靶向病原体的光敏剂共轭物
阅读：890发布：2020-09-20
专利汇可以提供靶向病原体的光敏剂共轭物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及包含 光敏剂 组分的共轭物分子,其中所说的光敏剂与非 抗体 非亲和成对的靶向部分共轭,本发明还描述了这种共轭物的制造方法和使用方法。，下面是靶向病原体的光敏剂共轭物专利的具体信息内容。
1.一种共轭分子，其中包含与对靶生物具亲和性的非配对成员 靶向部分偶联的光敏剂。
2.权利要求1的共轭分子，其中所说的靶生物是细菌细胞。
3.权利要求1的共轭分子，其中所说的靶向部分包括阳离子肽。
4.权利要求3的共轭分子，其中所说的靶向部分包括聚赖氨酸。
5.权利要求1的共轭分子，其中所说的靶向部分包括组氨素。
6.权利要求5的共轭分子，其中所说的组氨素是组氨素-5。
7.权利要求5的共轭分子，其中所说的组氨素是组氨素-1或-3。
8.权利要求1的共轭分子，其中所说的靶向部分包括抗微生物 性短肽。
9.权利要求1的共轭分子，其中所说的靶向部分包括选自组氨 素、防卫素、杀菌肽、爪蟾抗菌肽、格兰氏阳性细菌素、以及肽抗菌 素的多肽。
10.权利要求1的共轭物，其中所说的光敏剂是卟啉。
11.权利要求1的共轭物，其中所说的共轭物还包含与所说的靶 向部分和所说的光敏剂偶联的主链分子。
12.含权利要求1所述共轭分子和可药用载体的组合物。
13.一种共轭分子，其中包括与含有非配对成员多肽部分的靶向 部分偶联的光敏剂，其中所述非配对成员多肽部分具有对口腔细菌的 亲和性。
14.权利要求13的共轭分子，其中所说的靶向部分包括组氨素。
15.权利要求14的共轭分子，其中所说的靶向部分是组氨素-5。
16.权利要求14的共轭分子，其中所说的靶向部分是组氨素-1 或-3。
17.权利要求14的共轭分子，其中所说的光敏剂是卟啉。
18.权利要求13的共轭分子，其中所说的共轭物还包含与所说 的靶向部分和所说的光敏剂偶联的主链分子。
19.一种治疗患有以存在不希望的生物为特征的病症的患者的方 法，该方法包括：
将共轭物给药于患者，所说的共轭物包含与NPM靶向部分偶联 的光敏剂；
用波长适合让光敏剂产生细胞毒性效果的能量照射患者；
由此治疗患有以存在不希望的生物为特征的病症的患者。
20.权利要求19的方法，其中所述不希望的生物选自细菌细胞、 真菌细胞、原生动物细胞、卡氏肺囊虫细胞、病毒、寄生蠕虫和节肢 动物。
21.权利要求19的方法，其中所说的照射源是激光。
22.权利要求20的方法，其中所说的不希望的生物是细菌。
23.权利要求22的方法，其中所说的细菌位于包括咽喉和扁桃 体的口腔中；或者位于窦、耳、鼻、腹膜腔、表皮、肺或血中。
24.权利要求23的方法，其中所说的细菌位于伤口处。
25.权利要求20的方法，其中所说的不希望的生物是卡氏肺囊 虫。
26.权利要求20的方法，其中除所说的病症外，所说的患者还 患有获得性免疫疾病。
27.权利要求20的方法，其中所说的病症是牙周病。
28.一种治疗患有以在口腔中存在不希望的生物为特征的口腔病 症的患者的方法，该方法包括：
将共轭物给药于患者，所说的共轭物包含与非配对成员靶向部分 偶联的光敏剂；
用波长适合让光敏剂产生细胞毒性效果的能量照射患者；
由此治疗患有以存在不希望的生物为特征的病症的患者。
29.权利要求28的方法，其中包括将共轭物局部给药于患者的 被不希望的生物感染了的区域。
30.权利要求28的方法，其中将共轭物给药于牙周组织。
31.权利要求28的方法，其中所说的照射源是激光。
32.权利要求28的方法，其中所说的不希望的生物是细菌。
33.权利要求32的方法，其中所说的不希望的生物是口腔细菌 种。
34.权利要求32的方法，其中所说的口腔细菌种是牙龈卟啉单 胞菌(拟杆菌属)。
35.权利要求26的方法，其中所说的共轭物的靶向部分包括唾 液多肽。
36.权利要求35的方法，其中所说的共轭物的靶向部分是组氨 素。
37.权利要求28的方法，其中所说的共轭物的靶向部分是聚赖 氨酸。
38.权利要求28的方法，其中所说的光敏剂是卟啉。
39.权利要求28的方法，其中所说的共轭物还包括与组氨素靶 向部分和卟啉光敏剂偶联的聚赖氨酸主链。
40.权利要求28的方法，其中除所说的病症外，所说的患者还 患有获得性免疫疾病。
41.权利要求28的方法，其中所说的病症是牙周病。
42.一种共轭物分子的制作方法，该方法包括：
提供一多肽主链；
将光敏剂共价偶联到所述主链上；并且
将非配对成员靶向部分共价偶联到所说的多肽主链上以形成共轭 物分子，其中所说的靶向部分对靶生物具有亲和性。
43.权利要求42的方法，其中所说的多肽是聚赖氨酸。
44.权利要求42的方法，其中所说的光敏剂是卟啉或卟啉衍生 物。
45.权利要求44的方法，其中所说的卟啉是二氢卟酚e6或二氢 卟酚衍生物。
46.权利要求42的方法，其中所说的靶向部分包括组氨素。
47.一种治疗患有获得性免疫疾病的患者的方法，以治疗以在口 腔中存在不希望的生物为特征的口腔疾病并且所说的不希望的生物不 是造成获得性免疫疾病的生物，所说的方法包括：
将共轭物给药于患者，所说的共轭物包含与NPM靶向部分偶联 的光敏剂；
用波长适合让光敏剂产生细胞毒性效果的能量照射患者；
由此治疗患有以存在不希望的生物为特征的病症的患者。
48.权利要求47的方法，其中所说的不希望生物是口腔细菌种。
49.权利要求48的方法，其中所说的口腔细菌是牙龈卟啉单胞 菌(拟杆菌属)。
50.权利要求47的方法，其中所说的共轭物的靶向部分包括唾 液多肽。
51.权利要求50的方法，其中所说的共轭物的靶向部分包括组 氨素。
52.权利要求47的方法，其中所说的共轭物的靶向部分包括聚 赖氨酸。
53.权利要求47的方法，其中所说的光敏剂是卟啉。
54.权利要求47的方法，其中所说的共轭物还包括与组氨素靶 向部分和卟啉光敏剂偶联的聚赖氨酸主链。
55.权利要求47的方法，其中所述的获得性免疫疾病是AIDS。
56.权利要求47的方法，其中所说的病症是牙周病。
发明领域
本发明涉及包含光敏剂和靶向部分的共轭物，以及该共轭物的使 用方法。
发明背景
传染病依然是未能解决的问题，这主要是由于出现了耐多种抗菌 素的细菌菌株、新发现的病毒性疾病、以及真菌和原虫病的传播。
晚期牙周疾病是很多口腔感染疾病中的一种，并且是30岁以上 病人掉牙的首要原因。牙周病是由于细菌细胞及其在牙菌斑中的产物 与宿主防御机理之间的相互作用引起的(Antczak-Bouckoms，A(1994)， J.Dent.Educ.58：625-640)。目前的治疗经常依赖于机械去除牙菌斑和细 菌，这种方式可能是无效的(Unsal E.et al.(1995)，J.periodontol.66：47- 51)，或者是依赖于抗菌素治疗，这种方式可导致细菌的抗药性(Olsvik， B.et al(1995)J.Clin.Periodontol.)22：391-396)。
作为一种消除口腔细菌以及局部感染和胃肠感染细菌的具有吸引 力的方法，人们提出了光动力治疗(PDT)法，因为这些部位相对容易 照射。例如，可以使用光学纤维照射牙囊(Wilson，M.(1993)， J.Appl.Bacteriol.)75：299-306)。
发明概述
本发明者发现了一类迄今未作为光敏剂靶向部分的分子，它们可 以用来靶向光敏剂。
因此，本发明的特征在于一种共轭分子，该分子包含与非配对成 员(non-pair member)(NPM)部分如NPM-多肽偶联的光敏剂。
在靶向部分包括多肽的实施方案中，靶向部分可以是直链、支链 或环状多肽。
在优选的实施方案中，靶向部分包括抗微生物的短肽(SAMP)。 组氨素(histatin)、防卫素、杀菌肽、爪蟾抗菌肽、格兰氏阳性细菌素 以及肽抗菌素可以是SA。在优选的实施方案中，靶向部分包括细菌、 真菌、动物例如哺乳动物(例如人)的SAMP，或其活性片段或类似物。
在优选的实施方案中，靶向部分包括防卫素、或其活性片段或类 似物。示例性的防卫素可以是：人防卫素，如HNP-1、-2、-3或-4； 天竺鼠防卫素，如GPNP；兔防卫素，如兔NP-1、-2、-3A、-3B或-5； 大鼠防卫素，如大鼠NP-1、-2、-3或-4；鼠隐素(cryptin)、牛粒细胞 细菌素(bactenecin)和indolicidin；或牛精液胞质素。
在优选的实施方案中，靶向部分包括昆虫源的SAMP，或其活性 片段或类似物，例如惜古比天蚕蛾、大黄蜂、果蝇或其它昆虫的杀菌 肽、来自蜜蜂的蜜蜂素(apidaechin)、或来自果蝇的雄素(adropin)。
在优选的实施方案中，靶向部分包括两栖类源的SAMP，或其活 性片段或类似物，例如爪蟾抗菌肽、PGLA、XPF、LPF、CPG、PGQ、 铃蟾抗菌肽、铃蟾抗菌类肽BLP-1、-2、-3或-4，或短杆菌素(brevinin)。
在优选的实施方案中，靶向部分包括无脊椎动物的SAMP，或其 活性片段或类似物，例如来自马蹄形蟹的tachyplesin I、II或III，或 polyphemusin I或II。在优选实施方案中，靶向部分是来自鱼的物质， 如pardaxin。
在优选的实施方案中，靶向部分包括细菌素，更优选格兰氏阳性 细菌素，或其活性片段或类似物，例如乳酸链球菌肽、枯草菌素、表 皮素、gallidermin、唾液素(salivarin)和乳链球菌素。
在优选的实施方案中，靶向部分包括肽抗菌素，或其活性片段或 类似物，例如短杆菌酪肽(tyrocidin)或杆菌肽。
在优选的实施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)，或其活性 片段或类似物，例如组氨素(histatin)-1至-8，优选组氨素(histatin)-1、 -3、或-5。在优选的实施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)-5残 基13-24，或从其它组氨素(histatin)而来的相应残基。在优选的实施方 案中，靶向部分包括被改造而含有内部重复区的组氨素(histatin)分子。
在优选的实施方案中，靶向部分包括对多糖靶具亲和性的多肽， 如凝集素。示例性的凝集素可以是种子、豆、根、树皮、海藻、真菌、 细菌或无脊椎动物的凝集素。在优选的实施方案中，靶向部分包括植 物多肽，例如来自刀豆的凝集素如伴刀豆凝集素A，或来自兵豆的凝 集素。
在优选的实施方案中，靶向部分包括唾液多肽，或其活性片段或 类似物。唾液多肽的例子是组氨素(histatin)，如组氨素(histatin)-1至-8， 更优选组氨素(histatin)-1、-3、或-5。在优选的实施方案中，靶向部分 包括组氨素(histatin)-5残基13-24，或来自其它组氨素(histatin)的相应 残基。在优选的实施方案中，靶向部分包括被改造而包含内部重复区 的组氨素(histatin)分子。
在优选的实施方案中，靶向部分包括格兰氏阴性细菌素，如大肠 杆菌素B、大肠杆菌素E1、或大肠杆菌素Ia。
在优选的实施方案中，靶向部分包括细菌加工的多肽，如乳酸链 球菌肽、枯草菌素、表皮素、gallidermin、唾液素(salivarin)和乳链球 菌素。
在优选的实施方案中，靶向部分还包括除抗体或受体-配体对中 的任一成分之外的分子，如肽。
在优选的实施方案中，共轭物不包括，例如不偶联(如共价或非 共价偶联到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表 面上受体的配体。
在优选的实施方案中，靶向部分包括肽，所说肽的至少10、20、 30、40、50、60、70、80、90％的氨基酸残基是例如带正电的一种氨 基酸残基，如赖氨酸残基、精氨酸残基、或鸟氨酸残基。特别优选的 靶向部分是聚氨基酸，如聚赖氨酸、聚精氨酸、或聚鸟氨酸。
在优选的实施方案中，靶向部分：是阳离子性的；具有每分子+1、 +2或+3的净正电荷；具有等于或大于+4的净正电荷；包含带正电荷 的氨基酸残基，如赖氨酸；包含至少2、3、4个或更多带正电的氨基 酸残基，如赖氨酸、精氨酸、或鸟氨酸残基。
在其它实施方案中，靶向部分：是阴离子性的；具有每分子-1、- 2或-3的净负电荷；具有等于或大于-4的净负电荷；包含带负电荷的 氨基酸残基，如天冬氨酸或谷氨酸；包含至少2、3、4个或更多带正 电的氨基酸残基，如谷氨酸；包含至少10、20、30、40、50％或更多 带负电荷的氨基酸残基，如天冬氨酸或谷氨酸。
在优选的实施方案中，靶向部分：大约是电荷中性的；包含至少 50、60、70、80或90％的中性氨基酸残基，如丝氨酸、苏氨酸、丙氨 酸、蛋氨酸、半胱氨酸或缬氨酸。
在优选的实施方案中，靶向部分的分子量大于1200、1800、2400、 3000、6000、10,000、25,000、50,000、100,000或200,000道尔顿。 在优选的实施方案中，靶向部分的分子量小于250,000、150,000、 60,000、25,000、10,000、8,000或6,000道尔顿。在特别优选的实施 方案中，靶向部分的分子量为300-1800、600-2400、1200-6,000、 5,000-8,000、8,000-15,000、15,000-30,000、35,000-70,000、70,000- 150,000、或150,000-300,000道尔顿。
在优选的实施方案中，靶向部分包括长度至少为3、6、12、18、 24、30、60、100、250、500、1,000或2,500个残基的肽。在优选的 实施方案中，靶向部分是长度小于3,000、1,500、700、300、150、100、 80、60、40、30或15个残基的肽。在特别优选的实施方案中，靶向 部分包括长度为6-15、12-18、18-30、20-40、30-60、80-120、150-300、 300-600、800-1,200、或2,000-3,000个残基的肽。
在优选的实施方案中，靶向部分包括在靶生物的透性屏障中形成 孔的蛋白质，例如在金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏杆菌、白色念珠 菌、Leishmania donovani或Giaradia Lamblia中。
在其它优选的实施方案中，靶向部分包括低密度脂蛋白、高密度 脂蛋白或极低密度脂蛋白。
在优选的实施方案中，通过使用靶生物的表面分子作为亲和选择 或筛选的目标来选择靶向部分，例如以化学方式或在噬菌体展示文库 中选择靶向部分。
在特别优选的实施方案中，靶向部分包括聚赖氨酸分子。聚赖氨 酸的长度可以是6-15、12-18、18-30、20-40、30-60、80-120、150-300、 300-600、800-1,200、或2,000-3,000个残基。
在优选的实施方案中，靶向部分包括被化学修饰而改变了电荷的 多肽，如聚氨基酸，电荷改变如改变了聚氨基酸上一个或多个氨基酸 残基的侧链的电荷。举例说明，一个或多个、或大约10、25、50、75、 90或100％的带电侧链可以被修饰。“被修饰”的意思是指使负性侧 链如谷氨酸或天冬氨酸侧链变成带正电性或中性；使带正电的侧链如 赖氨酸、精氨酸或鸟氨酸的侧链变成带负电性或中性。例如，聚赖氨 酸的一个或多个侧链可以被变成中性或负性。
在优选的实施方案中，当以适当能量和波长的电磁波照射时，光 敏剂在吸收能量后产生单线态氧；光敏剂包括卟啉或卟啉衍生物；光 敏剂包括二氢卟酚e6或二氢卟酚衍生物。
在优选的实施方案中，共轭物还包括主链。在该实施方案中，主 链既偶联光敏剂又偶联靶向部分。主链还可以自身是靶向部分，如聚 赖氨酸。
在优选的实施方案中，共轭物分子具有对靶生物的亲和性。靶生 物例如可以是微生物如细菌细胞、真菌细胞、原生动物细胞、卡氏肺 囊虫细胞；病毒；或寄生蠕虫；或者节肢动物。
在细胞是细菌细胞的优选实施方案中，细菌细胞可以是葡萄球菌 属、链球菌属、肠杆菌属、分枝杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、 沙雷氏菌属、埃希氏杆菌属、欧文氏杆菌属、克雷伯氏杆菌属、疏螺 旋体属、密螺旋体属、弯曲杆菌属、卷旋杆菌属、博德特氏杆菌属、 奈瑟氏球菌属、军团菌属、钩端螺旋体属、小蛇菌属、枝原体属、类 杆菌属、克雷伯氏杆菌属、耶尔森氏菌属、衣原体属、弧菌属、放线 芽胞杆菌属、Porphyria、嗜血菌属、巴斯德氏菌属、消化链球菌属、 利斯特氏菌属、丙酸杆菌属、分枝杆菌属、棒状杆菌属或嗜皮杆菌属 的细胞。
在细胞是真菌细胞的优选实施方案中，细胞可以是念珠菌属或曲 霉属的细胞。
在优选的实施方案中，所述生物是卡氏肺囊虫。
在靶生物是原生动物细胞的优选实施方案中，细胞是内变形虫 属、弓形体属、贾第虫属、利什曼原虫属、潜隐孢子虫属(Cryptosporidium) 或血吸虫属。
在靶生物是病毒的优选实施方案中，病毒是HIV、HTLV、肝炎 病毒、流感病毒、鼻病毒、乳头瘤病毒、麻疹病毒、疱疹病毒、轮状 病毒、细小病毒、鹦鹉热病毒、或Ebola病毒。
在靶生物是节肢动物的优选实施方案中，节肢动物是寄生螨。
在靶生物是寄生虫的优选实施方案中，寄生虫是线虫或吸虫。
在优选的实施方案中，靶生物是口腔细菌种，例如牙龈卟啉单胞 菌(拟杆菌属)。
另一方面，本发明的特征是包含与非配对成员(NPM)靶向部分相 偶联的光敏剂的共轭分子和一种可药用载体。
另一方面，本发明的特征是一种共轭分子，该分子包括与含有非 配对成员多肽部分的靶向部分偶联的光敏剂，所述多肽部分具有对口 腔细菌的亲和性。
在靶向部分包括多肽的实施方案中，靶向部分可以是直链、支链 或环状的多肽。
在特别优选的实施方案中，靶向部分包括聚赖氨酸分子。聚赖氨 酸的长度可以是6-15、12-18、18-30、20-40、30-60、80-120、150-300、 300-600、800-1,200、或2,000-3,000个残基。
在优选的实施方案中，靶向部分包括被化学修饰而改变了电荷的 多肽，如聚氨基酸，电荷改变如改变了聚氨基酸上一个或多个氨基酸 残基的侧链的电荷。举例说明，一个或多个、或大约10、25、50、75、 90或100％的带电侧链可以被修饰。“被修饰”的意思是指使负性侧 链如谷氨酸或天冬氨酸侧链变成带正电性或中性；使带正电的侧链如 赖氨酸、精氨酸或鸟氨酸的侧链变成带负电性或中性。例如，聚赖氨 酸的一个或多个侧链可以被变成中性或负性。
在优选的实施方案中，当以适当能量和波长的电磁波照射时，光 敏剂在吸收能量后产生单线态氧；光敏剂包括卟啉或卟啉衍生物；光 敏剂包括二氢卟酚e6或二氢卟酚衍生物。
在优选的实施方案中，共轭物还包括主链。在该实施方案中，主 链既偶联光敏剂又偶联靶向部分。主链自身还可以是靶向部分，如聚 赖氨酸。
在优选的实施方案中，共轭物包括共轭到聚赖氨酸上的二氢卟酚 e6，例如共轭到分子量为1,000-3,000之间的聚赖氨酸上的1或2至20 个二氢卟酚e6分子。
在优选的实施方案中，共轭物包括共轭到组氨素(histatin)多肽或 其活性片段或类似物上的二氢卟酚e6，例如共轭到组氨素(histatin)-5 多肽上的1或2至4个二氢卟酚e6分子。
在优选的实施方案中，共轭物包括共轭到聚赖氨酸主链上的二氢 卟酚e6、和组氨素(histatin)多肽或其活性片段或类似物，例如，1-4 个聚赖氨酸链(MW1,000-3,000道尔顿，各包含1或2至20个二氢卟 酚e6)连接到组氨素(histatin)-5多肽上，或者1-4个组氨素(histatin)-5 多肽连接到聚赖氨酸链上(MW1,000-3,000道尔顿，并包含1或2-16 个二氢卟酚e6)。
在优选的实施方案中，靶生物是口腔细菌，如牙龈卟啉单孢菌(拟 杆菌属)。
在优选的实施方案中，共轭物不包括(例如不共价或非共价偶联 到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表面上受体 的配体。
在优选的实施方案中，靶向部分包括唾液多肽，或其活性片段或 类似物。唾液多肽的例子是组氨素(histatin)，如组氨素(histatin)-1至-8， 或更优选组氨素(histatin)-1、-3、或-5。在优选的实施方案中，靶向部 分包括组氨素(histatin)-5残基13-14，或来自其它组氨素(histatin)的相 应残基。在优选的实施方案中，靶向部分包括经改造而包含内部重复 区的组氨素(histatin)分子。
另一方面，本发明的特征是一种治疗患有以存在不希望生物为特 征的病症的患者的方法，该方法包括：
将包含与NPM靶向部分偶联的光敏剂的共轭物，例如这里所述 的共轭物，给药于患者；
用波长适合让光敏剂产生细胞毒性效果的能量照射患者；
由此治疗患有以存在不希望的生物为特征的病症的患者。
在优选的实施方案中，所述不希望的生物例如可以是，例如：微 生物，如细菌细胞、真菌细胞、原生动物细胞、卡氏肺囊虫细胞；病 毒；或寄生蠕虫；或者节肢动物。
在不希望的生物是细菌细胞的优选实施方案中，细菌细胞可以是 葡萄球菌属、链球菌属、肠杆菌属、分枝杆菌属、假单胞菌属、沙门 氏菌属、沙雷氏菌属、埃希氏杆菌属、欧文氏杆菌属、克雷伯氏杆菌 属、疏螺旋体属、密螺旋体属、弯曲杆菌属、卷旋杆菌属、博德特氏 杆菌属、奈瑟氏球菌属、军团菌属、钩端螺旋体属、小蛇菌属、枝原 体属、类杆菌属、克雷伯氏杆菌属、耶尔森氏菌属、衣原体属、弧菌 属、放线芽胞杆菌属、Porphyria、嗜血菌属、巴斯德氏菌属、消化链 球菌属、利斯特氏菌属、丙酸杆菌属、分枝杆菌属、棒状杆菌属或嗜 皮杆菌属的细胞。在更优选的实施方案中，细菌细胞可以是牙龈卟啉 单孢菌(拟杆菌属)；拟杆菌属种包括B.gingivalis(现在已知为牙龈卟啉 单孢菌)、啮蚀艾肯氏菌、核粒梭杆菌、直肠弯曲杆菌、真杆菌属种、 中间普雷沃氏菌(拟杆菌)、福赛斯拟杆菌、二氧化碳嗜纤维菌属种、 伴放线放线杆菌，和变异链球菌。
在细菌细胞是密螺旋体属细胞的优选实施方案中，病症是战壕嘴 (trenchmouth)、雅司疹或品他病。在其它的实施方案中，病症是脓疱 病或囊性痤疮。
在所述不希望的生物是真菌细胞的优选实施方案中，细胞可以是 念珠菌属或曲霉属细胞。在优选的实施方案中生物是卡氏肺囊虫。
在所述不希望的生物是原生动物细胞的优选实施方案中，细胞是 内变形虫属、弓形体属、贾第虫属、利什曼原虫属、潜隐孢子虫属 (Cryptosporidium)或血吸虫属。
在所述不希望的生物是病毒的优选实施方案中，病毒是HIV、 HTLV、肝炎病毒、流感病毒、鼻病毒、乳头瘤病毒、麻疹病毒、疱 疹病毒、轮状病毒、细小病毒、鹦鹉热病毒、或Ebola病毒。
在靶生物是节肢动物的优选实施方案中，节肢动物是寄生螨。
在靶生物是寄生虫的优选实施方案中，寄生虫是线虫或吸虫。在 优选的实施方案中，寄生虫是线虫，线虫是在患丝虫病的患者中发现 的。
在优选的实施方案中，靶生物是口腔细菌种，例如牙龈卟啉单孢 菌(拟杆菌属)。
在优选的实施方案中，共轭物不包括(例如不共价或非共价偶联 到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表面上受体 的配体。
另一方面，本发明的特征是一种治疗患有以在口腔中存在不希望 的生物为特征的口腔病患者的方法，该方法包括：
将包含与NPM靶向部分偶联的光敏剂的共轭物，例如这里所述 的共轭物，给药于患者；
用波长适合让光敏剂产生细胞毒性效果的能量照射患者；
由此治疗患有以存在不希望的生物为特征的病症的患者。
在优选的实施方案中，治疗方法包括将共轭物局部给药到患者被 所不希望的生物感染的部位。例如，共轭物可以通常局部给药到口腔 表面、牙龈、牙周组织、以发炎为特征的部位、损害处、牙或龈中的 裂缝或疵点、牙载体、切伤或切口(例口在牙齿或其它医疗保健过程中 造成的)、或给药到伤口。在其它实施方案中，该方法包括皮下给药， 例如皮下注射。在其它实施方案中方法包括局部注射到被不希望的生 物感染的位置或其附近。
在优选的实施方案中，照射是激光照射；或用光学纤维装置递送。
在优选的实施方案中，患者患有：以存在不希望的生物如微生物 为特征的口腔疾病，所说的微生物例如为不希望的细菌、真菌、病毒 或原生虫。该病症可以是受这些生物或本疾病影响而感染的牙齿、牙 龈如牙周组织、舌、扁桃体、悬雍垂、口腔衬里、或腮腺疾病中的任 何一种。
在优选的实施方案中，病症是感染性口腔疾病。
在优选的实施方案中，患者患有：牙周病，如牙周炎或牙周变性； 退缩龈；急性溃疡性龈炎；慢性龈炎；牙周脓肿；早发(幼年)牙周炎； 妊娠龈炎；冠周炎；感染性口腔炎；坏疽性口炎；化脓paratitis；下 颌骨或上颌骨的急性或慢性骨髓炎；牙髓炎或根尖周感染。
在优选的实施方案中，患者患有口腔真菌感染，例如放线菌病； 组织胞浆菌病；藻菌病；曲霉病；隐球菌病、孢子丝菌病；芽生菌病 或巴西芽生菌病感染。
在其它优选的实施方案中，患者患有口腔酵母感染，例如包括口 腔的念珠菌属感染，如念珠菌病；鹅口疮；慢性念珠菌病和念珠菌粘 膜白斑病；或患病毒感染，包括初发性疱疹性口炎，或唇疱疹。
在优选的实施方案中，患者除了患口腔疾病外，还患有免疫性疾 病，如获得性或遗传性免疫疾病。在特别优选的实施方案中，患者患 有AIDS或是HIV阳性。
在优选的实施方案中，所述不希望的生物是：口腔细菌种，如牙 龈卟啉单孢菌(拟杆菌属)；拟杆菌属种包括B.gingivalis(现在已知为牙 龈卟啉单孢菌)、啮蚀艾肯氏菌、核粒梭杆菌、直肠弯曲杆菌、真杆菌 属种、中间普雷沃氏菌(拟杆菌)、福赛斯拟杆菌、二氧化碳嗜纤维菌 属种、伴放线放线杆菌，和变异链球菌。
在优选的实施方案中，共轭物的靶向部分包括唾液多肽，或其活 性片段或类似物。唾液多肽的例子是组氨素(histatin)，如组氨素 (histatin)-1至-8，或更优选组氨素(histatin)-1、-3、或-5。在优选的实 施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)-5残基13-14，或来自其它组 氨素(histatin)的相应残基。在优选的实施方案中，靶向部分包括被改 造成包含内部重复区的组氨素(histatin)分子。
在特别优选的实施方案中，靶向部分包括聚赖氨酸分子。
在优选的实施方案中，靶向部分包括被化学修饰而改变了电荷的 多肽，如聚氨基酸，例如改变了聚氨基酸上一个或多个氨基酸残基的 侧链的电荷。举例说明，一个或多个、或大约10、25、50、75、90 或100％的带电侧链可以被修饰。“被修饰”的意思是指使负性侧链 如谷氨酸或天冬氨酸侧链成为带正电性或中性；使带正电的侧链如赖 氨酸、精氨酸或鸟氨酸的侧链成为带负电性或中性。例如，聚赖氨酸 的一个或多个侧链可以被变成中性或负性。
在优选的实施方案中，共轭物不包括(例如共价或非共价偶联 到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表面上受体 的配体。
在优选的实施方案中，当以适当能量和波长的电磁波照射时，光 敏剂在吸收能量后产生单线态氧；光敏剂包括卟啉或卟啉衍生物；光 敏剂包括二氢卟酚e6或二氢卟酚衍生物。
另一方面，本发明的特征是一种治疗牙周疾病患者的方法，所说 的病症特征为存在不希望的生物，该方法包括：
将包含与NPM靶向部分偶联的光敏剂的共轭物，例如这里所述 的共轭物，给药于患者；
用波长适合让光敏剂产生细胞毒性效果的能量照射患者；
由此治疗患者的牙周疾病。
在优选的实施方案中，治疗方法包括将共轭物局部给药到患者被 不希望的生物感染的部位。共轭物可以局部给药到牙龈、牙周组织、 牙周囊、以发炎为特征的部位、或损害处。在其它实施方案中，方法 包括全身给药，例如通过消化或注射。在其它实施方案中，方法包括 皮下给药如皮下注射。在其它实施方案中，方法包括局部注射到被不 希望的生物感染的位置处或附近。
在优选的实施方案中，患者患有：牙周炎或牙周变性；退缩龈； 急性溃疡性龈炎；慢性龈炎；牙周脓肿；早发(幼年)牙周炎；妊娠龈 炎。
在优选的实施方案中，患者除了患牙周疾病外，还患有免疫性疾 病，如获得性或遗传性免疫疾病。在特别优选的实施方案中，患者患 有AIDS或是HIV阳性。
在优选的实施方案中，不希望的生物是：口腔细菌种，如牙龈卟 啉单孢菌(拟杆菌属)；拟杆菌属种包括B.gingivalis(现在已知为牙龈卟 啉单孢菌)、啮蚀艾肯氏菌、核粒梭杆菌、直肠弯曲杆菌、真杆菌属种、 中间普雷沃氏菌(拟杆菌)、福赛斯拟杆菌、二氧化碳嗜纤维菌属种、 伴放线放线杆菌，和变异链球菌。
在优选的实施方案中，共轭物的靶向部分包括唾液多肽，或其活 性片段或类似物。唾液多肽的例子是组氨素(histatin)，如组氨素 (histatin)-1至-8，或更优选组氨素(histatin)-1、-3、或-5。在优选的实 施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)-5残基13-14，或来自其它组 氨素(histatin)的相应残基。在优选的实施方案中，靶向部分包括被改 造成包含内部重复区的组氨素(histatin)分子。
在特别优选的实施方案中，靶向部分包括聚赖氨酸分子。
在优选的实施方案中，靶向部分包括被化学修饰改变了电荷的多 肽，如聚氨基酸，例如改变了聚氨基酸上一个或多个氨基酸残基的侧 链的电荷。举例说明，一个或多个、或大约10、25、50、75、90或100％ 的带电侧链可以被修饰。“被修饰”的意思是指使负性侧链如谷氨酸 或天冬氨酸侧链成为带正电性或中性；使带正电的侧链如赖氨酸、精 氨酸或鸟氨酸的侧链成为带负电性或中性。例如，聚赖氨酸的一个或 多个侧链可以被变成中性或负性。
在优选的实施方案中，共轭物不包括(例如共价或非共价偶联 到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表面上受体 的配体。
在优选的实施方案中，当以适当能量和波长的电磁波照射时，光 敏剂在吸收能量后产生单线态氧；光敏剂包括卟啉或卟啉衍生物；光 敏剂包括二氢卟酚e6或二氢卟酚衍生物。
另一方面，本发明的特征是一种治疗患获得性免疫疾病和以存在 不希望的生物为特征的口腔疾病的患者的方法。在优选的实施方案 中，所述不希望生物是不同于造成获得性免疫疾病的生物。获得性免 疫疾病可以是例如AIDS或是HIV感染。所说的方法包括：
将包含与NPM靶向部分偶联的光敏剂的共轭物，例如这里所述 的共轭物，给药于患者；
用波长适合让光敏剂产生细胞毒性效果的能量照射患者；
由此治疗患者的以存在不希望的生物为特征的疾病。
在优选的实施方案中，治疗方法包括将共轭物局部给药到患者被 不希望的生物感染的部位。例如，共轭物可以通常局部给药到牙龈、 牙周组织、牙周囊、以发炎为特征的部位、或损害处。在其它实施方 案中，方法包括全身给药，例如通过消化或注射。在其它实施方案中， 方法包括皮下给药如皮下注射。在其它实施方案中，方法包括局部注 射到被不希望的生物感染的位置处或附近。
在优选的实施方案中，照射是激光照射；或用光学纤维装置递送。
在优选的实施方案中，不希望的生物是例如微生物，例如为不希 望的细菌、真菌、病毒或原生虫。病症可以是受这些生物或本疾病影 响而感染的牙齿、牙龈如牙周组织、舌、扁桃体、悬雍垂、口腔衬里、 或腮腺疾病中的任何一种。
在优选的实施方案中，病症是感染性口腔疾病。
在优选的实施方案中，患者患有：牙周病，如牙周炎或牙周变性； 退缩龈；急性溃疡性龈炎；慢性龈炎；牙周脓肿；早发(幼年)牙周炎； 妊娠龈炎；冠周炎；感染性口腔炎；坏疽性口炎；化脓paratitis；下 颌骨或上颌骨的急性或慢性骨髓炎；牙髓炎或根尖周感染。
在优选的实施方案中，患者患有口腔酵母感染，例如包括口腔的 念珠菌属感染，如念珠菌病；鹅口疮；慢性念珠菌病和念珠菌粘膜自 斑病；或患病毒感染，包括初发性疱疹性口炎，或唇疱疹。
在优选的实施方案中，不希望的生物是口腔类细菌，如牙龈卟啉 单孢菌(拟杆菌属)；拟杆菌属种包括B.gingivalis(现在已知为牙龈卟啉 单孢菌)、啮蚀艾肯氏菌、核粒梭杆菌、直肠弯曲杆菌、真杆菌属种、 中间普雷沃氏菌(拟杆菌)、福赛斯拟杆菌、二氧化碳嗜纤维菌属种、 伴放线放线杆菌，和变异链球菌。
在优选的实施方案中，共轭物的靶向部分包括唾液多肽，或其活 性片段或类似物。唾液多肽的例子是组氨素(histatin)，如组氨素 (histatin)-1至-8，或更优选组氨素(histatin)-1、-3、或-5。在优选的实 施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)-5残基13-14，或来自其它组 氨素(histatin)的相应残基。在优选的实施方案中，靶向部分包括被改 造成包含内部重复区的组氨素(histatin)分子。
在特别优选的实施方案中，靶向部分包括聚赖氨酸分子。
在优选的实施方案中，靶向部分包括被化学修饰改变了电荷的多 肽，如聚氨基酸，例如改变了聚氨基酸上一个或多个氨基酸残基的侧 链的电荷。举例说明，一个或多个、或大约10、25、50、75、90或100％ 的带电侧链可以被修饰。“被修饰”的意思是指使负性侧链如谷氨酸 或天冬氨酸侧链成为带正电性或中性；使带正电的侧链如赖氨酸、精 氨酸或鸟氨酸的侧链成为带负电性或中性。例如，聚赖氨酸的一个或 多个侧链可以被变成中性或负性。
在优选的实施方案中，共轭物不包括(例如共价或非共价偶联 到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表面上受体 的配体。
在优选的实施方案中，当以适当能量和波长的电磁波照射时，光 敏剂在吸收能量后产生单线态氧；光敏剂包括卟啉或卟啉衍生物；光 敏剂包括二氢卟酚e6或二氢卟酚衍生物。
另一方面，本发明的特征是一种共轭分子的制造方法，该方法包 括：
提供一个主链，如多肽主链；
将光敏剂偶联如共价偶联到主链上；
将靶向部分如这里所述的靶向部分偶联如共价偶联到主链上。
在优选的实施方案中，偶联反应涉及到光敏剂的受活化的酯部 分。在更优选的实施方案中，主链上的氨基作为亲核基团进行反应， 取代了光敏剂活性酯的离去基团。在优选的实施方案中，靶向部分通 过偶联剂偶联到主链上。
在优选的实施方案中，共轭物不包括(例如共价或非共价偶联 到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表面上受体 的配体。
另一方面，本发明的特征是一种用于消除不希望的生物用的试剂 盒。该试剂盒包含与靶向部分偶联的光敏剂和使用说明。
在优选的实施方案中，共轭物不包括，例如不偶联(如共价或非 共价偶联到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表 面上受体的配体。
光动力治疗涉及使用可光活化的化合物、或光敏剂，并结合使用 正确波长的光，来产生细胞毒性效果。为了增加光敏剂对靶的特异性， 可以使光敏剂结合到靶向部分上。本发明方法和共轭物的特征是使用 了NPM靶向的光敏剂。NPM可以有效且价有所值地将光敏剂向靶递 送。本发明组合物的优点在于(i)由于照射产生了毒性氧，该氧可以通 过细菌的细胞壁扩散，因而不需要内在地去杀死细菌；(ii)毒性氧的产 生可以具有刺激宿主免疫应答的局部效应，从而可以帮助根除细菌并 促进伤口愈合；(iii)仅在照射的部位产生细胞毒性应答。
除非另有定义，这里用到的技术和科学术语均与本发明所属领域 的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与这里所述的类似或等同 方法或资料也可以用来本发明的实施或测试，优选的方法和资料仍在 下面被描述。这里提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文 献均引入这里作为参考。另外，资料、方法和实施例均仅仅是举例说 明性的，而没有限定的意图。
附图简述
图1A表示不同电荷的二氢卟酚e6聚赖氨酸共轭物合成反应的第 一步，箭头1表示二氢卟酚e6(分子I)和N-羟基琥珀酰亚胺在二环己 基碳二亚胺和二甲基亚砜存在下反应，形成二氢卟酚e6-NHS酯(分子 II)。
图1B表示分子II和聚L-赖氨酸(分子IV)的反应2，形成聚L-赖 氨酸二氢卟酚e6(分子III)。
图1C表示组氨素(histatin)-5二氢卟酚e6共轭物的化学结构，四 个二氢卟酚e6部分分别偶联到组氨素(histatin)-5的每个赖氨酸残基的 ε-氨基上。
图1D表示分子III和乙酸酐或琥珀酸酐在DMSO中反应形成两 种分子V，对二氢卟酚e6聚赖氨酸乙酸酰胺中性共轭物来说，R基团 表示-COCH3；对二氢卟酚e6聚赖氨酸琥珀酸酰胺来说，R基团表示 -COCH2CH2COOH；对不再酰化的分子III来说，分子V中的R基团 是-H。
图2A表示具有组氨素(histatin)-5的16氨基酸残基片段的阳离子 性、中性和阴离子性二氢卟酚e6聚赖氨酸共轭物的合成反应顺序之 第一步，通过合成含巯基活性官能团2-吡啶基-二硫-3-丙酰基的分子 来实现，其中反应4表示聚赖氨酸二氢卟酚e6(分子V)和N-琥珀酰亚 胺-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)在DMSO中反应，产生聚赖氨酸二 氢卟酚e6-SPDP(分子VI)，并且进一步进行反应5，即分子VI和乙酸 酐或琥珀酸酐在DMSO中反应，形成乙酰或琥珀酰衍生物，其中分子 VII中的R分别表示-COCH3和-COCH2CH2COOH。
图2B表示分子VII和人组氨素(histatin)-5的一个16氨基酸残基 片段进一步反应合成共轭物，反应6表示组氨素(histatin)-5的片段和 SATA反应形成SATA-组氨素(histatin)-5片段(分子IX)，然后在反应 7中通过羟胺脱保护，产生偶联到组氨素(histatin)-5片段上的脱保护 的SATA(分子X)。
图2C表示反应8，是将分子X偶联到各聚赖氨酸二氢卟酚e6分 子和分子VII的乙酰和琥珀酰衍生物上，产生XI所示的分子，其中 对于带正电的未酰化共轭物来说，R表示-H；对于中性乙酸酰胺，R 表示-COCH3；对于带负电的琥珀酸酰胺，R表示-COCH2CH2COOH。
图3表示三种聚赖氨酸二氢卟酚e6共轭物在每mg含10-9mol二 氢卟酚e6的来自牙龈卟啉单孢菌细胞的细胞蛋白中的吸收曲线，阳 离子性共轭物的吸收由连接圈的实线表示，阴离子性的琥珀酰化共轭 物的吸收由连接方块的短虚线表示，中性的乙酰化共轭物的吸收由连 接实圈的点虚线表示，它们均为二氢卟酚浓度(μM)的函数。
图4表示三种二氢卟酚e6共轭物在每mg含10-11mol二氢卟酚e6 的来自HCPC-1仓鼠颊囊扁平细胞癌细胞的细胞蛋白中的吸收曲线， 该吸收是二氢卟酚浓度(μM)的函数，表示每种共轭物所用的符号如图 3中解释的一样。
图5表示牙龈卟啉单孢菌细胞经过波长630-710nm的光照射后的 存活曲线，用图3中解释的符号来表示预先吸收了二氢卟酚e6共轭 物的细胞，还包括吸收了Photofrin II的细胞样品(用连接x符号的短 虚线表示)，和另一种吸收了苯并卟啉(benzoporphyrin)衍生物的细胞样 品(用连接实三角形的短粗线表示)，它们的存活率均为光流量的函数。
图6表示HCPC-1仓鼠颊囊扁平细胞癌细胞经过波长630-710nm 的光照射后的存活曲线，预先吸收了二氢卟酚e6共轭物的细胞由图3 和6中解释的符号来表示，其存活率是光流量的函数。
发明详述
这里所说的光敏剂是指当使用具有适宜波长的电磁能(通常是适 宜波长的光线)照射时产生细胞毒性效果的物质。
这里所说的术语肽、多肽、和蛋白质可互换使用，除非另有特别 的说明。这里所述的方法和组合物中用到的肽、多肽和蛋白质可以是 重组的、从天然源中纯化的、或者是化学合成的。例如，说到使用细 菌蛋白或来自细菌的蛋白质，包括了使用重组技术生产的分子、从天 然源中纯化的分子、或化学合成的分子。
这里所说的非配对成员(NPM)是与靶位点结合的分子，例如多 肽。靶位点可以是蛋白质、核酸、脂类、多糖或其组合的结构。抗体、 受体、激素、生长因子、神经递质和酶不是NPM多肽并且在这里称 为成对成员(PM)。这些NPM在NPM和结合部位之间不表现出互补关 系。互补关系的意思是所结合的两个本体具有形状、轮廓和电荷的互 补组合，这种组合是基于位于一个本体上的“相对”官能团和位于另 一个本体上的“相对”官能团能够形成非共价键的能力，由此通过多 个非共价相互作用将两个本体配合。换句话说，NPM不包括与靶位点 互补的形状、轮廓和电荷类型的组合。通常来说，NPM对其靶子的亲 和性比PM低，例如上述的那些PM。NPM对其靶子的亲和力的Km 一般在mM到μM范围内。PM的结合在体内的释放，例如从底物中 释放出酶，通常需要结合其它的蛋白质，或者破坏或形成一个共价键。 在体外，经常要通过极度加热或pH来操作PM对，以分离组成PM 对的本体。
本发明的方法可以使用一种靶向部分，该靶向部分除了具有适用 于本发明目的的结合特性外还具有PM功能。例如，将LDL分子作为 PM型配体结合到阿朴B/E典型LDL受体上，将氧化或改变的LDL 分子作为PM型配体结合到巨噬细胞清除受体上。然而，LDL分子还 具有对格兰氏阴性表面组分的NPM型亲和力，这不是这里所说的PM 功能。PM相互作用通常以具有高特异性为特征，以致仅能识别一个 或几个同族分子，还以高亲和性为特征，一般具有在μM-pM范围内的 Km值。
这里所说的靶生物是指引起或加重病症的生物体。
这里所说的术语“患者”是指携带不希望的生物的活体动物或人， 其中所说的生物即是光动力治疗的靶生物。患者可以是免疫缺陷者。 患者可以是哺乳动物，包括人和非人哺乳动物例如狗、猫、猪、母牛、 羊、山羊、马、大鼠和小鼠。患者可能是以前通过化疗或抗生素疗法 治疗过的。
这里所说的“天然存在的”是指存在于自然中的分子。非天然存 在的分子是如果没有人为的介入其结构就不存在的分子。
这里所说的术语抗微生物性短肽(SAMP)是指长度少于60个氨基 酸残基的肽。符合这个限制的组氨素(histatin)、防卫素、杀菌肽、爪 蟾抗菌肽、格兰氏阳性细菌素、以及抗菌素均是SA。很多SA具有20-40 个氨基酸残基的长度。SA是天然存在的肽，并且由很多各种生物制 造。SA是NPM。很多SA具有广谱的抗微生物活性，例如可以杀死 一种以上的微生物，而且在某些情况下可以杀死关系较远的微生物种 类，例如格兰氏阴性和格兰氏阳性菌。
这里所说的多肽的活性片段或类似物保持了至少20％抗微生物活 性或多肽的靶生物亲和性。多肽类似物与多肽共有至少50％或更多、 优选60、70、80或90％的相同序列。
这里所说的唾液多肽是指患者产生或在患者唾液中发现的多肽。 大部分唾液多肽是由腮腺产生的。
这里所说的肽抗菌素是对细菌或真菌具有抗生活性的直链或环状 低聚肽，或者是其活性片段或类似物，是通过硫醚键而连接在多蛋白 复合物上通过酶促合成的。肽抗菌素可能包括非核糖体氨基酸例如D 氨基酸，可能包括非氨基酸残基例如乳酸或戊酸的酯。 光敏剂
光敏剂是当使用具有适当波长的电磁能(通常是适当波长的光线) 照射时产生细胞毒性效果的物质。
很多光敏剂产生单线态氧。当以适当能量水平和波长的电磁能照 射时，这种光敏剂分子转变成赋能形式。赋能形式可以和大气中O2反应，以致当光敏剂衰变成不带能状态时，产生单线态氧。单线态氧 是高活性的，并且对邻近的靶生物是有毒性的。
其三重赋能状态的寿命应当具有足够的持续时间(如几微秒)，以 允许和附近的分子相互作用产生细胞毒性种类。
光敏剂组合物应当有效地吸收高量子产率的适当波长的电磁能， 以有效产生赋能形式的光敏剂。当照射时，对靶生物的毒性应当有较 大的增加，优选10倍、100倍，或者更优选1,000倍的增加。光敏剂 应当表现出低的背景毒性，即在不用适当波长的能量照射时毒性是低 的。
光敏剂的其它优选特征包括在适宜溶剂中的高溶解性和稳定性。 例如，光敏剂应当在用来将其偶联到靶向部分或主链的条件下是可溶 的。期望的溶解度特性随反应所选择的条件而不同，但在DMSO、水、 乙醇、或者水和DMSO或乙醇的混合物(例如DMSO∶H2O或乙醇∶水) 有5％、10％或15％的溶解度可以是有用的。在水溶剂或乙醇∶水溶剂 中的溶解度优选为50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1mg/ml或10mg/ml。
当共轭到靶向部分时，所得的光敏剂：靶向部分共轭物在生理条 件下应当可溶于含适宜载体和赋形剂的含水溶剂、或者其它给药系统 如脂质体中。本发明的分子可以自由的光敏剂：靶向部分组合物溶液的 形式来给药，还可以各种剂型给药，包括(但不限于此)脂质体、肽/聚 合物结合物、或含去污剂的制剂。
本发明的组合物应当在至少一个周期的连续或脉冲照射治疗过程 中是稳定的，在该治疗过程期间组合物的每个分子优选被反复激活成 赋能状态，经历多次产生单线态氧的周期。在生理条件下，光敏剂共 轭分子的稳定性优选于37℃下1小时、30分钟、15分钟或至少1分 钟内存活10％、50％、90％、95％或99％的分子。
光敏剂包括(但不限于此)血卟啉，例如盐酸血卟啉和血卟啉酯 (Dobson，J and M.Wilson，Archs.Oral.Biol.37：883-887)；二血卟啉酯 (Wilson，M.et al.，1993，Oral Microbiol Immunol.8：182-187)；血卟啉IX (Russel et al.，1991，Can J.App.Spectros.36：103-107，可从Porphyrin Products，Logan，UT获得)及其衍生物；3，1-内消旋四(邻丙酰氨基苯基) 卟啉；氢化卟啉例如这里的二氢卟酚(chlorin)，以及四(羟基苯基)卟啉 系列的菌绿素，和合成的二卟啉和二-二氢卟酚；邻位取代的四苯基卟 啉(栅状卟啉)；二氢卟酚e6单乙烯二胺一酰胺(CMA Goff，B.A.et al.， 1994，70：474-480，可从Porphyrin Products，Logan，UT获得)；二氢卟酚 e6的一-1-天冬氨酰衍生物，和二氢卟酚e6的单和双天冬氨酰衍生物； 血卟啉混合物Photofrin II(Quardra Logic Technologies，Inc.，加拿大魁 北克BC)；苯并卟啉衍生物(BPD)，包括苯并卟啉一元酸环A(BPD- MA)、四氰乙烯加合物、二甲基乙炔二羧酸盐加合物、狄尔斯阿德耳 加成物、以及一元酸环“a”衍生物；萘菁 (naphthalocyanine)(Biolo，R.，1994，Photochem.和Photobiol，5959：362- 365)；Zn(II)-酞菁(Shopora，M.et al.，1995，Lasers in Medical Science 10：43-46)；甲苯胺蓝O(Wilson M，.et al.，1993，Lasers in Medical Science 8：69-73)；磺化铝和二磺化的酞菁(同上)；以及不含金属取代基和包含 各种其它取代基的酞菁；四硫酸化衍生物；磺化铝萘菁；亚甲蓝(同上)； 尼罗蓝；结晶紫；天蓝β氯化物；以及四碘四氯荧光素(Wilson，M.1994， Intl.Dent.，J.44：187-189)。很多光敏剂本体公开于Wilson，M.et al.，1992，Curr.Micro.25：77-81和Okamoto，H.et al.，1992，Lasers in Surg. Med.12：450-485中。
其它可用的光敏剂组合物包括(但不限于此)脱镁叶绿甲酯一酸， 例如焦脱镁叶绿甲酯一酸(pyropheophorbide)化合物，蒽二酮；蒽吡唑； 氨基蒽醌；吩噁嗪染料；吩噻嗪衍生物；硫属元素吡喃 鎓(chalcogenapylylium)染料，包括阳离子硒-和碲-吡喃鎓衍生物； verdins；红紫素包括八乙基红紫素和初红紫素(etiopurpurin)的锡和锌 衍生物；苯并萘并紫菜嗪；阳离子imminium盐；以及四环素。
适合在共轭物中使用的光敏剂可用这里所述的方法或者本领域技 术人员已知的方法来确定。
光敏剂氧化靶分子的效率是有用的一个量度。靶分子被光敏剂的 氧化效率可用在体外测定。底物的例子包括4-亚硝基-N，N，-二甲基苯 胺(RNO；Hasan，T.et al.，1987，Proc.AACR 28：395摘要1,568)和色氨酸或 组氨酸(Lambert，C.R.et al.1986，Photochem.Photobiol.44：595-601)。在 这些测定中，可以光谱监视所候选的光敏剂“漂白”底物的能力。化 学测定的优点在于可以同时筛选大量预测的光敏剂组合物。可变参数 包括光敏剂浓度、底物浓度、最佳照射强度和最佳照射波长。可以使 用高产率技术，包括使用塑料多孔皿、自动移液管和联机分光光度平 板读数器。不希望的光敏剂，例如在不照射条件下有高背景的组合物、 不具有有效能量捕获或活性潜力的组合物，可以被鉴别出来并且被除 去。
可以使用一种或多种靶生物模型的细胞进行体内测定来评价光敏 剂的背景细胞毒性和活化的形式。测定在照射和未照射光敏剂的存在 下杀死生物的效率，并且与未处理对照细胞样品的存活率比较。该测 定试验可以自动进行。使用菌落形成单位(CFU)或细胞生长计数可能 需要培养涂敷于营养培养基中的样品，随之是适当的生长迟滞期，以 允许菌落形成。
还可以通过生化方法的分析来监视靶生物模型细胞的存活，例如 DNA合成分析。在这种方法中，可以通过其对生物模型细胞样品的作 用来测定候选光敏剂的效率，其中所述样品也是被暴露到受标记的 DNA前体例如含氚胸腺嘧啶核甙中。然后收集细胞，洗涤除去未掺入 的前体，并监测前体的摄取和在酸不溶性沉淀中的掺入，这是DNA 合成的量度。在该测试中，也可以如上所述自动进行，这样可迅速评 价与定量出照射光敏剂组合物的定量评价效果。在未照射的对照细胞 和未处理的细胞中，做为细胞生长的函数DNA合成呈对数性增加。 表示存在假定的成功的新光敏剂的阳性结果是，在此光敏剂的存在下 被照射的细胞中的DNA合成中止。
适宜的靶生物模型是：大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球 菌和变异链球菌。光敏剂活性的适宜的阳性对照是甲苯胺蓝O。
如果筛出了大量的光敏剂，则可以指望使用两步筛选，其中第一 步是体外筛选而第二步是使用细胞。 照射
用适宜波长的光照射给定的化合物可以通过各种方法来实施。这 些方法包括(但不限于)施用激光、非激光或宽波段光。照射可以通过 体外或在关节内产生适宜波长的光来实现。本发明所用的光可以通过 使用任何能够传递必要功率光的装置来实施。包括(但不限于)纤维光 学仪器、关节内窥仪器或提供透照的仪器。光传递到口腔中可以通过 用易曲的光学纤维插入到牙周囊中或者通过经龈照明(牙龈的平均厚度 为5-7mm)来完成。灭活细菌需要的光源可以是便宜的二极管激光或 非相干光源。 偶联技术
这里所说的术语“偶联剂”指能够将光敏剂偶联到靶向部分上、 或者将光敏剂或靶向部分偶联到“主链”或“桥”上的试剂。任何键 均是适宜的，只要能够连接组成部分以致它们在生理条件下于给药或 治疗所需的时间内是稳定的，但共价键是优选的。两组成部分之间的 连接可以是直接的，例如光敏剂直接连接到靶向部分，也可以是间接 的，例如光敏剂连接到中间体如连接到主链上，而中间体是连接到靶 向部分上的。偶联剂应当在基本上保持光敏剂、主链(如果存在)和靶 向部分化学稳定的温度、pH、盐、溶剂体系和其它反应体的条件下起 作用。
偶联剂可以连接组成部分而不将偶联剂成分附加到被连接的组成 部分上。其它偶联剂导致偶联剂成分附加到被连接的组成部分上。例 如，偶联剂可以是均-或杂-双官能交联剂，并且其中交联剂的一个或 几个原子性组分会保留在组合物中。非交联剂的偶联剂可以在偶联反 应过程中完全除去，从而分子产物可以全部由光敏剂、靶向部分和主 链部分(如果存在的话)组成。
很多偶联剂与胺和羧化物反应，形成酰胺或醇以及与羧化物形成 酯。偶联剂为本领域已知的，例如参见Bodansky“肽的合成原理”第 二版(这里作为参考)和T.Greene and P.Wuts的“有机合成中的保护基” 第二版1991(John Wilsy，NY)。偶联剂应当稳定地连接组成部分，但应 当是光敏剂或靶向部分仅有最小的或没有变性或失活。
本发明的光敏剂共轭物可以通过使用以下实施例描述的方法将光 敏剂偶联到靶向部分上来制备，或者通过本领域已知的方法。各种偶 联剂包括交联剂可以用来共价结合。交联剂的实例包括N，N’-二环己 基碳二亚胺(DCC；Pierce)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰-硫代乙酸酯 (SATA)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDS)、邻亚苯基 二马来酰亚胺(o-PDM)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基) 环己烷-1-羧酸酯(硫基-SMCC)。例如参见Karpovsky et al.J.Exp.Med. 160：1686，1984；和Liu，MA et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648， 1985。其它方法包括Paulus，Behring Ins.Mitt.，No.78，118-132，1985； Brennan et al.Science 229：81-83，1985和Glennie et al.，J.Immunol.， 139：2367-2375，1987中所述。Pierce Chemical Co.目录T-155-T-200 页，1994(3737 N.Meridian Rd.，Rockford IL，61105，美国.；Pierce Europe B.V.，P.O.Box 1512，3260 BA Oud Beijerland，荷兰)中记载了很多肽和 蛋白质用的偶联剂、以及缓冲剂、溶剂及使用方法，该目录引入这里 作为参考。
DCC是一种有用的偶联剂(Pierce#20320；Rockland，IL)。它促进醇 NHS和二氢卟酚e6在DMSO(Pierce#20684)中偶联，形成可交联到多 溶素上的活化的酯。DCC(N，N’-二环己基碳二亚胺)是羧基反应性交 联剂，通常用作肽合成中的偶联剂，分子量206.32。另一种有用的交 联剂是SPDP(Pierce#21557)，一种对伯胺和巯基作用的杂双官能交联 剂。SPDP的分子量为312.4，空间距离(spacer arm)长度为6.8埃，对 NHS-酯和吡啶基二硫基是有反应性的，并产生可裂解的交联，以致当 进一步反应时，交联剂被消除从而使光敏剂可以直接连接到主链或靶 向部分上。其它有用的共轭剂是SATA(Pierce#26102)，用于给两步交 联引入嵌段SH基团，该基团用羟基胺-HCl(Pierce#26103)和硫基-SMCC 脱嵌段(Pierce#22322)去嵌段，SATA对胺和巯基是有反应性的。从 Pierce化学公司(Rockland，IL)还可以获得其它交联剂和偶联剂。将蛋 白质共轭到其它蛋白质上或其它组合物上(如共轭到金属离子标记蛋白 质用的报告基团或螯合剂上)的其余化合物和方法，尤其是那些涉及席 夫碱中间物的，被公开于EP0243,929A2(1987.11.4公开)。
通过预形成的活性酯(如N-羟基琥珀酰亚胺酯)或由碳化二亚胺介 导反应而原位共轭的酯，含羧基的光敏剂可以结合到靶多肽中的赖氨 酸的ε-氨基上。对含磺酸基的光敏剂使用相同办法，可以将磺酸基转 变成可和氨基反应的磺酰氯。具有羧基的光敏剂可以通过原位碳二亚 胺方法联接到多肽的氨基上去。光敏剂还可以连接到丝氨酸或苏氨酸 残基的羟基上，或半胱氨酸残基的巯基上。
共轭物组成部分的连接方法，例如将带光敏剂的聚氨基酸链连接 到抗菌性多肽上，可以使用杂双官能交联试剂。这些交联剂将一个官 能团结合到一个链上并且另一个官能团连接到第二个链上。这些官能 团一般是氨基、羧基、巯基和醛。有很多形式的能和这些基团反应来 将它们共轭到一起并且具有不同化学式结构的适宜的部分。参见Pierce 目录和Merrifield，R.B.et al.Ciba Found Symp.186：5-20.1994。
光敏剂：靶向部分共轭物的生产或纯化可以通过本领域已知的方 法实现。偶合反应的产率可以通过光谱分析从最后步骤的色谱分离中 洗脱下来的产物来计量。随后，存在未偶联的光敏剂和含光敏剂的反 应产物的物理特征是光敏剂部分吸收特征波长的光和其消光系数，所 以产物中的掺入是可以通过在特征波长或相似波长的光吸收来监视到 的。偶联一个或多个光敏剂分了到靶向部分或主链上去，可使使用大 小排阻凝胶层析法洗脱出的组分的洗脱图的吸收峰发生位移。大小排 阻凝胶层析可在Sephadax G50、G100或G200或其他如此的基质 (Pharmacia-Biotech，Piscataway NJ)上进行。适宜大小排阻凝胶例如 Sephadex凝胶的选择，可以通过凝胶来决定，其中光敏剂洗脱在超过 原料的排除体积太大以致不能和珠相互作用的组分中，即未偶联的起 始光敏剂组合物和分离珠相互作用到一定程度并且伴随延迟到一定程 度。适用的凝胶可以从未偶联光敏剂的分子量中预知。光敏剂偶联到 附加部分的成功反应产物通常具有特征性的较高分子量，使得它们和 级分珠相互作用的程度较低，并因而出现在比含未偶联光敏剂底物组 分洗脱得早的馏分中。未反应的光敏剂底物一般出现在起始原料特征 的组分中，各反应的产量可以因此从较大分子量原料的峰值大小、和 特征起始原料峰值的减少中估计出来。使用摩尔消光系数将产物组分 峰下的面积换算成产量大小。
产物可以通过使用NMR来分析，将适宜产物的峰面积积分，来 测定用不同偶联剂的相对产量。跟随偶联到聚氨基酸上时，经常观察 到在光敏剂的吸收中有几nm的红移。偶联到较大部分例如蛋白质中 时，可能产生可比较的位移，如与游离光敏剂的吸收相比较，偶联到 抗体上时造成的位移在那方向上为约3-5nm。对二氢卟酚e6而言，在 0.1M NaOH/1％ SDS中的相关的吸收最大值和消光系数为400nm和 150,000M-1，cm-1，对苯并卟啉衍生物来说为430nm和61,000-1，cm-1。 主链部分
本发明的光敏剂：靶向部分共轭物包括那些与光敏剂直接偶联的 靶向部分，例如组氨素(histatin)。本发明的其它光敏剂：靶向部分共轭 物包括“主链”或“桥”部分，例如聚氨基酸，其中主链既被偶联到 光敏剂上也被偶联到靶向部分上。主链本身可以就是靶向部分，例如 聚赖氨酸(见实施例4和图5与6)。
在光敏剂和靶向部分的共轭物中包含主链可以具有很多优点，包 括提供每条主链偶联较大化学计量范围的光敏剂和靶向部分。如果主 链具有对靶生物的内在亲和性，则复合物的亲和性可以通过偶联到主 链上而得到增强。可以通过将两个或多个不同的靶向部分偶联到单个 光敏剂-主链复合物中来扩大一个复合物所靶向的生物的特定范围。
可用于在本发明方法和化合物中的主链部分设计和特征分析的肽 包括聚氨基酸，所说的聚氨基酸可以是L-、D-、外消旋DL-或混合L- 和D-氨基酸组成的均聚物和杂聚物，并且可以是确定的或无规的混合 组成和序列。具有混合D和L氨基酸残基的天然存在的肽的实例包括 杆菌肽和短杆菌酪肽。这些肽可以仿造特定的天然肽被制造出来，并 且通过为增强结合到所选择的靶上的噬菌体展示和选择技术来进行优 化，以便将被选择的具有最高亲和性的肽特示出来，然后合成生产。 例如为增加溶解性、减少聚集性和改变疏水性程度的目的，可以进行 官能团的其它进一步修饰。非肽主链的例子包括核酸及核酸衍生物如 DNA、RNA和肽核酸；多糖及衍生物如淀粉、果胶、几丁质、纤维 素、半甲基化纤维素；脂类如甘油三酸酯衍生物和脑苷脂；合成聚合 物如聚乙二醇(PEGs)和PEG星形聚合物；葡聚糖衍生物、聚乙烯醇、 N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺共聚物、聚(DL-乙醇酸-乳酸)；以及包 含任何一种这类化合物成分的组合物。 共轭物电荷的修饰
共轭物对靶生物的亲和力可以通过修饰共轭物组分的电荷来提 高。
如聚-L-赖氨酸二氢卟酚e6的共轭物可以被制成具有不同大小和 电荷(阳离子性、中性和阴离子性)，例如可以用乙酰基、琥珀酰基或 其它R基团将聚赖氨酸的自由NH2封端来改变最终复合物的带电量。 本发明共轭物的净电荷可以通过等电点聚焦(IEF)来测定。该技术使用 外放电压在非筛析用丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中通过使用两性电解物质 体系(合成的缓冲组分)来产生pH梯度，当将带电的多肽加到凝胶上 时，它们将迁往凝胶的较高pH区域或迁往凝胶的较低pH区域，而在 使它们变得不带电的位置不再移动。这个位置可以通过参考已知的IEF 系列标记蛋白的位置来确定。
由于聚氨基酸上的极性带电基团的合并，以及平面芳族四吡咯环 之间的疏水吸引，这些共轭物可以采用可和细菌细胞壁相互作用的pH 依赖的构象。此外，组氨素(histatin)和相关的多肽包含至少一个赖氨 酸残基，该残基通过使用两种杂双官能试剂将组氨素(histatin)和聚赖 氨酸二氢卟酚e6分子之间以共价双硫键连接。可以确定光敏剂对各 种口腔病原细菌的最佳组成、浓度和使用时间。 靶向部分
所期望的靶向部分的特征包括：对一种或多种不希望的靶生物的 特异性、亲和性和亲合力，以及在偶联反应条件和器官或组织的生理 学条件下的稳定性。特异性不需作狭义的定义，例如它可以对靶向分 子是所需的，以便对一个宽范围中的靶生物具有亲和性，如格兰氏阴 性细菌。
当掺入到本发明的共轭物分子中时，靶向部分应当对患者的细胞 是无毒的。
靶向部分可以选白天然存在的蛋白质和肽的序列，来自这些多肽 的变种，和来自生物或化学合成的肽。对一种或多种靶生物具亲和性 的天然存在的肽可以提供具有所期望的特性如增加的亲和性和特异性 的序列，从而可以用来被个别地或做为相关肽文库的一个成员来合 成。这种肽可以基于对靶生物的亲和性来选择。
在本发明的方法和化合物中有用的具靶生物亲和性的天然存在的 肽包括唾液蛋白质例如组氨素(histatin)、微生物加工的蛋白质如细菌 素、能结合和/或杀死与生产菌株紧密相关种类的肽；和通过动物品种 产生的蛋白质如防卫素(由哺乳动物产生)、和杀菌肽和爪蟾抗菌肽(分 别由蛾类和两栖类产生)。
组氨素(histatin)、防卫素、杀菌肽和爪蟾抗菌肽是这类自然界广 泛发现的多肽的实例，具有小尺寸(一般大约30个氨基酸残基，并且 在10个残基和50个残基之间)、广谱抗菌特异性、和对靶生物的低亲 和性的特征。
使用组氨素(histatin)作为光敏剂靶向部分将允许将光敏剂靶向细 菌细胞，并同时保持宿主细胞不被损害。组氨素(histatin)是具有杀细 菌性和杀念珠菌性的富含组氨酸的阳离子多肽类，并且是正常人唾液 的成分(Oppenheim，G.G.et al.，J.Biol.Chem.263：7472-747，1988)。它们 的作用机理被认为是其α螺旋构象和阳离子电荷的组合引导它们插入 细菌细胞壁的极性头基团之间(Raj，.P.A.，et al.，J.Biol.Chem.269：9610- 9619，1994)。
尽管可用的组氨素(histatin)适合用作口腔杀菌剂，但它们起作用 需几个小时的时间，导致了为使组氨素保留在感染部位而使用制剂给 药赋形剂如凝胶的问题。然而，口腔细菌的光动力失活可以仅需要靶 向细菌的光敏剂的简单应用，例如通过施用漱口药。由于细菌比平均 的哺乳动物细胞小50-100倍，并且光动力治疗的原理被认为涉及在组 织中具有非常短扩散距离的分子种类如单线态氧(对于单线态氧，其扩 散距离小于50nm)。可以看出，对细菌中等程度的敏感剂选择性可能 导致在细胞毒性中的高水平选择性。人和实验动物中的低水平PDT显 示活化了宿主免疫系统的成分如巨噬细胞和淋巴细胞，且这些活化的 宿主细胞可以参与消灭细菌和帮助被疾病损毁的组织的再生。
组氨素(histatin)-1、-3和-5分别在38、32和24个残基的总多肽 长度中各包含7个组氨酸残基。组氨素(histatin)具有很多活性，例如 抗真菌活性如抗念珠菌属病原体(US专利5,486,503)。组氨素 (histatin)-5残基13-24的重组复制赋予肽以增强的杀念珠菌活性(Zuo，F. et al.，Gene 161：87-91，1995)。组氨素(histatin)-5是一种由口腔细菌种牙 龈卟啉单孢菌(拟杆菌属)所产生的胰蛋白酶类蛋白酶的抑制剂，所述 蛋白酶与牙周疾病的组织毁灭有关系(Nishikata，M.et al.，Biochem. Biophys.Res.Comm.174：625-630，1991)。约3,600个组氨素(histatin)-5 分子结合牙龈卟啉单孢菌，其Kd在10-6M数量级上(Murakami，Y.et al.，FEMS Microbiol Letts.82：253-256，1991)。组氨素(histatin)-5和-8抑 制牙龈卟啉单孢菌和S.mitis的共聚集(Murakami，Y.et al.，Inf.Immun. 59：3284-3286，1991)，这可能调节牙龈卟啉单孢菌对以前结合到口腔组 织上的格兰氏阳性细菌的附着。
组氨素(histatin)-5对至少一种口腔细菌种牙龈卟啉单孢菌 (Colon，J.O.et al.，J.Dent.Res.72 IADR Abstr：322，Abstr，751)和粘性放线 菌、内氏放线菌和溶齿放线菌(Kalpidis，C.D.et al.，op.cit.71：305， Abstr.1595)具有杀菌活性。对后者种的直接的抗菌活性似乎不存在对 放线菌属细胞凝集的受体活性。组氨素(histatin)-5的合成肽是牙龈卟 啉单孢菌(拟菌杆属)血细胞凝集素的潜在抑制剂(Murakami，Y.et al.， Archs.Oral.Biol.35：775-777)。该合成肽是强阳离子性的(22个残基中含 6个His、4个Lys和3个Arg)，可能做为在上皮细胞、唾液表膜和格 兰氏阳性细胞上牙龈卟啉单孢菌的结合域。
被C-或N-末端化学封闭并且与金属(例如Ag、Cu、Zn或Sn)络 合的组氨素(histatin)，适合一定范围的抗微生物用途，例如抗噬菌体、 抗龋、抗口臭的口腔用途、除臭用途、个人卫生用途等(EPO专利申 请721 774 A2)。
细菌素，是一类由细菌产生的并且杀死其它菌株和细菌种的蛋白 质(Jack，R.W.et al，Microbiol.Rev.59：171-200，1995)，可以用作靶向部分。 一种示例性的格兰氏阳性细菌素是乳酸链球菌肽，它由乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)产生并且符合食品药物管理局的适用食品保藏的 GRAS分类地位(通常被认为是安全的)。
细菌素乳酸链球菌肽、枯草菌素、表皮素、gallidermin、唾液素 (salivarin)和乳链球菌素是“羊毛硫抗生素”类格兰氏细菌素的例子， 它被定义为细菌素，其中一个或几个半胱氨酸残基连接到脱水丝氨酸 或苏氨酸上，形成已知如羊毛硫氨酸(Lan)或苏型-β-甲基羊毛硫氨酸 (MeLan)的硫醚连接的残基。在这些来自生产细胞的抗微生物的肽中 发现有翻译后修饰。羊毛硫抗生素包含18-24个残基的前导肽序列， 该羊毛硫抗生素裂解生成约22-35个残基的活性抗微生物肽。生产用 细菌种的生长、以及细菌素的制备和纯化可通过可由本领域技术人员 实现的公开程序和技术来完成。例如，Yang，R.et al.，Appl.and Env. Microbiol 58：3355-3359，1992描述了从乳酸菌4个属中的每种中纯化出 细菌素，是通过优化生产细胞的吸收，接着使用低pH来选择洗脱非 常富含细菌素的组分。细菌素乳酸链球菌肽(由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)生产)、和枯草菌素(枯草芽胞杆菌生产)各自的突变型比亲本野 生型具有更多所需的特性(Liu，W.and N.Hansen，J.Biol.Chem.267：25，078- 25，085，1992)。关于适宜基因的分离以及携带所需突变之菌株的诱变和 选择的程序可在Maniatis，T.et al，1982，分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY和接下来的第二版 Sambrook，J.et al.，1989中找到。
抗微生物肽由各种动物产生(参见Saberwal，G.and R.Nagaraj， Biochim.Biophys.Act.1197：109-131，1994的综述)。其实例是由惜古比 天蚕蛾产生的杀菌肽类的肽。几种杀菌肽包含37个残基，其中6个 是赖氨酸。杀菌肽能有效地对抗格兰氏阳性和格兰氏阴性细菌。其它 昆虫产生的肽包括蜜蜂素(apidaechin)(来自蜜蜂)、雄素(andropin)(来自 果蝇)、和来自大黄蜂、果蝇和其它昆虫的杀菌肽类的成分。
防卫素由哺乳动物(包括人)产生，通常约29-34个残基长度，且 爪蟾抗菌肽(约23个残基)由两栖类如有爪蟾蜍产生。来自人(HNP-1、 -2、-3和4)、天竺鼠(GPNP)、兔子(NP-1、-2、-3A、-3B、-4和-5)和 大鼠(NP-1、-2、-3和-4)的防卫素共有大量的同源区。防卫素可以具 有对格兰氏阳性细菌或格兰氏阴性细菌及真菌的抗微生物活性，其最 低抑制浓度在mM范围。兔NP-1和NP-2是比这类中的其它防卫素更 有潜力的抗微生物剂。其它哺乳动物抗微生物肽包括鼠隐素 (cryptdin)、牛粒细胞细菌素(bactenecin)和indolicidin、以及来自牛精 液的精液胞质素。其它两栖类抗微生物剂包括PGLX、XP、LPF、CPG、 PGQ、来自多彩铃蟾的铃蟾抗菌肽、来自东方铃蟾的铃蟾抗菌肽类的 肽BLP-1、-2、-3和-4、以及来自一食用蛙的短杆菌素(brevinin)。无 脊椎动物例如马蹄形螃蟹可以是诸如tachyplesin(I、II和III)和 polyphemusin(I和II)的抗微生物肽。
这类抗微生物剂中的肽通常是阳离子性的，并且可以具有广谱的 抗微生物活性，包括抗细菌和抗真菌活性。添加带正电荷的残基可以 增强几倍的抗微生物特异活性。正电荷被认为有助于肽插入到易感生 物的膜中，其中肽分子的结构可以形成孔并且引起离子和其它代谢物 的流出。例如，Moses sole鱼神经毒素33残基肽pardaxin的结构研究 揭示了琥珀酰化的pardaxin比未改性pardaxin更缓慢地插入红细胞和 膜模型(Shai，Y et al.，J.Biol，Chem.265：20，202-20，209，1990)。带正电荷 的爪蟾抗菌肽分子可以瓦解大肠杆菌的代谢和线粒体的电势 (Wseterhoff ，H.V.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.86：6597-6601，1989)。
新的肽，例如杀菌肽-蜂毒肽杂合物、以及合成的D-对映体，具 有抗微生物活性(Merrifield，R.B.et al.，“抗微生物肽”Ciba Foundation Symp.186，Hohn Wiley，Chichester，pp.5-26，1994)。这样合成的杀菌肽-蜂 毒肽抗耻垢分枝杆菌的活性大于利福平5倍。
靶向部分可以是对特定靶生物具有亲和性的植物蛋白质，例如， 具有多糖亲和性的凝集素蛋白质类物质。
靶向部分可以是包含很大比例的带正电荷氨基酸残基的合成肽， 例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、和合成的杂多肽。这种肽可以 是化学合成的或者是在重组生物体中生物生产的；在后一种情况中， 靶向部分肽可以是作为较大蛋白质的一部分(例如作为N-末端残基)， 并从较大的蛋白质中切割下来。如果对靶生物具有足够的亲和性，适 合作为“主链”和“桥”部分的多肽也适合作为靶向部分。靶向部分 可以通过这里描述的各种方法来合成和选择或富集。
靶向部分不必限制为是肽的组成，还可以是凝集素、多糖、类固 醇、金属有机复合物。靶向部分的构成可以是由氨基酸和糖如粘多糖 组成。一种有用的靶向部分可以是部分脂类和部分是肽的性质，例如 低密度脂蛋白。
血清脂蛋白特别是高密度和低密度脂蛋白(HDL和LDL)可以结合 到细菌表面蛋白上(Emancipator，K et al.，Infect.Immun.60：596- 601，1992)。HDL和特别是重组的HDL在体外和体内均能中和细菌脂 多糖(Wurfel MM et al.，J.Exp.Med.181：1743-1754，1995)。内源LDL可 以起保护作用，使机体不受内毒素和格兰氏阴性菌感染的致死性影响 (Netea，M.，et al.，J.Clin.Invest.97：1366-1372，1996)。脂蛋白对细菌表面 成分的适宜结合特点可以通过本领域已知的分子生物学方法来鉴别， 并且脂蛋白的结合特点可以用作本发明的光敏剂复合物中的靶向部 分。 候选肽靶向部分的生产和筛选
本发明者发现除了抗体和高亲和性配体对成分外的分子如肽，可 以用来将光敏剂导向到靶生物。以下方法可以用来修饰或改进这里所 发现的靶向部分或用来发现新的靶向部分。
一旦提供了具有合理亲和性的靶向部分，本领域技术人员便可以 通过产生片段或类似物、并且测试新产生结构的亲和性或特异性的改 进，来改变所公开的结构(例如聚赖氨酸多肽的结构)。下面将讨论允 许生产和测试片段和类似物的示例性方法。这些方法可以用来制造是 靶向部分的已知的天然存在的多肽或蛋白质的片段和类似物，如是多 肽，如组氨素(histatin)或低密度脂蛋白，它们中每一个对一种或几种 细菌种的细胞具有结合性亲和力。 片段的产生
蛋白质的片段可以通过重组、蛋白水解消化、化学合成几种方式 来产生。多肽的内片段或末端片段可以通过从编码多肽的核酸的一端 (末端片段)或两端(内片段)除去一个或几个核苷酸来产生。被诱变DNA 的表达产生多肽片段。因此用“末端-(蚕食式)”持续性外切核酸酶的 消化可以产生编码片段序列的DNA。编码蛋白质片段的DNA还可以 通过随机剪切、限制酶切消化或上述方法的组合来产生。
片段还可以通过使用本领域已知的技术例如常规Merrifield固相 f-Moc或t-Boc化学作用来化学合成。例如，本发明的肽可能被任意 地分成所需长度的没有片段重叠的片段，或者分成所需长度的重叠片 段。 类似物的产生：通过随机方法生产改变的DNA和肽序列
蛋白质的氨基酸序列变化体可以通过随机诱变编码蛋白质或蛋白 质一个特定域或区域的DNA来制备。有用的方法包括PCR诱变和饱 和诱变。随机氨基酸序列变体的文库还可以通过合成一组简并寡核苷 酸序列来产生。(在变体文库中筛选蛋白质的方法见本发明的别处)。 PCR诱变
在PCR诱变中，降低的Taq聚合酶保真度用来将随机诱变引入 DNA的克隆片段中(Leung et al.，1989，Techniquel：11-15)。这是一种非 常有效和相对快的引入随机诱变的方法。使用聚合酶链反应(PCR)， 在用Taq DNA聚合酶降低DNA合成保真度的条件下(例如通过使 dGTP/dATP比值为5并添加Mn2+到PCR反应中)，来扩增待诱变的DNA 区域。将扩增的DNA片段库插入到适宜的克隆载体中以提供随机突 变文库。 饱和诱变
饱和诱变允许将大量单个碱基置换引入克隆的DNA片段中 (Mayers et al.，1985，Science 229：242)。该技术包括突变的产生(例如通 过体外化学处理或照射单链DNA)，和互补DNA链的合成。可以通过 调整处理的烈度来调节突变频率，并且基本上可以获得所有可能的碱 基置换。由于这个过程不涉及突变片段的基因选择，因而可获得中性 置换和改变了功能的置换。点突变的分布不偏向于保存的序列元件。 简并寡核苷酶
同系物文库还可以从一组简并寡核苷酸序列中产生。简并序列的 化学合成可以在自动DNA合成仪中完成，然后将合成的基因连接到 合适的表达载体中。简并寡核苷酸的合成为本领域所已知(例如参见 Narang，SA(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura et al.(1981)Recombinant DNA，Proc 3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，ed.AG Walton， Amsterdam：Elsevier pp273-289；Itakura et al.(1984)Annu.Rev.Biochem. 53：323；Itakura et al.(1984)Science 198：1056；Ike et al(1983)Nucleic Acdid Res.11：477)。这种技术已被运用于其它蛋白质的定向进化(例如参见， Scott et al.(1990)Science 249：386-390；Roberts et al.(1992)PNAS 89：2429- 2433；Devlin et al.(1990)Science 249：404-406；Cwirla et al.(1990)PNAS 87：6378-6382；以及US专利5,223,409；5,198,346和5,096,815)。 类似物的产生：通过定向诱变生产改变的DNA和肽序列
非随机或定向诱变技术可以用来在特定区域中提供特定序列或突 变。这些技术可以用来生产蛋白质已知氨基酸序列残基的变体，包括 例如缺失、插入或置换。突变的位点可以单个地或系列地进行修饰， 例如通过(1)先用保守的氨基酸置换，然后根据达到的结果用更多的自 由基选择置换，(2)造成靶残基缺失，或(3)邻近于定位的位点插入相同 或不同类的残基，或者选择性结合1-3。 丙氨酸扫描诱变
丙氨酸扫描诱变是一种有用的鉴定所需蛋白质某些残基或区域的 方法，其中所说的蛋白质是诱变优选的位置或域(Cunningham and Wells，Scenice 244：1081-1085，1989)。在丙氨酸扫描中，鉴定出靶残基 的残基或基团(例如带电残基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并被置换 成中性或带负电的氨基酸(首选丙氨酸或聚丙氨酸)。氨基酸的置换可 以影响氨基酸和细胞内或外周围含水环境的相互作用。然后，通过在 置换的位点或为置换的位点引入另外或其它的变体来精修表现出对置 换功能性敏感的那些域。因此，当预确定了用于引入氨基酸序列变体 的位点时，突变自身的性质不需要预确定。例如，为优化在指定位点 的突变的性能，可以在靶密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱 变，并且筛选表达的所需蛋白质亚单位的变体来最佳组合所需的活 性。 寡核苷酸介导诱变
寡核苷酸介导诱变是一种有用的制备DNA置换、缺失或插入变 体的方法(例如参见Adelma et al.，DNA 2：183，1983)。简单地说，所需 的DNA由将编码突变的寡核苷酸和DNA模板杂交来改变，在此，模 板是质粒的单链形式或包含着所需蛋白的DNA序列的未被改变的或 野生型DNA序列的噬菌体。杂交后使用DNA聚合酶来合成模板的完 整第二互补链，以使模板因此掺入寡核苷酸引物，并在所需蛋白质DNA 中编码所选择的改变。通常，使用长度为至少25个核苷酸的寡核苷 酸。最适的寡核苷酸具有12-15个核苷酸，完全互补于模板上编码突 变的核苷酸两侧的序列。这就确保了寡核苷酸与单链DNA模板分子 的正确杂交。通过使用本领域已知的技术如Crea et al.(Proc.Natl. Acad.Sci.USA，75：5765，1978)所描述的可容易合成寡核苷酸。 盒式诱变
另一种制备变体的方法盒式诱变是基于Wells et al.所述的技术 (Gene 34：315，1985)。起始原料是包含待突变的蛋白质亚单位DNA的 质粒(或其它载体)。识别出待突变的蛋白质亚单位DNA中的密码子。 必须有一种识别突变位点两侧的独特的限制内切核酸酶。如果没有这 种限制位点存在，则可以通过使用上述寡核苷酸介导诱变的方法将其 引入到所需蛋白质亚单位DNA中的合适位置来产生所说的限制位点。 在将限制位点引入质粒之后，在这些位点处切割质粒使其线性化。使 用标准工艺合成一用来编码限制位点之间的DNA序列但含所需突变 的双链寡核苷酸。分别合成两条链然后使用标准技术将其杂交在一 起。该双链寡核苷酸被称为盒。将该盒设计成具有可和线性化质粒的 末端相比较的3’和5’末端，从而使它可以直接连接到质粒上。此 时该质粒包含突变的所需蛋白质亚单位DNA序列。 组合诱变
还可以使用组合诱变来产生突变。例如，将同系物或其它相关蛋 白质的氨基酸序列进行排列，以优选促进可能的最高同系性。可以选 择在排列序列的给定位置处出现的所有氨基酸，来产生组合序列的一 套简并。通过核酸水平的组合诱变产生变体的斑驳文库，并且通过斑 驳基因库来编码。例如可以将合成的寡核苷酸混合物酶促连接到基因 序列中以致潜在序列的简并组可表达为个体肽，或者可表达为一组含 简并序列组的较大融合蛋白。 肽片段或同系物的筛选文库用初级高流通量方法
在所得基因产物的筛选领域中已知有各种技术。筛选大文库的技 术通常包括将有用的核苷酸克隆到可复制的表达载体中，用所得的载 体文库转化适宜的细胞，并且在检测(例如此情况下)结合靶生物或靶 生物表面组成所需活性的条件下表达基因。该技术有助于载体的相对 容易分离，所说的载体是用来编码检测其产物的基因的。下面所述的 每种技术均符合筛选大量制造的序列(例如通过随机诱变技术)的高流 通量分析。 展示文库
在筛选试验的一种方式中，候选的肽被展示在细胞或病毒性颗粒 的表面，并在“淘选试验”中检测特别的细胞或病毒颗粒通过展示产 物结合适宜的靶生物的能力。例如，可以将基因文库克隆到用于细菌 细胞表面膜蛋白的基因中，并通过淘选试验来检测所得的融合蛋白 (Ladner et al.，WO88/06630；Fuchs et al.，(1991)Bio/Technology 9：1370- 1371；和Goward et al.，(1992)TIBS 18：136-140)。在相似的方式中，可以 使用一种可检测的标记配体来评价潜在功能性的肽同系物。荧光标记 的配体，例如靶生物，可以用来检测保留配体结合活性的同系物。使 用荧光标记的配体，允许细胞可在荧光显微镜下被目测检查与分离， 或者，当细胞的形态允许时，通过荧光激活的细胞分选仪来分离。
基因文库可被作为融合蛋白表达在病毒颗粒的表面上。例如，在 丝状噬菌体体系中，外来肽序列可以被表达在感染性噬菌体的表面， 由此带来了两个显著的好处。首先，由于这些噬菌体可以完全超过1013 噬菌体/毫升的浓度被应用到亲和基质中，因而可在同一时间里筛选大 量的噬菌体。其次，由于每种感染性噬菌体在其表面展示一种基因产 物，如果一特定噬菌体从亲和基质中以低产量回收，则该噬菌体可以 通过另一轮的传染来扩增。噬菌体展示库中最经常使用的是差不多相 同的大肠杆菌丝状噬菌体群M13、fd和fl。噬菌体gIII或gVIII外壳 蛋白均可以用来产生融合蛋白而不破坏病毒颗粒的最终包装。外来表 位可以被表达在pIII和噬菌体的NH2-末端，此噬菌体携带了从大量缺 乏这种表位的噬菌体中回收的表位(Ladner et al.，PCT出版物 WO90/02909；Garrard et al.，PCT出版物WO92/09690；Marks et al.，(1992) J.Biol.Chem.267：16007-16010；Griffiths et al.，(1993)EMBO J 12：725- 234；Clackson et al.，(1991)Nature 352：624-628；以及Barbsa et al.，(1992)PNAS 89：4457-4461)。
通用方式是使用大肠杆菌的麦芽糖受体(外膜蛋白，LamB)作为肽 融合配偶体(Charbit et al.，(1986)EMBO 5,3029-3037)。寡核苷酸被插入 到编码LamB基因用的质粒中，以产生融合到一种蛋白质的细胞外环 光敏剂(loophotosensitizer)中的肽。可利用这些肽来结合配体，例如抗 体，并且当细胞被施用于动物时可以引出免疫应答。其它细胞表面蛋 白例如OmpA(Schorr et al.，(1991)Vaccines 91，PP.387-392)、 PhoE(Agterberg，et al.，(1990)Gene 88，37-45)、和PAL(Fuchs et al.， (1991)Bio/Tech 9，1369-1372)，以及大细菌表面结构已充当了肽展示用 的载体。肽可以被融合成菌毛蛋白，这是一种聚合形成菌毛(用于遗传 信息的细菌间交换的管道)的蛋白质(Thiry，et al.，(1989)Appl.Environ. Microbiol.55，984-993)。由于它在和其它细胞相互影响中的作用，菌 毛提供了将肽呈现到细胞外环境的有用的支持。另一种用于肽展示的 大的表面结构是细菌运动器官--鞭毛。肽融合到亚单位蛋白质鞭毛蛋 白中提供了在宿主细胞上很多肽拷贝的致密排列(Kuwajima et al.， (1988)Bio/Tech.6，1080-2083)。其它细菌种类的表面蛋白也充当了肽 融合的配偶体。其实例包括葡萄球菌属蛋白A和奈瑟氏球菌属的外膜 IgA蛋白酶(Hasson et al.，(1992)J.Bacteriol.174，4239-4245；Klauser et al.，(1990)EMBO J.9，1991-1999)。
在上述的丝状噬菌体系统和LamB系统中，在肽和编码它的DNA 间的物理连接是通过在其表面载有肽的颗粒(细胞或噬菌体)中包含 DNA来实现的。捕获肽就捕获了颗粒及其中的DNA。另一种方案是 使用DNA结合蛋白LacI来形成肽和DNA之间的连接(Cull et al.，1992，PNAS USA 89：1865-1869)。该系统使用含LacI基因的质粒， 该基因在其3’末端具有寡核苷酸克隆位点。在通过阿拉伯糖的受控 诱导条件下，产生了LacI-肽融合蛋白。这种融合保留了LacI结合已 知为LacO操纵基因(LacO)的短DNA序列的天然能力。通过在表达质 粒上装配LacO的两个拷贝，LacI-肽融合体紧密地结合成编码它的质 粒。由于每个细胞中的质粒仅包含单一寡核苷酸序列，且每个细胞仅 表达单一肽序列，因此肽变得和指导其合成的DNA序列特定地和稳 定地关联。将文库的细胞温和地溶解并将肽-DNA复合物置于固定化 受体中，来回收含活性肽的复合物。然后，将关联的质粒DNA再引 入到扩增和DNA测序用的细胞中，来决定肽配体的同一性。正如方 法的实际应用所展示的，在抗阿片样肽强啡肽B的单克隆抗体上制造 和选择一种十二肽的大随机库。回收一大群的肽，都与对应于强啡肽 B六个残基部分的一个共有序列相关联(Cull et al.，(1992)Proc.Natl. Acad.Sci.USA89-1869)。
这个方案，有时被称作“质粒上的肽”，与噬菌体展示方法有两 个重要方面的不同。首先，肽附着在融合蛋白的C末端上，造成文库 成分展示为具有自由羧基末端的肽。两种丝状噬菌体外壳蛋白，pIII 和pVIII，都通过其C末端被固着在噬菌体上，并且客体肽被放入向 外扩展的N-末端域中。在一些设计中，噬菌体展示的肽恰好呈现在融 合蛋白的氨基末端处(Cwirla et al.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，6378-6382)。第二个不同是文库中确实存在影响肽总数的生物学倾 向性的设定。将LacI融合分子包含在宿主细胞的细胞质中。在翻译过 程中将噬菌体外壳融合短暂地露置到细胞质中，它通过内膜快速分泌 到周质区，通过其C末端的疏水域保持固定在膜中，其包含肽的N- 末端，突出到周质中等待装配到噬菌体颗粒中。它们暴露于不同蛋白 水解活性的结果是LacI和噬菌体文库中的肽可以明显不同。噬菌体外 壳蛋白需要先行转运穿过内膜和信号肽酶加工来掺入到噬菌体中。某 些肽对这些过程产生有害影响并且未被充分表现在文库中(Gallop et al.，(1994)J.Med.Chem.37(9)：123-1251)。这些特定的倾向性不是LacI展 示体系中的因素。
可从重组随机库中获得的短肽的数量是巨大的。通常制备107-109 个独立克隆的文库。已经建立了大到1011个重组体的文库，但这个大 小接近了克隆库的实际限度。文库大小的限度发生在将含随机化片段 的DNA转化到宿主细菌细胞的步骤中。为跨跃这个限度，最近已发 展了基于多核糖体复合物中新生肽展示的体外系统。这个展示文库方 法具有产生比目前可得的噬菌体/噬菌粒或质粒文库大3-6数量级量度 的文库的潜力。此外，文库的构造、肽的表达、和筛选，是以完全不 含细胞的模式完成的。
在该方法的一个应用中(Gallop et al.，(1994)J.Med.Chem.37 (9)：1233-1251)，构造一编码1012十肽的分子DNA文库，文库表达在 体外偶联转录/翻译系统的大肠杆菌S30中。选择条件以把核糖体停顿 到mRNA上，使多核糖体中RNA的主要部分积累，并产生含仍连接 在其编码RNA上的新生肽的复合物。多核糖体足够粗壮以致被亲和 纯化在固定化受体中，其方式与筛选较常规重组肽展示文库的方式相 同。从结合的复合物中回收RNA，转化成cDNA，通过PCR扩增来 产生下一轮合成和筛选用的模板。多核糖体展示方法可以和噬菌体展 示体系相偶联。在几轮筛选之后，将来自多核糖体富集库的cDNA克 隆到噬菌粒载体中。该载体既充当肽表达载体，展示融合到外壳蛋白 中的肽，又充当鉴定肽用的DNA测序载体。通过将多核糖体表达到 噬菌体上，既可以按这种模式继续亲和选择，也可以测定单个克隆上 的肽在噬菌体ELISA中的结合活性，或在完成噬菌体ELISA中的结 合特异性(Barret et al.，(1992)Anal.Biochem 204，357-364)。为鉴定活性 肽的序列，可对由噬菌粒宿主产生的DNA测序。 二次筛选
为鉴定、富集和选择对生物本体具有适宜亲和性的分子，在上述 高流通量试验之后继续二次筛选。二次筛选根据的是靶向部分结合有 用聚合物的能力。例如，可以用所需靶生物的表面蛋白或碳水化合物 来鉴定通过上述一种初级筛选所分离的肽片段组中的配体。可以使用 从重组生物中获得的高纯材料，例如，来自病毒性病原体的纯化蛋白， 从为获得此材料的目的而特别得到的重组生物中获得，或者可以使用 靶生物的粗制备品，例如细胞壁或表膜制备品，即使是靶生物的热失 活或福尔马林处理的制备品。
下面的实施例举例说明了两种示例的靶向原料，带正电荷的聚氨 基酸--聚赖氨酸(对很多细菌品种具亲和性并且也可以充当偶联附加靶 向部分的主链)；和唾液蛋白组氨素(histatin)(对几种口腔细菌具亲和 性)。每种原料均可以用作这里所述的描述噬菌体展示文库过程中的起 始材料，例如把核酸序列掺入到M13噬菌体展示载体的基因III序列 中(例如参见Scott et al.，(1990)Science 249：386-390；Roberts et al.，(1992) PNAS 89：2429-2433；Devlin et al.，(1990)Science 249：404-406；Cwirla et al.，(1990)PNAS87：6378-6382；以及US专利5,223,409；5,198,346和 5,096,815)。此时，富集噬菌体文库用的靶向材料可以是细胞壁组分， 该细胞壁组分的获得方法是，在标准蛋白酶抑制剂的存在下冷超声处 理靶生物、低速离心分离细胞壁和细胞质、并且将壁原料再悬浮于缓 冲剂中以便在多次的噬菌体文库结合选择中使用。该过程在US专利 5,233,409中有详细描述。经过二至三次的选择之后，可以分离出携带 聚氨基酸序列或对靶细胞壁亲和性的组氨素(histatin)变体的噬菌体， 该细胞壁能比起始材料显著地被促进。被改进的变体的序列可通过标 准DNA测序过程被容易测得，且肽可以通过标准肽合成方法大量地 产出。因此，这里所述的产生片段和类似物以及检测其对靶生物增强 的亲和性的方法是本领域已知的。 靶生物
本发明组合物和方法所靶向的生物出现在任何光可及的表面上或 在光可及的区域内(例如在人和动物患者之中)、在需要去污染的原料 上、或在农作物上。对人和动物而言，表皮、口腔、鼻腔、窦、耳、 肺、生殖泌尿道和胃肠道的感染是光可及的。表皮感染包括不希望的 生物细菌、真菌、病毒和动物源的感染，并且包括皮下感染特别是局 部损害，例如由原虫、寄生虫或寄生螨引起的，这些感染均是光可及 的。腹膜腔感染，例如由突发性阑尾炎引起的，至少通过腹腔镜装置 是光可及的。通过抗菌治疗或长期抗真菌治疗难治的各种皮肤感染， 例如趾甲的皮真菌(dermatophycoses)，是适合于使用本发明组合物的 PDT。
本发明组合物和方法应用的一个主要领域是口腔如牙龈的疾病和 感染。本发明的方法对治疗口部感染疾病是特别有效的，例如牙周疾 病。由于牙周疾病感染的囊发生在口腔表面的几个毫米间，PDT提供 了优于该病症传统物理方法刮治术和抗菌治疗的显著优点。口腔不希 望的靶生物包括大量细菌和真菌种类，例如拟杆菌属类，包括 B.gingivalis(现在已知为牙龈卟啉单孢菌)、啮蚀艾肯氏菌、核粒梭杆 菌、直肠弯曲杆菌、真杆菌属种、中间普雷沃氏菌(拟杆菌)、福赛斯 拟杆菌、二氧化碳嗜纤维菌属种、伴放线放线杆菌，和变异链球菌。
肺感染可以随多种属和种的细菌出现，包括传统肺结核的乳生结 核分枝杆菌、假单胞菌属(造成囊纤维变性患者死亡的首要原因)、克 雷伯氏杆菌属，并且还可以随多种病毒株出现。多种真菌和寄生物是 肺的机会病原体，卡氏肺囊虫感染是免疫妥协的AIDS患者死亡的通 常原因。随着耐传统抗菌治疗的肺病原体的增加，本发明组合物PDT 提供了另一种消除与微生物耐受机制无关的不希望的生物的方法。其 它表皮感染和较深组织的感染起因于烧伤、擦伤、割伤和刺伤。用本 发明的PDT对消毒这种潜在感染位置是有用的(可以快速导致中毒性 休克，枪弹伤所时常伴生的)，并且对治疗这些位置以消除或减少不希 望的感染性生物是有用的。伤口特别是烧伤感染的主要原因是格兰氏 阴性需氧菌假单胞杆菌属。该生物产生显示为延迟伤口愈合的外毒 素。多抗菌素抗性的铜绿假单胞杆菌是越来越明显的问题，尤其是在 大医院的烧伤部。假单胞杆菌属还产生角膜的暴发性感染。大肠杆菌 以及金黄色葡萄球菌是两种感染伤口的最常见细菌。
不希望的靶生物的其它位置包括生殖泌尿道、腹膜腔、内耳和外 耳、鼻腔和胃肠道。不希望的靶生物在间皮和内皮源的组织中增生的 感染位置通过应用最低侵入性技术也是PDT可及的。
靶生物可以是细胞或病毒。可以是不希望生物体的病毒包括含有 至少一种核酸分子和一种或多种蛋白的任何致病生命型，还可以包括 有包膜的病毒。细胞性靶生物包括至少一种界面细胞膜，并且能够产 生能量、合成核酸，并包含核糖体和能够进行核糖体蛋白合成。细胞 可以是单细胞的或多细胞的，并且所说的单细胞生物可以是原核生物 或真核生物。
原核靶生物可以是细菌，细菌可以是格兰氏阴性或格兰氏阳性， 或是缺少细胞壁的。区分细菌的格兰氏染色基础是本领域技术人员已 知的，根据特定株或种的细菌是否吸收染料，或者仅用复染剂着色。 为本发明靶生物的细菌可以是需氧的、厌氧的、兼性厌氧的或微需氧 的。本发明的螺旋体包括(但不限于)，疏螺旋体属和密螺旋体属。后 一种属包含了与战壕嘴(trenchmouth)、品他病和雅司疹疾病有关的各 种菌种，后两种是热带皮肤感染。适合作为靶生物的格兰氏阴性螺旋 状/弧菌状能动细菌属包括弯曲杆菌属和卷旋杆菌属。格兰氏阴性需氧 和微需氧性杆菌和球菌包括博德特氏杆菌属、奈瑟氏球菌属和军团菌 属。兼性厌氧格兰氏阴性杆菌包括假单胞菌属、沙门氏菌属、志贺氏 菌属、欧文氏杆菌属、肠杆菌属、欧文氏杆菌属、埃希氏杆菌属、弧 菌属、嗜血杆菌属、放线芽胞杆菌属、克雷伯氏杆菌属和沙门氏菌属。 作为本发明靶生物的一个重要细菌组是格兰氏阳性球菌，包括葡萄球 菌属和链球菌属，后者的一个菌株已知可引起各种感染，包括儿童皮 肤疾病脓疱病，而前者的一些菌株被通常称为“食肉细菌”。适于通 过本发明方法和组合物处理的格兰氏阳性杆菌包括利斯特氏菌属。
在缺少刚性细胞壁的细菌中，适合于光敏剂组合物处理的细菌是 枝原体属。适合本发明的放线菌纲的靶生物包括分枝杆菌属中的几个 种。可用本发明的共轭分子处理的其它细菌属包括：肠球菌属、钩端 螺旋体属、小蛇菌属、枝原体属、类杆菌属、耶尔森氏菌属、衣原体 属、弧菌属、放线芽胞杆菌属、卟啉单孢菌属、嗜血菌属、巴斯德氏 杆菌属、消化球菌属、原粘杆菌属和嗜皮菌属。本领域技术人员可来 认知没有在这里列举的这些及其它细菌族或属中适合本发明组合物的 靶向细菌。
可以被本发明组合物靶向的病毒包括(但不限于)腺病毒、疱疹病 毒、痘病毒、和反录病毒。真菌靶生物的代表属包括(但不限于)隐球 酵母属、芽生菌属、副球孢子菌属、念珠菌属、曲霉属、Mycetoma， 而且包括引起各种皮真菌病的其它属。
本发明的真核靶生物包括单细胞原虫和真菌病原体和寄生虫，其 可以具有多细胞期的生活史。患者的寄生虫感染是适合通过本发明组 合物治疗的。感染或移生肠道和泌尿生殖道的常见寄生虫包括变形 虫、鞭毛虫和线虫。此外，吸虫、绦虫、纤毛虫、球虫、微孢子虫寄 生虫的感染也会发生在这些管道中。利什曼原虫属和盘尾丝虫属的寄 生虫引起皮肤溃疡，在眼部的角膜瘙痒病(scrapings)中发现了棘头虫 属(Acanthamoeba)的寄生虫。杜诺丸氏利什曼原虫引起热带溃疡皮肤 病--黑热病，它适合于用本发明的方法和组合物来治疗。适合本发明 组合物所靶向的肠道属包括内变形虫属、贾第虫属、潜隐孢子虫属 (Cryptosporidium)，以及微孢子虫、蛲虫和蠕虫属。肺组织可以包含 卡氏肺囊虫，以及更罕见的变形虫例如内变形虫属、吸虫或绦虫。生 殖泌尿道可以被毛滴虫属和血吸虫属感染，可以通过本发明的组合物 来治疗。
病毒，原核或真核靶生物不只限于病原体和寄生虫，还可以包括 较高等级的生物如节肢动物。靶生物不仅限于动物患者的病原体和寄 生虫，还可以包括植物害虫。
这些列举是用来举例说明本发明在主要族的适宜靶生物中的应 用，而不是将本发明划界到所列举的种、属、科、目或纲上。 药用组合物
本发明的化合物包括配制用来局部给药的共轭物分子，还包括给 药于各种外表器官如外耳，或外部给药(例如通过口腔施用或通过洗肺) 可及的器官。这里所提及的实例不是要限制本发明共轭光敏剂的性质 或具体给药途径，这里也列举了其它途径。在本发明的另一个实施方 案中，光敏剂组合物可以通过组合治疗(即和其它药剂组合)来给药。 例如，组合治疗可以包括本发明的组合物和至少一种其它光敏剂、至 少一种抗菌素或其它常规的治疗。
多少有些不溶于水溶剂的光敏剂共轭物可以脂质体、或缓释的形 式使用，以致可以运用间歇式照明，即使用照明期间与不照明期间交 替的制度。用到的其它制度是连续期间的较低程度的照射，对此缓释 制剂是适宜的。
这里所说的术语“可药用载体”包括任何和所有生理相容的溶剂、 分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这些介质 和配剂对于药物活性物质的用法为本领域所公知。优选地，载体对口 腔、静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮给药(例如通过注射或 输注)是适宜的。依据给药的途径，活性化合物可以被涂包在原料之中， 以保护化合物免受酸和其它可能失活化合物的自然条件的影响。
本发明的共轭物也可以非肠道给药。这里所说的术语“非肠道给 药”意思是指除口腔和局部给药外的给药方式，通常是通过注射，包 括而非限定于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、 真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、 脊柱内、硬膜外、和胸骨内的注射和输注。
本发明的组合物可以通过本领域已知的各种方法给药。正如技术 人员都欣赏的，给药的途径和/或方式是根据所期望的结果来改变的。 可以用防止化合物快速释放的载体来制备活性化合物，例如受控释放 制剂包括植入剂、经皮补片、微囊化给药系统。可使用生物降解性、 生物相容性的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、 聚原酸酯和聚乳酸。这些制剂的很多制备方法都申请了专利或为本领 域的技术人员所公知。例如参见，《持续和控制释放药物的给药系统》 (Sustained and Controlled Release Drug Delivery System) J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker Inc.，NewYork，1978。
调整剂量制度来提供最佳的所需应答(如治疗应答)。例如，可以 用单独一个大丸剂给药，可以在一定时间内以数份分开的剂量给药， 或者按照治疗情形的要求所指示的按比例减少或增加剂量。
本领域的普通技术人员可以确定和开出处方给出所需药物组合物 的有效量。例如，开始可以服用比为达到所期治疗效果所需水平低的 已知或新光敏剂组合物的剂量，并且逐渐增加剂量直至达到所期望的 效果。 其它实施方案
本发明的组合物可以用来消毒无生命的物体，例如医用和牙用装 置、热敏滤器、透照器表面、超声处理用探测器、以及光可及的和带 有不希望的生物的任何其它表面。很多这些装置是不能进行高压灭菌 的，此时本发明的方法和组合物对其消毒可以是有用的。
本发明的方法和组合物可以掺入到试剂盒中，试剂盒包含一种或 多种可以或可以不偶联到主链上的光敏剂、一种或几种靶向部分、偶 联剂或交联剂、缓冲剂以及使用的指令。试剂盒的使用者可以选择适 宜的靶向部分来应用到所选特定的不希望的生物中。可以将两种或多 种靶向部分偶联到光敏剂-主链上，以便可以通过单独使用一种产品消 除或者基本上减少较广范围的不希望的生物。
本发明将通过以下的实施例作进一步的举例说明，这些实施例不 应当解释为进一步的限定。本申请中提及的所有参考文献、待审查的 专利申请和公开的专利均引入这里作为参考。 实施例 实施例1制备带不同电荷的聚赖氨酸-二氢卟酚e6共轭物
通过将1.5当量的二环己基碳二亚胺和1.5当量的N-羟基琥珀酰 亚胺、与1当量的二氢卟酚e6(图1A中的分子I)、或其它光敏剂在无 水二甲基亚砜(DMSO)中反应，形成NHS-酯(图1A中的分子II)，来制 备光敏剂二氢卟酚e6的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。在以光敏剂二氢 卟酚e6为例子的实施例中，所述的所用原料的制备过程也适合于制 备苯并卟啉衍生物的酯，或任何含羧基的四吡咯光敏剂的酯。经过在 室温下黑暗处保温24小时后，将NHS按等分试样进行冷冻以便进一 步使用。将L或D光学构型的、且具一定分子量范围的氢溴酸聚赖氨 酸(图1B的分子III)(HBr，50mg)(分子量40,000-60,000，相当于 22,000-33,000个游离的聚赖氨酸自由碱基)溶解于50ml无水DMSO 中，并加入N-乙基吗啉(1ml)。向该溶液添加含光敏剂-NHS酯(25mg) 的无水DMSO(1ml)。将溶液在室温下黑暗处保温24小时，以合成聚 赖氨酸二氢卟酚e6(图1B中的分子III，以及图1C中所示的)。
进行如下的电荷修饰。
为中和聚赖氨酸上的正电荷，将所得分子和酰化剂乙酸酐反应。 将聚赖氨酸二氢卟酚e6共轭物(图1D中的分子III)溶液的样品用过量 的乙酸酐(100mg溶于0.5ml无水DMSO)处理，产生不带电的中性乙 酸酰胺共轭物。所得分子不带电。可以改变这些条件来产生带其它电 性的分子。这允许制造和测试各种可能性，并且选择出对特定共轭物 或靶生物而言是最好的应用。
为把聚赖氨酸上的正电荷转变成负电荷，将分子和酰化剂琥珀酸 酐反应。将聚赖氨酸二氢卟酚e6共轭物在DMSO中的样品用过量的 琥珀酸酐(100mg溶于0.5ml无水DMSO)处理，产生琥珀酸酰胺，并 且将带正电的氨基基团转变成成了带负电荷的羧酸基团。可以改变这 些条件来产生其它带电性的分子。这允许制造和测试各种可能性，并 且选择出对特定共轭物或靶生物而言是最好的应用。
在将共轭物分子、和酰化修饰的共轭物在室温下黑暗处保温24 小时之后，将溶液转移到具有正确分子量截止的透析管中，以允许使 用耐DMSO的透析原料透析聚赖氨酸，并对改换3次的10mM磷酸 缓冲剂(pH7)进行透析24小时。图1D中显示了分子V，对二氢卟酚e6 聚赖氨酸乙酸酰胺中性共轭物来说，R基团表示-COCH3，而对二氢卟 酚e6聚赖氨酸琥珀酸酰胺来说，R基团表示-COCH2CH2COOH。 实施例2 制备带不同电荷的组氨素(histatin)-二氢卟酚e6共轭物
将组氨素(histatin)-5(10mg)溶解于2ml 0.1M的Na2CO3缓冲剂中 (pH9.5)，并且和含5mg二氢卟酚e6 N-羟基琥珀酰胺(如实施例1所 述制备的)的0.1ml DMSO混合。通过在室温下黑暗处保温24小时来 进一步继续反应，并且将溶液对10升的PBS透析三次。将所得的绿 色沉淀溶解在2ml 0.1M Na2CO3缓冲液中(pH10.5)。
吸收光谱测定表明，假定二氢卟酚e6在400nm下的消光系数不 被络合作用改变，即为1.5×105M-1，cm-1，且所有二氢卟酚e6在透析 后都保持共价连接在组氨素(histatin)上，则可确定每个组氨素 (histatin)-5肽链上连接4个二氢卟酚e6分子。虽然组氨素(histatin)-5 为碱性，但共轭物却被发现是酸性的，这是由于赖氨酸的氨基被二氢 卟酚上的两个羧基所取代。其结构示于图1C中。
组氨素(histatin)与二氢卟酚e6的比率通过改变反应中的两者的比 率而得到改变。 实施例3 制备带不同电荷的组氨素(histatin)-聚赖氨酸-二氢卟酚e6共 轭物
将实施例1中所说的聚赖氨酸二氢卟酚e6的DMSO溶液用N-琥 珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)的DMSO溶液处理，以形成 聚赖氨酸二氢卟酚e6-SPDP(图2A中的分子VI)。用量依赖于聚赖氨 酸的分子量，但应当是多聚物链的约三至四当量。将反应在室温下黑 暗处保温24小时。将聚赖氨酸-光敏剂-SPDP溶液如上透析。
将组氨素(histatin)(或其它含至少一个赖氨酸残基的多肽，5mg)溶 解于2ml磷酸缓冲液中(SATA，50mM，pH7.5，含1mM EDTA)并用N- 琥珀酰亚胺-S-硫代乙酸酯(0.5mg溶于DMSO，100μl)在室温下处理(如 图2B的反应6所示)，形成SATA-组氨素(histatin)(图2B中的分子IX)。 然后用200μl含盐酸羟胺0.5mM、EDTA 25mM和磷酸钠50mM的溶 液(pH7.5)处理肽溶液，并且在室温下保温2小时，形成脱保护的SATA 衍生物(图2B中的分子X)。然后将该溶液在P4柱上脱盐并且用含 10mM EDTA的磷酸缓冲剂(50mM，pH7.5)洗脱。产生含自由巯基的肽。
然后，将聚赖氨酸二氢卟酚e6的含自由巯基衍生物的肽(图2A 中的分子VII)(它可以带正电、中性或带负电)和SPDP以肽和聚赖氨 酸的相对分子量比，在室温下反应24小时。然后在Sephadex G50柱 上纯化该包含肽-聚赖氨酸-二氢卟酚e6共轭物(如图2C所示)的产物。 实施例4 光敏剂二氢卟酚e6共轭物的吸收
将牙龈卟啉单孢菌381--一种格兰氏阴性细菌并且是牙菌斑中的 一种最常见的细菌，在含1％氯化血红素、1％维生素K和5％羊血的 胰胨豆胨琼脂(TSA)中通过每周传代培养来保存。为实验目的，让生 物无氧生长在具有80％N2、10％CO2的室中35℃下48小时，离心收 集并重新悬浮于含1％氯化血红素和1％维生素K的胰胨豆胨肉汤培养 基(TSB)中。将细胞超声分散，并且通过巴氏滴管重复传代。在分光 光度计中用1ml试管测定细胞数(波长600nm下，1 O.D产生108细胞 /ml)，获得各实验用的适宜数量的细菌(吸收研究实验用109细胞/ml， 照射研究用实验用108细胞/ml)。
使用仓鼠颊囊扁平细胞癌细胞系(HCPC-1)的细胞(Odukoya，O.et al.，JNCI 71：6，1253-1258，1983)。让细胞在含高葡萄糖的Dulbecco改良 Eagle培养基(DMEM)(Gibco，Grand Island，NY)中生长，其中培养基补 充了热失活的10％胎牛血清(FCS，Gibon)、100单位/ml的青霉素G和 100μg/ml链霉素(Sigma，St.Louis，MO)。每2-3天换一次培养基并且 每周使用胰蛋白酶-EDTA进行传代。将所有细胞在含12ml生长培养 基的10cm直径的培养皿中维持，于37℃、95％空气5％CO2的潮湿大 气中。
使用以下带正电、负电和不带电的聚-L-赖氨酸与二氢卟酚e6(分 子量1,000-3,000)的本发明的光敏共轭物：聚赖氨酸二氢卟酚e6(阳离 子、未酰化)；琥珀酰化聚赖氨酸二氢卟酚e6(阴离子，聚赖氨酸-二氢 卟酚e6-琥珀酰)；和乙酰化聚赖氨酸二氢卟酚e6(中性，聚赖氨酸-二 氢卟酚e6-乙酰)。合成方法描述于实施例1中。除非另有说明，生长 和维持细菌和动物细胞所用的所有培养基、缓冲剂、溶液和玻璃器皿 均是经过灭菌的。
将牙龈卟啉单孢菌(109细胞/ml)的悬浮液样品一式三份，用1、5 和10μm二氢卟酚e6当量(TSB中的最终浓度)的光敏剂在室温下于暗 处培养1分钟，将细胞悬浮液离心，吸出含光敏剂的上清液并且用1ml 无菌PBS洗涤细菌一次。将细胞再悬浮于1.5ml的0.1M NaOH/1％十 二烷基磺酸钠(SDS)中，培养至少24小时，获得均匀溶液。
在分光荧光计中(型号FluoroMax，SPEX Industries，Edison，NJ)测定 各细胞提取物的荧光度。激发波为400nm，细胞悬浮液的发射光谱记 录为580-700nm。通过改进的Lowry法(Markwell M.A.et al.，Anal.Biochem.87：206，1978)测定各细胞提取物的蛋白含量，使用溶 于0.1M NaOH/1％SDS的牛血清白蛋白作为蛋白标准来作校正曲线。 结果用每mg细胞蛋白吸收的mol二氢卟酚e6来表达。
用胰蛋白酶消化指数生长期的HCPC-1细胞，使用血细胞计数器 计数。用1ml含10％FCS的生长培养基的105细胞接种24-孔培养平 皿的每个孔，培养过夜以允许细胞达到和恢复指数生长。将共轭物一 式三份添加到孔中，具体如下。除去培养基并换成含10％FCS和所说 浓度的共轭物的培养基，将平皿培养1分钟。然后从孔中吸出共轭物 溶液，将细胞用1ml无菌PBS洗涤一次，再用胰蛋白酶-EDTA培养10 分钟。离心所得的细胞悬浮液，吸出胰蛋白酶上清液并将沉淀溶解于 0.1M NaOH/1％SDS中。如上测定每种细胞提取物的荧光度。
如图3和4所示，共轭物的吸收是浓度的函数，其中图3和4分 别表示牙龈卟啉单孢菌和HCPC-1细胞(图的纵坐标相差50倍)。二氢 卟酚e6的吸收是剂量依赖性的。阳离子共轭物的牙龈卟啉单孢菌和 HCPC-1细胞的细胞积聚相比阴离子和中性共轭物在各浓度下分别多2 和2-4倍多。据观察，光敏剂共轭物积聚到细菌中的选择性相比哺乳 动物要高。 实施例5 二氢卟酚e6的光损害性
为确立这些共轭物杀死细菌同时保留哺乳动物细胞的有效性和选 择性，用三个共轭物和两种广泛使用的临床光敏剂--Photofrin II和 benzoporphyrin衍生物(BPD)(QLT Phototherapeutics Inc，温哥华BC)进 行比较。将光敏剂大块固体溶解在1mM DMSO中并用TSB稀释。
将牙龈卟啉单孢菌细胞(108/ml)一式两份用5μm二氢卟酚e6当 量的各共轭物、用Photofrin II和用BPD在室温下暗处培养1分钟。 将细胞离心，用无菌PBS洗涤一次，并加入1ml新鲜TSB。在本实施 例中，牙龈卟啉单孢菌和HCPC-1细胞对阳离子、阴离子和中性共轭 物的每ml细胞蛋白的二氢卟酚e6吸收率分别为46∶1、60∶1和22∶1。
将细菌悬浮液添加到12-孔平皿的孔中，用发光二极管序列在室 温下暗处进行照射，其发出的光为630-710nm波长，其跨度覆盖了这 些光敏剂组合物的最大吸光度。使用0-25J/cm3的能流以65m W/cm2 的辐照度从下曝光培养孔。照射期间将平皿覆盖以保持培养基的无菌 性。经过适宜的照射后，用TSB制备每个孔内含物的系列稀释，并且 一式两份地把100μl等分试样喷在血琼脂平皿上。通过计数平皿上的 菌落并且除以未照射的对照组中的菌落数，来计算每个孔的存活率， 其中未照射的对照是用光敏剂在室温下暗处培养，培养时间与照射的 时间相等。其它对照为：既没有用光敏剂也没有用光处理、并且在室 温下暗处培养的细菌，以及在没有光敏剂存在下经曝光的细胞。
将HCPC-1细胞(2×104在含10％FCS100μl生长培养基的等分试 样中)接种在96-孔平皿中，培养24小时直至70％融合。将每个平皿 的6个孔用5μM的各光敏剂培养，并用如实施例3所述的条件照射。 照射之后，用新鲜培养基在37℃下培养24小时。对照细胞在如实施 例3的条件下培养。照射后24小时，使用MTT微量培养四氮唑盐测 定法(一种评价活细胞的线粒体中脱氢酶活性的方法(Mosmann T.J.Immunol.Methods65-63，1983))测量细胞的存活，并且用经处理细胞 的570nm吸光度除以未照射对照的吸光度来计算存活率。
图5和6显示了共轭物对牙龈卟啉单孢菌光损害性的选择性比哺 乳动物细胞要高。阳离子聚赖氨酸-二氢卟酚e6杀死99.9％的细菌， 而对HCPC-1细胞却少于2％。还显示了中性共轭物聚赖氨酸-二氢卟 酚e6-乙酰的高选择性，它杀死超过90％的细菌但没有杀死HCPC-1 细胞。阴离子共轭物聚赖氨酸-二氢卟酚e6-琥珀酰造成牙龈卟啉单孢 菌的生存力下降66％，但HCPC-1却没有被这种光敏剂所杀死。
相反，PFII和BPD在给定的浓度下没有显示杀灭作用，除了BPD 杀死HCPC-1细胞而不是牙龈卟啉单孢菌。 实施例6 在动物伤口模型中的体内研究
通过使用解剖刀在小鼠的背侧皮上产生一3cm切口，然后接种107 和108c.f.u.的细菌，造成一感染性伤口。通过Stevens，E.J.et al.，J.Bum Care Rehabil.15，232-235，1994中的描述产生一感染性烧伤。在损害周 围或者静脉内注射作用于各细菌的共轭物或未共轭的二氢卟酚e6。有 系统地改变共轭物的剂量、光量、以及注射和照射之间的间隔。通过 观察伤口和烧伤的愈合率来评价治疗应答。治疗后相隔一定间隔取组 织样(2mm穿孔活组织检查)来确定细菌数量，并提供载玻片作病理组 织性评价。通过建成c.f.u./g组织并通过光学监视萤虫素酶转染 P.aeruginosa来定量伤口处的细菌集群。 其它实施方案
这里给出了物理参数值，例如氨基酸残基的分子量或数量，这些 值可以描述表现该值的所有或基本上是所有分子的总体，或该值代表 总体参数的平均、或众多值的分子的总体。通过残基数量或通过分子 量来说明的物理参数，如肽或蛋白聚合物的大小，可以包括残基数量 中或分子量中可能的一定程度的不均匀性，这种不均匀性例如是在这 种聚合物化学合成过程中出现的，并且是可以通过再使用前的纯化过 程减少但一般不能完全消除的。因此，例如一种所说包含10个赖氨 酸残基的聚赖氨酸制备物，可能由80％、90％、95％、99％或99.9％的 这种长度的分子组成，而其余的20％、10％、5％、1％和0.1％可能是 由具有9或8个残基或更少有的11或12个残基的分子组成。
这里所说的共轭物可以通过取代一种或多种在此所述的部分的混 合总体来合成。例如，可以将一种单独光敏剂部分的纯制备物添加到 含主链或靶向部分基质混合物的反应混合物中，来生产共轭物，其中 包含共轭到靶向部分混合物上、或主链或靶向部分化学整体上的单独 类型光敏剂部分。
对于所说的共轭物，可以在使用前在共轭物的配方中形成混合 物，例如，可以将欲用于不希望的生物混合物的配方制备成两个或多 个共轭物的混合物，每个共轭物具有对一种或几种不希望的生物的最 佳亲和性，以便可以减少或消除很多种靶生物。
本发明还包括组氨素(histatin)的片段，优选生物活性片段，或类 似物，例如组氨素(histatin)-5。具有组氨素(histatin)序列特征的生物活 性片段或类似物具有任何体内或体外活性。特别优选的片段是通过从 头合成、蛋白酶剪切或交替拼接而产生的片段，例如活性片段。由于 诸如组氨素(histatin)的肽经常显出一定范围的生理学特征并且由于这 些特征可以归因于分子的不同部分，因此有用的组氨素(histatin)片段 或片段类似物应当在任何组氨素(bistatin)活性生物试验中显出生物活 性。最优选的片段或类似物在任何体外或体内组氨素(histatin)试验中 具有全长度天然存在的组氨素(histatin)的20％的活性。
类似物与天然存在的组氨素(histatin)的区别可以是在于氨基酸序 列不同或以不涉及序列的方式，或者两者都有。非序列变化包括组氨 素(histatin)的体内或体外的化学衍生。非序列变化包括乙酰化、甲基 化、磷酸化、羧基化、糖基化的改变。
优选的类似物，包括组氨素(或其生物活性片段)，其序列可通过 一、二、三、四或五或更多保守氨基酸置换和/或通过一、二、三、四 或五或更多非保守氨基酸置换、缺失而与野生型序列不同，但却并不 消除组氨素的生物活性。保守置换一般包括用一个氨基酸置换另一种 相似特征的氨基酸，例如在以下组中的置换：缬氨酸、甘氨酸；甘氨 酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬 酰胺、谷酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、 酪氨酸。其它保守置换可以取自下表。
属于本发明的其它类似物是那些增加肽稳定性而修饰的类似物； 这种类似物可以在肽序列中包含例如一种或多种非肽键(以取代肽 键)。还包括有：含除天然存在的L-氨基酸(如D-氨基酸)或非天然存 在或合成的氨基酸(如β或γ氨基酸)的残基；以及环状类似物。
与组氨素(histatin)类似物相同，这里所说的术语“片段”一般是 具有足够带来生物活性的长度，例如全长度分子的至少20％的结合活 性。在优选的实施方案中，片段为12个残基长或更长。组氨素(histatin) 片段可以通过这里所述的方法或者通过本领域技术人员已知的方法来 产生。可以通过本领域技术人员已知的方法或者这里所述的方法来评 估候选片段显示组氨素(histatin)生物活性的能力。
为获得组氨素(histatin)多肽，可以将组氨素(histatin)-编码DNA 引入到表达载体中，将载体引入适合表达所需蛋白的细胞中，并通过 现有技术方法回收和纯化肽。优选的组氨素(histatin)肽在体内由融合 到较大蛋白上而产生，在从细胞提取物中初步纯化后，被切割成片段。 优选组氨素(histatin)肽是化学合成的，例如在肽合成仪中。
表1
保守氨基酸的置换 被取代的氨基酸 代码 用任何一种取代 丙氨酸 A D-Ala、Gly、β-Ala 精氨酸 R D-Arg、Lys、D-Lys、高-Arg、D-高-Arg、Met、Ile、D- Met、D-Ile、Orn、D-Orn 天冬酰胺 N D-Asn、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、Gln、D-Glu 天冬氨酸 D D-Asp、D-Asn、Asn、Glu、D-Glu、Gln、D-Gln 半胱氨酸 C 在亲本中没有，因而应用不是优选的 谷氨酰胺 Q D-Gln、Asn、D-Asn、Glu、D-Glu、Asp、D-Asp 谷氨酸 E D-Glu、D-Asp、Asp、Asn、D-Asn、Gln、D-Gln 甘氨酸 G Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、β-Ala酰基载体蛋白(ACP) 异亮氨酸 I D-Ile、Val、D-Val、Leu、D-Leu 亮氨酸 L D-Leu、Val、D-Val、Leu、D-Leu 赖氨酸 K D-Lys、Arg、D-Arg、高-Arg、D-高-Arg、Ile、D-Ile、Orn、 D-Orn 蛋氨酸 M 在亲本中没有，因而应用不是优选的 苯丙氨酸 F D-Phe、Tyr、D-Thr、L-多巴、His、D-His、Trp、D-Trp、 反-3，4或5-苯基脯氨酸、顺-3，4或5-苯基脯氨酸 脯氨酸 P D-Pro、L-1-硫代氮杂环戊烷-4-羧酸、D-或L-1-氧代氮杂 环戊烷-4-羧酸 丝氨酸 S D-Ser、Thr、D-Thr、异-Thr、磷酸丝氨酸 苏氨酸 T D-Thr、Ser、D-Ser、磷酸丝氨酸、异-Thr、Val、D-Val 酪氨酸 Y D-Tyr、Phe、D-Phe、L-多巴、His、D-His 缬氨酸 V D-Val、Leu、D-Leu、Ile、D-Ile
优选的组氨素(histatin)-1类似物是，其中：
R1是asp或缺失
R2是ser或磷酸丝氨酸或缺失
R3是his或缺失
R4是ala或缺失
R5是lys或arg或glu或asp
R6是arg或lys
R7是his
R8是his
R9是gly或ala
R10是tyr或phe
R11是lys或arg
R12是arg或lys
R13是lys或arg
R14是phe或tyr
R15是his
R16是glu或asp
R17是lys或arg
R18是his
R19是his
R20是ser或thr或磷酸丝氨酸
R21是his或缺失
R22是arg或lys或缺失
R23是gly或glu或asp或缺失
R24是tyr或phe或缺失
R25是pro或arg或lys或缺失
R26是phe或tyr或leu或ile或缺失
R27是phe或tyr或leu或ile或thr或ser或缺失
R28是gly或ala或缺失
R29是asp或glu或缺失
R30是phe或tyr或leu或ile或缺失
R31是gly或ala或缺失
R32是缺失或ser或thr或磷酸丝氨酸
R33是缺失或asn或gln
R34是缺失或tyr或phe
R35是缺失或leu或ile或tyr或phe
R36是tyr或phe或leu或ile或缺失
R37是缺失或asp或glu
R38是缺失或asn或gln
优选的组氨素(histatin)-3类似物是，其中：
R1是asp或缺失
R2是ser或磷酸丝氨酸或缺失
R3是his或缺失
R4是ala或缺失
R5是lys或arg或glu或asp
R6是arg或lys
R7是his
R8是his
R9是gly或ala
R10是tyr或phe
R11是lys或arg
R12是arg或lys
R13是lys或arg
R14是phe或tyr
R15是his
R16是glu或asp
R17是lys或arg
R18是his
R19是his
R20是ser或thr或磷酸丝氨酸
R21是his或缺失
R22是arg或lys或缺失
R23是gly或glu或asp或缺失
R24是tyr或phe或缺失
R25是arg或lys或缺失
R26是缺失或ser或thr或磷酸丝氨酸
R27是缺失或asn或gln
R28是缺失或tyr或phe
R29是缺失或leu或ile或tyr或phe
R30是tyr或phe或leu或ile或缺失
R31是缺失或asp或glu
R32是缺失或asn或gln
优选的组氨素(histatin)-5类似物是，其中：
R1是asp或缺失
R2是ser或磷酸丝氨酸或缺失
R3是his或缺失
R4是ala或缺失
R5是lys或arg或glu或asp
R6是arg或lys
R7是his
R8是his
R9是gly或ala
R10是tyr或phe
R11是lys或arg
R12是arg或lys
R13是lys或arg
R14是phe或tyr
R15是his
R16是glu或asp
R17是lys或arg
R18是his
R19是his
R20是ser或thr或磷酸丝氨酸
R21是his或缺失
R22是arg或lys或缺失
R23是gly或glu或asp或缺失
R24是tyr或phe或缺失
在优选的实施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)或其活性片 段或类似物，如组氨素(histatin)-1至-8，优选组氨素(histatin)-1、-3或 -5。在优选的实施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)的片段，如 组氨素(histatin)-5。在优选的实施方案中，靶向部分包含组氨素 (histatin)-5残基13-24，或相应的其它组氨素(histatin)的残基。在优选 的实施方案中，靶向部分包含被改造成包括内部重复区的组氨素 (histatin)分子。
可以理解上述通过结合详细描述说明了本发明，这些描述旨在说 明而非限定本发明，本发明的范围由以下的权利要求书的范围来定 义。属于本发明范围内的其它方面、优点和改进对于要发明所属的领 域的技术人员来说将是显而易见的。
晚期牙周疾病是很多口腔感染疾病中的一种，并且是30岁以上 病人掉牙的首要原因。牙周病是由于细菌细胞及其在牙菌斑中的产物 与宿主防御机理之间的相互作用引起的(Antczak-Bouckoms，A(1994)， J.Dent.Educ.58：625-640)。目前的治疗经常依赖于机械去除牙菌斑和细 菌，这种方式可能是无效的(Unsal E.et al.(1995)，J.periodontol.66：47- 51)，或者是依赖于抗菌素治疗，这种方式可导致细菌的抗药性(Olsvik， B.et al(1995)J.Clin.Periodontol.)22：391-396)。
作为一种消除口腔细菌以及局部感染和胃肠感染细菌的具有吸引 力的方法，人们提出了光动力治疗(PDT)法，因为这些部位相对容易 照射。例如，可以使用光学纤维照射牙囊(Wilson，M.(1993)， J.Appl.Bacteriol.)75：299-306)。
发明概述
本发明者发现了一类迄今未作为光敏剂靶向部分的分子，它们可 以用来靶向光敏剂。
因此，本发明的特征在于一种共轭分子，该分子包含与非配对成 员(non-pair member)(NPM)部分如NPM-多肽偶联的光敏剂。
在靶向部分包括多肽的实施方案中，靶向部分可以是直链、支链 或环状多肽。
在优选的实施方案中，靶向部分包括抗微生物的短肽(SAMP)。 组氨素(histatin)、防卫素、杀菌肽、爪蟾抗菌肽、格兰氏阳性细菌素 以及肽抗菌素可以是SA。在优选的实施方案中，靶向部分包括细菌、 真菌、动物例如哺乳动物(例如人)的SAMP，或其活性片段或类似物。
在优选的实施方案中，靶向部分包括防卫素、或其活性片段或类 似物。示例性的防卫素可以是：人防卫素，如HNP-1、-2、-3或-4； 天竺鼠防卫素，如GPNP；兔防卫素，如兔NP-1、-2、-3A、-3B或-5； 大鼠防卫素，如大鼠NP-1、-2、-3或-4；鼠隐素(cryptin)、牛粒细胞 细菌素(bactenecin)和indolicidin；或牛精液胞质素。
在优选的实施方案中，靶向部分包括昆虫源的SAMP，或其活性 片段或类似物，例如惜古比天蚕蛾、大黄蜂、果蝇或其它昆虫的杀菌 肽、来自蜜蜂的蜜蜂素(apidaechin)、或来自果蝇的雄素(adropin)。
在优选的实施方案中，靶向部分包括两栖类源的SAMP，或其活 性片段或类似物，例如爪蟾抗菌肽、PGLA、XPF、LPF、CPG、PGQ、 铃蟾抗菌肽、铃蟾抗菌类肽BLP-1、-2、-3或-4，或短杆菌素(brevinin)。
在优选的实施方案中，靶向部分包括无脊椎动物的SAMP，或其 活性片段或类似物，例如来自马蹄形蟹的tachyplesin I、II或III，或 polyphemusin I或II。在优选实施方案中，靶向部分是来自鱼的物质， 如pardaxin。
在优选的实施方案中，靶向部分包括细菌素，更优选格兰氏阳性 细菌素，或其活性片段或类似物，例如乳酸链球菌肽、枯草菌素、表 皮素、gallidermin、唾液素(salivarin)和乳链球菌素。
在优选的实施方案中，靶向部分包括肽抗菌素，或其活性片段或 类似物，例如短杆菌酪肽(tyrocidin)或杆菌肽。
在优选的实施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)，或其活性 片段或类似物，例如组氨素(histatin)-1至-8，优选组氨素(histatin)-1、 -3、或-5。在优选的实施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)-5残 基13-24，或从其它组氨素(histatin)而来的相应残基。在优选的实施方 案中，靶向部分包括被改造而含有内部重复区的组氨素(histatin)分子。
在优选的实施方案中，靶向部分包括对多糖靶具亲和性的多肽， 如凝集素。示例性的凝集素可以是种子、豆、根、树皮、海藻、真菌、 细菌或无脊椎动物的凝集素。在优选的实施方案中，靶向部分包括植 物多肽，例如来自刀豆的凝集素如伴刀豆凝集素A，或来自兵豆的凝 集素。
在优选的实施方案中，靶向部分包括唾液多肽，或其活性片段或 类似物。唾液多肽的例子是组氨素(histatin)，如组氨素(histatin)-1至-8， 更优选组氨素(histatin)-1、-3、或-5。在优选的实施方案中，靶向部分 包括组氨素(histatin)-5残基13-24，或来自其它组氨素(histatin)的相应 残基。在优选的实施方案中，靶向部分包括被改造而包含内部重复区 的组氨素(histatin)分子。
在优选的实施方案中，靶向部分包括格兰氏阴性细菌素，如大肠 杆菌素B、大肠杆菌素E1、或大肠杆菌素Ia。
在优选的实施方案中，靶向部分包括细菌加工的多肽，如乳酸链 球菌肽、枯草菌素、表皮素、gallidermin、唾液素(salivarin)和乳链球 菌素。
在优选的实施方案中，靶向部分还包括除抗体或受体-配体对中 的任一成分之外的分子，如肽。
在优选的实施方案中，共轭物不包括，例如不偶联(如共价或非 共价偶联到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表 面上受体的配体。
在优选的实施方案中，靶向部分包括肽，所说肽的至少10、20、 30、40、50、60、70、80、90％的氨基酸残基是例如带正电的一种氨 基酸残基，如赖氨酸残基、精氨酸残基、或鸟氨酸残基。特别优选的 靶向部分是聚氨基酸，如聚赖氨酸、聚精氨酸、或聚鸟氨酸。
在优选的实施方案中，靶向部分：是阳离子性的；具有每分子+1、 +2或+3的净正电荷；具有等于或大于+4的净正电荷；包含带正电荷 的氨基酸残基，如赖氨酸；包含至少2、3、4个或更多带正电的氨基 酸残基，如赖氨酸、精氨酸、或鸟氨酸残基。
在其它实施方案中，靶向部分：是阴离子性的；具有每分子-1、- 2或-3的净负电荷；具有等于或大于-4的净负电荷；包含带负电荷的 氨基酸残基，如天冬氨酸或谷氨酸；包含至少2、3、4个或更多带正 电的氨基酸残基，如谷氨酸；包含至少10、20、30、40、50％或更多 带负电荷的氨基酸残基，如天冬氨酸或谷氨酸。
在优选的实施方案中，靶向部分：大约是电荷中性的；包含至少 50、60、70、80或90％的中性氨基酸残基，如丝氨酸、苏氨酸、丙氨 酸、蛋氨酸、半胱氨酸或缬氨酸。
在优选的实施方案中，靶向部分的分子量大于1200、1800、2400、 3000、6000、10,000、25,000、50,000、100,000或200,000道尔顿。 在优选的实施方案中，靶向部分的分子量小于250,000、150,000、 60,000、25,000、10,000、8,000或6,000道尔顿。在特别优选的实施 方案中，靶向部分的分子量为300-1800、600-2400、1200-6,000、 5,000-8,000、8,000-15,000、15,000-30,000、35,000-70,000、70,000- 150,000、或150,000-300,000道尔顿。
在优选的实施方案中，靶向部分包括长度至少为3、6、12、18、 24、30、60、100、250、500、1,000或2,500个残基的肽。在优选的 实施方案中，靶向部分是长度小于3,000、1,500、700、300、150、100、 80、60、40、30或15个残基的肽。在特别优选的实施方案中，靶向 部分包括长度为6-15、12-18、18-30、20-40、30-60、80-120、150-300、 300-600、800-1,200、或2,000-3,000个残基的肽。
在优选的实施方案中，靶向部分包括在靶生物的透性屏障中形成 孔的蛋白质，例如在金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏杆菌、白色念珠 菌、Leishmania donovani或Giaradia Lamblia中。
在其它优选的实施方案中，靶向部分包括低密度脂蛋白、高密度 脂蛋白或极低密度脂蛋白。
在优选的实施方案中，通过使用靶生物的表面分子作为亲和选择 或筛选的目标来选择靶向部分，例如以化学方式或在噬菌体展示文库 中选择靶向部分。
在特别优选的实施方案中，靶向部分包括聚赖氨酸分子。聚赖氨 酸的长度可以是6-15、12-18、18-30、20-40、30-60、80-120、150-300、 300-600、800-1,200、或2,000-3,000个残基。
在优选的实施方案中，靶向部分包括被化学修饰而改变了电荷的 多肽，如聚氨基酸，电荷改变如改变了聚氨基酸上一个或多个氨基酸 残基的侧链的电荷。举例说明，一个或多个、或大约10、25、50、75、 90或100％的带电侧链可以被修饰。“被修饰”的意思是指使负性侧 链如谷氨酸或天冬氨酸侧链变成带正电性或中性；使带正电的侧链如 赖氨酸、精氨酸或鸟氨酸的侧链变成带负电性或中性。例如，聚赖氨 酸的一个或多个侧链可以被变成中性或负性。
在优选的实施方案中，当以适当能量和波长的电磁波照射时，光 敏剂在吸收能量后产生单线态氧；光敏剂包括卟啉或卟啉衍生物；光 敏剂包括二氢卟酚e6或二氢卟酚衍生物。
在优选的实施方案中，共轭物还包括主链。在该实施方案中，主 链既偶联光敏剂又偶联靶向部分。主链还可以自身是靶向部分，如聚 赖氨酸。
在优选的实施方案中，共轭物分子具有对靶生物的亲和性。靶生 物例如可以是微生物如细菌细胞、真菌细胞、原生动物细胞、卡氏肺 囊虫细胞；病毒；或寄生蠕虫；或者节肢动物。
在细胞是细菌细胞的优选实施方案中，细菌细胞可以是葡萄球菌 属、链球菌属、肠杆菌属、分枝杆菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、 沙雷氏菌属、埃希氏杆菌属、欧文氏杆菌属、克雷伯氏杆菌属、疏螺 旋体属、密螺旋体属、弯曲杆菌属、卷旋杆菌属、博德特氏杆菌属、 奈瑟氏球菌属、军团菌属、钩端螺旋体属、小蛇菌属、枝原体属、类 杆菌属、克雷伯氏杆菌属、耶尔森氏菌属、衣原体属、弧菌属、放线 芽胞杆菌属、Porphyria、嗜血菌属、巴斯德氏菌属、消化链球菌属、 利斯特氏菌属、丙酸杆菌属、分枝杆菌属、棒状杆菌属或嗜皮杆菌属 的细胞。
在细胞是真菌细胞的优选实施方案中，细胞可以是念珠菌属或曲 霉属的细胞。
在优选的实施方案中，所述生物是卡氏肺囊虫。
在靶生物是原生动物细胞的优选实施方案中，细胞是内变形虫 属、弓形体属、贾第虫属、利什曼原虫属、潜隐孢子虫属(Cryptosporidium) 或血吸虫属。
在靶生物是病毒的优选实施方案中，病毒是HIV、HTLV、肝炎 病毒、流感病毒、鼻病毒、乳头瘤病毒、麻疹病毒、疱疹病毒、轮状 病毒、细小病毒、鹦鹉热病毒、或Ebola病毒。
在靶生物是节肢动物的优选实施方案中，节肢动物是寄生螨。
在靶生物是寄生虫的优选实施方案中，寄生虫是线虫或吸虫。
在优选的实施方案中，靶生物是口腔细菌种，例如牙龈卟啉单胞 菌(拟杆菌属)。
另一方面，本发明的特征是包含与非配对成员(NPM)靶向部分相 偶联的光敏剂的共轭分子和一种可药用载体。
另一方面，本发明的特征是一种共轭分子，该分子包括与含有非 配对成员多肽部分的靶向部分偶联的光敏剂，所述多肽部分具有对口 腔细菌的亲和性。
在靶向部分包括多肽的实施方案中，靶向部分可以是直链、支链 或环状的多肽。
在特别优选的实施方案中，靶向部分包括聚赖氨酸分子。聚赖氨 酸的长度可以是6-15、12-18、18-30、20-40、30-60、80-120、150-300、 300-600、800-1,200、或2,000-3,000个残基。
在优选的实施方案中，靶向部分包括被化学修饰而改变了电荷的 多肽，如聚氨基酸，电荷改变如改变了聚氨基酸上一个或多个氨基酸 残基的侧链的电荷。举例说明，一个或多个、或大约10、25、50、75、 90或100％的带电侧链可以被修饰。“被修饰”的意思是指使负性侧 链如谷氨酸或天冬氨酸侧链变成带正电性或中性；使带正电的侧链如 赖氨酸、精氨酸或鸟氨酸的侧链变成带负电性或中性。例如，聚赖氨 酸的一个或多个侧链可以被变成中性或负性。
在优选的实施方案中，当以适当能量和波长的电磁波照射时，光 敏剂在吸收能量后产生单线态氧；光敏剂包括卟啉或卟啉衍生物；光 敏剂包括二氢卟酚e6或二氢卟酚衍生物。
在优选的实施方案中，共轭物还包括主链。在该实施方案中，主 链既偶联光敏剂又偶联靶向部分。主链自身还可以是靶向部分，如聚 赖氨酸。
在优选的实施方案中，共轭物包括共轭到聚赖氨酸上的二氢卟酚 e6，例如共轭到分子量为1,000-3,000之间的聚赖氨酸上的1或2至20 个二氢卟酚e6分子。
在优选的实施方案中，共轭物包括共轭到组氨素(histatin)多肽或 其活性片段或类似物上的二氢卟酚e6，例如共轭到组氨素(histatin)-5 多肽上的1或2至4个二氢卟酚e6分子。
在优选的实施方案中，共轭物包括共轭到聚赖氨酸主链上的二氢 卟酚e6、和组氨素(histatin)多肽或其活性片段或类似物，例如，1-4 个聚赖氨酸链(MW1,000-3,000道尔顿，各包含1或2至20个二氢卟 酚e6)连接到组氨素(histatin)-5多肽上，或者1-4个组氨素(histatin)-5 多肽连接到聚赖氨酸链上(MW1,000-3,000道尔顿，并包含1或2-16 个二氢卟酚e6)。
在优选的实施方案中，靶生物是口腔细菌，如牙龈卟啉单孢菌(拟 杆菌属)。
在优选的实施方案中，共轭物不包括(例如不共价或非共价偶联 到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表面上受体 的配体。
在优选的实施方案中，靶向部分包括唾液多肽，或其活性片段或 类似物。唾液多肽的例子是组氨素(histatin)，如组氨素(histatin)-1至-8， 或更优选组氨素(histatin)-1、-3、或-5。在优选的实施方案中，靶向部 分包括组氨素(histatin)-5残基13-14，或来自其它组氨素(histatin)的相 应残基。在优选的实施方案中，靶向部分包括经改造而包含内部重复 区的组氨素(histatin)分子。
另一方面，本发明的特征是一种治疗患有以存在不希望生物为特 征的病症的患者的方法，该方法包括：
将包含与NPM靶向部分偶联的光敏剂的共轭物，例如这里所述 的共轭物，给药于患者；
用波长适合让光敏剂产生细胞毒性效果的能量照射患者；
由此治疗患有以存在不希望的生物为特征的病症的患者。
在优选的实施方案中，所述不希望的生物例如可以是，例如：微 生物，如细菌细胞、真菌细胞、原生动物细胞、卡氏肺囊虫细胞；病 毒；或寄生蠕虫；或者节肢动物。
在不希望的生物是细菌细胞的优选实施方案中，细菌细胞可以是 葡萄球菌属、链球菌属、肠杆菌属、分枝杆菌属、假单胞菌属、沙门 氏菌属、沙雷氏菌属、埃希氏杆菌属、欧文氏杆菌属、克雷伯氏杆菌 属、疏螺旋体属、密螺旋体属、弯曲杆菌属、卷旋杆菌属、博德特氏 杆菌属、奈瑟氏球菌属、军团菌属、钩端螺旋体属、小蛇菌属、枝原 体属、类杆菌属、克雷伯氏杆菌属、耶尔森氏菌属、衣原体属、弧菌 属、放线芽胞杆菌属、Porphyria、嗜血菌属、巴斯德氏菌属、消化链 球菌属、利斯特氏菌属、丙酸杆菌属、分枝杆菌属、棒状杆菌属或嗜 皮杆菌属的细胞。在更优选的实施方案中，细菌细胞可以是牙龈卟啉 单孢菌(拟杆菌属)；拟杆菌属种包括B.gingivalis(现在已知为牙龈卟啉 单孢菌)、啮蚀艾肯氏菌、核粒梭杆菌、直肠弯曲杆菌、真杆菌属种、 中间普雷沃氏菌(拟杆菌)、福赛斯拟杆菌、二氧化碳嗜纤维菌属种、 伴放线放线杆菌，和变异链球菌。
在细菌细胞是密螺旋体属细胞的优选实施方案中，病症是战壕嘴 (trenchmouth)、雅司疹或品他病。在其它的实施方案中，病症是脓疱 病或囊性痤疮。
在所述不希望的生物是真菌细胞的优选实施方案中，细胞可以是 念珠菌属或曲霉属细胞。在优选的实施方案中生物是卡氏肺囊虫。
在所述不希望的生物是原生动物细胞的优选实施方案中，细胞是 内变形虫属、弓形体属、贾第虫属、利什曼原虫属、潜隐孢子虫属 (Cryptosporidium)或血吸虫属。
在所述不希望的生物是病毒的优选实施方案中，病毒是HIV、 HTLV、肝炎病毒、流感病毒、鼻病毒、乳头瘤病毒、麻疹病毒、疱 疹病毒、轮状病毒、细小病毒、鹦鹉热病毒、或Ebola病毒。
在靶生物是节肢动物的优选实施方案中，节肢动物是寄生螨。
在靶生物是寄生虫的优选实施方案中，寄生虫是线虫或吸虫。在 优选的实施方案中，寄生虫是线虫，线虫是在患丝虫病的患者中发现 的。
在优选的实施方案中，靶生物是口腔细菌种，例如牙龈卟啉单孢 菌(拟杆菌属)。
在优选的实施方案中，共轭物不包括(例如不共价或非共价偶联 到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表面上受体 的配体。
另一方面，本发明的特征是一种治疗患有以在口腔中存在不希望 的生物为特征的口腔病患者的方法，该方法包括：
将包含与NPM靶向部分偶联的光敏剂的共轭物，例如这里所述 的共轭物，给药于患者；
用波长适合让光敏剂产生细胞毒性效果的能量照射患者；
由此治疗患有以存在不希望的生物为特征的病症的患者。
在优选的实施方案中，治疗方法包括将共轭物局部给药到患者被 所不希望的生物感染的部位。例如，共轭物可以通常局部给药到口腔 表面、牙龈、牙周组织、以发炎为特征的部位、损害处、牙或龈中的 裂缝或疵点、牙载体、切伤或切口(例口在牙齿或其它医疗保健过程中 造成的)、或给药到伤口。在其它实施方案中，该方法包括皮下给药， 例如皮下注射。在其它实施方案中方法包括局部注射到被不希望的生 物感染的位置或其附近。
在优选的实施方案中，照射是激光照射；或用光学纤维装置递送。
在优选的实施方案中，患者患有：以存在不希望的生物如微生物 为特征的口腔疾病，所说的微生物例如为不希望的细菌、真菌、病毒 或原生虫。该病症可以是受这些生物或本疾病影响而感染的牙齿、牙 龈如牙周组织、舌、扁桃体、悬雍垂、口腔衬里、或腮腺疾病中的任 何一种。
在优选的实施方案中，病症是感染性口腔疾病。
在优选的实施方案中，患者患有：牙周病，如牙周炎或牙周变性； 退缩龈；急性溃疡性龈炎；慢性龈炎；牙周脓肿；早发(幼年)牙周炎； 妊娠龈炎；冠周炎；感染性口腔炎；坏疽性口炎；化脓paratitis；下 颌骨或上颌骨的急性或慢性骨髓炎；牙髓炎或根尖周感染。
在优选的实施方案中，患者患有口腔真菌感染，例如放线菌病； 组织胞浆菌病；藻菌病；曲霉病；隐球菌病、孢子丝菌病；芽生菌病 或巴西芽生菌病感染。
在其它优选的实施方案中，患者患有口腔酵母感染，例如包括口 腔的念珠菌属感染，如念珠菌病；鹅口疮；慢性念珠菌病和念珠菌粘 膜白斑病；或患病毒感染，包括初发性疱疹性口炎，或唇疱疹。
在优选的实施方案中，患者除了患口腔疾病外，还患有免疫性疾 病，如获得性或遗传性免疫疾病。在特别优选的实施方案中，患者患 有AIDS或是HIV阳性。
在优选的实施方案中，所述不希望的生物是：口腔细菌种，如牙 龈卟啉单孢菌(拟杆菌属)；拟杆菌属种包括B.gingivalis(现在已知为牙 龈卟啉单孢菌)、啮蚀艾肯氏菌、核粒梭杆菌、直肠弯曲杆菌、真杆菌 属种、中间普雷沃氏菌(拟杆菌)、福赛斯拟杆菌、二氧化碳嗜纤维菌 属种、伴放线放线杆菌，和变异链球菌。
在优选的实施方案中，共轭物的靶向部分包括唾液多肽，或其活 性片段或类似物。唾液多肽的例子是组氨素(histatin)，如组氨素 (histatin)-1至-8，或更优选组氨素(histatin)-1、-3、或-5。在优选的实 施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)-5残基13-14，或来自其它组 氨素(histatin)的相应残基。在优选的实施方案中，靶向部分包括被改 造成包含内部重复区的组氨素(histatin)分子。
在特别优选的实施方案中，靶向部分包括聚赖氨酸分子。
在优选的实施方案中，靶向部分包括被化学修饰而改变了电荷的 多肽，如聚氨基酸，例如改变了聚氨基酸上一个或多个氨基酸残基的 侧链的电荷。举例说明，一个或多个、或大约10、25、50、75、90 或100％的带电侧链可以被修饰。“被修饰”的意思是指使负性侧链 如谷氨酸或天冬氨酸侧链成为带正电性或中性；使带正电的侧链如赖 氨酸、精氨酸或鸟氨酸的侧链成为带负电性或中性。例如，聚赖氨酸 的一个或多个侧链可以被变成中性或负性。
在优选的实施方案中，共轭物不包括(例如共价或非共价偶联 到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表面上受体 的配体。
在优选的实施方案中，当以适当能量和波长的电磁波照射时，光 敏剂在吸收能量后产生单线态氧；光敏剂包括卟啉或卟啉衍生物；光 敏剂包括二氢卟酚e6或二氢卟酚衍生物。
另一方面，本发明的特征是一种治疗牙周疾病患者的方法，所说 的病症特征为存在不希望的生物，该方法包括：
将包含与NPM靶向部分偶联的光敏剂的共轭物，例如这里所述 的共轭物，给药于患者；
用波长适合让光敏剂产生细胞毒性效果的能量照射患者；
由此治疗患者的牙周疾病。
在优选的实施方案中，治疗方法包括将共轭物局部给药到患者被 不希望的生物感染的部位。共轭物可以局部给药到牙龈、牙周组织、 牙周囊、以发炎为特征的部位、或损害处。在其它实施方案中，方法 包括全身给药，例如通过消化或注射。在其它实施方案中，方法包括 皮下给药如皮下注射。在其它实施方案中，方法包括局部注射到被不 希望的生物感染的位置处或附近。
在优选的实施方案中，患者患有：牙周炎或牙周变性；退缩龈； 急性溃疡性龈炎；慢性龈炎；牙周脓肿；早发(幼年)牙周炎；妊娠龈 炎。
在优选的实施方案中，患者除了患牙周疾病外，还患有免疫性疾 病，如获得性或遗传性免疫疾病。在特别优选的实施方案中，患者患 有AIDS或是HIV阳性。
在优选的实施方案中，不希望的生物是：口腔细菌种，如牙龈卟 啉单孢菌(拟杆菌属)；拟杆菌属种包括B.gingivalis(现在已知为牙龈卟 啉单孢菌)、啮蚀艾肯氏菌、核粒梭杆菌、直肠弯曲杆菌、真杆菌属种、 中间普雷沃氏菌(拟杆菌)、福赛斯拟杆菌、二氧化碳嗜纤维菌属种、 伴放线放线杆菌，和变异链球菌。
在优选的实施方案中，共轭物的靶向部分包括唾液多肽，或其活 性片段或类似物。唾液多肽的例子是组氨素(histatin)，如组氨素 (histatin)-1至-8，或更优选组氨素(histatin)-1、-3、或-5。在优选的实 施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)-5残基13-14，或来自其它组 氨素(histatin)的相应残基。在优选的实施方案中，靶向部分包括被改 造成包含内部重复区的组氨素(histatin)分子。
在特别优选的实施方案中，靶向部分包括聚赖氨酸分子。
在优选的实施方案中，靶向部分包括被化学修饰改变了电荷的多 肽，如聚氨基酸，例如改变了聚氨基酸上一个或多个氨基酸残基的侧 链的电荷。举例说明，一个或多个、或大约10、25、50、75、90或100％ 的带电侧链可以被修饰。“被修饰”的意思是指使负性侧链如谷氨酸 或天冬氨酸侧链成为带正电性或中性；使带正电的侧链如赖氨酸、精 氨酸或鸟氨酸的侧链成为带负电性或中性。例如，聚赖氨酸的一个或 多个侧链可以被变成中性或负性。
在优选的实施方案中，共轭物不包括(例如共价或非共价偶联 到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表面上受体 的配体。
在优选的实施方案中，当以适当能量和波长的电磁波照射时，光 敏剂在吸收能量后产生单线态氧；光敏剂包括卟啉或卟啉衍生物；光 敏剂包括二氢卟酚e6或二氢卟酚衍生物。
另一方面，本发明的特征是一种治疗患获得性免疫疾病和以存在 不希望的生物为特征的口腔疾病的患者的方法。在优选的实施方案 中，所述不希望生物是不同于造成获得性免疫疾病的生物。获得性免 疫疾病可以是例如AIDS或是HIV感染。所说的方法包括：
将包含与NPM靶向部分偶联的光敏剂的共轭物，例如这里所述 的共轭物，给药于患者；
用波长适合让光敏剂产生细胞毒性效果的能量照射患者；
由此治疗患者的以存在不希望的生物为特征的疾病。
在优选的实施方案中，治疗方法包括将共轭物局部给药到患者被 不希望的生物感染的部位。例如，共轭物可以通常局部给药到牙龈、 牙周组织、牙周囊、以发炎为特征的部位、或损害处。在其它实施方 案中，方法包括全身给药，例如通过消化或注射。在其它实施方案中， 方法包括皮下给药如皮下注射。在其它实施方案中，方法包括局部注 射到被不希望的生物感染的位置处或附近。
在优选的实施方案中，照射是激光照射；或用光学纤维装置递送。
在优选的实施方案中，不希望的生物是例如微生物，例如为不希 望的细菌、真菌、病毒或原生虫。病症可以是受这些生物或本疾病影 响而感染的牙齿、牙龈如牙周组织、舌、扁桃体、悬雍垂、口腔衬里、 或腮腺疾病中的任何一种。
在优选的实施方案中，病症是感染性口腔疾病。
在优选的实施方案中，患者患有：牙周病，如牙周炎或牙周变性； 退缩龈；急性溃疡性龈炎；慢性龈炎；牙周脓肿；早发(幼年)牙周炎； 妊娠龈炎；冠周炎；感染性口腔炎；坏疽性口炎；化脓paratitis；下 颌骨或上颌骨的急性或慢性骨髓炎；牙髓炎或根尖周感染。
在优选的实施方案中，患者患有口腔酵母感染，例如包括口腔的 念珠菌属感染，如念珠菌病；鹅口疮；慢性念珠菌病和念珠菌粘膜自 斑病；或患病毒感染，包括初发性疱疹性口炎，或唇疱疹。
在优选的实施方案中，不希望的生物是口腔类细菌，如牙龈卟啉 单孢菌(拟杆菌属)；拟杆菌属种包括B.gingivalis(现在已知为牙龈卟啉 单孢菌)、啮蚀艾肯氏菌、核粒梭杆菌、直肠弯曲杆菌、真杆菌属种、 中间普雷沃氏菌(拟杆菌)、福赛斯拟杆菌、二氧化碳嗜纤维菌属种、 伴放线放线杆菌，和变异链球菌。
在优选的实施方案中，共轭物的靶向部分包括唾液多肽，或其活 性片段或类似物。唾液多肽的例子是组氨素(histatin)，如组氨素 (histatin)-1至-8，或更优选组氨素(histatin)-1、-3、或-5。在优选的实 施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)-5残基13-14，或来自其它组 氨素(histatin)的相应残基。在优选的实施方案中，靶向部分包括被改 造成包含内部重复区的组氨素(histatin)分子。
在特别优选的实施方案中，靶向部分包括聚赖氨酸分子。
在优选的实施方案中，靶向部分包括被化学修饰改变了电荷的多 肽，如聚氨基酸，例如改变了聚氨基酸上一个或多个氨基酸残基的侧 链的电荷。举例说明，一个或多个、或大约10、25、50、75、90或100％ 的带电侧链可以被修饰。“被修饰”的意思是指使负性侧链如谷氨酸 或天冬氨酸侧链成为带正电性或中性；使带正电的侧链如赖氨酸、精 氨酸或鸟氨酸的侧链成为带负电性或中性。例如，聚赖氨酸的一个或 多个侧链可以被变成中性或负性。
在优选的实施方案中，共轭物不包括(例如共价或非共价偶联 到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表面上受体 的配体。
在优选的实施方案中，当以适当能量和波长的电磁波照射时，光 敏剂在吸收能量后产生单线态氧；光敏剂包括卟啉或卟啉衍生物；光 敏剂包括二氢卟酚e6或二氢卟酚衍生物。
另一方面，本发明的特征是一种共轭分子的制造方法，该方法包 括：
提供一个主链，如多肽主链；
将光敏剂偶联如共价偶联到主链上；
将靶向部分如这里所述的靶向部分偶联如共价偶联到主链上。
在优选的实施方案中，偶联反应涉及到光敏剂的受活化的酯部 分。在更优选的实施方案中，主链上的氨基作为亲核基团进行反应， 取代了光敏剂活性酯的离去基团。在优选的实施方案中，靶向部分通 过偶联剂偶联到主链上。
在优选的实施方案中，共轭物不包括(例如共价或非共价偶联 到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表面上受体 的配体。
另一方面，本发明的特征是一种用于消除不希望的生物用的试剂 盒。该试剂盒包含与靶向部分偶联的光敏剂和使用说明。
在优选的实施方案中，共轭物不包括，例如不偶联(如共价或非 共价偶联到)：PM、抗体、酶、激素、细胞表面上的受体、或细胞表 面上受体的配体。
光动力治疗涉及使用可光活化的化合物、或光敏剂，并结合使用 正确波长的光，来产生细胞毒性效果。为了增加光敏剂对靶的特异性， 可以使光敏剂结合到靶向部分上。本发明方法和共轭物的特征是使用 了NPM靶向的光敏剂。NPM可以有效且价有所值地将光敏剂向靶递 送。本发明组合物的优点在于(i)由于照射产生了毒性氧，该氧可以通 过细菌的细胞壁扩散，因而不需要内在地去杀死细菌；(ii)毒性氧的产 生可以具有刺激宿主免疫应答的局部效应，从而可以帮助根除细菌并 促进伤口愈合；(iii)仅在照射的部位产生细胞毒性应答。
除非另有定义，这里用到的技术和科学术语均与本发明所属领域 的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与这里所述的类似或等同 方法或资料也可以用来本发明的实施或测试，优选的方法和资料仍在 下面被描述。这里提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文 献均引入这里作为参考。另外，资料、方法和实施例均仅仅是举例说 明性的，而没有限定的意图。
附图简述
图1A表示不同电荷的二氢卟酚e6聚赖氨酸共轭物合成反应的第 一步，箭头1表示二氢卟酚e6(分子I)和N-羟基琥珀酰亚胺在二环己 基碳二亚胺和二甲基亚砜存在下反应，形成二氢卟酚e6-NHS酯(分子 II)。
图1B表示分子II和聚L-赖氨酸(分子IV)的反应2，形成聚L-赖 氨酸二氢卟酚e6(分子III)。
图1C表示组氨素(histatin)-5二氢卟酚e6共轭物的化学结构，四 个二氢卟酚e6部分分别偶联到组氨素(histatin)-5的每个赖氨酸残基的 ε-氨基上。
图1D表示分子III和乙酸酐或琥珀酸酐在DMSO中反应形成两 种分子V，对二氢卟酚e6聚赖氨酸乙酸酰胺中性共轭物来说，R基团 表示-COCH3；对二氢卟酚e6聚赖氨酸琥珀酸酰胺来说，R基团表示 -COCH2CH2COOH；对不再酰化的分子III来说，分子V中的R基团 是-H。
图2A表示具有组氨素(histatin)-5的16氨基酸残基片段的阳离子 性、中性和阴离子性二氢卟酚e6聚赖氨酸共轭物的合成反应顺序之 第一步，通过合成含巯基活性官能团2-吡啶基-二硫-3-丙酰基的分子 来实现，其中反应4表示聚赖氨酸二氢卟酚e6(分子V)和N-琥珀酰亚 胺-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)在DMSO中反应，产生聚赖氨酸二 氢卟酚e6-SPDP(分子VI)，并且进一步进行反应5，即分子VI和乙酸 酐或琥珀酸酐在DMSO中反应，形成乙酰或琥珀酰衍生物，其中分子 VII中的R分别表示-COCH3和-COCH2CH2COOH。
图2B表示分子VII和人组氨素(histatin)-5的一个16氨基酸残基 片段进一步反应合成共轭物，反应6表示组氨素(histatin)-5的片段和 SATA反应形成SATA-组氨素(histatin)-5片段(分子IX)，然后在反应 7中通过羟胺脱保护，产生偶联到组氨素(histatin)-5片段上的脱保护 的SATA(分子X)。
图2C表示反应8，是将分子X偶联到各聚赖氨酸二氢卟酚e6分 子和分子VII的乙酰和琥珀酰衍生物上，产生XI所示的分子，其中 对于带正电的未酰化共轭物来说，R表示-H；对于中性乙酸酰胺，R 表示-COCH3；对于带负电的琥珀酸酰胺，R表示-COCH2CH2COOH。
图3表示三种聚赖氨酸二氢卟酚e6共轭物在每mg含10-9mol二 氢卟酚e6的来自牙龈卟啉单孢菌细胞的细胞蛋白中的吸收曲线，阳 离子性共轭物的吸收由连接圈的实线表示，阴离子性的琥珀酰化共轭 物的吸收由连接方块的短虚线表示，中性的乙酰化共轭物的吸收由连 接实圈的点虚线表示，它们均为二氢卟酚浓度(μM)的函数。
图4表示三种二氢卟酚e6共轭物在每mg含10-11mol二氢卟酚e6 的来自HCPC-1仓鼠颊囊扁平细胞癌细胞的细胞蛋白中的吸收曲线， 该吸收是二氢卟酚浓度(μM)的函数，表示每种共轭物所用的符号如图 3中解释的一样。
图5表示牙龈卟啉单孢菌细胞经过波长630-710nm的光照射后的 存活曲线，用图3中解释的符号来表示预先吸收了二氢卟酚e6共轭 物的细胞，还包括吸收了Photofrin II的细胞样品(用连接x符号的短 虚线表示)，和另一种吸收了苯并卟啉(benzoporphyrin)衍生物的细胞样 品(用连接实三角形的短粗线表示)，它们的存活率均为光流量的函数。
图6表示HCPC-1仓鼠颊囊扁平细胞癌细胞经过波长630-710nm 的光照射后的存活曲线，预先吸收了二氢卟酚e6共轭物的细胞由图3 和6中解释的符号来表示，其存活率是光流量的函数。
发明详述
这里所说的光敏剂是指当使用具有适宜波长的电磁能(通常是适 宜波长的光线)照射时产生细胞毒性效果的物质。
这里所说的术语肽、多肽、和蛋白质可互换使用，除非另有特别 的说明。这里所述的方法和组合物中用到的肽、多肽和蛋白质可以是 重组的、从天然源中纯化的、或者是化学合成的。例如，说到使用细 菌蛋白或来自细菌的蛋白质，包括了使用重组技术生产的分子、从天 然源中纯化的分子、或化学合成的分子。
这里所说的非配对成员(NPM)是与靶位点结合的分子，例如多 肽。靶位点可以是蛋白质、核酸、脂类、多糖或其组合的结构。抗体、 受体、激素、生长因子、神经递质和酶不是NPM多肽并且在这里称 为成对成员(PM)。这些NPM在NPM和结合部位之间不表现出互补关 系。互补关系的意思是所结合的两个本体具有形状、轮廓和电荷的互 补组合，这种组合是基于位于一个本体上的“相对”官能团和位于另 一个本体上的“相对”官能团能够形成非共价键的能力，由此通过多 个非共价相互作用将两个本体配合。换句话说，NPM不包括与靶位点 互补的形状、轮廓和电荷类型的组合。通常来说，NPM对其靶子的亲 和性比PM低，例如上述的那些PM。NPM对其靶子的亲和力的Km 一般在mM到μM范围内。PM的结合在体内的释放，例如从底物中 释放出酶，通常需要结合其它的蛋白质，或者破坏或形成一个共价键。 在体外，经常要通过极度加热或pH来操作PM对，以分离组成PM 对的本体。
本发明的方法可以使用一种靶向部分，该靶向部分除了具有适用 于本发明目的的结合特性外还具有PM功能。例如，将LDL分子作为 PM型配体结合到阿朴B/E典型LDL受体上，将氧化或改变的LDL 分子作为PM型配体结合到巨噬细胞清除受体上。然而，LDL分子还 具有对格兰氏阴性表面组分的NPM型亲和力，这不是这里所说的PM 功能。PM相互作用通常以具有高特异性为特征，以致仅能识别一个 或几个同族分子，还以高亲和性为特征，一般具有在μM-pM范围内的 Km值。
这里所说的靶生物是指引起或加重病症的生物体。
这里所说的术语“患者”是指携带不希望的生物的活体动物或人， 其中所说的生物即是光动力治疗的靶生物。患者可以是免疫缺陷者。 患者可以是哺乳动物，包括人和非人哺乳动物例如狗、猫、猪、母牛、 羊、山羊、马、大鼠和小鼠。患者可能是以前通过化疗或抗生素疗法 治疗过的。
这里所说的“天然存在的”是指存在于自然中的分子。非天然存 在的分子是如果没有人为的介入其结构就不存在的分子。
这里所说的术语抗微生物性短肽(SAMP)是指长度少于60个氨基 酸残基的肽。符合这个限制的组氨素(histatin)、防卫素、杀菌肽、爪 蟾抗菌肽、格兰氏阳性细菌素、以及抗菌素均是SA。很多SA具有20-40 个氨基酸残基的长度。SA是天然存在的肽，并且由很多各种生物制 造。SA是NPM。很多SA具有广谱的抗微生物活性，例如可以杀死 一种以上的微生物，而且在某些情况下可以杀死关系较远的微生物种 类，例如格兰氏阴性和格兰氏阳性菌。
这里所说的多肽的活性片段或类似物保持了至少20％抗微生物活 性或多肽的靶生物亲和性。多肽类似物与多肽共有至少50％或更多、 优选60、70、80或90％的相同序列。
这里所说的唾液多肽是指患者产生或在患者唾液中发现的多肽。 大部分唾液多肽是由腮腺产生的。
这里所说的肽抗菌素是对细菌或真菌具有抗生活性的直链或环状 低聚肽，或者是其活性片段或类似物，是通过硫醚键而连接在多蛋白 复合物上通过酶促合成的。肽抗菌素可能包括非核糖体氨基酸例如D 氨基酸，可能包括非氨基酸残基例如乳酸或戊酸的酯。 光敏剂
光敏剂是当使用具有适当波长的电磁能(通常是适当波长的光线) 照射时产生细胞毒性效果的物质。
很多光敏剂产生单线态氧。当以适当能量水平和波长的电磁能照 射时，这种光敏剂分子转变成赋能形式。赋能形式可以和大气中O2反应，以致当光敏剂衰变成不带能状态时，产生单线态氧。单线态氧 是高活性的，并且对邻近的靶生物是有毒性的。
其三重赋能状态的寿命应当具有足够的持续时间(如几微秒)，以 允许和附近的分子相互作用产生细胞毒性种类。
光敏剂组合物应当有效地吸收高量子产率的适当波长的电磁能， 以有效产生赋能形式的光敏剂。当照射时，对靶生物的毒性应当有较 大的增加，优选10倍、100倍，或者更优选1,000倍的增加。光敏剂 应当表现出低的背景毒性，即在不用适当波长的能量照射时毒性是低 的。
光敏剂的其它优选特征包括在适宜溶剂中的高溶解性和稳定性。 例如，光敏剂应当在用来将其偶联到靶向部分或主链的条件下是可溶 的。期望的溶解度特性随反应所选择的条件而不同，但在DMSO、水、 乙醇、或者水和DMSO或乙醇的混合物(例如DMSO∶H2O或乙醇∶水) 有5％、10％或15％的溶解度可以是有用的。在水溶剂或乙醇∶水溶剂 中的溶解度优选为50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1mg/ml或10mg/ml。
当共轭到靶向部分时，所得的光敏剂：靶向部分共轭物在生理条 件下应当可溶于含适宜载体和赋形剂的含水溶剂、或者其它给药系统 如脂质体中。本发明的分子可以自由的光敏剂：靶向部分组合物溶液的 形式来给药，还可以各种剂型给药，包括(但不限于此)脂质体、肽/聚 合物结合物、或含去污剂的制剂。
本发明的组合物应当在至少一个周期的连续或脉冲照射治疗过程 中是稳定的，在该治疗过程期间组合物的每个分子优选被反复激活成 赋能状态，经历多次产生单线态氧的周期。在生理条件下，光敏剂共 轭分子的稳定性优选于37℃下1小时、30分钟、15分钟或至少1分 钟内存活10％、50％、90％、95％或99％的分子。
光敏剂包括(但不限于此)血卟啉，例如盐酸血卟啉和血卟啉酯 (Dobson，J and M.Wilson，Archs.Oral.Biol.37：883-887)；二血卟啉酯 (Wilson，M.et al.，1993，Oral Microbiol Immunol.8：182-187)；血卟啉IX (Russel et al.，1991，Can J.App.Spectros.36：103-107，可从Porphyrin Products，Logan，UT获得)及其衍生物；3，1-内消旋四(邻丙酰氨基苯基) 卟啉；氢化卟啉例如这里的二氢卟酚(chlorin)，以及四(羟基苯基)卟啉 系列的菌绿素，和合成的二卟啉和二-二氢卟酚；邻位取代的四苯基卟 啉(栅状卟啉)；二氢卟酚e6单乙烯二胺一酰胺(CMA Goff，B.A.et al.， 1994，70：474-480，可从Porphyrin Products，Logan，UT获得)；二氢卟酚 e6的一-1-天冬氨酰衍生物，和二氢卟酚e6的单和双天冬氨酰衍生物； 血卟啉混合物Photofrin II(Quardra Logic Technologies，Inc.，加拿大魁 北克BC)；苯并卟啉衍生物(BPD)，包括苯并卟啉一元酸环A(BPD- MA)、四氰乙烯加合物、二甲基乙炔二羧酸盐加合物、狄尔斯阿德耳 加成物、以及一元酸环“a”衍生物；萘菁 (naphthalocyanine)(Biolo，R.，1994，Photochem.和Photobiol，5959：362- 365)；Zn(II)-酞菁(Shopora，M.et al.，1995，Lasers in Medical Science 10：43-46)；甲苯胺蓝O(Wilson M，.et al.，1993，Lasers in Medical Science 8：69-73)；磺化铝和二磺化的酞菁(同上)；以及不含金属取代基和包含 各种其它取代基的酞菁；四硫酸化衍生物；磺化铝萘菁；亚甲蓝(同上)； 尼罗蓝；结晶紫；天蓝β氯化物；以及四碘四氯荧光素(Wilson，M.1994， Intl.Dent.，J.44：187-189)。很多光敏剂本体公开于Wilson，M.et al.，1992，Curr.Micro.25：77-81和Okamoto，H.et al.，1992，Lasers in Surg. Med.12：450-485中。
其它可用的光敏剂组合物包括(但不限于此)脱镁叶绿甲酯一酸， 例如焦脱镁叶绿甲酯一酸(pyropheophorbide)化合物，蒽二酮；蒽吡唑； 氨基蒽醌；吩噁嗪染料；吩噻嗪衍生物；硫属元素吡喃 鎓(chalcogenapylylium)染料，包括阳离子硒-和碲-吡喃鎓衍生物； verdins；红紫素包括八乙基红紫素和初红紫素(etiopurpurin)的锡和锌 衍生物；苯并萘并紫菜嗪；阳离子imminium盐；以及四环素。
适合在共轭物中使用的光敏剂可用这里所述的方法或者本领域技 术人员已知的方法来确定。
光敏剂氧化靶分子的效率是有用的一个量度。靶分子被光敏剂的 氧化效率可用在体外测定。底物的例子包括4-亚硝基-N，N，-二甲基苯 胺(RNO；Hasan，T.et al.，1987，Proc.AACR 28：395摘要1,568)和色氨酸或 组氨酸(Lambert，C.R.et al.1986，Photochem.Photobiol.44：595-601)。在 这些测定中，可以光谱监视所候选的光敏剂“漂白”底物的能力。化 学测定的优点在于可以同时筛选大量预测的光敏剂组合物。可变参数 包括光敏剂浓度、底物浓度、最佳照射强度和最佳照射波长。可以使 用高产率技术，包括使用塑料多孔皿、自动移液管和联机分光光度平 板读数器。不希望的光敏剂，例如在不照射条件下有高背景的组合物、 不具有有效能量捕获或活性潜力的组合物，可以被鉴别出来并且被除 去。
可以使用一种或多种靶生物模型的细胞进行体内测定来评价光敏 剂的背景细胞毒性和活化的形式。测定在照射和未照射光敏剂的存在 下杀死生物的效率，并且与未处理对照细胞样品的存活率比较。该测 定试验可以自动进行。使用菌落形成单位(CFU)或细胞生长计数可能 需要培养涂敷于营养培养基中的样品，随之是适当的生长迟滞期，以 允许菌落形成。
还可以通过生化方法的分析来监视靶生物模型细胞的存活，例如 DNA合成分析。在这种方法中，可以通过其对生物模型细胞样品的作 用来测定候选光敏剂的效率，其中所述样品也是被暴露到受标记的 DNA前体例如含氚胸腺嘧啶核甙中。然后收集细胞，洗涤除去未掺入 的前体，并监测前体的摄取和在酸不溶性沉淀中的掺入，这是DNA 合成的量度。在该测试中，也可以如上所述自动进行，这样可迅速评 价与定量出照射光敏剂组合物的定量评价效果。在未照射的对照细胞 和未处理的细胞中，做为细胞生长的函数DNA合成呈对数性增加。 表示存在假定的成功的新光敏剂的阳性结果是，在此光敏剂的存在下 被照射的细胞中的DNA合成中止。
适宜的靶生物模型是：大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球 菌和变异链球菌。光敏剂活性的适宜的阳性对照是甲苯胺蓝O。
如果筛出了大量的光敏剂，则可以指望使用两步筛选，其中第一 步是体外筛选而第二步是使用细胞。 照射
用适宜波长的光照射给定的化合物可以通过各种方法来实施。这 些方法包括(但不限于)施用激光、非激光或宽波段光。照射可以通过 体外或在关节内产生适宜波长的光来实现。本发明所用的光可以通过 使用任何能够传递必要功率光的装置来实施。包括(但不限于)纤维光 学仪器、关节内窥仪器或提供透照的仪器。光传递到口腔中可以通过 用易曲的光学纤维插入到牙周囊中或者通过经龈照明(牙龈的平均厚度 为5-7mm)来完成。灭活细菌需要的光源可以是便宜的二极管激光或 非相干光源。 偶联技术
这里所说的术语“偶联剂”指能够将光敏剂偶联到靶向部分上、 或者将光敏剂或靶向部分偶联到“主链”或“桥”上的试剂。任何键 均是适宜的，只要能够连接组成部分以致它们在生理条件下于给药或 治疗所需的时间内是稳定的，但共价键是优选的。两组成部分之间的 连接可以是直接的，例如光敏剂直接连接到靶向部分，也可以是间接 的，例如光敏剂连接到中间体如连接到主链上，而中间体是连接到靶 向部分上的。偶联剂应当在基本上保持光敏剂、主链(如果存在)和靶 向部分化学稳定的温度、pH、盐、溶剂体系和其它反应体的条件下起 作用。
偶联剂可以连接组成部分而不将偶联剂成分附加到被连接的组成 部分上。其它偶联剂导致偶联剂成分附加到被连接的组成部分上。例 如，偶联剂可以是均-或杂-双官能交联剂，并且其中交联剂的一个或 几个原子性组分会保留在组合物中。非交联剂的偶联剂可以在偶联反 应过程中完全除去，从而分子产物可以全部由光敏剂、靶向部分和主 链部分(如果存在的话)组成。
很多偶联剂与胺和羧化物反应，形成酰胺或醇以及与羧化物形成 酯。偶联剂为本领域已知的，例如参见Bodansky“肽的合成原理”第 二版(这里作为参考)和T.Greene and P.Wuts的“有机合成中的保护基” 第二版1991(John Wilsy，NY)。偶联剂应当稳定地连接组成部分，但应 当是光敏剂或靶向部分仅有最小的或没有变性或失活。
本发明的光敏剂共轭物可以通过使用以下实施例描述的方法将光 敏剂偶联到靶向部分上来制备，或者通过本领域已知的方法。各种偶 联剂包括交联剂可以用来共价结合。交联剂的实例包括N，N’-二环己 基碳二亚胺(DCC；Pierce)、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰-硫代乙酸酯 (SATA)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDS)、邻亚苯基 二马来酰亚胺(o-PDM)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基) 环己烷-1-羧酸酯(硫基-SMCC)。例如参见Karpovsky et al.J.Exp.Med. 160：1686，1984；和Liu，MA et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648， 1985。其它方法包括Paulus，Behring Ins.Mitt.，No.78，118-132，1985； Brennan et al.Science 229：81-83，1985和Glennie et al.，J.Immunol.， 139：2367-2375，1987中所述。Pierce Chemical Co.目录T-155-T-200 页，1994(3737 N.Meridian Rd.，Rockford IL，61105，美国.；Pierce Europe B.V.，P.O.Box 1512，3260 BA Oud Beijerland，荷兰)中记载了很多肽和 蛋白质用的偶联剂、以及缓冲剂、溶剂及使用方法，该目录引入这里 作为参考。
DCC是一种有用的偶联剂(Pierce#20320；Rockland，IL)。它促进醇 NHS和二氢卟酚e6在DMSO(Pierce#20684)中偶联，形成可交联到多 溶素上的活化的酯。DCC(N，N’-二环己基碳二亚胺)是羧基反应性交 联剂，通常用作肽合成中的偶联剂，分子量206.32。另一种有用的交 联剂是SPDP(Pierce#21557)，一种对伯胺和巯基作用的杂双官能交联 剂。SPDP的分子量为312.4，空间距离(spacer arm)长度为6.8埃，对 NHS-酯和吡啶基二硫基是有反应性的，并产生可裂解的交联，以致当 进一步反应时，交联剂被消除从而使光敏剂可以直接连接到主链或靶 向部分上。其它有用的共轭剂是SATA(Pierce#26102)，用于给两步交 联引入嵌段SH基团，该基团用羟基胺-HCl(Pierce#26103)和硫基-SMCC 脱嵌段(Pierce#22322)去嵌段，SATA对胺和巯基是有反应性的。从 Pierce化学公司(Rockland，IL)还可以获得其它交联剂和偶联剂。将蛋 白质共轭到其它蛋白质上或其它组合物上(如共轭到金属离子标记蛋白 质用的报告基团或螯合剂上)的其余化合物和方法，尤其是那些涉及席 夫碱中间物的，被公开于EP0243,929A2(1987.11.4公开)。
通过预形成的活性酯(如N-羟基琥珀酰亚胺酯)或由碳化二亚胺介 导反应而原位共轭的酯，含羧基的光敏剂可以结合到靶多肽中的赖氨 酸的ε-氨基上。对含磺酸基的光敏剂使用相同办法，可以将磺酸基转 变成可和氨基反应的磺酰氯。具有羧基的光敏剂可以通过原位碳二亚 胺方法联接到多肽的氨基上去。光敏剂还可以连接到丝氨酸或苏氨酸 残基的羟基上，或半胱氨酸残基的巯基上。
共轭物组成部分的连接方法，例如将带光敏剂的聚氨基酸链连接 到抗菌性多肽上，可以使用杂双官能交联试剂。这些交联剂将一个官 能团结合到一个链上并且另一个官能团连接到第二个链上。这些官能 团一般是氨基、羧基、巯基和醛。有很多形式的能和这些基团反应来 将它们共轭到一起并且具有不同化学式结构的适宜的部分。参见Pierce 目录和Merrifield，R.B.et al.Ciba Found Symp.186：5-20.1994。
光敏剂：靶向部分共轭物的生产或纯化可以通过本领域已知的方 法实现。偶合反应的产率可以通过光谱分析从最后步骤的色谱分离中 洗脱下来的产物来计量。随后，存在未偶联的光敏剂和含光敏剂的反 应产物的物理特征是光敏剂部分吸收特征波长的光和其消光系数，所 以产物中的掺入是可以通过在特征波长或相似波长的光吸收来监视到 的。偶联一个或多个光敏剂分了到靶向部分或主链上去，可使使用大 小排阻凝胶层析法洗脱出的组分的洗脱图的吸收峰发生位移。大小排 阻凝胶层析可在Sephadax G50、G100或G200或其他如此的基质 (Pharmacia-Biotech，Piscataway NJ)上进行。适宜大小排阻凝胶例如 Sephadex凝胶的选择，可以通过凝胶来决定，其中光敏剂洗脱在超过 原料的排除体积太大以致不能和珠相互作用的组分中，即未偶联的起 始光敏剂组合物和分离珠相互作用到一定程度并且伴随延迟到一定程 度。适用的凝胶可以从未偶联光敏剂的分子量中预知。光敏剂偶联到 附加部分的成功反应产物通常具有特征性的较高分子量，使得它们和 级分珠相互作用的程度较低，并因而出现在比含未偶联光敏剂底物组 分洗脱得早的馏分中。未反应的光敏剂底物一般出现在起始原料特征 的组分中，各反应的产量可以因此从较大分子量原料的峰值大小、和 特征起始原料峰值的减少中估计出来。使用摩尔消光系数将产物组分 峰下的面积换算成产量大小。
产物可以通过使用NMR来分析，将适宜产物的峰面积积分，来 测定用不同偶联剂的相对产量。跟随偶联到聚氨基酸上时，经常观察 到在光敏剂的吸收中有几nm的红移。偶联到较大部分例如蛋白质中 时，可能产生可比较的位移，如与游离光敏剂的吸收相比较，偶联到 抗体上时造成的位移在那方向上为约3-5nm。对二氢卟酚e6而言，在 0.1M NaOH/1％ SDS中的相关的吸收最大值和消光系数为400nm和 150,000M-1，cm-1，对苯并卟啉衍生物来说为430nm和61,000-1，cm-1。 主链部分
本发明的光敏剂：靶向部分共轭物包括那些与光敏剂直接偶联的 靶向部分，例如组氨素(histatin)。本发明的其它光敏剂：靶向部分共轭 物包括“主链”或“桥”部分，例如聚氨基酸，其中主链既被偶联到 光敏剂上也被偶联到靶向部分上。主链本身可以就是靶向部分，例如 聚赖氨酸(见实施例4和图5与6)。
在光敏剂和靶向部分的共轭物中包含主链可以具有很多优点，包 括提供每条主链偶联较大化学计量范围的光敏剂和靶向部分。如果主 链具有对靶生物的内在亲和性，则复合物的亲和性可以通过偶联到主 链上而得到增强。可以通过将两个或多个不同的靶向部分偶联到单个 光敏剂-主链复合物中来扩大一个复合物所靶向的生物的特定范围。
可用于在本发明方法和化合物中的主链部分设计和特征分析的肽 包括聚氨基酸，所说的聚氨基酸可以是L-、D-、外消旋DL-或混合L- 和D-氨基酸组成的均聚物和杂聚物，并且可以是确定的或无规的混合 组成和序列。具有混合D和L氨基酸残基的天然存在的肽的实例包括 杆菌肽和短杆菌酪肽。这些肽可以仿造特定的天然肽被制造出来，并 且通过为增强结合到所选择的靶上的噬菌体展示和选择技术来进行优 化，以便将被选择的具有最高亲和性的肽特示出来，然后合成生产。 例如为增加溶解性、减少聚集性和改变疏水性程度的目的，可以进行 官能团的其它进一步修饰。非肽主链的例子包括核酸及核酸衍生物如 DNA、RNA和肽核酸；多糖及衍生物如淀粉、果胶、几丁质、纤维 素、半甲基化纤维素；脂类如甘油三酸酯衍生物和脑苷脂；合成聚合 物如聚乙二醇(PEGs)和PEG星形聚合物；葡聚糖衍生物、聚乙烯醇、 N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺共聚物、聚(DL-乙醇酸-乳酸)；以及包 含任何一种这类化合物成分的组合物。 共轭物电荷的修饰
共轭物对靶生物的亲和力可以通过修饰共轭物组分的电荷来提 高。
如聚-L-赖氨酸二氢卟酚e6的共轭物可以被制成具有不同大小和 电荷(阳离子性、中性和阴离子性)，例如可以用乙酰基、琥珀酰基或 其它R基团将聚赖氨酸的自由NH2封端来改变最终复合物的带电量。 本发明共轭物的净电荷可以通过等电点聚焦(IEF)来测定。该技术使用 外放电压在非筛析用丙烯酰胺或琼脂糖凝胶中通过使用两性电解物质 体系(合成的缓冲组分)来产生pH梯度，当将带电的多肽加到凝胶上 时，它们将迁往凝胶的较高pH区域或迁往凝胶的较低pH区域，而在 使它们变得不带电的位置不再移动。这个位置可以通过参考已知的IEF 系列标记蛋白的位置来确定。
由于聚氨基酸上的极性带电基团的合并，以及平面芳族四吡咯环 之间的疏水吸引，这些共轭物可以采用可和细菌细胞壁相互作用的pH 依赖的构象。此外，组氨素(histatin)和相关的多肽包含至少一个赖氨 酸残基，该残基通过使用两种杂双官能试剂将组氨素(histatin)和聚赖 氨酸二氢卟酚e6分子之间以共价双硫键连接。可以确定光敏剂对各 种口腔病原细菌的最佳组成、浓度和使用时间。 靶向部分
所期望的靶向部分的特征包括：对一种或多种不希望的靶生物的 特异性、亲和性和亲合力，以及在偶联反应条件和器官或组织的生理 学条件下的稳定性。特异性不需作狭义的定义，例如它可以对靶向分 子是所需的，以便对一个宽范围中的靶生物具有亲和性，如格兰氏阴 性细菌。
当掺入到本发明的共轭物分子中时，靶向部分应当对患者的细胞 是无毒的。
靶向部分可以选白天然存在的蛋白质和肽的序列，来自这些多肽 的变种，和来自生物或化学合成的肽。对一种或多种靶生物具亲和性 的天然存在的肽可以提供具有所期望的特性如增加的亲和性和特异性 的序列，从而可以用来被个别地或做为相关肽文库的一个成员来合 成。这种肽可以基于对靶生物的亲和性来选择。
在本发明的方法和化合物中有用的具靶生物亲和性的天然存在的 肽包括唾液蛋白质例如组氨素(histatin)、微生物加工的蛋白质如细菌 素、能结合和/或杀死与生产菌株紧密相关种类的肽；和通过动物品种 产生的蛋白质如防卫素(由哺乳动物产生)、和杀菌肽和爪蟾抗菌肽(分 别由蛾类和两栖类产生)。
组氨素(histatin)、防卫素、杀菌肽和爪蟾抗菌肽是这类自然界广 泛发现的多肽的实例，具有小尺寸(一般大约30个氨基酸残基，并且 在10个残基和50个残基之间)、广谱抗菌特异性、和对靶生物的低亲 和性的特征。
使用组氨素(histatin)作为光敏剂靶向部分将允许将光敏剂靶向细 菌细胞，并同时保持宿主细胞不被损害。组氨素(histatin)是具有杀细 菌性和杀念珠菌性的富含组氨酸的阳离子多肽类，并且是正常人唾液 的成分(Oppenheim，G.G.et al.，J.Biol.Chem.263：7472-747，1988)。它们 的作用机理被认为是其α螺旋构象和阳离子电荷的组合引导它们插入 细菌细胞壁的极性头基团之间(Raj，.P.A.，et al.，J.Biol.Chem.269：9610- 9619，1994)。
尽管可用的组氨素(histatin)适合用作口腔杀菌剂，但它们起作用 需几个小时的时间，导致了为使组氨素保留在感染部位而使用制剂给 药赋形剂如凝胶的问题。然而，口腔细菌的光动力失活可以仅需要靶 向细菌的光敏剂的简单应用，例如通过施用漱口药。由于细菌比平均 的哺乳动物细胞小50-100倍，并且光动力治疗的原理被认为涉及在组 织中具有非常短扩散距离的分子种类如单线态氧(对于单线态氧，其扩 散距离小于50nm)。可以看出，对细菌中等程度的敏感剂选择性可能 导致在细胞毒性中的高水平选择性。人和实验动物中的低水平PDT显 示活化了宿主免疫系统的成分如巨噬细胞和淋巴细胞，且这些活化的 宿主细胞可以参与消灭细菌和帮助被疾病损毁的组织的再生。
组氨素(histatin)-1、-3和-5分别在38、32和24个残基的总多肽 长度中各包含7个组氨酸残基。组氨素(histatin)具有很多活性，例如 抗真菌活性如抗念珠菌属病原体(US专利5,486,503)。组氨素 (histatin)-5残基13-24的重组复制赋予肽以增强的杀念珠菌活性(Zuo，F. et al.，Gene 161：87-91，1995)。组氨素(histatin)-5是一种由口腔细菌种牙 龈卟啉单孢菌(拟杆菌属)所产生的胰蛋白酶类蛋白酶的抑制剂，所述 蛋白酶与牙周疾病的组织毁灭有关系(Nishikata，M.et al.，Biochem. Biophys.Res.Comm.174：625-630，1991)。约3,600个组氨素(histatin)-5 分子结合牙龈卟啉单孢菌，其Kd在10-6M数量级上(Murakami，Y.et al.，FEMS Microbiol Letts.82：253-256，1991)。组氨素(histatin)-5和-8抑 制牙龈卟啉单孢菌和S.mitis的共聚集(Murakami，Y.et al.，Inf.Immun. 59：3284-3286，1991)，这可能调节牙龈卟啉单孢菌对以前结合到口腔组 织上的格兰氏阳性细菌的附着。
组氨素(histatin)-5对至少一种口腔细菌种牙龈卟啉单孢菌 (Colon，J.O.et al.，J.Dent.Res.72 IADR Abstr：322，Abstr，751)和粘性放线 菌、内氏放线菌和溶齿放线菌(Kalpidis，C.D.et al.，op.cit.71：305， Abstr.1595)具有杀菌活性。对后者种的直接的抗菌活性似乎不存在对 放线菌属细胞凝集的受体活性。组氨素(histatin)-5的合成肽是牙龈卟 啉单孢菌(拟菌杆属)血细胞凝集素的潜在抑制剂(Murakami，Y.et al.， Archs.Oral.Biol.35：775-777)。该合成肽是强阳离子性的(22个残基中含 6个His、4个Lys和3个Arg)，可能做为在上皮细胞、唾液表膜和格 兰氏阳性细胞上牙龈卟啉单孢菌的结合域。
被C-或N-末端化学封闭并且与金属(例如Ag、Cu、Zn或Sn)络 合的组氨素(histatin)，适合一定范围的抗微生物用途，例如抗噬菌体、 抗龋、抗口臭的口腔用途、除臭用途、个人卫生用途等(EPO专利申 请721 774 A2)。
细菌素，是一类由细菌产生的并且杀死其它菌株和细菌种的蛋白 质(Jack，R.W.et al，Microbiol.Rev.59：171-200，1995)，可以用作靶向部分。 一种示例性的格兰氏阳性细菌素是乳酸链球菌肽，它由乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)产生并且符合食品药物管理局的适用食品保藏的 GRAS分类地位(通常被认为是安全的)。
细菌素乳酸链球菌肽、枯草菌素、表皮素、gallidermin、唾液素 (salivarin)和乳链球菌素是“羊毛硫抗生素”类格兰氏细菌素的例子， 它被定义为细菌素，其中一个或几个半胱氨酸残基连接到脱水丝氨酸 或苏氨酸上，形成已知如羊毛硫氨酸(Lan)或苏型-β-甲基羊毛硫氨酸 (MeLan)的硫醚连接的残基。在这些来自生产细胞的抗微生物的肽中 发现有翻译后修饰。羊毛硫抗生素包含18-24个残基的前导肽序列， 该羊毛硫抗生素裂解生成约22-35个残基的活性抗微生物肽。生产用 细菌种的生长、以及细菌素的制备和纯化可通过可由本领域技术人员 实现的公开程序和技术来完成。例如，Yang，R.et al.，Appl.and Env. Microbiol 58：3355-3359，1992描述了从乳酸菌4个属中的每种中纯化出 细菌素，是通过优化生产细胞的吸收，接着使用低pH来选择洗脱非 常富含细菌素的组分。细菌素乳酸链球菌肽(由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)生产)、和枯草菌素(枯草芽胞杆菌生产)各自的突变型比亲本野 生型具有更多所需的特性(Liu，W.and N.Hansen，J.Biol.Chem.267：25，078- 25，085，1992)。关于适宜基因的分离以及携带所需突变之菌株的诱变和 选择的程序可在Maniatis，T.et al，1982，分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY和接下来的第二版 Sambrook，J.et al.，1989中找到。
抗微生物肽由各种动物产生(参见Saberwal，G.and R.Nagaraj， Biochim.Biophys.Act.1197：109-131，1994的综述)。其实例是由惜古比 天蚕蛾产生的杀菌肽类的肽。几种杀菌肽包含37个残基，其中6个 是赖氨酸。杀菌肽能有效地对抗格兰氏阳性和格兰氏阴性细菌。其它 昆虫产生的肽包括蜜蜂素(apidaechin)(来自蜜蜂)、雄素(andropin)(来自 果蝇)、和来自大黄蜂、果蝇和其它昆虫的杀菌肽类的成分。
防卫素由哺乳动物(包括人)产生，通常约29-34个残基长度，且 爪蟾抗菌肽(约23个残基)由两栖类如有爪蟾蜍产生。来自人(HNP-1、 -2、-3和4)、天竺鼠(GPNP)、兔子(NP-1、-2、-3A、-3B、-4和-5)和 大鼠(NP-1、-2、-3和-4)的防卫素共有大量的同源区。防卫素可以具 有对格兰氏阳性细菌或格兰氏阴性细菌及真菌的抗微生物活性，其最 低抑制浓度在mM范围。兔NP-1和NP-2是比这类中的其它防卫素更 有潜力的抗微生物剂。其它哺乳动物抗微生物肽包括鼠隐素 (cryptdin)、牛粒细胞细菌素(bactenecin)和indolicidin、以及来自牛精 液的精液胞质素。其它两栖类抗微生物剂包括PGLX、XP、LPF、CPG、 PGQ、来自多彩铃蟾的铃蟾抗菌肽、来自东方铃蟾的铃蟾抗菌肽类的 肽BLP-1、-2、-3和-4、以及来自一食用蛙的短杆菌素(brevinin)。无 脊椎动物例如马蹄形螃蟹可以是诸如tachyplesin(I、II和III)和 polyphemusin(I和II)的抗微生物肽。
这类抗微生物剂中的肽通常是阳离子性的，并且可以具有广谱的 抗微生物活性，包括抗细菌和抗真菌活性。添加带正电荷的残基可以 增强几倍的抗微生物特异活性。正电荷被认为有助于肽插入到易感生 物的膜中，其中肽分子的结构可以形成孔并且引起离子和其它代谢物 的流出。例如，Moses sole鱼神经毒素33残基肽pardaxin的结构研究 揭示了琥珀酰化的pardaxin比未改性pardaxin更缓慢地插入红细胞和 膜模型(Shai，Y et al.，J.Biol，Chem.265：20，202-20，209，1990)。带正电荷 的爪蟾抗菌肽分子可以瓦解大肠杆菌的代谢和线粒体的电势 (Wseterhoff ，H.V.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.86：6597-6601，1989)。
新的肽，例如杀菌肽-蜂毒肽杂合物、以及合成的D-对映体，具 有抗微生物活性(Merrifield，R.B.et al.，“抗微生物肽”Ciba Foundation Symp.186，Hohn Wiley，Chichester，pp.5-26，1994)。这样合成的杀菌肽-蜂 毒肽抗耻垢分枝杆菌的活性大于利福平5倍。
靶向部分可以是对特定靶生物具有亲和性的植物蛋白质，例如， 具有多糖亲和性的凝集素蛋白质类物质。
靶向部分可以是包含很大比例的带正电荷氨基酸残基的合成肽， 例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、和合成的杂多肽。这种肽可以 是化学合成的或者是在重组生物体中生物生产的；在后一种情况中， 靶向部分肽可以是作为较大蛋白质的一部分(例如作为N-末端残基)， 并从较大的蛋白质中切割下来。如果对靶生物具有足够的亲和性，适 合作为“主链”和“桥”部分的多肽也适合作为靶向部分。靶向部分 可以通过这里描述的各种方法来合成和选择或富集。
靶向部分不必限制为是肽的组成，还可以是凝集素、多糖、类固 醇、金属有机复合物。靶向部分的构成可以是由氨基酸和糖如粘多糖 组成。一种有用的靶向部分可以是部分脂类和部分是肽的性质，例如 低密度脂蛋白。
血清脂蛋白特别是高密度和低密度脂蛋白(HDL和LDL)可以结合 到细菌表面蛋白上(Emancipator，K et al.，Infect.Immun.60：596- 601，1992)。HDL和特别是重组的HDL在体外和体内均能中和细菌脂 多糖(Wurfel MM et al.，J.Exp.Med.181：1743-1754，1995)。内源LDL可 以起保护作用，使机体不受内毒素和格兰氏阴性菌感染的致死性影响 (Netea，M.，et al.，J.Clin.Invest.97：1366-1372，1996)。脂蛋白对细菌表面 成分的适宜结合特点可以通过本领域已知的分子生物学方法来鉴别， 并且脂蛋白的结合特点可以用作本发明的光敏剂复合物中的靶向部 分。 候选肽靶向部分的生产和筛选
本发明者发现除了抗体和高亲和性配体对成分外的分子如肽，可 以用来将光敏剂导向到靶生物。以下方法可以用来修饰或改进这里所 发现的靶向部分或用来发现新的靶向部分。
一旦提供了具有合理亲和性的靶向部分，本领域技术人员便可以 通过产生片段或类似物、并且测试新产生结构的亲和性或特异性的改 进，来改变所公开的结构(例如聚赖氨酸多肽的结构)。下面将讨论允 许生产和测试片段和类似物的示例性方法。这些方法可以用来制造是 靶向部分的已知的天然存在的多肽或蛋白质的片段和类似物，如是多 肽，如组氨素(histatin)或低密度脂蛋白，它们中每一个对一种或几种 细菌种的细胞具有结合性亲和力。 片段的产生
蛋白质的片段可以通过重组、蛋白水解消化、化学合成几种方式 来产生。多肽的内片段或末端片段可以通过从编码多肽的核酸的一端 (末端片段)或两端(内片段)除去一个或几个核苷酸来产生。被诱变DNA 的表达产生多肽片段。因此用“末端-(蚕食式)”持续性外切核酸酶的 消化可以产生编码片段序列的DNA。编码蛋白质片段的DNA还可以 通过随机剪切、限制酶切消化或上述方法的组合来产生。
片段还可以通过使用本领域已知的技术例如常规Merrifield固相 f-Moc或t-Boc化学作用来化学合成。例如，本发明的肽可能被任意 地分成所需长度的没有片段重叠的片段，或者分成所需长度的重叠片 段。 类似物的产生：通过随机方法生产改变的DNA和肽序列
蛋白质的氨基酸序列变化体可以通过随机诱变编码蛋白质或蛋白 质一个特定域或区域的DNA来制备。有用的方法包括PCR诱变和饱 和诱变。随机氨基酸序列变体的文库还可以通过合成一组简并寡核苷 酸序列来产生。(在变体文库中筛选蛋白质的方法见本发明的别处)。 PCR诱变
在PCR诱变中，降低的Taq聚合酶保真度用来将随机诱变引入 DNA的克隆片段中(Leung et al.，1989，Techniquel：11-15)。这是一种非 常有效和相对快的引入随机诱变的方法。使用聚合酶链反应(PCR)， 在用Taq DNA聚合酶降低DNA合成保真度的条件下(例如通过使 dGTP/dATP比值为5并添加Mn2+到PCR反应中)，来扩增待诱变的DNA 区域。将扩增的DNA片段库插入到适宜的克隆载体中以提供随机突 变文库。 饱和诱变
饱和诱变允许将大量单个碱基置换引入克隆的DNA片段中 (Mayers et al.，1985，Science 229：242)。该技术包括突变的产生(例如通 过体外化学处理或照射单链DNA)，和互补DNA链的合成。可以通过 调整处理的烈度来调节突变频率，并且基本上可以获得所有可能的碱 基置换。由于这个过程不涉及突变片段的基因选择，因而可获得中性 置换和改变了功能的置换。点突变的分布不偏向于保存的序列元件。 简并寡核苷酶
同系物文库还可以从一组简并寡核苷酸序列中产生。简并序列的 化学合成可以在自动DNA合成仪中完成，然后将合成的基因连接到 合适的表达载体中。简并寡核苷酸的合成为本领域所已知(例如参见 Narang，SA(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura et al.(1981)Recombinant DNA，Proc 3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，ed.AG Walton， Amsterdam：Elsevier pp273-289；Itakura et al.(1984)Annu.Rev.Biochem. 53：323；Itakura et al.(1984)Science 198：1056；Ike et al(1983)Nucleic Acdid Res.11：477)。这种技术已被运用于其它蛋白质的定向进化(例如参见， Scott et al.(1990)Science 249：386-390；Roberts et al.(1992)PNAS 89：2429- 2433；Devlin et al.(1990)Science 249：404-406；Cwirla et al.(1990)PNAS 87：6378-6382；以及US专利5,223,409；5,198,346和5,096,815)。 类似物的产生：通过定向诱变生产改变的DNA和肽序列
非随机或定向诱变技术可以用来在特定区域中提供特定序列或突 变。这些技术可以用来生产蛋白质已知氨基酸序列残基的变体，包括 例如缺失、插入或置换。突变的位点可以单个地或系列地进行修饰， 例如通过(1)先用保守的氨基酸置换，然后根据达到的结果用更多的自 由基选择置换，(2)造成靶残基缺失，或(3)邻近于定位的位点插入相同 或不同类的残基，或者选择性结合1-3。 丙氨酸扫描诱变
丙氨酸扫描诱变是一种有用的鉴定所需蛋白质某些残基或区域的 方法，其中所说的蛋白质是诱变优选的位置或域(Cunningham and Wells，Scenice 244：1081-1085，1989)。在丙氨酸扫描中，鉴定出靶残基 的残基或基团(例如带电残基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并被置换 成中性或带负电的氨基酸(首选丙氨酸或聚丙氨酸)。氨基酸的置换可 以影响氨基酸和细胞内或外周围含水环境的相互作用。然后，通过在 置换的位点或为置换的位点引入另外或其它的变体来精修表现出对置 换功能性敏感的那些域。因此，当预确定了用于引入氨基酸序列变体 的位点时，突变自身的性质不需要预确定。例如，为优化在指定位点 的突变的性能，可以在靶密码子或区域处进行丙氨酸扫描或随机诱 变，并且筛选表达的所需蛋白质亚单位的变体来最佳组合所需的活 性。 寡核苷酸介导诱变
寡核苷酸介导诱变是一种有用的制备DNA置换、缺失或插入变 体的方法(例如参见Adelma et al.，DNA 2：183，1983)。简单地说，所需 的DNA由将编码突变的寡核苷酸和DNA模板杂交来改变，在此，模 板是质粒的单链形式或包含着所需蛋白的DNA序列的未被改变的或 野生型DNA序列的噬菌体。杂交后使用DNA聚合酶来合成模板的完 整第二互补链，以使模板因此掺入寡核苷酸引物，并在所需蛋白质DNA 中编码所选择的改变。通常，使用长度为至少25个核苷酸的寡核苷 酸。最适的寡核苷酸具有12-15个核苷酸，完全互补于模板上编码突 变的核苷酸两侧的序列。这就确保了寡核苷酸与单链DNA模板分子 的正确杂交。通过使用本领域已知的技术如Crea et al.(Proc.Natl. Acad.Sci.USA，75：5765，1978)所描述的可容易合成寡核苷酸。 盒式诱变
另一种制备变体的方法盒式诱变是基于Wells et al.所述的技术 (Gene 34：315，1985)。起始原料是包含待突变的蛋白质亚单位DNA的 质粒(或其它载体)。识别出待突变的蛋白质亚单位DNA中的密码子。 必须有一种识别突变位点两侧的独特的限制内切核酸酶。如果没有这 种限制位点存在，则可以通过使用上述寡核苷酸介导诱变的方法将其 引入到所需蛋白质亚单位DNA中的合适位置来产生所说的限制位点。 在将限制位点引入质粒之后，在这些位点处切割质粒使其线性化。使 用标准工艺合成一用来编码限制位点之间的DNA序列但含所需突变 的双链寡核苷酸。分别合成两条链然后使用标准技术将其杂交在一 起。该双链寡核苷酸被称为盒。将该盒设计成具有可和线性化质粒的 末端相比较的3’和5’末端，从而使它可以直接连接到质粒上。此 时该质粒包含突变的所需蛋白质亚单位DNA序列。 组合诱变
还可以使用组合诱变来产生突变。例如，将同系物或其它相关蛋 白质的氨基酸序列进行排列，以优选促进可能的最高同系性。可以选 择在排列序列的给定位置处出现的所有氨基酸，来产生组合序列的一 套简并。通过核酸水平的组合诱变产生变体的斑驳文库，并且通过斑 驳基因库来编码。例如可以将合成的寡核苷酸混合物酶促连接到基因 序列中以致潜在序列的简并组可表达为个体肽，或者可表达为一组含 简并序列组的较大融合蛋白。 肽片段或同系物的筛选文库用初级高流通量方法
在所得基因产物的筛选领域中已知有各种技术。筛选大文库的技 术通常包括将有用的核苷酸克隆到可复制的表达载体中，用所得的载 体文库转化适宜的细胞，并且在检测(例如此情况下)结合靶生物或靶 生物表面组成所需活性的条件下表达基因。该技术有助于载体的相对 容易分离，所说的载体是用来编码检测其产物的基因的。下面所述的 每种技术均符合筛选大量制造的序列(例如通过随机诱变技术)的高流 通量分析。 展示文库
在筛选试验的一种方式中，候选的肽被展示在细胞或病毒性颗粒 的表面，并在“淘选试验”中检测特别的细胞或病毒颗粒通过展示产 物结合适宜的靶生物的能力。例如，可以将基因文库克隆到用于细菌 细胞表面膜蛋白的基因中，并通过淘选试验来检测所得的融合蛋白 (Ladner et al.，WO88/06630；Fuchs et al.，(1991)Bio/Technology 9：1370- 1371；和Goward et al.，(1992)TIBS 18：136-140)。在相似的方式中，可以 使用一种可检测的标记配体来评价潜在功能性的肽同系物。荧光标记 的配体，例如靶生物，可以用来检测保留配体结合活性的同系物。使 用荧光标记的配体，允许细胞可在荧光显微镜下被目测检查与分离， 或者，当细胞的形态允许时，通过荧光激活的细胞分选仪来分离。
基因文库可被作为融合蛋白表达在病毒颗粒的表面上。例如，在 丝状噬菌体体系中，外来肽序列可以被表达在感染性噬菌体的表面， 由此带来了两个显著的好处。首先，由于这些噬菌体可以完全超过1013 噬菌体/毫升的浓度被应用到亲和基质中，因而可在同一时间里筛选大 量的噬菌体。其次，由于每种感染性噬菌体在其表面展示一种基因产 物，如果一特定噬菌体从亲和基质中以低产量回收，则该噬菌体可以 通过另一轮的传染来扩增。噬菌体展示库中最经常使用的是差不多相 同的大肠杆菌丝状噬菌体群M13、fd和fl。噬菌体gIII或gVIII外壳 蛋白均可以用来产生融合蛋白而不破坏病毒颗粒的最终包装。外来表 位可以被表达在pIII和噬菌体的NH2-末端，此噬菌体携带了从大量缺 乏这种表位的噬菌体中回收的表位(Ladner et al.，PCT出版物 WO90/02909；Garrard et al.，PCT出版物WO92/09690；Marks et al.，(1992) J.Biol.Chem.267：16007-16010；Griffiths et al.，(1993)EMBO J 12：725- 234；Clackson et al.，(1991)Nature 352：624-628；以及Barbsa et al.，(1992)PNAS 89：4457-4461)。
通用方式是使用大肠杆菌的麦芽糖受体(外膜蛋白，LamB)作为肽 融合配偶体(Charbit et al.，(1986)EMBO 5,3029-3037)。寡核苷酸被插入 到编码LamB基因用的质粒中，以产生融合到一种蛋白质的细胞外环 光敏剂(loophotosensitizer)中的肽。可利用这些肽来结合配体，例如抗 体，并且当细胞被施用于动物时可以引出免疫应答。其它细胞表面蛋 白例如OmpA(Schorr et al.，(1991)Vaccines 91，PP.387-392)、 PhoE(Agterberg，et al.，(1990)Gene 88，37-45)、和PAL(Fuchs et al.， (1991)Bio/Tech 9，1369-1372)，以及大细菌表面结构已充当了肽展示用 的载体。肽可以被融合成菌毛蛋白，这是一种聚合形成菌毛(用于遗传 信息的细菌间交换的管道)的蛋白质(Thiry，et al.，(1989)Appl.Environ. Microbiol.55，984-993)。由于它在和其它细胞相互影响中的作用，菌 毛提供了将肽呈现到细胞外环境的有用的支持。另一种用于肽展示的 大的表面结构是细菌运动器官--鞭毛。肽融合到亚单位蛋白质鞭毛蛋 白中提供了在宿主细胞上很多肽拷贝的致密排列(Kuwajima et al.， (1988)Bio/Tech.6，1080-2083)。其它细菌种类的表面蛋白也充当了肽 融合的配偶体。其实例包括葡萄球菌属蛋白A和奈瑟氏球菌属的外膜 IgA蛋白酶(Hasson et al.，(1992)J.Bacteriol.174，4239-4245；Klauser et al.，(1990)EMBO J.9，1991-1999)。
在上述的丝状噬菌体系统和LamB系统中，在肽和编码它的DNA 间的物理连接是通过在其表面载有肽的颗粒(细胞或噬菌体)中包含 DNA来实现的。捕获肽就捕获了颗粒及其中的DNA。另一种方案是 使用DNA结合蛋白LacI来形成肽和DNA之间的连接(Cull et al.，1992，PNAS USA 89：1865-1869)。该系统使用含LacI基因的质粒， 该基因在其3’末端具有寡核苷酸克隆位点。在通过阿拉伯糖的受控 诱导条件下，产生了LacI-肽融合蛋白。这种融合保留了LacI结合已 知为LacO操纵基因(LacO)的短DNA序列的天然能力。通过在表达质 粒上装配LacO的两个拷贝，LacI-肽融合体紧密地结合成编码它的质 粒。由于每个细胞中的质粒仅包含单一寡核苷酸序列，且每个细胞仅 表达单一肽序列，因此肽变得和指导其合成的DNA序列特定地和稳 定地关联。将文库的细胞温和地溶解并将肽-DNA复合物置于固定化 受体中，来回收含活性肽的复合物。然后，将关联的质粒DNA再引 入到扩增和DNA测序用的细胞中，来决定肽配体的同一性。正如方 法的实际应用所展示的，在抗阿片样肽强啡肽B的单克隆抗体上制造 和选择一种十二肽的大随机库。回收一大群的肽，都与对应于强啡肽 B六个残基部分的一个共有序列相关联(Cull et al.，(1992)Proc.Natl. Acad.Sci.USA89-1869)。
这个方案，有时被称作“质粒上的肽”，与噬菌体展示方法有两 个重要方面的不同。首先，肽附着在融合蛋白的C末端上，造成文库 成分展示为具有自由羧基末端的肽。两种丝状噬菌体外壳蛋白，pIII 和pVIII，都通过其C末端被固着在噬菌体上，并且客体肽被放入向 外扩展的N-末端域中。在一些设计中，噬菌体展示的肽恰好呈现在融 合蛋白的氨基末端处(Cwirla et al.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，6378-6382)。第二个不同是文库中确实存在影响肽总数的生物学倾 向性的设定。将LacI融合分子包含在宿主细胞的细胞质中。在翻译过 程中将噬菌体外壳融合短暂地露置到细胞质中，它通过内膜快速分泌 到周质区，通过其C末端的疏水域保持固定在膜中，其包含肽的N- 末端，突出到周质中等待装配到噬菌体颗粒中。它们暴露于不同蛋白 水解活性的结果是LacI和噬菌体文库中的肽可以明显不同。噬菌体外 壳蛋白需要先行转运穿过内膜和信号肽酶加工来掺入到噬菌体中。某 些肽对这些过程产生有害影响并且未被充分表现在文库中(Gallop et al.，(1994)J.Med.Chem.37(9)：123-1251)。这些特定的倾向性不是LacI展 示体系中的因素。
可从重组随机库中获得的短肽的数量是巨大的。通常制备107-109 个独立克隆的文库。已经建立了大到1011个重组体的文库，但这个大 小接近了克隆库的实际限度。文库大小的限度发生在将含随机化片段 的DNA转化到宿主细菌细胞的步骤中。为跨跃这个限度，最近已发 展了基于多核糖体复合物中新生肽展示的体外系统。这个展示文库方 法具有产生比目前可得的噬菌体/噬菌粒或质粒文库大3-6数量级量度 的文库的潜力。此外，文库的构造、肽的表达、和筛选，是以完全不 含细胞的模式完成的。
在该方法的一个应用中(Gallop et al.，(1994)J.Med.Chem.37 (9)：1233-1251)，构造一编码1012十肽的分子DNA文库，文库表达在 体外偶联转录/翻译系统的大肠杆菌S30中。选择条件以把核糖体停顿 到mRNA上，使多核糖体中RNA的主要部分积累，并产生含仍连接 在其编码RNA上的新生肽的复合物。多核糖体足够粗壮以致被亲和 纯化在固定化受体中，其方式与筛选较常规重组肽展示文库的方式相 同。从结合的复合物中回收RNA，转化成cDNA，通过PCR扩增来 产生下一轮合成和筛选用的模板。多核糖体展示方法可以和噬菌体展 示体系相偶联。在几轮筛选之后，将来自多核糖体富集库的cDNA克 隆到噬菌粒载体中。该载体既充当肽表达载体，展示融合到外壳蛋白 中的肽，又充当鉴定肽用的DNA测序载体。通过将多核糖体表达到 噬菌体上，既可以按这种模式继续亲和选择，也可以测定单个克隆上 的肽在噬菌体ELISA中的结合活性，或在完成噬菌体ELISA中的结 合特异性(Barret et al.，(1992)Anal.Biochem 204，357-364)。为鉴定活性 肽的序列，可对由噬菌粒宿主产生的DNA测序。 二次筛选
为鉴定、富集和选择对生物本体具有适宜亲和性的分子，在上述 高流通量试验之后继续二次筛选。二次筛选根据的是靶向部分结合有 用聚合物的能力。例如，可以用所需靶生物的表面蛋白或碳水化合物 来鉴定通过上述一种初级筛选所分离的肽片段组中的配体。可以使用 从重组生物中获得的高纯材料，例如，来自病毒性病原体的纯化蛋白， 从为获得此材料的目的而特别得到的重组生物中获得，或者可以使用 靶生物的粗制备品，例如细胞壁或表膜制备品，即使是靶生物的热失 活或福尔马林处理的制备品。
下面的实施例举例说明了两种示例的靶向原料，带正电荷的聚氨 基酸--聚赖氨酸(对很多细菌品种具亲和性并且也可以充当偶联附加靶 向部分的主链)；和唾液蛋白组氨素(histatin)(对几种口腔细菌具亲和 性)。每种原料均可以用作这里所述的描述噬菌体展示文库过程中的起 始材料，例如把核酸序列掺入到M13噬菌体展示载体的基因III序列 中(例如参见Scott et al.，(1990)Science 249：386-390；Roberts et al.，(1992) PNAS 89：2429-2433；Devlin et al.，(1990)Science 249：404-406；Cwirla et al.，(1990)PNAS87：6378-6382；以及US专利5,223,409；5,198,346和 5,096,815)。此时，富集噬菌体文库用的靶向材料可以是细胞壁组分， 该细胞壁组分的获得方法是，在标准蛋白酶抑制剂的存在下冷超声处 理靶生物、低速离心分离细胞壁和细胞质、并且将壁原料再悬浮于缓 冲剂中以便在多次的噬菌体文库结合选择中使用。该过程在US专利 5,233,409中有详细描述。经过二至三次的选择之后，可以分离出携带 聚氨基酸序列或对靶细胞壁亲和性的组氨素(histatin)变体的噬菌体， 该细胞壁能比起始材料显著地被促进。被改进的变体的序列可通过标 准DNA测序过程被容易测得，且肽可以通过标准肽合成方法大量地 产出。因此，这里所述的产生片段和类似物以及检测其对靶生物增强 的亲和性的方法是本领域已知的。 靶生物
本发明组合物和方法所靶向的生物出现在任何光可及的表面上或 在光可及的区域内(例如在人和动物患者之中)、在需要去污染的原料 上、或在农作物上。对人和动物而言，表皮、口腔、鼻腔、窦、耳、 肺、生殖泌尿道和胃肠道的感染是光可及的。表皮感染包括不希望的 生物细菌、真菌、病毒和动物源的感染，并且包括皮下感染特别是局 部损害，例如由原虫、寄生虫或寄生螨引起的，这些感染均是光可及 的。腹膜腔感染，例如由突发性阑尾炎引起的，至少通过腹腔镜装置 是光可及的。通过抗菌治疗或长期抗真菌治疗难治的各种皮肤感染， 例如趾甲的皮真菌(dermatophycoses)，是适合于使用本发明组合物的 PDT。
本发明组合物和方法应用的一个主要领域是口腔如牙龈的疾病和 感染。本发明的方法对治疗口部感染疾病是特别有效的，例如牙周疾 病。由于牙周疾病感染的囊发生在口腔表面的几个毫米间，PDT提供 了优于该病症传统物理方法刮治术和抗菌治疗的显著优点。口腔不希 望的靶生物包括大量细菌和真菌种类，例如拟杆菌属类，包括 B.gingivalis(现在已知为牙龈卟啉单孢菌)、啮蚀艾肯氏菌、核粒梭杆 菌、直肠弯曲杆菌、真杆菌属种、中间普雷沃氏菌(拟杆菌)、福赛斯 拟杆菌、二氧化碳嗜纤维菌属种、伴放线放线杆菌，和变异链球菌。
肺感染可以随多种属和种的细菌出现，包括传统肺结核的乳生结 核分枝杆菌、假单胞菌属(造成囊纤维变性患者死亡的首要原因)、克 雷伯氏杆菌属，并且还可以随多种病毒株出现。多种真菌和寄生物是 肺的机会病原体，卡氏肺囊虫感染是免疫妥协的AIDS患者死亡的通 常原因。随着耐传统抗菌治疗的肺病原体的增加，本发明组合物PDT 提供了另一种消除与微生物耐受机制无关的不希望的生物的方法。其 它表皮感染和较深组织的感染起因于烧伤、擦伤、割伤和刺伤。用本 发明的PDT对消毒这种潜在感染位置是有用的(可以快速导致中毒性 休克，枪弹伤所时常伴生的)，并且对治疗这些位置以消除或减少不希 望的感染性生物是有用的。伤口特别是烧伤感染的主要原因是格兰氏 阴性需氧菌假单胞杆菌属。该生物产生显示为延迟伤口愈合的外毒 素。多抗菌素抗性的铜绿假单胞杆菌是越来越明显的问题，尤其是在 大医院的烧伤部。假单胞杆菌属还产生角膜的暴发性感染。大肠杆菌 以及金黄色葡萄球菌是两种感染伤口的最常见细菌。
不希望的靶生物的其它位置包括生殖泌尿道、腹膜腔、内耳和外 耳、鼻腔和胃肠道。不希望的靶生物在间皮和内皮源的组织中增生的 感染位置通过应用最低侵入性技术也是PDT可及的。
靶生物可以是细胞或病毒。可以是不希望生物体的病毒包括含有 至少一种核酸分子和一种或多种蛋白的任何致病生命型，还可以包括 有包膜的病毒。细胞性靶生物包括至少一种界面细胞膜，并且能够产 生能量、合成核酸，并包含核糖体和能够进行核糖体蛋白合成。细胞 可以是单细胞的或多细胞的，并且所说的单细胞生物可以是原核生物 或真核生物。
原核靶生物可以是细菌，细菌可以是格兰氏阴性或格兰氏阳性， 或是缺少细胞壁的。区分细菌的格兰氏染色基础是本领域技术人员已 知的，根据特定株或种的细菌是否吸收染料，或者仅用复染剂着色。 为本发明靶生物的细菌可以是需氧的、厌氧的、兼性厌氧的或微需氧 的。本发明的螺旋体包括(但不限于)，疏螺旋体属和密螺旋体属。后 一种属包含了与战壕嘴(trenchmouth)、品他病和雅司疹疾病有关的各 种菌种，后两种是热带皮肤感染。适合作为靶生物的格兰氏阴性螺旋 状/弧菌状能动细菌属包括弯曲杆菌属和卷旋杆菌属。格兰氏阴性需氧 和微需氧性杆菌和球菌包括博德特氏杆菌属、奈瑟氏球菌属和军团菌 属。兼性厌氧格兰氏阴性杆菌包括假单胞菌属、沙门氏菌属、志贺氏 菌属、欧文氏杆菌属、肠杆菌属、欧文氏杆菌属、埃希氏杆菌属、弧 菌属、嗜血杆菌属、放线芽胞杆菌属、克雷伯氏杆菌属和沙门氏菌属。 作为本发明靶生物的一个重要细菌组是格兰氏阳性球菌，包括葡萄球 菌属和链球菌属，后者的一个菌株已知可引起各种感染，包括儿童皮 肤疾病脓疱病，而前者的一些菌株被通常称为“食肉细菌”。适于通 过本发明方法和组合物处理的格兰氏阳性杆菌包括利斯特氏菌属。
在缺少刚性细胞壁的细菌中，适合于光敏剂组合物处理的细菌是 枝原体属。适合本发明的放线菌纲的靶生物包括分枝杆菌属中的几个 种。可用本发明的共轭分子处理的其它细菌属包括：肠球菌属、钩端 螺旋体属、小蛇菌属、枝原体属、类杆菌属、耶尔森氏菌属、衣原体 属、弧菌属、放线芽胞杆菌属、卟啉单孢菌属、嗜血菌属、巴斯德氏 杆菌属、消化球菌属、原粘杆菌属和嗜皮菌属。本领域技术人员可来 认知没有在这里列举的这些及其它细菌族或属中适合本发明组合物的 靶向细菌。
可以被本发明组合物靶向的病毒包括(但不限于)腺病毒、疱疹病 毒、痘病毒、和反录病毒。真菌靶生物的代表属包括(但不限于)隐球 酵母属、芽生菌属、副球孢子菌属、念珠菌属、曲霉属、Mycetoma， 而且包括引起各种皮真菌病的其它属。
本发明的真核靶生物包括单细胞原虫和真菌病原体和寄生虫，其 可以具有多细胞期的生活史。患者的寄生虫感染是适合通过本发明组 合物治疗的。感染或移生肠道和泌尿生殖道的常见寄生虫包括变形 虫、鞭毛虫和线虫。此外，吸虫、绦虫、纤毛虫、球虫、微孢子虫寄 生虫的感染也会发生在这些管道中。利什曼原虫属和盘尾丝虫属的寄 生虫引起皮肤溃疡，在眼部的角膜瘙痒病(scrapings)中发现了棘头虫 属(Acanthamoeba)的寄生虫。杜诺丸氏利什曼原虫引起热带溃疡皮肤 病--黑热病，它适合于用本发明的方法和组合物来治疗。适合本发明 组合物所靶向的肠道属包括内变形虫属、贾第虫属、潜隐孢子虫属 (Cryptosporidium)，以及微孢子虫、蛲虫和蠕虫属。肺组织可以包含 卡氏肺囊虫，以及更罕见的变形虫例如内变形虫属、吸虫或绦虫。生 殖泌尿道可以被毛滴虫属和血吸虫属感染，可以通过本发明的组合物 来治疗。
病毒，原核或真核靶生物不只限于病原体和寄生虫，还可以包括 较高等级的生物如节肢动物。靶生物不仅限于动物患者的病原体和寄 生虫，还可以包括植物害虫。
这些列举是用来举例说明本发明在主要族的适宜靶生物中的应 用，而不是将本发明划界到所列举的种、属、科、目或纲上。 药用组合物
本发明的化合物包括配制用来局部给药的共轭物分子，还包括给 药于各种外表器官如外耳，或外部给药(例如通过口腔施用或通过洗肺) 可及的器官。这里所提及的实例不是要限制本发明共轭光敏剂的性质 或具体给药途径，这里也列举了其它途径。在本发明的另一个实施方 案中，光敏剂组合物可以通过组合治疗(即和其它药剂组合)来给药。 例如，组合治疗可以包括本发明的组合物和至少一种其它光敏剂、至 少一种抗菌素或其它常规的治疗。
多少有些不溶于水溶剂的光敏剂共轭物可以脂质体、或缓释的形 式使用，以致可以运用间歇式照明，即使用照明期间与不照明期间交 替的制度。用到的其它制度是连续期间的较低程度的照射，对此缓释 制剂是适宜的。
这里所说的术语“可药用载体”包括任何和所有生理相容的溶剂、 分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这些介质 和配剂对于药物活性物质的用法为本领域所公知。优选地，载体对口 腔、静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮给药(例如通过注射或 输注)是适宜的。依据给药的途径，活性化合物可以被涂包在原料之中， 以保护化合物免受酸和其它可能失活化合物的自然条件的影响。
本发明的共轭物也可以非肠道给药。这里所说的术语“非肠道给 药”意思是指除口腔和局部给药外的给药方式，通常是通过注射，包 括而非限定于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、 真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、 脊柱内、硬膜外、和胸骨内的注射和输注。
本发明的组合物可以通过本领域已知的各种方法给药。正如技术 人员都欣赏的，给药的途径和/或方式是根据所期望的结果来改变的。 可以用防止化合物快速释放的载体来制备活性化合物，例如受控释放 制剂包括植入剂、经皮补片、微囊化给药系统。可使用生物降解性、 生物相容性的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、 聚原酸酯和聚乳酸。这些制剂的很多制备方法都申请了专利或为本领 域的技术人员所公知。例如参见，《持续和控制释放药物的给药系统》 (Sustained and Controlled Release Drug Delivery System) J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker Inc.，NewYork，1978。
调整剂量制度来提供最佳的所需应答(如治疗应答)。例如，可以 用单独一个大丸剂给药，可以在一定时间内以数份分开的剂量给药， 或者按照治疗情形的要求所指示的按比例减少或增加剂量。
本领域的普通技术人员可以确定和开出处方给出所需药物组合物 的有效量。例如，开始可以服用比为达到所期治疗效果所需水平低的 已知或新光敏剂组合物的剂量，并且逐渐增加剂量直至达到所期望的 效果。 其它实施方案
本发明的组合物可以用来消毒无生命的物体，例如医用和牙用装 置、热敏滤器、透照器表面、超声处理用探测器、以及光可及的和带 有不希望的生物的任何其它表面。很多这些装置是不能进行高压灭菌 的，此时本发明的方法和组合物对其消毒可以是有用的。
本发明的方法和组合物可以掺入到试剂盒中，试剂盒包含一种或 多种可以或可以不偶联到主链上的光敏剂、一种或几种靶向部分、偶 联剂或交联剂、缓冲剂以及使用的指令。试剂盒的使用者可以选择适 宜的靶向部分来应用到所选特定的不希望的生物中。可以将两种或多 种靶向部分偶联到光敏剂-主链上，以便可以通过单独使用一种产品消 除或者基本上减少较广范围的不希望的生物。
本发明将通过以下的实施例作进一步的举例说明，这些实施例不 应当解释为进一步的限定。本申请中提及的所有参考文献、待审查的 专利申请和公开的专利均引入这里作为参考。 实施例 实施例1制备带不同电荷的聚赖氨酸-二氢卟酚e6共轭物
通过将1.5当量的二环己基碳二亚胺和1.5当量的N-羟基琥珀酰 亚胺、与1当量的二氢卟酚e6(图1A中的分子I)、或其它光敏剂在无 水二甲基亚砜(DMSO)中反应，形成NHS-酯(图1A中的分子II)，来制 备光敏剂二氢卟酚e6的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯。在以光敏剂二氢 卟酚e6为例子的实施例中，所述的所用原料的制备过程也适合于制 备苯并卟啉衍生物的酯，或任何含羧基的四吡咯光敏剂的酯。经过在 室温下黑暗处保温24小时后，将NHS按等分试样进行冷冻以便进一 步使用。将L或D光学构型的、且具一定分子量范围的氢溴酸聚赖氨 酸(图1B的分子III)(HBr，50mg)(分子量40,000-60,000，相当于 22,000-33,000个游离的聚赖氨酸自由碱基)溶解于50ml无水DMSO 中，并加入N-乙基吗啉(1ml)。向该溶液添加含光敏剂-NHS酯(25mg) 的无水DMSO(1ml)。将溶液在室温下黑暗处保温24小时，以合成聚 赖氨酸二氢卟酚e6(图1B中的分子III，以及图1C中所示的)。
进行如下的电荷修饰。
为中和聚赖氨酸上的正电荷，将所得分子和酰化剂乙酸酐反应。 将聚赖氨酸二氢卟酚e6共轭物(图1D中的分子III)溶液的样品用过量 的乙酸酐(100mg溶于0.5ml无水DMSO)处理，产生不带电的中性乙 酸酰胺共轭物。所得分子不带电。可以改变这些条件来产生带其它电 性的分子。这允许制造和测试各种可能性，并且选择出对特定共轭物 或靶生物而言是最好的应用。
为把聚赖氨酸上的正电荷转变成负电荷，将分子和酰化剂琥珀酸 酐反应。将聚赖氨酸二氢卟酚e6共轭物在DMSO中的样品用过量的 琥珀酸酐(100mg溶于0.5ml无水DMSO)处理，产生琥珀酸酰胺，并 且将带正电的氨基基团转变成成了带负电荷的羧酸基团。可以改变这 些条件来产生其它带电性的分子。这允许制造和测试各种可能性，并 且选择出对特定共轭物或靶生物而言是最好的应用。
在将共轭物分子、和酰化修饰的共轭物在室温下黑暗处保温24 小时之后，将溶液转移到具有正确分子量截止的透析管中，以允许使 用耐DMSO的透析原料透析聚赖氨酸，并对改换3次的10mM磷酸 缓冲剂(pH7)进行透析24小时。图1D中显示了分子V，对二氢卟酚e6 聚赖氨酸乙酸酰胺中性共轭物来说，R基团表示-COCH3，而对二氢卟 酚e6聚赖氨酸琥珀酸酰胺来说，R基团表示-COCH2CH2COOH。 实施例2 制备带不同电荷的组氨素(histatin)-二氢卟酚e6共轭物
将组氨素(histatin)-5(10mg)溶解于2ml 0.1M的Na2CO3缓冲剂中 (pH9.5)，并且和含5mg二氢卟酚e6 N-羟基琥珀酰胺(如实施例1所 述制备的)的0.1ml DMSO混合。通过在室温下黑暗处保温24小时来 进一步继续反应，并且将溶液对10升的PBS透析三次。将所得的绿 色沉淀溶解在2ml 0.1M Na2CO3缓冲液中(pH10.5)。
吸收光谱测定表明，假定二氢卟酚e6在400nm下的消光系数不 被络合作用改变，即为1.5×105M-1，cm-1，且所有二氢卟酚e6在透析 后都保持共价连接在组氨素(histatin)上，则可确定每个组氨素 (histatin)-5肽链上连接4个二氢卟酚e6分子。虽然组氨素(histatin)-5 为碱性，但共轭物却被发现是酸性的，这是由于赖氨酸的氨基被二氢 卟酚上的两个羧基所取代。其结构示于图1C中。
组氨素(histatin)与二氢卟酚e6的比率通过改变反应中的两者的比 率而得到改变。 实施例3 制备带不同电荷的组氨素(histatin)-聚赖氨酸-二氢卟酚e6共 轭物
将实施例1中所说的聚赖氨酸二氢卟酚e6的DMSO溶液用N-琥 珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)的DMSO溶液处理，以形成 聚赖氨酸二氢卟酚e6-SPDP(图2A中的分子VI)。用量依赖于聚赖氨 酸的分子量，但应当是多聚物链的约三至四当量。将反应在室温下黑 暗处保温24小时。将聚赖氨酸-光敏剂-SPDP溶液如上透析。
将组氨素(histatin)(或其它含至少一个赖氨酸残基的多肽，5mg)溶 解于2ml磷酸缓冲液中(SATA，50mM，pH7.5，含1mM EDTA)并用N- 琥珀酰亚胺-S-硫代乙酸酯(0.5mg溶于DMSO，100μl)在室温下处理(如 图2B的反应6所示)，形成SATA-组氨素(histatin)(图2B中的分子IX)。 然后用200μl含盐酸羟胺0.5mM、EDTA 25mM和磷酸钠50mM的溶 液(pH7.5)处理肽溶液，并且在室温下保温2小时，形成脱保护的SATA 衍生物(图2B中的分子X)。然后将该溶液在P4柱上脱盐并且用含 10mM EDTA的磷酸缓冲剂(50mM，pH7.5)洗脱。产生含自由巯基的肽。
然后，将聚赖氨酸二氢卟酚e6的含自由巯基衍生物的肽(图2A 中的分子VII)(它可以带正电、中性或带负电)和SPDP以肽和聚赖氨 酸的相对分子量比，在室温下反应24小时。然后在Sephadex G50柱 上纯化该包含肽-聚赖氨酸-二氢卟酚e6共轭物(如图2C所示)的产物。 实施例4 光敏剂二氢卟酚e6共轭物的吸收
将牙龈卟啉单孢菌381--一种格兰氏阴性细菌并且是牙菌斑中的 一种最常见的细菌，在含1％氯化血红素、1％维生素K和5％羊血的 胰胨豆胨琼脂(TSA)中通过每周传代培养来保存。为实验目的，让生 物无氧生长在具有80％N2、10％CO2的室中35℃下48小时，离心收 集并重新悬浮于含1％氯化血红素和1％维生素K的胰胨豆胨肉汤培养 基(TSB)中。将细胞超声分散，并且通过巴氏滴管重复传代。在分光 光度计中用1ml试管测定细胞数(波长600nm下，1 O.D产生108细胞 /ml)，获得各实验用的适宜数量的细菌(吸收研究实验用109细胞/ml， 照射研究用实验用108细胞/ml)。
使用仓鼠颊囊扁平细胞癌细胞系(HCPC-1)的细胞(Odukoya，O.et al.，JNCI 71：6，1253-1258，1983)。让细胞在含高葡萄糖的Dulbecco改良 Eagle培养基(DMEM)(Gibco，Grand Island，NY)中生长，其中培养基补 充了热失活的10％胎牛血清(FCS，Gibon)、100单位/ml的青霉素G和 100μg/ml链霉素(Sigma，St.Louis，MO)。每2-3天换一次培养基并且 每周使用胰蛋白酶-EDTA进行传代。将所有细胞在含12ml生长培养 基的10cm直径的培养皿中维持，于37℃、95％空气5％CO2的潮湿大 气中。
使用以下带正电、负电和不带电的聚-L-赖氨酸与二氢卟酚e6(分 子量1,000-3,000)的本发明的光敏共轭物：聚赖氨酸二氢卟酚e6(阳离 子、未酰化)；琥珀酰化聚赖氨酸二氢卟酚e6(阴离子，聚赖氨酸-二氢 卟酚e6-琥珀酰)；和乙酰化聚赖氨酸二氢卟酚e6(中性，聚赖氨酸-二 氢卟酚e6-乙酰)。合成方法描述于实施例1中。除非另有说明，生长 和维持细菌和动物细胞所用的所有培养基、缓冲剂、溶液和玻璃器皿 均是经过灭菌的。
将牙龈卟啉单孢菌(109细胞/ml)的悬浮液样品一式三份，用1、5 和10μm二氢卟酚e6当量(TSB中的最终浓度)的光敏剂在室温下于暗 处培养1分钟，将细胞悬浮液离心，吸出含光敏剂的上清液并且用1ml 无菌PBS洗涤细菌一次。将细胞再悬浮于1.5ml的0.1M NaOH/1％十 二烷基磺酸钠(SDS)中，培养至少24小时，获得均匀溶液。
在分光荧光计中(型号FluoroMax，SPEX Industries，Edison，NJ)测定 各细胞提取物的荧光度。激发波为400nm，细胞悬浮液的发射光谱记 录为580-700nm。通过改进的Lowry法(Markwell M.A.et al.，Anal.Biochem.87：206，1978)测定各细胞提取物的蛋白含量，使用溶 于0.1M NaOH/1％SDS的牛血清白蛋白作为蛋白标准来作校正曲线。 结果用每mg细胞蛋白吸收的mol二氢卟酚e6来表达。
用胰蛋白酶消化指数生长期的HCPC-1细胞，使用血细胞计数器 计数。用1ml含10％FCS的生长培养基的105细胞接种24-孔培养平 皿的每个孔，培养过夜以允许细胞达到和恢复指数生长。将共轭物一 式三份添加到孔中，具体如下。除去培养基并换成含10％FCS和所说 浓度的共轭物的培养基，将平皿培养1分钟。然后从孔中吸出共轭物 溶液，将细胞用1ml无菌PBS洗涤一次，再用胰蛋白酶-EDTA培养10 分钟。离心所得的细胞悬浮液，吸出胰蛋白酶上清液并将沉淀溶解于 0.1M NaOH/1％SDS中。如上测定每种细胞提取物的荧光度。
如图3和4所示，共轭物的吸收是浓度的函数，其中图3和4分 别表示牙龈卟啉单孢菌和HCPC-1细胞(图的纵坐标相差50倍)。二氢 卟酚e6的吸收是剂量依赖性的。阳离子共轭物的牙龈卟啉单孢菌和 HCPC-1细胞的细胞积聚相比阴离子和中性共轭物在各浓度下分别多2 和2-4倍多。据观察，光敏剂共轭物积聚到细菌中的选择性相比哺乳 动物要高。 实施例5 二氢卟酚e6的光损害性
为确立这些共轭物杀死细菌同时保留哺乳动物细胞的有效性和选 择性，用三个共轭物和两种广泛使用的临床光敏剂--Photofrin II和 benzoporphyrin衍生物(BPD)(QLT Phototherapeutics Inc，温哥华BC)进 行比较。将光敏剂大块固体溶解在1mM DMSO中并用TSB稀释。
将牙龈卟啉单孢菌细胞(108/ml)一式两份用5μm二氢卟酚e6当 量的各共轭物、用Photofrin II和用BPD在室温下暗处培养1分钟。 将细胞离心，用无菌PBS洗涤一次，并加入1ml新鲜TSB。在本实施 例中，牙龈卟啉单孢菌和HCPC-1细胞对阳离子、阴离子和中性共轭 物的每ml细胞蛋白的二氢卟酚e6吸收率分别为46∶1、60∶1和22∶1。
将细菌悬浮液添加到12-孔平皿的孔中，用发光二极管序列在室 温下暗处进行照射，其发出的光为630-710nm波长，其跨度覆盖了这 些光敏剂组合物的最大吸光度。使用0-25J/cm3的能流以65m W/cm2 的辐照度从下曝光培养孔。照射期间将平皿覆盖以保持培养基的无菌 性。经过适宜的照射后，用TSB制备每个孔内含物的系列稀释，并且 一式两份地把100μl等分试样喷在血琼脂平皿上。通过计数平皿上的 菌落并且除以未照射的对照组中的菌落数，来计算每个孔的存活率， 其中未照射的对照是用光敏剂在室温下暗处培养，培养时间与照射的 时间相等。其它对照为：既没有用光敏剂也没有用光处理、并且在室 温下暗处培养的细菌，以及在没有光敏剂存在下经曝光的细胞。
将HCPC-1细胞(2×104在含10％FCS100μl生长培养基的等分试 样中)接种在96-孔平皿中，培养24小时直至70％融合。将每个平皿 的6个孔用5μM的各光敏剂培养，并用如实施例3所述的条件照射。 照射之后，用新鲜培养基在37℃下培养24小时。对照细胞在如实施 例3的条件下培养。照射后24小时，使用MTT微量培养四氮唑盐测 定法(一种评价活细胞的线粒体中脱氢酶活性的方法(Mosmann T.J.Immunol.Methods65-63，1983))测量细胞的存活，并且用经处理细胞 的570nm吸光度除以未照射对照的吸光度来计算存活率。
图5和6显示了共轭物对牙龈卟啉单孢菌光损害性的选择性比哺 乳动物细胞要高。阳离子聚赖氨酸-二氢卟酚e6杀死99.9％的细菌， 而对HCPC-1细胞却少于2％。还显示了中性共轭物聚赖氨酸-二氢卟 酚e6-乙酰的高选择性，它杀死超过90％的细菌但没有杀死HCPC-1 细胞。阴离子共轭物聚赖氨酸-二氢卟酚e6-琥珀酰造成牙龈卟啉单孢 菌的生存力下降66％，但HCPC-1却没有被这种光敏剂所杀死。
相反，PFII和BPD在给定的浓度下没有显示杀灭作用，除了BPD 杀死HCPC-1细胞而不是牙龈卟啉单孢菌。 实施例6 在动物伤口模型中的体内研究
通过使用解剖刀在小鼠的背侧皮上产生一3cm切口，然后接种107 和108c.f.u.的细菌，造成一感染性伤口。通过Stevens，E.J.et al.，J.Bum Care Rehabil.15，232-235，1994中的描述产生一感染性烧伤。在损害周 围或者静脉内注射作用于各细菌的共轭物或未共轭的二氢卟酚e6。有 系统地改变共轭物的剂量、光量、以及注射和照射之间的间隔。通过 观察伤口和烧伤的愈合率来评价治疗应答。治疗后相隔一定间隔取组 织样(2mm穿孔活组织检查)来确定细菌数量，并提供载玻片作病理组 织性评价。通过建成c.f.u./g组织并通过光学监视萤虫素酶转染 P.aeruginosa来定量伤口处的细菌集群。 其它实施方案
这里给出了物理参数值，例如氨基酸残基的分子量或数量，这些 值可以描述表现该值的所有或基本上是所有分子的总体，或该值代表 总体参数的平均、或众多值的分子的总体。通过残基数量或通过分子 量来说明的物理参数，如肽或蛋白聚合物的大小，可以包括残基数量 中或分子量中可能的一定程度的不均匀性，这种不均匀性例如是在这 种聚合物化学合成过程中出现的，并且是可以通过再使用前的纯化过 程减少但一般不能完全消除的。因此，例如一种所说包含10个赖氨 酸残基的聚赖氨酸制备物，可能由80％、90％、95％、99％或99.9％的 这种长度的分子组成，而其余的20％、10％、5％、1％和0.1％可能是 由具有9或8个残基或更少有的11或12个残基的分子组成。
这里所说的共轭物可以通过取代一种或多种在此所述的部分的混 合总体来合成。例如，可以将一种单独光敏剂部分的纯制备物添加到 含主链或靶向部分基质混合物的反应混合物中，来生产共轭物，其中 包含共轭到靶向部分混合物上、或主链或靶向部分化学整体上的单独 类型光敏剂部分。
对于所说的共轭物，可以在使用前在共轭物的配方中形成混合 物，例如，可以将欲用于不希望的生物混合物的配方制备成两个或多 个共轭物的混合物，每个共轭物具有对一种或几种不希望的生物的最 佳亲和性，以便可以减少或消除很多种靶生物。
本发明还包括组氨素(histatin)的片段，优选生物活性片段，或类 似物，例如组氨素(histatin)-5。具有组氨素(histatin)序列特征的生物活 性片段或类似物具有任何体内或体外活性。特别优选的片段是通过从 头合成、蛋白酶剪切或交替拼接而产生的片段，例如活性片段。由于 诸如组氨素(histatin)的肽经常显出一定范围的生理学特征并且由于这 些特征可以归因于分子的不同部分，因此有用的组氨素(histatin)片段 或片段类似物应当在任何组氨素(bistatin)活性生物试验中显出生物活 性。最优选的片段或类似物在任何体外或体内组氨素(histatin)试验中 具有全长度天然存在的组氨素(histatin)的20％的活性。
类似物与天然存在的组氨素(histatin)的区别可以是在于氨基酸序 列不同或以不涉及序列的方式，或者两者都有。非序列变化包括组氨 素(histatin)的体内或体外的化学衍生。非序列变化包括乙酰化、甲基 化、磷酸化、羧基化、糖基化的改变。
优选的类似物，包括组氨素(或其生物活性片段)，其序列可通过 一、二、三、四或五或更多保守氨基酸置换和/或通过一、二、三、四 或五或更多非保守氨基酸置换、缺失而与野生型序列不同，但却并不 消除组氨素的生物活性。保守置换一般包括用一个氨基酸置换另一种 相似特征的氨基酸，例如在以下组中的置换：缬氨酸、甘氨酸；甘氨 酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬 酰胺、谷酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、 酪氨酸。其它保守置换可以取自下表。
属于本发明的其它类似物是那些增加肽稳定性而修饰的类似物； 这种类似物可以在肽序列中包含例如一种或多种非肽键(以取代肽 键)。还包括有：含除天然存在的L-氨基酸(如D-氨基酸)或非天然存 在或合成的氨基酸(如β或γ氨基酸)的残基；以及环状类似物。
与组氨素(histatin)类似物相同，这里所说的术语“片段”一般是 具有足够带来生物活性的长度，例如全长度分子的至少20％的结合活 性。在优选的实施方案中，片段为12个残基长或更长。组氨素(histatin) 片段可以通过这里所述的方法或者通过本领域技术人员已知的方法来 产生。可以通过本领域技术人员已知的方法或者这里所述的方法来评 估候选片段显示组氨素(histatin)生物活性的能力。
为获得组氨素(histatin)多肽，可以将组氨素(histatin)-编码DNA 引入到表达载体中，将载体引入适合表达所需蛋白的细胞中，并通过 现有技术方法回收和纯化肽。优选的组氨素(histatin)肽在体内由融合 到较大蛋白上而产生，在从细胞提取物中初步纯化后，被切割成片段。 优选组氨素(histatin)肽是化学合成的，例如在肽合成仪中。
表1
保守氨基酸的置换 被取代的氨基酸 代码 用任何一种取代 丙氨酸 A D-Ala、Gly、β-Ala 精氨酸 R D-Arg、Lys、D-Lys、高-Arg、D-高-Arg、Met、Ile、D- Met、D-Ile、Orn、D-Orn 天冬酰胺 N D-Asn、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、Gln、D-Glu 天冬氨酸 D D-Asp、D-Asn、Asn、Glu、D-Glu、Gln、D-Gln 半胱氨酸 C 在亲本中没有，因而应用不是优选的 谷氨酰胺 Q D-Gln、Asn、D-Asn、Glu、D-Glu、Asp、D-Asp 谷氨酸 E D-Glu、D-Asp、Asp、Asn、D-Asn、Gln、D-Gln 甘氨酸 G Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、β-Ala酰基载体蛋白(ACP) 异亮氨酸 I D-Ile、Val、D-Val、Leu、D-Leu 亮氨酸 L D-Leu、Val、D-Val、Leu、D-Leu 赖氨酸 K D-Lys、Arg、D-Arg、高-Arg、D-高-Arg、Ile、D-Ile、Orn、 D-Orn 蛋氨酸 M 在亲本中没有，因而应用不是优选的 苯丙氨酸 F D-Phe、Tyr、D-Thr、L-多巴、His、D-His、Trp、D-Trp、 反-3，4或5-苯基脯氨酸、顺-3，4或5-苯基脯氨酸 脯氨酸 P D-Pro、L-1-硫代氮杂环戊烷-4-羧酸、D-或L-1-氧代氮杂 环戊烷-4-羧酸 丝氨酸 S D-Ser、Thr、D-Thr、异-Thr、磷酸丝氨酸 苏氨酸 T D-Thr、Ser、D-Ser、磷酸丝氨酸、异-Thr、Val、D-Val 酪氨酸 Y D-Tyr、Phe、D-Phe、L-多巴、His、D-His 缬氨酸 V D-Val、Leu、D-Leu、Ile、D-Ile
优选的组氨素(histatin)-1类似物是，其中：
R1是asp或缺失
R2是ser或磷酸丝氨酸或缺失
R3是his或缺失
R4是ala或缺失
R5是lys或arg或glu或asp
R6是arg或lys
R7是his
R8是his
R9是gly或ala
R10是tyr或phe
R11是lys或arg
R12是arg或lys
R13是lys或arg
R14是phe或tyr
R15是his
R16是glu或asp
R17是lys或arg
R18是his
R19是his
R20是ser或thr或磷酸丝氨酸
R21是his或缺失
R22是arg或lys或缺失
R23是gly或glu或asp或缺失
R24是tyr或phe或缺失
R25是pro或arg或lys或缺失
R26是phe或tyr或leu或ile或缺失
R27是phe或tyr或leu或ile或thr或ser或缺失
R28是gly或ala或缺失
R29是asp或glu或缺失
R30是phe或tyr或leu或ile或缺失
R31是gly或ala或缺失
R32是缺失或ser或thr或磷酸丝氨酸
R33是缺失或asn或gln
R34是缺失或tyr或phe
R35是缺失或leu或ile或tyr或phe
R36是tyr或phe或leu或ile或缺失
R37是缺失或asp或glu
R38是缺失或asn或gln
优选的组氨素(histatin)-3类似物是，其中：
R1是asp或缺失
R2是ser或磷酸丝氨酸或缺失
R3是his或缺失
R4是ala或缺失
R5是lys或arg或glu或asp
R6是arg或lys
R7是his
R8是his
R9是gly或ala
R10是tyr或phe
R11是lys或arg
R12是arg或lys
R13是lys或arg
R14是phe或tyr
R15是his
R16是glu或asp
R17是lys或arg
R18是his
R19是his
R20是ser或thr或磷酸丝氨酸
R21是his或缺失
R22是arg或lys或缺失
R23是gly或glu或asp或缺失
R24是tyr或phe或缺失
R25是arg或lys或缺失
R26是缺失或ser或thr或磷酸丝氨酸
R27是缺失或asn或gln
R28是缺失或tyr或phe
R29是缺失或leu或ile或tyr或phe
R30是tyr或phe或leu或ile或缺失
R31是缺失或asp或glu
R32是缺失或asn或gln
优选的组氨素(histatin)-5类似物是，其中：
R1是asp或缺失
R2是ser或磷酸丝氨酸或缺失
R3是his或缺失
R4是ala或缺失
R5是lys或arg或glu或asp
R6是arg或lys
R7是his
R8是his
R9是gly或ala
R10是tyr或phe
R11是lys或arg
R12是arg或lys
R13是lys或arg
R14是phe或tyr
R15是his
R16是glu或asp
R17是lys或arg
R18是his
R19是his
R20是ser或thr或磷酸丝氨酸
R21是his或缺失
R22是arg或lys或缺失
R23是gly或glu或asp或缺失
R24是tyr或phe或缺失
在优选的实施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)或其活性片 段或类似物，如组氨素(histatin)-1至-8，优选组氨素(histatin)-1、-3或 -5。在优选的实施方案中，靶向部分包括组氨素(histatin)的片段，如 组氨素(histatin)-5。在优选的实施方案中，靶向部分包含组氨素 (histatin)-5残基13-24，或相应的其它组氨素(histatin)的残基。在优选 的实施方案中，靶向部分包含被改造成包括内部重复区的组氨素 (histatin)分子。
可以理解上述通过结合详细描述说明了本发明，这些描述旨在说 明而非限定本发明，本发明的范围由以下的权利要求书的范围来定 义。属于本发明范围内的其它方面、优点和改进对于要发明所属的领 域的技术人员来说将是显而易见的。
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