免疫缺陷病毒相关性神经病、神经损伤、类风湿性关节炎疼痛、骨关节炎疼痛、烧伤、背痛、眼痛、内脏痛、癌症疼痛(例如骨癌疼痛)、牙痛、头痛、偏头痛、腕管综合症、纤维肌痛、神经炎、坐骨神经痛、骨盆过敏症、盆腔疼痛、疱疹后神经痛、手术后疼痛、中风后疼痛和月经痛。
[0373] 疼痛可以分为急性或慢性。“急性疼痛”是指突然开始并且质量通常很高的疼痛。急性疼痛可能会轻微并持续一段时间，或者可能会严重并持续数周或数月。在大多数情况
下，急性疼痛的持续时间不会超过三个月，并且在疼痛的根本原因已经治疗或已愈合时，它
会消失。然而，未缓解的急性疼痛可能导致慢性疼痛。“慢性疼痛”是指持续或反复发作的疼痛，持续超过急性疾病或损伤的正常过程，或持续超过三至六个月，并且对个人的健康有不
利影响。在具体的实施例中，术语“慢性疼痛”是指当它不应该时继续的疼痛。慢性疼痛可以是伤害性疼痛或神经性疼痛。
下，急性疼痛的持续时间不会超过三个月，并且在疼痛的根本原因已经治疗或已愈合时，它
会消失。然而，未缓解的急性疼痛可能导致慢性疼痛。“慢性疼痛”是指持续或反复发作的疼痛，持续超过急性疾病或损伤的正常过程，或持续超过三至六个月，并且对个人的健康有不
利影响。在具体的实施例中，术语“慢性疼痛”是指当它不应该时继续的疼痛。慢性疼痛可以是伤害性疼痛或神经性疼痛。
[0374] 在具体的实施例中，本文考虑的组合物和方法在减轻疼痛方面有效。
[0375] 在具体的实施例中，本文考虑的组合物和方法有效减少慢性疼痛。
[0376] 当患者症状中出现不适和异常敏感时，会出现临床疼痛。个人可以出现各种疼痛症状。这些症状包括：1)自发性疼痛，可能是暗沉、灼痛或刺痛；2)对有害刺激(痛觉过敏)的夸大疼痛反应；和3)通常无害的刺激产生的疼痛(异常性疼痛-迈耶(Meyer)等人,1994,疼
痛教科书(Textbook of Pain),13-44)。虽然患有各种形式的急性和慢性疼痛的患者可能
具有相似的症状，但其基本机制可能不同，因此可能需要不同的治疗策略。根据不同的病理
生理学，疼痛也可以分为许多不同的亚型，包括伤害性疼痛、炎症性疼痛和神经性疼痛。
痛教科书(Textbook of Pain),13-44)。虽然患有各种形式的急性和慢性疼痛的患者可能
具有相似的症状，但其基本机制可能不同，因此可能需要不同的治疗策略。根据不同的病理
生理学，疼痛也可以分为许多不同的亚型，包括伤害性疼痛、炎症性疼痛和神经性疼痛。
[0377] 在具体的实施例中，本文考虑的组合物和方法在减少伤害性疼痛方面是有效的。
[0378] 在具体的实施例中，本文考虑的组合物和方法在减少炎症疼痛方面是有效的。
[0379] 在具体的实施例中，本文考虑的组合物和方法在减少神经性疼痛方面是有效的。
[0380] 伤害性疼痛是由组织损伤或强烈刺激引起的，可能导致损伤。中度到重度急性伤害性疼痛是中枢神经系统创伤、拉伤/扭伤、烧伤、心肌梗塞和急性胰腺炎、手术后疼痛(任
何类型手术后的疼痛)、创伤后疼痛、肾绞痛、癌症疼痛和背痛。癌症疼痛可以是慢性疼痛，例如肿瘤相关疼痛(例如骨痛、头痛、面部疼痛或内脏疼痛)或与癌症治疗(例如化疗后综合
症、慢性手术后疼痛综合症或放疗后综合症)相关的疼痛。对化疗、免疫疗法、激素疗法或放疗反应也可能发生癌症疼痛。背痛可能是由于椎间盘突出或破裂或腰椎小关节、骶髂关节、
椎旁肌或后纵韧带异常所致。背痛可能会自然消退，但在一些持续12周以上的患者中，它会
成为一种慢性疾病，尤其会使身体虚弱。
何类型手术后的疼痛)、创伤后疼痛、肾绞痛、癌症疼痛和背痛。癌症疼痛可以是慢性疼痛，例如肿瘤相关疼痛(例如骨痛、头痛、面部疼痛或内脏疼痛)或与癌症治疗(例如化疗后综合
症、慢性手术后疼痛综合症或放疗后综合症)相关的疼痛。对化疗、免疫疗法、激素疗法或放疗反应也可能发生癌症疼痛。背痛可能是由于椎间盘突出或破裂或腰椎小关节、骶髂关节、
椎旁肌或后纵韧带异常所致。背痛可能会自然消退，但在一些持续12周以上的患者中，它会
成为一种慢性疾病，尤其会使身体虚弱。
[0381] 神经性疼痛可以定义为由神经系统中的原发病灶或功能障碍引发或引起的疼痛。神经性疼痛的病因包括例如周围神经病、糖尿病性神经病、疱疹后神经痛、三叉神经痛、背
痛、癌症神经病、HIV神经病、幻肢痛、腕管综合症、中枢性中风后疼痛和与慢性酒精中毒相关的疼痛、甲状腺功能减退症、尿毒症、多发性硬化症、脊髓损伤、帕金森病、癫痫症和维生素缺乏症。
痛、癌症神经病、HIV神经病、幻肢痛、腕管综合症、中枢性中风后疼痛和与慢性酒精中毒相关的疼痛、甲状腺功能减退症、尿毒症、多发性硬化症、脊髓损伤、帕金森病、癫痫症和维生素缺乏症。
[0382] 神经性疼痛可以与疼痛疾病有关，该疾病是指与疼痛相关或由疼痛引起的疾病，病症或病症。疼痛障碍的说明性实例包括关节炎、异常性疼痛、典型的三叉神经痛、三叉神
经痛、躯体形式障碍、假性麻醉、痛觉过敏、神经痛、神经炎、神经原性疼痛、痛觉缺失、麻醉性痛觉过敏、内脏疾病、慢性疼痛疾病、偏头痛/头痛、慢性疲劳综合症、复杂区域疼痛综合症、神经营养不良、足底筋膜炎或与癌症相关的疼痛。
经痛、躯体形式障碍、假性麻醉、痛觉过敏、神经痛、神经炎、神经原性疼痛、痛觉缺失、麻醉性痛觉过敏、内脏疾病、慢性疼痛疾病、偏头痛/头痛、慢性疲劳综合症、复杂区域疼痛综合症、神经营养不良、足底筋膜炎或与癌症相关的疼痛。
[0383] 炎症过程是一系列复杂的生物化学和细胞事件，响应于组织损伤或外来物质的存在而被激活，这会导致肿胀和疼痛。关节炎疼痛是一种常见的炎症性疼痛。
[0384] 适合用本文考虑的载体，组合物和方法治疗的其它类型的疼痛包括但不限于由肌肉骨骼病症引起的疼痛，包括肌痛、纤维肌痛、脊椎炎、血清阴性(非类风湿)关节病、非关节风湿病、肌营养不良症、糖原分解、多肌炎和肌炎；心脏和血管疼痛、包括由心绞痛、心肌梗塞、二尖瓣狭窄、心包炎、雷诺现象、硬化症和骨骼肌缺血引起的疼痛；头痛，如偏头痛(包括先兆偏头痛和无先兆偏头痛)、丛集性头痛、紧张型头痛、混合性头痛和与血管疾病相关的
头痛；和口面疼痛，包括牙痛、耳部疼痛、灼口综合症和颞下颌肌筋膜疼痛。
头痛；和口面疼痛，包括牙痛、耳部疼痛、灼口综合症和颞下颌肌筋膜疼痛。
[0385] 本文考虑的组合物和方法减少受试者所经历的疼痛量的能力可以使用多种疼痛量表来确定。患者自我报告可用于评估疼痛是否减轻；参见例如卡兹和梅尔扎克(Katz and
Melzack)(1999)北美临床外科(Surg.Clin.North Am.)79:231。或者，可以使用观察疼痛量
表。LANSS疼痛量表(LANSS Pain Scale)可用于评估疼痛是否减轻；参见例如本内特
(Bennett)(2001)疼痛(Pain)92:147。可以使用视觉模拟疼痛量表；参见例如什玛德
(Schmader)(2002)疼痛临床杂志(Clin.J.Pain)18:350。可以使用Likert疼痛量表；例如，
其中0是没有疼痛，5是中度疼痛，10是最可能的疼痛。儿童自我报告疼痛量表包括例如面部
疼痛量表(Faces Pain Scale)；Wong-Baker面部疼痛评分量表(Wong-Baker FACES Pain
Rating Scale)；和彩色模拟量表(Colored Analog Scale)。成人的自我报告疼痛量表包括
例如视觉模拟量表(Visual Analog Scale)；口头数字评估量表(Verbal Numerical
Rating Scale)；言语描述符量表(Verbal Descriptor Scale)；和简单疼痛量表(Brief
Pain Inventory)。疼痛测量量表包括例如Alder Hey Triage疼痛得分(斯特沃特
(Stewart)等人(2004)儿童疾病档案(Arch.Dis.Child.)89:625)；行为疼痛量表
(Behavioral Pain Scale)(佩恩(Payen)等人(2001)临床护理医学(Critical Care
Medicine)29:2258)；简明疼痛调查表(Brief Pain Inventory)(克里兰德和瑞恩
(Cleeland and Ryan)(1994)新加坡医学年报(Ann.Acad.Med.Singapore)23:129)；非语言
疼痛指标检查表(Checklist of Nonverbal Pain Indicators)(菲尔德(Feldt)(2000)疼
痛管理护理(Pain Manag.Nurs.)1:13)；临床护理疼痛观察工具(Critical-Care Pain
Observation Tool)(格里纳斯(Gelinas)等人(2006)美国临床护理杂志(Am.J.Crit.Care)
15:420)；舒适度量表(COMFORT scale)(安博尔(Ambuel)等人(1992)儿科心理学杂志
(J.Pediatric Psychol.)17:95)；达拉斯疼痛问卷(Dallas Pain Questionnaire)(奥兹古
勒(Ozguler)等人(2002)脊椎(Spine)27:1783)；测痛仪疼痛指数(Dolorimeter Pain
Index)(哈迪(Hardy)等人(1952)疼痛感觉和反应(Pain Sensations and Reactions)
Baltimore:The Williams&Wilkins Co.)；修订版面部疼痛量表(Faces Pain Scale–
Revised)(希克斯(Hicks)等人(2001)疼痛(Pain)93:173)；脸、腿、活动、哭泣可安慰性量表(Face Legs Activity Cry Consolability Scale)；麦吉尔疼痛问卷(McGill Pain
Questionnaire)(默扎克(Melzack)(1975)疼痛(Pain)1:277)；描述词差异量表
(Descriptor Differential Scale)(格蕾丝丽和魁罗兹(Gracely and Kwilosz)(1988)疼
痛(Pain)35:279)；数字11点框(Numerical 1 1point Box)(简森(Jensen)等人(1989)临床
疼痛杂志(Clin.J.Pain)5:153)；数字评级量表(Numeric Rating Scale)(哈德里克
(Hartrick)等人(2003)疼痛实践(Pain Pract.)3:310)；Wong-Baker面疼痛分级量表
(FACES Pain Rating Scale)；以及视觉模拟量表(Visual Analog Scale)(赫斯基森
(Huskisson)(1982)风湿病学杂志(J.Rheumatol.)9:768)。
Melzack)(1999)北美临床外科(Surg.Clin.North Am.)79:231。或者，可以使用观察疼痛量
表。LANSS疼痛量表(LANSS Pain Scale)可用于评估疼痛是否减轻；参见例如本内特
(Bennett)(2001)疼痛(Pain)92:147。可以使用视觉模拟疼痛量表；参见例如什玛德
(Schmader)(2002)疼痛临床杂志(Clin.J.Pain)18:350。可以使用Likert疼痛量表；例如，
其中0是没有疼痛，5是中度疼痛，10是最可能的疼痛。儿童自我报告疼痛量表包括例如面部
疼痛量表(Faces Pain Scale)；Wong-Baker面部疼痛评分量表(Wong-Baker FACES Pain
Rating Scale)；和彩色模拟量表(Colored Analog Scale)。成人的自我报告疼痛量表包括
例如视觉模拟量表(Visual Analog Scale)；口头数字评估量表(Verbal Numerical
Rating Scale)；言语描述符量表(Verbal Descriptor Scale)；和简单疼痛量表(Brief
Pain Inventory)。疼痛测量量表包括例如Alder Hey Triage疼痛得分(斯特沃特
(Stewart)等人(2004)儿童疾病档案(Arch.Dis.Child.)89:625)；行为疼痛量表
(Behavioral Pain Scale)(佩恩(Payen)等人(2001)临床护理医学(Critical Care
Medicine)29:2258)；简明疼痛调查表(Brief Pain Inventory)(克里兰德和瑞恩
(Cleeland and Ryan)(1994)新加坡医学年报(Ann.Acad.Med.Singapore)23:129)；非语言
疼痛指标检查表(Checklist of Nonverbal Pain Indicators)(菲尔德(Feldt)(2000)疼
痛管理护理(Pain Manag.Nurs.)1:13)；临床护理疼痛观察工具(Critical-Care Pain
Observation Tool)(格里纳斯(Gelinas)等人(2006)美国临床护理杂志(Am.J.Crit.Care)
15:420)；舒适度量表(COMFORT scale)(安博尔(Ambuel)等人(1992)儿科心理学杂志
(J.Pediatric Psychol.)17:95)；达拉斯疼痛问卷(Dallas Pain Questionnaire)(奥兹古
勒(Ozguler)等人(2002)脊椎(Spine)27:1783)；测痛仪疼痛指数(Dolorimeter Pain
Index)(哈迪(Hardy)等人(1952)疼痛感觉和反应(Pain Sensations and Reactions)
Baltimore:The Williams&Wilkins Co.)；修订版面部疼痛量表(Faces Pain Scale–
Revised)(希克斯(Hicks)等人(2001)疼痛(Pain)93:173)；脸、腿、活动、哭泣可安慰性量表(Face Legs Activity Cry Consolability Scale)；麦吉尔疼痛问卷(McGill Pain
Questionnaire)(默扎克(Melzack)(1975)疼痛(Pain)1:277)；描述词差异量表
(Descriptor Differential Scale)(格蕾丝丽和魁罗兹(Gracely and Kwilosz)(1988)疼
痛(Pain)35:279)；数字11点框(Numerical 1 1point Box)(简森(Jensen)等人(1989)临床
疼痛杂志(Clin.J.Pain)5:153)；数字评级量表(Numeric Rating Scale)(哈德里克
(Hartrick)等人(2003)疼痛实践(Pain Pract.)3:310)；Wong-Baker面疼痛分级量表
(FACES Pain Rating Scale)；以及视觉模拟量表(Visual Analog Scale)(赫斯基森
(Huskisson)(1982)风湿病学杂志(J.Rheumatol.)9:768)。
[0386] 在具体的实施例中，一种方法包括将包含开关受体的载体引入神经元细胞中，并通过提供激活开关受体的配体来控制细胞的活性，由此减轻受试者的疼痛。所述方法为疼
痛提供了显著的镇痛而没有脱靶效应，例如全身中枢神经系统抑制。在某些实施例中，与未
治疗的受试者相比，所述方法提供受试者的神经病理性疼痛的1％、5％、10％、15％、20％、
25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的减轻。
痛提供了显著的镇痛而没有脱靶效应，例如全身中枢神经系统抑制。在某些实施例中，与未
治疗的受试者相比，所述方法提供受试者的神经病理性疼痛的1％、5％、10％、15％、20％、
25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的减轻。
[0387] 在具体的实施例中，将本文考虑的载体施用或引入一或多个神经元细胞。神经元细胞可以是相同类型的神经元细胞，或不同类型的神经元细胞的混合群体。
[0388] 在一个实施例中，神经元细胞是伤害感受器或外周感觉神经元。
[0389] 感觉神经元的说明性实例包括但不限于背根神经节(DRG)神经元和三叉神经节(TGG)神经元。
[0390] 在一个实施例中，神经元细胞是参与神经元疼痛回路的抑制性中间神经元。
[0391] 在一些情况下，将编码开关受体的载体施用给有需要的受试者。施用方法的非限制性实例包括皮下施用、静脉内施用、肌内施用、皮内施用、腹腔施用、口服施用、输注、颅内施用、鞘内施用、鼻内施用、神经节内施用、脊柱内施用、小脑延髓池施用和神经内施用。在一些情况下，施用可以涉及注射载体的液体调配物。在其它情况下，施用可以涉及载体的固
体调配物的口服递送。在一些情况下，口服调配物可以与食物一起施用。在具体的实施例
中，载体经胃肠外、静脉内、肌内、腹腔、鞘内、神经内、神经节内、脊柱内或心室内向受试者施用以将载体引入一或多个神经元细胞。在各种实施例中，载体是rAAV。
体调配物的口服递送。在一些情况下，口服调配物可以与食物一起施用。在具体的实施例
中，载体经胃肠外、静脉内、肌内、腹腔、鞘内、神经内、神经节内、脊柱内或心室内向受试者施用以将载体引入一或多个神经元细胞。在各种实施例中，载体是rAAV。
[0392] 在一个实施例中，通过鞘内(IT)或神经节内(IG)施用将AAV施用于感觉神经元或伤害感受器，例如DRG神经元、TGG神经元等。
[0393] IT路线将AAV递送至脑脊液(CSF)。该施用途径可适用于治疗例如慢性疼痛或其它周围神经系统(PNS)或中枢神经系统(CNS)适应症。在动物中，通过将导管插入脑池并将其
推进到腰部水平，IT施用已经实现。在人类中，通过腰穿(LP)，这是一种常规床边手术，具有出色的安全性能，可以轻松进行IT分娩。
推进到腰部水平，IT施用已经实现。在人类中，通过腰穿(LP)，这是一种常规床边手术，具有出色的安全性能，可以轻松进行IT分娩。
[0394] 在特定情况下，可以通过神经节内施用将载体施用于受试者。脑内给药可能涉及直接注射入一或多个神经节。IG途径可将AAV直接递送至DRG或TGG实质中。在动物中，给予
DRG的IG通过开放的神经外科手术进行，这对于人类来说是不期望的，因为它需要复杂且有
创的手术。在人类中，可以使用微创CT成像引导技术来安全靶向DRG。用于对流增强递送
(CED)的定制针组件可用于将AAV输送到DRG实质中。在非限制性实例中，本发明的载体可递
送至一或多个背根神经节和/或三叉神经节以治疗慢性疼痛。在另一个非限制性实例中，可
将本发明的载体递送至结状神经节(迷走神经)以治疗癫痫。
DRG的IG通过开放的神经外科手术进行，这对于人类来说是不期望的，因为它需要复杂且有
创的手术。在人类中，可以使用微创CT成像引导技术来安全靶向DRG。用于对流增强递送
(CED)的定制针组件可用于将AAV输送到DRG实质中。在非限制性实例中，本发明的载体可递
送至一或多个背根神经节和/或三叉神经节以治疗慢性疼痛。在另一个非限制性实例中，可
将本发明的载体递送至结状神经节(迷走神经)以治疗癫痫。
[0395] 在又一个特定情况下，可以通过颅内给药(即，直接进入脑部)向受试者施用载体。在颅内给药的非限制性实例中，可将本发明的载体递送到脑的皮质中以治疗例如癫痫发作
焦点，进入室旁下丘脑以治疗例如饱食症或进入杏仁核中央核以治疗例如饱食症。在另一
个特定情况下，可以通过神经内注射(即直接注入神经)向受试者施用载体。可基于待治疗
的指征来选择神经，例如注射到坐骨神经中以治疗慢性疼痛或注射到迷走神经中以治疗癫
痫症或饱腹感病症。在又一个特定情况下，可以通过皮下注射向受试者施用载体，例如，进
入感觉神经末梢以治疗慢性疼痛。
焦点，进入室旁下丘脑以治疗例如饱食症或进入杏仁核中央核以治疗例如饱食症。在另一
个特定情况下，可以通过神经内注射(即直接注入神经)向受试者施用载体。可基于待治疗
的指征来选择神经，例如注射到坐骨神经中以治疗慢性疼痛或注射到迷走神经中以治疗癫
痫症或饱腹感病症。在又一个特定情况下，可以通过皮下注射向受试者施用载体，例如，进
入感觉神经末梢以治疗慢性疼痛。
[0396] 载体剂量可以表达为递送给受试者的载体基因组单位的数量。如本文所用的“载体基因组单元”是指以剂量施用的单个载体基因组的数目。单个载体基因组的大小通常取
决于所使用的病毒载体的类型。本发明的载体基因组可以是约1.0千碱基、1.5千碱基、2.0
千碱基、2.5千碱基、3.0千碱基、3.5千碱基、4.0千碱基、4.5千碱基、5.0千碱基、5.5千碱基、
6.0千碱基、6.5千碱基、7.0千碱基、7.5千碱基、8.0千个碱基、8.5千个碱基、9.0千个碱基、
9.5千个碱基、10.0千个碱基、至超过10.0千个碱基。因此，单个载体基因组可以包含多达或
6 6 6
多于10,000个碱基对的核苷酸。在一些情况中，载体剂量可以是约1×10、2×10、3×10 、4
×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×
107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、
9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×
10 10 10 10 10 10 10 10 11 11
10 、3×10 、4×10 、5×10 、6×10 、7×10 、8×10 、9×10 、1×10 、2×10 、3×
1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×
1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×
1013、6×1013、7×1013、8×1013、9×1013、1×1014、2×1014、3×1014、4×1014、5×1014、6×
1014、7×1014、8×1014、9×1014、1×1015、2×1015、3×1015、4×1015、5×1015、6×1015、7×
1015、8×1015、9×1015、1×1016、2×1016、3×1016、4×1016、5×1016、6×1016、7×1016、8×
1016、9×1016、1×1017、2×1017、3×1017、4×1017、5×1017、6×1017、7×1017、8×1017、9×
1017、1×1018、2×1018、3×1018、4×1018、5×1018、6×1018、7×1018、8×1018、9×1018、1×
1019、2×1019、3×1019、4×1019、5×1019、6×1019、7×1019、8×1019、9×1019、1×1020、2×
1020、3×1020、4×1020、5×1020、6×1020、7×1020、8×1020、9×1020或更高的载体基因组单
位。
决于所使用的病毒载体的类型。本发明的载体基因组可以是约1.0千碱基、1.5千碱基、2.0
千碱基、2.5千碱基、3.0千碱基、3.5千碱基、4.0千碱基、4.5千碱基、5.0千碱基、5.5千碱基、
6.0千碱基、6.5千碱基、7.0千碱基、7.5千碱基、8.0千个碱基、8.5千个碱基、9.0千个碱基、
9.5千个碱基、10.0千个碱基、至超过10.0千个碱基。因此，单个载体基因组可以包含多达或
6 6 6
多于10,000个碱基对的核苷酸。在一些情况中，载体剂量可以是约1×10、2×10、3×10 、4
×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×
107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、
9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×
10 10 10 10 10 10 10 10 11 11
10 、3×10 、4×10 、5×10 、6×10 、7×10 、8×10 、9×10 、1×10 、2×10 、3×
1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×
1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×
1013、6×1013、7×1013、8×1013、9×1013、1×1014、2×1014、3×1014、4×1014、5×1014、6×
1014、7×1014、8×1014、9×1014、1×1015、2×1015、3×1015、4×1015、5×1015、6×1015、7×
1015、8×1015、9×1015、1×1016、2×1016、3×1016、4×1016、5×1016、6×1016、7×1016、8×
1016、9×1016、1×1017、2×1017、3×1017、4×1017、5×1017、6×1017、7×1017、8×1017、9×
1017、1×1018、2×1018、3×1018、4×1018、5×1018、6×1018、7×1018、8×1018、9×1018、1×
1019、2×1019、3×1019、4×1019、5×1019、6×1019、7×1019、8×1019、9×1019、1×1020、2×
1020、3×1020、4×1020、5×1020、6×1020、7×1020、8×1020、9×1020或更高的载体基因组单
位。
[0397] 在具体实施例中，本文考虑的载体以至少约1×109基因组颗粒/mL、至少约1×1010基因组颗粒/mL、至少约5×1010基因组颗粒/mL、至少约1×1011基因组颗粒/mL、至少约5×
1011基因组颗粒/mL、至少约1×1012基因组颗粒/mL、至少约5×1012基因组颗粒/mL、至少约6
12 12 12
×10 基因组颗粒/mL、至少约7×10 基因组颗粒/mL、至少约8×10 基因组颗粒/mL、至少
约9×1012基因组颗粒/mL、至少约10×1012基因组颗粒/mL、至少约15×1012基因组颗粒/mL、
至少约20×1012基因组颗粒/mL、至少约25×1012基因组颗粒/mL、至少约50×1012基因组颗
粒/mL或至少约100×1012基因组颗粒/mL的滴度施用给受试者。如涉及病毒滴度所使用的术
语“基因组颗粒(gp)”或“基因组等同物”或“基因组拷贝”(gc)，是指含有重组AAV DNA基因组的病毒颗粒的数量，而不管感染性或功能。特定载体制备物中基因组颗粒的数量可以通
过例如本文实施例中，或者例如在克拉克(Clark)等人(1999)人类基因治疗(Hum.Gene
Ther.),10:1031-1039；维德维克(Veldwijk)等人(2002)分子治疗(Mol.Ther.),6:272-278
中所述的方法测量。
1011基因组颗粒/mL、至少约1×1012基因组颗粒/mL、至少约5×1012基因组颗粒/mL、至少约6
12 12 12
×10 基因组颗粒/mL、至少约7×10 基因组颗粒/mL、至少约8×10 基因组颗粒/mL、至少
约9×1012基因组颗粒/mL、至少约10×1012基因组颗粒/mL、至少约15×1012基因组颗粒/mL、
至少约20×1012基因组颗粒/mL、至少约25×1012基因组颗粒/mL、至少约50×1012基因组颗
粒/mL或至少约100×1012基因组颗粒/mL的滴度施用给受试者。如涉及病毒滴度所使用的术
语“基因组颗粒(gp)”或“基因组等同物”或“基因组拷贝”(gc)，是指含有重组AAV DNA基因组的病毒颗粒的数量，而不管感染性或功能。特定载体制备物中基因组颗粒的数量可以通
过例如本文实施例中，或者例如在克拉克(Clark)等人(1999)人类基因治疗(Hum.Gene
Ther.),10:1031-1039；维德维克(Veldwijk)等人(2002)分子治疗(Mol.Ther.),6:272-278
中所述的方法测量。
[0398] 本发明的载体可以在一定体积的流体中施用。在一些情况下，载体可以以约0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、
4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL、8.0mL、9.0mL、10.0mL、11.0mL、12.0mL、13.0mL、14.0mL、
15.0mL、16.0mL、17.0mL、18.0mL、19.0mL、20.0mL或大于20.0mL的体积施用。在一些情况下，载体剂量可以表示为施用给受试者的载体的浓度或滴度。在这种情况下，载体剂量可以表
示为每个体积的载体基因组单位数(即，基因组单位/体积)。
4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL、8.0mL、9.0mL、10.0mL、11.0mL、12.0mL、13.0mL、14.0mL、
15.0mL、16.0mL、17.0mL、18.0mL、19.0mL、20.0mL或大于20.0mL的体积施用。在一些情况下，载体剂量可以表示为施用给受试者的载体的浓度或滴度。在这种情况下，载体剂量可以表
示为每个体积的载体基因组单位数(即，基因组单位/体积)。
[0399] 在具体实施例中，本文考虑的载体以至少约5×109感染单位/mL、至少约6×109感染单位/mL、至少约7×109感染单位/mL、至少约8×109感染单位/mL、至少约9×109感染单
位/mL、至少约10×109感染单位/mL、至少约15×109感染单位/mL、至少约20×109感染单位/
mL、至少约25×109感染单位/mL、至少约50×109感染单位/mL或至少约100×109感染单位/
mL的滴度施用给受试者。如涉及病毒滴度所使用的术语“感染单位(iu)”、“感染性颗粒”或“复制单位”是指由感染中心测量的感染性和可复制重组AAV载体颗粒的数量测定法，也称
为复制中心测定法，如例如麦克劳克林(McLaughlin)等人(1988)病毒学杂志(J.Virol.),
62:1963-1973所述。
位/mL、至少约10×109感染单位/mL、至少约15×109感染单位/mL、至少约20×109感染单位/
mL、至少约25×109感染单位/mL、至少约50×109感染单位/mL或至少约100×109感染单位/
mL的滴度施用给受试者。如涉及病毒滴度所使用的术语“感染单位(iu)”、“感染性颗粒”或“复制单位”是指由感染中心测量的感染性和可复制重组AAV载体颗粒的数量测定法，也称
为复制中心测定法，如例如麦克劳克林(McLaughlin)等人(1988)病毒学杂志(J.Virol.),
62:1963-1973所述。
[0400] 在具体实施例中，本文考虑的载体以至少约5×1010转导单位/mL、至少约6×1010转导单位/mL、至少约7×1010转导单位/mL、至少约8×1010转导单位/mL、至少约9×1010转导
10 10 10
单位/mL、至少约10×10 转导单位/mL、至少约15×10 转导单位/mL、至少约20×10 转导
单位/mL、至少约25×1010转导单位/mL、至少约50×1010转导单位/mL或至少约100×1010转
导单位/mL的滴度施用给受试者。如涉及病毒滴度所用的术语“转导单位(tu)”是指导致功
能性转基因产物产生的感染性重组AAV载体颗粒的数量，如在本文实施例中或者例如在肖
(Xiao)等人(1997)神经生物学实验(Exp.Neurobiol.),144:113-124；或费希尔(Fisher)等
人(1996)病毒学杂志(J.Virol.),70:520-532(LFU分析)所述的功能性测定中所测量的。
10 10 10
单位/mL、至少约10×10 转导单位/mL、至少约15×10 转导单位/mL、至少约20×10 转导
单位/mL、至少约25×1010转导单位/mL、至少约50×1010转导单位/mL或至少约100×1010转
导单位/mL的滴度施用给受试者。如涉及病毒滴度所用的术语“转导单位(tu)”是指导致功
能性转基因产物产生的感染性重组AAV载体颗粒的数量，如在本文实施例中或者例如在肖
(Xiao)等人(1997)神经生物学实验(Exp.Neurobiol.),144:113-124；或费希尔(Fisher)等
人(1996)病毒学杂志(J.Virol.),70:520-532(LFU分析)所述的功能性测定中所测量的。
[0401] 载体剂量一般通过给药途径来确定。在一个具体实例中，神经节内注射可包括约0.1mL至约1.0mL体积的约1×109至约1×1013个载体基因组。在另一个具体情况中，鞘内注
射可包括约1.0mL至约12.0mL体积的约1×1010至约1×1015个载体基因组。在另一个具体情
况中，颅内注射可包括约0.1mL至约1.0mL体积的约1×109至约1×1013个载体基因组。在另
9 13
一个具体情况中，神经内注射可包括约0.1mL至约1.0mL体积的约1×10至约1×10 个载体
基因组。在另一个实例中，脊髓内注射可包括约0.1mL至约1.0mL体积的约1×109至约1×
1013个载体基因组。在又一个特定情况下，小脑延髓池输注可包括约0.5mL至约5.0mL体积的
约5×109至约5×1013个载体基因组。在另一个具体情况中，皮下注射可包括约0.1mL至约
9 13
1.0mL体积的约1×10至约1×10 个载体基因组。
射可包括约1.0mL至约12.0mL体积的约1×1010至约1×1015个载体基因组。在另一个具体情
况中，颅内注射可包括约0.1mL至约1.0mL体积的约1×109至约1×1013个载体基因组。在另
9 13
一个具体情况中，神经内注射可包括约0.1mL至约1.0mL体积的约1×10至约1×10 个载体
基因组。在另一个实例中，脊髓内注射可包括约0.1mL至约1.0mL体积的约1×109至约1×
1013个载体基因组。在又一个特定情况下，小脑延髓池输注可包括约0.5mL至约5.0mL体积的
约5×109至约5×1013个载体基因组。在另一个具体情况中，皮下注射可包括约0.1mL至约
9 13
1.0mL体积的约1×10至约1×10 个载体基因组。
[0402] 在一些情况下，通过输注将载体递送至受试者。通过输注递送给受试者的载体剂量可以作为载体输注速率来测量。载体输注速率的非限制性实例包括：神经节内、脊柱内、
颅内或神经内给药，1-10μl/min；和鞘内或脑池给药，10-1000μl/min。在某些情况下，通过MRI引导的对流增强递送(CED)将载体递送至受试者。这种技术能够增加病毒的传播和转
导，分布于整个大脑的大脑，并减少载体沿着针道的回流。
颅内或神经内给药，1-10μl/min；和鞘内或脑池给药，10-1000μl/min。在某些情况下，通过MRI引导的对流增强递送(CED)将载体递送至受试者。这种技术能够增加病毒的传播和转
导，分布于整个大脑的大脑，并减少载体沿着针道的回流。
[0403] 在各种实施例中，提供了一种方法，其包括将编码开关受体的载体施用于一或多种神经元细胞，该开关受体使神经元细胞失活或超极化，所述一或多种神经元细胞增加对
疼痛的疼痛感或敏感性，并将特异性结合表达开关受体的神经元细胞的配体施用给受试
者，从而使细胞失活，降低对疼痛的敏感性并增强镇痛作用。
疼痛的疼痛感或敏感性，并将特异性结合表达开关受体的神经元细胞的配体施用给受试
者，从而使细胞失活，降低对疼痛的敏感性并增强镇痛作用。
[0404] 在多个实施例中，提供了一种方法，其包括将编码开关受体的载体施用给一或多种神经元细胞，所述开关受体激活或极化神经元细胞，所述一或多种神经元细胞降低疼痛
感或对疼痛的敏感性，并且将特异性结合表达开关受体的神经元细胞的配体施用给受试
者，从而激活细胞，降低对疼痛的敏感性并增强镇痛作用。
感或对疼痛的敏感性，并且将特异性结合表达开关受体的神经元细胞的配体施用给受试
者，从而激活细胞，降低对疼痛的敏感性并增强镇痛作用。
[0405] 配体调配物可以通过各种途径施用于受试者。施用方法的非限制性实例包括皮下施用、静脉内施用、肌内施用、透皮施用、皮内施用、腹腔施用、口服施用、输注、颅内施用、鞘内施用、鼻内施用、神经节内施用和神经内施用。在一些情况下，施用可以涉及注射配体的
液体调配物。在其它情况下，施用可以涉及口服递送配体的固体调配物。在特定情况下，配
体通过口服给药(例如，丸剂、片剂、胶囊等)。在一些情况下，口服组合物可以与食物一起施用。在另一个特定情况下，通过鞘内注射(即，进入脊髓的蛛网膜下腔)施用配体以递送至受
试者的脑脊髓液(CSF)。在另一特定情况下，局部施用配体(例如皮肤贴剂、乳膏剂、洗剂、软膏剂等)。
液体调配物。在其它情况下，施用可以涉及口服递送配体的固体调配物。在特定情况下，配
体通过口服给药(例如，丸剂、片剂、胶囊等)。在一些情况下，口服组合物可以与食物一起施用。在另一个特定情况下，通过鞘内注射(即，进入脊髓的蛛网膜下腔)施用配体以递送至受
试者的脑脊髓液(CSF)。在另一特定情况下，局部施用配体(例如皮肤贴剂、乳膏剂、洗剂、软膏剂等)。
[0406] 施用给受试者的配体的剂量不受绝对限制，但取决于组合物及其活性成分的性质及其不需要的副作用(例如针对抗体的免疫反应)，待治疗的受试者和正在治疗的病症类型
和给药方式。通常，剂量将是治疗有效量，例如足以实现期望的生物效应的量，例如有效降
低或减弱受试者所经历的疼痛水平的量。在具体的实施例中，剂量还可以是预防量或有效
量。治疗有效量的配体可以取决于给药途径，待治疗的适应症和/或选择使用的配体。
和给药方式。通常，剂量将是治疗有效量，例如足以实现期望的生物效应的量，例如有效降
低或减弱受试者所经历的疼痛水平的量。在具体的实施例中，剂量还可以是预防量或有效
量。治疗有效量的配体可以取决于给药途径，待治疗的适应症和/或选择使用的配体。
[0407] 在一个实施例中，配体在施用载体之前首先施用于受试者。在递送载体后的某个时间，可将治疗有效量的配体施用给受试者。通常，在递送载体后，受试者的一或多个细胞
将产生由载体编码的蛋白质(即，开关受体)所需的时间段。在此期间，向受试者施用配体可
能对受试者不利。在这种情况下，在受试者的一或多种细胞产生了一定量的开关受体之后
施用配体可能是合适的。
将产生由载体编码的蛋白质(即，开关受体)所需的时间段。在此期间，向受试者施用配体可
能对受试者不利。在这种情况下，在受试者的一或多种细胞产生了一定量的开关受体之后
施用配体可能是合适的。
[0408] 在一个实施例中，首先在将载体施用于受试者的同时将配体首先施用于受试者。
[0409] 在一个实施例中，首先在向受试者施用载体后1、2、3、4、5、6、7、8、9、11或12小时、数日、数周、数月或数年施用配体。在一些情况下，治疗有效量的配体可以在递送载体后至少一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、
16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或超过30天施用给受试者。在一个具体实例中，在载体递送后至少一周施用给受试者治疗有
效量的配体。在另一个实例中，治疗有效量的配体每日至少连续三天施用给受试者。
16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或超过30天施用给受试者。在一个具体实例中，在载体递送后至少一周施用给受试者治疗有
效量的配体。在另一个实例中，治疗有效量的配体每日至少连续三天施用给受试者。
[0410] 本发明的配体的治疗有效量或剂量可以表示为每千克受试者体重的配体的mg或μg。在一些情况中，配体的治疗有效量可以是约0.001μg/kg、约0.005μg/kg、约0.01μg/kg、约
0.05μg/kg、约0.1μg/kg、约0.5μg/kg、约1μg/kg、约2μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、约5μg/kg、约6μg/kg、约7μg/kg、约8μg/kg、约9μg/kg、约10μg/kg、约20μg/kg、约30μg/kg、约40μg/kg、约50μg/kg、约60μg/kg、约70μg/kg、约80μg/kg、约90μg/kg、约100μg/kg、约120μg/kg、约140μg/kg、约160μg/kg、约180μg/kg、约200μg/kg、约220μg/kg、约240μg/kg、约260μg/kg、约280μg/kg、约300μg/kg、约320μg/kg、约340μg/kg、约360μg/kg、约380μg/kg、约400μg/kg、约420μg/kg、约440μg/kg、约460μg/kg、约480μg/kg、约500μg/kg、约520μg/kg、约540μg/kg、约560μg/kg、约580μg/kg、约600μg/kg、约620μg/kg、约640μg/kg、约660μg/kg、约680μg/kg、约700μg/kg、约720μg/kg、约740μg/kg、约760μg/kg、约780μg/kg、约800μg/kg、约820μg/kg、约840μg/kg、约860μg/kg、约880μg/kg、约900μg/kg、约920μg/kg、约940μg/kg、约960μg/kg、约980μg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg或大于10mg/kg.
0.05μg/kg、约0.1μg/kg、约0.5μg/kg、约1μg/kg、约2μg/kg、约3μg/kg、约4μg/kg、约5μg/kg、约6μg/kg、约7μg/kg、约8μg/kg、约9μg/kg、约10μg/kg、约20μg/kg、约30μg/kg、约40μg/kg、约50μg/kg、约60μg/kg、约70μg/kg、约80μg/kg、约90μg/kg、约100μg/kg、约120μg/kg、约140μg/kg、约160μg/kg、约180μg/kg、约200μg/kg、约220μg/kg、约240μg/kg、约260μg/kg、约280μg/kg、约300μg/kg、约320μg/kg、约340μg/kg、约360μg/kg、约380μg/kg、约400μg/kg、约420μg/kg、约440μg/kg、约460μg/kg、约480μg/kg、约500μg/kg、约520μg/kg、约540μg/kg、约560μg/kg、约580μg/kg、约600μg/kg、约620μg/kg、约640μg/kg、约660μg/kg、约680μg/kg、约700μg/kg、约720μg/kg、约740μg/kg、约760μg/kg、约780μg/kg、约800μg/kg、约820μg/kg、约840μg/kg、约860μg/kg、约880μg/kg、约900μg/kg、约920μg/kg、约940μg/kg、约960μg/kg、约980μg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg或大于10mg/kg.
[0411] 在具体的实施例中，施用给受试者的配体的剂量为至少约0.001微克/千克(μg/kg)、至少约0.005μg/kg、至少约0.01μg/kg、至少约0.05μg/kg、至少约0.1μg/kg、至少约0.5μg/kg、0.001毫克/千克(mg/kg)、至少约0.005mg/kg、至少约0.01mg/kg、至少约0.05mg/kg、至少约0.1mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约1mg/kg、至少约2mg/kg、至少约3mg/kg、至少约
4mg/kg、至少约5mg/kg、至少约5mg/kg、至少约6mg/kg、至少约7mg/kg、至少约8mg/kg、至少约8mg/kg、至少约9mg/kg或至少约10或更高的mg/kg。
4mg/kg、至少约5mg/kg、至少约5mg/kg、至少约6mg/kg、至少约7mg/kg、至少约8mg/kg、至少约8mg/kg、至少约9mg/kg或至少约10或更高的mg/kg。
[0412] 在具体的实施例中，施用给受试者的配体的剂量为至少约0.001μg/kg至至少约10mg/kg、至少约0.01μg/kg至至少约10mg/kg、至少约0.1μg/kg至至少约10mg/kg、至少约1μg/kg至至少约10mg/kg、至少约0.01mg/kg至至少约10mg/kg、至少约0.1mg/kg至至少约
10mg/kg或至少约1mg/kg至至少约10mg/kg，或其任何居间范围。
10mg/kg或至少约1mg/kg至至少约10mg/kg，或其任何居间范围。
[0413] 在一些方面，治疗有效量的配体可以以摩尔浓度(即M或mol/L)表示。在一些情况下，治疗有效量的配体可以是约1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、20nM、
30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、
800nM、900nM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、
60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、
1000mM或更大。
30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、
800nM、900nM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、
60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、
1000mM或更大。
[0414] 治疗有效量的配体可以每天施用一次或多于一次。在一些情况下，根据需要施用治疗有效量的配体(例如当需要缓解疼痛时)。该配体可以连续给药(例如，在治疗方案的持
续时间内每天没有中断)。在某些情况下，治疗方案可能少于一周、一周、两周、三周、一个月或超过一个月。在一些情况下，施用治疗有效量的配体一天、连续至少两天、连续至少三天、连续至少四天、连续至少五天、连续至少六天、连续至少七天、连续至少八天、连续至少九
天、连续至少十天或连续至少十天以上。在特定情况下，连续三天施用治疗有效量的配体。
在一些情况下，治疗有效量的配体可以每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五
次、每周六次、每周七次、每周八次、每周9次、每周10次、每周10次、每周11次、每周12次、每周13次、每周14次、每周15次、每周16次、每周17次、每周18次每周19次、每周20次、每周20次、每周25次、每周30次、每周35次、每周40次或每周40次以上施用。在一些情况下，治疗有效量的配体可以每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天9次、每天10次、或每天10次以上施用。在一些情况下，疗有效量的配体至少每小时、至少每两小时、至少每三小时、至少每四小时、至少每五小时、至少每六小时、至少每六小时每7小时、至少每8小时、至少每9小时、至少每10小时、至少每11小时、至少每12小时、至少每13小时、至少每14小时、至少每15小时、至少每16小时、至少每17小时、至少每18小时、至少每19小时、至少每20小时、至少每21小时、至少每22小时、至少每23小时、或至少每天施用。配体的剂量可以连续施用给受试者，或者每天1、2、3、4或5次；每周1、2、3、4、5、6或7次，每月1、2、3或4次，每2、3、4、5或6个月一次或每年一次，或者每月1次，2次，3次，4次，5次或6次或甚至更长的时间间隔。治疗持续时间可以持续一天，1、2或3周，1、2、3、4、5、7、8、
9、10或11个月，1、2、3、4、5或更多年或更长时间。
续时间内每天没有中断)。在某些情况下，治疗方案可能少于一周、一周、两周、三周、一个月或超过一个月。在一些情况下，施用治疗有效量的配体一天、连续至少两天、连续至少三天、连续至少四天、连续至少五天、连续至少六天、连续至少七天、连续至少八天、连续至少九
天、连续至少十天或连续至少十天以上。在特定情况下，连续三天施用治疗有效量的配体。
在一些情况下，治疗有效量的配体可以每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五
次、每周六次、每周七次、每周八次、每周9次、每周10次、每周10次、每周11次、每周12次、每周13次、每周14次、每周15次、每周16次、每周17次、每周18次每周19次、每周20次、每周20次、每周25次、每周30次、每周35次、每周40次或每周40次以上施用。在一些情况下，治疗有效量的配体可以每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次、每天八次、每天9次、每天10次、或每天10次以上施用。在一些情况下，疗有效量的配体至少每小时、至少每两小时、至少每三小时、至少每四小时、至少每五小时、至少每六小时、至少每六小时每7小时、至少每8小时、至少每9小时、至少每10小时、至少每11小时、至少每12小时、至少每13小时、至少每14小时、至少每15小时、至少每16小时、至少每17小时、至少每18小时、至少每19小时、至少每20小时、至少每21小时、至少每22小时、至少每23小时、或至少每天施用。配体的剂量可以连续施用给受试者，或者每天1、2、3、4或5次；每周1、2、3、4、5、6或7次，每月1、2、3或4次，每2、3、4、5或6个月一次或每年一次，或者每月1次，2次，3次，4次，5次或6次或甚至更长的时间间隔。治疗持续时间可以持续一天，1、2或3周，1、2、3、4、5、7、8、
9、10或11个月，1、2、3、4、5或更多年或更长时间。
[0415] 通过本文揭示的方法和组合物治疗的受试者可以是人类，或可以是非人类动物。本文使用的术语“治疗”及其语法等价物通常指使用组合物或方法来减少，消除或预防疾病
症状，并且包括实现治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指根除或改善所治疗的潜在病症
或病症。治疗的预防益处包括降低病症的风险，延缓病症的发展或降低发生病症的可能性。
症状，并且包括实现治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指根除或改善所治疗的潜在病症
或病症。治疗的预防益处包括降低病症的风险，延缓病症的发展或降低发生病症的可能性。
[0416] 非人动物的非限制性实例包括非人灵长类动物、家畜动物、家养宠物和实验室动物。例如，非人类动物可以是猿(例如、黑猩猩、狒狒、大猩猩或猩猩)、旧世界猴(例如猕猴)、新世界猴、狗、猫、野牛、骆驼、牛、鹿、猪、驴、马、骡、羊驼、绵羊、山羊、水牛、驯鹿、牦牛、小鼠、大鼠、兔子或任何其它非人类动物。如本文所述的组合物和方法适用于家畜动物的治
疗。家畜动物可以包括但不限于狗、猫、马、牛、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、蛇、乌龟和蜥蜴。
疗。家畜动物可以包括但不限于狗、猫、马、牛、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、蛇、乌龟和蜥蜴。
[0417] K.试剂盒
[0418] 可用于本发明的组合物和试剂可以包装在试剂盒中以促进本发明的特定实施方式的应用。在一些实施例中，提供了包含本文考虑的多核苷酸、载体或组合物的试剂盒。在
一个实施例中，试剂盒包含本文考虑的重组病毒。本文预期的试剂盒的实施例也可以包含
说明书。说明书可以是任何期望的形式，包括但不限于印刷在试剂盒插页上，印刷在一或多
个容器上，以及在电子存储介质(例如计算机可读存储介质)上提供的电子存储指令。
一个实施例中，试剂盒包含本文考虑的重组病毒。本文预期的试剂盒的实施例也可以包含
说明书。说明书可以是任何期望的形式，包括但不限于印刷在试剂盒插页上，印刷在一或多
个容器上，以及在电子存储介质(例如计算机可读存储介质)上提供的电子存储指令。
[0419] 试剂盒可以包含适合于执行本发明的方法的任何组分。在一种情况下，试剂盒可以包含生物药物组合物。生物药物组合物可以以一或多种治疗有效剂量提供。在一种情况
下，生物药物组合物可以包括编码GPCR或LGIC的载体。在其它情况下，试剂盒可以包含空载
体和适于将本发明的GPCR或LGIC克隆到载体中的试剂。适用于克隆GPCR或LGIC的试剂的非
限制性实例可以包括用于扩增GPCR或LGIC核酸序列的试剂，例如模板DNA或RNA、逆转录酶、
引物、dNTP、DNA聚合酶和缓冲液；用于克隆GPCR或LGIC的试剂，例如限制性内切核酸酶(即
限制酶)、DNA连接酶和缓冲液。
下，生物药物组合物可以包括编码GPCR或LGIC的载体。在其它情况下，试剂盒可以包含空载
体和适于将本发明的GPCR或LGIC克隆到载体中的试剂。适用于克隆GPCR或LGIC的试剂的非
限制性实例可以包括用于扩增GPCR或LGIC核酸序列的试剂，例如模板DNA或RNA、逆转录酶、
引物、dNTP、DNA聚合酶和缓冲液；用于克隆GPCR或LGIC的试剂，例如限制性内切核酸酶(即
限制酶)、DNA连接酶和缓冲液。
[0420] 在一些情况下，试剂盒可以包含一或多种本文所述的治疗有效剂量的配体。在一些情况下，试剂盒包含一或多种治疗有效剂量的氯氮平-N-氧化物。在其它情况下，试剂盒
包含一或多种治疗有效剂量的鼠尾草素B。
包含一或多种治疗有效剂量的鼠尾草素B。
[0421] 试剂盒可以包含治疗有效剂量的用于口服给药的片剂调配物中的任何组合物。在其它情况下，试剂盒可以包含治疗有效剂量的任何组合物，用于鞘内、神经节内、神经内、颅内、腹内或皮下给药的液体调配物。组合物可以以本文所述的任何调配物提供(即，片剂、凝胶、霜剂等)。在一些情况下，试剂盒可以包含干燥(即，冻干)或粉末形式的任何组合物。可以用液体溶液(即盐水溶液)重构干燥或粉末化的药物以形成液体调配物。载体和配体组合
物可以分开提供(例如在分开的试剂盒中)。试剂盒可进一步包含一或多种如本文所述的赋
形剂(即防腐剂、载体等)。
物可以分开提供(例如在分开的试剂盒中)。试剂盒可进一步包含一或多种如本文所述的赋
形剂(即防腐剂、载体等)。
[0423] 在一些情况下，试剂盒可以包含用于药物发现的试剂和材料。这种性质的试剂盒可能含有适合筛选化合物的细胞。在某些情况下，细胞可能是原代神经元、星形胶质细胞或
神经胶质细胞。在某些情况下，细胞是由神经干细胞或神经祖细胞产生的神经元。神经元可
以由诱导多能干细胞(iPS)产生。iPS细胞可以是已经回复到多能状态的工程化细胞(例如，
成纤维细胞、皮肤细胞等)。在一些情况下，iPS细胞可以来源于受试者或患者。在某些情况
下，患者可能患有疾病。在某些情况下，可以在试剂盒中提供iPS细胞，并提供产生神经元的试剂和说明。如本文所述的细胞可以在小瓶中提供(例如，以冷冻状态)或可以在准备培养
的培养皿上提供。试剂盒可以包含适合于生长本发明的细胞的细胞培养基。在其它情况下，
试剂盒可以包含用于收集来自受试者的细胞并用于产生iPS细胞的仪器和试剂。例如，试剂
盒可包含用于从受试者收集皮肤细胞(或皮肤活组织检查)的工具和用于从收集的皮肤细
胞产生iPS细胞的一组试剂(例如，转染试剂，一组质粒用于表达iPS标记基因(例如，Oct4、
SOX2、NANOG等))。用于筛选化合物的试剂盒可以含有编码GPCR或LGIC的载体或核酸分子。
在一些情况下，试剂盒可以包含一或多种用于筛选的候选化合物。在一些情况下，候选化合
物是GPCR或LGIC的配体。在具体实例中，试剂盒可包含用于筛选激活神经元中的靶GPCR或
LGIC的化合物的试剂和工具。该试剂盒可进一步包含用于测量细胞培养条件下的神经元活
性的工具(例如膜片钳系统、电压敏感染料等)。
神经胶质细胞。在某些情况下，细胞是由神经干细胞或神经祖细胞产生的神经元。神经元可
以由诱导多能干细胞(iPS)产生。iPS细胞可以是已经回复到多能状态的工程化细胞(例如，
成纤维细胞、皮肤细胞等)。在一些情况下，iPS细胞可以来源于受试者或患者。在某些情况
下，患者可能患有疾病。在某些情况下，可以在试剂盒中提供iPS细胞，并提供产生神经元的试剂和说明。如本文所述的细胞可以在小瓶中提供(例如，以冷冻状态)或可以在准备培养
的培养皿上提供。试剂盒可以包含适合于生长本发明的细胞的细胞培养基。在其它情况下，
试剂盒可以包含用于收集来自受试者的细胞并用于产生iPS细胞的仪器和试剂。例如，试剂
盒可包含用于从受试者收集皮肤细胞(或皮肤活组织检查)的工具和用于从收集的皮肤细
胞产生iPS细胞的一组试剂(例如，转染试剂，一组质粒用于表达iPS标记基因(例如，Oct4、
SOX2、NANOG等))。用于筛选化合物的试剂盒可以含有编码GPCR或LGIC的载体或核酸分子。
在一些情况下，试剂盒可以包含一或多种用于筛选的候选化合物。在一些情况下，候选化合
物是GPCR或LGIC的配体。在具体实例中，试剂盒可包含用于筛选激活神经元中的靶GPCR或
LGIC的化合物的试剂和工具。该试剂盒可进一步包含用于测量细胞培养条件下的神经元活
性的工具(例如膜片钳系统、电压敏感染料等)。
[0424] 在某些情况下，试剂盒可能会提供说明。说明可以在试剂盒中提供，或者可以以电子方式访问(例如在万维网上)。说明书可以提供关于如何使用本发明的组合物的信息。这
些说明书还可以提供关于如何使用本发明的装置的信息。说明书可以提供关于如何执行本
发明的方法的信息。在某些情况下，说明书可能提供剂量信息。在一些情况下，说明书可能
提供药物信息，如作用机制、药物调配物、不良风险、禁忌症等。在某些情况下，该试剂盒由医生或保健提供者购买，用于在诊所或医院进行管理。在某些情况下，试剂盒由实验室购买
并用于筛选候选化合物。
些说明书还可以提供关于如何使用本发明的装置的信息。说明书可以提供关于如何执行本
发明的方法的信息。在某些情况下，说明书可能提供剂量信息。在一些情况下，说明书可能
提供药物信息，如作用机制、药物调配物、不良风险、禁忌症等。在某些情况下，该试剂盒由医生或保健提供者购买，用于在诊所或医院进行管理。在某些情况下，试剂盒由实验室购买
并用于筛选候选化合物。
[0425] 现在将通过以下实例更全面地描述本发明。然而，本发明可以以许多不同的形式得到实施，并且不应被解释为限于本文中阐述的实施例；相反地，提供这些实施例是为了使
本发明将是透彻且完整的，并且这些实施例将把本发明的范围完整地传达给本领域技术人
员。
本发明将是透彻且完整的，并且这些实施例将把本发明的范围完整地传达给本领域技术人
员。
[0426] 表4.示例性的基因治疗载体核苷酸序列
[0427]
[0428]
[0429]
[0430]
[0431] 实例
[0432] 实例1.hSYN1–GlyR αlpha1 F207A/A288G AAV载体的构建。
[0433] V272-pFB-inCap6(Y705+Y731F+T492V)-inRep-Kan的克隆
[0434] 用引物2793F和2794R对含有引入的SbfI位点和突变(T492V)的390bp cap6片段进行PCR扩增。使用引物2795F和2796R对含有引入的BsiWI位点和突变(T492V)的440bp cap6
片段进行PCR扩增。扩增产物通过凝胶电泳分离并纯化。
片段进行PCR扩增。扩增产物通过凝胶电泳分离并纯化。
[0435] 将纯化的390bp和440bp PCR产物进行重叠PCR以产生具有引物2793F和2796R的810bp cap6片段。扩增产物通过凝胶电泳分离并纯化。
[0436] 纯化的810bp cap6片段用SbfI和BsiWI消化并连接到用SbfI和BsiWI消化的V220载体中以产生V272-pFB-inCap6(Y705+731F+T492V)-inRep-Kan。
[0437] 引物序列：
[0438]引物 引物序列5'至3' SEQ ID NO:
2793F ATAGGACCCTGCAGGTATAC 16
2794R CGTTTCTAAAGTAAAAACAGACAACAACAA 17
2795F CTGTTTTTACTTTAGAAACGCGCTGCTGCC 18
2796R GTACCAGTTGCCGTACGTCC 19
2793F ATAGGACCCTGCAGGTATAC 16
2794R CGTTTCTAAAGTAAAAACAGACAACAACAA 17
2795F CTGTTTTTACTTTAGAAACGCGCTGCTGCC 18
2796R GTACCAGTTGCCGTACGTCC 19
[0439] SWB01-pFB-hSyn-Gly(F207A+A288G)的克隆
[0440] PCR扩增以下片段：(a)用hSYN质粒作为模板用引物2799F和2800R PCR扩增hSyn启动子(510bp)；(b)使用野生型甘氨酸受体α1质粒作为模板，用引物2801F和2802R对甘氨酸
受体α1片段(652bp)进行PCR扩增；(c)用引物2803F和2804R和野生型甘氨酸受体α1质粒作
为模板PCR扩增甘氨酸受体α1片段(266bp)；(d)用引物2805F和2806R和野生型甘氨酸受体α
1质粒作为模板PCR扩增甘氨酸受体α1片段(461bp)；和(e)用V261作为模板用引物2807F，
2808F和2809R PCR扩增bGHpA片段(282bp)。扩增产物通过凝胶电泳分离并纯化。
受体α1片段(652bp)进行PCR扩增；(c)用引物2803F和2804R和野生型甘氨酸受体α1质粒作
为模板PCR扩增甘氨酸受体α1片段(266bp)；(d)用引物2805F和2806R和野生型甘氨酸受体α
1质粒作为模板PCR扩增甘氨酸受体α1片段(461bp)；和(e)用V261作为模板用引物2807F，
2808F和2809R PCR扩增bGHpA片段(282bp)。扩增产物通过凝胶电泳分离并纯化。
[0441] 在重叠PCR中使用纯化的PCR片段以产生以下较大片段：(1)使用重叠PCR用引物2799F和2804R将片段(a)、(b)和(c)连接在一起(1338bp)；和(2)使用重叠PCR用引物2803F
和2809R将片段(c)、(d)和(e)连接在一起(971bp)。扩增产物通过凝胶电泳分离并纯化。
和2809R将片段(c)、(d)和(e)连接在一起(971bp)。扩增产物通过凝胶电泳分离并纯化。
[0442] 片段1用KpnI和AvrII消化，片段2用AvrII和SphI消化。将这些片段连接到用KpnI和SphI消化的pFB-sc-EGFP中以产生SWB01-pFB-hSyn-Gly(F207A+A288G)。
[0443] 引物序列：
[0444]
[0445] 产生重组杆状病毒以产生1x 1013个载体基因组(vg)/mL的AAV6-Gly(hSYN-GlyR(F207A/A288G)-FLAG和AAV6(Y705F+Y731F+T492V)-Gly(hSYN-GlyR(F207A/A288G)-FLAG。
[0446] 实例2.治疗慢性疼痛的啮齿动物模型。
[0447] 慢性疼痛的诱导和治疗
[0448] 第0天：使用建立的周围神经损伤方法如慢性缩窄性损伤(CCI，CCI/CFA)或保留性神经损伤(SNI)模型，在啮齿动物三叉神经节或背根神经节中诱导慢性疼痛。参见本内特和
谢(Bennett&Xie).疼痛(Pain).1988,德科斯泰和沃夫(Decosterd&Woolf).疼痛(Pain)
.2000,以及今村、川本和中西(Imamura,Kawamoto,&Nakanishi.)大脑研究实验(Exp.Brain
Res.)1997。在一些情况下，在病毒载体注射后可能发生神经损伤。
谢(Bennett&Xie).疼痛(Pain).1988,德科斯泰和沃夫(Decosterd&Woolf).疼痛(Pain)
.2000,以及今村、川本和中西(Imamura,Kawamoto,&Nakanishi.)大脑研究实验(Exp.Brain
Res.)1997。在一些情况下，在病毒载体注射后可能发生神经损伤。
[0449] 第7天：使用公开的方法在一个或多个背根神经节或三叉神经节中在神经节内或鞘内注射大约1.0-10μL体积的108-1010个AAV6(Y705F+Y731F+T492V)-HSYN-GLYR(F207A/
A288G)-FLAG或AAV6-GLY(HSYN-GLYR(F207A/A288G)-FLAG载体基因组。参见维特、奥哈拉、
桑德博格(Vit,Ohara,Sundberg)等人分子疼痛(Mol Pain.)2009和汤、费歇尔、科斯蒂克
(Towne,Fischer,Kostic)等人神经科学方法杂志(J Neurosci Methods.)2011,和裴庭
(Pertin)等人分子疼痛(Mol Pain.)2009.
A288G)-FLAG或AAV6-GLY(HSYN-GLYR(F207A/A288G)-FLAG载体基因组。参见维特、奥哈拉、
桑德博格(Vit,Ohara,Sundberg)等人分子疼痛(Mol Pain.)2009和汤、费歇尔、科斯蒂克
(Towne,Fischer,Kostic)等人神经科学方法杂志(J Neurosci Methods.)2011,和裴庭
(Pertin)等人分子疼痛(Mol Pain.)2009.
[0450] CCI或SNI后2-12周：依维菌素通过口服强饲法(PO)、腹腔注射(IP)、皮下注射(SC)或在饮用水中施用，最终剂量为每天0.1-10.0mg/kg。使用建立的伤害感受测定法(包括操
作测定，通过Von Frey细丝的机械异常性疼痛/痛觉过敏，通过Hargreaves方法的热异常性
疼痛/痛觉过敏，或通过高架十字迷宫的焦虑行为)来执行疼痛和焦虑行为测定以定量镇痛
水平。参见综述欧德基尔博格(Odd-Geir Berge).英国药理学杂志(Br J Pharmacol.)
2011.
作测定，通过Von Frey细丝的机械异常性疼痛/痛觉过敏，通过Hargreaves方法的热异常性
疼痛/痛觉过敏，或通过高架十字迷宫的焦虑行为)来执行疼痛和焦虑行为测定以定量镇痛
水平。参见综述欧德基尔博格(Odd-Geir Berge).英国药理学杂志(Br J Pharmacol.)
2011.
[0451] 只有在依维菌素存在时，疼痛相关行为或焦虑才会明显减少，与对照组相比，可量化改善10％-500％。未接受依维菌素的生理盐水对照组中无法检测到疼痛相关行为的镇痛
或减轻。
或减轻。
[0452] 基因表达分析
[0453] 病毒载体注射后1-52周：注射AAV6(Y705F+Y731F+T492V)-HSYN-GLYR(F207A/A288G)-FLAG或AAV6-GLY(HSYN-GLYR(F207A/A288G)-FLAG后，收获神经节，加工，切片并显
微分析用抗FLAG抗体的GlyR-FLAG转基因表达，并用针对NF200、外周蛋白、IB4、物质P、
TRPV1、CGRP、TrkA、Advillin、ATF3、Iba1、NPY、PKCy或GFAP的抗体反向染色。
微分析用抗FLAG抗体的GlyR-FLAG转基因表达，并用针对NF200、外周蛋白、IB4、物质P、
TRPV1、CGRP、TrkA、Advillin、ATF3、Iba1、NPY、PKCy或GFAP的抗体反向染色。
[0454] 基因表达将是可检测的，主要定位于神经元并且很大程度上不存在于周围的非神经元组织和细胞。基因表达不会存在于对侧对照组织中。
[0455] 实例3.治疗患有慢性疼痛的患者。
[0456] 使用本文揭示的组合物和方法治疗患有慢性疼痛的患者。患者在第一天用体积为15
12.0mL的10 个AAV-hSYN1-hM4Di载体基因组处理进入脊髓蛛网膜下腔(即鞘内)。在这个实
例中，AAV载体在人突触蛋白-1(SYN1)启动子的控制下编码人类毒蕈碱DREADD hM4Di以用
于选择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受氯氮平-N-氧化物(CNO)处方。患者根
据需要自行口服100μM CNO(即在疼痛发作期间)。
12.0mL的10 个AAV-hSYN1-hM4Di载体基因组处理进入脊髓蛛网膜下腔(即鞘内)。在这个实
例中，AAV载体在人突触蛋白-1(SYN1)启动子的控制下编码人类毒蕈碱DREADD hM4Di以用
于选择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受氯氮平-N-氧化物(CNO)处方。患者根
据需要自行口服100μM CNO(即在疼痛发作期间)。
[0457] 实例4.治疗患有慢性疼痛的患者。
[0458] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有慢性神经性疼痛的患者。患者在第一天用体积为1.0mL的1013个AAV-hSYN1-GlyR-M载体基因组直接递送到一或多
个背根神经节中(即神经节内对流增强递送到腰椎、颈椎或胸椎DRG中)。在这个实例中，AAV
载体在人类突触蛋白-1(SYN1)启动子的控制下编码携带F207A/A288G突变GlyR-M的人类甘
氨酸受体以用于选择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受依维菌素(IVM)处方。
患者根据需要自行口服0.1mg/kg IVM(即在疼痛发作期间)。
个背根神经节中(即神经节内对流增强递送到腰椎、颈椎或胸椎DRG中)。在这个实例中，AAV
载体在人类突触蛋白-1(SYN1)启动子的控制下编码携带F207A/A288G突变GlyR-M的人类甘
氨酸受体以用于选择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受依维菌素(IVM)处方。
患者根据需要自行口服0.1mg/kg IVM(即在疼痛发作期间)。
[0459] 实例5.治疗患有慢性疼痛的患者。
[0460] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有慢性颅面疼痛(例如三叉神经痛或颞下颌关节功能障碍)的患者。患者在第一天用体积为1.0mL的1013个AAV-
hSYN1-GlyR-M载体基因组直接递送到三叉神经节(即，神经节内对流增强递送)中进行治
疗。在这个实例中，AAV载体在人类突触蛋白-1(SYN1)启动子的控制下编码携带F207A/
A288G突变GlyR-M的人类甘氨酸受体以用于选择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所
接受依维菌素(IVM)处方。患者根据需要自行口服0.1mg/kg IVM(即在疼痛发作期间)。
hSYN1-GlyR-M载体基因组直接递送到三叉神经节(即，神经节内对流增强递送)中进行治
疗。在这个实例中，AAV载体在人类突触蛋白-1(SYN1)启动子的控制下编码携带F207A/
A288G突变GlyR-M的人类甘氨酸受体以用于选择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所
接受依维菌素(IVM)处方。患者根据需要自行口服0.1mg/kg IVM(即在疼痛发作期间)。
[0461] 实例6.治疗患有慢性胰腺疼痛的患者。
[0462] 在一个非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有慢性胰腺疼痛(例如胰腺炎或胰腺癌)的患者。患者在第一天用体积为1.0mL的1013个AAV-hSYN1-GlyR-M载
体基因组直接注入腹腔神经丛(即神经内)进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人类突触蛋
白-1(SYN1)启动子的控制下编码携带F207A/A288G突变GlyR-M的人类甘氨酸受体以用于选
择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受依维菌素(IVM)处方。患者根据需要自行
口服0.1mg/kg IVM(即在疼痛发作期间)。
体基因组直接注入腹腔神经丛(即神经内)进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人类突触蛋
白-1(SYN1)启动子的控制下编码携带F207A/A288G突变GlyR-M的人类甘氨酸受体以用于选
择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受依维菌素(IVM)处方。患者根据需要自行
口服0.1mg/kg IVM(即在疼痛发作期间)。
[0463] 实例7.治疗患有肥胖的患者。
[0464] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有肥胖症的患者。患者在第一天用体积为1.0mL的1013个AAV-Ghrelin-GlyR-M载体基因组直接递送到迷走神经的
胃分支(即，神经内)中进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人类Ghrelin启动子的控制下编
码携带F207A/A288G突变的人甘氨酸受体GlyR-M以用于选择性神经元表达。注射后两周，患
者返回诊所接受依维菌素(IVM)处方。患者每日自行口服0.1mg/kg IVM以减轻体重过量(即
抑制阿托西特)。
胃分支(即，神经内)中进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人类Ghrelin启动子的控制下编
码携带F207A/A288G突变的人甘氨酸受体GlyR-M以用于选择性神经元表达。注射后两周，患
者返回诊所接受依维菌素(IVM)处方。患者每日自行口服0.1mg/kg IVM以减轻体重过量(即
抑制阿托西特)。
[0465] 实例8.治疗患有肥胖的患者。
[0466] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有肥胖症的患者。患者在第一天用体积为1.0mL的1013个AAV-TRPV1-GlyR-M载体基因组直接递送到支配胰腺的背
根神经节中(即，在肌内)。在这个实例中，AAV载体在人类TRPV1启动子控制下编码携带
F207A/A288G突变的人类甘氨酸受体GlyR-M，以在伤害感受器中选择性神经元表达。注射后
两周，患者返回诊所接受依维菌素(IVM)处方。患者每日自行口服0.1mg/kg IVM以减轻体重
过度减轻。
根神经节中(即，在肌内)。在这个实例中，AAV载体在人类TRPV1启动子控制下编码携带
F207A/A288G突变的人类甘氨酸受体GlyR-M，以在伤害感受器中选择性神经元表达。注射后
两周，患者返回诊所接受依维菌素(IVM)处方。患者每日自行口服0.1mg/kg IVM以减轻体重
过度减轻。
[0467] 实例9.治疗患有肥胖的患者。
[0468] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有肥胖症的患者。患者在第一天用体积为1.0mL的1013个AAV-SIM1-hM3Dq载体基因组直接递送到下丘脑的室旁核
(PVH)(即颅内，对流增强递送)中。在这个实例中，AAV载体编码人类单唾液酸家族BHLH转录
因子1(SIM1)启动子控制下的人类毒蕈碱DREADD hM3Dq，用于选择性神经元在促黑素皮质
素(POMC)神经元中的表达，并最终刺激减食欲途径。注射后两周，患者返回诊所接受氯氮平
处方。患者每日自行口服0.15mg/kg氯氮平以减轻体重(即抑制食欲)。
(PVH)(即颅内，对流增强递送)中。在这个实例中，AAV载体编码人类单唾液酸家族BHLH转录
因子1(SIM1)启动子控制下的人类毒蕈碱DREADD hM3Dq，用于选择性神经元在促黑素皮质
素(POMC)神经元中的表达，并最终刺激减食欲途径。注射后两周，患者返回诊所接受氯氮平
处方。患者每日自行口服0.15mg/kg氯氮平以减轻体重(即抑制食欲)。
[0469] 实例10.治疗患有肥胖的患者。
[0470] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有肥胖症的患者。患者在第一天用直接递送到下丘脑(即颅内)的室旁核(PVH)中的体积为1.0mL的1013个AAV-OXT-
hM3Dq载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人催产素(OXT)启动子控制下编码人
毒蕈碱DREADD hM3Dq，用于选择性神经元表达并最终刺激产生厌食的途径。注射后两周，患
者返回诊所接受哌拉平处方。患者每天口服0.5mg/kg的哌拉平(催眠素)以减轻体重过度
(即抑制食欲)。
hM3Dq载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人催产素(OXT)启动子控制下编码人
毒蕈碱DREADD hM3Dq，用于选择性神经元表达并最终刺激产生厌食的途径。注射后两周，患
者返回诊所接受哌拉平处方。患者每天口服0.5mg/kg的哌拉平(催眠素)以减轻体重过度
(即抑制食欲)。
[0471] 实例11.治疗患有肥胖的患者。
[0472] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有肥胖症的患者。患者在第一天用直接递送到下丘脑的弓形核(即颅内)中的1.0mL体积的1013个AAV-AgRP-KORD载
体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人类Agouti相关肽(AgRP)启动子的控制下编
码人类κ阿片受体DREADD，KORD，用于选择性神经元表达并最终抑制产毒途径。注射后两周，患者返回诊所接受鼠尾草素-B处方。患者每天口服0.1mg/kg鼠尾草素-B以减轻体重(即抑
制食欲)。
体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人类Agouti相关肽(AgRP)启动子的控制下编
码人类κ阿片受体DREADD，KORD，用于选择性神经元表达并最终抑制产毒途径。注射后两周，患者返回诊所接受鼠尾草素-B处方。患者每天口服0.1mg/kg鼠尾草素-B以减轻体重(即抑
制食欲)。
[0473] 实例12.治疗患有肥胖的患者。
[0474] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有肥胖症的患者。患者在第一天用直接递送到杏仁核中央核(CEA)(即颅内)的外侧分支(CEI)中的1.0mL体积的
1013个AAV-PKC-δ-hM3Dq载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人类蛋白激酶C-δ(PKC-δ)启动子的控制下编码人类蕈毒碱DREADD(hM3Dq)以用于在CEA GABA能神经元中选
择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受氯氮平处方。患者每日自行口服0.15mg/
kg氯氮平以减轻体重(即，用于抑制食欲)
1013个AAV-PKC-δ-hM3Dq载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人类蛋白激酶C-δ(PKC-δ)启动子的控制下编码人类蕈毒碱DREADD(hM3Dq)以用于在CEA GABA能神经元中选
择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受氯氮平处方。患者每日自行口服0.15mg/
kg氯氮平以减轻体重(即，用于抑制食欲)
[0475] 实例13.治疗患有PTSD的患者。
[0476] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有创伤后应激障碍(PTSD)的患者。患者在第一天用直接递送到C6星状神经节(即神经节内)中的1.0mL体积的
13
10 个AAV-hSYN1-hM4Di载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人突触蛋白-1
(hSYN1)启动子的控制下编码人类毒蕈碱DREADD hM4Di以用于选择性神经元表达。注射后
两周，患者返回诊所接受氯氮平处方。患者每日自行口服0.15mg/kg氯氮平治疗PTSD症状
(即焦虑症)。
13
10 个AAV-hSYN1-hM4Di载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人突触蛋白-1
(hSYN1)启动子的控制下编码人类毒蕈碱DREADD hM4Di以用于选择性神经元表达。注射后
两周，患者返回诊所接受氯氮平处方。患者每日自行口服0.15mg/kg氯氮平治疗PTSD症状
(即焦虑症)。
[0477] 实例14.治疗患有抑郁症的患者。
[0478] 在一个非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有治疗抵抗性抑郁症(TRD)的患者。患者在第一天用直接递送到迷走神经(即神经内)中1.0mL体积的1013个
AAV-hSYN1-GlyR-M载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人类突触蛋白-1
(hSYN1)启动子的控制下编码携带F207A/A288G突变GlyR-M的人类甘氨酸受体以用于选择
性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受依维菌素(IVM)处方。患者每天自行口服
0.1mg/kg IVM治疗抑郁症状。
AAV-hSYN1-GlyR-M载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人类突触蛋白-1
(hSYN1)启动子的控制下编码携带F207A/A288G突变GlyR-M的人类甘氨酸受体以用于选择
性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受依维菌素(IVM)处方。患者每天自行口服
0.1mg/kg IVM治疗抑郁症状。
[0479] 实例15.治疗患有GERD的患者。
[0480] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有胃食管反流疾病(GERD)的患者。患者在第一天用直接递送到下食管括约肌(LES)迷走神经和肌间神经丛(即
神经内神经丛)中的体积为1.0mL的1013个AAV-hSYN1-hM3Dq载体基因组进行治疗。在这个实
例中，AAV载体在人突触蛋白-1(hSYN1)启动子的控制下编码人类毒蕈碱DREADD hM3Dq以用
于选择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受氯氮平处方。患者每日自行口服
0.15mg/kg氯氮平用于GERD症状(即酸反流)。
神经内神经丛)中的体积为1.0mL的1013个AAV-hSYN1-hM3Dq载体基因组进行治疗。在这个实
例中，AAV载体在人突触蛋白-1(hSYN1)启动子的控制下编码人类毒蕈碱DREADD hM3Dq以用
于选择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受氯氮平处方。患者每日自行口服
0.15mg/kg氯氮平用于GERD症状(即酸反流)。
[0481] 实例16.治疗患有GERD的患者。
[0482] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有胃食管反流疾病(GERD)的患者。患者在第一天用直接递送到下食管括约肌(LES)平滑肌(即肌内)的1.0mL体
积的1013个载体基因组AAV-CAG-hM3Dq进行治疗。在这个实例中，AAV载体在混合鸡-β肌动蛋白(CAG)启动子控制下编码人毒蕈碱DREADD hM3Dq，用于在LES肌细胞中表达并最终增加平
滑肌张力。注射后两周，患者返回诊所接受氯氮平处方。患者每日自行口服0.15mg/kg氯氮
平用于GERD症状(即酸反流)。
积的1013个载体基因组AAV-CAG-hM3Dq进行治疗。在这个实例中，AAV载体在混合鸡-β肌动蛋白(CAG)启动子控制下编码人毒蕈碱DREADD hM3Dq，用于在LES肌细胞中表达并最终增加平
滑肌张力。注射后两周，患者返回诊所接受氯氮平处方。患者每日自行口服0.15mg/kg氯氮
平用于GERD症状(即酸反流)。
[0483] 实例17.治疗患有癫痫的患者。
[0484] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有与癫痫相关的癫痫发作的患者。患者在第一天用直接递送到迷走神经(即神经内)中1.0mL体积的1013个AAV-
hSYN1-GlyR-M载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人类突触蛋白-1(hSYN1)启
动子的控制下编码携带F207A/A288G突变GlyR-M的人类甘氨酸受体以用于选择性神经元表
达。注射后两周，患者返回诊所接受依维菌素(IVM)处方。患者每日自行口服0.1mg/kg IVM
用于癫痫症状(即癫痫发作)。
hSYN1-GlyR-M载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人类突触蛋白-1(hSYN1)启
动子的控制下编码携带F207A/A288G突变GlyR-M的人类甘氨酸受体以用于选择性神经元表
达。注射后两周，患者返回诊所接受依维菌素(IVM)处方。患者每日自行口服0.1mg/kg IVM
用于癫痫症状(即癫痫发作)。
[0485] 实例18.治疗患有癫痫的患者。
[0486] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有与癫痫相关的癫痫发作的患者。患者在第一天用直接递送到预先确定的发作焦点，例如运动皮质(即颅内)中的
1.0mL体积的1013个AAV-CamKIIα-KORD载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人
钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα(CamKIIα)启动子的控制下编码人κ阿片样受体DREADD
KORD以用于在兴奋性神经元中选择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受鼠尾草
素-B处方。患者每天口服0.1mg/kg鼠尾草素-B用于癫痫症状(即癫痫发作)。
1.0mL体积的1013个AAV-CamKIIα-KORD载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人
钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα(CamKIIα)启动子的控制下编码人κ阿片样受体DREADD
KORD以用于在兴奋性神经元中选择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受鼠尾草
素-B处方。患者每天口服0.1mg/kg鼠尾草素-B用于癫痫症状(即癫痫发作)。
[0487] 实例19.治疗患有运动障碍的患者。
[0488] 在非限制性实例中，使用本文揭示的组合物和方法治疗患有运动障碍(例如帕金森氏震颤)的患者。患者在第一天用直接递送到丘脑底核(即颅内STN)中的1.0mL体积的1013
个AAV-CamKIIα-KORD载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人钙/钙调蛋白依赖
性蛋白激酶IIα(CamKIIα)启动子的控制下编码人κ阿片样受体DREADD KORD以用于在兴奋
性神经元中选择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受鼠尾草素-B处方。患者每天
口服0.1mg/kg鼠尾草素-B用于运动障碍症状(即震颤)。
个AAV-CamKIIα-KORD载体基因组进行治疗。在这个实例中，AAV载体在人钙/钙调蛋白依赖
性蛋白激酶IIα(CamKIIα)启动子的控制下编码人κ阿片样受体DREADD KORD以用于在兴奋
性神经元中选择性神经元表达。注射后两周，患者返回诊所接受鼠尾草素-B处方。患者每天
口服0.1mg/kg鼠尾草素-B用于运动障碍症状(即震颤)。
[0489] 实例20.用表达开关受体的病毒载体治疗疼痛。
[0490] 使用表达开关受体的病毒载体可用于抑制疼痛，如伊耶,S.M(Iyer,S.M.)等人用于持续抑制疼痛的光遗传学和化学遗传学策略(Optogenetic and chemogenetic
strategies for sustained inhibition of pain.)Sci.Rep.6,30570；doi:10.1038/
srep30570(2016)所示的，其全部内容通过引用并入本文。
strategies for sustained inhibition of pain.)Sci.Rep.6,30570；doi:10.1038/
srep30570(2016)所示的，其全部内容通过引用并入本文。
[0491] 简而言之，向雌性C57BL/6小鼠的坐骨神经注射在人突触蛋白-1启动子控制下的携带SwiChR-eYFP的AAV6载体。SwiChR是阶梯功能抑制性通道视紫红质。注射后两周至三
周，在整个初级传入伤害感受器中检测到SwiChR的强表达。同上。从AAV6-hSyn-SwiChR-
eYFP注射小鼠获得的解离培养的背根神经节(DRG)的记录显示SwiChR对蓝光脉冲反应，并
且在照射期间引起输入电阻的显著降低。同上。透皮递送的蓝光在SwiChR表达小鼠中影响
伤害性测定。对表达SwiChR，YFP或氯离子传导抑制通道视紫红质iC1C2的小鼠进行盲法机
械阈值分析表明，蓝光在iC1C2+和SwiChR+小鼠中产生机械性戒断阈值和热潜伏期测量的
大的统计学显著增加，但在YFP+小鼠中没有。同上。使用改进的Hargreaves装置评估热缩回
潜伏期。在培养的SwiChR+DRG神经元中，单个1秒钟的蓝光脉冲足以诱导抑制电诱发动作电
位，不仅在光脉冲期间，而且在几秒钟之后，观察到在光刺激之后高达60秒的高刺激抑制概
率。同上。正如预期的那样，光遗传抑制可以通过用红光照射而迅速终止，这导致SwiChR通
道关闭。同上。SwiChR的这种“后光”抑制特性在体内得以保留，使得在小鼠'后光'期间的光遗传学抑制成为可能。同上。适当定时的补充光脉冲可用于延长SwiChR介导的抑制的持续
时间。即使在1小时的暂时稀少的蓝光脉冲之后，SwiChR+小鼠显示出稳定升高的疼痛阈值，
其在单个蓝光脉冲后观察到的升高阈值在统计学上不可区分。同上。YFP+小鼠的机械阈值
没有显著变化。同上。福尔马林试验(一种常用的疼痛试验，其中I期主要由直接激活伤害感
受器驱动，II期部分由炎症和脊髓促进机制驱动)表明对转导的无髓鞘初级传入的光遗传
学抑制是足够的在SwiChR+小鼠中减少伤害感受器触发的I期疼痛行为，但不足以缓解在II
期中观察到的更广泛的炎症反应。同上。
周，在整个初级传入伤害感受器中检测到SwiChR的强表达。同上。从AAV6-hSyn-SwiChR-
eYFP注射小鼠获得的解离培养的背根神经节(DRG)的记录显示SwiChR对蓝光脉冲反应，并
且在照射期间引起输入电阻的显著降低。同上。透皮递送的蓝光在SwiChR表达小鼠中影响
伤害性测定。对表达SwiChR，YFP或氯离子传导抑制通道视紫红质iC1C2的小鼠进行盲法机
械阈值分析表明，蓝光在iC1C2+和SwiChR+小鼠中产生机械性戒断阈值和热潜伏期测量的
大的统计学显著增加，但在YFP+小鼠中没有。同上。使用改进的Hargreaves装置评估热缩回
潜伏期。在培养的SwiChR+DRG神经元中，单个1秒钟的蓝光脉冲足以诱导抑制电诱发动作电
位，不仅在光脉冲期间，而且在几秒钟之后，观察到在光刺激之后高达60秒的高刺激抑制概
率。同上。正如预期的那样，光遗传抑制可以通过用红光照射而迅速终止，这导致SwiChR通
道关闭。同上。SwiChR的这种“后光”抑制特性在体内得以保留，使得在小鼠'后光'期间的光遗传学抑制成为可能。同上。适当定时的补充光脉冲可用于延长SwiChR介导的抑制的持续
时间。即使在1小时的暂时稀少的蓝光脉冲之后，SwiChR+小鼠显示出稳定升高的疼痛阈值，
其在单个蓝光脉冲后观察到的升高阈值在统计学上不可区分。同上。YFP+小鼠的机械阈值
没有显著变化。同上。福尔马林试验(一种常用的疼痛试验，其中I期主要由直接激活伤害感
受器驱动，II期部分由炎症和脊髓促进机制驱动)表明对转导的无髓鞘初级传入的光遗传
学抑制是足够的在SwiChR+小鼠中减少伤害感受器触发的I期疼痛行为，但不足以缓解在II
期中观察到的更广泛的炎症反应。同上。
[0492] hM4D(Gi)DREADD在初级传入伤害感受器中的表达允许抑制机械和热伤害感受。同上。雌性C57BL/6小鼠经神经内注射AAV6-hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine，并且在小直
径伤害感受器中观察到mCitrine表达。同上。向hM4D+小鼠腹腔施用氯氮平-N-氧化物(CNO)
增加机械性戒断阈值。同上。CNO施用于hM4D+小鼠后，观察到对Hargreaves阈值的强抑制，
表明化学遗传学抑制热感觉。同上。
径伤害感受器中观察到mCitrine表达。同上。向hM4D+小鼠腹腔施用氯氮平-N-氧化物(CNO)
增加机械性戒断阈值。同上。CNO施用于hM4D+小鼠后，观察到对Hargreaves阈值的强抑制，
表明化学遗传学抑制热感觉。同上。
[0493] 实例21.表达开关受体的病毒载体治疗遗留神经损伤模型的疼痛。
[0494] AAV载体生产
[0495] 使用标准分子生物学技术构建驱动人α-1GlyRM(F207A+A288G)-FLAG cDNA表达的人突触蛋白-1(hSYN)启动子的表达盒(也参见图5和SEQ ID NO:1用于描述载体)。将该盒亚
克隆到自我互补的AAV杆粒中，纯化，转染到Sf9昆虫细胞中以产生重组杆状病毒，然后扩
增。使用含有hSYN-GlyRM盒和另一种含有Rep和AAV6(Y705+731F+T492V)Cap基因的重组杆
状病毒的扩增重组杆状病毒双重感染Sf9细胞以产生重组AAV载体。纯化这些载体，使用
13
qPCR(2.15e vg/ml)测定病毒滴度，并使用SDS-PAGE来验证AAV载体(Virovek)的纯度。
克隆到自我互补的AAV杆粒中，纯化，转染到Sf9昆虫细胞中以产生重组杆状病毒，然后扩
增。使用含有hSYN-GlyRM盒和另一种含有Rep和AAV6(Y705+731F+T492V)Cap基因的重组杆
状病毒的扩增重组杆状病毒双重感染Sf9细胞以产生重组AAV载体。纯化这些载体，使用
13
qPCR(2.15e vg/ml)测定病毒滴度，并使用SDS-PAGE来验证AAV载体(Virovek)的纯度。
[0496] AAV脊髓注射到背角
[0497] 在腰椎扩大部位进行背侧半椎板切除术以暴露腰段脊髓的两段(约1.5-2mm)，之后硬脑膜被切开并反射。将病毒溶液装入玻璃微量移液管(预先填充矿物油)。将微量移液
管连接到安装在立体定向仪上的手动微量注射器上。病毒溶液靶向背角(左侧)。沿着暴露
区域内的尾-轴线，以等距线性方式进行6次每次240nl的注射。每次注射后，观察1分钟的休
息时间，然后缝合肌肉层，用钉子封闭皮肤，并使动物在加热垫恢复到他们的笼子之前恢
复。最后的行为测试后，动物灌注进行组织学分析。
管连接到安装在立体定向仪上的手动微量注射器上。病毒溶液靶向背角(左侧)。沿着暴露
区域内的尾-轴线，以等距线性方式进行6次每次240nl的注射。每次注射后，观察1分钟的休
息时间，然后缝合肌肉层，用钉子封闭皮肤，并使动物在加热垫恢复到他们的笼子之前恢
复。最后的行为测试后，动物灌注进行组织学分析。
[0498] AAV神经节内注射入背根神经节(DRG)
[0499] 用硼硅酸盐玻璃毛细管(0.78/1mm内部/外部直径)拉伸至细点，通过聚乙烯管(0.4/0.8mm内部/外部直径)连接到安装在显微注射泵上的注射器中进行注射。针头安装在
立体框架的延伸臂上，向外摆动(仅用于固定和操作针头)。管道、注射器和针头都装满了
水。将1微升空气吸入针中，随后加入1.1μl病毒载体溶液。对于每次注射，针头分别装有该体积。手术前麻醉动物。在沿着背侧中线的切口之后，通过去除椎骨的侧向过程暴露L4和
L5DRG。将位于DRG上的神经外膜打开，将玻璃针插入神经节，距离暴露的神经节表面400μm
深。在3分钟延迟以允许密封玻璃毛细管尖端周围的组织后，以0.2μl/分钟的速率注射1.1μl病毒溶液。进一步延迟2分钟后，取出针头。首先注射L4神经节，然后注射L5神经节。用5-0缝线将覆盖在脊髓上的肌肉松弛地缝合在一起，伤口闭合。允许动物在37℃恢复并接受术
后镇痛。
立体框架的延伸臂上，向外摆动(仅用于固定和操作针头)。管道、注射器和针头都装满了
水。将1微升空气吸入针中，随后加入1.1μl病毒载体溶液。对于每次注射，针头分别装有该体积。手术前麻醉动物。在沿着背侧中线的切口之后，通过去除椎骨的侧向过程暴露L4和
L5DRG。将位于DRG上的神经外膜打开，将玻璃针插入神经节，距离暴露的神经节表面400μm
深。在3分钟延迟以允许密封玻璃毛细管尖端周围的组织后，以0.2μl/分钟的速率注射1.1μl病毒溶液。进一步延迟2分钟后，取出针头。首先注射L4神经节，然后注射L5神经节。用5-0缝线将覆盖在脊髓上的肌肉松弛地缝合在一起，伤口闭合。允许动物在37℃恢复并接受术
后镇痛。
[0500] AAV鞘内注射小鼠
[0501] 首先将小鼠麻醉，然后垂直放置，头部固定在立体定位框内。颈部底部做了一个切口，以暴露颈部的凹槽。在脑池内切开一个(1-2mm)的深度，使脑脊液漏出。然后将4cm32G鞘内导管缓慢地插入腰脊髓的方向，并通过围绕导管缝合皮肤。然后让小鼠恢复。然后麻醉小
鼠，并施用载体(6μl)。用6μl的PBS冲洗导管，然后取出并让小鼠恢复。
鼠，并施用载体(6μl)。用6μl的PBS冲洗导管，然后取出并让小鼠恢复。
[0502] 行为实验和疼痛模型
[0503] 为了在模拟神经性疼痛病症的模型中产生机械疼痛超敏，使用了精确的机械异常性疼痛模型的保留性神经损伤(SNI)模型(谢尔兹(Shields)等人,2003,疼痛杂志(The
Journal of Pain),4,465-470)。该模型由腓总神经和腓肠神经切开并分离胫骨分支产生
(见图7)。通过将小鼠置于高架丝网格上并用von Frey细丝刺激后爪的足底表面来评估机
械性退缩阈值。使用Chaplan&Yaksh的上下方法确定脊髓注射AAV-GlyRM前的机械阈值。在
单侧载体注射到脊髓背角三周后，再次测试动物以确认其机械收缩阈值没有改变。对载体
注射的同侧和对侧的后爪进行了测试。研究中包括的动物都没有因注射含有GlyRM转基因
的AAV而导致的阈值变化。使用加速旋转杆(Stoelting,USA)以33rpm的最大速度测试运动
协调性。记录小鼠在旋转杆上的持续时间，截止时间为300秒。每只小鼠都经过三次训练试
验，两小时后进行测试。随后，所有小鼠接受单次IP注射依维菌素(15mg/kg或10mg/kg)，并
且机械阈值在SNI后1、2、5、7和13天使用升降法再次测试。当以15mg/kg进行测试时，观察到机械性疼痛超敏的完全逆转。对侧没有变化，即依维菌素在没有载体的情况下没有可测量
的效果。逆转持续至少5天。在第13天，当阈值恢复到伤后基线时，腹腔注射10mg/kg，并且再次观察到恢复到非损伤基线阈值。随访这些动物48小时，阈值保持在基线。然后灌注动物用
于组织学。
Journal of Pain),4,465-470)。该模型由腓总神经和腓肠神经切开并分离胫骨分支产生
(见图7)。通过将小鼠置于高架丝网格上并用von Frey细丝刺激后爪的足底表面来评估机
械性退缩阈值。使用Chaplan&Yaksh的上下方法确定脊髓注射AAV-GlyRM前的机械阈值。在
单侧载体注射到脊髓背角三周后，再次测试动物以确认其机械收缩阈值没有改变。对载体
注射的同侧和对侧的后爪进行了测试。研究中包括的动物都没有因注射含有GlyRM转基因
的AAV而导致的阈值变化。使用加速旋转杆(Stoelting,USA)以33rpm的最大速度测试运动
协调性。记录小鼠在旋转杆上的持续时间，截止时间为300秒。每只小鼠都经过三次训练试
验，两小时后进行测试。随后，所有小鼠接受单次IP注射依维菌素(15mg/kg或10mg/kg)，并
且机械阈值在SNI后1、2、5、7和13天使用升降法再次测试。当以15mg/kg进行测试时，观察到机械性疼痛超敏的完全逆转。对侧没有变化，即依维菌素在没有载体的情况下没有可测量
的效果。逆转持续至少5天。在第13天，当阈值恢复到伤后基线时，腹腔注射10mg/kg，并且再次观察到恢复到非损伤基线阈值。随访这些动物48小时，阈值保持在基线。然后灌注动物用
于组织学。
[0504] 与对侧的未受伤对照侧相比，含有驱动人α-1GlyRM(F207A+A288G)(也称为SWB001或AAV-GlyRM)表达的人突触蛋白-1(hSYN)启动子的AAV载体在SNI模型中产生100％镇痛
(参见图7)，在单次腹腔注射依维菌素后持续7-10天。在第13天依维菌素清除后，重复依维
菌素给药在SNI模型中提供100％镇痛(参见图8)。
(参见图7)，在单次腹腔注射依维菌素后持续7-10天。在第13天依维菌素清除后，重复依维
菌素给药在SNI模型中提供100％镇痛(参见图8)。
[0505] 组织处理和免疫组织化学
[0506] 如先前所述进行免疫组织化学(布雷兹(Braz)等人,神经元(Neuron),74(4):663-675,2012)。简言之，用氯胺酮(60mg/kg)/甲苯噻嗪(8mg/kg)/乙酰丙嗪(3mg/kg)的混合盐
水溶液麻醉小鼠，并心脏灌注0.1M盐水磷酸盐缓冲液(PBS)，和随后的在PBS中的4％多聚甲
醛(PFA)。然后通过椎板切除术提取脊髓，在相同的固定剂中后固定2小时，并在4℃下在
30％蔗糖/PBS溶液中冷冻保护。也解剖腰骶背根神经节(DRG)，并进行相同的后固定和冷冻
保护方案。
水溶液麻醉小鼠，并心脏灌注0.1M盐水磷酸盐缓冲液(PBS)，和随后的在PBS中的4％多聚甲
醛(PFA)。然后通过椎板切除术提取脊髓，在相同的固定剂中后固定2小时，并在4℃下在
30％蔗糖/PBS溶液中冷冻保护。也解剖腰骶背根神经节(DRG)，并进行相同的后固定和冷冻
保护方案。
[0507] 使用低温恒温器(Leica Microsystems)裂解腰脊髓切片。裂解横向切片(25μm厚)并置于含有PBS的48孔板中并在4℃下储存。将DRG嵌入TissueTek OCT化合物(拜耳)中。裂
解横切面(14μm)，将其安装在Superfrost Plus载玻片(Thermo Fisher Scientific,
Rockford,IL)上，在室温下干燥1小时，并在4℃下储存。将组织切片在PBS/0.3％Triton X-
100(PBS-T；Sigma，St.Louis，MO)中洗涤三次，并在10％正常山羊血清/PBS/0.3％Triton
X-100(NGST)孵育1小时，然后在室温(RT)下在1％NGST溶液中加入主要抗体过夜。然后将切
片用PBS-T溶液洗涤三次，并在室温下与Alexa荧光团缀合的第二抗体孵育1小时。将切片用
PBS洗涤三次，风干，并使用Aqua Polymont(Polysciences,Inc.,Warrington,USA)覆盖。使
用初级FLAG抗体(兔，1:4000；Sigma#F7425)检测GlyRM-FLAG转基因表达。使用缀合至Alexa
荧光团的相应二抗在1％NGST中以1:800稀释初步染色。免疫染色的切片用Zeiss LSM700直
立共聚焦荧光显微镜成像。通过多次给药途径注射后三周观察到含有人突触蛋白-1(hSYN)
启动子驱动的人α-1GlyRM(F207A+A288G)表达的AAV载体的稳健表达(图6)。
解横切面(14μm)，将其安装在Superfrost Plus载玻片(Thermo Fisher Scientific,
Rockford,IL)上，在室温下干燥1小时，并在4℃下储存。将组织切片在PBS/0.3％Triton X-
100(PBS-T；Sigma，St.Louis，MO)中洗涤三次，并在10％正常山羊血清/PBS/0.3％Triton
X-100(NGST)孵育1小时，然后在室温(RT)下在1％NGST溶液中加入主要抗体过夜。然后将切
片用PBS-T溶液洗涤三次，并在室温下与Alexa荧光团缀合的第二抗体孵育1小时。将切片用
PBS洗涤三次，风干，并使用Aqua Polymont(Polysciences,Inc.,Warrington,USA)覆盖。使
用初级FLAG抗体(兔，1:4000；Sigma#F7425)检测GlyRM-FLAG转基因表达。使用缀合至Alexa
荧光团的相应二抗在1％NGST中以1:800稀释初步染色。免疫染色的切片用Zeiss LSM700直
立共聚焦荧光显微镜成像。通过多次给药途径注射后三周观察到含有人突触蛋白-1(hSYN)
启动子驱动的人α-1GlyRM(F207A+A288G)表达的AAV载体的稳健表达(图6)。
[0508] 实例22.用表达开关受体的病毒载体治疗对热痛敏感性的作用。
[0509] AAV注射和热缩回潜伏期分析
[0510] 在第0天，在成年Sprague-Dawley大鼠中进行双侧三叉神经节注射10微升含有α1 GlyR(F207A-A288G)转基因的AAV载体。在AAV注射后两个月，向大鼠施用单次腹腔注射依维
菌素10mg/kg。第二天，通过将毛发从他们的脸颊剃去，直到但不包括触须垫，准备大鼠进行热潜伏期分析。然后将它们放入直径为2.75英寸×8英寸的透明聚碳酸酯圆筒中并使其适
应环境。老鼠自然而然地将自己定位，因此他们的鼻子就在缸开口的外面。在视频监控下，
将大鼠暴露于2W红外(808nm)激光照射的光束，该照射聚焦成在剃刮的脸颊区域上投射约
1mm×0.5mm的目标尺寸。然后，大鼠对激光产生的热量做出反应，突然出现头部位置变化
(退缩反射)。然后重复该序列至每边10次试验。使用视频编辑软件从视频测量激光照射开
始时间和头部缩回反射之间的延迟，从而允许逐帧分析。
菌素10mg/kg。第二天，通过将毛发从他们的脸颊剃去，直到但不包括触须垫，准备大鼠进行热潜伏期分析。然后将它们放入直径为2.75英寸×8英寸的透明聚碳酸酯圆筒中并使其适
应环境。老鼠自然而然地将自己定位，因此他们的鼻子就在缸开口的外面。在视频监控下，
将大鼠暴露于2W红外(808nm)激光照射的光束，该照射聚焦成在剃刮的脸颊区域上投射约
1mm×0.5mm的目标尺寸。然后，大鼠对激光产生的热量做出反应，突然出现头部位置变化
(退缩反射)。然后重复该序列至每边10次试验。使用视频编辑软件从视频测量激光照射开
始时间和头部缩回反射之间的延迟，从而允许逐帧分析。
[0511] 结果
[0512] 个体受试者结果如图9所示，平均结果如图10所示。用依维菌素预处理的试验大鼠的平均热缩回潜伏期为2.69秒。在依维菌素(10mg/kg)的腹腔给药后，平均缩回潜伏期确定
为5.19秒，配对t检验p值＝0.054。因此，依维菌素治疗导致热痛敏感性的92.9％的痛觉阈
值转变。
为5.19秒，配对t检验p值＝0.054。因此，依维菌素治疗导致热痛敏感性的92.9％的痛觉阈
值转变。
[0513] 上文所描述的不同的实施例可以组合以提供另外的实施例。本说明书中提及的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物的全部内容通过引用并入本文中，如同每个单独的出版物、专
利或专利申请被具体地和单独地指示为通过引用并入一样。必要时可以修改这些实施例的
方面以使用不同专利、申请以及公开的观点来提供又另外的实施例。
利或专利申请被具体地和单独地指示为通过引用并入一样。必要时可以修改这些实施例的
方面以使用不同专利、申请以及公开的观点来提供又另外的实施例。
[0514] 可以根据以上详细说明对这些实施例作出这些和其它改变。总体而言，在以下权利要求书中，所使用的术语不应理解为将权利要求书限制于本说明书和权利要求书中所披
露的具体实施例，但应理解为包括所有可能的实施例以及这份权利要求书所有权获得的等
效物的全部范围。因此，权利要求书不受本发明限制。
露的具体实施例，但应理解为包括所有可能的实施例以及这份权利要求书所有权获得的等
效物的全部范围。因此，权利要求书不受本发明限制。
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