本发明的说明书涉及许多已公开的文献。这些文献的相关主题引入本 说明书作为参考。

本发明涉及一种检测哺乳动物被抗酸微生物感染的方法，其中，(a) 所述哺乳动物的粪便样品与(aa)一种受体，在允许来自所述抗酸微生物 的抗原与该受体形成复合物的条件下共同培养；或与(ab)两种不同的受 体，在允许来自所述抗酸微生物的抗原与该两种受体形成复合物的条件下 共同培养，其中如(aa)中所述的受体或如(ab)中所述的受体特异地与一 种抗原相结合，至少对一些哺乳动物来说，该抗原通过肠道后表现为一种 结构，该结构与天然结构相当或在哺乳动物被抗酸微生物、其抽提物或溶 菌产物或者源于该抗酸微生物的蛋白、蛋白片段或合成肽所感染或免疫后 产生的抗体与该结构相抗；和(b)检测如(a)项中描述的至少一种抗原- 受体复合物的形成。优选地，该抗酸微生物是细菌，尤其是幽门螺杆菌 (Helicobacter pylorvi)，肝螺旋杆菌(Helicobacter hepaticus)，空 肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。而且，该受体优选地与过氧化氢酶，金属蛋白酶或脲酶 的表位相结合。另外，本发明还涉及包含所述组分的诊断和药用组合物与 测试装置，以及含有这些组分的包装。

目前，有多种侵染性，半侵染性或非侵染性的用于检测哺乳动物体被 微生物病原体或寄生虫感染的方法。所有侵染性的方法均是以内窥镜检查 和活组织检查为先决条件。若使用侵染性技术，受检者的自然完整性就会 被破坏，例如在活组织检查中。通过活组织检查获得样品耗时、耗资而且 通常会给病人造成损伤。由于特定微生物感染，例如幽门螺杆菌，无需在 全部的胃粘膜中分布，因此通过活组织检查，在非感染位点获得的样品可 能造成假阴性的结果。所有侵染性方法的另一缺陷是：所有的检测结果均 受早期质子泵抑制剂，铋或抗生素治疗的影响。

半侵染或非侵染诊断方法记录参数的变化，而这些参数可以在不干扰 生物体的情况下测定。为达到这一目的，优选采用体液和分泌物，例如血 清，呵气，尿液，唾液，汗液或粪便进行分析。用直接的方法检测病原体 或寄生虫的存在，可以通过电子显微镜，光学鉴定(optical characterisation)，质谱法，放射性降解产物测定或特异的酶反应等手段 检测其组分或降解产物。但是这些方法常常需要昂贵和尖端的仪器(例如， 所述的呵气检测)。相比之下，间接检测方法用于检测宿主生物体对病原体 或寄生虫的反应，例如宿主血清或唾液中抗病原体抗原抗体的出现。既然 在多数情况下使用侵染性技术对生物体的干扰对生物体产生损害，而且需 要昂贵且尖端的仪器并有损健康，非侵染性技术由于从上述体液或分泌物 中取样相对简便而为人们所采用。而且，既然并非每一个宿主都通过相同 的途径与某一特定的病原体或寄生虫起反应，宿主的反应发生延迟，也可 能在所述病原体或寄生虫从生物体中去除之后仍继续反应，所以直接的方 法总应是优选的。因此，理想的是通过非侵染性的方法，在体液或分泌物 中直接检测病原体或寄生虫来进行诊断。与间接方法不同这一方法可以检 测到当前的感染状态。

而且，诊断方法也应当考虑到其他方面而予以优化：高再现性，灵敏 性和特异性，可靠性和所用材料的质量稳定性，低消耗地用该方法进行生 产和操作，应用简单无须昂贵和尖端的仪器均是需要考虑的参数。

鉴于上述原因，在医学诊断中用的越来越多的是基于高选择性和特定 种类的物质(例如抗体，受体，凝集素和适体(aptamer))对某些分子结 构的结合亲和力的方法，所述的分子结构可通过它们对所要分析的相关物 质的高特异性进行筛选。主要可能的方法是将这些物质固定在固体表面并 偶联放射性核素、与适当底物引发颜色反应的酶(例如，ELISA＝酶联免疫 吸附测定)或具有高度特异亲和力的着色颗粒来发展廉价，简单而省时的 方法以检测体内自然产生的物质或身体异物。

在开发这些检测方法的起始阶段唯一使用的是多克隆抗体。然而，它 们具有几个本领域技术人员所公知的缺陷，其中最主要的是其可用性有限 和经常发生交叉反应。通过开发制备单克隆抗体的方法(Khler & Milstein(1975))，受体分离和其直接在宿主细胞系统中表达的进展，对 特异碳水化合物具有高亲和力的凝集素的开发和对单链核酸分子(适体) 能够特异地与分子结构相结合的发现使上述缺陷中的大部分得以排除。目 前，检测方法的特异性和敏感性能够通过相对简单的方法得以优化。

鉴于其高特异性，这种方法特别适合于检测单独的、确定的底物，例 如半抗原、肽或蛋白，只要所识别的结构元件在待检测的样品群中是恒定 的且对于待检测的底物来说是特异性的。而且，它们适合于在体液中进行 测定，因此对于在这一样品基质中直接检测病原体而言，它们是显而易见 的选择。据此，现有技术中介绍了从粪便中诊断下述病原体的方法，例如 Entamoeba histolytica(Hague(1993)，传染病杂志167：247-9)，肠道 出血大肠杆菌(Escherichia coli)(EHEC，Park(1996)，临床微生物 学杂志34：988-990)，Vibdo cholerae(Hasan(1954)，FEMS微生物通 讯120：143-148)，Toro病毒样颗粒(Koopmans(1993)临床微生物学杂 志31：2738-2744)或Taenia saginata(Machnicka(1996)，应用寄生 虫学37：106-110)。

对于所有的人，上述病原体的共同特征在于，它们均是在宿主的肠道 内可以存活并可繁殖。从而，它们具有在降解和消化系统活跃的肠道内能 够存活和繁殖的机制。从而大量完整的或基本完整的病原体或寄生虫可以 随粪便排出。通常，易于从粪便或所制备的粪便样品中利用检测试剂例如 可以识别完整的病原体或寄生虫的抗体检测到它们。

但也有大量的病原体和寄生虫由于受感染的组织(肺、胃、胰腺、十 二指肠和肝脏)与胃肠道相关而存在于粪便中，但另一方面，它们自身不 能在肠道内生存和/繁殖。这些病原体和寄生虫包括，例如幽门螺杆菌 (Helicobacter pylorvi)，肝螺旋杆菌(Helicobacter hepaticus，)，结 核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和其它分枝杆菌，肺炎衣原 体Chlamydia pneumoniae)，嗜肺军团菌(Legionella pneumophilae)， 肺囊虫(Pneumocystis carinii)等等。其中的一些病原体可以在例如痰 中检测到。但是痰中的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)仅 可能在很短的一段时间内检测到，即包含病原体的腔已打开时。而且由于 存在下述的事实使检测更加困难，即，并不是总能获得待检者的痰样品进 行检测。这适用于例如，婴儿，昏迷的病人或动物。其它病原体，例如，嗜 肺军团菌(Legionella pneumophilae)可以通过经肾脏进入尿液的抗原特 异地检测出来。但也只有当存在于尿液中的抗原量足以检测出来时才可能 进行。在粪便中检测是一种很好的替代选择。然而这些生物体，通过肠道 就伴随着肠道菌群的降解消化机制的猛烈攻击。这种情况下，可观察到的 病原体特异的分子结构可能受到破坏或者它们的浓度大大降低。

对其它抗酸细菌而言也存在病原体在肠道中降解而影响在粪便样品中 进行可靠的检测的问题。在受感染的病人胃中的细菌数量比寄居于肠道中 的其它细菌要少。而且，这些细菌或细菌片断在离开胃部之后还要经过富 含蛋白酶的长长的肠道。在这些环境的影响下，在粪便中只能发现少数的 完整蛋白。无法想象，总是某些蛋白的相同片段可以完好无损地通过肠道。 从中得出的另一结论是对于进行ELISA所必须的，即同一抗原两表位的结 合，并不象其出现在天然蛋白中的抗原中时那么必须，而且定位相近的两 个表位最有可能在需要同一分子上的两个表位参与的检测方法中表现出阳 性结果。理想的情况是，在同一分子中只有一个表位是检测中所需的。另 外，在受感染的病人的粪便中所检测出的抗原分布表明在通过肠道的过程 中抗原加工的个别特征。缓解这一问题的第一种方法已由欧洲专利文献 EP-A 0 806 667所公开。在这一申请中介绍了特定的幽门螺杆菌(H.pylori) 菌株溶菌可以诱导产生多克隆抗体。这些抗体可以识别更多的来自不同地 理区域的菌株的变异体。但在该申请中并没有说明血清所识别的是那些抗 原。尽管尽可能实现标准化，但事实上免疫血清仍然可能不同，因此上述 申请中所提及的方法只能算作广泛应用的次优化方案。另外，还必须持续 免疫新动物以提供多克隆血清。相应的方法既耗时又耗资。

理想的是，单一的或有限数量的特异于这一病原生物体/寄生虫的试剂 即可以对抗酸病原生物体/寄生虫的感染作出可靠的检测。更主要地，这种 方法将会大大地降低相关检测方法的费用。因此，本发明所强调的技术问 题就是，提供一种相应的检测方法或相应的试剂。

这一技术问题由权利要求中所述的实施方案得以解决。

由此，本发明涉及一种检测哺乳动物被抗酸微生物感染的方法，其中， (a)所述哺乳动物的粪便样品与(aa)一种受体，在允许来自所述抗酸微生 物的抗原与该受体形成复合物的条件下共同培养；或与(ab)两种不同的 受体，在允许来自所述抗酸微生物的抗原与该两种受体形成复合物的条件 下共同培养，其中如(aa)中所述的受体或如(ab)中所述的受体特异地与 一种抗原相结合，至少对一些哺乳动物来说，该抗原通过肠道后表现为一 种结构，该结构与天然结构相当或在哺乳动物被抗酸微生物、其抽提物或 溶菌产物或者源于该抗酸微生物的蛋白、蛋白片段或合成肽所感染或免疫 后产生的抗体与该结构相抗；和(b)检测如(a)项中描述的至少一种抗 原-受体复合物的形成。

在本发明中，术语“抗酸微生物”包括任何微生物，只要其具有适应 宿主的特性/机制使其能够耐受消化道的理化影响，并能通过优选的免疫学 检测或通过使用适体将其检测出来。这样的抗酸微生物的例子包括幽门螺 杆菌(Helicobacter pylorvi)，肝螺旋杆菌(Helicobacter hepaticum)， 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，假结核分枝杆菌 (Mycobacterium pseudotuberculosis)，和(Mycobacterium cansassii)。

本发明所用到的术语＂哺乳动物粪便样品＂是指任何可用于本发明检测 方法的粪便样品。尤其包括由公知的方法制备的用于诊断检测的粪便样品。 样品的制备可通过下述例如，依照RIDASCREEN内变形虫属酶免疫测定 (R-Biopharm GmbH，Darmstadt)方法进行。

本领域的技术人员可轻易地调整＂允许复合物形成的条件＂；参见 Harlow和Lane，出处同上。这些条件是，例如生理条件。

本发明所用到的术语＂在通过肠道后表现为一种[...]结构，该结构与 天然结构相当＂，是指该抗原表位通过肠道后可被一种受体例如，单克隆抗 体、其衍生物或片段，或由所获得抗的还未通过肠道的或就在肠道的相同 抗原/表位的适体所识别。换句话说，该与上述物质特异结合的表位/抗原， 就其结构而言是完整的或基本完整的，通过肠道而未被降解。该表位/抗原 天然结构的来源可以是例如，由弗氏压碎器破碎并进一步依照标准方法(参 见，例如，Sambrook等.，＂分子克隆实验操作手册＂，第二版，1989，CSH 出版社，冷泉港美国)纯化的细菌提取物，或通过标准方法(例如 Sambrook等.，出处同上)纯化的细菌裂解物。

依照本发明，术语＂通过肠道后表现为一种[...]的结构，在哺乳动物 被抗酸微生物、其抽提物或溶菌产物或源于该抗酸微生物的蛋白或蛋白片 段或合成肽所感染或免疫后所产生的抗体与该结构相抗＂是指由受体所识 别的该表位与由哺乳动物，优选人，的免疫系统所呈递的表位相当。抗原 呈递机制及导致抗原加工的机制和由此产生的抗体的种类是本领域所公知 的并在下述文献中有所描述，例如，Janeway和Travers，的免疫学，第二 版1997，Spektrum Akademischer Verlag GmbH，Heidelberg。这些表位 可能与天然表位不同。可以通过自然感染(合成肽除外)或免疫使哺乳动 物与所述微生物或蛋白或片段或合成肽相接触。对于免疫，可以使用所述 微生物/蛋白的提取物，裂解物，合成肽等。合适的免疫方法是本领域所公 知的，并在下述文献中有所描述，例如Harlow和Lane，出处同上。合适 的抗体也可以通过例如免疫和/或筛选替代品例如合成肽，由重组所产生的 蛋白，提取物，裂解物或部分消化的蛋白。

＂合成肽＂包括具有至少一个天然抗原或已通过肠道的抗原的表位的 肽。所述的肽可以具有与所述的抗原或其中的片段相同的一级结构。但是， 它们也可以有不同的一级结构(基本的氨基酸序列，例如保守替换)。

此处所用的术语＂特异结合＂是指所述的受体对非感染哺乳动物样品中 的表位没有或基本没有活性。通常所述的受体仅与出现在粪便样品中抗原 的表位相结合。

依照本发明的这一实施方案，所制备的粪便样品可以结合到例如，固 相上，此感染介质可以用标记受体检测。如果通过肠道后呈现的抗原(仍) 以(同源)二聚体或多聚体形式出现，则可以将相同的受体既作为捕获剂 又作为检测剂。    

另外，对本发明的方法来说重要的是，成功的检测仅需要一个，在以 基本不变的方式通过肠道后，可以检测到的抗原蛋白表位。这一表位在同 源二聚体或多聚体中可出现几次。找到这种可检测形式表位的可能性明显 高于在检测分析中需要检测一个以上表位的情况。

最终，本发明的仅需要一个受体的方法在成本和操作的标准化方面具 有优势。

依照本发明的惊人发现来自所述微生物的特异抗原在通过肠道后 具有一种，对于检测来说，基本不变的表位结构，第二个实施方案也应视 为是对本发明至关重要的。这一实施方案基于不同受体结合到同一抗原的 不同表位这一事实。此处，术语“基本上”是指在侵染个体中所述的表位 及相应微生物感染可检出高于70％，优选至少75％，更优选高于85％，特别 优选高于90％，更特别优选高于95％最优选高于98％。理想的是，100％ 的受感染个体被检测出感染。

依照本发明我们惊讶地发现，仅以一个特异地结合于抗酸微生物抗原 表位的受体，或以两个特异地结合于同一抗原两个表位的受体，就可以以 一种相对可靠的方式诊断出这些细菌/病原体的感染。本发明也体现在，具 有所述特性的其它表位由其它受体识别，例如单克隆抗体，或其片段或衍生 物或适体。后面的实施方案适合于进一步提高诊断的可靠性。有益的是， 这些其它受体可以是抗体，片段或衍生物，其可特异地识别脲酶，优选β- 脲酶，26kDa蛋白或Hsp60，所有的均优选来自幽门螺杆菌(H.Pylori)。 对一个或更多这些蛋白/蛋白片段的检测可以在同一实验中进行或用同一 样品的不同部分进行独立地实验。

本发明的结果是惊人的，主要是由于本领域此前的研究结果与此相背 离。例如，对于幽门螺杆菌(H.Pylori)，已发现主要抗原在ELISA中并 不表现所期望的特异性和灵敏性；参见Newell等，传染病的血清诊断免 疫治疗(Serodiag.Immunother.Infect.Dis.)3(1989)，1-6。而且， EP-A-0806667中说，鉴于幽门螺杆菌(H.pylori)菌株的变异性，不可 能用受体，例如单克隆抗体，可靠地检测幽门螺杆菌(H.pylori)感染。

与本领域的上述情况相比，本发明的方法是有益的，这主要是由于其允 许仅用一种受体进行相对可靠的诊断。例如，在ELISA中，检测使用成对 的受体，例如抗体，其片段或衍生物或者适体，两个成对受体与同一抗原 的相同或不同表位相结合。例如，幽门螺杆菌(H.Pylori)过氧化氢酶 形成由几个相同的亚单位构成的多聚体结构。因此，在ELISA或其他分析 中，同一受体既可用于捕获受体也可以用于检测受体。本发明方法的另一 优点是该方法是一种直接的非侵染性方法，其增加了上述的对病人的有益 性和所检测疾病阶段的可靠性。

在一优选实施方案中所述的抗酸微生物是抗酸细菌。

许多抗酸细菌是目前本领域所公知的。在一特定的优选实施方案中所 述的抗酸细菌属于螺旋杆菌属(Helicobacter)，弯曲杆菌属 (Campylobacter)或分枝杆菌属(Mycobacterium)。

在另一特定的优选实施方案中，所述的细菌属于幽门螺杆菌 (Helicobacter pylorvi)肝螺旋杆菌(Helicobacter hepaticum)空肠 弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。

在又一特定的优选实施方案中所述的受体是抗体，其片段或衍生物或 适体。

在本发明的范围内单克隆抗体的＂片段＂或＂衍生物＂与该单克隆抗体 具有相同的结合特异性。这样的片段或衍生物可以通过标准的方法制备； 参见例如Harlow和Lane，＂抗体，实验操作手册＂，CSH出版社，冷泉 港，美国1988。片段的例子包括Fab-，F(ab′)2或Fv-片段。scFv片段 是衍生物的实例。衍生物也可以是通过化学方法制备的，与所述抗体具有 相同结合特性或具有改进的结合特性的物质。这样的物质可以通过例如， 拟肽(peptidomimetics)或不同噬菌体展示周期(different cycles of phage display以改善结合特性为目的的筛选所产生。依照本发明，适体 是指核酸例如RNA；ssDNA(ss＝单链)，经修饰的RNA或经修饰的ssDNA， 其与大量的具有高特异性和亲和性的靶序列相结合。术语＂适体＂是本领域 所公知并已被定义的，例如在Osborne等.，生物化学现代观1(1997)，5-9 或Stull和Szoka，药学研究12(1995)，465-483。

在本发明的范围内，术语＂抗原-抗体复合物＂并不仅仅包括所述抗原与 天然抗体所形成的复合物，还包括所述抗原与抗体的片段或衍生物所形成 的复合物。

本发明包括仅应用单克隆抗体、其片段或其衍生物或者适体的实施方 案，也包括在同一次检测中使用不同类型检测试剂的实施方案。因此，可 能仅列举两个实施方案，其中第一单克隆抗体与第二抗体衍生物一起使用， 或第一适体与第二抗体片段共同使用。在这一方面，所用的术语＂第一＂和 ＂第二＂指第一和第二检测试剂。但并不表示总是使用两个抗体或其衍生物 或片段。

使用单克隆抗体，其片段或衍生物或使用适体易于保持诊断方法的可 靠性标准，这意味着与目前已知的方法和为上述目的所提出的方法相比具 有更大的优势。而且，这种方法也不需要持续的免疫和随后依所需检测新 的动物，例如，依照欧洲专利文献EP-A 0 806 667中介绍的方法。

在本发明的又一优选实施方案中的抗原是一种过氧化氢酶抗原，优选 来自幽门螺杆菌(H.Pylori)。所述的过氧化氢酶具有特殊的优势，即它 在目前已知的所有抗酸细菌中都能检测到。依照本发明，作为另一个优势， 所述的过氧化氢酶对肠道的消化作用具有很强的抗性，这使检测得以大大 简化。毕竟，所述的过氧化氢酶或其片段通过肠道后是以优势结构存在， 例如以四聚体形式，这便于仅使用一种受体进行检测。

依照本发明我们惊讶地发现，在其粪便检测到抗酸细菌感染的哺乳动 物种群，特别是病人中，这一种群的所有成员都在粪便中表现出一致的过 氧化氢酶表位再现性，因此极可能仅用一种相应的受体，优选单克隆抗体， 其片段或衍生物或适体进行相对可靠的诊断。具体地说，由于过氧化氢酶 具有四聚体抗原结构，这一诊断可以很好地在，例如ELISA或相似布置的 固相系统中进行。

所述的过氧化氢酶特别优选是幽门螺杆菌(H.pylori)的过氧化氢酶

在另一优选实施方案中，所述抗原是金属蛋白酶，特别优选来自幽门 螺杆菌(H.pylori)。

在再一优选实施方案中，所述抗原脲酶，特别是来自幽门螺杆菌(H. pylori)。

在又一优选实施方案中，用于检测的受体混合物有另外的用途，若所 述受体用作该抗原的检测剂则使用具有捕获所述抗原功能的受体混合物， 若所述受体用作该抗原的捕获剂则使用具有检测功能的受体混合物。本发 明的这一实施方案为高可靠性的诊断，特别是对于那些通过肠道后不以二 聚体或多聚体构象存在的抗原。这一实施方案使得在大部分标准化的免疫 检测方法中使用的两种受体类型中的一种是单克隆抗体，而第二种受体类 型可以是，例如多克隆血清。

在另一优选实施方案中，所述的受体混合物是多克隆抗血清。

在另一特别优选实施方案中，获得了抗微生物，优选幽门螺杆菌(H. pylori)，溶菌产物的多克隆抗血清。

在又一特别优选的实施方案中，所述的溶菌产物是富含抗原的溶菌产 物。

在又一优选实施方案中，所述的溶菌产物是减少了优势免疫抗原的溶 菌产物。

上述的两个实施方案还包含下述事实，即所述的溶菌产物是富含抗原 的溶菌产物，优选富含过氧化氢酶且具有减少了优势免疫抗原的溶菌产物， 优选主要是脲酶。具体地说，所述的组合提供了获得高免疫收率的可能性， 其特别适合于本发明。在实施方案中具体描述了进行相应的富集和排除的 方式。

依照本发明的又一优选实施方案获得了抗纯的或(半)人工合成抗原 的多克隆抗血清，优选来自幽门螺杆菌(H.pylori)。

依照本发明，所述的受体，优选单克隆抗体、其片段或衍生物，或适 体可识别并特异结合线性的或构象表位。在又一优选实施方案中，至少一 种受体与构象表位相结合。

在一特定实施方案中，所有的受体均与构象表位相结合。

在一特定实施方案中，与过氧化氢酶表位相结合的所述抗体 [HP25.2m/2H10]的重链具有至少一个下述的CDRs，优选CDR3，更优选具有 下述全部三种CDRs： CDR1：NYWIH CDR2：YINPATGSTSYNQDFYD CDR3：EGYDGFDS

在又一特定实施方案中，编码与过氧化氢酶表位相结合的抗体 [HP25.2m/2H10]重链的DNA序列具有至少一个下述的CDRs，优选CDR3， 更优选具有下述全部三种CDRs： CDR1：AACTACTGGA TTCAC CDR2：TACATTAATC CTGCCACTGG TTCCACTTCT TACAATCAGG

  ACTTTCAGGA C CDR3：GAGGGGTACG ACGGGTTTGA CTCC

在又一特定实施方案中，所述与过氧化氢酶表位相结合的抗体 [HP25.2m/2H10]的轻链具有至少一个下述的CDRs，优选CDR3，更优选具 有下述全部三种CDRs： CDR1：SASSSVNYMY CDR2：DTSKLAS CDR3：QQWSSNPYT

而且，在又一特定实施方案中，编码与过氧化氢酶表位相结合的抗体 [HP25.2m/2H10]轻链的DNA序列具有至少一个下述的CDRs，优选CDR3， 更优选具有下述全部三种CDRs： CDR1：AGTGCCAGCT CAAGTGTAAA TTACATGTAC CDR2：GACACATCCA AATTGGCTTC T CDR3：CAGCAGTGGA GTAGTAATCC GTACACG

在又一特定实施方案中，所述与过氧化氢酶表位相结合的抗体 [HP25.6m/1B5]的重链具有至少一个下述的CDRs，优选CDR3，更优选具有 下述全部三种CDRs： CDR1：DTYVH CDR2：KIDPANGKTKYDPIFQA CDR3：PIYYASSWFAY  

在又一特定实施方案中，编码所述与过氧化氢酶表位相结合的抗体 [HP25.6m/1B5]重链的DNA序列具有至少一个下述的CDRs，优选CDR3，更 优选具有下述全部三种CDRs： CDR1：GACACCTATGTGCAC CDR2：AAGATTGATCCTGCGAATGGTAAAACTAAATATGACCCGATATTC

  CAGGCC CDR3：CCCATTTATTACGCTAGTTCCTGGTTTGCTTAC

在又一特定实施方案中，所述与过氧化氢酶表位相结合的抗体 [HP25.6m/1B5]的轻链具有至少一个下述的CDRs，优选CDR3，更优选具有 下述全部三种CDRs： CDR1：KASQDVGTSVA CDR2：WTSTRHT CDR3：QQYSSSPT

而且，在又一特定实施方案中，编码所述与过氧化氢酶表位相结合的 抗体[HP25.6m/1B5]轻链的DNA序列具有至少一个下述的CDRs，优选CDR3， 更优选具有下述全部三种CDRs： CDR1：AAGGCCAGTCAGGATGTGGGTACTTCTGTTGCC CDR2：TGGACATCCACCCGGCACACT CDR3：CAGCAATATAGCAGCTCTCCCACG

在另一优选实施方案中，对β-脲酶特异的抗体是由杂交瘤 HP8m/4H5-D4-C9或HP9.1m/3C2-F8-E2所产生的抗体，上述杂交瘤于1998 年6月23日依照布达佩斯条约保存于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen DSMZ)，保藏号为DSM ACC2360和DSM ACC2362。在附图中描述的对β-脲酶[HP8m/1 H5-G2-B4] 特异的抗体是由所保藏的杂交瘤HP8m/4H5-D4-C9的子克隆所产生的。由母 克隆和子克隆所产生的抗体均由同一DNA序列编码并具有相同的特性。

本发明所述方法的另一优选实施方案中，与所述β-脲酶表位相结合的 抗体重链具有至少一个下述的CDRs，优选CDR3，更优选具有下述全部三种 CDRs： CDR1：GFTFSSHFMS CDR2：SISSGGDSFYPDSLKG CDR3：DYSWYALDY 或： CDR1：GYAFSTSWMN CDR2：RIYPGDGDTNYNGKFKG CDR3：EDAYYSNPYSLDY

本发明所述方法的另一优选实施方案中，编码所述与β-脲酶表位相结 合的抗体重链的DNA序列具有至少一个下述的CDRs，优选CDR3，更优选具 有下述全部三种CDRs： CDR1：GG CTACGCATTC AGTACCTCCT GGATGAAC CDR2：CGGATTTATC CTGGAGATGG AGATACTAAC TACAATGGGA AGTTCAAGGG C CDR3：GAG GATGCCTATT ATAGTAACCC CTATAGTTTG GACTAC 或： CDR1：GG ATTCACTTTC AGTAGCCATT TCATGTCT CDR2：TCCATTAGTA GTGGTGGTGA CAGTTTCTAT CCAGACAGTC TGAAGGGC CDR3：GACTAC TCTTGGTATG CTTTGGACTA C

本发明所述方法的另一优选实施方案中，所述与β-脲酶表位相结合的 抗体轻链具有至少一个下述的CDRs，优选CDR3，更优选具有下述全部三种 CDRs： CDR1：RASQSIGTRIH CDR2：YGSESIS CDR3：QQSNTWPLT 或： CDR1：HASQNINVWLS CDR2：KASNLHT CDR3：QQGRSYPLT

另外，编码所述抗体轻链的DNA序列优选具有下述的CDRs： CDR1：A GGGCCAGTCA GAGCATTGGC ACAAGAATAC AC CDR2：TAT GGTTCTGAGT CTATCTCT CDR3：CAACAA AGTAATACCT GGCCGCTCAC G 或： CDR1：C ATGCCAGTCA GAACATTAAT GTTTGGTTAA GC CDR2：AAG GCTTCCAACT TGCACACA CDR3：CAACAG GGTCGAAGTT ATCCTCTCAC G

另外，优选具有所述CDRs的重链和轻链同时出现于一种抗体、其片段 或衍生物，所述的抗体、其片段或衍生物特异地与优选来自幽门螺杆菌(H. pylori)的过氧化氢酶或β-脲酶或其片段相结合。本发明还包括下述的实 施方案，在这些实施方案中，这些重链和轻链与其它重链和轻链相结合， 其中，所述的结合特性得以必要地维持或提高。相应的方法是本领域所公 知的。特别优选的抗体在其重链和轻链的可变区具有如图1和2，3和4， 5和6或，7和8所示的氨基酸序列，或该区域由其中所示的DNA序列所 编码。

依照本领域所公知的方法，所述的CDRs可整合到多种FRs(构架区)。

在优选实施方案中下述步骤在将粪便样品与所述抗体共同培养之前进 行：将所述粪便样品以1∶3到1∶25优选1∶10，特别优选1∶5的比例重悬于 重悬缓冲液中，并在震荡混合器上混合。一种样品缓冲液的例子是：150mM PBS，0.1％ SDS。在一优选实施方案中，重悬缓冲液由150mM PBS，0.5％动 物血清，0.1％去污剂。动物血清可以选自牛，小鼠，大鼠或猪，去污剂可 以选自离子去污剂(优选Tween 20)，非离子去污剂(优选SDS)或两性去污 剂(特别优选Chaps)。

在另一实施方案中，本发明的检测方法也用于在胃气、呼吸冷凝物、 唾液、牙菌斑、粘液涂片、活组织、全血或血清中检测幽门螺杆菌(H. pylori)。可以通过给病人喝含冷CO2的饮料使胃气以“打嗝”的形式释放 出来而获得。所述的气可以收集在适当的容器中，或以本领域人员所知的 方式，例如通过如德国专利文献DE 19718925所述的装置或如德国专利文 献DE 19505504中所述装置获得呼吸冷凝物。用这种方法所获得的冷凝物 可以以液体的形式用于本发明的检测，该方法的所有步骤均如前所述，只 是用此处所述的样品替代粪便样品。牙菌斑和粘液涂片也可依照本领域所 知的方法获得，并且可以象唾液、全血和血清一样，以合适的浓度用于本 发明的检测，仅需对重悬缓冲液作些改动。

在又一优选实施方案中，至少一个在(b)步骤中形成的抗原-受体复 合物/抗原-受体-受体-混合复合物通过免疫学方法检测。

在又一优选实施方案中，至少一个在(b)步骤中形成的抗原-受体复 合物/抗原-受体-受体-混合复合物通过ELISA，RIA，Western blot或免疫 层析的方法检测。这些方法是本领域所公知的；参见Harlow和Lane，部 分引用。

在本发明的方法的特别优选实施方案中，在免疫学方法，具体地说是 RIA或ELISA中，同一受体既用于固相结合又用于检测抗原表位。由于捕 获受体可以非修饰的形式结合于固相，例如微量滴定板上，用于检测的受 体可以任意地进行标记。另一方面，所述的受体可以是没有标记的，而所 述微生物的表位，优选细菌表位可通过第三标记受体检测，所述的第三标 记受体优选的是抗体、其片段或衍生物，或适体，种属特异性的或Ig-种 类特异性的抗体或相应的适体。抗体的标记物，例如用放射性或荧光标记 物是本领域已知的；参见Harlow和Lane，部分引用。对适体的应用是相 同的。上述的实施方案特别适合于检测过氧化氢酶，其在通过肠道后可选择 地以四聚体形式出现。在这一实施方案中当然也可以联合使用抗体、其中 的片段或衍生物和适体，例如联合使用与同一抗原不同表位相结合的抗体 等。

三步ELISA是一种检测方法，其包括用捕获抗体包被平皿，加入样品 和连接物(例如已标记的检测抗体)和其间的清洗步骤。一步ELISA与三步 ELISA间的区别在于样品和所用的连接物加入到用捕获抗体预包被的平皿 与应用是在同一步骤中完成的。

在本发明的另一优选实施方案中，所述的单克隆抗体是鼠单克隆抗体。

另外，在另一优选实施方案中所述的受体是固定到支持物上的。进行 常规检测时，将受体，优选所述抗体、其片段或衍生物或适体固定到支持 物上是特别有益的。而且，抗体-支持物/适体-支持物可以打包作为成套工 具，或作为试剂盒。

在另一特定优选实施方案中所述支持物的材料是多孔材料。

在另一特定优选实施方案中所述的支持材料是一检测条。

另外，在另一优选实施方案中所述的支持物由纤维素或其衍生物组成。

其粪便、胃气、呼吸凝集物等可用本发明的方法分析的哺乳动物可以 是一种动物，例如驯养的动物如猫或狗，实用动物如猪或其他类型的动物 如小鼠、虎、沙土鼠或白鼬。

在另一优选实施方案中所述的哺乳动物是人。

在另一优选实施方案中本发明的方法是自动化的方法。自动化的方法 可以是例如通过机器人进行操作，让机器人进行操作过程中的一些或全部 步骤。相关的机器人是本领域所公知的。

而且本发明涉及具有V区的单克隆抗体、其中的片段或其衍生物，其 具有上述联合的CDRs或由上述的杂交瘤产生。

在这种情况下，具有至少一个如图1和2、3和4、5和6或7和8所 示V区的单克隆抗体、其中的片段或其衍生物为优。优选地，此抗体含有 两个如图1和2、3和4、5和6或7和8所示的V区。而且这些V区优选 地由如图1和2、3和4、5和6或7和8所示的DNA序列所编码。 

在本发明的一个特定优选实施方案中，所述的单克隆抗体、其中的片 段或其衍生物是鼠抗体或其片段或衍生物或嵌合体，优选人源化的抗体、 其片段或衍生物。所述的衍生物也可以是融合蛋白。而且，所述的抗体优 选经标记的，例如通过一种胶体，利用放射性、荧光，磷光或化学发光物 质标记。

嵌合人源化抗体和人抗体和所述的其它衍生物的生产是本领域所公知 的。(例如Vaughan等.，1998；Orlandi等.，1989，Harlow和Lane，部 分引用)。

本发明还涉及与所述单克隆抗体、其片段或其衍生物特异结合相同表 位的适体。上述适体可根据本领域所公知的方法生产。

此外，本发明涉及被上述的抗体、其片段或其衍生物或者适体特异结 合的表位。

而且，本发明进一步涉及能特异结合本发明所述表位的抗体，衍生物 或其中的片段。这些抗体可以是例如单克隆抗体，其可通过标准的方法用 所述的表位作为半抗原/抗原组分所生产。

而且本发明涉及诊断组合物，其包括至少一个选择性地固定于支持物 上的受体，优选至少一个上述定义的单克隆抗体，其片段或衍生物或者适 体。

而且，本发明涉及检测至少一种上述定义的表位的检测装置，其包括 (a)至少一个上述定义的固定于支持物上的受体，优选单克隆抗体、其片 段或衍生物或者适体；(b)制备和分析粪便样品的装置，和可选择的上述 定义的受体的混合物。

本发明进一步涉及一种检测装置，该装置包括(a)至少一种上述定义 的受体，优选一种单克隆抗体、其片段或衍生物或者一种适体，所述的受 体与颗粒大小范围典型地在5nm到100nm，优选20nm到60nm(颗粒 大小为40nm到60nm的金和200nm到500nm的乳胶是特别优选的) 的胶体金，乳胶颗粒或其他有色颗粒相连接；(b)一种制备和分析粪便样 品的装置；和可任选的(c)上述定义的受体混合物。

而且，本发明还涉及一种试剂盒，其包括(a)至少一种上述定义的受 体，优选一种单克隆抗体、其片段或衍生物或者一种适体，所述的受体与 可任选地固定于支持物上；和可任选的(b)一种制备和分析粪便样品的装 置；和可任选的(c)上述定义的受体混合物。

所述的装置除用于制备和分析粪便样品外，所述的组合物和检测装置 和试剂盒也可以带有制备(如果需要)和分析胃气，呼吸凝集物，唾液等 的装置。

本发明还涉及一种包含至少一种上述的受体，可任选地与制药上可接 受的支持物和/或稀释剂相结合的组合物。该组合物优选地是一种药物制 剂。

制药上可接受的支持物的例子是本领域的技术人员所公知的。它们包 括磷酸盐缓冲的盐溶液，水，乳剂如油/水乳剂，不同种类的去污剂，无菌 溶液等。可通过已知的常规方法来制备包含上述支持物的药物制剂。这些 药物制剂可以在合适的剂量范围内施用于个体，例如每病人每天1μg到100 mg。可以有多种施用形式，例如静脉内的，腹膜内的，皮下的，肌内的， 局部的或真皮内的。主治医师可以根据临床情况选择施用剂量。本领域的 技术人员可知所述的剂量依赖于多种因素，例如大小，体表，年龄，性别， 或病人的大致情况，也依赖于所使用的特定药物制剂，持续时间和应用的 种类以及可能与之同时施用的其它药物制剂。

最后，本发明还涉及包含本发明的诊断组合物，本发明的检测装置或 本发明的试剂盒的包装。

本发明的诊断组合物的组分本发明的检测装置和/或本发明的试剂盒 可以包装于如小瓶或细管的容器内，可任选地置于缓冲液和/或溶液中。可 能将一种或多种组分包装于一个容器中。

附图描述： 图1：编码对过氧化氢酶特异的单克隆抗体[HP25.2m/2H10]重链V区 的已克隆DNA序列。所编码的氨基酸以单字母代码表示。以下划线表示由 Kabat等所述的CDR区域1-3。 Fig.2：编码对过氧化氢酶特异的单克隆抗体[HP25.2m/2H10]轻链V 区的已克隆DNA序列。所编码的氨基酸以单字母代码表示。以下划线表示 由Kabat等所述的CDR区域1-3。 Fig.3：编码对过氧化氢酶特异的单克隆抗体[HP25.6m/1B5]重链V区 的已克隆DNA序列。所编码的氨基酸以单字母代码表示。以下划线表示由 Kabat等所述的CDR区域1-3。 Fig.4：编码对过氧化氢酶特异的单克隆抗体[HP25.6m/1B5]轻链V区 的已克隆DNA序列。所编码的氨基酸以单字母代码表示。以下划线表示由 Kabat等所述的CDR区域1-3。 Fig.5：编码对脲酶特异的第一单克隆抗体(DSM ACC2360)轻链的DNA 序列。所编码的氨基酸以单字母代码表示。以下划线表示由Kabat等所述 的CDR区域1-3。 Fig.6：编码对脲酶特异的第一单克隆抗体(DSM ACC2360)重链的DNA序 列。所编码的氨基酸以单字母代码表示。以下划线表示由Kabat等所述的 CDR区域1-3。 Fig.7：编码对脲酶特异的第一单克隆抗体(DSM ACC2362)轻链的DNA 序列。所编码的氨基酸以单字母代码表示。以下划线表示由Kabat等所述 的CDR区域1-3。 Fig.8：编码对脲酶特异的第二单克隆抗体(DSM ACC2362)重链的DNA 序列。所编码的氨基酸以单字母代码表示。以下划线表示由Kabat等所述 的CDR区域1-3。 Fig.9：在摄入奥美拉唑(Omeprazol)，甲硝唑(Metronidazol)和克 拉霉素(Clarithromycin)后，对幽门螺杆菌(H.pylori)阳性病人的 根除治疗过程。

实施例1：幽门螺杆菌(H.pylori)抗原的分离 幽门螺杆菌(H.pylori)的培养

幽门螺杆菌(H.Pylori)(菌株NCTC 11637)涂布在加有10％马血 清和两性霉素B、万古霉素和Cefsoludin(Sigma Chemicals)的Wilkins chalkers琼脂平板上，在微需氧大气(Anaerocult GasPAk，Merck)中37 ℃条件下培养3或4天。将两个平皿中的内容悬浮于加有350ml添加了 上述抗生素的BHIB培养基的一个1升的瓶(Schott)中，用混有10％ CO2， 5％O2，85％N2的混合气体熏10min，然后将瓶子封起来。培养物于37℃下 在旋转摇床上振荡培养两天。接下来，将瓶中的培养物在无菌条件下装入 一个10升的瓶中，并将瓶子用4，7升BHIB-培养基填满。再于37℃下在旋 转摇床上培养两天。随后，全部离心，5,000g离心15min，倾出上清， 将菌体称重。为保存这些菌体可将其以2∶1(w/v)的比例悬浮于加有15％丙 三醇的生理盐水中，在-80℃条件下冷冻。为检测所培养细菌的一致性，在 检测脲酶，氧化酶和过氧化氢酶活性的同时进行显微镜检。 实施例2：幽门螺杆菌(H.Pylori)抗原的制备 制备幽门螺杆菌(H.pylori)溶菌产物

pH7.5的PBS以1∶10的比例加入幽门螺杆菌(H.Pylori)菌体(实施 例1)中，冰浴重悬。细菌细胞在冰上用小超声探头(Son ifer，Branson) 以25-30％的强度进行超声处理10×60s，每两次处理间隔60s。破碎的 细菌细胞在4℃条件下10,000rpm(Sorvall，5534)离心2×20min。将上 清液作为产生多克隆抗血清的抗原制品。 幽门螺杆菌(H.pylori)过氧化氢酶的制备

裂解缓冲液(20mM Tris HCI，pH7.0，1mM EDTA，1mM苯甲基磺酰 氟(PMSF)，0.05％叠氮化钠和10％(v/v)异丁醇)以1∶2(w/v)的比例 加到冷冻的菌体中，在吊挂摇床(overhead shaker)中于室温(RT)下振 荡直至全部溶解，其后再振荡约15min。以20,000rpm(Sorvall，SS-34) 在4℃条件下离心20min后，倾出上清并经0.45μm-滤器过滤。

澄清的上清液用缓冲液A(20mM Tris HCI，pH7.0，1mM EDTA，1mM PMSF，0.05％叠氮化钠)以1∶3的比例稀释后转到用缓冲液A平衡的 SourceQ柱(16/10)(Pharmacia)上。从SourceQ柱中流出的包括过氧化 氢酶，不含幽门螺杆菌(H.pylori)的主要抗原例如脲酶，Hsp60和烷 基氢过氧化物还原酶。

为分离过氧化氢酶，将从SourceQ柱中流出的物质进行分子筛层析 (Superdex 200)(16/60)。所述的过氧化氢酶与另一分子大小约为150kDa 的蛋白(嗜中性白细胞活化蛋白，NAP)以约等量的比例一起分离出来。

为获得高纯度的过氧化氢酶，可向SourceQ-柱流出物中添加2M醋酸 钠溶液，pH4.9，on 40mM醋酸钠转到SourceS柱(8/28)上。用缓冲液 A洗去非结合蛋白后，过氧化氢酶用缓冲液B(40mM醋酸钠，1M NaCl， pH4.9)，以线性NaCl梯度(在缓冲液A中添加0％到100％的缓冲液B)进 行洗脱。过氧化氢酶在约370mM NaCl处被洗脱出来。 实施例3：过氧化氢酶的性质：

通过还原条件下的SDS PAGE可知所述的纯化蛋白的分子量约为58kDa 纯度90％。

为鉴定所分离的蛋白进行了微量测序。所述蛋白在SDS PAGE凝胶中用 LysC蛋白酶切割。提取出的蛋白混合物经RP-HPLC分离。对LysC肽进行 序列分析，得到下述的氨基酸序列： ERLHDTIGESLAHVTHK

这一序列与幽门螺杆菌(H.pylori)过氧化氢酶中相应的LysC肽 (Manos J.等.(1998)螺旋杆菌3(1)，28-38；Genbank接受号AAC1 6068.1)一致。 实施例4：多克隆抗体和单克隆抗体(pab；mab)的生产 多克隆抗血清的生产：

抗幽门螺杆菌(H.pylori)溶菌产物的多克隆抗血清，带有极少主要 抗原如脲酶，Hsp60和烷基氢过氧化物还原酶(参见实施例2：分离和纯 化)的幽门螺杆菌溶菌产物，富含过氧化氢酶(例如向溶菌产物中加入过氧 化氢酶)的幽门螺杆菌溶菌产物，抗纯过氧化氢酶的多克隆抗血清，可用 含过氧化氢酶表位的相应免疫制剂免疫所选择的哺乳动物(例如小鼠， 兔，山羊等)而获得。

所述的抗体可通过血清蛋白A亲和层析进行纯化，并可用作夹心ELISA (参见实施例9)中的捕获抗体，以评估所述单克隆抗体是否适用于在病人 的粪便中进行抗原检测。

多克隆兔抗血清可通过由幽门螺杆菌溶菌产物的多克隆抗体 (Herbertshausen)产生。通过蛋白A亲和层析从这些抗血清中纯化出多 克隆抗体，将其用作夹心ELISA(参见实施例9)中的捕获抗体以评估所 述单克隆抗体是否适用于在病人的粪便中进行抗原检测。

单克隆抗体的制备： 以本领域的技术人员所公知的方法(Harlow & Lane，1988；Peters & Baum garten，1990)制备所述的单克隆抗体。 免疫

由幽门螺杆菌溶菌产物(参见实施例2)产生的抗原制剂用于免疫小 鼠(BALB/c×C57/Black，F1代，8-12周龄)。用50μg抗原与弗氏完全 佐剂(Difco)，以1∶1的比例进行乳化经腹膜内注射(200μl/小鼠)方式 进行基础免疫。每四个月加强注射一次，每只小鼠注射25μg混有弗氏非 完全佐剂的抗原。从小鼠眼眶后血中获得的抗血清作为ELISA(参见融合 筛选)中的阳性对照。 融合    

最后一次免疫后两天，摘除小鼠的脾，将脾细胞与含5∶1比例PEG 4000 的杂交瘤P3x63Ag8.653(ATCC CRL-1580；Kearney等.，1979)细胞融合。 融合细胞悬浮于HAT培养基(添加有次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核甙 (100×浓度；Sigma)的克隆培养基(＝RPMI 1640培养基，20％FCS，200 U/mI rhlL-6))中，以2-6×104细胞/孔的密度加入96-孔微滴定板。将 所述杂交瘤在37℃，5％CO2和相对湿度95％的条件下培养。 通过直接ELISA的方法进行融合筛选：

在96-孔微滴定板(MaxiSorb，Nunc)上进行直接ELISA，对克隆盘(融 合后约10天)中含所述抗体的培养物上清液进行筛选：

用2μg/ml含于免疫抗原的碳酸盐缓冲液，pH9.6包被所述的ELI SA 平板(100μl/孔，过夜，5℃)。吸除包被溶液，仍游离的结合位点用含 2％脱脂奶粉的PBS(w/v)封闭(200μl/孔，1h，室温)。用含0.025％Tween 20(v/v)的PBS，pH7.3洗平板两次后，初级克隆培养物上清液非稀释地 滴加到孔中(100μl/孔)，所述平板在室温下培养1-2小时。抗血清用作 阳性对照，上述培养基作为阴性对照。再次清洗后，用含于PBS中的过氧 化物酶标记的二抗(含0.1％牛血清白蛋白的兔抗鼠Ig-POD(DAkO)， 20min，室温)进行抗体结合检测。所述的过氧化物酶使无色底物四甲基联 苯胺(TMB，Sigma)变为有色复合物。清洗并敲击平板四次后，加入所述 底物溶液(含TMB+H2O2的K-Blue，Neogen或柠檬酸缓冲液，pH4.5)。 10min后加入1N硫酸终止反应。与无色的阴性培养物上清液相比，产生 抗原-特异性抗体的培养物上清液被明显着色。 建立和培养所述杂交瘤：

为获得单克隆，依照有限稀释分析的原理将阳性克隆再克隆两次 (Coller & Coller，1983)。第一次再克隆在添加了次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱 氧核苷(100×浓度；Sigma)的克隆培养基中进行，第二次再克隆在克隆培 养基中进行。通过直接ELISA的方法检测再克隆的抗原特异性。最后，最 终的克隆适应于扁瓶中的产物培养基(含5％1gG-还原型FCS的RPMI 1640 培养基)。所述细胞低温保存，生产培养物上清液用于抗体纯化。 实施例5：培养物上清液中所得抗体的鉴定

根据其对受幽门螺杆菌(H.Pylori)感染病人的粪便样品在夹心ELISA 中的良好反应性(参见表2)，从全部30个特异(产生抗免疫抗原的抗体) 中选出10个克隆。 定型

用定型试剂盒IsoStrip(Roche Diagnostics)利用所确立的克隆在 所述培养物上清液中对所述单克隆抗体定型。结果是：8种IgG1-克隆类型 和1种IgG2a-克隆类型(参见表2) Western印迹

在Western印迹中，检测了所述培养物上清液特异识别免疫抗原的能 力。每胶15μg纯化抗原在还原样品缓冲液(Laemmi，1970)中煮沸，施于 12％-SDS聚丙烯酰胺微型凝胶(8.6cm×7.7cm×0.1cm，Biometra)。 25-30mA下电泳分离后，用半干印记技术将所述蛋白(抗原)固定在硝酸 纤维素膜上。

用含2％脱脂奶粉的PBS将膜封闭(30min，室温)。用TBS/Tween 20 (0.2％)洗膜3次每次5min。为进行下述培养步骤，将上述的膜用带有34 杂交道的载网平板夹在杂交印记筛选装置中(Schleicher and Schu II)。 在形成的每一道中加入250μl TBS/Tween 20和250μl待检测的杂交瘤 培养物上清液。在室温下振荡培养2h。

在用TBS/Tween 20清洗三次后，所述的膜与连接POD的第二抗体(兔 抗鼠Ig-POD，DAKO)共同培养1h。将膜洗三次，添加3，3-二氨基联苯胺底 物溶液(DAB，Sigma)即可观察到免疫复合物。通过不溶的过氧化物酶底物 即可观察到与抗体结合的蛋白带。

在Western blot中，6个杂交瘤培养物上清液表现出相应于过氧化 氢酶(58kDa)的一条带，三个是阴性的，但其在ELISA中表现为与天然 抗原呈现阳性反应。它们可能识别构象表位.表2是上述结果的小结。 实施例6：从杂交瘤培养物上清液中纯化单克隆抗体

通过经改进的蛋白-G亲和层析(Pharmacia Biotech，1994)从无血清 杂交瘤上清液中纯化单克隆抗体。

经过滤的(0.45μm)培养物上清液直接导入蛋白G基质中。通过测定 280nm下的光密度来检测流出物或洗脱物中的蛋白。用150mM PBS，pH7.2 洗后，用0.1M甘氨酸/HCl进行洗脱直到检测剂的背景值。所述的-G基质 用0.1M甘氨酸/HCl，pH2.7再生。 实施例7：结合物的产生 将单克隆抗体与过氧化物酶(POD)偶联以应用于ELISA

所述单克隆抗体在外部与(POD)偶联。聚-POD连接物由MicroCoat (Bemned，Germany)获得，HRP(辣根过氧化物酶)-葡聚糖连接物由DAKO (Copenhagen，Denmark)获得。 单克隆抗体与生物素偶联以用于ELISA

纯化后，将所述单克隆抗体生物素酰基化以便在ELISA中用作检测抗 体。单克隆抗体与生物素和POD的偶联依本领域所公知的方法(Harlow & Lane，1988)进行。

单克隆抗体以约1-2mg/ml的浓度进行连接。偶联前，将所述抗体在 0.1M醋酸钠缓冲液，pH8.3和0.1M碳酸氢钠缓冲液，pH8.3中透析 进行再缓冲。每1mg抗体滴加50μgN-羟基琥珀酰亚胺基生物素(NHS-d- 生物素；Sigma)在DMSO中混合。将混合物在室温下培养1小时。然后生 物素酰基化的抗体通过在0.15M PBS，0.05％NaN3，pH7.5中充分透析与 非偶联的NHS-d-生物素相脱离。 将单克隆抗体与胶体金偶联以用于快速免疫学检测：

所述单克隆抗体(mab)连接到胶体金上以用于快速的免疫学检测。这 是依照标准方法(Frens，1973；Geoghegan和Ackerman，1977；Slot等.， 1985)进行的。为生产胶体金，200ml 0.01％金亚氯酸盐-(HAuCl4)-溶 液加热至沸腾，在继续加热的过程中添加2ml 1％柠檬酸钠(Na3C6H5O7)以 还原。

为将单克隆抗体偶联到胶体金上，稳定所需的大量IgG与金溶液混合， 于室温下温育15min。对偶联理想的IgG浓度和合适的pH值是针对每一 单克隆抗体分别确定的。多聚体或蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)以1％加 入到偶联制剂中以稳定金IgG结合物。通过将金IgG结合物离心从偶合制 剂中去除不与IgG偶合的金胶体和游离IgG。优选在4℃下进行储存，并将 0.05％的NaN3加入到上述金IgG连接物缓冲液中。 实施例8：纯化的单克隆抗体的鉴定： 通过表面胞质团共振光谱(SPR光谱)检测抗体-抗原相互作用

通过SPR光谱，可以测定单克隆抗体的亲和常数。这样可以找到用于 ELISA快速检测的合适抗体。 在Pharmacia BIAcore上进行表面胞质团光谱测定

所有的步骤均依照生产商的介绍在Pharmacia Biacore Processing Unit CA 186(BlAcore方法手册)上进行。

过氧化氢酶通过BlAcore CM5传感芯片的葡聚糖基质的胺偶联固定。 为激活葡聚糖基质，将45μl 1∶1-混合的0.05MN-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 和0.2M 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)溶液以5 μl/min的流速加到所述传感芯片。然后所述过氧化氢酶(35μl；50μg/ml 在10mM醋酸钠中pH5.0)结合到葡聚糖基质上。剩余的NHS酯用1M乙 醇胺(35μl)灭活。不与葡聚糖基质共价连接的过氧化氢酶通过用HCl(10 mM；15μl)使传感芯片再生而除去。

通过添加对所述过氧化氢酶-特异的单克隆抗体，它们与固定的氧化氢 酶起反应，测定了结合到检测剂上的附着物的质量。所应用的不同浓度的 抗体溶液的浓度范围在20到670nM。每种浓度的抗体均通过固定在传感 器芯片上的过氧化氢酶以25μl/min的流速注入。 结果：

抗体吸附常数(kon)和解吸常数(koff)的比值可以通过共振信号 (BlAevaluation software 3.0)的时程计算。测定了6个针对过氧化氢酶 的单克隆抗体的亲和力： 表1：过氧化氢酶单克隆抗体亲和力测定结果： 单克隆抗体 kon[M-1s-1] koff[s-1]  KD[M] HP25.2m/2H10  1.44E+05  3.90E-05  2.71E-10 HP25.6m/1G4  1.41E+05  2.52E-05  1.79E-10 HP25.6m/1B5  5.67E+04  3.86E-05  6.81E-10 HP25.6m/4E3  4.92E+04  5.96E-05  1.21E-09 HP25.6m/1A5  3.91E+04  4.77E-05  1.22E-09 HP25.6m/1H4  7.12E+04  4.12E-05  5.79E-10 KD＝koff∶kon 选择用于人粪便ELISA的抗体配对

在检测所述培养物上清液时，表现最低检测限度的抗体通过SPR表位 重叠的方法进行确定，并测定了亲和常数。检测了确定的结合(没有表位 重叠，高吸收速率常数，低解吸速率常数)的抗原在夹心粪便ELISA中的检 测限度。 实施例9：在病人的样品中筛选单克隆抗体培养物上清液(混合的多克隆 /单克隆系统)

所述的通过直接ELISA(实施例4)表现特异抗原识别的单克隆抗体作 为培养物上清液在夹心ELISA中对其病人识别和抗原检测限度进行了分 析。

作为源于内部的样品，使用粪便样品，其感染状态(0和4组)由组 织学分析和/或13C尿素呼吸检测确定其感染状态。在作为参考的检测中 组0病人显示幽门螺杆菌-阴性结果，组4病人显示幽门螺杆菌-阳性结果。

所述ELISE平板(微滴定板MaxiSorb；Nunc)用100μl of多克隆兔 抗-过氧化氢酶抗体或多克隆兔抗-幽门螺杆菌抗体在50℃下包被过夜 (pab；约20μg IgG/ml 0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.5)。为封闭游离的结 合位点，每孔滴加200μl 150mM PBS pH7.2和0.2％鱼胶(w/v)在室 温下温育30min。然后，将该ELISA平板用250μl加有0.025％Tween 20 的PBS(洗涤缓冲液1)洗两次。人粪便以1∶10(w/v)的比例悬浮于150mM 添加2％脱脂奶粉和1mM EDTA的PBS中。

为确定抗原检测限度，幽门螺杆菌-阴性的粪便样品悬液与50ng/ml过 氧化氢酶(参见实施例3)混合并用幽门螺杆菌-阴性的粪便悬液按1∶2 稀释。每孔100μl所述粪便悬液温育1h(对病人的样品进行双重检测)。 敲空所述ELISA平板，用洗涤缓冲液2(加有0.2％ Tween 20的PBS)漂洗 后再用洗涤缓冲液2洗四次。然后加入100μl杂交瘤培养物上清液(在PBS 中按1∶5的比例稀释)在室温下温育60min。通过加入过氧化物酶-连接的 第二抗体(兔抗鼠IgG-POD，DAKO)检测结合抗体。在下一步骤中所述的 过氧化物酶将加入的无色POD底物四甲基联苯胺(TMB，Sigma)转变为兰色 产物。5到10min后优选10min后通过加入1N硫酸(100μl/孔)终止 反应。通过ELISA读数仪(MWG Spektral)测定上述着色反应的强度。在 450nm下测定，以620nm，优选630nm作为参考波长。检测前加入抗体 或底物溶液，所述ELISA平板用洗涤缓冲液1洗三至四次。

确定仍可测定出的大于或等于两倍零值(不添加抗原的幽门螺杆菌- 阴性的粪便样品)的消灭值作为检测限度。

将针对幽门螺杆菌溶菌产物的多克隆捕获抗体的，敏感度为68％(在25 个阳性样品中17个被正确地检测出来)特异性为82％(17个幽门螺杆菌- 阴性的样品中，3个是假阳性)的单克隆抗体HP25.2m/2H10用于夹心 ELISA。病人对更多单克隆抗体(培养物上清液)的识别参见表3。 表2：HP25.2m/2H10：在夹心ELISA中的敏感性和特异性(捕获抗体：针 对幽门螺杆菌的单克隆抗体) 粪便样品 患者的感染状况 捕获抗体：针对 幽门HP的单克 隆抗体 检测抗体： HP25.2m/2H10( 培养物上清 液)OD450-630 评估： 截断：0.1： OD450-630＝0.1 CX0010 阳性 0.25 阳性 CX1014 阳性 0.75 阳性 CX1029 阳性 0.18 阳性 CX1038 阳性 0.09 阴性 CX1052 阳性 0.11 阳性 CX2008 阳性 0.63 阳性 CX2009 阳性 0.32 阳性 CX2016 阳性 0.07 阴性 CX2019 阳性 0.59 阳性 CX2029 阳性 0.52 阳性 CX0213 阳性 0.04 阴性 CX294-1 阳性 0.14 阳性 CX3098 阳性 0.13 阳性 CX3146 阳性 0.05 阴性 CX3148 阳性 0.08 阴性 CX3234 阳性 0.18 阳性 CX4003 阳性 0.17 阳性 CX4006 阳性 0.25 阳性 CXT001 阳性 0.23 阳性 CXT002 阳性 0.53 阳性 CXT003 阳性 0.12 阳性 CXT004 阳性 0.03 阴性 CXT005 阳性 0.03 阴性 CXT006 阳性 0.31 阳性 CXT007 阳性 0.08 阴性 CX1008 阴性 0.29 阳性 CX1031 阴性 0.08 阴性 CX1049 阴性 0.7 阳性 CX1051 阴性 0.09 阴性 CX0142 阴性 0.03 阴性 CX0185 阴性 0.03 阴性 CX0189 阴性 0.08 阴性 CX0193 阴性 0.03 阴性 CX2010 阴性 0.08 阴性 CX2018 阴性 0.09 阴性 CX0220 阴性 0.03 阴性 CX0231 阴性 0.03 阴性 CX0258 阴性 0.02 阴性 CX3008 阴性 0.09 阳性 CX3011 阴性 0.08 阴性 CX3033 阴性 0.07 阴性 CX3035 阴性 0.09 阴性 缩写：pab：多克隆抗体；HP：幽门螺杆菌(H.pylori) 表3：针对过氧化氢酶的单克隆抗体的鉴定：     融合/克隆   同型    WB   (ag)      NWG    (ng/ml)     经校正检测的粪便样             品   阳性样品   阴性样品     HP25.2m/2H10   1gG2a，K     +      1.5     17/25     14/17     HP25.6m/1G4   1gG1，K     +      1.5     4/5      2/2     HP25.6m/1B5   IgG1，K     +      3-6     3/5      2/2     HP25.6m/1H4   IgG1，K     +      3-6     2/5      2/2     HP25.6m/4E3   IgG1，K     +       6     2/5      2/2     HP25.6m/1A5   1gG1，K     +       6     2/5      2/2     HP25.6m/5E4   IgG1，K     -      1.5     1/5      2/2     HP25.6m/4A12   IgG1，K     -      1.5     1/5      2/2     HP25.6m/5F4   IgG1，K     -      1.5     1/5      2/2 缩写：ag：抗原；WB：Western blot；NWG：检测限度 结果：

表3概括了同型检测，Western印迹分析，检测限度的确定和针对病人 中过氧化氢酶的单克隆抗体检测结果。上述数据显示通过单克隆抗体检测 天然过氧化物酶的良好检测结果与病人中的良好检测并不相关。

在混合的多克隆抗体/单克隆抗体夹心ELISA系统中所述的单克隆抗 体HP25.2m/2H10表现出68％敏感性和82％的特异性。在只有单克隆的ELISA 系统中使用纯化的单克隆抗体(而非培养物上清液)其敏感性和特异性还有 望提高。在此情况下，无论是针对相同抗原表位的单克隆抗体(参见实施 例10)，还是针对同一抗原不同表位的两个不同的单克隆抗体(参见实施 例12)都可用作捕获和检测抗体。 实施例10：在人粪便中通过ELISA(单纯的单克隆抗体系统)检测幽门螺杆 菌(H.pylori)

为进行所述检测，处理来自10不同医院或肠胃诊所的病人的粪便样 品。由13C尿素呼吸检测和/或胃活组织组织学分析检测所述的幽门螺杆菌 (H.pylori)状态。所述待检测的粪便样品进行编号使实验室工作人员不 知道其感染状态。 幽门螺杆菌(H.pylori)粪便夹心ELISA(三步ELISA)

所述的ELISA平板(MaxiSorb；Nunc)用100μl单克隆抗体溶液(2.0μg HP25.2m/2H10/ml，0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.5)在37℃下包被1h。为 封闭游离的结合位点，每孔滴加200μl 150mM PBS和0.2％鱼胶(w/v) 在室温下温育30min。然后，将该ELISA平板用250μl洗涤缓冲液1(加 有0.025％Tween的PBS)洗两次。人粪便以1∶10(w/v)的比例悬浮于150 mM添加2％脱脂奶粉和1mM EDTA的PBS中。为确定抗原检测限度，将纯 化的幽门螺杆菌过氧化物酶中加入到已知浓度的来自幽门螺杆菌-阴性的 病人的粪便悬液。将上述粪便悬液在7000g下离心5分钟。每孔100μl所 述粪便悬液温育1h。敲空所述ELISA平板，用洗涤缓冲液2(加有0.2％ Tween的PBS)冲洗并洗涤四次。然后加入100μl生物素偶联的单克隆抗体 在室温下温育60min。通过加入链霉抗生物素与POD的结合物检测结合抗 体。在下一步骤中所述的POD将加入的无色底物TMB(Sigma)转变为兰色 产物。5到10min后优选10min后通过加入1N硫酸(100μl/孔)终止 反应。通过ELISA读数仪(MWG Spektral)测定上述着色反应的强度。 在455nm下测定，以620nm，优选630nm作为参考波长。                                  表4：通过ELISA用所述的单克隆抗体HP25.2m/2H10作为捕获和检测

                                  抗体在粪便中检测幽门螺杆菌(H.pylori)过氧化氢酶      病人    临床状      态   HP粪便ELISA   OD(455-630)      1001     阴性     0.069      1002     阴性     0.104      1007     阴性     0.053      1008     阴性     0.042      1010     阴性     0.043      1012     阴性     0.055      1017     阴性     0.052      1021     阴性     0.045      1022     阴性     0.068      1024     阴性     0.036      1025     阴性     0.046      1027     阴性     0.057      1030     阴性     0.061      1031     阴性     0.037      1032     阴性     0.056      1034     阴性     0.048      1035     阴性     0.033      1040     阴性     0.037      1046     阴性     0.046      2002     阴性     0.056      2006     阴性     0.032      2007     阴性     0.027      2010     阴性     0.039      2012     阴性     0.041      2013     阴性     0.049      2014     阴性     0.046      2015     阴性     0.048      2017     阴性     0.050      2018     阴性     0.061      2023     阴性     0.056      2024     阴性     0.051      2028     阴性     0.102      2033     阴性     0.050      2034     阴性     0.077      2043     阴性     0.045      3123     阴性     0.055      3213     阴性     0.119      3214     阴性     0062      3224     阴性     0048      3225     阴性     0065      3236     阴性     0 043      4004     阴性     0 089      5004     阴性     0 079      5007     阴性     0 055      5008     阴性     0 156      5009     阴性     0 076      5010     阴性     0.073      5012     阴性     0.051      5013     阴性     0.057      5017     阴性     0.064     5018     阴性     0.033     5019     阴性     0.017     5020     阴性     0.017     5021     阴性     0.019     5022     阴性     0.020     5024     阴性     0.015     5025     阴性     0.017     5027     阴性     0.022     5028     阴性     0.021     5030     阴性     0.019     5031     阴性     0.014     5033     阴性     9.018     5034     阴性     0.013     5035     阴性     0.018     5036     阴性     0.031     5040     阴性     0.024     5042     阴性     0.026     5046     阴性     0.021     5052     阴性     0.020     5056     阴性     0.523     5057     阴性     0.023     5060     阴性     0.055     5063     阴性     0.022     5064     阴性     0.017     5065     阴性     0.035     5066     阴性     0.024     5067     阴性     0 088     5068     阴性     0021     6002     阴性     0 078     6005     阴性     0019     6008     阴性     0 013     6019     阴性     0.034     7005     阴性     0.025     7006     阴性     4.556     7009     阴性     0.030     7013     阴性     9.024     8004     阴性     0.023     8047     阴性     0.021     213     阳性     0.879     294     阳性     4.097     444-1     阳性     0.201     1003     阳性     0.475     1013     阳性     4.087     1014     阳性     0.105     1015     阳性     2.469     1028     阳性     0.096     1029     阳性     4.466     1037     阳性     2.485     2001     阳性     0.083     2003     阳性     0.817     2005     阳性     1.508     2008     阳性     4.247     2009     阳性     1.597     2016     阳性     2.651     2022     阳性     0.135     2029     阳性     3.953     2032     阳性     3.400     2035     阳性     3.384     2039     阳性     0.053     2040     阳性     4.602     2041     阳性     0.200     2042     阳性     4.592     3146     阳性     1.742     6014     阳性     2.572     3149     阳性     0.989     3153     阳性     4.590     3570     阳性     4.567     3577     阳性     4.566     3215     阳性     4.540     3219     阳性     4.486     3220     阳性     4.518     3231     阳性     4.706     3234     阳性     4.567     3235     阳性     4.616     3241     阳性     3.671     3243     阳性     4.582     4003     阳性     4.700     4005     阳性     0.401     4006     阳性     4.694     4018     阳性     4.142     4019     阳性     2.366     4020     阳性     1.468     5001     阳性     4.490     5002     阳性     3.917     5003     阳性     4.321     5006     阳性     4.826     77     阳性     0.067     5011     阳性     0.071     53     阳性     4.773     70     阳性     1.084     5016     阳性     0.101     68     阳性     4.611     5069     阳性     1.079     CXT5     阳性     0.602     5072     阳性     4.151     5075     阳性     4.307     5076     阳性     4.516     CXT4     阳性     0.268     5078     阳性     1.022     6001     阳性     4.441     6004     阳性     4.296     CXT3     阳性     2.126     6018     阳性     4.656     6020     阳性     0.427     7001     阳性     2.717     CXT2     阳性     4.479     7002     阳性     4.143     7003     阳性     0.149     7004     阳性     4.543     CXT1     阳性     0.953     8026     阳性     0.025     8033     阳性     0.784     67     阳性     0.589     5029     阳性     0.675     64     阳性     1.785     58     阳性     0.304     5039     阳性     3.391     CXT13     阳性     3.785     6013     阳性     1.972     CXT12     阳性     0.157     5048     阳性     1.695     5050     阳性     0.490     CXT10     阳性     0.247     5053     阳性     4.232     5055     阳性     4.364     CXT9     阳性     2.455     5058     阳性     3.886     5059     阳性     4.450    CXT8    阳性     4.374    5061    阳性     4.032    CXT7    阳性     0.647    CXT6    阳性     4.592 幽门螺杆菌(H.pylori)ELISA(n＝1821) 幽门螺杆菌(H.pylori) 感染状态 阳性 阴性 幽门螺杆菌(H.Pylori)粪便夹心ELI SA 阳性     89     6 截断OD450-620：0.09 阴性     5     82 灵敏度：94.7％ 特异性：93.2％

表4表明通过粪便夹心ELISA的方法分析幽门螺杆菌-阴性(H. pylori-阴性)和幽门螺杆菌-阳性(H.pylori-阳性)的粪便样品的结果。 这里所述单克隆抗体，优选HP25.2m/2H10，既用作捕获抗体又用作检测抗 体(POD-标记)以检测来自粪便样品的所述的幽门螺杆菌(H.Pylori)抗 原过氧化氢酶。所述的过氧化氢酶是极为稳定的抗原，其可通过消化道而 不发生改变并可在粪便样品中检测出来。在仅基于一个过氧化氢酶-特异的 纯单克隆ELISA系统，对182个粪便样品的分析敏感性为94.7％特异性为 93.2％。这一敏感性和特异性导致高阳性和阴性预测值，使检测幽门螺杆菌 (H.pylori)感染，仅通过所述样品以高可信度的、廉价的和非侵染性的 粪便分析以确定根除治疗提供了可能。可能地，通过针对过氧化氢酶不同 抗原表位的不同单克隆抗体的结合或两种不同抗原(例如过氧化氢酶/脲 酶)检测系统的结合提高上述的敏感性和特异性。

由于一步ELISA检测的发展，与下述三步ELISA检测(实施例11和 12)相比可用性得以提高。 实施例11：在三步ELISA检测法中寻找合适的抗体配对

依照实施例10进行检测。

为寻找合适的抗体配对，针对过氧化氢酶(参见表3)的，已经纯化且 其中一些是生物素酰化的(参见实施例7)单克隆抗体进行了处理。首先 所述的单克隆抗体相互滴定以寻找用作捕获和检测抗体的理想的浓度。然 后用经优化的ELISA系统检测病人的粪便样品，确定幽门螺杆菌阴性的人 的粪便(零-粪便)中过氧化氢酶(表5)。

有关病人识别和抗原检测限度的单克隆抗体参见表5。 表5：寻找针对过氧化氢酶的单克隆抗体配对的结果(三步ELISA)                              捕获抗体 生物素酰化 的检测抗体 25.2m/2H1  0  25.6m/1B5  25.6m/1G4  25.6m/1A5  25.6m/1H4  25.6m/2H10  N：0.03  G4：7-8  G0：2  0.1  7  2  0.03  8  2  0.1  7  2  0.03  8  2  25.6m/1B5  N：0.1  G4：8  G0：2  0.1  7  1  0.1  5  2  0.03  7  2  0.3  8  2  25.6m/1G4  N：0.3  G4：6-8  G0：1-2  0.1  7  2  0.1  8  4  0.01  8  2  0.1  8  2  25.6m/1A5  N：0.3  G4：6-7  G0：2  0.1  7  2  0.3  5  2  0.1  7  2  0.3  8  2  25.6m/1H4  N：0.1  G4：8  G0：3  0.3  0.1  4-7  2  0.3  7  2  0.1  8  2 病人识别(检测8临界-阳性G4和4临床-阴性G0样品) N＝在零-粪便中所述过氧化氢酶检测限度[ng/ml] 临界阳性-阳性＝在检测中是特定的未定状态的样品 在一步ELISA中寻找合适的抗体配对

为寻找合适的抗体配对，针对过氧化氢酶(参见表9)的，已经纯化且 其中一些是生物素酰化的(参见实施例7)单克隆抗体进行了处理。

不同捕获和检测抗体的组合(参见表6)用27幽门螺杆菌-阳性和 17幽门螺杆菌-阴性的病人样品在一步ELISA中进行检测。

一步夹心ELISA

2-8℃下用100μl的mab溶液(2.0μg捕获抗体/ml碳酸盐缓冲液，0.1 M，pH9.5)包被ELISA平板(MaXiSorb Lockwell；Nunc)过夜。用PBS将如 此包被的ELISA平板洗涤两次。加入每孔200μl封闭缓冲液(0.3％BSA；在 PBS中的5％山梨醇)，并在2-8℃下温育过夜以封闭仍然游离的结合部位。 吸干ELISA平板，在循环干燥炉上于2-8℃下干燥过夜，然后与干燥剂袋 一起于28℃下储存。

将患者的粪便悬浮在样品缓冲液(150mM PBS+0.5％动物血清+1mM EDTA+0.1％去污剂)，比例为1∶5(0.1g粪便样品+500μl样品缓冲液)，持 续约30秒(Vortex)，然后在3000g下离心5分钟。向此平板施用每孔50μl 的上清液。

然后，向此粪便悬浮液中直接加入已用样品缓冲液中稀释过的50μl POD标记的抗体。该平板在振荡器上温育1小时。用洗涤缓冲液(75mM PBS， 0.25％ Tween)洗涤5次，然后将过氧化酶底物TMB(四甲基联苯胺)加到 该单组分底物(Seramun)(100μl/孔)。10分钟后，加入1N盐酸(100μl/孔) 终止酶反应。然后以630nm为参照波长在450nm下测定着色的强度。 表6：针对过氧化氢酶的单克隆抗体配对的结果(一步ELISA)                                     捕获抗体 POD标 记的 抗体 25.2m /2H10    25.6m    /1B5    25.6m    /1A5   25.6m   /4A12    25.6m    /1G4    25.6m    /1H4  25.6m /3D6   25.6m   /2E12    25.6m    /5E4 25.2m /2H10 -     24     14     24     11     22     13     23     14     24     12     19     14     24     12     22     15 25.6m /1B5 G4：23 G0：12     -     23     13     20     14     23     12     23     12     18     12     23     10     22     12 25.6m /1H4 G4：21 G0：9     24     13     24     14     -     24     11     -     20     15     25     12     24     20 25.6m /4A12 G4：20 G0：13     20     12     20     17     -     20     13     25     3     19     13     20     13     20     15 25.6m /3D6 G4：17 G0：15     24     9     24     12     21     13     23     8     23     13     -     22     9     22     14 患者识别(检测27份临界阳性G4和17份临床阴性G0样品)；截断：OD450-630nm： 0.15。

抗体组合HP25.6m/1B5(捕获抗体)和HP25.2m/2H10-POD(检测抗体)证 明是非常有利的，因为具有良好的患者识别(校正检测为24/27幽门螺杆菌 (H.pylori)阳性和14/17幽门螺杆菌(H.pylori)阴性样品)，对人粪 便中的幽门螺杆菌(H.pylori)抗原(过氧化氢酶)的强大的信号检测强度。 实施例12：通过一步ELISA法检测人粪便中的幽门螺杆菌(H.pylori)

为进行该实验，对来自10个不同医院或胃肠病诊所的患者的粪便进行 处理。通过13C尿素呼吸实验和/或胃活组织检查的组织学分析，测定幽门 螺杆菌(H.pylori)阴性或幽门螺杆菌(H.pylori)阳性的状况。 幽门螺杆菌(H.pylori)粪便夹心ELISA(一步实验)

2-8℃下用100μl HP25.6m/1B5)/ml碳酸盐缓冲液，0.1M，pH9.5)包 被ELISA平板(MaXiSorb Lockwell；Nunc)过夜。用PBS将如此包被的ELISA 平板洗涤两次。加入每孔200μl封闭缓冲液(0.3％BSA；在PBS中的20％ 山梨醇)，并在2-8℃下温育过夜以封闭仍然游离的结合部位。吸干ELISA 平板，在循环干燥炉上于28℃下干燥过夜，然后与干燥剂袋一起于2-8℃ 下储存。将患者的粪便悬浮在样品缓冲液(150mM PBS+0.5％动物血清+1 mM EDTA+0.1％去污剂)，比例为1∶5(0.1g粪便样品+500μl样品缓冲注液)， 持续约30秒(Vortex)，然后在3000g下离心5分钟。向此平板施用每孔 50μl的上清液(二倍到三倍测定)。然后，向此粪便悬浮液中直接加入已 在样品缓冲液中稀释过的50μlPOD标记的抗体HP25.2m/2H10-葡聚糖 POD)。该平板在振荡器上温育1小时。

用洗涤缓冲液(75mM PBS，0.25％Tween)洗涤5次，然后将过氧化酶底 物TMB(四甲基联苯胺)加到该单组分底物中(100μl/孔)。10分钟后，加 入1N盐酸(100μl/孔)终止酶反应。然后以630nm为参照波长，在450nm 下测定着色的强度。 表7：在总共119份粪便样品的分析中，一步ELISA实验结果与黄金标准的 比较  检测样  品编号 13C呼 吸 检测 结果 胃活组 织检测 结果 一步 ELISA检 测结果  1001  n.d. 阴性 0.033  1002  n.d. 阴性 0.022  1007  n.d. 阴性 0.015  1008  n.d. 阴性 0.032  1010  n.d. 阴性 0.016  1012  n.d. 阴性 0.026  1017  n.d. 阴性 0.026  1021  n.d. 阴性 0.014  1022  n.d. 阴性 0.018  1024  n.d. 阴性 0.018  1025  n.d. 阴性 0.022  1027  n.d. 阴性 0.044  1030  n.d. 阴性 0.021  1031  n.d. 阴性 0.014  1032  n.d. 阴性 0.014  1034  n.d. 阴性 0.023  1035  n.d. 阴性 0.068  1040  n.d. 阴性 0.058  1046  n.d. 阴性 0.023  2002  n.d. 阴性 0.019  2006  n.d. 阴性 0.017  2007 阴性 n.d. 0.019  2010 n.d. 阴性 0.070  2012 阴性 n.d. 0.040  2013 阴性 n.d. 0.040  2014 阴性 n.d. 0.016  2015 n.d. 阴性 0.027  2017 阴性 阴性 0.034  2018 阴性 阴性 0.030  2023 n.d. 阴性 0.031  2024 阴性 n.d. 0.023  2028 n.d. 阴性 0.049  2033 阴性 阴性 0.040  2034 阴性 阴性 0.083  2043 n.d. 阴性 0.083  3123 阴性 n.d. 0.013  3213 n.d. 阴性 0.035  3224 阴性 n.d. 0.014  3225 n.d. 阴性 0.025  4004 n.d. 阴性 0.044  5004 n.d. 阴性 0.045  5007 n.d. 阴性 0.014  5008 n.d. 阴性 0.015  5009 n.d. 阴性 0.028  5010 n.d. 阴性 0.058  5012 n.d. 阴性 0.030   5013   n.d.   阴性   0.031   5017   n.d.   阴性   0.027   5018   n.d.   阴性   0.033   5019   n.d.   阴性   0.010   5020   n.d.   阴性   0.192   5021   n.d.   阴性   0.023   5022   n.d.   阴性   0.017   5024   n.d.   阴性   0.011   5025   n.d.   阴性   0.015   5027   n.d.   阴性   0.026   5028   n.d.   阴性   0.020   5030   n.d.   阴性   0.033   5031   n.d.   阴性   0.013   5033   n.d.   阴性   0.014   5035   n.d.   阴性   0.028   5036   n.d.   阴性   0.022   5040   n.d.   阴性   0.024   5042   n.d.   阴性   0.053   5046   n.d.   阴性   0.018   5052   n.d.   阴性   0.015   5056   n.d.   阴性   1.919   9011   n.d.   阴性   0.647   9012   n.d.   阴性   0.026   9013   n.d.   阴性   0.022   9015   n.d.   阴性   0.032   9019   n.d.   阴性   0.040   9022   n.d.   阴性   0.029   213   n.d.   阳性   0.752   444   n.d.   阳性   0.241   1003   n.d.   阳性   0.446   1013   n.d.   阳性   3.809   1014   n.d.   阳性   0.316   1015   n.d.   阳性   2.693   1028   n.d.   阳性   0.959   1029   n.d.   阳性   4.336   1037   n.d.   阳性   2.152   2005   阳性   n.d.   1.289   2008   n.d.   阳性   3.814   2009   阳性   n.d.   1.050   2016   n.d.   阳性   1.564   2029   阳性   阳性   4.347   2032   阳性   阳性   2.661   2035   n.d.   阳性   3.632   2039   阳性   阳性   0.694   2040   n.d.   阳性   3.189   2041   阳性   阳性   1.195   2042   阳性   阳性   4.350   3146   阳性   n.d.   4.189   3219   阳性   阳性   4.267   3220   阳性   阳性   4.138   3231   阳性   阳性   4.332   3234   阳性   阳性   3.989   3241   阳性   阳性   1.580   3570   阳性   n.d.   4.147   4003   n.d.   阳性   4.140   4005   阳性   阳性   0.298   4006   n.d.   阳性   4.228   6027   n.d.   阳性   4.244   6040   n.d.   阳性   3.105   6050   n.d.   阳性   3.806   6052   n.d.   阳性   4.221   6064   n.d.   阳性   4.225   6065   n.d.   阳性   4.210   7001   n.d.   阳性   2.584   7002   n.d.   阳性   4.245   7003   n.d.   阳性   2.236   7020   n.d.   阳性   0.038   8026   n.d.   阳性   0.013   8033   n.d.   阳性   1.269   9001   n.d.   阳性   3.765   9002   n.d.   阳性   4.049   9003   n.d.   阳性   3.674   9006   n.d.   阳性   0.992   9007   n.d.   阳性   0.052   9008   n.d.   阳性   4.165   9009   n.d.   阳性   0.033   9014   n.d.   阳性   4.042   9017   n.d.   阳性   4.276   9018   n.d.   阳性   0,44   9022   n.d.   阳性   1.961   T01   阳性   n.d.   2.083   T02   阳性   n.d.   1.722   T03   阳性   阳性   3.871   T04   阳性   阳性   4.463   T05   阳性   阳性   2.368   T07   阳性   阳性   0.785   T09   阳性   n.d.   1.480   T10   阳性   n.d.   0.768   T13   n.d.   阳性   2.211   T70   阳性   n.d.   0.675   T77   阳性   n.d.   0.038   T88   阳性   n.d.   1.377

n.d.：未检测

截断：(OD450-630nm)：阳性＞0.18；阴性＜0.13   (n＝199)   一步检测     方法        黄金标准     阳性     阴性     阳性     94     3     阴性     6     96 灵敏度：94％ 特异性：97％ 结果：

表7显示了采用一步粪便夹心ELISA法检查幽门螺杆菌(H.pylori) 阴性和幽门螺杆菌(H.pylori)阳性粪便样品的结果。将单克隆抗体 (HP25.6m/1B5；HP25.2m/2H10)用于检测粪便样品中幽门螺杆菌(H.pylori) 抗原过氧化氢酶。在纯单克隆ELISA系统中对199份粪便样品进行检查， 该分析是以前述的过氧化氢酶特异性单克隆抗体为基础的，其灵敏度为 94％，而特异性为97％。 实施例13：通过优化的一步ELISA法检测人粪便中的幽门螺杆菌 (H.pylori)

为进行该实验，对来自10个不同医院或胃肠病诊所的患者的粪便进行 处理。通过胃活体组织检查的组织分析检测幽门螺杆菌(H.pylori)的状 况。这些实验在外部GLP实验室进行，其中对测试样品进行编号，以使实 验室工作人员不知道样品的感染状况。 优化的一步夹心ELISA：

2-8℃下用100μl的mab溶液(2.0μgHP25.6m/1B5)/ml碳酸盐缓冲液， 0.1M，pH9.5)包被ELISA平板(MaXiSorb Lockwell；Nunc)过夜。用PBS 将如此包被的ELISA平板洗涤两次。加入每孔200μl封闭缓冲液(0.3％BSA； 在PBS中的5％山梨醇)，并在2-8℃下温育过夜以封闭仍然游离的结合部位。 吸干ELISA平板，在循环干燥炉上于28℃下干燥过夜，然后与干燥剂袋一 起于2-8℃下储存。

将患者的粪便悬浮在样品缓冲液(150mM PBS+0.5％动物血清+1mM EDTA+0.1％去污剂)，比例为1∶5(0.1g粪便样品+500μl样品缓冲液)，持 续约30秒(Vortex)，然后在3000g下离心5分钟。向此平板施用每孔50μl 的上清液。然后，向此粪便悬浮液中直接加入已在样品缓冲液中稀释过的 50μl POD标记的抗体(200fM/ml的HP25.2m/2H10-葡聚糖POD标记)。该 平板在振荡器上温育1小时。用洗涤缓冲液(75mM PBS，0.25％ Tween)洗 涤5次，然后将过氧化酶底物TMB(四甲基联苯胺)加到该单组分底物 (Seramun)(100μl/孔)。10分钟后，加入1M硫酸(100μl/孔)终止酶反应。 然后以630nm为参照波长，在450nm下测定着色的强度。 表8：幽门螺杆菌(H.pylori)粪便夹心ELISA(优化的一步测试)

通过优化的一步ELISA，采用单克隆抗体HP25.6m/1B5；HP25.2m/2H10 检测粪便中的幽门螺杆菌(H.pylori)过氧化氢酶。    病人编      号  组织学检   测结果   HP粪便   ELISA   CX 7042   阴性   0.022   CX 12070   阴性   0.018   CX 9138   阴性   0.013   CX 12080   阴性   0.015   CX 12076   阴性   0.071   CX 7028   阴性   0.019   CX 9046   阴性   0.013   CX 12077   阴性   0.025   CX 9109   阴性   0.012   CX 9120   阴性   0.018   CX 9144   阴性   0.014   CX 12032   阴性   0.017   CX 2067   阴性   0.037   CX 8010   阴性   0.017   CX 12027   阴性   0.043   CX 12085   阴性   0.012   CX 2105   阴性   0.016   CX 9029   阴性   0.028   CX 9101   阴性   0.013   CX 9119   阴性   0.073   CX 9129   阴性   0.022   CX 9174   阴性   0.029   CX 12079   阴性   0.016   CX 12092   阴性   0.031   CX 2066   阴性   0.043   CX 5115   阴性   0.022   CX 7035   阴性   0.076   CX 9024   阴性   0.018   CX  9136   阴性   0.014   CX 12065   阴性   0.017   CX 12084   阴性   0.014   CX 2044   阴性   0.028   CX 7032   阴性   0.048   CX 8011   阴性   0.014  CX 8050   阴性   0.015  CX 9056   阴性   0.014  CX 6067   阴性   0.016  CX 9041   阴性   0.036  CX 9157   阴性   0.021  CX 12042   阴性   0.014  CX 9134   阴性   0.016  CX 9160   阴性   0.015  CX 9171   阴性   0.042  CX 9025   阴性   0.017  CX 9150   阴性   0.014  CX 2050   阴性   0.013  CX 2057   阴性   0.021  CX 9184   阴性   0.018  CX 11021   阴性   0.009  CX 7043   阴性   0.024  CX 7036   阴性   0.016  CX 7047   阴性   0.015  CX 9064   阴性   0.06  CX 8002   阴性   0.015  CX 9115   阴性   0.016  CX 9189   阴性   0.063  CX 9195   阴性   0.015  CX 12059   阴性   0.028  CX 8015   阴性   0.015  CX 9137   阴性   0.052  CX 9187   阴性   0.015  CX 9047   阴性   0.017  CX 9166   阴性   0.019  CX 12064   阴生   0.031  CX 2070   阴性   0.018  CX 6081   阴性   0.05  CX 9104   阴性   0.013  CX 9167   阴性   0.017  CX 9196   阴性   0.027  CX 9066   阴性   0.016  CX 10010   阴性   0.012  CX 9061   阴性   0.014  CX 9170   阴性   0.013  CX 11012   阴性   0.03  CX 2064   阴性   0.024  CX 5101   阴性   0.025  CX 7021   阴性   0.045  CX 9105   阴性   0.013  CX 12016   阴性   0.019  CX 6070   阴性   0.013  CX 2101   阴性   0.021  CX 8014   阴性   0.016  CX 9169   阴性   0.014  CX 12088   阴性   0.017  CX 9121   阴性   0.033  CX 9023   阴性   0.055  CX 12071   阴性   0.022  CX 10003   阴性   0.028  CX 12047   阴性   0.02  CX 9089   阴性   0.017  CX 9107   阴性   0.032  CX 2061   阴性   0.03  CX 11013   阴性   0.014  CX 9092   阴性   0.017  CX 1202{   阴性   0.049  CX 12024   阴性   0.023  CX 9125   阴性   0.019  CX 2107   阴性   0.025  CX 9039   阴性   0.032  CX 12046   阴性   0.013  CX 11024   阴性   0.053  CX 12012   阴性   0.015  CX 12040   阴性   0.028  CX 2087   阴性   0.027  CX 9028   阴性   0.018  CX 9176   阴性   0.014  CX 10007   阴性   0.019  CX 12089   阴性   0.012  CX 7048   阴性   0.041  CX 9114   阴性   0.019  CX 12019   阴性   0.028  CX 9052   阴性   0.015  CX 9181   阴性   0.014  CX 12058   阴性   0.055  CX 9030   阴性   0.023  CX 9059   阴性   0.015  CX 10005   阴性   0.028  CX 10039   阴性   0.018  CX 9190   阴性   0.015  CX 9164   阴性   0.016  CX 10044   阴性   0.023  CX 9110   阴性   0.027  CX 9127   阴性   0.018  CX 12013   阴性   0.022  CX 5105   阴性   0.017  CX 9178   阴性   0.037  CX 10024   阴性   0.015  CX 2098   阴性   0.038  CX 10008   阴性   0.015  CX 10034   阴性   0.016  CX 9162   阴性   0.513  CX 12023   阴性   0.023  CX 2091   阴性   0.225  CX 12034   阴性   0.022  CX 12039   阴性   0.019  CX 9085   阴性   0.022  CX 10029   阴性   0.03  CX 11022   阴性   0.031  CX 2073   阴性   0.035  CX 12017   阴性   0.017  CX 9141   阴性   0.024  CX 10026   阴性   0.014  CX 12003   阴性   0.038  CX 9050   阴性   0.038  CX 9086   阴性   0.017  CX 10013   阴性   0.036  CX 12062   阴性     4  CX 6063   阴性   3.537  CX 9133   阳性   0.023  CX 9188   阳性   0.017   CX 9192   阳性   0.014   CX 2048   阳性   0.548   CX 2078   阳性   0.296   CX 8009   阳性   0.695   CX 9145   阳性   1.778   CX 9076   阳性   0.09   CX 9072   阳性   0.024   CX 5148   阳性   0.213   CX 11004   阳性   0.477   CX 2093   阳性   0.271   CX 12060   阳性   1.205   CX 7053   阳性   2.436   CX 11006   阳性   0.13   CX 8001   阳性     4   CX 2100   阳性   1.539   CX 5113   阳性   0.583   CX 7029   阳性   0.155   CX 10020   阳性   1.335   CX 2099   阳性   3.403   CX 12018   阳性   0.927   CX 7037   阳性     4   CX 2083   阳性   3.896   CX 4001   阳性   0.678   CX 5125   阳性     4   CX 9130   阳性   2.499   CX 11008   阳性   3.367   CX 9194   阳性     4   CX 12028   阳性   3.671   CX 4016   阳性   2.545   CX 4013   阳性     4   CX 9135   阳性     4   CX 11001   阳性     4   CX 2106   阳性   2.71   CX 2094   阳性     4   CX 9082   阳性   1.769   CX 5123   阳性   3.773   CX 6076   阳性     4   CX 9155   阳性     4   CX 7030   阳性   3.661   CX 9128   阳性     4   CX 12035   阳性     4   CX 10023   阳性   3.426   CX 2060   阳性     4   CX 12041   阳性     4   CX 9045   阳性   1.382   CX 9096   阳性   1.653   CX 2056   阳性     4   CX 12002   阳性   2.441   CX 6061   阳性   0.018   CX 11020   阳性     4   CX 9147   阳性   3.758   CX 9078   阳性   3.686   CX 5147   阳性     4   CX 7023   阳性     4   CX 9131   阳性     4   CX 9156   阳性     4   CX 10019   阳性   13.438   CX 12026   阳性   3.941   CX 9079   阳性   3.628   CX 4023   阳性     4   CX 9031   阳性   3.273   CX 5116   阳性     4   CX 9077   阳性   3.929   CX 4012   阳性     4   CX 5106   阳性   3.648   CX 12095   阳性     4   CX 10002   阳性   3.698   CX 11005   阳性     4   CX 9093   阳性     4   CX 11014   阳性   3.465   CX 9051   阳性     4   CX 10028   阳性   3.799   CX 4017   阳性     4   CX 9182   阳性     4   CX 9099   阳性     4   CX 12022   阳性     4   CX 2079   阳性   3.884   CX 9102   阳性   3.524   CX 2076   阳性   3.593   CX 9177   阳性     4   CX 9088   阳性   2.14   CX 6072   阳性     4   CX 7038   阳性     4   CX 9123   阳性     4   CX 12074   阳性     4   CX 9055   阳性     4   CX 9036   阳性     4   CX 6078   阳性     4   CX 2069   阳性   3.778   CX 9043   阳性   3.727   CX 12050   阳性   3.516   CX 5119   阳性     4   CX 9113   阳性     4   CX 9068   阳性   3.857   CX 2092   阳性     4   CX 10050   阳性     4   CX 9053   阳性   3.874   CX 4015   阳性   3.784   CX 12075   阳性   3.717   CX 9027   阳性   3.718   CX 9080   阳性     4   CX 9098   阳性     4   CX 9112   阳性     4   CX 9175   阳性     4   CX 9063   阳性     4   CX 12020   阳性     4   CX 9158   阳性     4   CX 9198   阳性   3.874   CX 9165   阳性     4   CX 9034   阳性   3.874   CX 12055   阳性   3.754   CX 6074   阳性     4   CX 6082   阳性     4   CX 6069   阳性     4   CX 9193   阳性     4   CX 9149   阳性     4 CX 9106   阳性    4 截断：OD450-640nm：0.15 n＝357                                                                                   历史     阴性     阳性   阳性     141     6   阴性     7     203 HP粪便ELISA 灵敏度：95％    置信区间(95％)：90.5-98.1％ 灵敏度：97％    置信区间(95％)：93.9-98.0％ 结果：

表8显示了通过粪便夹心ELISA法检查幽门螺杆菌(H.pylori)阴性 和幽门螺杆菌(H.pylori)阳性粪便样品(第一次诊断)的结果。将单克 隆抗体(捕获抗体：HP25.6m/1B5；检测抗体：HP25.2m/2H10-POD)用于检测 粪便样品中幽门螺杆菌(H.pylori)抗原过氧化氢酶。在纯单克隆ELISA 系统中对粪便样品进行分析，该分析是以过氧化氢酶特异性单克隆抗体为 基础的，其灵敏度为95％，而特异性为97％。 实施例14：根除/根除控制过程

只有通过直接检测幽门螺杆菌(H.pylori)抗原而不是血清中的抗原 才可以进行根除控制，因为在感染之后，幽门螺杆菌(H.pylori)抗体在血 液中仍存在数个月。因此，与血清幽门螺杆菌(H.pylori)实验相比，所述 的夹心粪便ELISA提供了评价根除成功的可能性。图9显示了在应用奥美 拉唑(Omeprazol)，甲硝唑(Metronidazol)和克拉霉素(Clarithromycin) 之后根除治疗幽门螺杆菌(H.pylori)阳性患者的过程。在开始治疗的6 天后，在粪例中再也不能检测到幽门螺杆菌(H.pylori)抗原。 表9显示了在根除研究中HP粪便ELISA的结果。在根除治疗的4-6周后， 取粪便样品。将13C-呼吸实验用作参照实验。 根据实施例12进行这些实验(一步ELISA)。 表9：根除控制-通过一步ELISA法检测粪便的幽门螺杆菌(H.pylori)过氧 化氢酶。取样：根除治疗4-6周后。 病人编   号 13C-呼吸   检测   HP粪便   ELISA   450-630nm   131   阴性   0.024   132   阴性   0.012   138   阴性   0.024   147   阴性   0.016   148   阴性   0.014   149   阴性   0.019   151   阴性   0.018   154   阴性   0.012   155   阴性   0.011   158   阴性   0.013   159   阴性   0.023   161   阴性   0.025   165   阴性   0.013   166   阴性   0.014   167   阴性   0.183   168   阴性   0.016   172   阴性   0.015   177   阴性   0.015   180   阴性   0.146   182   阴性   0.026   187   阴性   0.014   188   阴性   0.017   194   阴性   0.020   195   阴性   0.015   199   阴性   0.013   205   阴性   0.035   206   阴性   0.020   213   阴性   0.018   215   阴性   0.014   216   阴性   0.034   217   阴性   0.014   219   阴性   0.014   223   阴性   0.086   224   阴性   0.020   227   阴性   0.139   245   阴性   0.094   246   阴性   0.120   250   阴性   0.019   251   阴性   0.042   253   阴性   0.034   255   阴性   0.033   256   阴性   0.041   270   阴性   0.053     271     阴性     0.033     275     阴性     0.040     283     阴性     0.036     284     阴性     0.018     296     阴性     0.170     303     阴性     0.064     308     阴性     0.029     310     阴性     0.025     311     阴性     0.013     312     阴性     0.049     315     阴性     0.021     318     阴性     0.037     319     阴性     0.044     320     阴性     0.057     322     阴性     0.019     324     阴性     0.017     326     阴性     0.154     327     阴性     0.016     328     阴性     0.015     329     阴性     0.266     330     阴性     0.035     331     阴性     0.013     337     阴性     0.015     338     阴性     0.051     339     阴性     0.021     350     阴性     0.037     353     阴性     0.019     356     阴性     0.023     357     阴性     0.025     358     阴性     0.057     359     阴性     0.023     360     阴性     0.073     366     阴性     0.018     367     阴性     0.018     368     阴性     0.029     369     阴性     0.028     152     阳性     0.365     156     阳性     0.264     160     阳性     3.851     162     阳性     2.021     169     阳性     0.112     179     阳性     0.573     181     阳性     2.886     186     阳性     2.084     196     阳性     0.282     220     阳性     0.905     240     阳性     2.837     252     阳性     1.606     278     阳性     3.173     300     阳性     0.840     325     阳性     3.898     334     阳性     2.946     361     阳性     0.269   161/179      9     阳性     0.263 与参照实验相比，本研究(97名患者)表现出94％的灵敏度和95％的特异性 (截断：OD450-630：0.15). 实施例14表明HP粪便ELISA不仅可以用于幽门螺杆菌(H.pylori)的第一 次诊断，而且用于根除的控制和根除过程的佐证。 实施例15：来自杂交瘤细胞系的免疫球蛋白的功能性可变区的克隆和序列 检测

根据Chomczynski(Chomczynski，1987)从产抗体杂交瘤细胞系中分离 总RNA。

然后，根据常规的方法合成相应的cDNA。

通过PCR扩增编码各个抗体的Kappa轻链和重链Fd片段(VH或CH1)的 DNA区域。使用表10中所述的寡核苷酸引物组，从单杂交瘤细胞系中分离 的cDNA作为模板。

所用的引物组导致在重链Fd片断的5′-XhoI和3′-SpeI酶切位点，和 Kappa轻链的5′-SacI和3′-XbaI酶切位点。为了PCR扩增编码重链Fd 的DNA片断，将11种不同的5′-VH引物(MVH 1-8和MULH 1-3)各自与3′-VH 引物M1gG2a[HP25.2m/2H10]组合，或与3′-VH引物MIgG1[HP25.6m/1B5] 一起使用。为了扩增编码Kappa轻链的DNA片断，将11种不同的5′-VK 引物(MUVK 1-7和MULK 1-4)各自与3′-VK引物3′MUCK组合。

在所有的PCR扩增中使用以下的温度程序：94℃下变性30秒，52℃引 物结合60秒，72℃下聚合90秒。此程序持续40个循环，然后在72℃下 进行10分钟以完成所述片断。

通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增的结果，并分离预期分子量的DNA 带。对于抗体(HP25.2m/2H10)，采用酶XhoI和SpeI(重链)或SacI和 XbaI(轻链)对分离的带进行限制消化。将所得片断在已先用限制酶Xhol 和Spel或SacI和XbaI将质粒载体Bluescript KS(Stratagene)酶切之 后，克隆至此质粒载体上。对依次制备克隆重链和轻链片断的质粒制品测 序。选择编码免疫球蛋白(VH或VL)的重链和轻链功能可变区的序列。这样， 可以精确鉴定各杂交瘤细胞系的一个功能性VH和一个功能性VL区域。图 1和图2显示了功能性VH和VL序列。VH区域的第一组4个氨基酸通过再 克隆完成。根据常规方法(Sambrook等.，1989)进行克隆和测序。

对于抗体HP25.6m/1B5，将所分离的带直接测序，并鉴定功能性轻链 和功能性重链。采用酶XhoI和SpeI(重链)或ScaI和XbaI(轻链)依 次将重链Fd片断和轻链限制酶切消化，将所得片段再克隆到已用限制酶 XhoI和SpeI和SacI和XbaI分别酶切的质粒载体pB111HisEx(Connex) 上，然后，再次对其进行测序。

这样，可以精确地鉴定该杂交瘤细胞系的一个功能性VH和一个功能性 VL区域。该功能性VH和VL序列如图3和图4所示。对于VH和VL序列， 成熟的N末端在已通过先导引物测序进行检测后进行了描述。根据常规方 法(Sambrook等.，1989)进行克隆和测序。 表10：PCR扩增免疫球蛋白重链和轻链功能可变区所用的引物列表(沿 5′-3′方向) MVH1  (GC) AG GTG CAG CTC GAG GAG TCA GGA CCT MVH2  GAG GTC CAG CTC GAG CAG TCT GGA CCT MVH3  CAG GTC CAA CTC GAG CAG CCT GGG GCT MVH4  GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGG GCA MVH5  GA(AG)  GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGA GGA MVH6  GAG GTG AAG CTT CTC GAG TCT GGA GGT MVH7  GAA GTG AAG CTC GAG GAG TCT GGG GGA MVH8  GAG GTT CAG CTC GAG CAG TCT GGA GCT MULK1 GGG GAG CTC CAC CAT GGA GAC AGA CAC ACT CCT GCT AT MULK2 GGG GAG CTC CAC CAT GGA TTT TCA AGT GCA GAT TTT CAG MULK3 GGG GAG CTC CAC CAT GGA GWC ACA KWC TCA GGT CTT TRT A MULK4   GGG GAG CTC CAC CAT GKC CCC WRC TCA GYT YCT KGT MIgG1   TAT GCA ACT AGT ACA ACC ACA ATC CCT GGG MIgG2a  GAG AGA GGG GTT CTG ACT AGT GGG CAC TCT GGG CTC MUVK1   CCA GTT CCG AGC TCG TTG TGA CTC AGG AAT CT MUVK2   CCA GTT CCG AGC TCG TGT TGA CGC AGC CGC CC MUVK3   CCA GTT CCG AGC TCG TGC TCA CCC AGT CTC CA MUVK4   CCA GTT CCG AGC TCC AGA TGA CCC AGT CTC CA MUVK5   CCA GAT GTG AGC TCG TGA TGA CCC AGA CTC CA MUVK6   CCA GAT GTG AGC TCG TCA TGA CCC AGT CTC CA MUVK7   CCA GTT CCG AGC TCG TGA TGA CAC AGT CTC CA MULH1   GGG CTC GAG CAC CAT GGR ATG SAG CTG KGT MAT SCT CTT MULH2   GGG CTC GAG CAC CAT GRA CTT CGG GYT GAG CTK GGT TTT MULH3   GGG CTC GAG CAC CAT GGC TGT CTT GGG GCT GCT CTT CT 3′MUCK GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGA A

                       参考文献 Coller & Coller，1983：ColIer，H.A.，Coller，B.S.，Meth.Enzymol. 121：412-417 Harlow & Lane，1988：Harlow，E.，Lane，D.，抗体：实验操作手册，冷 泉港实验室，纽约 Kearney等.，1979：Kearney，免疫学杂志123：1548-1550 Laemmli，1970：Laemmli，E.K.，自然，227：680-685 Peters & Baumgarten，1990：Peters，J.H.，Baumgarten，H.(editors)， Monoklonale Antiko-rper，Springer Verlag，Berlin Fa-gerstam等.，1990：Fa-gerstam，L.G.等，J.Mol.Recognit.3： 208-214 Malmqvist，1996：方法9：525-532 Eschweiler等.，1993：Eschweiler，B.，等.，Zentralbl.F.Bakt.280： 73-85 药物生物技术，1994：单克隆抗体纯化手册 Chomczynski，1987：生物化学年评162：156-159 Sambrook等.，1989：分子克隆实验手册，冷泉港实验室，纽约，第二版 Vaughan等.，1998：自然生物技术16：535-539 Orlandi等.，1989：美国国家科学院汇编86：3833-3837 Janeway & Travers，1997：免疫学，第二版Spektrum Akademischer Verlag GmbH，Heidelberg Osborne等.，1997：化学生物学现代观1：5-9 Stull和Szoka，1995：药学研究12：465-483 Frens，1973：自然生理科学241，20-23 Geoghegan和Ackerman，1977：组织化学和细胞化学杂志， 25(11)，1187-1200 Slot，1985：欧洲细胞生物化学杂志38，87-93 Manos等.，1998：螺旋杆菌3(1)，28-38 Haque，1993：传染病学杂志167：247-9 Park，1996：临床微生物学杂志34：988-990 Hasan，1994：FEMS微生物通讯120：143-148 Koopmans，1993：临床微生物学杂志31：2738-2744 Machnicka，1996：应用寄生虫学37：106-110