技术领域
[0001] 本
发明涉及
植物种植领域，尤其涉及一种控制害虫的方法及其在植物 种植中抗虫的用途。
背景技术
[0002] 赤拟谷盗(Tribolium castaneum Herbst)属于鞘翅目拟步甲科。分布于 中国大部分省区，世界热带与较温暖地区。主要危害玉米、小麦、稻、高 粱、油料、干果、豆类、中药材、生药材、生姜、干鱼、干肉、皮革、蚕 茧、烟叶等宿主。该虫有臭腺分泌臭液，使面粉发生霉腥味，其分泌物还 含有致癌物苯醌。
[0003] microRNA(miRNA)为上世纪90年代发现的一类内源性的非编码RNA， 约22个核苷酸。它们由RNA聚合酶II(RNApolymerase II,polyII)转录， 形成长度为几百甚至上千个
碱基的初级转录本(pri-miRNA)，其中 pri-miRNA的5’端具有帽子结构和poly(A)尾巴。pri-miRNA于细胞核内在 RNaseIII的作用下，被剪切生成miRNA前体(pre-miRNA)。前体miRNA 通过Ran-GTP介导的exportin-5蛋白转运到
细胞质中。在RNaseIII/Dicer复 合体的作用下，pre-miRNA被剪切成两个不完全
配对的miRNA和miRNA* (miRNA*就是与miRNA不完全互补配对的序列)。最后在解旋酶的作用 下miRNA/miRNA*
复合体解旋形成成熟单链的miRNA。成熟的miRNA会 与沉默复合体(RISC)结合，而剩下的miRNA*在细胞质中被RNase所降 解。
[0004] 到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现有28645个miRNA分子， 大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因 组中，miRNAs的表达方式各不相同。部分
线虫和果蝇的miRNA在各个发 育阶段的全部细胞中都有表达，而其他的miRNA则依据某种更为严谨的位 相和时相的表达模式，即在不同组织、不同发育阶段中miRNA的
水平有显 著差异。
[0005] 大量的研究工作表明，miRNA具有调控
生物体生长和发育，细胞分化 和凋亡，
激素的分泌和
信号的传导以及应答各种胁迫，但是鲜有文献报道 昆虫受miRNA生长调控相关内容。本发明提供一种含有miRNA或其类似 物的
杀虫剂，尤其是杀鞘翅目害虫赤拟谷盗的杀虫剂组合物，其具有特异 性强、不杀伤有益生物、无残留、无毒
副作用等优点。
发明内容
[0006] 为了解决上述技术问题，提高植物抗虫能
力，本发明提供一种控制害 虫的方法。
[0007] 本发明是以如下技术方案实现的：一种控制害虫的方法，所述方法包 括向植物中引入至少一种microRNA成分，使所述植物与害虫
接触。
[0008] 进一步地，所述方法包括：获得第一microRNA的前体序列、第二 microRNA的前体序列，分别在所述前体序列发夹结构两端约50bp处设计 引物，接着以DNA为模板利用所设引物扩增获得第一microRNA的前体序 列的多核苷酸序列、第二microRNA的前体序列的多核苷酸序列；扩增后 将所述第一microRNA的前体序列、第二microRNA的前体序列用琼脂糖凝 胶DNA回收
试剂盒回收，将回收的所述第一microRNA的前体序列、第二 microRNA的前体序列的DNA产物分别与pMD19-T载体连接获得重组质 粒pMD19-miR3805，pMD19-miR71；将所述重组质粒pMD19-miR3805， pMD19-miR71分别和双元质粒载体pCAMBIA2301连接；将验证正确的植 物表达载体导入农杆菌感受态细胞中并用所述农杆菌感受态细胞将所述植 物表达载体转化入植物，经鉴定正确的阳性质粒p2301-miR3805、 p2301-miR71通过农杆菌介导法转化到水稻愈伤包括步骤一、首先活化农杆 菌，在含50mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YM培养基上划线，28℃暗 培养，收集农杆菌菌体，将其悬浮于含有200μM己酰丁香
酮的AAM液体 悬浮培养基中，调整菌体浓度至OD600为0.8～1.0；步骤二、取开花后12-15 天左右的水稻幼穗脱粒，用清水漂去秕粒，用70％
乙醇浸泡1-2分钟，然 后用加有几滴Tween20的1.25％的
次氯酸钠溶液浸泡90分钟，进行表面灭 菌，用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用，在无菌
滤纸上用
镊子和刮牙器挤出 水稻幼胚置于固体诱导培养基上，26℃暗培养诱导愈伤组织，约5-7天后剥 下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基上，在相同条件下继代培养5天 左右，用于共培养；步骤三、水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养，去壳的水 稻成熟
种子先用70％乙醇浸泡1-2分钟，然后用0.1％升汞浸泡30分钟，进 行表面灭菌，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放 在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养，约
10-15天后，剥下成熟胚盾片 长出的愈伤组织，转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养，以 后每两周继代培养一次，挑选继代培养4-5天、色泽淡黄颗粒状的愈伤组织 共培养；步骤四、将活化后的农杆菌菌液倒入含继代培养1周的水稻愈伤 组织的无菌三
角瓶，侵染10min，并不时晃动，然后将愈伤组织置于无菌的 滤纸上沥干30min后，置于铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基上，25℃ 暗培养3天，将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗
5-6次，再用含500mg/L 头孢拉定的无菌水清洗1～2遍，置于无菌滤纸上沥干1h，将晾干的愈伤转 入含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择， 28℃暗培养14天，然后将长有抗性愈伤的初始愈伤转到新的含500mg/L头 孢拉定和50mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃光照培养，直到 颗粒性的抗性愈伤组织长出，选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有潮 霉素的分化培养基上，于25℃12h光照/12h黑暗条件下培养，待再生小苗 长成约1cm高时，将其移到生根培养基上壮苗，25℃12h光照/12h黑暗条 件下培养，最后将转基因苗挑出，加入适量蒸馏水炼苗3天至一周左右， 洗去琼脂，
培养箱水培1周，移栽到
温室的土钵中生长，挑选生长正常的 植株，进行潮霉素PCR筛选和GUS
染色，获得阳性T0代植株，共10个 株系，获得转入第一microRNA前体序列、第二microRNA前体序列的植物 株系；
[0009] 大量种植所述转入第一microRNA前体序列、第二microRNA前体序列 的植物。
[0010] 进一步地，所述第一microRNA为tca-miR-3805、所述第二microRNA 为tca-miR-71。
[0011] 进一步地，所述植物选自水稻、拟南芥、玉米、谷子、小麦或青稞。
[0012] 成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工 而产生的，初级转录物称为pri-miRNA。pri-miRNA长度从几百到几千个碱 基不等，带有5‘帽子和3’polyA尾巴，以及1到数个发夹径环结构。 Pri-miRNA经剪切产生约70个碱基的miRNA前体，即pre-miRNA。 pre-miRNA为单一发夹结构，5‘带有
磷酸基团，3’有两个突出碱基，并 带有3‘羟基。pre-miRNA经进一步剪切，形成长度约为22个碱基的单链 成熟miRNA。
[0013] 本发明的有益效果是：
[0014] 本发明提供一种控制害虫的方法，其包含向植物中转入多个用于控制 鞘翅目昆虫害虫赤拟谷盗的microRNA，可直接用于控制鞘翅目害虫侵害植 物；本发明用于控制赤拟谷盗的靶
片段不影响植物体内的非靶标序列的表 达；本发明提供了杀虫剂组合物包括多个microRNA，混用靶标序列可避免 赤拟谷盗产生抗性。
[0015] 下面通过
实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
具体实施方式
[0016] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进 一步地详细描述。
[0017] 实施例1：影响昆虫生长发育的特异性miR的筛选
[0018] 选取大小一致、健康状况一致的赤拟谷盗三龄幼虫，称量每只虫子的 重量，记录昆虫生长状态，随机分为5组，4组为miR处理组1组为对照 组(非定标性的控制序列NC)，每组20只。顺血液循环流动方向，用微量注 射器从斜纹夜蛾幼虫的侧腹部第一和第二腹足之间，分别注射人工合成的 待测试miR，待测试miR序列为：
[0019] tca-miR-3805:uccguucacauucggauuuuauugug(SEQ ID NO：1)
[0020] tca-miR-71:ugaaagacauggguagugagau(SEQ ID NO：2)
[0021] tca-miR-279:gauggguucgggucuaguggcacg(SEQ ID NO：3)
[0022] tca-miR-317:uggggaccacccuguguu(SEQ ID NO：4)
[0023] 非定标性的控制序列(NC)：5'-uucuccgaacgugucacgu-3’(SEQ ID NO： 5)，注射量为每只幼虫4μg，注射后喂饲人工
饲料(市售)。注射后第1-7 天观察虫子的形态变化并记录，从第2天开始每天统计虫子的死亡率。
[0024] 表1.注射miR后幼虫死亡率统计
[0025]
[0026] 实验结果如表1所示，从表1中可以看出注射tca-miR-3805，tca-miR-71 的处理组在注射7天后，死亡率高达85％、90％，远远高于对照组的11％， 说明tca-miR-3805，tca-miR-71可以影响昆虫的生长发育，具备优秀的抗虫、 杀虫作用。
[0027] 实施例2：转基因水稻的获得
[0028] 如无特殊说明，下述实验所用试剂均为市售试剂。首先获得 tca-miR-3805，tca-miR-71的前体序列(获得自miRbase)，前体序列为：
[0029] pre-miR-3805:aagaagauuugcgccuauucccagguccguucacauucggauuuuauugug aauauuaaauaugauucgucugugauggucuugugggucgguccgaucaacaa(SEQ ID NO：6)[0030] pre-miR-71:gucucuucuugaaagacauggguagugagauguuuaauuaauaaauuuugucu cacuaccuugucuuucauguagcgau(SEQ ID NO：7)
[0031] 根据miR-3805的前体序列，在database中查阅其所在基因组位点的两 端的序列，分别在前体发夹结构两端约50bp处设计引物接着以DNA为模 板，利用所设引物扩增miR3805前体基因。PCR反应体系为50μl，依次加 入DNA模板1μl、10×PCRbuffer 5μl、10mM dNTPs 4μl、10μM正向引物 (miR3805-F)0.8μl、10μM反向引物(miR3805-R)0.8μl、TaKaRa Taq(5U/μl) 聚合酶0.5μl，最后加ddH2O补至50μl。PCR反应条件：预变性94℃5min， 变性94℃30s，
退火59℃30s，延伸72℃30s，30个循环，最后延伸72℃10min， 4℃保存。
[0032] 扩增后将miR3805前体基因DNA产物，利用天根生化科技(北京)有限 公司生产的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，按
说明书操作，将回收的 miR3805前体基因DNA与pMD19-T载体(TakaRa)进行连接反应，连接体 系10μl，分别加入0.5μlpMD19-T载体、4.5μl纯化的miR3805前体的DNA、 5μl Solution I。16℃下连接3h后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α(市售) 感受态细胞中。通过Amp筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴 定正确后，选取正确的菌液提取质粒pMD19-miR3805。利用天根公司生产 的普通质粒小提试剂盒提取质粒操作，按说明书操作。
[0033] 将提取的质粒pMD19-miR3805和DNA双元质粒载体pCAMBIA2301 同时用TakaRa公司生产的KpnI和PstI进行双酶切。酶切体系50μl，包括 5μl 10×Mbuffer、28μl pMD19-miR3805质粒、28μl pCAMBIA2301-miR71 质粒、1μl KpnI、1μl PstI和15μl ddH2O，37℃水浴过夜。将DNA双元质 粒载体pCAMBIA2301和克隆质粒pMD19-miR3805酶切后，割胶回收DNA 片段。接着用T4连接酶连接，然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受 态细胞中，进行菌液PCR，并提取质粒进行酶切鉴定。
[0034] 将正确的植物表达载体p2301-miR3805导入农杆菌感受态细胞 EHA105，操作如下：取200μl农杆菌感受态细胞，加入1μg p2301-miR3805 质粒，混匀，
冰浴5min，液氮中速冻5min，37℃水浴5min，然后加入1ml YM培养基28℃恢复培养4h。10000g离心30s，弃上清，吸200μl菌液涂 布于含有50mg/L卡那霉素和40μg/l利福平的YM平板，28℃培养，约48h 后长出农杆菌单菌落。摇菌，提取农杆菌质粒DNA重新转入大肠杆菌DH5α 中，再提取质粒进行酶切鉴定。按上述方法获得了分别转化有pre-miR3805 核苷酸序列、pre-miR71核苷酸序列的重组质粒。
[0035] 经鉴定正确的阳性质粒p2301-miR3805、p2301-miR71通过农杆菌介导 法转化到水稻愈伤。操作如下：步骤一、首先活化农杆菌，在含50mg/L卡 那霉素和40mg/L利福平的YM培养基上划线，28℃暗培养。收集农杆菌 菌体，将其悬浮于含有200μM己酰丁香酮(As)的AAM液体悬浮培养基中。 调整菌体浓度至OD600为0.8～1.0。步骤二、取开花后12-15天左右的水 稻(日本晴)幼穗脱粒，用清水漂去秕粒，用70％乙醇浸泡1-2分钟，然 后用加有几滴Tween20的1.25％的次氯酸钠溶液(活性氯含量为1.25％)浸 泡90分钟，进行表面灭菌。用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。在无菌滤 纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基(NB培养基)上， 26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代 培养基(NB培养基)上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。 步骤三、水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养，去壳的水稻成熟种子先用70％ 乙醇浸泡1-2分钟，然后用0.1％升汞浸泡30分钟，进行表面灭菌(最好在 摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后， 放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养。约10-15天后，剥下成熟胚盾 片长出的愈伤组织，转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。 以后每两周继代培养一次。挑选继代培养4-5天、色泽淡黄颗粒状的愈伤组 织共培养。步骤四，将活化后的农杆菌菌液倒入含继代培养1周的水稻愈 伤组织的无菌三角瓶，侵染
10min，并不时晃动。然后将愈伤组织置于无菌 的滤纸上沥干30min后，置于铺有一层无菌滤纸的固体共培养培养基上， 25℃暗培养3天。将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗5-6次，再用含 500mg/L头孢拉定的无菌水清洗1～2遍，置于无菌滤纸上沥干1h。将晾干 的愈伤转入含500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一 轮选择，28℃，暗培养14天。然后将长有抗性愈伤的初始愈伤转到新的含 500mg/L头孢拉定和50mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光 照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。选择生长旺盛的抗性愈伤组织 转移到含有潮霉素的分化培养基上，于25℃，12h光照/12h黑暗条件下培 养。待再生小苗长成约1cm高时，将其移到生根培养基上壮苗，25℃，12h 光照/12h黑暗条件下培养。最后将转基因苗挑出，加入适量蒸馏水炼苗3 天至一周左右，洗去琼脂，培养箱水培1周，移栽到温室的土钵中生长。 挑选生长正常的植株，进行潮霉素PCR筛选和GUS染色，获得阳性T0代 植株，共10个株系。
收获T1代种子繁种并鉴定至T2代，获得转入pre-miR3805序列的水稻转基因株系、pre-miR71序列的水稻转基因株系。
[0036] 实施例3：鉴定转基因水稻对赤拟谷盗的杀虫效果
[0037] 将转入miR-3805核苷酸序列的水稻植株、转入miR-71核苷酸序列的 水稻植株对赤拟谷盗进行抗虫效果检测。
[0038] 选用经鉴定为阳性单拷贝的转入pre-miR3805核苷酸序列的水稻植株 (Y1)3个，转入pre-miR71核苷酸序列的水稻植株(Y2)3个，阴性的水 稻转化事件(NGM1)3个，每个转化事件选取3个株系，每一株系选取3 棵苗；同时以野生型水稻植株作为对照(CK1)；在温室中种植至出苗；每 棵苗上取面积约1x2cm的
叶片，平铺放入铺有保湿滤纸的培养皿中，使得 植物部分尽量不会相互重叠便于后期观察死亡率；每皿中放入10头孵化时 间不超过24小时的初孵赤拟谷盗，并盖紧培养皿
盖子，将培养皿放入底下 垫有保湿纱布的生测盒中，并将生测盒放入
温度24±2℃，D/L为24/0，湿 度为70-80％的生测箱中；从接虫第2天开始，每天从培养皿外统计存活的 赤拟谷盗数量，每个转化事件以3个株系为平均水平，每个载体以3个转 化事件为平均存活数水平；每3天将培养皿中存活的赤拟谷盗转移至装有 新鲜叶片的培养皿中，实验结果如表1所示。
[0039] 表2、水稻转化事件叶片饲喂赤拟谷盗的实验结果
[0040]
[0041] 表2的实验结果表明：转入pre-miR3805核苷酸序列的水稻植株(Y1) 和转入pre-miR71核苷酸序列的水稻植株对赤拟谷盗均具有较好的抑制效 果，7天后，赤拟谷盗的死亡率高达90-100％，相较于野生型和NGM有十 分优异的抗虫效果。
[0042] 实施例4.生物源杀虫剂的制备
[0043] 大量种植转入pre-miR3805或pre-miR71核苷酸序列的植物，切碎后用
搅拌机搅碎，将搅拌后的植物放置于浓度为65％的酒精中，搅拌均匀，用 于植物表面喷施，或植物根部浸泡。
