鞘脂的相互转换的机制和作用一直是科学研究日益增长的课题。鞘 磷脂不仅是细胞膜的构件，也是作为对细胞作用有深远影响的有效脂质 信使的前体。如下文中所述，这些脂质的受激诱导代谢精确地参与了过 度增殖性、炎症性或新生血管性疾病的生物学过程。因此，对这些代谢 途径的控制是治疗多种疾病的新方法。
神经酰胺是由鞘磷脂响应几种刺激，包括生长因子和炎症细胞因子 时进行水解所产生的。神经酰胺在癌细胞内诱导细胞凋亡。另外，神经 酰胺可以在神经酰胺酶的作用下水解而产生鞘氨醇。鞘氨醇然后被鞘氨 醇激酶磷酸化产生鞘氨醇-1-磷酸(S1P)。证据显示S1P是发挥增殖和 抗细胞凋亡作用的重要的第二信使。另外，神经酰胺增强了响应抗癌药 物，包括紫杉醇和依托泊苷的细胞凋亡。而且，神经酰胺诱导了肿瘤细 胞的凋亡但不杀死静息的正常细胞。在多种细胞系中的研究一致说明S1P 能够诱发增殖并保护细胞免于凋亡。综合起来，数据显示了神经酰胺和 S1P间的平衡决定了癌症细胞是否增殖或因细胞凋亡而死亡。因此，通 过减少增殖细胞中S1P的产生而改变这一平衡是治疗因非正常细胞增殖 导致的疾病的有效方法。
鞘氨醇激酶负责细胞中S1P的生产。编码RNA的SK在多数组织中 表达，而且在肿瘤组织中的表达水平比在相应正常组织中的高。多种增 殖因子，包括蛋白激酶C(PKC)活化剂、胎牛血清、血小板源生长因 子、表皮生长因子和肿瘤坏死因子α(TNFα)可以快速地提高细胞的SK活 性。这促进了靶细胞的增殖并抑制其细胞凋亡。另外，已经证明了SK的 致癌作用。在这些研究中，向NIH/3T3纤维原细胞中转染SK足以促进 病灶的形成，使细胞在软琼脂上生长，并使这些细胞在NOD/SCID小鼠 体内形成肿瘤。另外，通过显性失活SK突变体的转染或用非特异SK抑 制剂D-赤-N，N-二甲基鞘氨醇(DMS)处理细胞对SK的抑制阻止了由致 癌基因H-Ras诱导的转变。因为Ras的非正常活化，以及ras家族基因的 过表达和突变经常发生在癌症中，所以这些发现提示了SK在癌症中的显 著作用。
除了在调控细胞增殖和凋亡中的作用，也发现S1P对细胞介导的免 疫功能的几个重要作用。血小板、单核细胞和肥大细胞经活化而分泌S1P， 在组织受损的位点促进炎症级联反应。SK的活化是信号响应所必须的， 因为TNFα通过核因子Kappa B(NFκB)的活化而诱导粘附分子表达的能 力是被S1P模仿且被DMS阻止的。相似地，S1P模仿了TNFα诱导环氧 合酶2(COX-2)表达和前列腺素E2(PGE2)合成的能力，通过RNA干扰对 SK的敲除阻止了对TNFα的这些响应而没有阻止对S1P的这些响应。S1P 也是嗜中性粒细胞活化中Ca2+内流的诱导因子，嗜中性粒细胞活化由 TNFα和其他刺激产生并导致超氧化物和其他有毒自由基的产生。因此， 在免疫细胞和其靶组织内降低S1P的产生是治疗由非正常炎症导致的疾 病的有效方法。这些疾病的实例包括炎症性肠病、关节炎、动脉硬化、 哮喘、过敏、炎症性肾病、循环休克、多发性硬化、慢性阻塞性肺病、 皮肤炎症、牙周病、牛皮癣和T细胞介导的免疫疾病。
血管新生是指体内多种生长因子或其他刺激促进新血管形成的状 态，此过程对多种疾病的病理是关键性的。在各种情况下，过度的血管 新生使该疾病得到发展和/或对患者产生不想要的作用。因为保守的生化 机制调控了形成这些新血管的血管内皮细胞的增殖，期望能够证实抑制 这些机制的方法能够有效治疗和预防多种疾病。更特别的，已经鉴定出 可导致致病性血管新生的特定的生长因子。例如，血管内皮细胞生长因 子(VEGF)具有血管新生和促有丝分裂的能力。尤其是，VEGF诱导血 管内皮细胞增殖，且有助于新血管的形成。鞘氨醇激酶是VEGF作用的 重要的介导因子。例如，已发现SK介导了VEGF诱导的蛋白激酶活化。 还发现VEGF特异地诱导S1P受体，其与响应S1P的胞内信号增强及血 管新生作用的增强相关。通过SK产生的S1P刺激NFκB的活性而导致 COX-2和粘附分子的生产以及附加VEGF的生产，这些都促进了血管新 生。而且，SK调控了一氧化氮合成酶(eNOS)内皮细胞异构体的表达， eNOS其后也调节了血管新生。因此，在内皮细胞内降低S1P的生产似乎 是治疗因非正常血管新生造成的疾病的有效方法。这些疾病的实例包括 关节炎、癌症、牛皮癣、卡波西肉瘤、血管瘤、心肌血管新生性疾病、 动脉硬化和眼睛血管新生性疾病。
尽管对鞘脂衍生信号的兴趣很高，但对该途径内酶的抑制因子所知 甚少，而且体内SK的药理性抑制的应用目前还未得到证实。特别是，该 领域受困于缺少有效的、有选择性的SK抑制剂。至今的药理学研究已经 使用了3种化合物抑制SK活性：DMS、D，L-苏型-二氢鞘氨醇和N，N，N- 三甲基鞘氨醇。然而，这些化合物都不是SK的特异抑制剂，也抑制几种 其他的蛋白和脂质激酶。因此，仍需要改进的SK抑制剂作为抗增殖、抗 炎症和抗血管新生试剂。
发明概述
在本申请中，描述了表现出上述所需活性的全新化合物。因此，本 发明包括下述所示的通式(I)的化合物，这些化合物的合成方法，包括 该化合物的药物组合物，和在治疗或预防过度增殖性疾病、炎症性疾病 或血管新生性疾病中使用该化合物或组合物的方法，以及更为尤其的是 能够抑制SK的化合物。
一方面，本发明提供了通式I的化合物：

以及其药学可接受的盐，其中
L是键或者是-C(R3，R4)-；
X是-C(R3，R4)N(R5)-、-C(O)N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(R4，R5)-、-N(R4)-、 -O-、-S-、-C(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R4)-或-N(R4)S(O)2-；
R1是H、烷基、环烷基、环烷基烷基(cycloalkylalkyl)、烯基、炔基、 杂烷基、芳基、烷基芳基、烯基芳基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、 杂环烷基、烷基杂环烷基、酰基、芳酰基、卤素、卤代烷基、烷氧基、 卤代烷氧基、羟烷基、链烷酰基、-COOH、-OH、-SH、-S-烷基、-CN、 -NO2、-NH2、-CO2(烷基)、-OC(O)烷基、氨甲酰基、单烷基氨基氨甲酰 基或二烷基氨基氨甲酰基、单烷基氨甲酰基或二烷基氨甲酰基、单烷基 氨基或二烷基氨基、氨烷基、单烷基氨烷基或二烷基氨烷基、硫代氨甲 酰基或者单烷基硫代氨甲酰基或二烷基硫代氨甲酰基；
R2是H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、 烷基芳基、烯基芳基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、杂环烷基、烷基 杂环烷基、酰基、芳酰基、卤素、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟 烷基、链烷酰基、-COOH、-OH、-SH、-S-烷基、-CN、-NO2、-NH2，、-CO2(烷 基)、-OC(O)烷基、氨甲酰基、单烷基氨基氨甲酰基或二烷基氨基氨甲酰 基、单烷基氨甲酰基或二烷基氨甲酰基、单烷基氨基或二烷基氨基、氨 烷基、单烷基氨烷基或二烷基氨烷基、硫代氨甲酰基、单烷基硫代氨甲 酰基或二烷基硫代氨甲酰基、烷基-S-烷基、-杂芳基-芳基、-烷基-杂芳基 -芳基、-C(O)-NH-芳基、-烯基-杂芳基、-C(O)-杂芳基或-烯基-杂芳基-芳 基；
R3是H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、 烷基芳基、烯基芳基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、杂环烷基、烷基 杂环烷基、酰基、芳酰基、卤素、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟 烷基、链烷酰基、氧代(＝O)、-COOH、-OH、-SH、-S-烷基、-CN、-NO2、 -NH2，、-CO2(烷基)、-OC(O)烷基、氨甲酰基、单烷基氨基氨甲酰基或二 烷基氨基氨甲酰基、单烷基氨甲酰基或二烷基氨甲酰基、单烷基氨基或 二烷基氨基、氨烷基、单烷基氨烷基或二烷基氨烷基、硫代氨甲酰基或 者单烷基硫代氨甲酰基或二烷基硫代氨甲酰基；
其中，上述R1、R2和R3基团的烷基和环部分任选被最多5个基团 取代，所述取代基独立为(C1-C6)烷基、卤素、卤代烷基、-OC(O)(C1-C6 烷基)、-C(O)O(C1-C6烷基)、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR′C(O)R″、-CF3、 -OCF3、-OH、C1-C6烷氧基、羟烷基、-CN、-CO2H、-SH、-S-烷基、-SOR′R″、 -SO2R′、-NO2，或NR′R″，其中R′和R″独立为H或(C1-C6)烷基，其中取代 基的每一个烷基部分任选被进一步取代，其中取代基为独立选自卤素、 CN、OH和NH2中的1、2或3个基团；以及
R4和R5独立为H或烷基，条件是当R3和R4在同一个碳原子上且 R3是氧代，则R4不存在。
本发明也提供了通式I的化合物的合成方法。
本发明也提供了包括通式I的化合物或其盐，和药学可接受的载体、 溶液、佐剂或稀释剂中的至少一种的药物组合物。
本发明也提供了治疗或预防过度增殖性疾病、炎症性疾病或血管新 生性疾病的方法。
本发明也提供了抑制细胞中鞘氨醇激酶的方法。
本发明的化合物是有效的和具有选择性的SK抑制剂。因此，本发明 提供了可用做抗增殖、抗炎症和抗血管新生试剂的SK抑制剂。
通过以下特定的优选具体实施方式和权利要求的更详细表述，本发 明的特别优选的具体实施方式会更清楚。
附图说明
图1.SK抑制剂对肿瘤生长的抑制。Balb/c雌鼠皮下注射悬浮在PBS 中的JC鼠腺癌细胞。待肿瘤生长明显之后，在奇数天经口给动物灌胃 100μl PEG400(对照，空心方块)或100mg/kg化合物62(三角形)或化 合物57(圆圈)。至18天以内，测量总体重和肿瘤体积。*p＜0.05。插 图：研究期间每组小鼠的平均体重。
图2.化合物62抑制肿瘤生长的剂量响应关系。Balb/c雌鼠皮下注 射悬浮在PBS中的JC细胞。待肿瘤生长明显之后，在奇数天经口给动物 灌胃100μl PEG400(对照，空心方块)或3.5mg/kg(圆圈)、10mg/kg (倒三角形)、35mg/kg(三角形)或100mg/kg(方块)的化合物62。 至18天以内，测量总体重和肿瘤体积。
图3.化合物62对VEGF诱导的血管渗漏的作用。裸鼠腹腔内注射 DMSO(对照，空心柱)或腹腔内注射75mg/kg的化合物62(阴影线柱) 或者经口灌以100mg/kg的化合物62(实心柱)。30分钟后，静脉注射 伊凡思蓝染料，再皮下注射PBS或400ng的VEGF。对每只动物的血管 外渗区域定量。数值代表了血管渗漏区域的平均值±SD。*p＜0.01。
图4.化合物62对糖尿病大鼠的视网膜血管通透性的作用。施用链 脲霉素使大鼠患糖尿病，并45天不做任何处理。在45天到87天期间， 对照(空心柱)和糖尿病大鼠用溶剂(阴影柱)或者25mg/kg(水平阴影 线)或75mg/kg(交叉阴影线(cross-hatched bars)的化合物62处理。 在87天，测量每个动物的视网膜渗漏。数值代表了每组3-5个大鼠的平 均值±SD。
图5.化合物62对TNFα诱导的NFκB活化的抑制。由与荧光素酶 相连的TNFα响应启动子转染的纤维原细胞用指定浓度的化合物62处 理，再用TNFα处理6小时。细胞所表达荧光素酶的量通过荧光来测定。 数值代表了典型实验中一式三份样品的荧光素酶的活性的平均值±SD。
图6.化合物62对TNFα诱导的Cox-2活性的抑制。大鼠IEC6细胞 (A栏)或人内皮细胞(B栏)与作为溶剂对照的二甲基亚砜(DMSO) 温育18小时，或与存在于DMSO中的100ng TNFα/mL温育18小时、或 与含有10μg/mL化合物62的100ng TNFα/mL温育18小时。通过ELISA 定量分泌到培养基中的PGE2水平。数值代表了典型实验中一式三份样品 的平均值±SD。
图7.急性DSS-结肠炎模型中，化合物62和地泊坦对DAI的作用。 C57BL/6小鼠按如下方法处理6天：正常饮用水及每日口服施用PEG(无 DSS)，含2％DSS的饮用水及每日口服PEG(单独DSS)；含2％DSS 的饮用水及每日口服含50mg/kg化合物62的PEG(DSS+化合物62)， 或者含2％DSS的饮用水及每日口服含50mg/kg地泊坦的PEG(DSS+地 泊坦)。在指定日当天，计算每组的疾病活动指数。数值代表了每组5-6 个小鼠的平均值±SD。
图8.急性DSS-结肠炎模型中，化合物62和地泊坦对结肠长度的作 用。如图7所述实验的小鼠在第6天时处死，收集每只动物的结肠并对 其进行测量。数据代表了结肠长度的平均值±SD。
图9.急性DSS-结肠炎模型中，化合物62和地泊坦对结肠组织学分 数的作用。如图7所述实验的小鼠在第6天时处死，收集每只动物的结 肠并测定其组织学分数。数值代表了每组5-6个小鼠的平均值±SD。
图10.急性DSS-结肠炎模型中，化合物62和地泊坦对嗜中性粒细胞 浸润(infiltration)结肠的作用。测量图7所述动物结肠的髓过氧物酶活性。 数值代表了每克组织中MOP活性单位数的平均值±SD。
图11.急性DSS-结肠炎模型中，化合物62和地泊坦对结肠细胞因子 水平的作用。提取如图7所述小鼠的结肠样品并分析指定细胞因子的水 平。数值代表了每组4-5个样品中每种细胞因子的量的平均值±SD。
图12.DSS-结肠炎模型中，化合物62对动物结肠内S1P水平的作用。 提取如图7所述小鼠的结肠样品并通过LC/MS/MS分析S1P的水平。数 值代表了每组4-5个样品的平均值±SD。
图13.慢性DSS-结肠炎模型中，化合物62对DAI的作用。小鼠接受 2个循环(每个循环为7天)的DSS(第一个循环为1.5％，第二个循环 为1％)和2个循环的正常饮用水，并在28天时以DAI进行随机分组， 每组8只小鼠。小鼠再按照以下方法处理：无DSS(■)-正常饮用水及每 天口服PEG400共7天(水对照)；单独DSS(▲)-含1.5％DSS的饮用水 及每天口服PEG共7天；DSS+化合物62()-含1.5％DSS的饮用水及每 天口服化合物62(50mg/kg)共7天；DSS+地泊坦(◆)-含1.5％DSS的饮 用水及口服地泊坦(50mg/kg)。相对无DSS组，*p＜0.001。
图14.慢性DSS-结肠炎模型中，化合物62对动物结肠中S1P水平的 作用。提取如图13所述小鼠的结肠样品并通过LC/MS/MS分析S1P的水 平。数值代表了每组8个样品的平均值±SD。相对无DSS组，*p＜0.05。
图15.慢性DSS-结肠炎模型中，化合物62和地泊坦对结肠细胞因子 水平的作用。提取图13所述的小鼠的结肠样品并分析指定细胞因子的水 平。数值代表了每组8个样品的量的平均值±SD。
图16.慢性DSS-结肠炎模型中，化合物62和地泊坦对血清细胞因子 水平的作用。分析图13所述小鼠的血清中的指定细胞因子的水平。数值 代表了每组8个样品的量的平均值±SD。
图17.化合物62对小鼠CIA模型的疾病进程的作用。对雌DBA/1小 鼠注射胶原蛋白，3周后增强，其后观察其关节炎症状。一旦有疾病显示， 按以下方法处理小鼠组12天：(▲)化合物62(每周6天，每天口服100 mg/kg)；或(■)载体(以同样时间表施用PEG400)。在治疗的指定日 期，测定平均临床分数(A)和平均后足直径(B)。相对PEG400单独组，*p ≤0.05。
图18.佐剂诱发的关节炎模型中，化合物62对大鼠疾病进程的作用。雄 Lewis大鼠皮下注射乳酪分枝杆菌，2周后出现免疫反应的症状。有反应的 大鼠随机分成治疗组(每组n＝8)，每两天接受的口服剂量是：单独溶剂 (0.375％Tween-80)；100mg/kg的化合物62(ABC294640)；35mg/kg的化合 物62；或者5mg/kg的化合物62，或腹腔内注射吲哚美辛(5mg/kg)。每只动 物的疾病严重程度通过测量后足厚度来定量。A栏是后足关节炎反应的时间 进程。B栏是结束当日(第10天)后足厚度的测量值。C栏是第10天时， 相对非关节炎大鼠(首次)，各组的足厚度变化。相对溶剂单独组，*，p＜0.05； ***，p＜0.001。
优选具体实施方式的描述
为所有目的，本文中所有引用的专利和文章都通过引用的方式并入 本文。
除非取代基明确定义为是针对某具体通式的取代基，否则应该理解 一个具体通式具有其所引用的在前通式的取代基。
如上文所述，本发明提供了通式I的化合物：

以及其药学可接受的盐，其中：
L是键或者是-C(R3，R4)-；
X是-C(R3，R4)N(R5)-、-C(O)N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(R4，R5)-、-N(R4)-、 -O-、-S-、-C(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R4)-或-N(R4)S(O)2-；
R1是H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、 烷基芳基、烯基芳基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、杂环烷基、烷基 杂环烷基、酰基、芳酰基、卤素、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟 烷基、链烷酰基、-COOH、-OH、-SH、-S-烷基、-CN、-NO2、-NH2、-CO2(烷 基)、-OC(O)烷基、氨甲酰基、单烷基氨基氨甲酰基或二烷基氨基氨甲酰 基、单烷基氨甲酰基或二烷基氨甲酰基、单烷基氨基或二烷基氨基、氨 烷基、单烷基氨烷基或二烷基氨烷基、硫代氨甲酰基或者单烷基硫代氨 甲酰基或二烷基硫代氨甲酰基；
R2是H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、 烷基芳基、烯基芳基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、杂环烷基、烷基 杂环烷基、酰基、芳酰基、卤素、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟 烷基、链烷酰基、-COOH、-OH、-SH、-S-烷基、-CN、-NO2、-NH2，、-CO2(烷 基)、-OC(O)烷基、氨甲酰基、单烷基氨基氨甲酰基或二烷基氨基氨甲酰 基、单烷基氨甲酰基或二烷基氨甲酰基、单烷基氨基或二烷基氨基、氨 烷基、单烷基氨烷基或二烷基氨烷基、硫代氨甲酰基、单烷基硫代氨甲 酰基或二烷基硫代氨甲酰基、烷基-S-烷基、-杂芳基-芳基、-烷基-杂芳基 -芳基、-C(O)-NH-芳基、-烯基-杂芳基、-C(O)-杂芳基或-烯基-杂芳基-芳 基；
R3是H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、 烷基芳基、烯基芳基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、杂环烷基、烷基 杂环烷基、酰基、芳酰基、卤素、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟 烷基、链烷酰基、氧代(＝O)、-COOH、-OH、-SH、-S-烷基、-CN、-NO2、 -NH2，、-CO2(烷基)、-OC(O)烷基、氨甲酰基、单烷基氨基氨甲酰基或二 烷基氨基氨甲酰基、单烷基氨甲酰基或二烷基氨甲酰基、单烷基氨基或 二烷基氨基、氨烷基、单烷基氨烷基或二烷基氨烷基、硫代氨甲酰基或 者单烷基硫代氨甲酰基或二烷基硫代氨甲酰基；
其中，上述R1、R2和R3基团各自的烷基和环部分任选被最多5个 基团取代，所述取代基独立为(C1-C6)烷基、卤素、卤代烷基、-OC(O)(C1-C6 烷基)、-C(O)O(C1-C6烷基)、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR′C(O)R″、-CF3、 -OCF3、-OH、C1-C6烷氧基、羟烷基、-CN、-CO2H、-SH、-S-烷基、-SOR′R″、 -SO2R′、-NO2，或NR′R″，其中R′和R″独立为H或(C1-C6)烷基，其中取代 基的每一个烷基部分任选被进一步取代，其中取代基为独立选自卤素、 CN、OH和NH2中的1、2或3个基团；以及
R4和R5独立为H或烷基，条件是当R3和R4在同一个碳原子上且 R3是氧代，则R4不存在。
通式I的优选化合物包括其中L是键的化合物。
通式I的优选化合物也包括其中L是键并且X是-C(R3R4)-的化合物。 更优选地，R3和R4形成氧代(＝O)基团。
通式I的优选化合物也包括其中R1是H的化合物。
通式I的优选化合物也包括其中R1是任选取代的芳基的化合物。优 选地，芳基是苯基。更优选地，苯基是非取代的或被卤素取代。优选的 卤素取代基是Cl和F。
通式I的优选化合物进一步包括其中R2是OH的化合物。
通式I的优选化合物进一步包括其中R2为C1-C6烷基，更优选为C1-C3 烷基，再更优选为CH3的化合物。
通式I的优选化合物进一步包括其中R2是烯基芳基的化合物。优选 地，烯基芳基的芳基部分是苯基或萘基，任选被卤素、氰基或羟基中的1 个或2个取代。
通式I的优选化合物进一步包括其中R2是烯基-杂芳基的化合物。
通式I的优选化合物进一步包括其中R2是烯基-杂芳基-芳基的化合 物。
通式I的优选化合物包括通式I-1的化合物：

以及其药学可接受的盐，其中：
L是键或者是-C(R3，R4)-；
X是-C(R3，R4)N(R5)-、-C(O)N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(R4，R5)-、-N(R4)-、 -O-、-S-、-C(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R4)-或-N(R4)S(O)2-；
R1是H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、 烷基芳基、烯基芳基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、杂环烷基、烷基 杂环烷基、酰基、芳酰基、卤素、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟 烷基、链烷酰基、-COOH、-OH、-SH、-S-烷基、-CN、-NO2、-NH2、-CO2(烷 基)、-OC(O)烷基、氨甲酰基、单烷基氨基氨甲酰基或二烷基氨基氨甲酰 基、单烷基氨甲酰基或二烷基氨甲酰基、单烷基氨基或二烷基氨基、氨 烷基、单烷基氨烷基或二烷基氨烷基、硫代氨甲酰基或者单烷基硫代氨 甲酰基或二烷基硫代氨甲酰基；和
R2是H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、 烷基芳基、烯基芳基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、杂环烷基、烷基 杂环烷基、酰基、芳酰基、卤素、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟 烷基、链烷酰基、-COOH、-OH、-SH、-S-烷基、-CN、-NO2、-NH2，、-CO2(烷 基)、-OC(O)烷基、氨甲酰基、单烷基氨基氨甲酰基或二烷基氨基氨甲酰 基、单烷基氨甲酰基或二烷基氨甲酰基、单烷基氨基或二烷基氨基、氨 烷基、单烷基氨烷基或二烷基氨烷基、硫代氨甲酰基、单烷基硫代氨甲 酰基或二烷基硫代氨甲酰基、烷基-S-烷基、-杂芳基-芳基、-烷基-杂芳基 -芳基、-NH-芳基、-烯基-杂芳基、杂芳基、-NH-烷基、-NH-环烷基或- 烯基-杂芳基-芳基，
其中，上述R1和R2基团各自的烷基和环部分任选被最多5个基团取 代，所述取代基独立为(C1-C6)烷基、卤素、卤代烷基、-OC(O)(C1-C6烷 基)、-C(O)O(C1-C6烷基)、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR′C(O)R″、-CF3、 -OCF3、-OH、C1-C6烷氧基、羟烷基、-CN、-CO2H、-SH、-S-烷基、-SOR′R″、 -SO2R′、-NO2，或NR′R″，其中R′和R″独立为H或(C1-C6)烷基，其中取代 基的每一个烷基部分任选被进一步取代，其中取代基为独立选自卤素、 CN、OH和NH2中的1、2或3个基团。
通式I的优选化合物包括通式II的化合物：

以及其药学可接受的盐，其中：
Y是-C(R4，R5)-、-N(R4)-、-O-或-C(O)-；
R1是H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、 烷基芳基、烯基芳基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、杂环烷基、烷基 杂环烷基、酰基、芳酰基、卤素、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟 烷基、链烷酰基、-COOH、-OH、-SH、-S-烷基、-CN、-NO2、-NH2、-CO2(烷 基)、-OC(O)烷基、氨甲酰基、单烷基氨基氨甲酰基或二烷基氨基氨甲酰 基、单烷基氨甲酰基或二烷基氨甲酰基、单烷基氨基或二烷基氨基、氨 烷基、单烷基氨烷基或二烷基氨烷基、硫代氨甲酰基或者单烷基硫代氨 甲酰基或二烷基硫代氨甲酰基；
R2是H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、 烷基芳基、烯基芳基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、杂环烷基、烷基 杂环烷基、酰基、芳酰基、卤素、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟 烷基、链烷酰基、-COOH、-OH、-SH、-S-烷基、-CN、-NO2、-NH2，、-CO2(烷 基)、-OC(O)烷基、氨甲酰基、单烷基氨基氨甲酰基或二烷基氨基氨甲酰 基、单烷基氨甲酰基或二烷基氨甲酰基、单烷基氨基或二烷基氨基、氨 烷基、单烷基氨烷基或二烷基氨烷基、硫代氨甲酰基、单烷基硫代氨甲 酰基或二烷基硫代氨甲酰基、烷基-S-烷基、-杂芳基-芳基、-烷基-杂芳基 -芳基、-C(O)-NH-芳基、-烯基-杂芳基、-C(O)-杂芳基或-烯基-杂芳基-芳 基；
R3是H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、 烷基芳基、烯基芳基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、杂环烷基、烷基 杂环烷基、酰基、芳酰基、卤素、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟 烷基、链烷酰基、氧代(＝O)、-COOH、-OH、-SH、-S-烷基、-CN、-NO2、 -NH2，、-CO2(烷基)、-OC(O)烷基、氨甲酰基、单烷基氨基氨甲酰基或二 烷基氨基氨甲酰基、单烷基氨甲酰基或二烷基氨甲酰基、单烷基氨基或 二烷基氨基、氨烷基、单烷基氨烷基或二烷基氨烷基、硫代氨甲酰基或 者单烷基硫代氨甲酰基或二烷基硫代氨甲酰基；
其中，上述R1、R2和R3基团各自的烷基和环部分任选被最多5个 基团取代，所述取代基独立为(C1-C6)烷基、卤素、卤代烷基、-OC(O)(C1-C6 烷基)、-C(O)O(C1-C6烷基)、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR′C(O)R″、-CF3、 -OCF3、-OH、C1-C6烷氧基、羟烷基、-CN、-CO2H、-SH、-S-烷基、-SOR′R″、 -SO2R′、-NO2，或NR′R″，其中R′和R″独立为H或(C1-C6)烷基，其中取代 基的每一个烷基部分任选被进一步取代，其中取代基为独立选自卤素、 CN、OH和NH2中的1、2或3个基团；以及
R4和R5独立为H或烷基。
更优选的通式II的化合物包括下述化合物，其中：
Y是-C(R4，R5)-、-N(R4)-、-O-或-C(O)-；
R1是H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、 烷基芳基、烯基芳基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、杂环烷基、烷基 杂环烷基、酰基、芳酰基、卤素、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟 烷基、链烷酰基、-COOH、-OH、-SH、-S-烷基、-CN、-NO2、-NH2、-CO2(烷 基)、-OC(O)烷基、氨甲酰基、单烷基氨基氨甲酰基或二烷基氨基氨甲酰 基、单烷基氨甲酰基或二烷基氨甲酰基、单烷基氨基或二烷基氨基、氨 烷基、单烷基氨烷基或二烷基氨烷基、硫代氨甲酰基或者单烷基硫代氨 甲酰基或二烷基硫代氨甲酰基；
R2是H、烷基、环烷基、环烷基烷基、烯基、炔基、杂烷基、芳基、 烷基芳基、烯基芳基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、杂环烷基、烷基 杂环烷基、酰基、芳酰基、卤素、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、羟 烷基、链烷酰基、-COOH、-OH、-SH、-S-烷基、-CN、-NO2、-NH2，、-CO2(烷 基)、-OC(O)烷基、氨甲酰基、单烷基氨基氨甲酰基或二烷基氨基氨甲酰 基、单烷基氨甲酰基或二烷基氨甲酰基、单烷基氨基或二烷基氨基、氨 烷基、单烷基氨烷基或二烷基氨烷基、硫代氨甲酰基、单烷基硫代氨甲 酰基或二烷基硫代氨甲酰基、烷基-S-烷基、-杂芳基-芳基、-烷基-杂芳基 -芳基、-C(O)-NH-芳基、-烯基-杂芳基、-C(O)-杂芳基或-烯基-杂芳基-芳 基；
其中，上述R1和R2基团各自的烷基和环部分任选被最多5个基团取 代，所述取代基独立为(C1-C6)烷基、卤素、卤代烷基、-OC(O)(C1-C6烷 基)、-C(O)O(C1-C6烷基)、-CONR4R5、-OC(O)NR4R5、-NR4C(O)R5、-CF3、 -OCF3、-OH、C1-C6烷氧基、羟烷基、-CN、-CO2H、-SH、-S-烷基、-SOR4R5、 -SO2R4R5、-NO2，或NR4R5，其中取代基的每一个烷基部分任选被进一步 取代，其中取代基为独立地选自卤素、CN、OH和NH2中的1、2或3基 团；
R3是H、烷基、或氧代(＝O)；以及
R4和R5是独立的H或(C1-C6)烷基。
通式II的更优选的化合物包括其中Y是-NH-的化合物。
通式II的优选化合物包括其中R3是氧代的化合物。
通式II的优选化合物包括其中R3是甲基的化合物。
通式II的优选化合物包括其中R1是H的化合物。
通式II的优选化合物进一步包括其中R1是任选取代的芳基的化合 物。优选地，该芳基是苯基，其为非取代的或被1个或2个卤素取代。 优选地，卤素是氯或氟。
通式II的优选化合物也包括其中R2是烷基或环烷基的化合物。
通式II的优选化合物也包括其中R2是芳基或-烷基芳基的化合物。 两组中的优选芳基是苯基。烷基芳基中的优选烷基是直链或支链的C1-C3 烷基。芳基基团可以是非取代的或是取代的。优选的取代基包括独立地 选自卤素、羟基、烷基、氰烷基、氨烷基、硫代烷氧基、三氟甲基、卤 代烷氧基、芳氧基和烷氧基中的1、2、3、4或5(优选1或2)个基团。
通式II的优选化合物也包括其中R2是杂环烷基或-烷基-杂环烷基- 的化合物。两组中的杂环烷基优选为哌啶基、哌嗪基、哌咯烷基和吗啉 基。杂环烷基可以是非取代的或取代的。优选的取代基包括独立地选自 卤素、羟基、烷基、氰烷基、氨烷基、硫代烷氧基、三氟甲基、卤代烷 氧基、芳氧基、氧基和烷氧基中的1、2、3、4或5(优选1或2)个基 团。
通式II的优选化合物也包括其中R2是杂芳基或-烷基-杂芳基-的化合 物。两组中的杂芳基优选是吡啶基、咪唑基、吲哚基、咔唑基、噻唑基、 苯并噻唑基、苯并噁唑基、嘌呤基和噻嗯基。杂芳基基团可以是非取代 的或取代的。优选的取代基包括独立地选自卤素、羟基、烷基、氰烷基、 氨烷基、硫代烷氧基、三氟甲基、卤代烷氧基、芳氧基和烷氧基中的1、 2、3、4或5(优选1或2)个基团。
本发明也提供了治疗患有如下疾病或病症的患者，或者预防患者罹 患如下疾病或病症的方法，所述疾病或病症选自由过度增殖性疾病、炎 症性疾病或血管新生性疾病构成的组，该方法包括对需要该治疗或预防 的患者施用治疗有效量的通式I化合物或其药学可接受的盐、或者施用 治疗有效量的通式II化合物或其药学可接受的盐。
本发明化合物可有效治疗或预防的过度增殖性疾病优选是癌症，作 为其非限制性实例的包括如实体瘤，例如头颈癌、肺癌、胃肠道癌、乳 腺癌、妇科癌、睾丸癌、尿道癌、神经癌、内分泌癌、皮肤癌、肉瘤、 纵隔癌、腹膜后癌、心血管癌、肥大细胞增多症、癌肉瘤、圆柱瘤、牙 癌、嗅神经母细胞瘤、脐尿管癌、Merkel细胞癌和副神经节瘤，以及造 血细胞癌例如霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性白血病、急性白血 病、骨髓增生性癌、浆细胞恶性增生和骨髓增生异常综合症。以上所列 疾病用于示例，而没有穷举或用于限制。
其他能够用本发明化合物治疗或预防的优选疾病包括炎症性疾病， 其中例如是炎症性肠病、关节炎、动脉硬化、哮喘、过敏、炎症性肾病、 循环休克、多发性硬化、慢性阻塞性肺病、皮肤炎症、牙周病、牛皮癣 和T细胞介导的免疫疾病，包括过敏性脑脊髓炎、过敏性神经炎、同种 异体移植排斥反应、移植物抗宿主病、心肌炎、甲状腺炎、肾炎、系统 性红斑狼疮和胰岛素依赖型糖尿病。
其他能够用本发明化合物治疗或预防的优选疾病包括血管新生性疾 病，例如糖尿病视网膜病变、关节炎、牛皮癣、卡波西肉瘤、血管瘤、 心肌血管新生性疾病、动脉粥样硬化斑块血管新生性疾病和眼睛血管新 生性疾病，例如脉络膜血管新生性疾病、早产儿视网膜病变(晶体后纤 维增生症)、黄斑退化、角膜移植物排斥反应、虹膜红变、新生儿血管 性青光眼(neuroscular glaucoma)和奥斯特韦伯综合症。
本发明进一步提供了鞘氨醇激酶抑制剂的制备方法。在一个具体实 施方式中，该方法包括将下述通式的前体化合物：

在足以产生下述通式的化合物的条件下与通式为H2N-R2的化合物接 触：

其中：
R1和R2如上文所定义。
该方法进一步包括将如上所示金刚烷基酰胺通过将其与Zn(BH4)2接 触，还原成金刚烷基胺。
在另一个具体实施方式中，鞘氨醇激酶抑制剂的制备方法包括将下 述通式的前体化合物：

在足以产生下述通式的化合物的条件下与通式为R2-Br或R2C(O)Cl的
化合物接触，：
或
其中：
R1、R2和R3如上文所定义。
在另一个具体实施方式中，该方法包括将下述通式的前体化合物：

在足以产生下述通式的化合物的条件下与通式为H2N-R2或R2C(O)Cl 的化合物接触：
或
其中：
R1、R2和R3如上文所定义。
本发明也提供了药物组合物，其包括作为活性组分的通式I的化合 物或其药学可接受的盐，或者通式II的化合物或其药学可接受的盐，以 及药学可接受的载体、介质或助剂。
本发明的药物组合物可制备成多种施用形式的制剂，包括片剂、囊 形片、丸剂或锭剂，或可将其填充入合适的容器内，如胶囊，或者瓶(是 悬浮液时)。在本文中使用的“药学可接受的载体介质”包括任何所有 适用于特定所需剂型的溶剂、稀释剂或其他液体载体；分散或悬浮助剂； 表面活性剂；防腐剂；固体粘结剂；润滑剂和类似物。制备药物组合物 所使用的各种媒介和载体(vehicles/carriers)及其已知的制备技术可见 Remington’s Pharmaceutical Sciences(Osol et al.eds.，15th ed.，Mack Publishing Co.：Easton，PA，1975)。除了与本发明化合物不相容的传统载 体介质以外，例如其会产生任何不需要的生物学作用或与药物组合物中 的任何其他成分以其他有害的方式相互作用，载体介质的使用根据预期 包括在本发明的范围之内。
在本发明的药物组合物中，活性试剂的量占组合物总重量(包括载 体介质或助剂)为至少1wt％并且不多于99wt％。优选地，组合物中活性 试剂的比例为组合物重量的1wt％-70wt％。适于肠内或肠外施用的药用的 有机或无机固体载体介质或有机或无机液体载体介质可用于制备该组合 物。明胶、乳糖、淀粉、镁、硬脂酸盐、滑石粉、植物和动物脂肪和油、 胶质聚烷撑二醇或其他已知的药用的赋形剂或稀释剂适合作为载体介 质。
本发明的药物组合物可以通过任何能够有效治疗患有如下疾病或病 症的患者，或者预防患者罹患如下疾病或病症的施用方式对患者施用有 效治疗患有如下疾病或病症的患者，或者预防患者罹患如下疾病或病症 的本发明的药物组合物的任何量，所述疾病或病症选自由过度增殖性疾 病、炎症性疾病或血管新生性疾病构成的组。这样，本文所用的表述“治 疗有效量”是指针对靶细胞提供活性试剂所需作用的足够用量。所需的 精确用量随着不同的受试者而变化，其依赖于受试者的种系、年龄和一 般状况；特定的SK抑制剂；其施用方式等。
本发明的药物组合物优选制成易于施用和剂量一致的单位剂型。在 本文中使用的“单位剂型”是指适用于待治疗动物的治疗试剂的物理存 在的独立单元。每剂量应当包括计算出的单独或与所选药学载体介质一 起作用使产生所需治疗作用的活性物质的量。一般来说，药物组合物以 含大约0.1mg至大约10,000mg，优选大约1mg至大约1000mg该物质的 单位剂型施用。
本发明的药物组合物可口服或非肠道施用，例如通过肌肉注射、腹 腔内注射或静脉输注。药物组合物的口服或非肠道施用的剂量水平是每 天相对动物体重的大约0.1mg/kg至大约1000mg/kg，优选大约1mg/kg至 100mg/kg，一天一次或多次，从而获得所需的治疗作用。
尽管本发明的药物组合物可对任何能受益于该组合物的治疗作用的 受试者施用，但该试剂特别用于人类疾病的治疗。
本发明的药物组合物一般每天施用1-4次以递送本文描述的日剂量。 另外，这些范围内的剂量可以在较长的时间内(通常是1-96小时)通过恒 量输液进行给药，直到获得所需的治疗效果。然而，本文描述的化合物 和药物组合物精确的施用规则依赖于接受治疗的动物的需要，所施用的 治疗类型和主治医师的判断。
在特定的情况下，本发明的化合物包括一个或多个不对称碳原子， 因此该化合物能够以不同的立体异构体形式存在。这些化合物可以，例 如是外消旋体、手性非外消旋体或非对映异构体。在这些情况下，单对 映异构体，即光学活性形式，可通过不对称合成或拆分外消旋体而获得。 外消旋体的拆分可通过例如传统方法，如拆分试剂存在下进行结晶；色 谱，例如使用手性HPLC柱；或使用拆分溶剂衍生外消旋体混合物产生 非对映异构体，通过色谱分离非对映异构体，再去除拆分试剂产生光学 富集形式的原始化合物。可以重复上述任意工序以提高化合物的光学纯 度。
当本文描述的化合物包括烯烃双键或其他几何不对称中心时，除非 另有说明，意旨该化合物包括顺式、反式、Z-和E-构型。相似地，也包 括所有的互变异构体形式。
本发明化合物的无毒药学可接受的盐包括，但不局限于无机酸盐， 所述无机酸例如是盐酸、硫酸、磷酸、焦磷酸、氢溴酸和硝酸，或者有 机酸，所述有机酸例如是蚁酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸、反丁烯二酸、 酒石酸、琥珀酸、醋酸、乳酸、甲磺酸、p-甲苯磺酸、2-羟乙基磺酸、水 杨酸和硬脂酸。相似地，药学可接受的阳离子包括，但不局限于钠、钾、 钙、铝、锂和铵。本领域技术人员可识别大量无毒药学可接受的加成盐。 本发明也包括本发明化合物的前体药物。
本发明也包括本发明化合物的前体药物。本领域技术人员可以识别 多种合成方法，这些合成方法可用于制备无毒药学可接受的加成盐和本 发明所包括的化合物的前体药物。
本发明提供了通式I和II的化合物，其是SK的抑制剂，可有效调节 鞘磷脂的信号转导途径，用于治疗和预防过度增殖性疾病，炎症性疾病 和血管新生性疾病。本领域的技术人员可以只根据对化合物的化学结构 的知识制备本发明的化合物。制备本发明化合物的化学知识是本领域技 术人员已知的。事实上，制备本发明化合物的方法有许多。可从本文或 本领域中查阅具体实例的制备方法。
如上所讨论，鞘脂对调控细胞增殖和凋亡的平衡十分重要。鞘氨醇 -1-磷酸由SK酶生产，并刺激了肿瘤细胞的增殖。SK作用和由其导致的 神经酰胺的耗尽一起阻止了细胞凋亡。本发明的化合物是人SK的抑制 剂。因此，本发明对SK活性的抑制可以减弱肿瘤细胞增殖并促进细胞凋 亡。因此，本发明的化合物有效作为抗癌试剂。而且，细胞增殖是动脉 硬化和牛皮癣发展所必须的过程，所以本发明的化合物，作为SK抑制剂， 可用于治疗这些及其他过度增殖性疾病。另外，特定种类的白细胞的不 适当活化和/或增殖导致慢性炎症和自身免疫疾病。从而，本发明的化合 物也可以用于治疗这些疾病。另外，不适当的血管新生导致如下所述的 多种疾病。从而，本发明的化合物也可以用于治疗这些疾病。
定义
以下定义和解释用于贯穿本文所使用的术语，其中包括说明书和权 利要求。
应当注意，除非文中另有清楚指明，说明书和所附权利要求中使用 的单数形式“一”、“一个”和“这个”都包括复数对象。因此，例如， 组合物包括“一个化合物”包括两个或多个化合物的混合。应当注意， 除非文中另有清楚指明，术语“或”通常使用的意思都包括“和/或”。
符号“-”一般代表链上两个原子之间的键。  因此 CH3-O-CH2-CH(Ri)-CH3代表2-取代-1-甲氧基丙烷化合物。另外，符号“-” 代表取代基与化合物连接的位点。这样，例如芳基(C1-C6)烷基-是指一种 烷基芳基基团，例如苄基，其通过烷基与化合物连接。
当表示多个取代基连接到某一结构上时，应当理解这些取代基可以 相同或不同。例如″Rm被任选取代，取代基为1、2或3个Rq基团″是指 Rm被1、2或3个Rq基团取代，其中Rq基团可以相同或不同。
短语“任选取代”可与短语“取代或非取代”交换使用。除非另有 指明，任选取代基团可在该基团每一个可取代的位置具有取代基，且每 一个取代基彼此独立。
在本文中使用的术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
术语“杂原子”是指氮、氧或硫并包括氮和硫的任何氧化形式，以 及任何碱性氮的季铵形式。术语“氮”也包括杂环中可取代的氮。例如 在具有0-3个选自氮、氧或硫的杂原子的饱和或部分非饱和环中，氮可 以是N(如在3，4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或NR+ (如在N-取代的吡咯烷基中)。
在本文中单独或作为较大基团的一部分的术语“烷基”是指饱和的 脂肪烃，其包括直链、支链或环(也称作“环烷基”)基团。烷基基团 的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁 基、戊基、己基、庚基、3-乙基丁基及类似物。优选地，烷基基团具有 1-20个碳原子(本文中所指的数字范围，如“1-20”，其意思都是指该 基团，例如此情况的烷基基团，可包括1个碳原子、2个碳原子、3个碳 原子等等，最大并包括20个碳原子)。更优选的是具有1-10个碳原子 的中等大小的烷基。最优选的是具有1-4个碳原子的低级烷基。环烷基 可以是单环或多环稠合系统。环烷基基团的实例包括环丙基、环丁基、 环戊基、环己基、环庚基、环辛基和金刚烷基。烷基或环烷基基团可以 是非取代的或被1、2、3个或更多的取代基取代。这样的取代基的实例 包括但不局限于：卤素、羟基、氨基、烷氧基、烷氨基、二烷氨基、环 烷基、芳基、芳氧基、芳基烷氧基、杂环基和(杂环)氧基。实例包括 氟甲基、羟乙基、2，3-二羟乙基、(2-或3-呋喃基)甲基、环丙基甲基、 苄氧乙基、(3-吡啶基)甲基、(2-噻吩基)乙基、羟丙基、氨基环己基、 2-二甲氨基丁基、甲氧基甲基、N-吡啶乙基和二乙氨基乙基。
在本文中单独或作为较大基团中的一部术语“环烷基烷基”是指通 过如上文所述的烷基基团连接到母分子基团的C3-C10环烷基基团。环烷 基烷基基团的实例包括环丙基甲基和环戊基乙基。
在本文中单独或作为较大基团中的一部分的术语“烯基”是指具有 至少1个碳-碳双键的脂肪族烃，其包括具有至少一个碳-碳双键的直链、 支链或环状基团。优选地，烯基基团具有2-20个碳原子。更优选的是具 有1-10个碳原子的中等大小的烯基。最优选的是具有2-6个碳原子的更 小的烯基。烯基基团可以是非取代的，或者被1、2、3个或更多的取代 基取代。这样的取代基的实例包括但不局限于卤素、羟基、氨基、烷氧 基、烷氨基、二烷氨基、环烷基、芳基、芳氧基、芳基烷氧基、杂环基 和(杂环基)氧基。如果有取代基的话，根据双键和取代基的位置，双 键的几何学结构可以是对(E)或同(Z)，顺式或反式。烯基基团的实 例包括乙烯基、丙烯基、顺-2-丁烯基、反-2-丁烯基和2-羟基-2-丙烯基。
在本文中单独或作为较大基团中的一部分的术语“炔基”是指具有 至少1个碳-碳三键的脂肪族碳氢化合物，其包括具有至少一个碳-碳三键 的直链、支链或环状基团。优选地，炔基基团具有2-20个碳原子。更优 选的是具有2-10个碳原子的中等大小的炔基。最优选的是具有2-6个碳 原子的低级炔基。炔基基团可以是非取代的，或者被1、2、3个或更多 的取代基取代。这样的取代基的实例包括但不局限于卤素、羟基、氨基、 烷氧基、烷氨基、二烷氨基、环烷基、芳基、芳氧基、芳基烷氧基、杂 环基和(杂环基)氧基。炔基基团的实例包括乙炔基、丙炔基、2-丁烯 基和2-羟基-2-丁炔基。
在本文中单独或作为较大基团中的一部分的术语“烷氧基”代表通 过氧桥连接到母分子基团的烷基基团，其具有指定数目的碳原子。烷氧 基基团的实例如甲氧基、乙氧基、丙氧基和异丙氧基。烷氧基基团可以 进一步被1个或多个卤素原子取代，例如氟、氯或溴，从而产生“卤代 烷氧基”基团。这样的基团的实例包括氟甲氧基、氯甲氧基、三氟甲氧 基和氟乙氧基。
在本文中单独或作为较大基团中的一部分的术语“芳基”是指包含 至少一个芳香环的芳香烃环系统。芳香环可任选稠合或连接到其他芳香 烃环或非芳香烃环。另外，芳基基团可以是取代的或非取代的，取代基 团可以是氢、卤素、羟基、烷基、卤代烷基、烷氧基、硝基、氰基、烷 氨基、羧基或烷氧羰基。芳基基团的实例包括如苯基、萘基、1，2，3，4-四 氢萘、苯并二恶唑和联苯基。非取代的芳基基团的优选实例包括苯基和 联苯基。芳基基团的优选的取代基包括氢、卤素、烷基、卤代烷基、羟 基和烷氧基。
在本文中单独或作为较大基团中的一部分的术语“杂烷基”是指如 本文定义的烷基基团，其中基团中的碳原子被一个或多个杂原子取代。 这样的杂烷基基团使用术语乙醚、硫醚、胺及类似物来交替地指代。
在本文中单独或作为较大基团中的一部分的术语“杂环基”是指饱 和的、部分非饱和的和非饱和的含杂原子的环形基团，其中杂原子可选 自氮、硫和氧。所述的杂环基基团可以是非取代的或者在环系统内的一 个或多个原子上被取代。杂环可以包括一个或多个氧代基团。
在本文中单独或作为较大基团中的一部分的术语“杂环烷基”是指 含有至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的非芳香环系统。杂环烷基环可 任选稠合或与其他杂环烷基环和/或非芳香烃环连接。优选的杂环烷基基 团具有3-7元环。杂环烷基基团的实例包括，例如哌嗪、吗啉、哌啶、 四氢呋喃、吡咯烷和吡唑。优选的单环杂环烷基基团包括哌啶基、哌嗪 基、吗啉基、吡咯烷基、硫代吗啉基、噻唑烷基、1，3-二氧戊环基 (1，3-dioxolanyl)、1，4-二噁烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩、四氢噻喃基 (tetrahydrothiopyranyl)和类似物。杂环烷基基团也可以是部分取代的。这 样的基团的实例包括二氢噻吩基、二氢吡喃基、二氢呋喃基和二氢噻唑 基。
在本文中单独或作为较大基团中的一部分的术语“杂芳基”是指含 有至少一个选自氮、氧和硫的杂原子的芳香环系统。杂芳基环可以是稠 合的或与一个或多个杂芳基环、芳香或非芳香烃环或者杂环烷基环连接。 另外，杂芳基基团可以是非取代的或者在环系统内的一个或多个原子上 被取代，或含有一个或多个氧代基团。杂芳基基团的实例包括，例如吡 啶、呋喃、噻吩、咔唑和嘧啶。杂芳基基团的优选实例包括噻吩基、苯 丙噻吩基、吡啶基、喹啉基、吡嗪基、嘧啶基、咪唑基、苯并咪唑基、 呋喃基、苯并呋喃基、噻唑基、苯并噻唑基、异恶唑基、恶二唑基、异 噻唑基、苯并异噻唑基、三唑基、四唑基、吡咯基、吲哚基、吡唑基、 苯并吡唑基、嘌呤基、苯并恶唑基和咔唑基。
术语“酰基”是H-C(O)-或烷基-C(O)-基团，其中直链、支链或环状 烷基基团如前所述。酰基基团的实例包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、2- 甲基丙酰基、丁酰基和己酰基。
术语“芳酰基”是芳基-C(O)-基团，其中芳酰基如前所述。实例性的 芳酰基基团包括苯甲酰基和1-、2-萘甲酰基。
术语“溶剂化物”意思是本发明的化合物与一个或多个溶剂分子的 物理缔合。这种物理缔合涉及不同程度的离子和共价键，其中包括氢键。 在某些情况下，例如当一个或多个溶剂分子并合到结晶固体的晶格内时， 溶剂化物能够分离。“溶剂化物”包括溶液相和可分离的溶剂化物。实 例性的溶剂化物包括乙醇化物、甲醇化物及类似物。“水合物”是其中 溶剂分子为H2O的溶剂化物。
分子式相同但原子连接的性质或次序或者原子的空间排列不同的化 合物称为“异构体”。原子空间排列不同的异构体称为“立体异构体”。 相互不是镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，而相互为不重叠镜 像的立体异构体称为“对映异构体”。当化合物具有不对称中心，例如 连接到4个不同基团的碳原子，则可能形成一对对映异构体。对映异构 体可通过其不对称中心的绝对构型，根据本领域技术人员已知的Cahn和 Prelog的R-和S-次序规则来表示。另外，对映异构体可通过化合物溶液 旋转偏振光平面的方式来表示，分别称为右旋或左旋(即，(+)或(-)异构 体)。手性化合物可以单独的对映异构体或其混合物的形式存在。包含 等比例对映异构体的混合物称为“外消旋混合物”。
本发明的化合物可具有一个或多个非对称中心；因此这样的化合物 可以制成单独的(R)-或(S)-立体异构体或其混合物。除非另有说明，本说 明书和权利要求包括单独的对映异构体及其混合物、外消旋混合物等。
本发明的某些化合物可表现出互变异构现象和/或结构同分异构的现 象。例如，本文所述的某些化合物可采用碳-碳双键的E或Z构象，或者 它们可以是E和Z的混合物。本发明包括任何互变异构体或结构同分异 构体及其混合物。
除非另有说明，本文描述的结构也包括不同之处仅在于存在一个或 多个同位素富集的原子的化合物。例如，具有所述结构但其中的氢被氘 或氚替代，或其中的碳被13C-或14C-富集的碳取代的化合物也包括在本 发明的范围内。这样的化合物可用作例如生物分析中的分析工具或探针。
在本文中使用的“SK相关疾病”、“SK导致的疾病”和“非正常 SK活性”都是指不适当的状态，即低于或更常见的高于SK催化活性的 状态。不适当的催化活性可导致以下几种结果中的一种：(1)正常情况 下不表达SK的细胞的SK表达，(2)SK催化活性的增加导致出现不需 要的细胞过程，例如，不限于此的细胞增殖、细胞调节、抗细胞凋亡和/ 或分化。该SK表达的改变可通过增加SK的表达和/或SK的突变而进行， 从而使其催化活性得到增强，(3)SK催化活性的降低导致细胞过程的 不需要的下降。SK相关的疾病的实例在本申请的其他地方有描述，但不 局限于此。
术语“方法”是指完成既定任务的方式、手段、技术和程序，其包 括但不局限于化学、药学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知 的或容易从已知的方式、手段、技术和程序开发的方式、手段、技术和 程序。
术语“调节”是指SK催化活性的改变。尤其是，调节是指SK催化 活性的活化，或优选SK催化活性的抑制，这依赖于暴露于SK的化合物 或盐的浓度。
在本文中使用的术语“催化活性”是指在SK的影响下鞘氨醇磷酸化 的速率。
在本文中使用的术语“接触”是指将本发明的化合物与SK放置在一 起，由此使该化合物能够直接地，即通过与SK本身相互作用，或者间接 地，即通过改变SK的胞内定位影响SK催化活性。这样的“接触”可以 在体外完成，即在试管、培养皿或类似物中。在试管中，接触可只涉及 化合物和SK或者涉及整个细胞。细胞可在细胞培养皿中维持或生长并在 该环境中与化合物接触。在本文中，在化合物应用在更复杂的活有机体 内前可对特定化合物影响SK相关疾病的能力进行测定。对有机体外的细 胞，已有多种本领域技术人员已知的方法使该化合物与SK接触且，其包 括但不局限于直接的细胞显微注射和许多促进化合物穿过生物膜的运动 的技术。
在本文中使用的术语“体外”是指在人工环境下进行的程序，所述 的人工环境例如是试管中或细胞培养系统中，但不局限于此。技术人员 能够认识到，例如分离的SK酶可以在体外环境下与调节剂接触。另外， 分离的细胞可以在体外环境下与调节剂接触。
在本文中使用的术语“体内”是指在活体体内完成的程序，所述活 的有机体例如是人、小鼠、大鼠、兔、牛、马、猪、犬、猫或灵长类， 但不局限于此。
在本文中使用的术语“IC50”或“50％抑制浓度”是指将生物学过程 降低50％的化合物浓度。这些过程包括但不局限于酶促反应，即SK催化 活性的抑制，或者细胞特性，即细胞增殖、凋亡或S1P的细胞生产。
在本文中使用的“给药”或“施用”是指向为了预防或治疗SK相关 疾病的有机体内递送本发明的化合物或盐或者包含本发明化合物或盐的 药物组合物。
在本文中使用的术语“预防”是指防止有机体罹患SK相关疾病的方 法。
在本文中使用的术语“治疗”是指减轻或消除SK介导疾病和/或其 相关症状的方法。
术语“有机体”是指任何包括至少一个细胞的活的个体。活体(活 的有机体)可以如单细胞原核生物般简单，或者如哺乳动物般复杂。在 本发明的一个优选方面中，该有机体是哺乳动物。在本发明的一个特别 优选方面中，哺乳动物是人类。
“药物组合物”是指本文所述的一种或几种化合物，或其药学可接 受的盐与其他化学成分，如生理可接受的载体和赋形剂的混合物。药物 组合物的目的是便于对有机体施用化合物。
术语“药学可接受的盐”是指保持母体化合物生物效力的盐。这种 盐包括：(1)酸加成盐，其可通过母体化合物的自由碱与无机酸，例如 盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、硫酸和高氯酸及类似物，或者与有机酸， 例如醋酸、草酸、(D)或(L)苹果酸、马来酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺 酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸及类似物的反应获得， 其中优选的是盐酸或(L)-苹果酸；或者(2)当母体化合物中的酸性部分 被金属离子如碱金属离子、碱土离子或铝离子替换，或者与有机碱如乙 醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡萄糖胺以及类似物配 位所形成的盐。
在本文中使用的术语“生理可接受载体”是指对有机体不引起显著 刺激也不消除所施用的化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。通常， 这些包括了患者出于药理学/毒理学方面的考虑，以及制药化学家出于组 合物、制剂、稳定性、患者接受度和生物利用度的物理/化学方面的考虑 认为是可以接受的特性和/或物质。
“赋形剂”是指添加到药物组合物中从而进一步有助于化合物的施 用的惰性物质。赋形剂的实例包括但不局限于：碳酸钙、磷酸钙、多种 糖和多种淀粉、纤维素衍生物(包括微晶纤维素)、明胶、植物油、聚 乙二醇、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂以及类似物。
在本文中使用的术语“治疗有效量”是指有效降低或缓解所治疗疾 病中的至少一种症状，或者降低或延迟该疾病中的一种或多种临床标记 物或症状的发生而施用的化合物的量。对于癌症的治疗，治疗有效量是 指具有如下效果的量：(1)缩减肿瘤体积，(2)抑制，即一定程度上 减缓，优选地停止肿瘤的迁移，(3)抑制，即一定程度上减缓，优选地 停止肿瘤的生长，和/或(4)一定程度上减轻，优选地消除与癌症相关的 一种或多种症状。
本发明的化合物也可作为前体药物使用。术语“前体药物”是指在 体内转化为母体药物的试剂。前体药物经常是有用的，因为在一些情况 下，它们比母体药物更容易施用。例如它们可通过口服施用而具有生物 利用度，而母体药物则没有。前体药物相对母体药物在药物组合物中还 可具有更高的溶解性。前体药物的实例可以是但不局限于以酯(“前体 药物”)、氨基甲酸酯或脲的形式施用的本发明化合物。
本发明的化合物也可在有机体，例如人类体内被酶代谢，从而产生可以 调节SK活性的代谢物。这样的代谢物在本发明的范围内。
适应症
鞘氨醇激酶(SK)，其催化活性被本发明的化合物和组合物所调节， 是多种疾病中非正常活化的信号通路中的关键酶。以下讨论概述了SK在 过度增殖性、炎症性和血管新生性疾病中的作用，且最后提供了本发明 化合物和组合物的应用实例。这些化合物和组合物在预防和/或治疗SK 非正常活化的其他疾病中的应用也在本发明的范围内。
过度增殖性疾病
本发明涉及用于治疗和/或预防过度增殖性疾病的化合物、药物组合 物和方法。更特别地，本发明涉及抑制SK酶活性以治疗和/或预防过度 增殖性疾病，例如癌症、牛皮癣、系膜细胞增殖性疾病(mesangial cell proliferative disorders)、动脉硬化和再狭窄的化合物和药物组合物。以下 讨论说明了SK在这几种过度增殖性疾病中的作用。因为以上所列疾病中 涉及同样的过程，所以本发明的化合物、药物组合物和方法可用于治疗 和/或多种疾病。
鞘氨醇-1-磷酸和神经酰胺在癌细胞增殖和凋亡中具有相反的作用。 鞘磷脂不仅是细胞膜的构件，也是作为对细胞作用有深远影响的有效脂 质信使的前体。被刺激物诱导的这些脂质的代谢在肿瘤细胞生物学中很 重要。从而，这些代谢途径为抗癌药物的开发提供了令人振奋的靶标。
神经酰胺是鞘磷脂在响应生长因子或其他刺激时进行水解而产生 的。神经酰胺诱发肿瘤细胞内的细胞凋亡，但也可以通过神经酰胺酶的 作用进一步水解而产生鞘氨醇。鞘氨醇随后迅速被SK磷酸化而产生S1P， S1P是实施增殖和抗细胞凋亡行为的一个关键的第二信使。例如，向小 鼠卵细胞内显微注射S1P会诱发DNA的合成。另外，S1P有效地抑制与 降低与半胱天冬酶活性相关的神经酰胺诱导的细胞凋亡。而且，神经酰 胺增强了响应抗癌药物如紫杉醇和依托泊苷的细胞凋亡。这些在多种细 胞系中进行的研究显示S1P能够诱发增殖并保护细胞免受神经酰胺所诱 导的细胞凋亡。
假定一个关键的平衡，其可被称为神经酰胺/S1P变阻器(rheostat)， 以决定细胞的命运。在此模型中，神经酰胺和S1P细胞浓度之间的平衡 决定了细胞是否增殖或者产生凋亡。一旦暴露于有丝分裂原或胞内肿瘤 蛋白，细胞就经历到胞内S1P水平的快速升高和神经酰胺水平的损耗。 这一情况促进了细胞存活和增殖。相对地，在缺少神经酰胺和/或SK活 化的情况下鞘磷脂酶的活化导致了神经酰胺的积累和随后的细胞凋亡。
SK是细胞内负责S1P生产的酶。在大多数组织中检测到编码RNA 的SK。包括PKC活化剂、胎牛血清和血小板源生长因子(Olivera et al.， 1993，Nature 365：557)、EGF和TNFα(Dressler et al.，1992，Science 255： 1715)在内的许多增殖因子迅速地提高细胞SK活性。ERK对SK的磷酸 化提高SK活性(Pitson et al.，2003，EMBO J 22：5491)，其中S1P通过 Ras-Raf-Mek-Erk途径促进了信号转导、建立了细胞增殖的放大级联。
鞘氨醇激酶和S1P在癌细胞发病机制中起到重要作用。已经证明了 SK的致癌作用。在这些研究中，向NIH/3T3纤维原细胞中转染SK足以 促进病灶的形成和细胞在软琼脂上的生长，并使这些细胞在NOD/SCID 小鼠体内形成肿瘤(Xia et al.，2000，Curr Biol 10：1527)。另外，通过显性 失活SK突变体的转染或用非特异SK抑制剂DMS处理细胞阻止了由致 癌基因H-Ras介导的转变。因为Ras的非正常活化经常在癌症中发生， 这些发现提示了SK在癌症中的显著作用。SK也与MCF-7细胞中的雌激 素信号和依赖雌激素的肿瘤发生相关(Nava et al.，2002，Exp Cell Res 281： 115)。过度增殖性疾病与SK活性相联系的其他途径和靶标包括通过Ras 和MAP激酶途径的VEGF信号(Shu et al.，2002，Mol Cell Biol 22：7758)、 蛋白激酶C(Nakade et al.，2003，Biochim Biophys Acta 1635：104)、TNFα (Vann et al.，2002，J Biol Chem 277：12649)、干细胞核因子-1和视黄酸受 体α、胞内钙和级联活化。尽管对S1P下游靶标的确定仍然是细胞生物 学中的有趣课题，但已经有关于这些途径的充足验证说明可开发SK抑制 剂使其成为新型的抗增殖药物。
细胞增殖是许多疾病的特征，其中包括但不局限于癌症、牛皮癣、 系膜细胞增殖疾病、动脉硬化和再狭窄。因此，本发明的化合物、药物 组合物和方法可用于预防和/或治疗癌症，其中包括实体瘤、造血细胞癌 和肿瘤转移。这样的癌症包括但不局限于：实体瘤如头颈癌、肺癌、胃 肠道癌、乳腺癌、妇科癌、睾丸癌、尿道癌、神经癌、内分泌癌、皮肤 癌、肉瘤、纵隔癌、腹膜后癌、心血管癌、肥大细胞增多症、癌肉瘤、 圆柱瘤、牙癌、神经母细胞、脐尿管癌、Merkel细胞癌和副神经节瘤。 另外，这样的癌症也包括但不局限于造血细胞癌例如霍奇金淋巴瘤、非 霍奇金淋巴瘤、慢性白血病、急性白血病、骨髓增生性癌、浆细胞恶性 增生和骨髓增生异常综合症。
牛皮癣是一种常见的慢性毁容性(disfiguring)皮肤疾病，其特征为清 晰的、红色、硬的鳞片状斑块，这些斑块可以是局部的或者是广泛分布 的。尽管该疾病极少致命，但其严重破坏了患者的生活质量，并且因为 缺乏有效的治疗手段而进一步复杂化。因此很需要应对该情况的有效和 安全的药物。牛皮癣的特征是局部角化细胞增殖、T细胞调节的炎症及 局部血管新生。在所有这些过程中出现了SK的非正常活性。因此，希望 SK抑制剂可用于牛皮癣的治疗。系膜细胞增殖性疾病是指肾脏中系膜细 胞非正常增殖产生的疾病。系膜细胞增殖性疾病包括多种人类肾脏疾病 如肾小球肾炎、糖尿病肾病和恶性肾硬化，以及如血栓性微血管病变综 合症、移植排斥和肾小球疾病(glomerulopathies)。由于系膜细胞的增殖是 被生长因子诱发的，而生长因子的活性依赖于通过SK而提高的信号，因 此期望本发明的SK抑制化合物、药物组合物和方法能够在这些系膜细胞 增殖性疾病的治疗中应用。除了以下讨论的炎症性过程，动脉硬化和再 狭窄的特征是位于损伤处的血管平滑肌细胞的增殖。由于血管平滑肌细 胞的增殖是被生长因子诱发的，而生长因子的活性依赖于通过SK而提高 的信号，因此期望本发明的SK抑制化合物、药物组合物和方法能用于治 疗这些血管疾病。
炎症性疾病
本发明也涉及用于治疗和/或预防炎症性疾病的化合物、药物组合物 和方法。更特别的，本发明涉及抑制SK酶活性来治疗和/或预防炎症性 疾病的化合物和药物组合物，这些炎症性疾病例如是炎症性肠病、关节 炎、动脉硬化、哮喘、过敏、炎症性肾病、循环休克、多发性硬化、慢 性阻塞性肺病、皮肤炎症、牙周病、牛皮癣和T细胞介导的免疫疾病， 包括过敏性脑脊髓炎、过敏性神经炎、同种异体移植排斥反应、移植物 抗宿主病、心肌炎、甲状腺炎、肾炎、系统性红斑狼疮和胰岛素依赖型 糖尿病。以下的讨论显示了SK在这些炎症性疾病中的作用。由于上述疾 病中包括相同的过程，因此本发明的化合物、药物组合物和方法可用于 治疗和/或预防多种疾病。
炎症性肠病(IBD)包括一组以下肠道(lower intestine)的病理性炎症 为特征的疾病。克隆氏病和溃疡性结肠炎是最广为人知的IBD，尽管对 其拟议的机制暗示了传染性免疫学诱导因子的参与，但它们的病因仍有 待阐明，所以它们被归类到“特发性”IBD。能够模拟人体内所观察到的 的临床和免疫病理疾病的几种动物模型的发展大大推进了对IBD病因和 治疗的研究。这些模型的研究清楚地说明：IBD的完整表现依赖于人和 细胞免疫反应之间的协同作用。已经认识到免疫细胞和细胞因子在IBD 的发病机制中具有关键作用；然而其发生的分子机制仍然不清楚。如下 讨论到在患IBD的肠道中促进炎症的细胞因子都活化了共同的介导因 子——鞘氨醇激酶(SK)。最突出的是，发现肿瘤坏死因子α(TNFα)在IBD 中具有显著的作用，这样直接针对此细胞因子的抗体治疗，即Remicade 是有前途的治疗方法。TNFα激活了几种有助于IBD的过程，并且是起 始并维持Th1响应所必须的。例如，已发现TNFα通过诱发核因子kappa B(NFκB)而起作用，TNFα参与了促炎症酶类一氧化氮合成酶(NOS)和氧 化酶-2(COX-2)的增加。已发现COX-2通过其产生的前列腺素在IBDs炎 症中起到关键作用，NOS产生的一氧化氮介导的氧化压力加重了IBD的 炎症。
IBDs中免疫活化的常见途径是肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞和多 形核嗜中性粒细胞的局部内流，从而导致了炎症过程的二次放大，并产 生了这些疾病的临床表现。这导致了IBD患者的回肠和结肠的粘膜内肥 大细胞数量的显著升高，而这伴随着TNFα的明显增加(He，2004，World J Gastroenterology 10(3)：309)。其他的肥大细胞分泌物，包括组胺和类胰 蛋白酶，在IBDs中很重要。因此，炎症级联反应在IBDs病理中明显具 有关键作用。
鞘脂相互转换的机制和作用已经是科学研究中的增长课题。鞘磷脂 不仅是细胞膜的构件，也是高效生物活性脂质神经酰胺和鞘氨醇-1-磷酸 (SIP)的前体。神经酰胺：S1P变阻器被认为决定了细胞的命运，因此神 经酰胺和S1P的相对细胞浓度决定了细胞是否增殖或进行细胞凋亡。神 经酰胺通过鞘磷脂响应炎症压力，包括TNFα时进行水解而产生，并且 可以被神经酰胺酶水解产生鞘氨醇。鞘氨醇然后快速被鞘氨醇激酶(SK) 磷酸化而产生S1P。神经酰胺酶和SK也被细胞因子和生长因子活化，导 致了S1P胞内水平的迅速升高以及神经酰胺水平的迅速损耗。此情况促 进了细胞增殖并抑制了细胞凋亡。吞噬细胞的凋亡失调是IBDs的慢性炎 症状态中的重要部分，已经发现S1P保护了嗜中性粒细胞使其免于响应 Fas、TNFα和神经酰胺而产生的细胞凋亡。相似地，S1P也阻止了巨噬 细胞的细胞凋亡。
除了其在调控细胞增殖和凋亡中的作用，也发现了S1P介导细胞免 疫功能的几个重要作用。血小板、单核细胞和肥大细胞经活化而分泌S1P， 在组织受损的位点促进炎症级联反应。SK的活化是信号响应所必须的， 因为TNFα通过NFκB的活化而诱发粘附分子表达的能力是被S1P模仿且 被SK抑制剂二甲基鞘氨醇阻止的(Xia et al.，1998，Proc Natl Acad Sci U S A 95：14196)。相似地，S1P模仿了TNFα诱导COX-2表达和PGE2合成 的能力，而且通过RNA干扰对SK的敲除阻止了对TNFα的这些反应而 没有阻止对S1P的这些反应(Pettus et al.，2003，FASEB J 17：1411)。S1P 也是嗜中性粒细胞活化中Ca2+内流的介导因子，嗜中性粒细胞活化由 TNFα和其他刺激产生并导致超氧化物和其他有毒自由基的产生 (Mackinnon，2002，Journal of Immunology 169(11)：6394)。
鞘脂代谢物在IBDs病理中作用的模型涉及在结肠上皮细胞和招募 肥大细胞、巨噬细胞及嗜中性粒细胞中的多个事件的组合。在该疾病的 早期，免疫反应或其他活化信号促进了炎症性细胞因子的释放，尤其是 TNFα从巨噬细胞和肥大细胞的释放。TNFα的活性通过其对S1P生产的 活化而被介导。例如TNFα通过对鞘磷脂酶、神经酰胺酶和SK的活化诱 导内皮细胞(Xia et al.，1998，Proc Natl Acad Sci U S A95：14196)、嗜中性 粒细胞(Niwa et al.，2000，Life Sci 66：245)以及单核细胞内S1P的生产。 S1P是此途径中的中心作用体，因为其对粘膜上皮细胞、巨噬细胞、肥 大细胞和嗜中性粒细胞具有多效作用。在粘膜细胞内，S1P活化了NFκB 从而诱发了粘附分子的表达，活化了COX-2而导致了PGE2的合成，以 及活化了NOS而产生一氧化氮。这些趋化因子和粘附分子一起促进了嗜 中性粒细胞浸润入粘膜。同时，S1P活化了嗜中性粒细胞从而导致了氧 自由基的释放，并进一步使上皮组织发炎而破坏上皮组织。相似地，S1P 促进了肥大细胞的活化和脱粒。
由于IBDs中涉及的过程是被细胞因子和生长因子诱发的，而细胞因 子和生长因子的作用依赖于通过SK而提高的信号，因此期望本发明的 SK抑制化合物、药物组合物和方法可用于治疗IBDs。
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性、系统疾病，其特征是滑膜增生、 大量细胞浸润、软骨和骨的腐蚀以及非正常免疫反应。能够模拟人体内 观察到的临床和免疫病理疾病的几种动物模型的发展推进了对类风湿性 关节炎病因和治疗的研究。这些模型的研究清楚地说明：RA的完整表现 依赖于人和细胞免疫反应之间的协同作用。已经认识到免疫细胞，尤其 是嗜中性粒细胞和细胞因子在关节炎的发病机制中具有关键作用；然而 其发生的分子机制仍然不清楚。
类风湿炎症的早期阶段的特征是白细胞，尤其是嗜中性粒细胞浸润 入组织。对RA来说，此种情况主要发生在关节，此处白细胞浸润导致 了滑膜炎和滑膜增厚而产生的发热、发红、肿胀和疼痛的典型症状。随 着疾病的发展，异常积累的细胞侵入并损坏了关节内的软骨和骨从而导 致了畸形和慢性疼痛。炎症细胞因子TNFα、IL-1β和IL-8作为这种浸润 过程中的关键介导因子起作用，它们存在于RA患者的滑膜液中。粘附 分子、细胞因子和趋化因子的整合作用导致白细胞集中到炎症患处。在 兔的脂多糖诱发关节炎中，TNFα和IL-1β在炎症起始阶段的产生与白细 胞浸润的时间过程同步。嗜中性粒细胞粘附到血管内皮层是细胞溢出进 入间质的第一步。此过程被选择素、整合素和内皮粘附分子，例如ICAM-1 和VCAM-1诱导。因为TNFα诱导了ICAM-1和VCAM-1的表达，并在 关节炎关节中呈现高浓度，所以似乎此蛋白在关节炎疾病的发病机制中 起到中心作用。此观点得到了抗-TNFα治疗，例如Remicade的临床活性 的支持。白细胞粘附到内皮层后，白细胞沿趋化浓度梯度迁移。RA发展 中的另一个关键过程是通过血管新生增强对粘膜血液的供应。促炎症细 胞因子(包括TNFα)有效地诱发关键的血管新生因子VEGF的表达。这些 数据一起指出了TNFα、白细胞、白细胞粘附分子、白细胞趋化因子和血 管新生在关节炎损伤的发病机制中的重要作用。
在该疾病的早期，免疫反应或其他活化信号促进了炎症细胞因子的 释放，尤其是TNFα和IL-1β从巨噬细胞和肥大细胞的释放。神经酰胺是 由鞘磷脂在响应炎症压力(包括TNFα和IL-1β)时进行水解所产生的 (Dressler et al.，1992，Science 255：1715)。神经酰胺进一步被神经酰胺酶 水解产生鞘氨醇，鞘氨醇然后迅速被SK磷酸化而产生S1P。神经酰胺酶 和SK也被细胞因子和生长因子活化，导致了S1P胞内水平的迅速升高 以及神经酰胺水平的迅速损耗。此情况促进了细胞增殖并抑制了细胞凋 亡。吞噬细胞的凋亡失调是关节炎的慢性炎症状态中的重要部分，已经 发现S1P保护了嗜中性粒细胞使其免于响应Fas、TNFα和神经酰胺而产 生的细胞凋亡。相似地，S1P也阻止了巨噬细胞的细胞凋亡。
S1P除了在调控细胞增殖和凋亡中的作用，其还是该途径中的中心 作用体，因为其对内皮细胞、白细胞、软骨细胞和滑膜细胞具有多效作 用。在内皮细胞内，S1P活化了NFκB从而诱发了多种粘附分子并活化 COX-2而导致了PGE2的合成。这些趋化因子和粘附分子一起促进了嗜中 性粒细胞浸润入滑膜。同时S1P直接活化了嗜中性粒细胞而导致氧自由 基的释放从而破坏关节组织。RA的发展与Th1至Th2环境的变化相联系， 鞘氨醇选择性地抑制Th1细胞。因此，抑制鞘氨醇转变为S1P可以缓解 该疾病的发展。一经活化，血小板、单核细胞和肥大细胞分泌S1P，在 组织受伤位置促进炎症级联反应(Yatomi et al.，Blood 86：193(1995))。S1P 也促进了软骨细胞分泌蛋白酶，而有助于关键损坏。最后，S1P介导的 VEGF表达促进了支持滑膜细胞增殖所必须的血管新生。因此，抑制鞘氨 醇转化为S1P可以缓解该疾病的发展。
由于关节炎中涉及的过程是被细胞因子和生长因子所诱导，而细胞 因子和生长因子的作用依赖于通过SK而提高的信号，因此期望本发明的 SK抑制化合物、药物组合物和方法可用于治疗关节炎。
动脉硬化是复杂的血管疾病，其包括一系列以炎症反应为特征的细 胞和分子事件。响应血管损伤，最初的动脉硬化病变是由急性炎症反应 引发的，且大多数由单核细胞、血小板和T淋巴细胞所介导。这些炎症 细胞被活化并通过局部表达的趋化因子和在内皮细胞表面表达的粘附分 子被招募进入内皮下层的血管空间。连续向受伤的血管招募额外的循环 炎症细胞通过进一步活化血管平滑肌(VSM)细胞的迁移和增殖增强了 炎症反应。此慢性血管炎症反应导致了纤维帽的形成，其是由单核细胞/ 巨噬细胞和VSM细胞组成的富含氧化剂的炎症环境。随着时间的发展， 残留的单核细胞/巨噬细胞分泌的胞外金属蛋白酶使该纤维帽不稳定并破 裂。破裂的纤维帽可以轻易地阻塞血管从而导致急性心脏或脑局部缺血。 动脉硬化的这种基本机制说明单核细胞/巨噬细胞的活化以及VSM细胞 迁移和增殖在动脉硬化病变的发展和进程中具有关键作用。重要的是， 这提示了阻止这些血管炎症细胞的活性或平滑肌细胞的增殖的治疗方法 能够预防动脉硬化的发展和/或进程。
SK在血小板内高表达使得血小板可以磷酸化循环鞘氨醇而产生 S1P。血小板响应血管受伤向受伤部分释放大量S1P，其能够通过活化S1P 受体对VSM细胞施加促有丝分裂作用。S1P也在活化的内皮细胞和VSM 细胞中产生。在这些细胞中，胞内产生的S1P作为第二信使分子起作用， 调控了与细胞增殖相联系的Ca2+自稳平衡和细胞凋亡的抑制。另外，吞 噬细胞的凋亡失调是动脉硬化的慢性炎症状态的重要部分，并且S1P保 护了粒细胞免于细胞凋亡。这些研究一起说明了SK的活化改变了鞘脂的 代谢有利于S1P的形成，导致促炎症和高增殖细胞响应。
除了在调控细胞增殖和凋亡中的作用，也发现S1P对细胞介导免疫 功能的几个重要作用。血小板和单核细胞经活化而分泌细胞因子、生长 因子和S1P，在组织受损的位点促进炎症级联反应。例如，TNFα通过核 因子Kappa-κB(NFκB)的诱发而起作用，其作用是增加促炎症酶：一氧化 氮合成酶(NOS)和环氧合酶2(COX-2)。COX-2通过其产生的前列腺素在 动脉硬化炎症中起到关键作用，NOS产生的一氧化氮介导的氧化压力加 重了炎症。因为炎症细胞因子通过NFκB活化诱发粘附分子表达的能力 是被S1P模仿的，所以SK活化是信号响应所必须的。相似地，S1P模仿 了TNFα诱导COX-2表达和PGE2合成的能力，且通过RNA干扰对SK 的敲除阻止了对TNFα的这些响应而没有阻止对S1P的这些响应。S1P也 是粒细胞活化中的Ca2+内流的介导因子，导致超氧化物和其他有毒自由 基的产生。
这些研究一起说明SK是动脉硬化的新分子靶标。将SK抑制剂用作 抗动脉硬化试剂可以防止白细胞的恶性活化，并防止浸润和平滑肌细胞 的过度增殖，从而使得本发明的化合物、药物组合物和方法可用于治疗 和/预防动脉硬化。
哮喘病理的生理终点(physiological endpoint)是由于炎症导致支气管 变窄。在大部分哮喘病例中，暴露于过敏原引发并随后加重了炎症。这 些过敏原一经吸入，就结合到循环IgE然后结合到由残留在支气管内的 炎症细胞表达的高亲和力的FcεRI表面受体上。此胞外结合导致炎症细 胞内信号事件的级联反应，最终活化了这些细胞并分泌多种因子，从而 触发了排列在支气管的细胞膨胀，导致狭窄的支气管和气体交换的减少。 响应最初暴露于过敏原的炎症过程不能完全减退。而且，再次暴露可导 致被称为支气管高反应性的放大响应。这种高反应性状态可通过气道重 塑导致永久性的狭窄气道状况。因此，首次过敏原暴露的未加抑制的炎 症反应会导致慢性炎症和永久的支气管收缩。所以，抑制或缩小这种扩 大的炎症似乎可以降低与哮喘相关的症状。
许多研究已经揭示了肥大细胞参与了导致哮喘的炎症过程，也发现 SK参与了过敏原刺激的肥大细胞活化，而肥大细胞活化是支气管炎症过 程的关键步骤。在大鼠嗜碱白细胞RBL-2H3中，IgE/Ag结合到高亲和力 的FcεRI受体上导致SK活化以及鞘氨醇转化为S1P(Choi et al.，1996， Nature 380：634)。新形成的S1P提高了肥大细胞活化所需要的胞内钙水 平。另外，高浓度的鞘氨醇降低了IgE/Ag暴露介导的白三烯合成并减少 了细胞因子转录和分泌(Prieschl et al.，1999，J Exp Med 190：1)。
除了SK和S1P在肥大细胞活化中的关键作用，S1P也直接作用于哮 喘炎症通路的下游信号。Ammit和其同事证明与无哮喘受试者相比，哮 喘患者过敏原刺激24小时后收集的肺泡灌洗液(BAL)中的S1P水平升高 了(Ammit et al.，2001，FASEB J 15：1212)。联系活化的肥大细胞产生并分 泌S1P的发现，这些结果揭示了S1P和哮喘炎症反应之间的相关性。为 评估SK和暴露于S1P对细胞反应的可能作用，ASM培养物在有S1P的 情况下生长(Ammit et al.，，2001 Id.)。此外，气道平滑肌(ASM)细胞能够对 S1P和SK依赖的刺激，例如TNFα和IL-1β产生反应。使用S1P的治疗 提高了磷酸肌醇水解和胞内钙动员，这两者都促进了ASM收缩。而且， S1P治疗增加了DNA合成、细胞数量和ASM细胞从G1到S期加速的进 程。
除了对ASM细胞的直接作用，S1P也调控细胞因子的分泌和细胞粘 附分子的表达，从而通过白细胞的招募和协助胞外组分的相互作用而放 大了炎症反应。类似于TNFα，S1P诱发了IL-6的分泌并提高了细胞粘 附分子，如VCAM-1、ICAM-1和E-选择素的表达(Shimamura et al.，2004， Eur J Pharmacol 486：141)。除了S1P对肥大细胞活化的作用，S1P以及 SK在哮喘发病机制中的小支气管炎症阶段中的多种功能清楚的显示在 该疾病的急性和慢性阶段实施药物介入的可能性。
总的来说，SK是新抗哮喘治疗的标靶。SK抑制剂用作抗哮喘试剂 可以抑制细胞因子诱导的白细胞活化，从而阻止白细胞的恶性活化，并 阻止气道平滑肌细胞高增殖，从而使得本发明的化合物、药物组合物和 方法可用于治疗和/预防哮喘。
类似于哮喘，慢性阻塞性肺病(COPD)包括与肺组织中异常嗜中性 粒细胞活化相联系的气流阻碍和高反应性。这在临床上表现为支气管炎、 纤维化或肺气肿，而这些构成了美国死亡原因的第四位。因为COPD中 化学危害物对炎症细胞的活化通过NFκB诱导的途径而发生，其与哮喘 所活化的信号通路相似，所以本发明的化合物、药物组合物和方法也可 用于治疗和/预防COPD。
炎症参与了多种皮肤疾病，其中包括牛皮癣、异位性皮炎、接触超 敏和痤疮，其影响超过20％的人口。尽管外用皮质激素得到广泛使用， 但其副作用阻止了其长期使用。因为炎症反应通常涉及上文详述的信号 途径的异常活化，所以本发明的化合物、药物组合物和方法也可用于治 疗和/预防这些皮肤疾病。
包括过敏性脑脊髓炎、过敏性神经炎、同种异体移植排斥反应、移 植物抗宿主病、心肌炎、甲状腺炎、肾炎、系统性红斑狼疮和胰岛素依 赖型糖尿病在内的多种疾病可被T细胞不适当的活化所诱发。这些疾病 的发病机制的共同特性包括被单核细胞浸润、CD4和CD8的自身反应性 T细胞的表达以及通过炎症介导因子如IL-1、IL-6和TNFα的高活性信号。 因为炎症反应通常涉及上文详述的信号途径的异常活化，所以本发明的 化合物、药物组合物和方法也可用于治疗这些T细胞调节的免疫疾病。
血管新生性疾病
本发明也涉及可用于治疗和/或预防涉及不需要的血管新生的疾病的 化合物、药物组合物和方法。更具体而言，本发明涉及抑制鞘氨醇激酶 的酶活性的化合物和组合物在治疗和/或预防血管新生性疾病中的应用， 所述疾病例如是糖尿病视网膜病变、关节炎、癌症、牛皮癣、卡波西肉 瘤、血管瘤、心肌血管新生性疾病、动脉粥样硬化斑块血管新生性疾病 和眼睛血管新生性疾病，例如脉络膜血管新生性疾病、早产儿视网膜病 变(晶体后纤维增生症)、黄斑退化、角膜移植物排斥反应、虹膜红变、 新生儿血管性青光眼(neuroscular glaucoma)和奥斯特韦伯综合症。以下的 讨论显示了SK在这些血管新生性疾病中的作用。因为以上所列疾病中涉 及同样的过程，所以本发明的化合物、药物组合物和方法可用于治疗和/ 或预防多种疾病。
血管新生是指体内多种生长因子或其他刺激促进新血管形成的状 态。如下所讨论的，该过程对多种疾病的病理学都是关键的。在每种情 况下，过度的血管新生使疾病得到发展和/或在患者体内产生不需要的作 用。因为保守的生化机制调控了形成这些新血管的血管内皮细胞的增殖， 即新血管形成，所以期望研发出抑制这些机制的方法来治疗和/或预防多 种疾病。以下讨论提供了本发明的化合物、组合物和方法如何用于抑制 这些疾病中血管新生的更多细节。
糖尿病视网膜病是视觉受损的主要原因，生长因子表达的提高有助 于该疾病中的致病性血管新生。尤其是，血管内皮细胞生长因子(VEGF) 是导致糖尿病视网膜病中新血管形成的主要原因(Frank et al.，1997，Arch Ophthalmol 115：1036，Sone et al.，1997，Diabetologia 40：726)，且已经发 现VEGF在增殖性糖尿病视网膜病患者中升高了(Aiello et al.，1994，N Engl J Med 331：1480)。除了糖尿病视网膜病，其他几个衰弱性眼部疾病 (debilitating ocular diseases)，包括年龄相关黄斑退化和脉络膜血管新生， 与VEGF和其他生长因子介导的过度血管新生相关(Grant et al.，2004， Expert Opin Investig Drugs 13：1275)。
在视网膜中，VEGF在色素上皮、神经视网膜、周细胞和血管平滑 肌层中表达。VEGF诱导内皮细胞增殖，促成视网膜中新血管的形成(Pe′er et al.，1995，Lab Invest 72：638)。同时，视网膜中的碱性成纤维细胞生长 因子(bFGF)被活化，此因子与VEGF协同作用从而一起诱发了新血管的 形成，而新血管的内皮下层基质比正常血管薄。另外，VEGF有助于在视 网膜组织的渗出物形成位置的间质内液体的渗出。VEGF也促进了内皮细 胞的开窗，该过程产生了液体能渗漏的细胞间通道，且其破坏了细胞间 的紧密连接。这样，视网膜中VEGF活性的降低很可能有效地减缓视网 膜血管新生的发展和进程以及产生视网膜病变过程的血管渗漏。
已经证明促炎症细胞因子TNFα在糖尿病视网膜病中起作用，因为其 改变了内皮细胞的细胞骨架，导致有渗漏的屏障功能和内皮细胞活化 (Camussi et al.，1991，Int Arch Allergy Appl Immunol 96：84)。视网膜内皮 细胞的这些变化是糖尿病视网膜病的病理的核心。
VEGF和SK作用之间的联系参与了推进视网膜病。已发现SK介导 了VEGF诱发的ras-活化和有丝分裂原活化的蛋白激酶(Shu et al.，2002， Mol Cell Biol 22：7758)。已发现VEGF增强了响应S1P的胞内信号，从 而增加了其血管新生作用(Igarashi et al.，2003，Proc Natl Acad Sci USA 100：10664)。已发现S1P刺激了NFκB活性(Xia et al.，1998，Proc Natl Acad Sci USA95：14196)从而导致COX-2和粘附分子的产生以及更多 VEGF的产生，所有这些都与血管新生相联系。而且，一氧化氮合成酶内 皮异构体(eNOS)作为血管内皮细胞内的关键信号分子而调节了包括血管 新生性反应在内的广泛功能，其表达被SK调控(Igarashi et al.，2000 J Biol Chem 275：32363)。已清楚，SK是血管新生的核心调控因子，这支持了 我们的假说：SK的病理学操控具有治疗用途。也发现S1P刺激了血管新 生性的NFκB的产生。NFκB导致了Cox2和粘附分子的产生，以及更多 VEGF的产生，所有这些都与血管新生相联系。
此途径中最吸引人的介入位点之一是鞘氨醇通过酶SK转化为S1P。 SK是哺乳动物细胞中负责S1P合成的关键酶，其有助于细胞存活和增殖， 并介导参与血管新生和炎症的关键过程，其中包括对VEGF(Shu et al.， 2002，Mol Cell Biol 22：7758)和TNFα(Xia et al.，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95：14196)的响应。因此，抑制S1P产生是糖尿病视网膜病治疗介 入的潜在重要位点。
血管新生在癌症中的作用已得到公认。肿瘤的生长依赖新血管形成 从而可以为肿瘤细胞提供营养。肿瘤新血管形成期间促进内皮细胞增殖 的主要因子是VEGF。如上所讨论的，通过VEGF受体的信号依赖SK的 作用。因此，本发明的化合物、药物组合物和方法可用于治疗癌症。
尽管导致脉络膜新血管形成的3个主要疾病是与年龄相关的黄斑退 化、近视和眼外伤，但有超过50种的眼病都与脉络膜新血管形成相关。 即使导致这些的成因大部分是先天的，但是其中已知的成因还涉及退化、 感染、脉络膜肿瘤和或外伤。在隐形眼镜佩戴者中，眼球缺氧而导致脉 络膜新血管形成。由于脉络膜新血管的形成是被生长因子诱导的，而生 长因子依赖于通过SK升高的信号，因此期望本发明的SK抑制性化合物、 药物组合物和方法能够用于治疗脉络膜新血管形成的疾病。
血管瘤是血管新生性疾病，其特征在于积累肥大细胞、纤维原细胞 和巨噬细胞的毛细管内皮的增殖。它们代表了婴儿最频发的肿瘤，其特 征是快速的新生儿性生长(增殖期)。在6至10个月年龄时，血管瘤的 生长速度与婴儿的生长速度成比例，在其后的5至8年内非常缓慢的退 化(消退期)。大多数血管瘤以单独肿瘤的形式发生，而大约20％的患 病婴儿具有多个肿瘤并可出现在身体的任何位置。几项研究提供了对这 些病变的组织病理学认识。尤其是，增殖的血管瘤表达高水平的增殖细 胞核抗原(细胞处于S期的标记)、IV型胶原酶、VEGF和FGF-2。由 于血管瘤被生长因子所诱发，而生长因子的作用依赖于通过SK升高的信 号，因此期望本发明的SK抑制性化合物、药物组合物和方法能够用于治 疗血管瘤。
牛皮癣和卡波西肉瘤是皮肤的血管新生性和增殖性疾病。富血管牛 皮癣病变表达高水平的血管新生性诱发因子IL-8，其中内源性抑制因子 TSP-1的表达被降低。卡波西肉瘤(KS)是与人类免疫缺陷病毒(HIV)感染 相关的最常见肿瘤，并且在此环境下几乎总是与人胞疹病毒8的感染相 关。KS的典型特征是增殖性的纺锤状细胞，其被视为肿瘤细胞和形成血 管的内皮细胞。KS是细胞因子诱导的疾病，对不同的炎症介导因子如 IL-1β、TNF-α和IFN-γ以及血管新生性因子表现出高度的响应。由于牛 皮癣和KS的进程是由生长因子所诱导，而生长因子的作用依赖于通过 SK升高的信号，因此期望本发明的SK抑制性化合物、药物组合物和方 法能够用于治疗这些疾病。
实施例
通过参考下述实施例可以更好的理解本发明。这些实施例旨在代表 本发明特定具体实施方式，而不用于限制本发明的范围。
本发明代表性的化合物包括表1和2中的化合物。使用Chemdraw Ultra(7.0.1版)命名结构，该软件可从CambridgeSoft Corporation，100 CambridgePark Drive，Cambridge，MA 02140，USA处获得。
表1本发明的代表化合物










表2.本发明的代表化合物



通用方法。在CDCl3、DMSO-d6中使用Varian 300设备获得NMR 光谱。提供相对TMS的化学位移用于1H-和13C-NMR光谱。使用前，干 燥和蒸馏溶剂。需要无水条件的反应在氮气氛中操作，使用硅胶(Merck， silica gel 60，230-400mesh)进行柱层析。所有的试剂和市售材料均未经进 一步纯化而使用。
实施例1.合成3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺，化合物 62的方法。
作为实例，合成化合物62的方法在方案1中描述。在存在氯化铝 (AlCl3)下直接将金刚烷-1-羧酸(1)溴化而产生1的3-溴化衍生物(2)，其再 通过弗里德尔-克拉夫茨反应转化为(3)。3与氯化亚砜(SOCl2)反应产生 3-R-取代-1-金刚烷羰酰氯4。通过4与取代胺的反应，例如与4-氨甲基 吡啶(5)在THF中反应可获得(6，也表示为化合物62)和相关的酰胺化 合物。

方案1
更具体地，金刚烷-1-羧酸(1)(45g，0.25mol)于0℃加入到AlCl3 (45g，0.34mol)和Br2(450g)的混合物中，并在0-10℃搅动48hrs， 在约20℃放置5hrs，倾倒在500g碎冰上，用300ml CHCl3稀释并用固 体Na2S2O5去色。使用Et2O(50ml×2)萃取液相。使用H2O洗涤合并的 有机溶液并用10％NaOH萃取。碱性提取物用2N H2SO4酸化而得到49g (产率＝75.7％)的3-溴-金刚烷-1-羧酸(2)。
经过30分钟的时间，将-10℃的50ml干氯苯中的3-溴-金刚烷-1-羧 酸(2)(16.0g，61.7mmol)加入到100ml干氯苯和9.3g，70mmol的AlCl3中。 其后混合物加热到室温持续1小时，再加热到90℃持续10小时。其后将 混合物倾倒在200g碎冰上，并过滤得到14.2g(产率＝79.3％)的3-(4- 氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(3)。
3与等摩尔的1，1’-羰基二咪唑(CDI)反应产生中间产物3-R-取代-1- 金刚烷羰基咪唑(4)。通过4与取代胺反应获得相应的金刚烷基酰胺。
例如，3与4-氨甲基吡啶(5)在甲苯中反应，产生{3-(4-氯苯基)-金刚 烷-1-羧酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺}(6也表示为化合物62)，其产率为92.6％， 熔点为128-130℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.72-2.25(m，12H， Admant-CH)，4.44-4.46(d，J＝6Hz，2H，CH2-Py)，6.18(m，1H，HN)， 7.13-7.15(d，J＝6Hz，2H，H-Py)，7.15-7.30(m，4H，H-Ph)，8.52-8.54(d，J＝ 6 Hz，2H，H-Py)，13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.98，35.73，36.71，38.77， 42.18，42.37，44.88，122.38，125.30，126.57，128.56，129.26，148.39， 150，20 177.76；MS m/z(相对强度)381.50(MH+，100)，383.41(90)， 384.35(80)。
实施例2.化合物62合成的第二种方法。
合成化合物62和相关金刚烷基酰胺的第二种方法在方案2中描述。 3-苯基取代的中间产物(3)如上述制备。3与1，1’-羰基二咪唑(CDI)反应产 生3-R-取代-1-金刚烷羰基咪唑中间产物(4)。通过4与取代胺反应，例如 与4-氨甲基吡啶5在甲苯中反应，获得6{3-(4-氯苯基)-金刚烷-l-羧酸(吡 啶-4-基甲基)-酰胺}。

方案2.
通过多种芳香化合物与2缩合可以有效地合成不同组的取代芳基金 刚烷(aryladamantanes)，而且多种这样的化合物是市售的。另外，可使用 多种偶联试剂和含一级胺的化合物有效地完成3的酰胺化。以下实例提 供了此过程的几种代表性产物；然而，能够调整这些方法而产生许多结 构上相关的可视作本发明对象的金刚烷基酰胺。
实施例3.金刚烷基酰胺的合成。
使用实施例1或2描述的方法来制备取代的金刚烷基酰胺库。以下 提供的数据包括：合成量、酰胺化反应的产率、化合物的熔点(m.p)、化 合物的质谱(MS)数据和化合物的NMR谱数据。
化合物1：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸异丙基酰胺。产率＝81％；m.p.： 140-141.5℃；MS m/z(相对强度)332(MH+，95)。
化合物2：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸环丙基酰胺。90mg，产率＝78.3％； m.p.：145-148℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.44-0.46(m，2H，CH2)， 0.76-0.78(m，2H，CH2)，1.59-1.92(m，12H，Admant-CH)，2.25(s，2H， Admant-CH)，2.62-2.65(m，1H，CH)，5.64(m，1H，HN)，7.28-7.30(m， 4H，H-Ph)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ6.7，22.7，28.8，35.5，36.5， 3 8.4，42.0，44.5，126.2，128.1，131.4，148.2，178.5；MS m/z(相对强 度)330.46(MH+，100)，331.47(25)，332.46(35)。
化合物3：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(2-乙硫基-乙基)-酰胺。180mg， 产率＝92.0％；m.p.：101-103℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.24-1.29(t， J＝7.5Hz，3H，CH3)，1.74-1.97(m，12H，Admant-CH)，2.27(s，2H， Admant-CH)，2.52-2.59(q，J＝7.5Hz，2H，CH2)，2.65-2.70(t，J＝7.5Hz， 2H，CH2)，3.41-3.47(m，2H，CH2)，6.12(m，1H，HN)，7.24-7.28(m， 4H，Ar-H)，7.38-7.45(m，2H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ15.1， 25.7，29.0，31.6，35.8，36.7，38.3，38.6，42.0，42.3，44.7，126.6， 128.5，148.6，177.6；MS m/z(相对强度)373.6(MH+，100)，374.6(25)， 375.6(40)。
化合物4：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸苯基酰胺。120mg，产率＝68.5％； m.p.：190-192℃；MS m/z(相对强度)366(MH+，35)。
化合物5：金刚烷-1-羧酸(4-羟苯基)-酰胺。77mg，产率＝57％；m.p.：224-226 ℃；MS m/z(相对强度)272(MH+，50)。
化合物6：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(4-羟苯基)-酰胺。产率＝66％；m.p.： 240-242℃；1H NMR(200MHz，CDCl3)δ0.86-2.32(m，14H，Admant-H)， 6.75-6.78(d，J＝9Hz，2H，Ar-H)，7.26-7.33(m，6H，Ar-H)；13C NMR (300 MHz，CDCl3)δ23.7，28.8，29.4，29.7，30.3，35.5，38.5.3，38.7， 42.0，44.6，115.7，122.5，126.3，128.3，140.6，173.6；MS m/z(相对 强度)382(MH+，50)。
化合物7：醋酸4-{[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羰基]-氨基}-苯酯。140mg， 产率＝85％；m.p.：176-178℃；MS m/z(相对强度)424(MH+，75)，425(50)， 426(55)。
化合物8：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(2，4-二羟苯基)-酰胺。5mg，产率 ＝4％；m.p.：242-244℃；MS m/z(相对强度)398(MH+，20)。
化合物9：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(3-羧甲基-苯基)-酰胺。74mg，产 率＝38％；m.p.：173-175℃；MS m/z(相对强度)396(MH+，90)。
化合物10：金刚烷-1-羧酸(4-氰甲基-苯基)-酰胺。5.1mg，产率＝4％；m.p.： 184-186℃；MS m/z(相度強度)295(MH+，50)。
化合物11：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(4-氰甲基-苯基)-酰胺。92mg， 产率＝46％；mp：157-159℃；MS m/z(相对强度)405(MH+，20)。
化合物12：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸苄酰胺。144mg，产率＝75.8％； m.p.：134-136℃；MS m/z(相对强度)380(MH+，75)。
化合物13：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸4-叔丁基-苄酰胺。35mg，产率＝ 62％；m.p.：187-189℃；MS m/z(相对强度)436(MH+，30)。
化合物14：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸4-甲硫基-苄酰胺。100mg，产率 ＝47％；m.p.：139-141℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.73-1.98(m，12H， Admant-CH)，2.26(s，2H，Admant-CH)，2.47(s，3H，SCH3)，4.38-4.40 (d，J＝6Hz，2H，CH2)，5.84(s(br)，1H，HN)，7.16-7.24(m，4H，Ar-H)， 7.26-7.30(m，4H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ15.9，28.8，35.5， 36.5，38.4，41.7，42.0，42.9，44.6，126.2，126.7，128.2，131.4，135.2， 137.5，148.1，177.2；MS m/z(相对强度)426.6(MH+，100)，427.6(30)， 428.6(32)。
化合物15：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸3-三氟甲基-苄酰胺。190mg，产 率＝81％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.58-2.00(m，12H， Admant-CH)，2.28(s，2H，Admant-CH)，4.50-4.52(d，J＝6Hz，2H，CH2)， 6.02(m，1H，HN)，7.26-7.29(m，4H，Ar-H)，7.44-7.54(m，4H，Ar-H)； 13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.8，35.5，36.5，3 8.5，41.8，42.0，42.8， 44.5，124.0，126.2，128.1，129.0，130.7，139.9，148.3，177.2；MS m/z (相对强度)448.2(MH+，100)。
化合物16：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸4-三氟甲基-苄酰胺。180mg，产 率＝80％；m.p.：165-167℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.74-1.99(m， 12H，Admant-CH)，2.28(s，2H，Admant-CH)，4.48-4.50 (d，J＝6Hz， 2H，CH2)，6.03(m，1H，HN)，7.24-7.30(m，4H，Ar-H)，7.34-7.36(d， J＝6Hz，2H，Ar-H)，7.57-7.59(d，J＝6Hz，2H，Ar-H)；13C NMR(300MHz， CDCl3)δ29.0，35.7，36.7，38.3，38.7，42.2，42.3，43.1，43.9，44.8， 125.9，126.6，127.9，128.5，131.9，142.9，148.4，177.8；MS m/z(相 对强度)448.2(MH+，100)。
化合物17：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸3，5-双-三氟甲基-苄酰胺。168mg， 产率＝65％；m.p.：125-127℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.75-2.00(m， 12H，Admant-CH)，2.28(s，2H，Admant-CH)，4.53-4.55(d，J＝6Hz， 2H，CH2)，6.24(m，1H，HN)，7.23-7.30(m，4H，Ar-H)，7.69(s，2H， Ar-H)，7.77(s，1H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.9，35.6， 36.7，38.6，42.0，42.2，42.6，44.7，121.5，125.5，126.5，127.6，128.5， 131.8，141.8，148.4，178.1；MS m/z(相对强度)516.2(MH+，100)。
化合物18：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸3-氟-5-三氟甲基-苄酰胺。210mg， 产率＝90％；m.p.：92-94℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.75-2.00(m， 12H，Admant-CH)，2.29(s，2H，Admant-CH)，4.48-4.50(d，J＝6Hz， 2H，CH2)，6.07(m，1H，HN)，7.14-7.29(m，7H，Ar-H)；13C NMR(300 MHz，CDCl3)δ28.9，35.6，36.6，38.3，38.7，42.0，42.1，42.6，44.7， 111.7，112.0，117.7，118.0，119.8，126.5，128.5，131.8，143.2，148.4， 161.2，164.5，178.1；MS m/z(相对强度)466.2(MH+，100)。
化合物19：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸2-氟-4-三氟甲基-苄酰胺。156mg， 产率＝67％；m.p.：190-192℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.60-1.96(m， 12H，Admant-CH)，2.28(s，2H，Admant-CH)，4.51-4.53(d，J＝6Hz， 2H，CH2)，6.08(m，1H，HN)，7.26-7.44(m，7H，Ar-H)；13C NMR(300 MHz，CDCl3)δ15.7，29.0，35.7，36.7，38.7，42.2，44.8，113.3，121.5， 126.6，128.5，130.8，131.9，148.4，177.7；MS m/z(相对强度)466.1(MH+， 100)。
化合物20：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸3，5-二氟-苄酰胺。160mg，产率 ＝85％；m.p.：59-61℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.75-2.03(m，12H， Admant-CH)，2.29(s，2H，Admant-CH)，4.38-4.41(d，J＝6Hz，2H，CH2)， 6.00(m，1H，HN)，6.67-6.81(m，3H，Ar-H)，7.29(s，4H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.9，35.7，36.7，38.1，38.7，42.1，42.3， 42.8，44.1，44.7，103.0，110.2，126.6，128.5，131.9，148.4，164.9， 178.0；MS m/z(相对强度)416.59(MH+，100)，417.59(35)，418.59(40)， 419.60(20)。
化合物21：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸3，4-二氟-苄酰胺。179mg，产率 ＝86％；m.p.：100-102℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.74-1.98(m，12H， Admant-CH)，2.28(s，2H，Admant-CH)，4.38-4.41(d，J＝6Hz，2H，CH2)， 5.96(m，1H，HN)，6.98(s，1H，Ar-H)，7.06-7.12(m，2H，Ar-H)，7.24-7.30 (m，4H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ29.0，35.7，36.7，38.7， 42.0，42.1，42.7，44.8，116.7，117.7，123.7，126.6，128.5，148.5，177.8； MS m/z(相对强度)416.4(MH+，100)。
化合物22：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸3，4，5-三氟-苄酰胺。195mg，产 率＝90％；m.p.：106-108℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.75-1.98(m， 12H，Admant-CH)，2.29(s，2H，Admant-CH)，4.36-4.38(d，J＝6Hz， 2H，CH2)，6.03(m，1H，HN)，6.82-6.89(t，J＝7.5Hz，2H，Ar-H)，7.28 (s，4H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.9，35.6，36.7，38.7， 42.1，42.4，44.7，111.3，111.4，111.5，123.3，125.5，126.6，128.5， 129.8，131.8，135.6，148.4，178.0；MS m/z(相对强度)434.5(MH+，100)。 化合物23：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸3-氯-4-氟-苄酰胺。143mg，产率 ＝66.2％；m.p.：112-114℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.74-1.98(m， 12H，Admant-CH)，2.28(s，2H，Admant-CH)，4.37-4.39(d，J＝6Hz， 2H，CH2)，5.99(m，1H，HN)，7.08(s，1H，Ar-H)，7.10-7.12(m，1H， Ar-H)，7.28-7.30(m，5H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.8， 35.5，36.5，38.5，41.8，42.0，42.3，44.6，116.8，126.2，127.2，128.2， 129.6，148.0，177.2；MS m/z(相对强度)432.5(MH+，50)。
化合物24：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸4-氟-3-三氟甲基-苄酰胺。220mg， 产率＝94％；m.p.：111-113℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.72-1.96(m， 12H，Admant-CH)，2.25(s，2H，Admant-CH)，4.39-4.41(d，J＝6Hz， 2H，CH2)，6.31-6.34(m，1H，HN)，7.03-7.22(m，2H，Ar-H)，7.25-7.29 (m，3H，Ar-H)，7.38-7.45(m，2H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3) δ28.8，35.5，36.7，37.7，38.6，38.7，42.1，42.3，43.2，44.7，117.3， 126.2，126.5，128.5，133.2，148.4，177.8；MS m/z(相对强度)466.6(MH+， 100)。
化合物25：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸2-氯-4-氟-苄酰胺。145mg，产率 ＝97.3％；m.p.：132-134℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 1.72-2.03(m， 12H，Admant-CH)，2.25(s，2H，Admant-CH)，4.45-4.47(d，J＝6Hz， 2H，CH2)，6.23(m，1H，HN)，6.90-6.96(m，1H，Ar-H)，7.08-7.18(m， 2H，Ar-H)，7.26-7.33(m，4H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ29.0， 35.7，36.7，38.4，38.6，41.2，42.2，42.4，44.7，114.4，117.0，126.6， 128.5，131.5，148.5，163.7，177.7；MS m/z(相对强度)432.54(MH+， 100)，433.55(25)，434.54(80)，435.54(30)，436.64(25)。
化合物26：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸4-氯-3-三氟甲基-苄酰胺。136mg， 产率＝92.0％；m.p.：77-79℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.58-1.99(m， 12H，Admant-CH)，2.29(s，2H，Admant-CH)，4.45-4.47(d，J＝6Hz， 2H，CH2)，6.05(m，1H，HN)，7.26-7.3 1(m，4H，H-Ph)，7.36-7.39(d， J＝9Hz，1H，Ar-H)，7.44-7.47(d，J＝9Hz，1H，Ar-H)，7.66(s，1H， Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.7，35.5，36.5，38.5，41.9，42.3， 44.6，126.2，126.4，128.3，131.6，131.8，137.8，148.0，177.3；MS m/z (相对强度)482.55(MH+，100)，483.55(35)，484.35(70)。
化合物27：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸3-氨甲基-2，4，5，6-四氯-苄酰胺。 70mg，产率＝31％；m.p.：170-172℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.60 (s，2H，NH2)，1.72-1.94(m，12H，Admant-CH)，2.25(s，2H，Admant-CH)， 4.19(s，2H，CH2)，4.79-4.81(d，J＝6Hz，2H，CH2)，5.91(m(br)，1H， HN)，7.26-7.27(m，4H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.7，35.5， 36.4，38.4，40.9，41.9，43.7，44.5，122.9，125.2，125.9，126.2，128.1， 129.3，131.4，131.8，134.1，134.3，139.2，148.0，176.6；MS m/z(相 对强度)546.9(MH+，100)。
化合物28：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸[1-(4-氯苯基)-乙基]-酰胺。113 mg，产率＝53％；m-p-：204-206℃(B)；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 1-44-1-46(d，J＝6Hz，3H，CH3)，1-58-1-94(m，12H，Admant-CH)，2-27 (s，2H，Admant-CH)，5-06-5.11(m，1H，CH)，5.75-5.78(m(br)，1H， HN)，7.20-7.31(m，8H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ22.0，29.0， 35.7，36.7，38.6，38.7，41.8，42.2，44.8，48.1，126.3，126.6，127.7， 128.5，129.0，131.8，133.2，142.3，148.5，176.6；MS m/z(相对强度) 428.4(MH+，100)。
化合物29：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸[1-(4-溴苯基)-乙基]-酰胺。69 mg，产率＝29％；m.p.：218-220℃；MS m/z(相对强度)472(MH+，80)， 474(MH+，100)。
化合物30：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸4-甲磺酰基-苄酰胺。189mg， 产率＝82％；m.p.：115-117℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.75-2.00(m， 12H，Admant-CH)，2.29(s，2H，Admant-CH)，3.02(s，3H，CH3)，4.51-4.53 (d，J＝6Hz，2H，CH2)，6.19(m，1H，HN)，7.16-7.28(m，4H，Ar-H)， 7.40-7.43(d，J＝9Hz，2H，Ar-H)，7.84-7.87(d，J＝9Hz，2H，Ar-H)； 13C NMR(300MHz，CDCl3)δ 29.0，35.5，35.7，36.7，37.7，38.5，38.7， 42.0，42.2，44.6，44.7，117.7，125.6，126.6，127.7，128.1，129.9， 131.7，137.4，139.1，145.9，148.6，178.0；MS m/z(相对强度)458.3(MH+， 100)。
化合物31：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸4-二甲氨基-苄酰胺。161mg，产率 ＝76.1％；m.p.：154-156℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.72-1.97(m，12H， Admant-CH)，2.36(s，2H，Admant-CH)，2.94(s，6H，N(CH3)2)，4.32-4.34 (d，J＝6Hz，2H，CH2)，5.73(m，1H，HN)，6.68-6.71(d，J＝9Hz，2H， Ar-H)，7.13-7.16(d，J＝9Hz，2H，Ar-H)，7.28(s，4H，Ar-H)；13C NMR(300 MHz，CDCl3)δ15.7，29.0，35.8，38.7，40.9，42.3，43.4，44.8，112.9， 126.6，128.5，129.2，137.7，140.9，173.4；MS m/z(相对强度)422.66(M+， 100)，423.66(MH+，90)，424.64(60)。
化合物32：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸4-三氟甲氧基-苄酰胺。200mg，产 率＝86.2％；m.p.：119-121℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.72-2.02(m，12H， Admant-CH)，2.24(s，2H，Admant-CH)，4.39-4.41(d，J＝6Hz，2H，CH2)， 6.27(s，1H，HN)，7.06-7.26(m，8H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3) δ29.0，35.7，35.8，36.7，38.4，38.7，42.1，42.4，42.8，43.6，44.8，121.2， 121.6，126.3，126.6，128.5，128.7，129.1，137.5，148.4，177.9；MS m/z (相对强度)464.4(MH+，70)。
化合物33：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸3-三氟甲氧基-苄酰胺。200mg， 产率＝86％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.75-2.00(m，12H， Admant-CH)，2.28(s，2H，Admant-CH)，4.45-4.47(d，J＝6Hz，2H， CH2)，6.00(m，1H，HN)，7.01-7.19(m，3H，Ar-H)，7.24-7.38(m，5H， Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ29.0，35.7，36.7，38.7，42.0， 42.2，42.8，44.8，119.8，125.9，126.6，128.5，130.2，131.8，141.5， 148.6，149.7，177.8；MS m/z(相对强度)464.2(MH+，100)。
化合物34：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸4-苯氧基-苄酰胺。170mg，产率＝ 72.0％；m.p.：121-123℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.58-1.99(m，12H， Admant-CH)，2.27(s，2H，Admant-CH)，4.41-4.43(d，J＝6Hz，2H，CH2)， 5.88(m，1H，HN)，6.95-7.02(m，3H，Ar-H)，7.09-7.14(m，1H，Ar-H)， 7.20-7.36(m，9H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.8，35.6，36.5， 38.5，42.0，42.9，43.9，44.6，118.8，118.9，123.3，128.2，129.0，129.6， 131.4，133.1，148.1，156.5，156.9，176.9；MS m/z(相对强度)472.36(MH+， 100)，473.36(30)，474.37(30)。
化合物35：金刚烷-1-羧酸3，4-二羟基-苄酰胺。143mg，产率＝48％； m.p.：184-186℃；MS m/z(相对强度)302(MH+，8)。
化合物36：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸3，4-二羟基-苄酰胺。134mg，产 率＝65％；m.p.：73-75℃；MS m/z(相对强度)412(MH+，10)。
化合物37：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸苯乙基-酰胺。150mg，产率＝ 76％；m.p.：123-125℃；MS m/z(相对强度)394(MH+，14)。
化合物38：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸[2-(4-氟苯基)-乙基]-酰胺。156 mg，产率＝78％；m.p.：103-105℃；MS m/z(相对强度)412(MH+，52)， 413(17)，414(20)。
化合物39：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸[2-(4-溴苯基)-乙基]-酰胺。30mg， 产率＝55％；m.p.：114-116℃；MS m/z(相对强度)472(MH+，38)，474 (MH+，42)。
化合物40：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸[2-(4-羟苯基)-乙基]-酰胺。112 mg，产率＝55％；m.p.：174-176℃；MS m/z(相对强度)410(MH+，100)， 411(25)，412(33)。
化合物41：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸[2-(4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺。 159mg，产率＝75％；m.p.：108-110℃；MS m/z(相对强度)424(MH+， 55)，425(18)，426(20)。
化合物42：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸[2-(3-溴-4-甲氧基-苯基)-乙基]-酰胺。 220mg，产率＝87.5％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.63-1.89(m，12H， Admant-CH)，2.25(s，2H，Admant-CH)，2.71-2.76(t，J＝7.5Hz，2H，CH2)， 3.42-3.48(q，J＝12Hz，2H，NCH2)，3.87(s，3H，OCH3)，5.62(s(br)，1H， NH)，6.82-6.84(d，J＝6Hz，1H，Ar-H)，7.07-7.09(d，J＝6Hz，1H，Ar-H)， 7.27-7.30(m，4H，Ar-H)，7.36(s，1H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3) δ29.0，34.6，35.7，36.7，38.6，40.8，41.9，42.2，44.8，56.5，112.3，111.7， 126.6，128.5，128.6，129.0，132.8，133.9，148.6，154.7，177.6；MS m/z (相对强度)502(MH+，80)，503(25)，504(MH+，100)，505(33)。
化合物43：金刚烷-1-羧酸[2-(3，4-二羟苯基)-乙基]-酰胺。69mg，产率 ＝24％；mp：98-100℃；1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.94-0.98(m，2H， CH2)，1.60-1.95(m，15H，Admant-CH)，3.12-3.15(m，2H，CH2)，6.39-6.41 (d，J＝6Hz，1H，Ar-H)，6.54(s，1H，Ar-H)，6.60-6.62(d，J＝6Hz， 1H，Ar-H)，7.35(s，1H，NH)；13C NMR(300MHz，DMSO-d6)δ27.6， 29.4，35.1，36.9，37.8，38.6，44.6，46.4，114.8，116.9，119.4，131.4， 145.6，164.4；MS m/z(相对强度)316.5(MH+，50)，317.5(8)。
化合物44：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸[2-(3，4-二羟苯基)-乙基]-酰胺。 100mg，产率＝47.0％；m.p.：124-126℃；MS m/z(相对强度)426(MH+， 100)。
化合物45：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(2-苯并[1，3]二氧杂环戊烯-5-基- 乙基)-酰胺。190mg，产率＝87％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 1.71-1.90(m，12H，Admant-CH)，2.24(s，2H，Admant-CH)，2.70-2.75(t， J＝6Hz，2H，CH2)，3.42-3.48(q，J＝6Hz，2H，CH2)，5.61(m，1H， NH)，5.93(s，2H，CH2)，6.60-6.63(d，J＝9Hz，，1H，Ar-H)，6.67(s，1H， Ar-H)，6.73-6.76(d，J＝9Hz，，1H，Ar-H)，7.26-7.29(m，4H，Ar-H)； 13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.6，28.8，35.4，35.5，36.4，38.3，40.6， 41.6，42.0，43.8，44.5，100.8，108.2，109.0，121.5，126.2，128.1， 132.5，146.0，148.2，177.0；MS m/z(相对强度)438.28(MH+，100)， 439.29(45)，440.28(55)。
化合物46：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸[2-(3-苯氧基-苯基)-乙基]-酰胺。 200mg，产率＝82％；m.p.：114-116℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 1.70-1.95(m，12H，Admant-CH)，2.23(s，2H，Admant-CH)，2.75-2.80(，t， J＝7.5Hz，2H，CH2)，3.45-3.51(q，J＝12Hz，2H，NCH2)，5.63(s(br)， 1H，NH)，6.83-7.01(m，5H，Ar-H)，7.07-7.18(m，2H，Ar-H)，7.22-7.35 (m，6H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.8，29.0，35.8，36.7， 38.6，40.7，41.9，42.3，44.8，116.9，117.1，119.2，119.4，123.5，123.6， 123.9，126.6，128.5，130.0，130.2，141.7，148.3，157.4，177.7；MS m/z(相对强度)486.58(MH+，93)，487.56(60)，488.55(68)，489.54(25)。
化合物47：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸[2-(4-苯氧基-苯基)-乙基]-酰胺。 224mg，产率＝92％；m.p.：88-90℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.71-1.90 (m，12H，Admant-CH)，2.24(s，2H，Admant-CH)，2.77-2.81(t，J＝6Hz， 2H，CH2)，3.48-3.51(m，2H，NCH2)，5.63(s(br)，1H，NH)，6.94-7.00 (m，4H，Ar-H)，7.09-7.35(m，9H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3) δ29.1，29.3，35.2，35.8，36.7，38.7，40.9，41.9，42.3，44.8，118.9， 119.4，123.5，126.6，128.6，129.3，130.0，130.4，131.8，134.2，148.7， 156.1，157.6，177.5；MS m/z(相对强度)486.58(MH+，93)，487.56(60)， 488.55(68)，489.54(25)。
化合物48：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(3-苯基-丙基)-酰胺。195mg，产 率＝59％；m.p.：97-100℃；MS m/z(相对强度)408(MH+，55)。
化合物49：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(二苯基-4-基甲基)-酰胺。200mg， 产率＝87.7％；m.p.：208-210℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.74-2.09(m， 12H，Admant-CH)，2.26(s，2H，Admant-CH)，4.48-4.50(d，J＝6Hz，2H， CH2)，5.94(m，1H，HN)，7.29-7.37(m，6H，Ar-H)，7.42-7.46(m，3H， Ar-H)，7.55-7.59(m，4H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ15.7，29.0， 35.8，36.7，38.8，42.0，42.3，43.4，44.9，126.6，127.3，127.6，127.7， 128.4，128.5，129.0，137.7，140.9，148.5，177.4；MS m/z(相对强度)456.59 (MH+，90)，457.57(20)，458.56(30)。
化合物50：金刚烷-1-羧酸(1-甲基-哌啶-4-基)-酰胺。120mg，产率＝76％； m.p.：157-159℃；MS m/z(相对强度)277(MH+，100)。
化合物51：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(1-甲基-哌啶-4-基)-酰胺。136 mg，产率＝74.4％；m.p.：146-148℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 1.06-2.77(m，25H，Admant-CH，)，4.44-3.70(m，1H，CH)， 5.41-5.43(m，1H，HN)，7.26-7.29(m，4H，H-Ar)；13C NMR(300MHz， CDCl3)δ11.6，29.1，32.5，35.8，36.7，38.6，41.9，42.2，44.8，46.0， 46.4，54.7，126.6，128.5，131.8，148.6，176.8；MS m/z(相对强度、)387 (MH+，100)。
化合物52：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(4-甲基-哌嗪-1-基)-酰胺。182 mg，产率＝66.2％；m.p.：142-147℃；MS m/z(相对强度)387(MH+，48)。 化合物53：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(3-叔丁基氨基-丙基)-酰胺。160 mg，产率＝79％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.11(s，9H，3CH3)， 1.69-1.95(m，14H，Admant-CH，CH2)，2.18(m，1H，HN)，2.25(s， 2H，Admant-CH)，2.70-2.74(t，J＝6Hz，2H，CH2)，3.33-3.38(m，2H， CH2)，7.16-7.27(m，4H，Ar-H)，7.42(m，1H，HN)；13C NMR(300MHz， CDCl3)δ28.5，28.7，29.1，29.4，35.9，36.7，38.8，39.3，39.7，41.1， 41.8，42.3，42.6，45.0，46.0，51.8，126.3，128.3，128.4，148.8，177.8： MS m/z(相对强度)403.1(MH+，100)。
化合物54：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(3-吡咯烷-1-基-丙基)-酰胺。184 mg，产率＝92％；m.p.：86-88℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.63-1.92 (m，18H，Admant-CH，CH2)，2.24(s，2H，Admant-CH)，2.50(s，4H， CH2)，2.58-2.62(t，J＝6Hz，2H，CH2)，3.33-3.38(m，2H，CH2)，7.19-7.28 (m，4H，Ar-H)，7.92(m，1H，HN)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ 23.7， 26.5，29.1，35.9，36.7，38.7，40.7，41.7，42.3，44.9，54.4，56.4， 126.6，128.4，129.6，131.6，148.8，177.6；MS m/z(相对强度)401.25(MH+， 100)。
化合物55：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸[3-(2-氧基-吡咯烷-1-基)-丙基]- 酰胺。190mg，产率＝98％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.60-2.12 (m，16H，cyclo-CH2，Admant-CH)，2.27(s，2H，Admant-CH)，2-36-2.47 (t，J＝7.5Hz，2H，cyclo-CH2)，3.15-3.20(t，J＝7.5Hz，2H，CH2)，3-32-3.42 (m，4H，CH2)，7.09(m，1H，HN)，7.18-7.32(m，4H，Ar-H)；13C NMR(300 MHz，CDCl3)δ18.2，26.5，29.1，31.1，35.0，35.9，36.7，38.5，39.5， 42.0，42.4，44.8，47.6，126.7，128.4，166.5，177.9；MS m/z(相对 强度)415.6(MH+，100)。
化合物56：金刚烷-1-羧酸[2-(1-甲基-吡咯烷-2-基)-乙基]-酰胺。23mg， 产率＝33％；m.p.：82-84℃；MS m/z(相对强度)291(MH+，100)。
化合物57：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸[2-(1-甲基-吡咯烷-2-基)-乙基]- 酰胺。200mg，产率＝61.7％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.68-2.36 (m，24H，Admant-CH，2.98-3.04(m，1H，CH*)，3.17-3.27 (m，1H，Ha)，3.45-3.53(m，1H，Hb)，7.24-7.30(m，4H，H-Ar)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ22.9，28.6，29.1，29.5，35.9，36.7，38.6， 40.9，41.7，42.4，44.7，57.3，65.0，126.5，128.4，131.6，148.8，177.4； MS m/z(相对强度)401(MH+，100)。HCL salt：m.p.：68-70℃。
化合物58：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(2-吗啉-4-基-乙基)-酰胺。147 mg，产率＝73％；m.p.：110-112℃；MS m/z(相对强度)403(MH+，100)。
化合物59：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(2-哌嗪-1-基-乙基)-酰胺。144 mg，产率＝72％，油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.65-1.97(m，15H， NH，环-CH2，Admant-CH)，2.27(s，2H，Admant-CH)，2.36-2.50(m， 6H，环-CH2)，2.87-2.90(m，2H，CH2)，3.30-3.95(m，2H，CH2)，6.34 (m，1H，HN)，7.18-7.29(m，4H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ 28.8，35.6，36.4，38.4，41.6，42.1，44.5，46.2，52.7，54.1，56.8， 126.3，128.2，148.4，156.2，177.3；MS m/z(相对强度)402.6(MH+， 100)。
化合物60：金刚烷-1-羧酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺。200mg，产率＝74％； m.p.：155-157℃；MS m/z(相对强度)285.63(MH+，100)，286.71(40)。
化合物61：3-(4-氟苯基)-金刚烷-1-羧酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺。105mg， 产率＝97％；油；MS m/z(相对强度)365(MH+，90)。
化合物62：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(吡啶-4-基甲基)-酰胺。产率＝ 92.6％；m.p.：128-130℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.72-2.25(m，12H， Admant-CH)，4.44-4.46(d，J＝6Hz，2H，CH2-Py)，6.18(m，1H，HN)， 7.13-7.15(d，J＝6Hz，2H，H-Py)，7.15-7.30(m，4H，H-Ph)，8.52-8.54 (d，J＝6Hz，2H，H-Py)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.98，35.73， 36.71，38.77，42.18，42.37，44.88，122.38，125.30，126.57，128.56， 129.26，148.39，150，20 177.76；MS m/z(相对强度)381.50(MH+，100)， 383.41(90)，384.35(80)。
化合物63：金刚烷-1-羧酸(2-吡啶-4-基-乙基)-酰胺。175mg，产率＝61％； m.p.：151-153℃；MS m/z(相对强度)285(MH+，100)。
化合物64：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(2-吡啶-4-基-乙基)-酰胺。70mg， 产率＝55.7％；m.p.：144-147℃；MS m/z(相对强度)395(MH+，100)。
化合物65：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺。195 mg，产率＝95％；m.p.：128-130℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.70-2.00 (m，14H，CH2，Admant-CH)，2.27(s，2H，Admant-CH)，3.25-3.32(，m， 2H，CH2)，3.96-4.00(m，2H，CH2)，5.65(m，1H，HN)，6.95(s，1H， 咪唑-H)，7.07(s，1H，咪唑-H)，7.26-7.28(m，4H，Ar-H)，7.49(s， 1H，咪唑-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ29.0，31.5，35.7，36.7， 37.0，38.6，41.9，42.2，44.8，45.0，119.1，126.3，126.6，128.5，129.8， 131.8，137.3，148.5，178.0；MS m/z(相对强度)398.66(MH+，100)， 399.62(45)，400.63(60)，401.60(20)。
化合物66：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(2-甲基-1H-吲哚-5-基)-酰胺。产 率＝56％；m.p.：145-147℃；MS m/z(相对强度)419(MH+，35)。
化合物67：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(1H-四唑-5-基)-酰胺。120mg， 产率＝67％；m.p.：＞240℃；MS m/z(相对强度)358.2(MH+，100)，359.1 (35)，361.1(60)。
化合物68：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(9-乙基-9H-咔唑-3-基)-酰胺。 111mg，产率＝46％；m.p.：165-167℃；MS m/z(相对强度)482.67(MH+， 100)，483.67(65)，484.66(55)。
化合物69：金刚烷-1-羧酸[4-(4-氯苯基)-噻唑-2-yl]-酰胺。182mg，产率 ＝49％；m.p.：162-164℃；MS m/z(相对强度)373(MH+，100)。
化合物70：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸[4-(4-氯苯基)-噻唑-2-基]-酰胺。 产率＝56％；m.p.：172-174℃；MS m/z(相对强度)483(MH+，20)。
化合物71：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸苯并噻唑-2-基酰胺。产率＝ 48.8％；m.p.：209-211℃；MS m/z(相对强度)423(MH+，50)。
化合物72：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(5-氯-苯并噁唑-2-基)-酰胺。产 率＝45％；油；MS m/z(相对强度)441(MH+，18)。
化合物73：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(9H-嘌呤-6-基)-酰胺。180mg， 产率＝88.2％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.84-2.2(m，13H，NH， Admant-CH)，2.38(s，2H，Admant-CH)，7.07(s，1H，Ar-H)，7.30(m， 4H，Ar-H)，7.63(s，1H，Ar-H)，8.38(s，1H，Ar-H)；13C NMR(300MHz， CDCl3)δ28.8，35.5，36.7，37.7，38.7，42.1，44.6，45.1，117.7，123.2， 125.5，126.5，126.6，128.7，129.9，130.1，132.1，137.4，147.8，174.3； MS m/z(相对强度)408.6(MH+，100)。
实施例4.金刚烷基酰胺转化为金刚烷基胺的方法
作为实例，合成金刚烷基胺化合物的方法在方案3中描述。如上所 述制备的大量金刚烷基酰胺通过羰基基团与Zn(BH4)2的还原转化为其 相应的金刚烷基胺(方案3)。
硼氢化锌(Zn(BH4)2)通过本领域已知的方法制备。简单来说，将20.8 g(165mmol)新合并的ZnCl2和12.9g(330mmol)NaBH4置于装配有回 流冷凝器的干燥、有侧柄的250ml烧瓶中。使用双头针向其中添加250ml 干燥的THF，混合物在室温下搅拌24h。上清液中的活性氢化物含量通 过用2N H2SO4焠灭等份来估算，氢的量使用气体滴定管来估算。最终 上清溶液含0.66 M Zn(BH4)2并用于以下进一步的反应。
金刚烷基酰胺转化为相应的金刚烷基胺的通用方法包括在THF中 混合100mg的金刚烷基酰胺和2.0ml的Zn(BH4)2(0.36M，2.3mmol)。 该混合物回流24h，并通过添加1ml的水焠灭任何多余的氢化物。通常， 该混合物再用K2CO3饱和，上清层过滤并通过K2CO3干燥，蒸发去除溶 剂。然后使用快速层析(乙酸乙酯∶己烷＝1∶4)纯化残留物而得到金 刚烷基胺化合物。

方案3.
以下实例提供了此过程的几种代表性产物；然而，能够调整这些方 法而产生许多结构上相关的可视作本发明对象的金刚烷基胺。
实施例5.金刚烷基胺的合成。
使用实施例4描述的方法来制备取代的金刚烷基胺库。以下提供的 数据包括：合成量、还原反应的产率、化合物的熔点(m.p)、化合物的质 谱(MS)数据和化合物的NMR谱数据。
化合物75：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-异丙基胺。39mg，产率＝41％； 油；MS m/z(相对强度)318(MH+，20)。
化合物76：4-{[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-氨基}-苯酚。75mg，产率 ＝66％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.60-1.86(m，12H，Admant-H)， 2.22(s，2H，Admant-H)，2.58-2.62(m，1H，NH)，2.83(s，2H，CH2)， 6.53-6.56(d，J＝9Hz，2H，Ar-H)，6.68-6.71(d，J＝9Hz，2H，Ar-H)，7.28(s，4H， Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ14.3，29.0，34.9，36.1，36.7，39.9， 42.6，46.3，57.4，114.1，116.1，126.3，128.1，131.2，143.2，147.3，148.9；MS m/z(相对强度)368.6(MH+，100)，369.6(50)，370.6(30)。
化合物77：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-(4-三氟甲基-苄基)-胺。23mg， 产率＝28％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.55-1.83(m，13H，Admant-H， NH)，2.18(s，2H，Admant-H)，2.32(s，2H，NCH2)，3.84(s，2H，NCH2)， 7.27(s，4H，Ar-H)，7.43-7.45(d，J＝6Hz，2H，Ar-H)，7.56-7.58(d，J＝6Hz，2H， Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ29.1，34.7，36.3，36.7，40.0，42.7，46.5， 54.1，61.7，125.1，126.3，128.0，131.1，144.9，149.1；MS m/z(相对强度) 434.4(MH+，60)，435.4(25)，436.4(30)。
化合物78：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-(2-氟-4-三氟甲基-苄基)-胺。 21mg，产率＝24％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 1.55-1.83(m，12H， Admant-H)，2.20(s，2H，Admant-H)，2.32(s，2H，CH2)，3.88(s，2H，Ar-CH2)， 7.26-7.27(s，4H，Ar-H)，7.29-7.31(m，2H，Ar-H)，7.49-7.53(m，2H，Ar-H)； 13C NMR(300MHz，CDCl3)δ29.0，34.6，36.2，36.7，39.9，42.7，46.5，47.6， 61.7，112.4，112.7，120.8，126.3，128.0，130.4，131.8，149.1；MS m/z(相对 强度)452.7(MH+，100)，453.7(30)，454.7(40)。
化合物79：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-(4-氟-3-三氟甲基-苄基)-胺。 24mg，产率＝38％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.28-1.82(m，12H， Admant-H)，2.19(s，2H，Admant-H)，2.51-2.55(m，1H，CH2)，2.88-2.90(m， 1H，CH2)，3.40(s，1H，NH)，3.76-3.80(m，1H，CH2)，4.08-4.13(m，1H，CH2)， 7.14-7.29(m，5H，Ar-H)，7.57(m，2H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ 28.5，34.3，35.5，36.4，39.8，41.9，42.1，46.3，61.2，66.7，117.4，117.7，126.0， 128.2，129.0，130.5，131.6，135.9，147.7，158.1，161.5；MS m/z(相对强度 rel inensity)452.4(MH+，100)，453.4(50)，454.4(60)。
化合物80：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-(4-三氟甲氧基-苄基)-胺。23 mg，产率＝36％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.28-1.80(m，12H， Admant-H)，2.15(s，2H，Admant-H)，2.53-2.57(m，1H，NCH2)，2.84-2.90(m， 1H，NCH2)，3.38(m，1H，NH)，3.68-3.75(m，1H，NCH2)，4.14-4.19(m，1H， NCH2)，7.13-7.16(d，J＝9Hz，2H，Ar-H)，7.36-7.39(d，J＝9Hz，2H，Ar-H)， 7.2-5-7.27(m，4H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.5，29.0，34.6， 36.3，39.7，40.0，42.7，46.5，53.9，61.7，66.2，120.7，121.2，126.0，126.3， 128.1，129.0，131.6，132.9，147.9；MS m/z(相对强度)450.6(MH+，70)， 451.6(30)，452.6(40)。
化合物81：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-[2-(3-苯氧基-苯基)-乙基]-胺。 27mg，产率＝42％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.50-1.82(m，13H， Admant-CH，NH)，2.16(s，2H，Admant-CH)，2.34(s，2H，CH2)，2.76-2.84(m， 4H，NCH2)，5.63(s(br)，1H，NH)，6.83-7.01(m，5H，Ar-H)，7.07-7.18(m， 2H，Ar-H)，7.22-7.35(m，6H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ29.1， 34.6，36.1，36.7，40.0，42.7，46.5，52.1，62.3，116.4，118.8，119.1，123.1， 123.6，126.3，128.0，129.5，142.2，149.1，157.1；MS m/z(相对强度)472.4 (MH+，100)，473.3(70)，474.3(80)。
化合物82：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-(1-甲基-哌啶-4-基)-胺。12mg， 产率＝6％；油；MS m/z(相对强度)373.6(MH+，100)，374.6(25)， 375.6(36)。
化合物83：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-(4-甲基-哌嗪-1-基)-胺。产率 ＝12％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.54-1.82(m，12H，Admant-H)， 2.17(s，2H，Admant-H)，2.52(s，2H，CH2)，2.63(s，3H，NCH3)，2.77-2.80(m， 4H，NCH2)，2.98-3.15(m，4H，NCH2)，7.28(s，4H，Ar-H)；13C NMR(300 MHz，CDCl3)δ28.8，29.0，34.3，36.2，39.8，40.0，42.3，42.6，45.9，46.5，50.4， 51.5，54.6，58.5，59.6，60.3，126.3，128.0，131.2，148.1，149.4；MS m/z(相对 强度)374.7(MH+，30)，375.7(5)，376.7(8)。
化合物84：N-叔丁基-N′-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-丙烷-1，3-二胺。
产率＝18％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.29-1.32(m，6H，CH2)， 1.55-1.90(m，21H，Admant-CH，C(CH3)3)，2.21-2.46(m，2H，Admant-CH)， 2.42-2.87(m，2H，NH)，3.29-3.31(d，J＝6Hz，2H，CH2)，7.26-7.28(m，4H， Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ 26.4，26.6，28.6，28.7，28.8，36.2， 38.2，38.4，38.6，39.7，42.7，44.6，126.3，128.0；MS m/z(相对强度)389.6 (MH+，100)。
化合物85：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-(3-吡咯烷-1-基-丙基)-胺。15 mg，产率＝15％；m.p.：138-140℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.56-1.91 (m，18H，Admant-CH，CH2)，2.21-2.46(m，5H，Admant-CH，NH，CH2)， 2.72-2.89(m，6H，CH2)，3.52(m，2H，CH2)，7.26-7.28(m，4H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ22.8，22.9，23.3，28.6，29.8，34.6，35.6，36.6，39.6， 39.8，42.1，42.2，46.1，56.6，61.2，61.3，62.2，126.2，128.2，131.5，147.9；MS m/z(相对强度)387.6(MH+，100)，388.6(60)，389.6(65)。
化合物86：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-[2-(1-甲基-吡咯烷-2-基)-乙 基]-胺。23mg，产率＝24％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.54-1.87(m， 20H，CH2，Admant-H)，2.18(s，2H，Admant-H)，2.29-2.41(m，4H，CH2)， 2.62(m，3H，NCH3)，2.87-3.18(m，1H，NCH)，3.36(m，1H，NH)，7.27(s，4H， Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ29.0，36.2，36.7，40.0，40.6，42.7，46.6， 48.6，57.2，64.7，126.3，128.0；MS m/z(相对强度)387.4(MH+，100)，388.4 (33)，389.4(40)。
化合物87：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-(2-吗啉-4-基-乙基)-胺。9mg， 产率＝9％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.57-1.90(m，16H，Admant-H)， 2.25(s，2H，Admant-H)，2.36-2.47(m，4H，CH2)，2.73-2.99(m，4H，NCH2)， 3.57-3.58(m，2H，NCH2)，4.32(m，1H，NH)，7.27(s，4H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.6，29.1，35.7，36.2，39.7，40.0，46.6，47.4，53.8， 54.5，55.4，62.9，67.1，126.1，16.3，128.0，128.2；MS m/z(相对强度)389.7 (MH+，100)，390.7(33)，391.7(40)。
化合物88：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-吡啶-4-基甲基-胺。产率＝72％； 油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.55-1.84(m，12H，Admant-H)，2.20(s，2H， CH2)，2.29(s，2H，Admant-H)，3.90(s，2H，Ar-CH2)，7.26-7.28(s，4H，Ar-H)， 7.49-7.51(d，J＝6Hz，2H，Ar-H)，8.59-8.51(d，J＝6Hz，2H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.9，34.6，36.0，36.5，39.8，42.5，46.3，52.6，61.7， 123.9，126.2，127.9，128.0，131.0，146.8，148.9，154.6；MS m/z(相对强度) 367.7(MH+，100)，368.7(35)，369.7(60)。
化合物89：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-(9-乙基-9H-咔唑-3-基)-胺。 77mg，产率＝81％；油；MS m/z(相对强度)468(MH+，20)。
化合物90：[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基甲基]-[5-(4-氯苯基)-噻唑-2-基]-胺。 15.5mg，产率＝21％；油；MS m/z(相对强度)469(MH+，30)。
实施例6.合成金刚烷基乙胺和金刚烷基乙酰胺化合物的方法。
作为实例，合成金刚烷基乙胺和金刚烷基乙酰胺化合物的方法在方 案4中描述。如实例1中的描述制备取代-1-金刚烷羰酰氯(4)。在含氢氧 化钠的甲苯中，4与丙二酸二甲酯反应得到(3-R-取代-苯基-1-金刚烷羰基) 丙二酸二甲酯(5)，其再被醋酸与水和硫酸的混合物 (CH3COOH-H2O-H2SO4比例为10∶3∶1)水解而得到相应的3-R-取代-苯基 -1-金刚烷基甲酮(6)。酮6与甲酰胺和甲酸反应(Leukart反应)得到7， 而7能够通过烷化或酰化修饰而产生金刚烷基乙胺化合物(8)或金刚烷基 乙酰胺化合物(9)。

方案4
合成金刚烷基乙胺化合物的第二种方法在方案5中描述。如上所述 制备3-R-取代-苯基-1-金刚烷基甲酮(6)。通过6与取代的一级胺在甲酸中 的反应，即Wallach反应，获得相应的金刚烷基乙胺化合物(8)。例如， 通过4-氯-6与4-氨基-1-甲基哌啶的反应，而4-氨基-1-甲基哌啶通过N- 甲基哌啶酮转化为相应的肟来合成，其后使用氢化锂铝(LiAlH4)反应 生成氨基化合物，即获得也称为化合物107的{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1- 基]-乙基}-(1-甲基-哌啶-4-基)-胺。

方案5
以下实例提供了此过程的几种代表性产物；然而，能够调整这些方 法而产生许多结构上相关的可视作本发明对象的金刚烷基乙胺或金刚烷 基乙酰胺。
实施例7.金刚烷基乙胺的合成。
使用实施例6描述的方法来制备取代的金刚烷基乙胺库。以下提供 的数据包括：合成量、反应的产率、化合物的熔点(m.p)、和化合物的质 谱(MS)数据。
化合物91：1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙胺。产率＝77％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.95-0.98(m，3H，CH3)，1.30-2.22(m，16H， Admant-CH，NH2)，4.24-4.30(m，1H，CH)，7.26-7.29(m，4H，H-Ar)；MS m/z(相对强度)290.4(MH+，40)。
化合物92：{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基}-异丙基-胺。产率＝27％； 油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.91-0.94(d，J＝6Hz，6H，2CH3)， 1.15-1.68(m，12H，Admant-CH)，1.81(m，3H，CH3)，2.19(s，2H， Admant-CH)，3.74-3.76(m，1H，HN)，4.24-4.30(m，1H，CH)，7.26-7.29(m， 4H，H-Ar)。
化合物93：苯基-[1-(3-苯基-金刚烷-1-基)-乙基]-胺。
化合物94：{1-[3-(4-氟苯基)-金刚烷-1-基]-乙基}-苯基-胺.
化合物95：{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基}-苯基-胺。产率＝19％； 油。
化合物96：(1-金刚烷-1-基-乙基)-苄基-胺。产率＝64％；m.p.：62-64℃；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.12-1.16(d，J＝8Hz，3H，CH3)，1.56-2.01(m，17H， Admant-CH，CH2)，3.03(m，1H，HN)，4.24-4.40(m，1H，CH)，7.26-7.30(m， 4H，Ar-H)，8.32(s，1H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ11.6，29.1， 32.5，35.8，36.7，38.6，41.9，42.2，44.8，46.0，46.4，54.7，126.6，128.5，131.8， 148.6；MS m/z(相对强度)270.5(MH+，10)。
化合物97：苄基-[1-(3-苯基-金刚烷-1-基)-乙基]-胺。产率＝41％；油。
化合物98：苄基-{1-[3-(4-氟苯基)-金刚烷-1-基]-乙基}-胺。产率＝42％；油； 1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.92-0.95(d，J＝6Hz，3H，CH3)，1.49-2.10(m， 21H，Admant-CH，CH2)，2.19-2.29(m，6H，NCH)，2.79-2.94(m，1H，HN)， 6.94-7.04(m，2H，Ar-H)，7.28-7.35(m，2H，Ar-H)；13C NMR(300MHz， CDCl3)δ28.98，35.73，36.71，38.77，42.18，42.37，44.88，122.38，125.30， 126.57，128.56，129.26，148.39，150.2；MS m/z(相对强度)364.5(MH+， 75)，365.5(20)。
化合物99：苄基-{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基}-胺。产率＝25％；油； 1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.13-1.17(d，J＝8Hz，3H，CH3)，1.59-2.05(m， 15H，Admant-CH，CH2)，2.23(s，2H，Admant-H)，3.03(m，1H，HN)， 4.04-4.10(m，1H，CH)，7.20-7.31(m，8H，Ar-H)，8.33-8.35(s，1H，Ar-H)； 13C NMR(300MHz，CDCl3)δ11.6，29.1，32.5，35.8，36.7，38.6，41.9，42.2， 44.8，46.0，46.4，54.7，126.6，128.5，131.8，148.6；MS m/z(相对强度)380.4 (MH+，80)。
化合物100：(4-叔丁基-苄基)-{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基}-胺。 产率＝2％；油；MS m/z(相对强度)436.3(MH+，30)。
化合物101：[1-(4-溴苯基)-乙基]-{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基}- 胺。产率＝3％；油；MS m/z(相对强度)472.2(MH+，98)，474.2(MH+， 100)。
化合物102：(1-金刚烷-1-基-乙基)-[2-(4-溴苯基)-乙基]-胺。产率＝0.4％； 油；MS m/z(相对强度)362.2(M-H+，98)，364.2(M-H+，100)。
化合物103：[2-(4-溴苯基)-乙基]-{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基}- 胺。产率＝11％；油；MS m/z(相对强度)472.1(MH+，50)，474.1(MH+，60)。
化合物104：(1-金刚烷-1-基-乙基)-(1-甲基-哌啶-4-基)-胺。产率＝16％；油；
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 0.91-0.94(d，J＝9Hz，3H，CH3)，1.43-2.00(m， 23H，Admant-CH，CH2)，2.25(m，3H，NCH3)，2.47-2.50(m，1H，NH)， 2.76-2.80(m，2H，HC-N)；MS m/z(相对强度)275.2(M-H+，45)。
化合物105：(1-甲基-哌啶-4-基)-[1-(3-苯基-金刚烷-1-基)-乙基]-胺。产率 ＝29％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.92-0.95(d，J＝6Hz，3H，CH3)， 1.49-2.10(m，21H，Admant-CH，CH2)，2.19-2.29(m，6H，NCH)，2.79-2.94 (m，1H，HN)，6.94-7.04(m，2H，Ar-H)，7.28-7.35(m，5H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.98，35.73，36.71，38.77，42.18，42.37，44.88， 122.38，125.30，126.57，128.56，129.26，148.39，150.2；MS m/z(相对强度) 353.6(MH+，85)，354.6(25)。
化合物106：{1-[3-(4-氟苯基)-金刚烷-1-基]-乙基}-(1-甲基-哌啶-4-基)-胺。 产率＝11％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ 0.92-0.95(d，J＝6Hz，3H， CH3)，1.49-2.10(m，21H，Admant-CH，CH2)，2.19-2.29(m，6H，NCH)， 2.79-2.94(m，1H，HN)，6.94-7.04(m，2H，Ar-H)，7.28-7.35(m，2H，Ar-H)； 13C NMR(300MHz，CDCl3)δ28.98，35.73，36.71，38.77，42.18，42.37， 44.88，122.38，125.30，126.57，128.56，129.26，148.39，150.2；MS m/z(相对 强度)371.5(MH+，85)，372.5(50)，373.5(8)。
化合物107：{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基)-(1-甲基-哌啶-4-基)-胺。 产率＝28％；油；1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.95-0.98(d，J＝6Hz，3H， CH3)，1.30-2.75(m，29H，Admant-CH，)，3.74-3.76(m，1H，HN)， 4.24-4-30(m，1H，CH)，7.26-7.29(m，4H，H-Ar)；MS m/z(相对强度)387.3 (MH+，65)。
化合物108：{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基)-(4-甲基-哌嗪-1-基)-胺。 产率＝23％；油；MS m/z(相对强度)389.2(MH+，100)。
化合物109：[1-(3-苯基-金刚烷-1-基)-乙基]-吡啶-4-基甲基-胺。产率＝16％； 油；MS m/z(相对强度)347.2(MH+，30)。
化合物110：{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基)-(6-氯-吡啶-3-基甲基)- 胺。产率＝18％；油；MS m/z(相对强度)415.2(MH+，20)。
化合物111：{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基)-(2-吡啶-4-基-乙基)-胺。 油。
化合物112：{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基)-(3H-咪唑-4-基甲基)- 胺。油。
化合物113：{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基)-(2-甲基-1H-吲哚-5-基)- 胺。产率＝5％；油；MS m/z(相对强度)417.2(M+-H，15)。
化合物114：{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基)-(9-乙基-9H-咔唑-3-基)- 胺。产率＝60％；m.p.：70-72℃；MS m/z(相对强度)482(M+，50)，483(MH+， 25)，484(20)。
化合物115：{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基)-(9-乙基-9H-咔唑-3-基 甲基)-胺。产率＝13％；油；MS m/z(相对强度)496.2(M-H+，30)。
化合物116：9-乙基-9H-咔唑-3-羧酸{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基)- 酰胺。产率＝28。
化合物117：1-{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基}-3-(4-氯-3-三氟甲基- 苯基)-脲。产率＝6％；m.p.：103-105℃；MS m/z(相对强度)511.2(MH+， 5)。
化合物118：1-{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基)-3-(4-氯-3-三氟甲基-苯 基)-脲。m.p：103-105℃：1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δ1.05-1.07(d，J＝6Hz， 3H，CH3)，1.50-1.80(m，12H，Admant-CH)，2.18(s，2H，Admant-CH)，3.62-3.68 (m，1H，CH)，4.83-4.86(m，1H，HN)，6.91-6.94(m，1H，NH-Ar)，7.20-7.28(m， 4H，Ar-H)，7.32-7.35(d，J＝9Hz，1H，Ar-H)，7.48-7.51(d，J＝9Hz，1H，Ar-H)， 7.60(s，1H，Ar-H)；13C NMR(300MHz，CDCl3)δ15.2，28.8，36.0，36.5，37.6， 37.8，42.4，54.0，56.1，117.8，122.8，126.2，128.1，131.8，132.7，154.6；MS m/z (相对强度)511(MH+，5)。
化合物119：(4-溴-噻吩-2-基甲基)-{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基}- 胺。产率＝8％；油；MS m/z(相对强度)464.1(MH+，50)。
化合物120：{1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙基}-(4-苯基-噻吩-2-基甲 基)-胺。产率＝8％；油；m/z(相对强度)463.0(MH+，100)。
实施例8.合成金刚烷基丙烯酮的方法。
作为实例，合成金刚烷基丙烯酮化合物的方法在方案5中描述。如 上所述制备3-R-取代-苯基-1-金刚烷基甲酮(6)。通过6与取代的醛反应， 获得相应的金刚烷基丙烯酮化合物(10)。例如，通过与4-氯-6与4-羟基 苯甲醛的反应，获得也称为化合物132的1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1- 基]-3-(4-羟基-苯基)-丙烯酮。

方案5
实施例9.金刚烷基丙烯酮的合成。
使用实施例6描述的方法来制备取代的金刚烷基丙烯酮化合物库。 以下提供的数据包括：反应的产率、化合物的熔点(m.p)、和化合物的质 谱(MS)数据。
化合物121：3-苯基-金刚烷-1-羧酸。
化合物122：3-(4-氟苯基)-金刚烷-1-羧酸。
化合物123：3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸。产率＝79％。
化合物124：1-金刚烷-1-基-乙酮。m.p.：44-46℃。
化合物125：1-(3-苯基-金刚烷-1-基)-乙酮。产率＝54％；1H NMR(300MHz， CDCl3)δ1.73-2.10(m，12H，Admant-CH)，2.14(s，3H，CH3)，2.27(s，2H， Admant-CH)，7.25-7.26(m，1H，Ar-H)，7.30-7.36(m，4H，H-Ar)。
化合物126：1-[3-(4-氟苯基)-金刚烷-1-基]-乙酮。产率＝59％；59％；油；
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ1.73-1.90(m，12H，Admant-CH)，2.10(s，3H， CH3)，2.27(s，2H，Admant-CH)，6.96-7.04(m，2H，Ar-H)，7.28-7.35(m，2H， H-Ar)。
化合物127：1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-乙酮。产率＝54％(2步)；m.p.： 54-56℃。
化合物128：2-(金刚烷-1-羰基)-丙二酸二甲酯。产率＝80％；油。
化合物129：2-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羰基]-丙二酸二甲酯。产率＝91％； 油。
化合物130：3-(4-氯苯基)-1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-丙烯酮。产率＝ 18％。
化合物131：4-{3-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-3-氧代-丙烯基}-苄腈。
化合物132：1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-3-(4-羟基-苯基)-丙烯酮。产率 ＝16％；m.p.：87-89℃；MS m/z(相对强度)393.2(MH+，100)。
化合物133：1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-3-萘-2-基-丙烯酮。产率＝20％； m.p.：82-84℃。
化合物134：1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-3-(6-氯-吡啶-3-基)-丙烯酮。产 率＝4％。
化合物135：1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-3-(1H-咪唑-4-基)-丙烯酮。产 率＝3％；油。
化合物136：1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-3-(9-乙基-9H-咔唑-3-基)-丙烯 酮。产率＝3％；m.p.：138-140℃。
化合物137：1-[3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-基]-3-(4-苯基-噻吩-2-基)-丙烯酮。 产率＝13％。
实施例10.抑制人SK活性的分析。
已经确立了鉴定重组人SK抑制剂的分析方法(French et al.，2003， Cancer Res 63：5962)。将人SK的cDNA亚克隆到pGEX细菌表达载体中， 从而导致该酶作为融合蛋白与谷胱甘肽-S-转移酶一起表达，其后该融合 蛋白在固定有谷胱甘肽的柱子上纯化。SK活性的测量方法如下：重组SK 与[3H]鞘氨醇和1mM ATP在指定条件下一起温育，再在碱性条件下使用 氯仿：甲醇提取待分析混合物。这使得未反应的[3H]鞘氨醇部分进入有机 相，而新合成的[3H]S1P部分进入水相。其后对等量水相的放射性定量作 为对所形成[3H]S1P的测量。进入水相的[3H]鞘氨醇部分的背景水平低， 重组SK的添加大大提高了[3H]S1P的形成。阳性对照DMS在大于25μM 浓度时完全抑制SK活性。
在另一个分析方法中，重组人SK与上述未标记的鞘氨醇和ATP一 起温育。30分钟后，添加乙腈终止反应从而直接提取出新合成的S1P。 其后按以下方法定量样品中的S1P量。17个碳(C17 base)的D-赤型-鞘 氨醇和C17 SIP分别作为鞘氨醇和S1P的内标。这些17个碳的脂肪酸连 接的鞘脂不是自然产生的，使这些类似物成为优秀的标准。通过高效液 相色谱分级脂质，使用C8-反相柱用1mM甲酸铵甲醇液/2mM甲酸铵水 溶液洗脱。在多种反应中使用Finnigan LCQ Classic LC-MS/MS监测阳离 子化模式而得到鞘氨醇的m/z 300(前体离子)→282(产物离子)的离子和 S1P的380→264的离子。通过绘制每个鞘脂合成标准的峰面积比值而 得出标准曲线，用来测定样品中鞘氨醇和S1P的标准化量。
实施例11.通过本发明的化合物对人SK的抑制。
使用上述LC/MS/MS分析测试本发明每种化合物抑制重组SK的能 力。通常，将化合物各自溶解在二甲基亚砜中，在终浓度为6μg/ml时测 试。分析的结果见表3。数据显示出通式I的化合物表现出抑制重组SK 体外活性的能力范围。在6μg/ml浓度(相应于大约15毫摩尔)时，有 几种化合物完全抑制了SK活性。如在下述实施例中所详述，口服接受化 合物的小鼠血液中的化合物浓度明显更高，说明化合物足以用于治疗用 途。
尽管许多化合物抑制纯化的SK酶，但确定它们在完整细胞中抑制 内源SK的能力还是有用的。我们之前已经描述了完整细胞分析，其中使 用测试化合物处理后，MDA-MB-231人乳腺癌细胞与终浓度为1μM的 [3H]鞘氨醇温育(French et al.，Cancer Res 63：5962(2003))。细胞摄取了 外源[3H]鞘氨醇并通过内源SK的作用将其转化为[3H]S1P。所得[3H]S1P 如上所述通过基于电荷的分离方法而分离。该分析的结果显示在表3中。 数据显示了许多抑制纯化SK的化合物在完整细胞中也抑制SK活性。对 于效力研究，MDA-MB-231细胞暴露于多种浓度的测试化合物中，再分 析[3H]鞘氨醇到[3H]S1P的转化。每种化合物以剂量依赖的方式降低 [3H]S1P的形成，它们的IC50值在15至64μM范围内。这些结果说明通 式I或II的化合物在完整细胞中有效地抑制SK活性。
表3.SK活性的抑制。人SK与6μg/ml指定的化合物温育，再如上所述 分析活性。标记为“重组SK(％抑制)”栏中的数值代表被抑制的SK 活性的百分比。MDA-MB-231细胞与20μg/ml指定化合物温育，再如上 所述分析内源SK活性。标记为“细胞S1P(％抑制)”栏中的数值代表 被抑制的S1P生产的百分比。另外，MDA-MB-231细胞用多种浓度的特 定化合物处理，再测定细胞所产生的S1P的量。标记为“细胞S1P IC50 (μM)”栏中的数值代表抑制S1P生产达50％所需要的化合物浓度。ND＝ 未测定。
化合物 重组SK(％抑制) 细胞S1P(％抑制) 细胞S1P IC50(μM)  1  38     0  ND  2  0     ND  ND  3  6     ND  ND  4  44     14  ND  5  100     17  ND  6  72     90  15  7  100     96  ND  8  49     0  ND  9  84     40  ND  10  3     9  ND  11  17     0  ND  12  36     3  ND  13  78     0  ND
 14  19     ND  ND  16  8     ND  ND  17  56     ND  ND  18  0     ND  ND  20  0     ND  ND  21  65     ND  ND  22  56     ND  ND  23  0     ND  ND  24  20     ND  ND  25  47     ND  ND  26  36     ND  ND  27  50     ND  ND  28  6     ND  ND  29  55     0  ND  30  1     ND  ND  31  74     ND  ND  32  17     ND  ND  33  10     ND  ND  34  0     ND  ND  35  87     0  ND  36  37     72  ND  37  24     36  ND  38  40     34  ND  39  19     26  ND  40  100     52  ND  41  67     23  ND  42  5     ND  ND  43  0     0  ND  44  33     88  35  45  64     ND  ND  46  4     ND  ND  47  26     ND  ND  48  36     14  ND  49  33     ND  ND
  50  0     44  ND   51  84     88  25   52  54     61  ND   53  52     ND  ND   54  95     ND  ND   55  8     ND  ND   56  33     40  ND   57  30     83  60   58  67     55  ND   59  0     ND  ND   60  0     23  ND   61  58     24  ND   62  13     92  26   63  0     39  ND   64  41     80   63   65  3     ND  ND   66  92     8  ND   67  10     ND  ND   68  17     0  ND   69  40     13  ND   70  33     4  ND   71  27     0  ND   72  14     1  ND   73  53     ND  ND   74  0     28  ND   75  ND     41  ND   76  42     ND  ND   77  27     ND  ND   78  43     ND  ND   79  19     ND  ND   80  5     ND  ND   81  67     ND  ND   82  75     ND  ND   83  60     88  16
 84  84     ND  ND  85  0     ND  ND  86  6     ND  ND  87  75     55  64  88  1     ND  ND  89  37     1  ND  90  26     16  ND  93  70     ND  ND  104  0     ND  ND  114  33     46  51  118  77     5  ND  130  38     ND  ND  131  41     ND  ND  132  8     ND  ND  133  36     ND  ND  134  52     ND  ND  135  64     ND  ND
实施例12.本发明SK抑制剂的选择性。
因为这些化合物中大部分与激酶中高度保守的核苷酸结合结构域 相互作用，所以开发蛋白激酶抑制剂的一个常见问题是缺少针对靶激酶 的选择性。为确定本发明的化合物是否是非选择性的激酶抑制剂，测定 了SK抑制剂，即化合物62对不同板的20个纯化激酶的作用。该化合物 在50μM的单一浓度下进行测试。激酶和该SK抑制剂的作用见表4。
数据显示了化合物62对SK的高特异性，因为所测试的20个不同 的激酶中没有一个被该化合物显著的抑制。该板包括丝氨酸/苏氨酸激酶 和酪氨酸激酶，以及几种通过其与脂质相互作用而被调控的激酶。总的 来说，数据说明本发明化合物的生物作用不被蛋白激酶的非靶向抑制所 调节。
表4.化合物62的选择性。数值代表在存在50μM化合物62的情况下指 定激酶的对照活性的百分比。
激酶 化合物62  激酶 化合物62 Ca2+/钙调蛋白PK IV 81±3  MEK激酶1 104±3 Abl 98±0  CHK1 142±13 Aurora-A 103±1  EFGR 101±3 蛋白激酶Cα 86±5  Fyn 84±5 蛋白激酶Cε 101±1  cSrc 115±3 CDK1/细胞周期蛋白B 105±1  IKKα 150±16 CDK2/细胞周期蛋白E 106±6  PKA 104±5 P38 MAP激酶1 94±2  PKBα 95±2 P38 MAP激酶2 109±5  PKBγ 105±8 PDK1 116±3  cRaf 96±5
实施例13.本发明SK抑制剂的细胞毒谱。
为进一步评价该化合物在完整细胞中的生物效力，使用人癌细胞系 评估每种化合物的细胞毒性。这些实验所采用的方法是已经广泛使用的 方法。所测试的细胞系包括MCF-7人乳腺癌细胞和MCF-10A非转化人 乳腺上皮细胞。所指定的细胞系用多种剂量的测试化合物处理48h。然后 使用SRB结合分析测定细胞存活率(Skehan et al.，1990，J Natl Cancer Inst 82：1107)，并计算抑制增殖达到50％(IC50)的化合物浓度。本发明化合物 的细胞毒性总结在表5中。数值(μM)代表重复试验的平均值±SD。如 数据所表明的，本发明的化合物在低微摩尔(sub-to-low-micromolar)下 仍可抗增殖。在许多情况下，转化的MCF-7细胞比非转化的MCF-10A 细胞显著地更敏感。这说明化合物在患者体内抑制肿瘤细胞的生长而不 诱导对正常细胞的毒性。总的来说，数据说明这些化合物能够进入完整 细胞并阻止它们增殖，从而使这些化合物对上述适应症有用。
表5.本发明化合物的抗癌活性。测定指定化合物对人乳腺癌细胞(MCF-7) 和非转化人乳腺上皮细胞(MCF-10A)的细胞毒性。数值代表抑制细胞增 殖的平均IC50。ND＝未测定。
化合物  MCF-7  IC50(μM)  MCF-10A  IC50(μM) 化合物  MCF-7  IC50(μM)  MCF-10A  IC50(μM)  1  23  151  71  21  118  2  20  ND  72  2  6  3  18  ND  73  80  ND  4  72  137  74  3  70
  5   ND   30   75   11   ND   6   5   15   76   5   ND   7   3   ND   77   ND   ND   8   47   94   78   30   ND   9   9   17   79   ND   ND   10   ND   170   80   ND   ND   11   87   87   81   ND   ND   12   11   99   82   ND   ND   13   51   115   83   5   ND   14   36   ND   84   ND   ND   15   ＞112   ND   85   ND   ND   16   17   ND   86   5   ND   17   17   ND   87   38   33   18   19   ND   88   11   ND   19   ＞108   ND   89   74   41   20   33   ND   90   96   107   21   27   ND   91   5   4   22   18   ND   92   2   6   23   23   ND   93   15   ND   24   17   ND   94   0.6   ND   25   87   ND   95   22   68   26   19   ND   96   9   9   27   8   ND   97   0.5   ND   28   64   ND   98   3   ND   29   7   106   99   0.7   ND   30   14   ND   100   0.3   ND   31   74   ND   101   10   ND   32   24   ND   102   2   ND   33   30   ND   103   ND   ND   34   ＞106   ND   104   34   ND   35   19   ND   105   5   14   36   13   9   106   2   6   37   5   127   107   1   1   38   9   40   108   5   ND
  39   15   106   109   26   ND   40   6   37   110   6   ND   41   6   71   111   13   ND   42   ＞100   ND   112   5   ND   43   27   ND   113   14   ND   44   6   9   114   55   9   45   17   ND   115   1   ND   46   91   ND   116   6   ND   47   16   ND   117   3   ND   48   ND   ND   118   ND   ND   49   68   ND   119   11   ND   50   181   ND   120   108   ND   51   8   25   121   13   176   52   10   15   122   155   182   53   11   ND   123   48   95   54   11   ND   124   11   105   55   ND   ND   125   8   59   56   10   ND   126   2   6   57   6   8   127   6   16   58   20   36   128   34   63   59   ND   ND   129   16   105   60   7   ND   130   7   ND   61   ND   ND   131   27   ND   62   17   21   132   17   ND   63   11   ND   133   13   ND   64   8   20   134   16   ND   65   ND   ND   135   3   ND   66   19   53   136   8   ND   67   ND   ND   137   9   ND   68   54   104   69   30   106   70   7   103
实施例14.本发明SK抑制剂的抗癌活性调查。
以上提供的数据显示了本发明化合物抑制人乳腺癌细胞增殖的能 力。为检验代表化合物抗癌活性的范围，测定化合物62和57对代表几 个主要肿瘤类型的一组多种人肿瘤细胞系的化疗效力。数据显示在表6， 说明本发明的化合物对多种癌症具有抗癌活性。
表6.SK抑制剂对人肿瘤细胞系的效力。用SK抑制剂处理稀疏涂布的细 胞48小时，使用磺酰罗丹明B测定细胞生存力并与媒介-(DMSO)处理的 细胞比较。数据是至少3次独立实验的平均值+SD。
IC50(μM) IC50(μM) 细胞系 组织 化合物62 化合物57 1025LU 黑色素瘤 33.7±2.7  7.2±0.8 A-498 肾 12.2±6.0  8.0±3.5 Caco-2 结肠 11.8±5.6  3.2±2.0 DU145 前列腺 21.9±1.5  8.7±3.3 Hep-G2 肝 6.0±2.6  5.0±1.8 HT-29 结肠 48.1±7.6  9.6±4.0 MCF-7 乳腺，ER+ 18.4±7.4  12.1±3.1 MDA-MB-231 乳腺，ER- 29.1±11.1  12.5±2.5 Panc-1 胰脏 32.8±0.1  14.1±6.3 SK-OV-3 卵巢 10.5±2.6  9.2±2.8 T24 膀胱 39.4±7.4  12.7±2.8
实施例15.本发明SK抑制剂的体内毒性。
例如，已发现化合物62和57能够至少以15mg/ml(～30-40mM)的浓 度溶解在DMSO∶PBS中用于腹腔内(IP)施用或溶解在PEG400中用 于口服给药。使用IP给药的急性毒性研究显示在用高达至少50mg/kg的 化合物62和57处理雌性Swiss-Webster小鼠时，小鼠没有立即出现毒性 或延迟出现毒性。向相同的小鼠每两天重复注射超过15天时，显示出没 有毒性的相似结果。对小鼠口服施用每种化合物而没有出现明显的毒性， 口服施用的剂量为高达至少100mg/kg。
实施例16.本发明SK抑制剂的药代动力学。
对化合物62和57进行了口服药代动力学研究。每种化合物溶解在 PEG400中，对雌性Swiss-Webster小鼠经口灌胃100mg/kg的剂量。麻醉 小鼠，并在5分钟、30分钟、1小时、2小时和8小时通过心脏穿刺取血。 使用液-液萃取、合适的内标和具有UV检测的反相HPLC测定测试化合 物的浓度。对照血液样品用来确定化合物特定的峰。使用WINNONLIN 分析软件包(Pharsight)来计算药代动力学参数。测试了非房屋模型和 房屋模型，最适用方程式所得的结果见表7。
表7.SKI抑制剂的口服药代动力学数据。

这些研究说明，口服给药后1h，血液中可检测到较大量的每种化合 物。两种化合物都具有优秀的PK性能，其在完整细胞模型中至少8h内 的曲线下面积(AUC)和Cmax(最大血药浓度)值超过重组SK催化活 性的IC50，S1P的形成亦是如此。高半衰期暗示了延长的活性，其降低了 对频繁给药的需要。这些PK性能说明本发明的化合物具有优异的药物性 能，尤其是低毒性的高口服利用度。
对溶解在0.375％Tween-80中的化合物62进行口服生物利用度研 究。经静脉内或口服对雌性Swiss-Webster小鼠施予50mg/kg化合物62。 麻醉小鼠并在1分钟至8小时期间的时间点通过心脏穿刺取血。使用液- 液萃取和偶联了离子阱四极杆质谱仪的反相HPLC对化合物62的浓度定 量。对照血液样品中加入已知量的内标和分析物用来确定化合物特定的 峰并制定量用的标准曲线。使用WINNONLIN分析软件包(Pharsight) 来计算药代动力学参数。测试了非房屋模型和房屋模型，最适用方程式 所得的结果见表8。
表8.化合物62的生物利用度数据。
途径 剂量   AUC0→∞  AUC0→∞   Tmax   Cmax   Cmax   T1/2 (mg/kg)   (μg*h/ml)   (μM*h)   (h)   (μg/ml)   (μM)   (h) 静脉 内 50   56.9   137   0   31.1   74   1.4 口服 50   37.5   90.1   0.25   8   19   4.5
在整个研究期间，化合物62的血液水平超过抑制SK活性的IC50。 与静脉内给药相比，化合物62的口服药代动力学显示了非常好的口服生 物利用度(F＝AUC(口服)/AUC(iv)＝0.66)。这些结果说明化合物62具 有异的药物性能，尤其是口服利用度好，毒性低。
实施例17.本发明SK抑制剂的抗肿瘤活性。
使用同基因肿瘤模型评估代表性SK抑制剂的抗肿瘤活性，同基因肿 瘤模型使用了在具有免疫活性的Balb/c小鼠皮下生长的小鼠JC乳腺腺癌 细胞系(Lee et al.，2003，Oncol Res 14：49)。这些细胞表达了比非转化细胞 提高了的SK活性，以及表现出源于P-糖蛋白活性的多药耐药表型。
数据显示在图1和2中。在图1中，对6-8周龄的Balb/c小鼠皮下 注射悬浮在磷酸盐缓冲盐水中的106个JC细胞。SK抑制剂化合物62和 57溶解在PEG400中，并以100mg/kg的剂量每两天施用。每日监测体 重和肿瘤体积。在图1中，每个动物的肿瘤生长以相对于第1天的肿瘤 体积表示。
如在图1中显示的，使用任一种SK抑制剂处理的动物体内肿瘤的生 长比对照动物中肿瘤的生长明显缓慢(在第16天降低＞70％)。化合物 62和57与对照相比分别抑制69和78％的肿瘤生长。图1的插图显示了 在此实验期间的动物体重。3组中没有观察到动物体重的明显不同，说明 任一种SK抑制剂都不具有明显的毒性。
化合物62的剂量响应研究说明该化合物在35kg/kg或更高的剂量口 服施用时具有抗肿瘤活性(图2)。任何剂量下都未观察到对小鼠的毒性。
测试了本发明其他化合物抑制小鼠体内JC腺癌细胞生长的能力。结 果总结在表9中。
表9.SK抑制剂的体内抗肿瘤活性。在JC肿瘤模型中对腹腔内(ip) 或口服(po)施用的指定化合物进行测试。如果化合物相对于对照动物 的肿瘤抑制至少60％的肿瘤生长，该化合物则表示为具有活性。
化合物     体内活性     44     具有活性-ip     51     具有活性-ip和po     57     具有活性-po     62     具有活性-ip和po     107     具有活性-ip
实施例18.SK抑制剂对VEGF诱导的血管通透性的体内作用。
使用Miles和Miles描述的方法测量VEGF对体内血管渗漏的作用 (Miles et al.，1952，J Physiol 118：228)。多组雌性无胸腺裸鼠(大约20g) 腹腔内单独注射50微升的DMSO或单独注射50微升的化合物62(75 mg/kg)。在一些实验中，化合物62以100mg/kg的剂量口服施用。30 分钟后，尾静脉注射100μL溶解在PBS的0.5％伊文思蓝染料。30分钟 后，小鼠接受第一轮连续3次(每30分钟)的左后胁皮内注射VEGF(每 次注射含400ng VEGF的20μL PBS)。作为对照，相似地注射PBS到右 后胁。最后一次注射后30分钟，通过使用卡尺测量蓝色皮肤上斑点的长 度和宽度估计染料从静脉到皮肤的渗漏。
施用VEGF皮内药丸导致蛋白结合的染料渗漏至皮肤，这说明血管 通透性的局部升高。如在图3中显示的，当在VEGF处理前1小时腹腔 内或口服施用化合物62时，可以显著地降低血管渗漏(3小时后测定)。 因此，本发明的SK抑制剂具有抑制响应VEGF的体内血管渗漏的能力。
实施例19.SK抑制剂对糖尿病视网膜病的体内作用。
使用150-175g的雄性Sprague-Dawley大鼠。通过过夜禁食后腹腔内 注射链脲佐菌素(柠檬酸盐缓冲液中65mg/kg)产生糖尿病。假注射的无 糖尿病动物作为对照。注射后3天测量血糖，血糖超过250mg/dL的动 物作为糖尿病大鼠用于本研究。在研究期间每周监测血糖水平和体重。 在第45天，在对照和糖尿病大鼠组中测量视网膜血管通透性(Antonetti et al.，1998，Diabetes 47：1953，Barber et al.，2005，Invest Ophthalmol Vis Sci 46：2210)。简单来说，测量动物体重，用克他命/赛拉嗪(80/0.8mg/kg)麻 醉并注射异硫氰酸荧光素偶联的牛血清白蛋白(FITC-BSA；Sigma目录号 A-9771)到大腿静脉中。FITC-BSA循环30分钟后，断头处死大鼠。收集 干血以测量FITC-BSA浓度，并迅速摘取眼睛。每只眼睛置于4％多聚甲 醛中1小时并在异戊烷和干冰浴中冷冻于包埋介质中。石蜡包埋的眼睛 在显微镜用薄片切片机上切成10μm的切片。切片脱蜡后，用装配有Sony CLD摄像头的Olympus OM-2荧光显微镜查看。用Leica激光共聚焦软 件(Leica Confocal Software)(2.61版，build 1538，LCS Lite，2004)测量数码 图像的荧光强度。以每个眼睛的平均视网膜强度对用同样方法分析的非 注射对照和动物的血浆荧光进行标准化。通过对眼睛的连续切片，此技 术能够定量视网膜中的不同的血管通透性(Antonettiet al.，1998，Diabetes 47：1953，Barber et al.，2005，Ibid.)。
剩余的对照动物再饲养6周，即直到第87天，同样处理剩余的糖尿 病大鼠，并分为未处理、低剂量化合物62(25mg/kg)或高剂量化合物 62(75mg/kg)处理组。从第45天至第87天，每周5天通过腹腔内注 射化合物62(溶解在0.375％的Tween-80中)。在第87天，如上所述测 量所有剩余动物的视网膜血管通透性。使用兔多克隆抗体染色切片以确 定SK的免疫活性，并使用Hoescht复染细胞核。
保留高血糖大鼠45天不处理，使视网膜病得到发展。此时，通过使 用定量图像分析测量FITC-标记的BSA至视网膜的渗漏来评估对照和糖 尿病大鼠的视网膜血管通透性。糖尿病大鼠基本上提高了标记的BSA进 入视网膜内网和外核层的渗漏。图像的定量显示出糖尿病大鼠视网膜中 FITC-BSA的渗漏量提高了大约4倍。因此，在用SK抑制剂处理开始前 已经出现了实质性的糖尿病诱发的血管受损。
所有存活的大鼠在第87天处死，以FITC-BSA到视网膜的渗漏来评 估视网膜病。如图4所示的，与对照大鼠相比，糖尿病大鼠的视网膜血 管通透性显著升高。以任何剂量的SK抑制剂化合物62处理的糖尿病动 物比未处理的糖尿病大鼠实质上降低了FITC-BSA渗漏水平。该化合物 的这种作用在视网膜的内网层和外核层中都有表现。
使用如上所述的SK抗体的免疫组织化学来评估SK在这些动物视网 膜中的表达。因为荧光出现在无SK抗体温育的样品中，所以在视网膜色 素上皮和外层中的荧光是非特异的。对照大鼠的视网膜切片只有低水平 的SK特异染色；而SK的表达在神经节细胞层以及在内核层和内网层分 界面上的特定细胞体和突出(projections)中显著提高。也在低剂量和高剂 量化合物62处理的动物中观察到SK表达的提高。因此，长时间的高血 糖状态似乎与视网膜SK水平的提高相关，而视网膜SK水平的提高没有 被SK抑制剂正常化。该表达数据说明化合物62非常高效地抑制糖尿病 视网膜中的SK活性，从而阻止了通常在视网膜病中出现的血管通透性的 增加。
实施例20.SK抑制剂对TNFα诱导的NFκB的抑制。
化合物62的优异水溶性使其可以在NFκB报告细胞系(图5)中得 到评估。使用与荧光素酶连接的NFκB响应元件转染的纤维原细胞在暴 露于TNFα时，产生了高水平的荧光素酶。TNFα对NFκB的活化被SK 抑制剂，化合物62以剂量依赖的形式所抑制。
实施例21.SK抑制剂对TNFα诱导的粘附分子表达的抑制。
类似于体内的内皮细胞，HUVECs响应几种生长因子而增殖，并响 应炎症细胞因子如TNFα和IL-1β。对人内皮细胞进行Western分析来评 估SK抑制剂对已知被TNFα调控的信号蛋白的作用。在这些实验中，对 细胞进行血清饥饿处理24小时，再暴露在TNFα(100ng/mL)中6小时。 分析处理细胞的细胞裂解物中的粘附分子ICAM-1和VCAM-1。TNFα引 起参与白细胞招募的粘附蛋白表达的显著升高，其中包括ICAM-1和 VCAM-1。TNFα的这些作用通过用化合物62处理这些细胞而被抑制， 这样这两个蛋白的诱导被25μM化合物完全消除。
实施例22.SK抑制剂对TNFα诱导的前列腺素合成的抑制。
为测定SK抑制剂对Cox-2活性的作用，使用ELISA分析测量用 TNFα处理的IEC6大鼠肠上皮细胞和人内皮细胞生产的PGE2。任一细胞 暴露于TNFα都导致Cox-2活性的显著升高，其活性用PGE2的生产来测 量(图6)。TNFα对Cox-2的这种诱导被化合物62强烈抑制。
总的来说，这些数据说明对SK的抑制会有效地阻止细胞中TNFα起 始的炎症级联反应。期望其能够缓解几种炎症性疾病的病理，其中包括 IBD、关节炎、动脉硬化和哮喘。
实施例23.SK抑制剂在炎症性肠病的急性模型中的体内作用。
在IBD的葡萄糖硫酸钠(DSS)模型中使用SK抑制剂进行实验。在 这些实验中，为雄性C57BL/6小鼠提供随意的标准鼠饲料和水。在它们 适应后，动物随机地分成5或6组用于DSS(分子量40,000MW，从ICN Biomedicals，Inc.，Aurora，OH获得)和药物处理。SK抑制剂溶解在PEG400 中，每日口服给药，每剂量体积为0.1mL。使用地泊坦作为阳性对照， 其为FDA批准的抗结肠炎药物，其中的有效组分是奥沙拉秦，奥沙拉秦 在体内转化为5-氨基水杨酸。对小鼠饲喂正常饮用水或2％的DSS，并以 每日口服50mk/kg的SK抑制剂或地泊坦处理。每天测量每只动物的体 重，在第4-6天对每只动物的疾病活动指数(DAI)进行记录。在第6天， 颈椎脱臼处死动物，取完整结肠并测量长度，测量到最接近0.1cm。将 部分结肠固定、切片并以不记名方式对其组织学进行评估以测定其组织 学分数。使用结肠的其他部分进行炎症标记物的生化分析。
DAI监视了体重下降、大便稠度和便血，其是对疾病严重性的一种 测量方法。接受正常饮用水和PEG作为溶剂对照的动物在整个实验中具 有很低的DAIs(图7)。使小鼠暴露于含有DSS的饮用水，显著诱发了 IBD症状，其中包括体重下降、大便稀、便血。该疾病的严重程度从第4 天开始至小鼠处死的第6天逐渐升高。接受DSS的动物用化合物62或地 泊坦的处理降低了小鼠IBD表现的严重程度，在第6天时效果最显著。 SK抑制剂和地泊坦在降低接受DSS的小鼠的DAI的能力是基本相等的。 应当注意到此急性模型产生了快速而显著的IBD症状，使其成为药物测 试的严格分析。
在第6天，颈椎脱臼处死动物，测量整个结肠来估算因为瘀痕和损 害导致的缩短，将其后固定、切片并以不记名方式进行组织学测试。与 水对照组相比，使用DSS和PEG处理的小鼠的结肠显著缩短(图8)。 在用DSS处理同时也用化合物62或地泊坦处理的小鼠具有中等长度的结 肠，说明药物的基本保护作用。而且，对任一SK抑制剂的响应至少与用 地泊坦处理的小鼠的响应一样好。
来自多个处理组的结肠切片的组织学检查与DAI终点一致，说明在 DSS单独组中的显著损害在SK抑制剂处理动物中被减少或消除。来自水   处理对照动物的结肠显示出正常的形态，而来自DSS单独处理小鼠的结 肠严重发炎且受损。切片中出现了大量的嗜中性粒细胞，以及严重受损 的隐窝(crypts)，伴随粘膜水肿的中度炎症性浸润。来自使用DSS和化合 物62处理的动物的结肠表现出无或轻微的隐窝受损，无或低水平的炎症 性细胞浸润以及粘膜无水肿。
作为对损伤的可定量测量，结肠按组织学分数分级，评分基于炎症 严重程度、炎症范围、隐窝受损和显示出该特征的表面区域百分比。这 些形态都以不记名方式来评分。如图9所示，接受含DSS的饮用水的动 物比接受正常饮用水的动物(这些动物具有一定轻微的炎症，这可能源 于PEG媒介)具有基本上更高的组织学分数(表示为中等至严重IBD)。 与其他分析一样，尽管不是所有的动物都被完全保护，但给予SK抑制剂 或地泊坦的小鼠的组织学分数一致低于单独接受DSS的动物。DAI分数 和组织学分数对每个动物都能很好的关联，证实DAI分数是结肠炎症和 损伤的优异指示。
在DSS结肠炎的研究中，测试了小鼠的结肠的髓过氧化物酶(MPO) 活性(其可反应嗜中性粒细胞流入结肠的情况，且经常作为炎症的测量方 法)。如图10所示，与水对照处理相比，DSS单独处理的动物中的MPO 活性被大幅提高。在每日接受化合物62或地泊坦的小鼠中，MPO活性 的升高被显著消减了。嗜中性粒细胞标记物活性的降低与在H&E染色的 结肠切片中观察到的粒细胞发生的减少表现一致。因此，结肠MPO水平 可以是炎症性白细胞组织浸润程度的优异的生物标记物。
使用Luminex 100系统来测量参与炎症的几个细胞因子，该系统可 以对小体积样品中的多种细胞因子和生长因子定量。对来自结肠炎DSS 模型的小鼠的结肠样品中的Th1细胞因子IFN-γ、调节因子IL-10细胞因 子，以及巨噬细胞衍生的促炎症细胞因子、TNFα、IL-1β和IL-6进行检 测。图11描绘了这些分析的结果，并显示出DSS处理促进了结肠中所有 这些细胞因子的积累。重要的是，所有这些促炎症蛋白，即IFN-γ、IL-1β、 IL-6和TNFα的升高在用SK抑制剂或地泊坦处理的小鼠中被减弱了。相 反地，抗炎症细胞因子IL-10的水平没有被SK抑制剂抑制。
作为对SK抑制剂在此急性模型中作用的最后测量，使用LC-MS/MS 方法分析在DSS处理动物的结肠中的S1P水平。该技术使能够检测用SK 抑制剂处理的动物中S1P生物活性和S1P水平变化之间的相关性。DSS 结肠炎实验中来自动物的结肠样品用冷的PBS均浆，加入内标(鞘氨醇 和S1P的C17类似物)并进行液-液萃取。测定每种鞘脂的分析物对内标 的比率。与水处理对照相比，来自DSS处理小鼠的结肠中的S1P水平明 显更高(图12)。重要的是，使用化合物62处理的动物比DSS单独处 理的样品具有明显更低的结肠S1P水平。
实施例24.SK抑制剂在炎症性肠病的慢性模型中的体内作用。
使用IBD的35天模型评估SK抑制剂在小鼠中的效力，该小鼠经受 了多次DSS诱发炎症循环。此慢性模型与急性模型相似，不同的是饮用 水中的DSS浓度更低且动物循环性接受DSS(第1-7天DSS，第8-13天 水，第14-21天DSS，第22-27天水，其后接受DSS直到研究完成的第 35天)。在这些实验中，在第28天开始用SK抑制剂或地泊坦处理小鼠， 并每日施用直到研究完成。每两天监测DAI指数直到第28天，其后每天 监测直到第35天。在第35天处死动物，测量结肠长度和细胞因子谱 (profiles)的变化。
对小鼠循环性给予含DSS的饮用水导致DAI的可逆升高(图13)。 在第三次给予DSS期间，对小鼠施予化合物62或地泊坦的处理，显著地 抑制对照小鼠的DAI升高(在第35天，所有3种化合物的P＜0.0001)。
与水处理对照动物相比，DSS处理小鼠的结肠长度明显较短(7.8± 0.3cm对4.9±0.2cm)，反映出炎症诱发的创伤。同在急性模型中一样， 用化合物62或地泊坦处理的动物的结肠具有中等长度(分别为6.2±0.2 和6.1±0.2cm)。因为在第一和第二DSS循环中没有对动物进行处理， 所以这是一个有意义的发现。因此，对炎症诱导的结肠收缩的抑制可以 被有效的抗IBD药所逆转。
免疫组织化学说明SK在对照、非DSS处理小鼠的结肠中低水平表 达。与水对照相比，DSS处理小鼠的结肠中SK表达被升高，并且此表达 在同时接受化合物62的DSS小鼠中明显降低。
慢性结肠炎模型小鼠的结肠内的S1P水平依据急性模型中描述的相 同方法来评估，得到的结果与急性模型中的结果相似，即，与水对照相 比，DSS单独处理小鼠的S1P水平升高(图14)。化合物62处理(在 处死前7天内每日口服50mg/kg)导致S1P水平的显著降低(图14)。
促炎症细胞因子TNFα、IL-1β、IFN-γ和IL-6的水平在DSS慢性处 理的小鼠结肠中基本被提高了；而IL-10水平没有变化(图15)。在最 后的DSS循环中用化合物62处理的小鼠具有降低了的促炎症细胞因子水 平，而用地泊坦处理的动物表达与DSS单独处理组相等同的细胞因子谱。 这反映出大量免疫细胞存在于慢性暴露于DSS的小鼠结肠中。然而，SK 抑制剂处理的小鼠体内细胞因子的升高没有导致DAI升高或结肠缩短， 说明炎症细胞因子诱导的信号被阻止。
为了比较，测定处死时小鼠血清中相同细胞因子的水平。如图16所 示，这些细胞因子的循环系统水平明显比结肠水平低，反映出在此模型 中的局部炎症。DSS升高了IL-1β、IFN-γ、IL-6和IL-10的循环系统水平， 而TNFα仍然低于分析的检测限。测试化合物中没有任何一个影响到 IL-1β或IFN-γ的循环系统水平；然而，化合物62和地泊坦都降低了IL-6 的血浆水平。因此，IL-6的血浆水平可作为临床试验中SK抑制剂的抗炎 症作用的药代动力学标记物。
实施例25.SK抑制剂在小鼠胶原诱导的关节炎模型中的体内作用。
在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中评估SK抑制剂化合物62的抗 关节炎活性。通过尾静脉注射对雌性DBA/1小鼠施予2mg/mL乳化在完 全弗氏佐剂(Sigma)中的鸡免疫级别II型胶原(Chondrex)。3周后， 小鼠接受不完全弗氏佐剂中的胶原增强剂并其后每日监测关节炎症状。 一旦小鼠达到临界足厚度和临床分数，即将它们随机分到如下治疗组中： 化合物62(每周6天，每日口服给药100mg/kg)或媒介(以相同的安排施 用0.375％的Tween-80)。通过使用数字式卡尺测量后足体积而对每只动 物的疾病严重程度定量。根据感知到的炎症活性对每个足评分，其中每 足按照以下规则得到0-3中的某一分数：0＝正常；1＝轻微，有明确的踝 或腕发红及肿胀，或者仅限于个别足趾发红及肿胀但不考虑患病趾数； 2＝脚腕或手腕的中等发红及肿胀，3＝包括足趾在内的整个足的严重发红 及肿胀，而全部分数在0-12的范围内。使用ANOVA测试处理组中的差 异。
如图17所示，无论用平均临床分数(Average Clinical Score)(图10A) 或平均后足直径(Average Hind Paw Diameter)(图10B)测量，任一种SK 抑制剂的处理都惊人地显示出炎症反应，并且对两个终点，在处理的第5 天开始出现明显的降低。在实验结束的第12天，与媒介处理的小鼠相比， 化合物62所引起的后足增厚减弱了90％，以及临床分数降低了67％。因 为在本分析中，30％的症状减弱被认为是抗关节炎活性的表现，所以SK 抑制剂在此模型中超过了疗效标准。
在第12天，对小鼠实施安乐死，取其后肢，剥除皮肤和肌肉，福尔 马林固定，去除石灰质并石蜡包埋。其后后肢切片并用苏木精/曙红染色。 对胫附关节进行组织学评估来确定炎症和滑膜增生的严重程度。与非诱 导小鼠相比，胶原诱导的关节炎导致严重的表型，其显示为严重的炎症 和滑膜细胞浸润，以及显著的骨再吸收。使用化合物62处理的小鼠具有 明显降低的组织学损伤，与足厚度和临床分数数据相符。
实施例26.SK抑制剂在大鼠佐剂诱导的关节炎模型中的体内作用。
佐剂诱发的关节炎是另一个广泛使用的分析方法，其概括了人类风 湿性关节炎的许多特征，因此可用于新候选药物的评估。通过尾皮下注 射对年龄和体重合适的雄性Lewis大鼠(150-170g)施予1mg悬浮在0.1ml 轻矿物油中的分支杆菌(Mycobacterium butyricum(Difco，杀死并干燥)) 入。免疫反应性的症状在2周后出现。有反应的大鼠随机分为处理组， 并每日口服施予以下剂量(1ml)：单独溶剂(0.375％的Tween-80)；100 mg/kg化合物62；35mg/kg化合物62或5mg/kg化合物62，或者每两天 腹膜内注射(5mg/kg)吲哚美辛作为阳性对照。通过测量后足厚度对每只 动物的疾病严重程度定量。如上，30％或更高的减少被认为是此模型中 抗炎症活性的指示。
如图17所示，单独溶剂处理的大鼠在其后10天时间里显示出后足厚度的逐 渐增加。化合物62以剂量依赖模式抑制这种关节炎反应，其中最高剂量具 有与吲哚美辛相似的治疗功效。剂量为5、35或100mg/kg的化合物62分别 导致关节炎反应降低13、42和76％。这样，化合物62在此关节炎模型中是 高效的。
相关应用的引用
本申请为非临时申请，根据35 U.S.C.119(e)条款的规定，要求2005年 6月17日提交的临时申请60/691,563的优先权，在此通过引用的方式并入其 内容。
政府资助
本发明是在联邦公共卫生署授予的R43基金CA097833支持下完成 的。因此，美国政府享有本专利的某些权利。