特异性表达PD-1的干细胞、其鉴定和分离方法及用途
阅读：359发布：2020-10-01
专利汇可以提供特异性表达PD-1的干细胞、其鉴定和分离方法及用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种特异性表达程序性死亡受体1(PD-1)的干细胞，尤其是 口腔 来源的干细胞，包括但不限于 牙髓 干细胞、 牙龈 干细胞(GMSCs)、牙周膜干细胞(PDLSCs)、牙 乳头 干细胞(SCAPs)和牙囊干细胞(DFSCs)或其任意组合，优选包括乳牙牙髓间充质干细胞(SHED)和/或恒牙牙髓间充质干细胞(DPSC)；也包括最初不表达PD-1但经CRISPR修饰后表达PD-1的其它组织来源的间充质干细胞，例如经CRISPR修饰的PD-1+骨髓间充质干细胞(BMMSC)。本发明还公开了特异性表达程序性死亡受体1(PD-1)的干细胞的鉴定和分离方法、制备CRISPR修饰的PD-1+间充质干细胞的方法以及本发明的表达PD-1的间充质干细胞在组织再生、缓解 疼痛 、 治疗 慢性疼痛和治疗一系列 疾病 中的用途。，下面是特异性表达PD-1的干细胞、其鉴定和分离方法及用途专利的具体信息内容。
1.一种干细胞，其特征在于：所述干细胞特异性表达程序性死亡受体1(PD-1)。
2.如权利要求1所述的干细胞，其中所述干细胞是间充质干细胞。
3.如权利要求1或2所述的干细胞，其中所述干细胞来源于哺乳动物的口腔组织，优选地，所述哺乳动物是人。
4.如权利要求3所述的干细胞，其中所述口腔组织包括但不限于牙齿组织、牙周组织或口腔黏膜等，优选地，所述口腔组织包括但不限于牙体、牙髓、牙龈、牙周膜或韧带等。
5.如权利要求3所述的干细胞，其中所述干细胞包括牙髓干细胞、牙龈干细胞(GMSCs)、牙周膜干细胞(PDLSCs)、牙乳头干细胞(SCAPs)和牙囊干细胞(DFSCs)中的任意一种或多种。
6.如权利要求4或5所述的干细胞，其中所述干细胞包括乳牙牙髓间充质干细胞(SHED)和/或恒牙牙髓间充质干细胞(DPSC)，优选乳牙牙髓间充质干细胞(SHED)。
7.如权利要求2所述的干细胞，其中所述间充质干细胞包括最初不表达PD-1但经CRISPR修饰后表达PD-1的间充质干细胞，优选CRISPR修饰的PD-1+骨髓间充质干细胞。
8.一种干细胞的鉴定方法，其中所述干细胞特异性表达程序性死亡受体1(PD-1)，所述方法包括：
从组织中分离并培养干细胞；
用检测PD-1的试剂检测培养的干细胞中表达PD-1的个体。
9.一种分离干细胞的方法，其中所述干细胞特异性表达程序性死亡受体1(PD-1)，所述方法包括：
从组织中分离并培养干细胞；
用检测PD-1的试剂检测培养的干细胞中表达PD-1的个体；
从培养的干细胞中分离表达PD-1的干细胞。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述检测PD-1的试剂是抗-PD-1抗体。
11.如权利要求8或9所述的方法，其中所述从组织中分离并培养干细胞的步骤包括从组织中原代分离及培养贴壁生长的细胞。
12.如权利要求8或9所述的方法，其中所述用检测PD-1的试剂检测培养的干细胞中表达PD-1的个体的步骤使用流式细胞术、免疫印迹技术或其组合。
13.如权利要求8或9所述的方法，还包括用间充质干细胞特征性表面标志物鉴定干细胞的步骤，优选地，所述标志物选自阳性标志物和阴性标志物，其中所述阳性标志物选自：
CD105、CD73和CD90，和所述阴性标志物选自：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR；并且
所述干细胞能够进行贴壁生长；以及
所述干细胞能够在体外进行成骨诱导分化、成脂诱导分化、成神经诱导分化以及成软骨诱导分化。
14.如权利要求13所述的方法，其中用间充质干细胞特征性表面标志物鉴定干细胞的步骤在用检测PD-1的试剂检测培养的干细胞中表达PD-1的个体的步骤之前或与之同时进行。
15.如权利要求8-14任一项所述的方法，其中所述干细胞包括牙髓干细胞、牙龈干细胞(GMSCs)、牙周膜干细胞(PDLSCs)、牙乳头干细胞(SCAPs)和牙囊干细胞(DFSCs)中的任意一种或多种，优选包括乳牙牙髓间充质干细胞(SHED)和/或恒牙牙髓间充质干细胞(DPSC)，更优选包括乳牙牙髓间充质干细胞(SHED)。
16.如权利要求9所述的方法，所述方法还包括：
纯化所述分离的表达PD-1的干细胞。
17.一种制备CRISPR修饰的PD-1+间充质干细胞的方法，其中所述间充质干细胞最初不表达PD-1，所述方法包括：
在间充质干细胞中筛选合适的PD-1基因靶序列，得到靶向序列5 '-
CGACTGGCCAGGGCGCCTGTGGG-3'；
设计sgRNA序列；
构建sgRNA表达载体；
将dCas9和sgRNA表达载体导入到目的细胞中；以及
通过实验验证所述目的细胞是否表达PD-1。
18.如权利要求17所述的方法，其中最初不表达PD-1的所述间充质干细胞是任何组织来源的不表达PD-1的间充质干细胞，优选骨髓间充质干细胞。
19.一种特异性表达程序性死亡受体1(PD-1)的干细胞，其中所述干细胞根据权利要求
9-18任一项所述的方法获得。
20.根据权利要求1-7任一项所述的表达PD-1的间充质干细胞或根据权利要求19所述的表达PD-1的间充质干细胞在制备用于组织再生、或缓解/治疗疼痛、或治疗免疫相关性疾病或炎症性疾病或代谢性和退行性疾病或部分恶性肿瘤或真菌感染的药物中的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述组织再生包括但不限于牙髓再生、牙龈再生、骨再生、软骨再生、皮肤和黏膜再生、血管再生、肌肉和肌腱再生、心肌细胞再生、角膜再生、视网膜再生、外周神经元再生、中枢神经元再生、胰岛再生、脂肪再生等；所述疼痛包括但不限于痛经、神经血管性头痛、关节痛、消化系统平滑肌痉挛所引起的腹痛等；所述免疫相关性疾病包括但不限于全身和局部的自身免疫性疾病例，诸如系统性红斑狼疮、硬皮病、系统性硬化症、重症肌无力、I、II、III和IV型超敏反应、肝炎后肝纤维化、炎性肠病(IBD)、肾小球肾炎、皮肌炎、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、再生障碍性贫血、部分原发性高血压等；所述炎症性疾病包括各种原因导致的关节炎如风湿性关节炎、类风湿关节炎、痛风性关节炎、损伤性关节炎及关节退行性变，实质器官炎症如病毒性肝炎或感染、酒精、中毒等导致的肝炎、脂肪肝、肺炎、中毒或微生物感染或吸入不可降解异物导致的肺纤维化、蜂窝织炎、皮下脓肿等皮肤/软组织炎症，桥本甲状腺炎等甲状腺炎症、结肠炎、黏膜炎、牙周炎、牙龈炎、克罗恩病等；所述代谢性和退行性疾病包括动脉粥样硬化和狭窄导致的心脑血管系统疾病、I型和II型糖尿病、痛风、皮肤和神经的淀粉样变性、帕金森病/帕金森综合征、阿尔茨海默病、骨关节退行性变等；所述恶性肿瘤包括但不限于恶性浆细胞病、何杰金淋巴瘤与非何杰金淋巴瘤、急慢性淋巴细胞白血病、造血干细胞移植后的移植物抗宿主病(GVHD)，或与造血干细胞共移植治疗恶性血液病等；或所述真菌感染包括但不限于全身或局部的白色念珠菌感染、霉菌感染、隐球菌感染，皮肤和指甲的癣等。
22.根据权利要求1-7任一项所述的表达PD-1的间充质干细胞或根据权利要求19所述的表达PD-1的间充质干细胞在制备用于治疗慢性疼痛或用于组织再生的药物中的用途。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述慢性疼痛选自慢性软组织损伤；躯干及四肢顽固性痛点或结节；骨刺引起的临床症状；神经、血管受压性疾病、软组织损伤后出现的挛缩、疤痕炎症等压迫牵引刺激神经血管引起的症状；急、慢性损伤引起的滑囊炎导致的滑囊壁肿胀，炎症刺激压迫周围组织而出现的症状；及各种损伤引起的肘、膝关节周围肌肉、韧带、滑膜、软组织挛缩黏连。
24.根据权利要求22所述的用途，其中所述所述组织再生包括但不限于神经再生、血管再生、牙髓再生或骨组织再生。
25.一种特异性检测PD-1的试剂在制备用于鉴定、筛选和/或分离特异性表达PD-1的干细胞群体的检测剂中的用途，优选地，所述干细胞群体是口腔干细胞群体。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述特异性检测PD-1的试剂是抗PD-1抗体。
27.根据权利要求25所述的用途，其中所述干细胞群体具有更高的干性。
特异性表达PD-1的干细胞、其鉴定和分离方法及用途
技术领域
[0001] 本发明涉及一种特异性表达程序性死亡受体1(PD-1)的干细胞，尤其是特异性表达PD-1的哺乳动物(优选人)的口腔组织来源的间充质干细胞。本发明也包括最初不表达PD-1但经CRISPR修饰后表达PD-1的其他间充质干细胞。本发明还涉及鉴别和分离特异性表达PD-1的干细胞的方法、制备CRISPR修饰的PD-1+间充质干细胞的方法、本发明的表达PD-1的间充质干细胞(包括经CRISPR修饰后表达PD-1的间充质干细胞)用于组织再生、或缓解/治疗疼痛、或治疗免疫相关性疾病或炎症性疾病或代谢性和退行性疾病或部分恶性肿瘤或真菌感染的用途、以及其在治疗慢性疼痛以及促进神经再生中的应用。
背景技术
[0002] 干细胞是一种未分化的细胞，有两个基本特性，一是具有自我复制能力，二是能分化成一种以上的功能细胞，根据分化潜能的大小，干细胞一般分成三类，第一类是全能干细胞(totipotent stem cell)即可以分类为功能一致的全能细胞，可以发育为胎儿。第二类是多潜能干细胞(pturipotent stem cell)，它能够分化为身体中的每种细胞类型，但是不能形成胎盘或胎儿发育所必需的支持组织。由于多潜能干细胞的分化潜能不是“全体”的，因此不将这种细胞称为“全能”，而且它们不是胚胎。多潜能干细胞进一步特化为多能(multipotent)干细胞，其专用于分化为特定功能特化的特定种系的细胞。多能干细胞能够分化为它们所源自的组织中含有的细胞类型；例如血液干细胞只能够分化为红血细胞、白血细胞和血小板。胚胎干细胞(Embryonic stem cell)具有广泛的潜能，能生成除胎盘外的机体所有的组织细胞。第三类是成体干细胞(aduit stem cell)是一种将拥有终生自我复制(identical copies)和自我更新(self-renewal)能力的未分化细胞，它分布于不同的组织，并可演变成为各种类型的资质细胞。
[0003] 干细胞根据所处的发育阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞，间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是成体干细胞家族的重要成员，是一类中胚层来源的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，主要存在于全身结缔组织和器官间质中。MSC最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。
[0004] 鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、造血支持、免疫调控以及获取容易等特点，其日益受到人们的关注。在体内或体外特定的诱导条件下，MSC可分化为多种组织细胞，因此可作为理想的种子细胞参与组织器官的修复过程。但由于不同的分离方法得到的MSC的纯度不同，极大地影响了疗效的稳定性。因此，对MSC表面标记分子进行鉴定、分选，已成为干细胞领域的研究热点。尤其地，寻找MSC特异性标记物、制定MSC鉴定标准也一直是干细胞研究领域的热点和难点，但是目前还没有特异性的标记物能够鉴定和分离间充质干细胞。
[0005] MSC表面标记分子包括相对特异性抗原、细胞因子及受体、生长因子及受体、黏附分子和细胞外基质等。虽然目前已经发现报道了一些多能干细胞的标志物，但在特异性上有所欠缺，不能区分特定来源、特定干性或特定幼稚程度的干细胞。
[0006] “干性(stemness)”是干细胞区别于其他细胞的重要特征，自我更新和向不同的细胞分化的能力是干性的两个主要表现方面。干细胞研究中的关键问题是了解其干性维持和分化的机制，干性是干细胞生物学、再生医学领域的核心课题之一。目前已经发现一些在调节干细胞干性方面起关键作用的物质，但是在鉴定、分离高干性干细胞方面缺乏组织特异性标记物，特别是对其生物学活性和干性有决定性调控作用的特异性标记物仍未发现。因此急需一种鉴定、分离和制备高干性间充质干细胞的方法，以此来提高研究效率并降低试验成本。
[0007] 虽然间充质干细胞移植在诸多疾病的治疗中有强大的潜力，但是植入后细胞的生存、增殖、分化能力的判定和提升仍是临床应用中需面对的问题，为了促进植入细胞的存活、定向分化及其他相关生物学效应的产生，保证治疗效果，对间充质干细胞进行适当的筛选或修饰，从而得到高纯度、高干性的细胞，是十分必要的。
[0008] 鉴于MSC在组织再生、免疫调节、治疗慢性疼痛、癌症、炎症、感染或代谢性疾病的治疗中的应用价值，对MSC进行表型鉴定及分化能力的检测，从而分选出纯度更高的高干性干细胞群将具有重要的临床意义。因此，需要寻找一种新的干细胞特异性标志物，用于分离纯化特定的干细胞群体，以提供更加高效的治疗药物；同时，为了保证治疗效果，也有需要提供一种修饰的高干性干细胞群体。
发明内容
[0009] 本发明的目的是提供一种特异性表达程序性死亡受体1(PD-1)的干细胞、其鉴定和分离方法、制备CRISPR修饰的PD-1+间充质干细胞的方法、本发明的PD-1+间充质干细胞在组织再生、或缓解/治疗疼痛、或治疗免疫相关性疾病或炎症性疾病或代谢性和退行性疾病或部分恶性肿瘤或真菌感染中的应用、以及其在治疗慢性疼痛以及促进神经再生中的应用。本发明所述的干细胞具有干细胞分化潜能，体外培养可分化成为神经元细胞、成骨细胞、成软骨细胞和成脂细胞等。
[0010] 程序性死亡受体-1(“PD-1”也称为“CD279”)是广泛地负调节免疫应答的T-细胞调节剂CD28/CTLA-4家族的约31kD I型膜蛋白成员(Ishida,Y.等(1992)“Induced Expression Of PD-1,A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily,Upon Programmed Cell Death,”EMBO J.11:3887-3895)。目前已有研究表明PD-1在激活的T-细胞、B-细胞和单核细胞上表达，且以低水平在天然杀伤细胞(NK)T-细胞中表达。已有PD-1抗体被批准用于治疗多种类型的癌症，包括黑色素瘤、肺癌、肾癌等。但尚未见到有关PD-1在干细胞表面上表达的报道。
[0011] 本发明是基于发明人这样的发现：PD-1主要在口腔来源的干细胞表面存在，并与干细胞幼稚程度、增殖分化能力和生物学活性(即干细胞的“干性”)相关。发明人利用多种干细胞表面标志物，对不同来源的干细胞群体进行研究，结果发现，PD-1仅存在于特定的干细胞群体上，并且，表面存在PD-1的这类干细胞群体更幼稚、分化程度低、干性更好，因而在疾病治疗诸如组织再生、或缓解/治疗疼痛、或治疗免疫相关性疾病或炎症性疾病或代谢性和退行性疾病或部分恶性肿瘤或真菌感染中具有更好的疗效。
[0012] 本发明的第一方面提供了一种特异性表达PD-1的干细胞。
[0013] 在一个实施方式中，特异性表达PD-1的干细胞是间充质干细胞。
[0015] 在一个实施方式中，特异性表达PD-1的干细胞来源于哺乳动物的口腔组织，优选地，来源于人的口腔组织。
[0017] 在一个优选的实施方式中，所述特异性表达PD-1的干细胞包括但不限于牙髓干细胞、牙龈干细胞(GMSCs)、牙周膜干细胞(PDLSCs)、牙乳头干细胞(SCAPs)或牙囊干细胞(DFSCs)或其任意组合；优选地，所述特异性表达PD-1的干细胞包括乳牙牙髓间充质干细胞(SHED)和/或恒牙牙髓间充质干细胞(DPSC)；更优选地，所述特异性表达PD-1的干细胞包括乳牙牙髓间充质干细胞(SHED)。
[0018] 在一个实施方式中，所述间充质干细胞包括但不限于最初不表达PD-1但经CRISPR修饰后表达PD-1的间充质干细胞，优选CRISPR修饰的PD-1+骨髓间充质干细胞(BMMSC)。
[0019] 本发明的第二方面提供了一种组合物，所述组合物包括根据本发明所述的任何一种或多种特异性表达PD-1的干细胞。
[0020] 在一个实施方式中，所述组合物进一步包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等。
[0022] 本发明的第四方面提供了一种干细胞的鉴定方法，其中所述干细胞特异性表达程序性死亡受体1(PD-1)，所述方法包括：
[0023] 从组织中分离并培养干细胞；
[0024] 用检测PD-1的试剂检测培养的干细胞中表达PD-1的个体。
[0025] 在一个实施方式中，所述检测PD-1的试剂是抗-PD-1抗体。
[0026] 在一个实施方式中，所述从组织中分离并培养干细胞的步骤包括从组织中原代分离及培养贴壁生长的细胞。
[0027] 在一个实施方式中，所述用检测PD-1的试剂检测培养的干细胞中表达PD-1的个体的步骤使用流式细胞术、免疫印迹技术或其组合。
[0028] 在一个实施方式中，鉴定特异性表达PD-1的干细胞的方法还包括用间充质干细胞特征性表面标志物鉴定干细胞的步骤，优选地，所述标志物选自阳性标志物和阴性标志物，其中所述阳性标志物选自：CD105、CD73和CD90，和所述阴性标志物选自：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR；并且
[0029] 所述干细胞能够进行贴壁生长；以及
[0030] 所述干细胞能够在体外进行成骨诱导分化、成脂诱导分化、成神经诱导分化以及成软骨诱导分化。
[0031] 在一个实施方式中，用间充质干细胞特征性表面标志物鉴定干细胞的步骤在用检测PD-1的试剂检测培养的干细胞中表达PD-1的个体的步骤之前或与之同时进行。
[0032] 在一个实施方式中，其中所述干细胞包括但不限于牙髓干细胞、牙龈干细胞(GMSCs)、牙周膜干细胞(PDLSCs)、牙乳头干细胞(SCAPs)或牙囊干细胞(DFSCs)或其任意组合，优选包括乳牙牙髓间充质干细胞(SHED)和/或恒牙牙髓间充质干细胞(DPSC)，更优选包括乳牙牙髓间充质干细胞(SHED)。
[0033] 本发明的第五方面提供了一种分离干细胞的方法，其中所述干细胞特异性表达程序性死亡受体1(PD-1)，所述方法包括：
[0034] 从组织中分离并培养干细胞；
[0035] 用检测PD-1的试剂检测培养的干细胞中表达PD-1的个体；
[0036] 从培养的干细胞中分离表达PD-1的干细胞。
[0037] 在一个实施方式中，所述方法还包括纯化所述分离的表达PD-1的干细胞。
[0038] 在一个实施方式中，所述检测PD-1的试剂是抗-PD-1抗体。
[0039] 在一个实施方式中，所述从组织中分离并培养干细胞的步骤包括从组织中原代分离及培养贴壁生长的细胞。
[0040] 在一个实施方式中，所述用检测PD-1的试剂检测培养的干细胞中表达PD-1的个体的步骤使用流式细胞术、免疫印迹技术或其组合。
[0041] 在一个实施方式中，方法还包括用间充质干细胞特征性表面标志物鉴定干细胞的步骤，所述标志物选自阳性标志物和阴性标志物，其中所述阳性标志物选自：CD105、CD73和CD90，和所述阴性标志物选自：CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR；并且[0042] 所述干细胞能够进行贴壁生长；以及
[0043] 所述干细胞能够在体外进行成骨诱导分化、成脂诱导分化、成神经诱导分化以及成软骨诱导分化。
[0044] 在一个实施方式中，用间充质干细胞特征性表面标志物鉴定干细胞的步骤在用检测PD-1的试剂检测培养的干细胞中表达PD-1的个体的步骤之前或与之同时进行。
[0045] 在一个实施方式中，所述从培养的干细胞中分离表达PD-1的干细胞的步骤使用免疫磁珠分离法或流式细胞分选术或其组合。
[0046] 在一个实施方式中，所述干细胞包括但不限于牙髓干细胞、牙龈干细胞(GMSCs)、牙周膜干细胞(PDLSCs)、牙乳头干细胞(SCAPs)或牙囊干细胞(DFSCs)或其任意组合，优选包括乳牙牙髓间充质干细胞(SHED)和/或恒牙牙髓间充质干细胞(DPSC)，更优选包括乳牙牙髓间充质干细胞(SHED)。
[0047] 本发明的第六方面还提供了一种制备CRISPR修饰PD-1+间充质干细胞的方法，其中所述间充质干细胞最初不表达PD-1，所述方法包括：
[0048] 在间充质干细胞中筛选合适的PD-1基因靶序列，得到靶向序列5'-CGACTGGCCAGGGCGCCTGTGGG-3'；
[0049] 设计sgRNA序列；
[0050] 构建sgRNA表达载体；
[0051] 将dCas9和sgRNA表达载体导入到目的细胞中；以及
[0052] 通过实验验证所述目的细胞是否表达PD-1。
[0053] 在本发明方法的一个实施方案中，最初不表达PD-1的所述间充质干细胞是任何组织来源的不表达PD-1的间充质干细胞，优选骨髓间充质干细胞(BMMSC)。
[0054] 本发明的第七方面提供了一种特异性表达程序性死亡受体1(PD-1)的干细胞，其中所述干细胞根据本文所述的任一方法获得。
[0055] 本发明的第八方面提供了本发明所述的任何特异性表达PD-1的干细胞在制备用于组织再生、或缓解/治疗疼痛、或治疗免疫相关性疾病或炎症性疾病或代谢性和退行性疾病或部分恶性肿瘤或真菌感染的药物中的用途。
[0056] 在一个实施方式中，组织再生包括但不限于牙髓再生、牙龈再生、骨再生、软骨再生、皮肤和黏膜再生、血管再生、肌肉和肌腱再生、心肌细胞再生、角膜再生、视网膜再生、外周神经元再生、中枢神经元再生、胰岛再生、脂肪再生等；免疫相关性疾病包括但不限于全身和局部的自身免疫性疾病例，诸如系统性红斑狼疮、硬皮病、系统性硬化症、重症肌无力、I、II、III和IV型超敏反应、肝炎后肝纤维化、炎性肠病(IBD)、肾小球肾炎、皮肌炎、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、再生障碍性贫血、部分原发性高血压等；炎症性疾病包括各种原因导致的关节炎如风湿性关节炎、类风湿关节炎、痛风性关节炎、损伤性关节炎及关节退行性变，实质器官炎症如病毒性肝炎或感染、酒精、中毒等导致的肝炎、脂肪肝、肺炎、中毒或微生物感染或吸入不可降解异物导致的肺纤维化、蜂窝织炎、皮下脓肿等皮肤/软组织炎症，桥本甲状腺炎等甲状腺炎症、结肠炎、黏膜炎、牙周炎、牙龈炎、克罗恩病等；代谢性和退行性疾病包括动脉粥样硬化和狭窄导致的心脑血管系统疾病、I型和II型糖尿病、痛风、皮肤和神经的淀粉样变性、帕金森病/帕金森综合征、阿尔茨海默病、骨关节退行性变等；恶性肿瘤包括但不限于恶性浆细胞病、何杰金淋巴瘤与非何杰金淋巴瘤、急慢性淋巴细胞白血病、造血干细胞移植后的移植物抗宿主病(GVHD)、或与造血干细胞共移植治疗恶性血液病等；真菌感染包括但不限于全身或局部的白色念珠菌感染、霉菌感染、隐球菌感染，皮肤和指甲的癣等；或所述疼痛包括但不限于痛经、神经血管性头痛、关节痛、消化系统平滑肌痉挛所引起的腹痛等。
[0057] 本发明的第九方面提供了本发明所述的任何特异性表达PD-1的干细胞在制备用于治疗慢性疼痛的药物中的用途。
[0058] 在一个实施方式中，所述慢性疼痛选自慢性软组织损伤；躯干及四肢顽固性痛点或结节；骨刺引起的临床症状；神经、血管受压性疾病、软组织损伤后出现的挛缩、疤痕炎症等压迫牵引刺激神经血管引起的症状；急、慢性损伤引起的滑囊炎导致的滑囊壁肿胀，炎症刺激压迫周围组织而出现的症状；及各种损伤引起的肘、膝关节周围肌肉、韧带、滑膜、软组织挛缩黏连。
[0059] 本发明另外提供了一种特异性检测PD-1分子的试剂的用途，包括用这样的试剂来鉴定、筛选以及分离分化程度更低、干性更好的干细胞群体，尤其是口腔组织来源的干细胞群体，其中所述干细胞群体为PD-1阳性的。该群体干细胞还能够与成体的免疫系统各类细胞、尤其是杀伤性T淋巴细胞产生更显著的相互作用，从而达到对免疫系统更好的综合调节效果，诱导产生持久的免疫稳态。优选地，特异性检测PD-1分子的试剂是抗PD-1抗体。
[0060] 在一个实施方式中，如上所述的干细胞群体具有更高的干性。
[0061] 本发明还提供了一种试剂盒，用于分离或检测特异性表达PD-1的干细胞群体，其中所述试剂盒包含特异性地检测PD-1的试剂。优选地，所述特异性地检测PD-1的试剂是抗PD-1抗体。在一个实施方式中，试剂盒还可以包含检测其他干细胞表面标志物的试剂，所述其他干细胞表面标志物可以选自但不限于CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19、HLA-DR或其任意组合。
[0062] 在一个实施方式中，试剂盒可以包括特异性地检测PD-1的试剂、特异性地检测干细胞表面阳性表达的标记分子的试剂和特异性地检测干细胞表面阴性表达的标记分子的试剂。优选地，试剂盒包括抗PD-1抗体、特异性地检测CD105、CD73、和CD90的试剂以及特异性地检测CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR的试剂。
[0063] 本发明还提供本发明的试剂盒在鉴定、筛选以及分离分化程度更低、干性更好的干细胞群体中的用途，其中所述干细胞群体为PD-1阳性的。
[0064] 本发明首次从特定的干细胞群体中发现了PD-1分子的存在。经过研究发现，特异性表达PD-1的干细胞群体(尤其是口腔组织来源的干细胞群体)相比其他的干细胞群体具有更好的优势，诸如更强的传代能力，更强大的多向分化乃至跨胚层分化能力、更强的组织器官修复能力和诱导机体免疫耐受——免疫系统稳态的能力，更强的调节机体细胞能量代谢的能力等，因而能够为许多疾病诸如免疫相关性疾病(包括全身和局部的自身免疫性疾病例，诸如系统性红斑狼疮、硬皮病、肝炎后肝纤维化等)、炎症性疾病(包括各种原因导致的关节炎、软组织炎症、甲状腺炎症等)、代谢性疾病和退行性(包括糖尿病、痛风等)、恶性肿瘤(包括恶性浆细胞病、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤等)、真菌感染(包括全身或局部的白色念珠菌感染、霉菌感染、隐球菌感染等)、组织再生(包括牙髓再生、牙龈再生、骨再生、软骨再生、神经再生等)以及慢性疼痛(包括慢性软组织损伤；躯干及四肢顽固性痛点或结节；骨刺引起的临床症状；神经、血管受压性疾病、软组织损伤后出现的挛缩、疤痕炎症等压迫牵引刺激神经血管引起的症状；急、慢性损伤引起的滑囊炎导致的滑囊壁肿胀，炎症刺激压迫周围组织而出现的症状；及各种损伤引起的肘、膝关节周围肌肉、韧带、滑膜、软组织挛缩黏连)提供了一种新的、效果更好的治疗方案，该治疗方案可以使用更少的细胞达到比现有细胞治疗手段更好的疗效(例如提高治愈率、降低复发率、延长存活期、缩短治疗时间、改善或缓解疾病的症状等)、没有免疫排斥反应且与化疗方案相比几乎不存在不良反应。
[0065] 在本发明中，除非另外说明，否则“不表达PD-1”也包括以极低水平表达PD-1的情形。
[0066] 在本发明中，除非另外说明，否则“CRISPR修饰的PD-1+间充质干细胞”是指最初不表达PD-1但经CRISPR修饰后表达PD-1的间充质干细胞，其中所述间充质干细胞可以是任何组织(例如骨髓)来源的间充质干细胞。
[0067] 在本发明中，除非另外说明，否则“PD-1+间充质干细胞”表示表达PD-1的间充质干细胞，包括特异性表达PD-1的口腔间充质干细胞(例如GMSC、PDLSC、SCAP、DFSC、SHED、DPSC等)和经CRISPR修饰的PD-1+间充质干细胞(例如CRISPR修饰的PD-1+BMMSC)。
[0068] 在本发明中，除非另外说明，否则“牙髓干细胞”表示“牙髓间充质干细胞”，“牙龈干细胞”表示“牙龈间充质干细胞”，“骨髓干细胞”表示“骨髓间充质干细胞”，以此类推。
[0069] 前述内容仅仅是示意性的并且决不旨在是限制性的。除了上述示意性方面、实施方式和特征，通过参考下述详说明，本发明的进一步的方面、实施方式和特征将更容易理解。
[0071] 通过参考下述附图，本发明的进一步的方面、特征将更容易被理解。本领域技术人员应该理解，这些附图仅示意性地阐述了根据本发明的一些实施方式，而不应将其视为是对本发明范围的限制。
[0072] 图1示出了SHED、DPSC与BMMSC的PD-1、PD-L1的免疫印迹结果。
[0073] 图2示出了小鼠体内外胚间充质干细胞(EMSC)、GMSC、脂肪间充质干细胞(AMSC)中PD-1、PD-L1免疫印迹分析的结果。
[0074] 图3A示出了SHED、DPSC与BMMSC的流式细胞分析结果；图3B示出了实时荧光定量PCR结果，其中图3B(1)显示针对PD-1的实时荧光定量PCR结果，图3B(2)示出针对PD-L1的实时荧光定量PCR结果。
[0075] 图4A-B示出了针对PD-1和PD-L1两种蛋白，对SHED、DPSC和骨髓间充质干细胞(BMMSC)进行染色的免疫荧光染色结果。
[0076] 图5A-I示出了采用siRNA敲低SHED表面PD-1的实验结果。图5A显示敲低表面PD-1后SHED的细胞形态；图5B及图5C显示Brdu染色检测敲低表面PD-1后SHED的细胞增殖情况；图5D及图5E显示Ki67染色检测敲低表面PD-1后SHED的细胞增殖情况；图5F显示敲低3天与6天后SHED的成骨分化实验结果；图5G显示蛋白质免疫印迹分析的结果，相较于对照组SHED，PD-1siRNA处理能下调SHED中PD-1的表达水平；图5H显示群体倍增检测的结果，相较于对照组SHED，经过PD-1siRNA处理的SHED群体倍增数显著降低；图5I显示蛋白质免疫印迹分析的结果，相较于对照组SHED，PD-1siRNA处理能上调SHED中Runx2、OCN的表达水平。
[0077] 图6A-I示出了采用siRNA敲低DPSC表面PD-1的实验结果。图6A显示敲低表面PD-1后DPSC的细胞形态；图6B及图6C显示Brdu染色检测敲低表面PD-1后DPSC的细胞增殖情况；图6D及图6E显示Ki67染色检测敲低表面PD-1后DPSC的细胞增殖情况；图6F显示敲低3天与6天后DPSC的成骨分化实验结果；图6G显示蛋白质免疫印迹分析的结果，相较于对照组DPSC，PD-1siRNA处理能下调DPSC中PD-1的表达水平；图6H显示群体倍增检测的结果，相较于对照组DPSC，经过PD-1siRNA处理的DPSC群体倍增数显著降低；图6I显示蛋白质免疫印迹分析的结果，相较于对照组DPSC，PD-1siRNA处理能上调DPSC中Runx2、OCN的表达水平。
[0078] 图7A-I示出了采用siRNA敲低BMMSCs表面PD-1的实验结果。图7A显示敲低表面PD-1后BMMSCs的细胞形态；图7B及图7C显示Brdu染色检测敲低表面PD-1后BMMSCs的细胞增殖情况；图7D及图7E显示油红O染色镜检结果以及敲低表面PD-1后BMMSC的成脂分化情况；图
7F显示敲低6天与4周后BMMSCs的成骨分化实验结果；图7G显示蛋白质免疫印迹分析的结果，对照组BMMSC与PD-1siRNA处理的BMMSC中PD-1的表达水平无明显差异；图7H显示群体倍增检测的结果；图7I显示蛋白质免疫印迹分析的结果，对照组BMMSC与PD-1siRNA处理的BMMSC中Runx2、ALP、OCN的表达水平无明显差异。
7F显示敲低6天与4周后BMMSCs的成骨分化实验结果；图7G显示蛋白质免疫印迹分析的结果，对照组BMMSC与PD-1siRNA处理的BMMSC中PD-1的表达水平无明显差异；图7H显示群体倍增检测的结果；图7I显示蛋白质免疫印迹分析的结果，对照组BMMSC与PD-1siRNA处理的BMMSC中Runx2、ALP、OCN的表达水平无明显差异。
[0079] 图8A-E示出了PD-1敲低后的免疫印迹检测结果。图8A显示SHED、DPSC和hBMMSC的免疫印迹检测结果；图8B显示敲低PD-1后SHED中与原始程度相关(Notch1/2、NICD等)蛋白的表达水平；图8C显示敲低PD-1后SHED中与细胞干性相关(Oct3/4、Nanong等)蛋白的表达水平；图8D显示不同浓度DAPT处理下SHED中NICD和PD-1的蛋白表达水平；图8E显示siRNA与PD98059处理下Notch1、P-ERK(磷酸化细胞外调节蛋白激酶)等重要通路蛋白的表达水平，其中“+”代表添加，“-”代表不添加。
[0080] 图9显示了实时荧光定量PCR的检测结果。
[0081] 图10显示了双阳性SHED流式分拣的结果。图10A和图10C显示的是流式细胞分析结果；图10B和图10D显示免疫细胞荧光染色的结果。
[0082] 图11显示PD-1阳性间充质干细胞的基本特性。图11A显示实时荧光定量PCR分析的结果；图11B显示细胞增殖率检测结果，图11C显示群体倍增检测结果；图11D和图11E显示成骨分化的结果；图11F显示分别在体内移植PD-1阴/阳性间充质干细胞，细胞在体内的成骨分化结果(PD-1-比PD-1+的成骨区域明显多)；图11G显示蛋白质免疫印迹分析的结果(PD-1+间充质干细胞中OCT3/4的表达量明显高于PD-1-)。
[0083] 图12显示细胞凋亡研究的结果。图12A显示用重组的人源性PD-L1和PD-L2处理后的凋亡研究的结果；图12B显示用重组人源性PD-L1、PD-L2处理后的细胞增殖率研究结果，PD-L2处理后，细胞增殖率明显升高；图12C显示用重组人源性PD-L1、PD-L2处理后的细胞群体倍增数研究结果，PD-L2处理后，群体倍增数明显升高。
[0084] 图13A-13B显示免疫印迹结果；图13C-13D以及图13G-13H分别显示增殖率和群体倍增检测的结果；图13E和图13I显示成骨分化检测的结果；图13F显示敲低SHP2后，成骨标志物Runx2和OCN的表达量升高；图13J显示用SHP2抑制剂(NSC87877)抑制SHED中的SHP2信号传导，同样导致成骨标志物Runx2和OCN的表达量升高；和图13K显示分别用siRNA敲低SHED中SHEP2或者用抑制剂NSC87877处理SHED，SHP2表达量的变化。
[0085] 图14A显示分别敲低PD-1和敲低SHP2后SHED中ERK、p-ERK的表达量；图14B-14C和图14G-14H分别显示增殖率和群体倍增检测的结果；图14D和图14I显示成骨分化检测的结果；图14E和图14J显示免疫印迹结果；图14F显示用PD98059处理后，PD-1和p-SHP2的表达水平；图14K显示分别用ERK抑制剂PD98059处理，siRNA敲低SHEP2，siRNA敲低SHEP2并加入PEITC后，SHED中ERK和P-ERK的表达水平。
[0086] 图15A显示敲低PD-1和SHP2后，SHED中Notch1和NICD的表达量；图15B和15F分别显示用PD98059(一种非ATP竞争性MEK抑制剂)处理后，SHED的Notch1和NICD的表达量以及活性β-连环蛋白和总β-连环蛋白的表达水平；图15C-15D显示增殖速率和群体倍增检测的结果；图15E显示敲低PD-1和SHEP2后或用NSC87877处理SHED后，活性β-连环蛋白和总β-连环蛋白的表达水平；图15G显示分别用PD98059处理、XAV939+PD98059共同处理对SHED成骨分化的影响；以及图15H显示分别用PD98059处理、XAV939+PD98059共同处理对SHED中Runx2和OCN表达的影响。
[0087] 图16A显示敲低PD-1和SHP2后，SHED中Notch2的表达量；图16B显示用Notch抑制剂DAPT处理，或用XAV-939(通过抑制锚聚合酶1/2而选择性抑制Wnt/β-连环蛋白介导的转录)处理后，SHED中的ERK、P-ERK的表达；图16C显示用PD98059，或用PD98059+DLL1共处理后，SHED中Notch1和NICD的表达水平；16D显示用PD98058处理，或用PD98058+XAV939共处理后，SHED中活性β-连环蛋白和总β-连环蛋白的表达水平。
[0088] 图17显示实时荧光定量分析的结果。
[0089] 图18显示免疫印迹蛋白灰度分析结果。
[0090] 图19显示炎症症状评分的结果。
[0091] 图20显示X射线评分的结果。
具体实施方式
[0092] 在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
[0093] 实施例1.不同来源干细胞的分离和培养
[0094] 1、SHED和DPSC的分离培养
[0096] (2)将牙齿剖开，并抽取牙髓组织；
[0097] (3)将牙髓组织加入L-DMEM培养基洗涤，在500-700g条件下离心5分钟，弃上清；
[0099] (5)每3天换一次培养基，细胞达80％左右融合时传代；传代培养基为MSC专用无血清培养基。
[0100] 2、GMSC的分离、培养
[0101] (1)选取小鼠健康牙龈，在超净工作台内，于无菌培养皿中用PBS液反复冲洗牙体3-4遍，然后使用无菌手术刀片，小心刮取根中1/3处的牙周膜，边刮取边用PBS液冲洗，使用眼科剪将刮取的组织块剪至最小。
[0102] (2)所述的牙龈组织块转移至离心管中，在1000r/min条件下离心2分钟，弃掉所述离心管中的上清液，避光条件下分别加入1mL I型胶原酶和1mL Dispase酶，在37℃恒温水浴锅内消化40-50分钟。
[0103] (3)将消化完全的牙龈组织经所述离心管离心5分钟，弃掉上清液，加入完全培养液2mL，制成细胞悬液。将所述重悬的细胞接种于六孔板中，在每孔中加入2mL的所述的完全培养液，置于5％的CO2孵箱中在37℃下培养；
[0105] 参考上面的方法分离和培养牙周膜干细胞(PDLSC)、牙乳头干细胞(SCAPs)和牙囊干细胞(DFSCs)。
[0106] 显微镜观察显示，成功地分离到相应的SHED、DPSC、GMSCs、SCAPs和DFSCs，与使用常规手段培养的BMMSC、EMSC和AMSC进行对照，分离到的SHED、DPSC、GMSCs、SCAPs和DFSCs均显示特征性的间充质干细胞形态。
[0107] 实施例2.不同来源干细胞的分离和培养
[0108] 间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，存在于多种器官和组织中，包括骨髓、脐带、脂肪组织、骨骼肌和口腔等。骨髓干细胞(BMMSCs)是一种经常用于移植的间充质干细胞类型，主要来源于骨髓。牙髓组织来源的间充质干细胞(MSC-DP)是一种具有高度增殖能力的神经嵴来源的干细胞群体，可以从脱落的乳牙或恒牙牙髓中分离得到。
[0109] 1、人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)与成人牙髓干细胞(DPSC)
[0110] (1)分别收集人的滞留切牙(乳牙)和第三磨牙(恒牙)的牙髓组织，用含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素的PBS缓冲液反复冲洗；
[0111] (2)充分剪碎牙髓组织，加入3mg/ml I型胶原酶和4mg/ml中性蛋白酶，在37℃培养箱中消化1小时，用70μm细胞滤网进行过滤以制备单细胞悬浮液；
[0112] (3)终止消化并充分洗涤后将单细胞悬液(0.01～1×105/孔)接种于六孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱中(培养液为α-MEM，含15％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、0.1mM左旋抗坏血酸、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)。培养10-14天后见单克隆形成，消化后进行传代培养扩增。
[0113] 2、牙龈间充质干细胞(GMSC)
[0114] 参照实施例1中分离和培养GMSC的方法来分离并培养小鼠GMSC。
[0115] 3、人骨髓干细胞(BMMSC)
[0116] 购买健康人类成年志愿者(20-35岁)的人骨髓提取物(购于AllCells LLC)，采用含10％胎牛血清的α-MEM培养液，并加入适量青霉素和链霉素，培养于37℃，5％CO2的恒温培养箱中。每天在光学显微镜下进行观察，并且至少两天更换一次新的培养液。
[0117] 显微镜观察显示，成功地分离到相应的SHED、DPSC、GMSC和BMMSC，与使用常规手段培养的BMMSC、EMSC和AMSC进行对照，分离到的SHED、DPSC、GMSC和BMMSC均显示特征性的间充质干细胞形态。
[0118] 实施例3.不同来源的干细胞的成骨诱导和成脂诱导以及成牙本质/成骨分化鉴定[0119] 成骨诱导：在培养基中添加2mMβ-甘油磷酸酯(Sigma-Aldrich)，100μM 2-磷酸酯抗坏血酸以及10nM地塞米松(Sigma-Aldrich)，进行成骨诱导。四周后，通过用矿物化茜素红对培养物染色，观察矿化结节形成。
[0120] 显微镜观察显示，培养的干细胞均成功地分化成成骨细胞。
[0121] 成脂诱导：将500nM黄嘌呤(Sigma-Aldrich)、60μM吲哚美辛(Sigma-Aldrich)、500nM皮质醇(Sigma-Aldrich)、10μg/ml胰岛素(Sigma-Aldrich)以及100μM 2-磷酸酯抗坏血酸加入到生长培养基中，进行成脂诱导。一周后，通过用油红O(Sigma Aldrich)对培养的细胞进行染色，在显微镜下对阳性细胞进行观察。
[0122] 显微镜观察显示，培养的干细胞均成功地分化成成脂肪细胞。
[0123] 成牙本质/成骨分化鉴定：将口腔干细胞接种于六孔板，更换成骨诱导培养基(含15％FBS(胎牛血清)，10-7M地塞米松磷酸钠，1.8mM磷酸二氢钾，0.1mML-2磷酸抗坏血酸，
100U/ml青霉素/链霉素，2mM L-谷氨酰胺的α-MEM培养基)，诱导10d后，收集细胞蛋白，Western Blot技术检测成牙本质/成骨蛋白DSPP、Runx2、ALP、OCN的表达，可检测到上述蛋白的高表达(95％阳性率)；诱导4周，可观察矿化结节时，1％茜素红S染色，能够在镜下肉眼观察到干细胞形成牙本质样结构。
100U/ml青霉素/链霉素，2mM L-谷氨酰胺的α-MEM培养基)，诱导10d后，收集细胞蛋白，Western Blot技术检测成牙本质/成骨蛋白DSPP、Runx2、ALP、OCN的表达，可检测到上述蛋白的高表达(95％阳性率)；诱导4周，可观察矿化结节时，1％茜素红S染色，能够在镜下肉眼观察到干细胞形成牙本质样结构。
[0124] 实施例4.口腔干细胞表面标志物的检测
[0125] 将口腔干细胞分装入FACS管中。1500rpm离心5min，弃上清，分别加入荧光标记的抗人CD73、CD31、CD34、CD90、CD105、CD146抗体，冰上避光孵育1h。然后，用0.5％BSA中和，离心弃上清，2％的多聚甲醛固定液，流式细胞仪检测间充质干细胞表面标记物表达情况。
[0126] 荧光显微镜图像采集结果显示，标志物CD105、CD73、CD90均能在口腔干细胞表面进行表达，而CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR不能在口腔干细胞表面进行表达。
[0127] 实施例5.间充质干细胞的鉴定
[0128] 2006年国际干细胞研究组织发布了间充质干细胞鉴定方法：(1)MSC在标准的体外培养条件下，能够进行贴壁生长；(2)MSC表达干细胞表面标记物CD105、CD73、CD90，不表达细胞表面标记物CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR；以及(3)MSC在体外诱导条件下，具有多向分化潜能，能够分化为成骨细胞、成脂细胞、成神经细胞和成软骨细胞等。不同组织来源的MSC的表面标记物的差异可以体现细胞的一些特征，并且可以进一步根据这些表面标志物将MSC进行分类，例如：通过对骨髓、胎儿血、脐血、胎盘、脂肪组织等来源的MSC进行比较，发现CD133在骨髓、脐带、胎盘来源的MSC中不表达，而在其他来源的MSC中均表达，而CD133为神经胶质瘤的表面标记物，表明骨髓、脐带、胎盘来源的MSC是一类具有向神经胶质细胞分化的潜能的MSC。
[0129] 1、间充质干细胞表面标志物检测
[0130] (1)取汇合度达到80％-90％的第二代间充质干细胞，加入胰蛋白酶消化成单细胞悬液。
[0131] (2)终止消化后用PBS缓冲液洗涤3遍，血细胞计数板计数，调整细胞浓度至1×106个/ml。
[0132] (3)分别加入荧光标记的抗体(抗-CD34-PE、抗-CD45-PE、抗-CD14-PE、抗-CD11b-PE、抗-CD79a-PE、抗-CD19-PE、抗-HLA-DR-PE或抗-CD105-PE、抗-CD73-PE、抗-CD90-PE)，4℃孵育30分钟，同型lgG(Southern Biotech)作为相应的阴性对照。
[0133] (3)PBS洗涤后，重悬于500μl PBS中，样品通过流式细胞仪进行分析。
[0134] 流式细胞分析结果显示上述干细胞的表面表达CD105、CD73、CD90，但不表达CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR。
[0135] 2、间充质干细胞多向分化诱导潜能检测
[0136] (1)成骨诱导：参照实施例3中的方法进行成骨诱导。
[0137] (2)成脂诱导：参照实施例3中的方法进行成脂诱导。
[0138] (3)成软骨诱导：将1×106个细胞置于5ml聚丙烯管中，离心成颗粒状后在完全培养基中进行培养直至形成球形。加入1ml DMEM(Gibco)，其含有15％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1％ITS+(BD Bioscience)、100mM地塞米松、100μM抗坏血酸、2mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的成软骨培养基，补充有10ng/ml TGF-β1。培养约4周后，将球状体用4％PFA固定，石蜡包埋切片，用0.1％的番红O-甲苯胺蓝(Sigma)进行染色，在显微镜下进行观察。
[0139] (4)成神经诱导：将细胞接种在2孔腔室玻片中，之后在含有10％FBS、1X N-2增补物、10ng/ml成纤维细胞生长因子、10ng/ml表皮生长因子、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基中培养2-3周。
[0140] 显微镜观察显示，培养的干细胞均成功地分化成成骨细胞、成脂细胞、成软骨细胞以及成神经细胞。
[0141] 实施例6.免疫印迹分析
[0142] 用M-PER试剂盒(Thermo,Rockford,IL)提取总蛋白，以抗β-肌动蛋白作为内参进行调整上样量，以保证每一条带添加的质量相同。上样并用10％NuPAGE凝胶(Invitrogen Co.)进行电泳分离，然后用硝化纤维素膜(Millipore Inc.)进行转膜。用5％脱脂奶粉和0.1％Tween 20封闭1小时，4℃孵育一抗(BioXcell公司，InVivoPlus抗m PD-1)过夜，然后再用1:10000的二抗(BioXcell公司，山羊抗小鼠(H+L):HR)孵育1小时。用超敏ECL反应液与膜反应1分钟，X光片自动洗片机来洗片，曝光不同时间来观察图像。
[0143] 结果显示SHED与DPSC在细胞膜表面(而非胞质)特异性地表达表面标志物PD-1，而BMMSC的细胞膜上几乎不表达PD-1；SHED、DPSC和BMMSC在细胞质中均表达PD-L1(图1)。
[0144] 另外，出生后10天的小鼠牙龈干细胞GMSCs中存在PD-1的高表达，在8周之后稍有降低；而小鼠的外胚间充质干细胞(EMSC)和脂肪间充质干细胞(AMSC)在10天和8周均检测不到PD-1的表达(图2)。用同样方法对SCAPs和DFSCs进行上述实验和对比，得到同样结果。
[0145] 以上实验结果表明，PD-1主要在口腔组织来源的干细胞表面存在，并且与干细胞幼稚程度相关。
[0146] 实施例7.流式细胞分析
[0147] 将不同来源的干细胞与PE(藻红蛋白)或者FITC(异硫氰酸荧光素)鼠单克隆抗人CD34和CD45流式抗体进行孵育，用CD73、CD105、CD146、CD166(间充质干细胞表面标志物)或lgG(Southern Biotech)作为同型对照。
[0148] 选取原代培养10天的BMMSC、SHED和DPSC，针对PD-1、PD-L1两种表面标志物进行染色。用含有2％的FBS和2％多聚甲醛的PBS液进行固定，样品通过流式细胞仪进行分析。
[0149] 结果显示，SHED的PD-1阳性率接近20％，DPSC达到10％，SHED和DPSC表达PD-1，且SHED高于DPSC，几乎检测不到PD-1阳性的BMMSC，并且BMMSC的PD-L1表达量高于SHED和DPSC(图3A-3B)。
[0150] 实施例8.siRNA转染
[0151] (1)转染前24h，在500μL无抗培养基中接种0.5-2×105个细胞，转染时细胞融合度为30-50％。
[0152] (2)用50μL Opti-MEM稀释siRNA(转染细胞的终浓度为33nM)，轻轻吹吸3-5次混匀。
[0153] (3)轻轻颠倒混匀转染试剂，用50μL Opti-MEM稀释1.0μLLipofectamineTM2000，吹吸混匀3-5次，室温下静置5min。
[0154] (4)混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。转染复合物加入24孔细胞板中，轻摇混匀。
[0155] (5)细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养18-48h。转染4-6h后可换新鲜培养基。
[0156] 通过显微镜观察siRNA敲低PD-1后SHED、DPSC和BMMSC的细胞形态。分别通过Brdu染色和Ki67染色检测敲低表面PD-1后SHED、DPSC和BMMSC的细胞增殖情况。在敲低的第3天与第6天进行SHED、DPSC和BMMSC的成骨分化实验。
[0157] 结果显示，采用siRNA敲低SHED、DPSC和BMMSC表面的PD-1后，SHED和DPSC的生长能力显著降低，细胞数量减少(其中Brdu和ki 67是细胞核增殖指数，数值越高，说明细胞增生越活跃)；DP-1敲低后，SHED和DPSC展现出明显的成骨分化趋势，干细胞的干性降低，说明该标志物与干细胞的干性高度相关(图5，图6)。而BMMSC在PD-1敲低前后，细胞生长能力和细胞干性均没有发生明显的变化(图7)。
[0158] 免疫印迹检测结果(请见图8)还显示，PD-1敲低后，与干细胞干性相关的标志物(Oct3/4)和与原始程度相关的标志物(Notch1/2，NICD)的表达也显著降低，活性β联蛋白表达量上调。加入PD98059特异性抑制剂抑制ERK(即，胞外信号调节激酶，其是MAPK家族的一员，它的信号传递途径是涉及调节细胞生长、发育及分裂的信号网络的核心)后，PD-1敲低的SHED标志物表达增加，暗示了DP-1可能是通过MAPK/ERK途径发挥作用。
[0159] 实施例9.免疫荧光染色
[0160] (1)在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，用4％的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次。
[0161] (2)PBS浸洗玻片后用吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min。
[0162] (3)吸水纸吸掉封闭液，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。
[0163] (4)在暗室中，用PBST浸洗爬片后，用吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min。
[0164] (5)滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST洗去多余的DAPI。用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
[0165] 针对PD-1和PD-L1两种蛋白，对SHED、DPSC和骨髓间充质干细胞(BMMSC)进行染色，结果与免疫印迹的结果相符：PD-1在SHED、DPSC的细胞中表达，而在BMMSC细胞中不表达；PD-1的配体PD-L1在SHED、DPSCB、MMSC细胞中均表达(图4)，这也验证了SHED和DPSC在细胞膜表面特异性地表达PD-1，而BMMSC的细胞膜上几乎不表达PD-1。
[0166] 实施例10.间充质干细胞PD-1的特异性表达
[0167] 1、流式细胞仪检测
[0168] 取培养到第二代(P2)的间充质干细胞加入胰蛋白酶进行消化，终止消化后用含有2％FBS(已灭活)的PBS进行洗涤。然后将细胞转移到5mL聚苯乙烯管后上机，通过流式细胞仪收集PD-1+(APC阳性细胞)和PD-1-(APC阴性细胞)的间充质干细胞。
[0169] 2、免疫荧光染色检测
[0170] 将口腔来源间充质干细胞接种于八孔板(2×104个细胞/孔)中，参照实施例9中的方法进行免疫荧光染色检测。
[0171] 3、实时荧光定量PCR检测
[0172] (1)每孔细胞加入1ml Trizol后，冰上放置5min，使其充分裂解。
[0173] (2)12,000rpm离心5min，弃沉淀后，加入200μl-300μl氯仿，振荡混匀后冰上放置15min。
[0174] (3)4℃12,000rpm离心15min后，吸取上层水相，转移至新离心管中。加入0.5ml异丙醇混匀，冰上放置5-10min。
[0175] (4)4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底。加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
[0177] (6)检测RNA质量和浓度后，选用反转录试剂盒获得cDNA样品，然后选用Real-time PCR试剂盒上机操作。
[0178] 荧光定量PCR结果表明，SHED与DPSC编码PD-1的mRNA，且SHED的表达量高于DPSC；而BMMSC几乎不表达(图9)。
[0179] 4、Western-Blot免疫印迹分析
[0180] 参照实施例6进行免疫印迹分析。
[0181] 以上实验结果表明，SHED和DPSC在细胞膜表面特异性地表达PD-1，而BMMSC的细胞膜上几乎不表达PD-1；PD-1在主要口腔组织来源的干细胞表面存在，并且与间充质干细胞幼稚程度相关。
[0182] 实施例11.阳性间充质干细胞的生物学特性研究
[0183] 1、PD-1阳性口腔间充质干细胞的分拣
[0184] 取培养到第二代(P2)的SHED加入胰蛋白酶进行消化，终止消化后用含有2％FBS(已灭活)的PBS进行洗涤。然后将细胞转移到5mL聚苯乙烯管后上机，通过流式细胞仪分别收集PD-1+/CD73+、PD-1+/CD90+、PD-1+/CD105+双阳性的口腔间充质干细胞，选取双阳性率高的细胞亚群进行分拣。
[0185] 流式细胞分析结果表明SHED中的PD-1和CD73(18.8％)、CD90(19.55％)、CD105(13.86％)呈现双阳性(图10A)。免疫细胞荧光染色技术检测到PD-1与SHED标志物CD90共表达(图10B)；并且，在从人脱落牙齿中收集到的牙髓中也利用免疫细胞荧光染色证明牙髓中+确实存在PD-1和CD90双阳性细胞(图10D)。进一步通过流式细胞术，分拣CD90+PD-1(90.39％)和CD90+PD-1-(0.09％)细胞(图10C)。
[0186] 2、细胞增殖率检测
[0187] 将间充质干细胞(10×103/孔)接种在2孔室载玻片上，并培养2-3天。将培养物与BrdU溶液(1:100)(Invitrogen)孵育20小时，并根据BrdU染色试剂盒(Invitrogen)说明书进行染色。样品用苏木精染色。每个样本取10张图像，进行BrdU阳性细胞和总细胞的计数，用BrdU阳性细胞数和总细胞数的百分比表示细胞增殖情况。
[0188] 3、集落形成单位检测
[0189] 将间充质干细胞接种在60mm培养板上，约10～15天，将培养板用0.1％甲苯胺蓝与2％多聚甲醛溶液的混合物染色。含有＞50个细胞的集落被计数为单集落簇。在每个实验组的5个独立样品中进行CFU-F计数。
[0190] 4、群体倍增数检测
[0191] 第一次传代时，将MSC用胰蛋白酶消化并按照2×105个细胞的密度接种在35-mm培养皿中，当汇合度和与接种细胞时的汇合度相同时收集细胞。群体倍增(PD)通过以下公式计算：PD＝log2(收集细胞数/接种细胞数)。每代细胞产生总数累加，直到细胞停止分裂为止，以确定PD的值。
[0192] 5、端粒酶活性和碱性磷酸酶活性检测
[0193] (1)端粒酶活性检测：取第3代细胞，用CHAPS等去污剂从细胞中制备端粒酶提取液，在非端粒引物TS的3’末端合成端粒重复序列，然后将反应产物进行PCR扩增，同时引入下游引物，反应体系中带标记寡核苷酸对产物进行标记，根据循环阈值测定端粒酶活性。
[0194] (2)碱性磷酸酶活性检测：取第3代细胞，以1×104个/ml密度接种于24孔培养板，每孔接种细胞悬液1ml。加入成骨细胞分化诱导培养液，诱导分化一周后，用2.5g/L胰蛋白酶消化，PBS洗两次。每孔细胞加1ml PBS，于200W超声波破碎仪上处理3次，每次50-60秒，间隔5分钟。离心后取上清液测ALPase含量。
[0195] 研究结果见下面表1。
[0196] 表1.PD-1阴性/阳性间充质干细胞对比研究
[0197]
[0198] 实时荧光定量分析证明了PD-1+SHED表达PD-1mRNA，而PD-1-SHED不表达PD-1mRNA(图11A)。低密度接种培养10天，PD-1+SHED形成克隆形成单位(CFU-F)的效率更高，且端粒酶和碱性磷酸酶的活性更高(表1)。通过Brdu染色和连续培养分析发现，PD-1+SHED的增殖率和群体倍增数明显高于PD-1-SHED(图11B，图11C)。在成骨分化诱导培养条件下，相较于PD-1-SHED，PD-1+SHED形成矿化结节的能力较低，意味着骨质/牙源性分化能力较低(图11D)；并且其成骨标志物Runx2和OCN的表达量也较低(图11E)。对免疫受损小鼠进行皮下注射后发现，PD-1+SHED产生新骨的能力明显低于PD-1-SHED(图11F)。这些数据说明，PD-1+SHED代表一群分化能力更低、增殖能力更高(即“高干性”)的细胞亚群。Nanog和OCT3/4是维持干细胞干性的关键基因，二者主要通过阻断干细胞的分化以维持多能性。能够看到PD-1-+
SHED中OCT3/4的含量明显低于PD-1SHED(图11G)。
SHED中OCT3/4的含量明显低于PD-1SHED(图11G)。
[0199] 实施例12.PD-1+调控间充质干细胞干性机制的研究
[0200] 1、细胞凋亡研究
[0201] (1)分别用重组的人源性PD-L1和PD-L2对细胞进行孵育处理。
[0202] (2)离心收集悬浮细胞，1000～1500rpm离心5min，弃培养基。
[0203] (3)加500μl冷PBS轻柔重悬并洗涤细胞两次，1000～1500rpm离心5min，收集细胞。
[0204] (4)缓慢加入400μl缓冲液以悬浮细胞，在细胞悬液中分别加入适量膜联蛋白V，轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15分钟。
[0205] (5)在细胞悬液中分别加入适量7AAD+，轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育5分钟。
[0206] (6)经处理过的细胞转入流式管，在流式细胞仪上分析。
[0207] 用重组的人源性PD-L1和PD-L2处理SHED，发现与对照组相比，处理后的SHED用7AAD+膜联蛋白V(即Annexin-V)试剂盒进行细胞凋亡检测时的细胞凋亡数量略微升高，但没有统计学意义上的区别(图12A)。通过Brdu染色和连续培养分析发现，用PD-L2处理后，SHED的增殖率和群体倍增数均增加，而用PD-L1处理并无明显变化(图12B，图12C)。这些数据表明，PD-L/PD-1信号通路能提高SHED的自我更新能力。
[0208] 2、siRNA转染敲低PD-1
[0209] 参照实施例8进行转染。
[0210] 3、PD-1siRNA对间充质干细胞干性影响的研究
[0211] (1)细胞形态镜检：取贴壁培养所得P3-P6代细胞，汇合度达80％时，直接在普通光学显微镜下进行形态学镜检，随机取10个不同视野进行拍照比对。
[0212] (2)细胞增殖率检测：将细胞(10×103/孔)接种在2孔室载玻片上，并培养2-3天。将培养物与BrdU溶液(1:100)(Invitrogen)孵育20小时，并根据BrdU、Ki67染色试剂盒(Invitrogen)说明书进行染色。样品用苏木精染色。每个样本取10张图像，分别进行BrdU、Ki67阳性细胞和总细胞的计数，分别用BrdU、Ki67阳性细胞数和总细胞数的百分比表示细胞增殖情况。
[0213] (3)成骨诱导分化检测：在培养基中添加2mMβ-甘油磷酸酯，100μM 2-磷酸酯抗坏血酸以及10nM地塞米松，成骨诱导四周，用矿物化茜素红进行染色观察。
[0214] 对SHED、DPSC和BMMSC进行siRNA PD-1处理后，SHED和DPSC的PD-1蛋白含量明显下降，生长能力显著降低，细胞数量减少(图5、6)；SHED和DPSC展现出明显的成骨分化趋势，与成骨分化密切相关的蛋白Runx2、OCN的表达也显著上升；而BMMSC在PD-1敲低前后，细胞生长能力和细胞分化趋势均没有发生明显的变化(图7)。说明PD-1与干细胞维持自我更新和阻止成骨分化，即细胞干性高度相关。
[0215] 4、PD-1siRNA对干性相关因子影响的研究
[0216] 参照实施例6进行免疫印迹分析。
[0217] 免疫印迹检测结果显示PD-1敲低后，与干细胞干性相关的标志物如Oct3/4，和与原始程度相关的标志物(Notch1/2，NICD)的表达也显著降低，进一步说明了PD-1与干细胞维持干性高度相关。加入PD98059特异性抑制剂抑制ERK后，PD-1敲低的SHED标志物表达增加，暗示了DP-1可能是通过MAPK/ERK途径发挥作用(图8)。
[0218] 1)PD-1通过SHP2(含SH2结构域的酪氨酸蛋白磷酸酶)/ERK信号通路调节SHED的自我更新和分化
[0219] 免疫印迹结果表明，siRNA敲低PD-1后的SHED中p-SHP2(磷酸化的SHP2)的表达量比对照组低，而总SHP2表达量并无明显差异(图13A)。SHED和DPSC表达p-SHP2，而BMMSCs不表达p-SHP2(图13B)。用siRNA敲低SHED中的p-SHP2表达(图13K)，通过Brdu染色和连续培养分析发现，SHED的增殖率和群体倍增显著降低(图13C，图13D)。在成骨分化诱导培养条件下，用茜素红染色检测到敲低SHP2的SHED形成矿化结节的能力增强(图13E)，并且成骨标志物Runx2和OCN的表达量升高(图13F)。另外，使用SHP2抑制剂(NSC87877)抑制SHED中的SHP2信号传导，SHED增殖率和群体倍增显著降低(图13G，图13H和图13K)并且成骨分化增强(图13I，图13J)。这些数据表明，SHP2是PD-1调节MSC-DP的自我更新和分化的下游信号。
[0220] 分别敲低PD-1和敲低SHP2后检测SHED中ERK的表达量，敲低后SHED中p-ERK(磷酸化的ERK)的表达量显著降低，而总ERK的表达量并无明显改变(图14A)。另外，用SHP2抑制剂NSC87877处理后，SHED中p-ERK的表达水平也降低(图14A)。用ERK抑制剂PD98059来降低SHED中ERK的表达水平，SHED的增殖率和群体倍增降低(图14B，图14C和图14K)，而形成矿化结节的能力增强(图14D)，并且表达成骨标志物Runx2和OCN(图14E)。然而，PD98059处理不影响PD-1和SHP2表达(图14F)。接着使用ERK激活剂PEITC处理敲低SHP2的SHED，发现PEITC处理后SHED的增殖率和群体倍增显著增加，矿化结节形成减少，Runx2和OCN的表达水平降低(图14G-J和图14K)。这些数据表明，PD-1通过调节SHP2/ERK级联信号通路，来调控SHED的自我更新和分化。
[0221] 2)PD-1/SHP2/ERK/通过Notch信号通路调节SHED的自我更新，并通过WED/β-连环蛋白信号通路抑制SHED的分化
[0222] 敲低PD-1和SHP2后，SHED中Notch1和NICD以及Notch2的表达量均显著降低(图15A和图16A)。SHP2抑制剂NSC87877处理后，SHED的Notch1和NICD表达量降低(图15A)，ERK抑制剂PD98059处理后，SHED的Notch1和NICD表达量也降低，而Notch抑制剂DAPT处理对SHED中的ERK表达没有明显影响(图15B和16B)。以上数据表明，Notch信号可能是SHED内PD-1/SHP2/ERK信号通路的下游。用Notch激活子DLL1处理SHED，提高其Notch1和NICD的表达水平(图16C)。Brdu染色、连续培养分析结果显示，添加DLL1可以减轻由于PD98059处理造成的SHED增殖速率和群体倍增下降(图15C，图15D)。这些数据说明，Notch信号是PD-1/SHP2/ERK级联信号调控SHED自我更新的下游通路。
[0223] 敲低PD-1和敲低SHP2的SHED中活性β-连环蛋白水平均显著升高，但总β-连环蛋白表达无明显变化(图15E)。NSC87877处理SHED后，活性β-连环蛋白的表达水平显著升高，而总β-连环蛋白的表达水平无明显变化(图15E)。用PD98059处理SHED后，活性β-连环蛋白的表达水平增加，而用Wnt/β-连环蛋白抑制剂(XAV939)处理对ERK表达无明显影响(图15F和图16B)。这些证据表明，Wnt/β-连环蛋白信号通路可能是SHED中PD-1/SHP2/ERK通路的下游通路。为了验证Wnt/β-连环蛋白信号在PD-1/SHP2/ERK介导SHED分化过程中发挥的作用，用XAV939处理来抑制SHED中活性β-连环蛋白的表达(图16D)，结果发现添加XAV939能够减弱PD98059处理后SHED中矿化结节形成和成骨标志物表达的增加(图15G，图15H)。这些数据说明PD-1通过SHP2/ERK/β-连环蛋白信号通路来调节SHED的成骨分化。
[0224] 实施例13.高干性间充质干细胞的制备和分离
[0225] 1、间充质干细胞的分离和培养
[0226] 参照实施例2的方法获得和培养骨髓间充质干细胞(BMMSC)以及人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)。
[0227] 2、间充质干细胞的鉴定
[0228] 参照实施例5进行间充质干细胞的鉴定。
[0229] 3、CRISPR修饰PD-1+间充质干细胞的制备筛选
[0230] 参考Du等“, CRISPR Technology for Genome Activation and Repression in Mammalian Cells,”Cold Spring Harb Protoc.,2016-1-4(doi:10.1101/pdb.prot090175)中公开的方法(通过引用将该文献第42页倒数第7段第一行至第45页倒数第7段最后一行的内容并入本文)，制备和筛选经CRISPR修饰的表达PD-1的间充质干细胞。
[0232] (2)转染前24小时，在6孔板中每孔接种1.5×105-2.5×105个细胞，每孔加入3ml无抗生素标准生长培养基，直至细胞汇合度达到80％。
[0233] (3)BMMSC细胞预处理后，根据细胞数量加入质粒，混合后转移至电穿孔杯中，冰上孵育5min，在电穿孔仪中用适宜条件进行电穿孔。电穿孔后加入适量培养液进行细胞重悬，再度离心后去除死细胞后接种。
[0234] (4)电穿孔48h后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白以确定CRISPR/Cas9质粒成功表达。流式分选GFP阳性细胞，单克隆分离培养，挑单克隆进行传代培养。用筛选培养基传代培养一段时间后，取部分细胞用于基因组DNA抽提和基因型鉴定，筛选出成功表达PD-1的细胞株。
[0235] (5)分别取培养到第二代(P2)的BMMSC(天然)、SHED(天然)、BMMSC(CRISPR修饰)加入胰蛋白酶进行消化，终止消化后用含有2％FBS(已灭活)的PBS进行洗涤。然后将细胞转移到5mL聚苯乙烯管后上机，通过流式细胞仪分选PD-1阳性的间充质干细胞亚群。筛选出三类细胞PD-1-WT、PD-1+WT、PD-1+CRISPR，分别移植BMMSC(WT)、SHED(WT)、BMMSC(CRISPR PD-1+)，然后进行扩大培养。
[0236] 扩大培养第10天，通过实时荧光定量分析发现，未经过CRISPR修饰的BMMSC(PD-1-WT)几乎不表达PD-1，而经过CRISPR修饰的BMMSC(PD-1+CRISPR)能表达PD-1，且表达量与天然表达PD-1的SHED(PD-1+WT)相当。说明由CRISPR介导的PD-1激活不仅能够激活基因转录，且能保持PD-1稳定、高效的转录(图17)。
[0237] 实施例14.CRISPR修饰PD-1+间充质干细胞的生物学特性
[0238] 1、细胞增殖率检测
[0239] 参照实施例11进行细胞增殖率检测。
[0240] 2、集落形成单位检测
[0241] 参照实施例11进行集落形成单位检测。
[0242] 3、群体倍增数检测
[0243] 参照实施例11进行群体倍增数检测。
[0244] 以上实验结果见表2。
[0245] 表2.生物学特性对比
[0246]
[0247] 注：*与对照组比较P<0.05，**与对照组比较P<0.005，***与对照组比较P<0.0005。
[0248] 4、代谢活力检测
[0249] 取扩大培养P2代细胞，按照每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养。分别在接种1、3、5、7、9、11、13天，每孔加入10μl CCK-18反应2小时，酶标仪测定430nm下的OD值。不加细胞的CCK-8孔作为阴性对照，将细胞培养各孔OD值减去阴性对照OD值后计算OD平均值并进行比较。
[0250] 实验结果见表3。
[0251] 表3.细胞代谢活力
[0252]
[0253] 注：*与对照组比较P<0.05。
[0254] 扩大培养(低密度接种)培养10天，相较于未经过CRISPR修饰的BMMSC(PD-1-WT)，经过CRISPR修饰的BMMSC(PD-1+CRISPR)的细胞增殖率、集落形成的效率、群体倍增数更高，且成骨/牙分化程度更低(表2)；而且，PD-1+CRISPR的细胞增殖率、集落形成的效率、群体倍增数以及成骨/牙分化程度均与天然表达PD-1的SHED(PD-1+WT)相当。另外，从培养的第5天起到第13天，PD-1+CRISPR和PD-1+WT的细胞代谢活力明显高于PD-1-WT(表3)。
[0255] 5、“干性”相关基因表达测定
[0256] (1)每孔细胞加入1ml Trizol后，冰上放置5min，使其充分裂解。
[0257] (2)12,000rpm离心5min，弃沉淀后，加入200μl-300μl氯仿，振荡混匀后冰上放置15min。
[0258] (3)4℃12,000rpm离心15min后，吸取上层水相，转移至新离心管中。加入0.5ml异丙醇混匀，冰上放置5-10min。
[0259] (4)4℃12,000rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底。加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
[0260] (5)离心后弃尽上清液，真空干燥5-10min，然后可用50μl ddH2O，TE缓冲液或0.5％SDS溶解RNA样品。
[0261] (6)检测RNA质量和浓度后，选用反转录试剂盒获得cDNA样品，然后选用Real-time PCR试剂盒上机操作。
[0262] 6、Western-Blot免疫印迹分析
[0263] 参照实施例6行免疫印迹分析。
[0264] 扩大培养10天后进行免疫印迹，然后用Quantity One软件检测目的条带的灰度+ +值，得到免疫印迹蛋白相对定量结果(见图18A-B)。结果表明，PD-1CRISPR和PD-1 WT的成骨分化标志物Runx2、OCN的蛋白含量明显低于PD-1-WT(图18A)，而干性标记基因Oct4、Nanog相应的蛋白含量高于PD-1-WT(图18B)。此外，PD-1+CRISPR和PD-1+WT的碱性磷酸酶(ALP)的蛋白含量也高于PD-1-WT(图18A)。以上数据说明，PD-1+CRISPR和PD-1+WT的细胞更加幼稚(分化程度低)，而且细胞存活、增殖能力更高，即干性更高。
[0265] 实施例15.PD-1+CRISPR修饰间充质干细胞的应用
[0266] 1、疾病动物造模
[0267] (1)慢性疼痛模型：取6～8周龄的DBA/1小鼠，对足垫进行多点皮内注射100μg鸡II型胶原蛋白，进行为期21天的炎性反应。
[0269] 2、间充质干细胞移植治疗
[0270] (1)慢性疼痛动物模型：通过流式细胞术分拣后，将约2×105个细胞重悬在PBS中，通过尾部静脉注射入疾病动物体内，对照组输注BMMSC(WT)，空白对照组输注等量PBS。
[0271] (2)组织再生动物模型：将4x 105个细胞与4mg羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)陶瓷粉末(Zimmer Inc.)混合，37℃孵育2小时后离心去上清，制成干细胞移植复合物，术后2小时内将复合物移植入软骨缺损区域。每只小鼠植入两肢，一肢作为实验组分别使用SHED+(WT)或BMMSC(CRISPR PD-1 )或对照组使用BMMSC(WT)，另一肢作为空白对照组不添加细胞。
[0273] 抽取注射间充质干细胞的小鼠的血清以及对照组小鼠血清冻存于-80℃。用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞因子以相关抗体水平。
[0274] 结果见下面表4-5。
[0275] 表4.免疫细胞亚群
[0276]
[0277] 注：*与空白对照组比较P<0.05，**与空白对照组比较P<0.005。
[0278] 表5.炎性与免疫因子含量
[0279]
[0280] 注：*与空白对照组比较P<0.05，**与空白对照组比较P<0.005，***与对照组比较P<0.0005。
[0281] 4、炎症症状评分
[0282] 临床症状评分按照以下等级评估临床关节炎：①0分＝无损伤或红肿现象；1分＝一个爪子出现肿胀；②2分＝一个以上爪子出现肿胀；③3分＝所有爪子及脚背出现肿胀；④4分＝所有爪子或脚踝严重肿胀。炎性反应21天后，在0、2、4、6、8、10周进行临床症状分检测。
[0283] 5、X-Ray检测(组织再生评分)
[0284] 双盲法对小鼠的膝关节X光片进行阅片，具体标准如下。①表面规则度：0分，正常；1分，平行的叠片状表面；2分，全层25％～50％深度的裂隙；3分，全层50％～100％深度的裂隙；4分，严重的崩解，包括出现纤丝化。②结构完整性：0分，正常；1分，轻度崩解，包括形成囊肿；2分，严重崩解。③厚度：0分，与邻近软骨等厚；1分，是邻近软骨厚度的50％～100％；2分，小于邻近软骨厚度的50％。④与邻近软骨连接：0分，双侧连接；1分，单侧连接或双侧部分连接；2分无连接。⑤邻近软骨变性程度：0分，正常；1分，邻近软骨出现小于50％崩解或萎缩；2分，邻近软骨出现大于50％崩解或萎缩。检测结果见图20。
[0285] 6、组织病理评分
[0286] (1)组织病理评分按照以下等级评估组织再生：在移植8周后获取移植物，用4％多聚甲醛固定，然后用10％EDTA(pH8.0)脱钙进行石蜡包埋。石蜡切片脱蜡，再水化，并用苏木精和曙红(H&E)染色。每个样本制成4个切片，随机选取移植物不同区域的10个图像，使用Image J软件(NIH)计算组织面积。
[0287] (2)组织病理评分按照以下等级评估关节炎：在炎性反应10周后取前、后足爪，用4％多聚甲醛固定，然后用10％EDTA(pH8.0)脱钙进行石蜡包埋。石蜡切片脱蜡，再水化，并用苏木精和曙红(H&E)染色。每个样本制成4个切片，每个切片随机选取10个视野进行观察，对观察到滑膜增生、新生血管和炎细胞浸润或骨、骨侵蚀的视野进行计数，每个视野记为一分。
[0288] (3)破骨细胞检测：按TRAP染色的实验操作方法，在37℃染色20min。细胞质呈现暗红色的细胞被确认为破骨细胞样细胞。用显微镜在100倍的放大率下，对膝关节损伤边界组织中TRAP阳性细胞进行计数。
[0289] 下面表6显示了组织再生区域。
[0290] 表6.组织再生区域
[0291]
[0292] 注：*与空白对照组比较P<0.05，**与空白对照组比较P<0.005。
[0293] 慢性关节炎模型动物从治疗第4周起到第10周，PD-1+CRISPR组和PD-1+WT组动物的炎症症状评分低于PD-1-WT组，三组都低于空白对照组(图19A)。治疗第10周取组织进行病理分析发现，PD-1+CRISPR组和PD-1+WT组动物的组织病理评分低于PD-1-WT组，三组都低于空白对照组(图19B)。免疫细胞亚群分析发现，PD-1-WT组、PD-1+CRISPR组和PD-1+WT组都具有显著降低Th17、Th1细胞和增加Treg的作用，从而达到修复免疫紊乱的作用(表4)。另外观察到，PD-1-WT组、PD-1+CRISPR组和PD-1+WT组的IL-10、IL-17、sRANKL、CTX均低于空白对照组，其中PD-1+CRISPR组和PD-1+WT组的IL-17、sRANKL、CTX低于PD-1-WT组(表5)。以上数据说明，PD-1CRISPR修饰的MSC具有平衡慢性炎症导致的免疫紊乱，有效降低炎性因子水平，抑制炎症的进展的能力，且治疗慢性疼痛的效果比未经PD-1CRISPR修饰的PD-1-阴性间充质干细胞更好；PD-1+牙源性间充质干细胞也有类似的效果。
[0294] 治疗第10周取组织再生模型动物检测发现，PD-1-WT组、PD-1+CRISPR组和PD-1+WT组再生软骨组织区域高于空白对照组，破骨细胞区域少于空白对照；PD-1+CRISPR组和PD-1+WT组再生软骨组织区域高于PD-1-WT组(表6)。PD-1-WT组、PD-1+CRISPR组和PD-1+WT组再生软骨组织区域高于空白对照组，破骨细胞区域少于空白对照。通过X射线观察发现，PD-1-WT组、PD-1+CRISPR组和PD-1+WT组X射线评分低于空白对照组，其中PD-1+CRISPR组和PD-1+WT-组低于于PD-1 WT组。以上数据说明，PD-1CRISPR修饰的MSC具有促进组织细胞新生，引导组织再生修复的作用，且治疗组织缺损效果比未经PD-1CRISPR修饰的PD-1-阴性间充质干细胞更好；PD-1+牙源性间充质干细胞也有类似的效果。
[0295] 以上实验均使用SPSS13.0来分析数据，P＝0.05为显著性检验水平。用ANOVA以及Newman-Keuls来进行配对检验。
[0296] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到其各种变化或替换，这些都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
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