[03]哺乳动物细胞膜对于许多细胞和组织的结构完整性和活性很重要。 特别重要的是起到直接和间接控制多种药理学、生理学和细胞过程的作用 的跨膜门控离子通道的研究。已识别和研究了众多门控离子通道以确定其 在细胞功能中的作用。
[04]门控离子通道涉及在细胞如神经元或肌细胞中信号的接收、整合、 转导、传导和传递中。门控离子通道可决定膜兴奋性。门控离子通道也可 影响膜的静息电位、动作电位的波形和频率以及兴奋阈。门控离子通道通 常表达于电兴奋细胞如神经元细胞中并为多亚基的(multimeric)。门控离子 通道也可在非兴奋细胞(例如脂肪细胞或肝细胞)中发现，在其中它们可起 例如信号转导作用。
[05]迄今识别出的众多门控离子通道是对例如电压调制、温度、化学环 境、pH、配体浓度和/或机械刺激敏感的通道。特定调节剂的实例包括： ATP、辣椒素、神经递质(例如乙酰胆碱)、离子(例如Na+、Ca+、K+、Cl-、 H+、Zn+、Cd+)和/或肽(例如FMRF)。对这些刺激敏感的门控离子通道的 实例为DEG/ENaC、TRPV和P2X基因超家族的成员。
[06]DEG/ENaC基因超家族的成员表现出高度的功能异质性，具有宽的 组织分布，其包括运输上皮细胞以及神经元可兴奋组织。DEG/ENaC蛋白 是膜蛋白，其特征是两个跨膜结构域(transmembrane spanning domains)、 细胞内N-和C-端以及富含半胱氨酸的细胞外环。取决于其在细胞中的功 能，DEG/ENaC通道或如钠动态平衡中涉及的上皮钠通道(ENaC)那样为 组成活化型的或如秀丽线虫(C.elegans)退化蛋白所要求的那样由机械刺 激活化的或由配体例如肽活化(如螺旋蜗牛的FaNaC的情况，其为FMRF 酰胺肽活化的通道并涉及在神经传递中)或由质子活化(如酸感受离子通道 (ASICs)的情况)。迄今已知的该基因家族的哺乳动物成员为αENaC(也称 SCNN1A或scnn1A)、βENaC(也称SCNN1B或scnn1B)、γENaC(也称 SCNN1G或scnn1G)、δENaC(也称ENaCd、SCNN1D、scnn1D dNaCh)、 ASIC1a(也称ASIC、ASIC1、BNaC2、hBNaC2、ASICα、ACCN2、Accn2 和accn2)、ASIC1b(也称ASICβ)、ASIC2a(也称BNC1、MDEG、mDEG、 MDEG1、BNaC1、ASIC2、ACCN1、Accn1和accn1)、ASIC2b(也称 MDEG2、ACCN1变体2)、ASIC3(也称hASIC3、DRASIC、TNaC1、 SLNAC1、ACCN3、Accn3和accn3)、ASIC4(也称BNaC4、SPASIC、 ACCN4、Accn4和accn4)、BLINaC(也称hINaC、ACCN5、Accn5和accn5)、 和hINaC。近来关于该基因超家族的综述参见Kellenberger，S.and Schild， L.(2002)Physiol.Rev.82：735，其通过引用结合到本文中。
[07]目前已知P2X基因超家族的七个成员；P2X1(也称P2RX1)、P2X2(也 称P2RX2)、P2X3(也称P2RX3)、P2X4(也称P2RX4)、P2X5(也称P2RX5)、 P2X6(也称P2RX6)和P2X7(也称P2RX7)。P2X蛋白结构类似于ASIC蛋 白结构，类似之处在于其含两个跨膜结构域、细胞内N-和C-端以及富含 半胱氨酸的细胞外环。所有P2X受体因对细胞外ATP的释放产生响应而 开放，并为小离子可通透的，且一些具有明显的钙通透性。P2X受体大量 分布于神经元、神经胶质、上皮、内皮、骨骼、肌肉和造血组织上。近来 关于该基因超家族的综述参见North，R.A.(2002)Physiol.Rev.82：1013， 其通过引用结合到本文中。
[08]表达于感觉神经元中对智利辣椒中的辛辣成分反应产生烧灼痛的受 体为辣椒素(TRPV或香草酸(vanilloid))受体，表示为TRPV1(也称VR1、 TRPV1α、TRPV1β)。TRPV1受体形成非选择性的阳离子通道，其由辣椒 素和类似物(RTX)以及热毒(＞43)活化，具有被质子例如H+离子增强的诱 导反应。酸pH也能引发与一些背根神经节神经元中的天然质子敏感电流 类似的缓慢钝化电流。虽然主要在初级感觉神经元中，但TRPV1的表达 也在多种脑核和脊髓中发现(Physiol.Genomics 4：165-174，2001)。
[09]两种结构相关受体TRPV2(也称VRL1和VRL)和TRPV4(也称 VRL-2、Trp12、VROAC、OTRPC4)不响应辣椒素、酸或中热，而是由高 温活化(Caterina M.J.，et al.(1999)Nature.398(6726)：436-41)。此外，该受 体家族例如TRPV或香草酸家族含ECAC-1(也称TRPV5和CAT2、CaT2) 和ECAC-2(也称TRPV6、CaT、ECaC、CAT1、CATL和OTRPC3)受体， 其为钙选择性通道(Peng，J.B.，et al.(2001)Genomics 76(1-3)：99-109)。近来 对于TRPV(香草酸)受体的综述参见Szallasi，A.and Blumberg，P.M.(1999) Pharmacol.Rev.51：159，其通过引用结合到本文中。
[10]门控离子通道的成员响应各种刺激例如化学(例如质子)、热和机械刺 激的能力、其在整个身体里的位置(例如背根神经节和三叉神经节中的小直 径初级感觉神经元)以及得自活体外和活体内模型的数据已暗示这些通道 存在于多种神经疾病、疾患和病症中。例如，已经表明大鼠ASIC2a通道 由与导致秀丽线虫中神经元退化的相同变异活化。此外，这些受体被细胞 外质子例如H+浓度的增加活化。通过向皮肤或肌肉灌注低pH溶液以及延 长真皮内低pH溶液的灌注将引起细胞外pH的改变，其模拟慢性疼痛的 痛觉过敏。此外，转基因小鼠例如ASIC2a、ASIC3、P2X3转基因小鼠均 具有对有害和无害刺激的改进反应。因此，门控离子通道的生物物理学、 解剖学和药理学性质与其在伤害性感受中的涉及一致。
[11]研究已表明ASICs在疼痛、神经疾病和疾患、胃肠疾病和疾患、泌 尿生殖器疾病和疾患以及炎症中起作用。例如，研究已表明ASICs在痛觉 中起作用(Price，M.P.et al.，Neuron.2001；32(6)：1071-83；Chen，C.C.et al.， Neurobiology 2002；99(13)8992-8997)，包括内脏痛和躯体痛(Aziz，Q.，Eur. J.Gastroenterol.Hepatol.2001；13(8)：891-6)；伴随心脏局部缺血的胸痛 (Sutherland，S.P.et al.，(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98：711-716)和慢性 痛觉过敏(Sluka，K.A.et al.，Pain.2003；106(3)：229-39)。近来已表明ASIC 拮抗剂在炎性疼痛以及切开术后疼痛中有效(Dube，GR.et al.，Pain 2005； 117：88-96；Voiley N.Curr Drug Targets Inflamm Allergy.2004；3：71-9)。 中枢神经元中的ASICs已经表明可能参与伴随脑局部缺血、中风和癫痫症 的神经元细胞死亡(Chesler，M.，Physiol.Rev.2003；83：1183-1221；Lipton， P.，Physiol.Rev.1999；79：1431-1568)。也已表明ASICs参与条件性恐惧、 突触可塑性、学习和记忆的神经机制(Wemmie，J.A.et al.，PNAS 2004；101： 3621-6；Wemmie，J.et al.，J.Neurosci.2003；23(13)：5496-5502；Wemmie，J. et al.，Neuron.2002；34(3)：463-77)。ASICs已经表明涉及在炎症相关持续 痛和炎症性肠病(Wu，L.J.et al.，J.Biol.Chem.2004；279(42)：43716-24； Yiangou，Y.et al.，Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.2001；13(8)：891-6；Voiley N.Curr Drug Targets Inflamm Allergy.2004；3：71-9)以及胃肠郁滞(Holzer， Curr.Opin.Pharm.2003；3：618-325)中。近来对人所作的研究表明ASICs 是酸诱导疼痛的基本传感器(Ugawa et al.，J.Clin.Invest.2002；110： 1185-90；Jones et al.，J.Neurosci.2004；24：10974-9)。此外，也认为ASICs 在果蝇的配子发育和早期胚胎发育中起作用(Darboux，I.et al.，J.Biol. Chem.1998；273(16)：9424-9)，是肠管中酸感受和机械感受功能的基础 (Page，A.J.et al.Gastroenterology.2004；127(6)：1739-47；Page，A.J.et al.， Gut.2005；54：1408-15；Suguira T.et al.，J Neurosci.2005；25：2617-27)，并已 表明涉及在内分泌腺中(Grunder，S.et al.，Neuroreport.2000；11(8)： 1607-11)。近来的数据也表明，ASICs可通过人骨组织在酸感受中起作用 (Jahr H.et al.，Biochem Biophys Res Commun.2005；337：349-54)。因此， 调节这些门控离子通道的化合物可用于这些疾病和疾患的治疗中。

[12]在一个方面中，本发明提供了式1化合物。在另一方面中，本发明 提供了式2化合物。在另一方面中，本发明提供了式3化合物。在一个实 施方案中，式3由化合物F、化合物31、化合物36、化合物37、化合物 38、化合物39、化合物40、化合物50、化合物51、化合物52、化合物53 或化合物54代表。
[13]在一个方面中，本发明提供了式4化合物。在一个实施方案中，式 4由化合物35或化合物110代表。
[14]在一个方面中，本发明提供了式5化合物。在一个方面中，本发明 提供了式5a化合物。在一个实施方案中，式5a由化合物K、化合物T、 化合物32、化合物33、化合物101、化合物102、化合物103、化合物104、 化合物105、化合物106、化合物107、化合物108或化合物111代表。
[15]在一个方面中，本发明提供了式6化合物。在一个方面中，本发明 提供了式6a化合物。在一个实施方案中，式6a由化合物C、化合物G、 化合物34、化合物41、化合物42、化合物43、化合物44、化合物45、化 合物46、化合物47、化合物48或化合物49代表。
[16]在一个方面中，本发明提供了式7化合物。在一个实施方案中，式 7由化合物A、化合物D、化合物H、化合物L、化合物M、化合物N、 化合物O、化合物P、化合物Q、化合物59、化合物60、化合物61或化 合物116代表。
[17]在一个方面中，本发明提供了式8化合物。在一个实施方案中，式 8由化合物B、化合物R、化合物S、化合物1、化合物2、化合物3、化 合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10、 化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、化合物15、化合物16、化 合物17、化合物18、化合物19、化合物20、化合物21、化合物22、化合 物23、化合物24、化合物25、化合物26、化合物27、化合物28、化合物 29、化合物30、化合物55、化合物56、化合物57、化合物58、化合物62、 化合物63、化合物64、化合物65、化合物66、化合物67、化合物68、化 合物69、化合物70、化合物71、化合物72、化合物73、化合物74、化合 物75、化合物76、化合物77、化合物78、化合物79、化合物80、化合物 81、化合物82、化合物83、化合物84、化合物85、化合物86、化合物87、 化合物88、化合物89、化合物90、化合物91、化合物92、化合物93、化 合物94、化合物95、化合物96、化合物97、化合物98、化合物99、化合 物100、化合物109、化合物112、化合物113、化合物114、化合物115、 化合物117、化合物118、化合物119、化合物120、化合物121或化合物 122代表。
[18]在一个方面中，本发明提供了一种调节门控离子通道活性的方法， 其包括使表达门控离子通道的细胞与有效量的本发明化合物接触。
[19]在本发明的另一实施方案中，使细胞与有效量的本发明化合物接触 将抑制门控离子通道的活性。在又一实施方案中，门控离子通道由选自 DEG/ENaC、P2X和TRPV基因超家族的成员的至少一种亚基组成。在另 一实施方案中，门控离子通道由选自αENaC、βENaC、γENaC、δENaC、 ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4、BLINaC、hINaC、 P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6、P2X7、TRPV1、TRPV2、TRPV3、 TRPV4、TRPV5和TRPV6的至少一种亚基组成。在另一实施方案中，门 控离子通道为同源多聚体的(homomultimeric)。在又一实施方案中，门控 离子通道为异源多聚体的(heteromultimeric)。在另一实施方案中， DEG/ENaC门控离子通道由选自αENaC、βENaC、γENaC、δENaC、 BLINaC、hINaC、ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4 的至少一种亚基组成。在另一实施方案中，DEG/ENaC门控离子通道由选 自ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4的至少一种亚 基组成。在另一实施方案中，门控离子通道包含ASIC1a和/或ASIC3。在 另一实施方案中，P2X门控离子通道包含选自P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、 P2X5、P2X6和P2X7的至少一种亚基。在另一实施方案中，TRPV门控离 子通道包含选自TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5和TRPV6 的至少一种亚基。在另一实施方案中，异源多聚体门控离子通道包括下列 门控离子通道的组合：αENaC、βENaC和γENaC；αENaC、βENaC和 δENaC；ASIC1a和ASIC3；ASIC1b和ASIC3；ASIC2a和ASIC3；ASIC2b 和ASIC3；ASIC1a、ASIC2a和ASIC3；P2X1和P2X2；P2X1和P2X5； P2X2和P2X3；P2X2和P2X6；P2X4和P2X6；TRPV1和TRPV2；TRPV5 和TRPV6；和TRPV1和TRPV4。在另一实施方案中，异源多聚体门控 离子通道包括下列门控离子通道的组合：ASIC1a和ASIC2a；ASIC2a和 ASIC2b；ASIC1b和ASIC3；和ASIC3和ASIC2b。
[20]在本发明的另一实施方案中，门控离子通道的活性与疼痛有关。在 又一实施方案中，门控离子通道的活性与炎性疾患有关。在再一实施方案 中，门控离子通道的活性与神经疾患有关。
[21]在另一实施方案中，所述疼痛选自皮肤痛、躯体痛、内脏痛和神经 性痛。在再一实施方案中，所述疼痛为急性痛或慢性痛。在又一实施方案 中，皮肤痛与损伤、外伤、割伤、裂伤、刺伤、烧伤、外科手术伤口、感 染或急性炎症有关。在另一实施方案中，躯体痛与肌肉骨胳和结缔系统的 损伤、疾病或疾患有关。在再一实施方案中，所述损伤、疾病或疾患选自 扭伤、骨折、关节炎、牛皮癣、湿疹和局部缺血性心脏病。在又一实施方 案中，所述内脏痛与循环系统、呼吸系统、胃肠系统或生殖泌尿系统的损 伤、疾病或疾患有关。在另一实施方案中，所述循环系统的疾病或疾患选 自局部缺血性心脏病、心绞痛、急性心肌梗塞、心脏心律不齐、静脉炎、 间歇性跛行、静脉曲张和痔。在再一实施方案中，所述呼吸系统的疾病或 疾患选自哮喘、呼吸道感染、慢性支气管炎和肺气肿。在又一实施方案中， 所述胃肠系统的疾病或疾患选自胃炎、十二指肠炎、过敏性肠综合征、结 肠炎、克罗恩氏病、胃肠回流疾病、溃疡和憩室炎。
[22]在另一实施方案中，所述生殖泌尿系统的疾病或疾患选自膀胱炎、 尿路感染、肾小球肾炎、多囊性肾病、肾结石和生殖泌尿系统癌症。在再 一实施方案中，所述躯体痛选自关节痛、肌痛、慢性腰背痛、幻肢痛、癌 症伴随疼痛、牙痛、纤维肌痛、自发性疼痛病、慢性非特异性疼痛、慢性 骨盆疼痛、术后疼痛和牵涉性痛。在又一实施方案中，神经性痛与神经系 统的损伤、疾病或疾患有关。在另一实施方案中，所述神经系统的损伤、 疾病或疾患选自神经性痛、神经病、头痛、偏头痛、心因性疼痛、慢性头 部疼痛和脊髓损伤。
[23]在本发明的另一实施方案中，门控离子通道的活性选自肌肉骨胳和 结缔组织系统、呼吸系统、循环系统、生殖泌尿系统、胃肠系统或神经系 统的炎性疾患。在另一实施方案中，所述肌肉骨胳和结缔组织系统的炎性 疾患选自关节炎、牛皮癣、肌炎(myocitis)、皮肤炎、骨癌和湿疹。在再 一实施方案中，所述呼吸系统的炎性疾患选自哮喘、支气管炎、鼻窦炎、 咽炎、喉炎、气管炎、鼻炎、囊性纤维化、呼吸道感染和急性呼吸困难综 合征。在又一实施方案中，所述循环系统的炎性疾患选自脉管炎、血尿综 合征、动脉粥样硬化、动脉炎、静脉炎、心脏炎和冠心病。在另一实施方 案中，所述胃肠系统的炎性疾患选自炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏 病、憩室炎、病毒感染、细菌传染、消化性溃疡、慢性肝炎、齿龈炎、牙 周炎(periodentitis)、口腔炎、胃炎和胃肠回流疾病。在再一实施方案中， 所述生殖泌尿系统的炎性疾患选自膀胱炎、多囊性肾病、肾病综合征、尿 路感染、胱氨酸症、前列腺炎、输卵管炎、子宫内膜异位症和泌尿生殖器 癌症。
[24]在另一实施方案中，所述神经疾患选自精神分裂症、学习障碍、双 相型障碍、抑郁症、阿尔茨海默氏症、癫痫症、多发性硬化、肌萎缩性侧 索硬化、中风、成瘾、脑缺血、神经病、视网膜色素退化、青光眼、心脏 心律不齐、带状疱疹、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏症、焦虑症、恐慌症、 恐惧症、焦虑性歇斯底里、广泛性焦虑症和神经官能症。
[25]在另一方面中，本发明提供了一种治疗病对象疼痛的方法，其包括 向对象施用有效量的本发明化合物。在一个实施方案中，所述对象为哺乳 动物。在再一实施方案中，所述哺乳动物为人。
[26]在又一实施方案中，所述疼痛选自皮肤痛、躯体痛、内脏痛和神经 性痛。在再一实施方案中，所述疼痛为急性痛或慢性痛。
[27]在另一方面中，本发明提供了一种治疗病对象炎性疾患的方法，其 包括向对象施用有效量的本发明化合物。在一个实施方案中，所述对象为 哺乳动物。在再一实施方案中，所述哺乳动物为人。
[28]在又一实施方案中，所述炎性疾患为肌肉骨胳和结缔组织系统、呼 吸系统、循环系统、生殖泌尿系统、胃肠系统或神经系统的炎性疾患。
[29]在另一方面中，本发明提供了一种治疗病对象神经疾患的方法，其 包括施用有效量的本发明化合物。在一个实施方案中，所述对象为哺乳动 物。在再一实施方案中，所述哺乳动物为人。
[30]在又一实施方案中，所述神经疾患选自精神分裂症、双相型障碍、 抑郁症、阿尔茨海默氏症、癫痫症、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、中 风、成瘾、脑缺血、神经病、视网膜色素退化、青光眼、心脏心律不齐、 带状疱疹、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏症、焦虑症、恐慌症、恐惧症、焦 虑性歇斯底里、广泛性焦虑症和神经官能症。
[31]在另一方面中，本发明提供了一种治疗病对象与泌尿生殖器和/或胃 肠系统有关的疾病或疾患的方法，其包括向对象施用有效量的本发明化合 物。在另一实施方案中，所述对象为哺乳动物。在再一实施方案中，所述 哺乳动物为人。
[32]在又一实施方案中，所述胃肠系统的疾病或疾患选自胃炎、十二指 肠炎、过敏性肠综合征、结肠炎、克罗恩氏病、溃疡和憩室炎。在另一实 施方案中，所述生殖泌尿系统的疾病或疾患选自膀胱炎、尿路感染、肾小 球肾炎、多囊性肾病、肾结石和生殖泌尿系统癌症。
[33]在本发明的另一实施方案中，所述方法还包括施用佐剂组合物。在 又一实施方案中，所述佐剂组合物选自阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、 局部麻醉剂、皮质类甾醇、非甾体抗炎药物、非选择性COX抑制剂、非 选择性COX2抑制剂、选择性COX2抑制剂、抗癫痫剂、巴比妥类药物、 抗抑郁剂、大麻和局部镇痛剂。
附图说明
[34]图1示出了如实施例1中所述化合物R对hASIC1a活性的抑制效果 的剂量依赖曲线。使瞬时表达hASIC1a的HEK-293细胞在有和没有浓度 渐增的化合物R的情况下与温和的酸性缓冲液接触。通过用钙选择性荧光 染料测定细胞内钙的改变确定门通道活性。化合物R剂量依赖性地抑制了 这些细胞中酸诱导的hASIC1a活性。
[35]图2A和B示出了如实施例2中所述化合物B和R对酸诱导的重组 同源hASIC1a通道活性的剂量依赖性抑制效果。HEK293细胞用hASIC1a 转染。用膜片钳法的全细胞模式(电压钳模式)记录有和没有化合物的情况 下酸诱导的内向电流。对于各化合物均清楚地观察到温和的pH刺激所引 起电流的剂量依赖性降低，表明化合物B和R为酸门控离子通道活性的抑 制剂。
[36]图3A、3B和3C给出了如实施例2中所述化合物R对hASIC1和 hASIC3电流的影响更详细的分析。在该实施例中，CHO细胞用hASIC1a 或hASIC3单独转染并用膜片钳法的全细胞模式(电压钳模式)记录有和没 有化合物的情况下酸诱导的内向电流。在图3A中，1μM的化合物R能将 hASIC1a电流降低约一半，而在图3B中，30μM的化合物R未抑制hASIC3- 介导的电流。图3C表明化合物R对酸诱导的重组同源hASIC1a通道活性 具有剂量依赖性抑制效果而对hASIC3却没有。这些数据一起表明，相对 于hASIC3，化合物R对hASIC1a有选择性。
[37]图4A、4B、4C和4D分别示出了如实施例3中所述化合物B、R、 7和32对酸诱导的重组同源hASIC1a通道活性的剂量依赖性抑制效果。 用双电极电压钳法记录有和没有化合物的情况下微注射了编码cDNA的 hASIC1a的爪蟾卵母细胞的酸诱导电流。对于各化合物，因温和的pH刺 激所引起的电流均有剂量依赖性降低，表明化合物B、R、7和32为酸门 控离子通道活性的抑制剂。
[38]图5示出了化合物A对大鼠中跖内注射福尔马林所引起化学诱导自 发痛的效果(实施例5中所述福尔马林模型)。这些结果表明该化合物使疼 痛强度(由回缩行为评价)发生剂量依赖性降低。
[39]图6示出了化合物R的不同浓度对大鼠中福尔马林诱导疼痛的影 响。图6A给出了跖内注射福尔马林后总体疼痛行为(如缩爪、舔爪和咬爪) 随时间的变化，图6B示出了舔爪和咬爪的次数。这些结果表明化合物R 使大鼠中的疼痛行为发生剂量依赖性降低。
[40]图7示出了化合物R对福尔马林诱导疼痛的剂量依赖性效果。给出 了化合物A与福尔马林试验第IIa阶段中舔爪和咬爪次数的剂量依赖关系。 使疼痛得分减半(ED50)的有效剂量为～50mg/kg。
[41]图8示出了化合物36、37和38的制备的合成示意图。
[42]图9A、9B、9C和9D示出了化合物39和47的合成示意图以及本 发明的一般化合物的预言性合成示意图。
[43]图10示出了化合物108的制备的合成示意图。
[44]图11A和11B示出了化合物103和104的制备的合成示意图。
[45]图12示出了可用于本发明化合物的制备的中间体其制备的合成示 意图。
[46]图13A、13B和13C示出了化合物107、105和106的制备的合成示 意图。
[47]图14A和14B示出了化合物111和109的制备的合成示意图。
[48]图15A、15B和15C示出了化合物12、112和110的制备的合成示 意图。
发明详述
[49]本发明至少部分基于可用于门控离子通道活性调节中的化合物的识 别。门控离子通道涉及在细胞(例如电兴奋细胞如神经元或肌细胞)中信号 的接收、传导和传递中。门控离子通道可决定膜兴奋性(例如细胞响应刺激 并将其转化为感觉冲动的能力)。门控离子通道也可影响膜的静息电位、动 作电位的波形和频率以及兴奋阈。门控离子通道通常表达于电兴奋细胞如 神经元细胞中并为多亚基的；其可形成同源多聚体(例如由一种类型的亚基 构成)或异源多聚体结构(例如由一种以上类型的亚基构成)。门控离子通道 也可在非兴奋细胞(例如脂肪细胞或肝细胞)中找到，在其中它们可起例如 信号转导作用。
[50]门控离子通道通常为由亚基构成的同源或异源复合物，其包含至少 一种属于DEG/ENaC、TRPV和/或P2X基因超家族的亚基。DEG/ENaC 受体基因超家族的非限制性实例包括上皮Na+通道(例如αENaC、βENaC、 γENaC和/或δENaC)、哺乳动物退化蛋白(也称MDEG)、脑Na+通道 (BNaC、BNC)和酸感受离子通道(ASICs)(例如ASIC1、ASIC1a、ASIC1b、 ASIC2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和/或ASIC4)。P2X受体基因超家族 的非限制性实例包括P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6和P2X7。
TRPV受体基因超家族的非限制性实例包括TRPV1(也称VR1)、TRPV2(也 称VRL-1)、TRPV3(也称VRL-3)、TRPV4(也称VRL-2)、TRPV5(也称 ECAC-1)和/或TRPV6(也称ECAC-2)。
[51]异源多聚体门控离子通道的非限制性实例包括αENaC、βENaC和 γENaC；αENaC、βENaC和δENaC；ASIC1a和ASIC2a；ASIC1a和 ASIC2b；ASIC1a和ASIC3；ASIC1b和ASIC3；ASIC2a和ASIC2b； ASIC2a和ASIC3；ASIC2b和ASIC3；ASIC1a、ASIC2a和ASIC3；ASIC3 和P2X(例如P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6和P2X7)，优选ASIC3 和P2X2；ASIC3和P2X3；和ASIC3、P2X2和P2X3；ASIC4与ASIC1a、 ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b和ASIC3中的至少一者；BLINaC(或hINaC) 与ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4中的至少一者； δENaC和ASIC(例如ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和 ASIC4)；P2X1和P2X2、P2X1和P2X5、P2X2和P2X3、P2X2和P2X6、P2X4 和P2X6、TRPV1和TRPV2、TRPV5和TRPV6、TRPV1和TRPV4。
[52]基于以上所述，需要调制离子通道活性的组合物和其使用方法以治 疗与疼痛、炎症、神经系统、胃肠系统和生殖泌尿系统有关的病症、疾病 和疾患。
定义
[53]本文中用到的术语“酸”指羧酸、磺酸、亚磺酸、氨基磺酸、膦酸和 硼酸官能团。
[54]术语“烷基”包括饱和脂族基，包括直链烷基(例如甲基、乙基、丙基、 丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、支链烷基(异丙基、叔 丁基、异丁基等)、环烷(脂环)基(环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛 基)、烷基取代环烷基和环烷基取代烷基。此外，表达“Cx-Cy-烷基”(其中x 为1-5，y为2-10)表示具有特定碳范围的特定烷基(直链或支链)。例如，表 达C1-C4-烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、叔丁基和 异丁基。
[55]术语烷基还包括可进一步含取代烃主链的一个或多个碳的氧、氮、 硫或磷原子的烷基。在一个实施方案中，直链或支链烷基主链中有10个或 以下碳原子(例如，对于直链，C1-C10；对于支链，C3-C10)，更优选6个或 以下碳。同样，优选的环烷基在其环结构中有4-7个碳原子，更优选在其 环结构中有5或6个碳。
[56]此外，烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基等)包括“未 取代烷基”和“取代烷基”，后者指具有取代烃主链一个或多个碳上的氢的取 代基的烷基部分，其使分子可发挥其预期功能。
[57]术语“取代”用于描述具有取代分子的一个或多个原子如C、O或N 上的氢的取代基的部分。这类取代基可包括例如烯基、炔基、卤素、羟基、 烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、碳酸盐、烷基 羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰 基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸盐、磷酰基、膦酰基、氨基(包括烷基氨 基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包 括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯 基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸盐、硫酸盐、烷基亚硫酰基、磺酸盐、氨 磺酰、磺酰胺、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环、烷基芳基、吗啉 基、苯酚、苄基、苯基、哌嗪、环戊烷、环己烷、吡啶、5H-四唑、三唑、 哌啶或芳族或杂芳族部分。
[58]本发明的取代基的其他实例包括但不限于选自直链或支链烷基(优 选C1-C5)、环烷基(优选C3-C8)、烷氧基(优选C1-C6)、硫代烷基(优选C1-C6)、 烯基(优选C2-C6)、炔基(优选C2-C6)、杂环基、碳环基、芳基(如苯基)、芳 氧基(如苯氧基)、芳烷基(如苄基)、芳氧烷基(如苯氧烷基)、芳基乙酰亚胺 基、烷基芳基、杂芳烷基、烷基羰基和芳基羰基或其他这类酰基、杂芳基 羰基或杂芳基、(CR’R”)0-3NR’R”(如-NH2)、(CR’R”)0-3CN(如-CN)、-NO2、 卤素(如-F、-Cl、-Br或-I)、(CR’R”)0-3C(卤素)3(如-CF3)、(CR’R”)0-3CH(卤 素)2、(CR’R”)0-3CH2(卤素)、(CR’R”)0-3CONR’R”、(CR’R”)0-3(CNH)NR’R”、 (CR’R”)0-3S(O)1-2NR’R”、(CR’R”)0-3CHO、(CR’R”)0-3O(CR’R”)0-3H、 (CR’R”)0-3S(O)0-3R’(如-SO3H、-OSO3H)、(CR’R”)0-3O(CR’R”)0-3H(如 -CH2OCH3和-OCH3)、(CR’R”)0-3S(CR’R”)0-3H(如-SH和-SCH3)、 (CR’R”)0-3OH(如-OH)、(CR’R”)0-3COR’、(CR’R”)0-3(取代或未取代苯基)、 (CR’R”)0-3(C3-C8环烷基)、(CR’R”)0-3CO2R’(如-CO2H)或(CR’R”)0-3OR’基 团或任何天然存在的氨基酸的侧链的部分；其中R’和R”各自独立地为氢、 C1-C5烷基、C2-C5烯基、C2-C5炔基或芳基。这类取代基可包括例如卤素、 羟基、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、羧酸酯、 烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸盐、磷 酰基、膦酰基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳 基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、 氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、肟、硫醇、烷硫基、芳硫基、硫代碳 酸盐、硫酸盐、磺酸盐、氨磺酰、磺酰胺、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮 基、杂环基或芳族或杂芳族部分。在某些实施方案中，羰基部分(C＝O)可 经肟部分进一步衍生化，例如醛部分可衍生化为其肟(-C＝N-OH)类似物。 本领域技术人员应理解，烃链上取代的部分其自身可酌情被取代。例如， 环烷基可进一步为上述取代基所取代。“芳烷基”部分为被芳基(例如苯甲基 (即苄基))所取代的烷基。
[59]术语“胺”或“氨基”应理解为广泛适用于分子或部分或官能团，如本 领域内的广义理解那样，并可为伯、仲或叔的。术语“胺”或“氨基”包括其 中氮原子与至少一个碳、氢或杂原子共价键合的化合物。该术语包括例如 但不限于“烷基氨基”、“芳基氨基”、“二芳基氨基”、“烷基芳基氨基”、“烷 基氨基芳基”、“芳基氨基烷基”、“烷基氨基烷基”、“酰胺”、“酰氨基”和“氨 基羰基”。术语“烷基氨基”包括其中氮与至少一个其他烷基键合的基团和化 合物。术语“二烷基氨基”包括其中氮原子与至少两个其他烷基键合的基团。 术语“芳基氨基”和“二芳基氨基”包括其中氮与至少一个或分别两个芳基键 合的基团。术语“烷基芳基氨基”、“烷基氨基芳基”或“芳基氨基烷基”指与 至少一个烷基和至少一个芳基键合的氨基。术语“烷基氨基烷基”指与也与 烷基键合的氮原子键合的烷基、烯基或炔基。
[60]术语“酰胺”、“酰氨基”或“氨基羰基”包括含与羰基或硫代羰基的碳 键合的氮原子的化合物或部分。所述术语包括含与氨基键合的烷基、烯基、 芳基或炔基且所述氨基还与羰基键合的“烷基氨基羰基”。其包括含与氨基 键合的芳基或杂芳基部分且所述氨基还与羰基或硫代羰基的碳键合的芳 基氨基羰基和芳基羰基氨基。术语“烷基氨基羰基”、“烯基氨基羰基”、“炔 基氨基羰基”、“芳基氨基羰基”、“烷基羰基氨基”、“烯基羰基氨基”、“炔 基羰基氨基”和“芳基羰基氨基”均包括在术语“酰胺”中。酰胺还包括脲基 (氨基羰基氨基)和氨基甲酸酯(氧代羰基氨基)。
[61]在本发明的特定实施方案中，术语“胺”或“氨基”指式N(R8)R9或 C1-6-N(R8)R9取代基，其中R8和R9各自独立地选自-H和-(C1-4烷基)0-1G， 其中G选自-COOH、-H、-PO3H、-SO3H、-Br、-Cl、-F、-O-C1-4烷基、 -S-C1-4烷基、芳基、-C(O)OC1-C6-烷基、-C(O)C1-4烷基-COOH、-C(O)C1-C4- 烷基和-C(O)-芳基；或N(R8)R9为吡咯基、四唑基、吡咯烷基、吡咯烷基 -2-酮、二甲基吡咯基、咪唑基和吗啉基。
[62]术语“芳基”包括可含零到四个杂原子的5-和6-元单环芳基，例如苯 基、吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、异噻唑、咪唑、三唑、四唑、吡唑、恶唑、 异恶唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。此外，术语“芳基”包括多环芳基， 例如三环、二环芳基，如萘、苯并恶唑、苯并二恶唑、苯并噻唑、苯并咪 唑、苯并噻吩、亚甲基二氧苯基、喹啉、异喹啉、蒽基、菲基、萘啶、吲 哚、苯并呋喃、嘌呤、苯并呋喃、氮杂嘌呤或中氮茚。在环结构中有杂原 子的芳基也可称为“芳基杂环”、“杂环”、“杂芳基”或“杂芳族”。芳环可在 一个或多个环位置为上述取代基所取代，例如烷基、卤素、羟基、烷氧基、 烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、碳酸盐、烷基 羰基、烷基氨基羰基、芳烷基氨基羰基、烯基氨基羰基、烷基羰基、芳基 羰基、芳烷基羰基、烯基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫代羰基、 磷酸盐、磷酰基、膦酰基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基 氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基 羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷硫基、芳硫基、 硫代碳酸盐、硫酸盐、烷基亚硫酰基、磺酸盐、氨磺酰、磺酰胺、硝基、 三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基或芳族或杂芳族部分。芳基还可与脂环 或非芳香杂环稠合或桥接以形成多环(例如四氢化萘)。
[63]术语“吸电子基团”或“吸电子原子”(也称“EWG”)是本领域内熟知 的，表示取代基从相邻原子吸引价电子的趋势，即相对于相邻原子而言所 述取代基是电负性的。吸电子能力水平的量化由哈默特(Hammett)σ(∑) 常数给出。这一众所周知的常数在许多文献中均有描述，例如J.March， Advanced Organic Chemistry(高等有机化学)，McGraw Hill Book Company，New York，(1977版)第251-259页。对于给电子基团，哈默特常 数值常为负(对于NH2，∑[P]＝-0.66)，而对于吸电子基团常为正(对于硝基， ∑[P]＝0.78)，其中∑[P]代表对位取代。吸电子基团的非限制性实例包括硝 基、酰基、甲酰、磺酰、三氟甲基、氰基、氯化物、羰基、硫代羰基、酯、 亚氨基、酰氨基、羧酸、磺酸、亚磺酸、氨基磺酸、膦酸、硼酸、硫酸酯、 羟基、巯基、氰基、氰酸盐、硫代氰酸盐、异氰酸盐、异硫代氰酸盐、碳 酸盐、硝酸盐和硝基等。示例性的吸电子原子包括但不限于氧原子、氮原 子、硫原子或卤素原子(如氟、氯、溴或碘原子)。应理解，除非另有指出， 否则本文中提到的酸性官能团也涵盖与适宜阳离子结合的该官能团的盐。
[64]应指出，本发明的一些化合物的结构含不对称碳原子。因此应理解， 因这类不对称性而产生的异构体(如所有对映异构体和非对映体)均包括在 本发明的范围内。这类异构体可通过传统分离技术和通过立体化学控制合 成以基本纯净的形式获得。此外，本申请中讨论的结构和其他化合物及部 分也包括其所有互变异构体。本文所述化合物可通过本领域公认的合成策 略获得。
[65]本文所述反应的最终产物可通过常规技术如通过萃取、结晶、蒸馏、 色谱等分离。
[66]另外，术语“其任意组合”意思是可组合任何数量的所列官能团和分 子以产生更大的分子结构。例如，术语“芳基”(其代表苯基)、“CO2X1”(其 中X1＝H)和C1-5-烷基(即-CH3和-CH2CH2CH2-)可组合形成3-甲氧基-4-丙氧 基苯甲酸取代基。应理解，当组合官能团和分子以形成更大的分子结构时， 可根据需要除或加氢以满足各原子的化合价。
[67]本文中用到的术语“门控离子通道”或“门通道”可互换使用，指响应 例如电压(如膜去极化或超极化)、温度(如高于或低于37℃)、pH(如高于或 低于7.4的pH值)、配体浓度的改变和/或机械刺激的哺乳动物(例如大鼠、 小鼠、人)多亚基复合物。特定调节剂的实例包括但不限于内源性细胞外配 体，如花生四烯酸乙醇胺、ATP、谷氨酸盐、半胱氨酸、甘氨酸、γ-氨基 丁酸(GABA)、组氨酸、血清素(5HT)、乙酰胆碱、肾上腺素、新肾上腺素、 质子、离子(如Na+、Ca++、K+、Cl-、H+、Zn+)和/或肽(如甲硫-脑啡肽、亮 氨酸脑啡肽、强啡肽)、神经营养因子和/或RF氨基化合物(RFamide)相 关肽(如FMRF氨基化合物(FMRFamide)或FLRF氨基化合物 (FLRFamide))；内源性细胞内配体，如环式核苷酸(如环式AMP、环式 GMP)、ATP、Ca++和/或G-蛋白；外源性细胞外配体或调节剂，如α-氨基 -3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸盐(AMPA)、氨氯吡脒、辣椒素、辣椒平 (capsazepine)、地棘蛙素、镉、钡、钆、胍、红藻氨酸盐、N-甲基-D-天冬 氨酸酯(NMDA)。门控离子通道也包括响应毒素的复合物，所述毒素的实 例包括但不限于漏斗网蛛毒素(如α-漏斗网蛛毒素IVA、IVB、ω-漏斗网蛛 毒素IVA、TK)、蝎毒素(蝎毒素2)、蜜蜂神经毒素、蜘蛛毒素(Argiotoxin)、 箭毒蛙毒素、裸藻毒(如裸藻毒PbTx-2、PbTx-3、PbTx-9)、北非蝎毒素、 氯毒素、鱼肉毒素、芋螺毒素(如α-芋螺毒素GI、GIA、GII、IMI、MI、 MII、SI、SIA、SII和/或EI；δ-芋螺毒素；μ-芋螺毒素GIIIA、GIIIB、 GIIIC和/或GS；ω-芋螺毒素GVIA、MVIIA、MVIIC、MVIID、SVIA 和/或SVIB)、树眼镜蛇毒素、捕鸟蛛毒素(GsMTx-4、ω-捕鸟蛛毒素SIA)、 木藜芦毒素、哈那毒素(Hanatoxins)、非洲蝎毒(Iberiotoxins)、短肽蝎毒素、 久罗毒素(Jorotoxins)、短肤蝎毒素、南非蝎毒素(Kurtoxins)、海南捕鸟蛛 毒素1(Leiurotoxin 1)、苦毒素(Pricotoxins)、普萨莫毒素(Psalmotoxins)(如 普萨莫毒素1(Psalmotoxin 1)(PcTx1))、玛格毒素、诺克休斯毒素 (Noxiustoxins)、智利火乌蛛(Phrixotoxins)、PLTX II、石房蛤毒素、海葵 毒素(Stichodactyla Toxins)、海葵毒素(如得自埃里根司马海葵毒素 (Anthopleura elegantissima)的APETx2)、河豚毒素、钳蝎属毒素K-α、缘 青蟹毒素(Scyllatoxins)和/或筒箭毒碱。
[68]在优选的实施方案中，本发明的化合物调节ASIC1a和/或ASIC3的 活性。
[69]“门控离子通道介导活性”为通常在门控离子通道的存在下得到或直 接或间接调制(例如抑制或促进)的生物活性。门控离子通道介导活性包括 例如细胞如神经元或肌细胞中信号的接收、整合、转导、传导和传递。由 特定门控离子通道如ASIC1a或ASIC3介导的生物活性在本文中指门控离 子通道如ASIC1a-或ASIC3-介导的活性。为确定化合物抑制门控离子通道 介导活性的能力，可使用本文中所述的活体外和活体内检测。
[70]本文中用到的“神经传递”为通过其小信号分子(术语称神经递质)以 规定的方式从一个神经元快速传至另一细胞的过程。通常，伴随进入动作 电位的去极化后，突触前神经元末端将分泌神经递质。然后该神经递质扩 散通过突触间隙而作用于突触后细胞上的特定受体上，所述突触后细胞最 通常为神经元，但也可为另一细胞类型(如神经肌肉接点处的肌纤维)。神 经递质的作用可或为刺激性的(去极化突触后细胞)或为抑制性的(导致过极 化)。神经传递可通过神经调节剂快速增减，其中神经调节剂通常以突触前 或突触后方式起作用。研究已表明，门控离子通道ASIC1a可有助于神经 传递[Babini et al.，J Biol Chem.277(44)：41597-603(2002)]。
[71]门控离子通道介导活性的实例包括但不限于疼痛(如炎性痛、急性 痛、慢性恶性痛、慢性非恶性痛和神经性痛)、炎性疾患、泌尿生殖和胃肠 系统的疾病和疾患以及神经疾患(如神经变性或神经精神障碍)。
[72]“疼痛”定义为与现存或潜在的组织损伤有关的或是用这类损伤来描 述的不愉快感觉和情绪体验(疼痛研究国际协会-IASP)。最通常根据持续时 间(即急性对慢性痛)和基础病理生理学(即伤害感受性对神经性痛)对疼痛 分类。
[73]急性痛可描述为响应组织外伤和疾病而出现的具有情绪和认知以及 感觉特征并用作防御机制的不愉快体验。急性痛通常伴随有病理学(如外 伤、外科手术、分娩、服药、急性病状)且疼痛随相应损伤的愈合而解决。 急性痛主要是伤害感受性的，但也可是神经性的。
[74]慢性痛为拖延至愈合期后的疼痛，具有通常较低并不足以解释疼痛 的存在、强度和/或程度的确定的病理学级别(美国疼痛学会-APS)。慢性痛 可以是伤害感受性的、神经性的或二者，并由损伤(如外伤或外科手术)、 恶性病症或多种慢性病症(例如关节炎、纤维肌痛和神经病)引起。有时， 慢性痛的存在没有明显的原因。
[75]“伤害感受性疼痛”是由于组织和器官损伤产生的疼痛。伤害感受性 疼痛由身体的表面或深部组织中疼痛受体的活化引起。伤害感受性疼痛进 一步的特征为“躯体痛”，包括“皮肤痛”和“深部躯体痛”及“内脏痛”。
[76]“躯体痛”包括“皮肤痛”和“深部躯体痛”。皮肤痛由皮肤和相关器官 的损伤、疾病和疾患引起。与皮肤痛有关的病症的实例包括但不限于切伤、 烧伤、感染、裂伤、以及外伤性损伤和术后或手术疼痛(例如切口位置)。
[77]“深部躯体痛”由肌肉骨胳组织的损伤、疾病或疾患引起，所述肌肉 骨胳组织包括韧带、腱、骨、血管和结缔组织。与深部躯体痛有关的深部 躯体痛或病症的实例包括但不限于扭伤、骨折、关节痛、脉管炎、肌痛和 肌筋膜痛。关节痛指由受伤(如扭伤、骨折或错位)和/或发炎(例如关节炎) 的关节引起的疼痛。血管炎指带疼痛的血管炎症。肌痛指源于肌肉的疼痛。 肌筋膜痛指源自筋膜和/或肌肉的损伤或炎症的疼痛。
[78]“内脏”痛与身体器官和内腔的损伤、炎症或疾病有关，其中所述身 体器官和内腔包括但不限于循环系统、呼吸系统、胃肠系统、生殖泌尿系 统、免疫系统以及耳、鼻和喉。内脏痛也可与侵袭身体器官和组织的传染 性和寄生性疾病有关。内脏痛特别难以定位，内脏组织的若干损伤表现出 牵涉性痛，其中感觉发生在与损伤位置完全不相关的区域。例如，心肌局 部缺血(部分心肌组织缺血)可能是牵涉性痛最好的已知实例；感觉可能发 生在胸上部，感觉为受限或左肩、臂或甚至手中的疼痛。幻肢痛为来自不 再拥有或不再自其得到物理信号的肢体的疼痛感觉，这是截肢者和四肢瘫 痪者几乎普遍都有的体验。
[79]“神经性痛”或“源于神经组织的疼痛”为由神经系统中的原发性损 害、机能障碍或扰动引发或引起的疼痛。“神经性痛”可因周围神经系统(“周 围神经性痛”)和中枢神经系统(“中枢性疼痛”)的外伤、炎症或疾病而发生。 例如，神经性痛可由受刺激、受压迫、受压、断裂或发炎(神经炎)的神经 所引起。存在许多神经性痛综合征，如糖尿病性神经病、三叉神经痛、带 状疱疹神经痛(“带状疱疹”)、中风后疼痛和复杂性区域疼痛综合征(也称反 射性交感神经营养不良或“RSD”和灼痛)。
[80]本文中用到的术语“炎性疾病或疾患”包括至少部分由炎症引起或加 剧的疾病或疾患，其特征通常在于受侵袭组织和器官中的血流增加、水肿、 免疫细胞活化(如增殖、细胞因子生成或噬菌作用增强)、发热、发红、肿 胀、疼痛和功能失却。炎症的原因可能是由于物理损伤、化学物质、微生 物、组织坏死、癌症或其他药剂。炎性疾患包括急性炎性疾患、慢性炎性 疾患和复发性炎性疾患。急性炎性疾患通常是持续时间较短的，持续约几 分钟至约一到两天，但也可持续几周。急性炎性疾患的主要特征包括血流 增加、液体和血浆蛋白渗出(水肿)以及白细胞如嗜中性粒细胞的迁移。慢 性炎性疾患通常持续时间较长，例如数星期到数月到数年或更久，并在组 织学上伴随淋巴细胞和巨噬细胞的存在以及血管和结缔组织的增殖。复发 性炎性疾患包括一段时间后复发或具有周期性的疾患。一些疾患可属于一 个或多个类别。
[81]术语“神经疾患”和“神经变性疾患”指神经系统(包括周围神经系统 和中枢神经系统)的损伤、疾病和机能障碍。神经疾患和神经变性疾患包括 但不限于与门控离子通道介导生物活性有关的疾病和疾患。神经疾患的实 例包括但不限于阿尔茨海默氏症、癫痫症、癌症、神经肌肉疾病、多发性 硬化、肌萎缩性侧索硬化、中风、脑局部缺血、神经病(如化疗引发神经病、 糖尿病性神经病)、视网膜色素变性、亨廷顿氏舞蹈病和帕金森氏症、学习 障碍、焦虑症(如恐怖症(如广场恐怖症、幽闭恐怖症)、恐慌症、恐惧症、 焦虑症、广泛性焦虑症和神经官能症)、和共济失调性毛细血管扩张症。
[82]本文中用到的“神经病”定义为至和自脑和脊髓传送信息的神经的故 障，其导致一种或多种疼痛、感觉缺失以及对肌肉控制的无能为力。有时， 控制血管、肠和其他器官的神经的故障导致异常的血压、消化问题以及其 他基本身体过程的缺失。周围神经病可涉及单个神经或神经组的损伤(单神 经病)或可影响多个神经(多神经病)。
[83]术语“治疗”包括至少一种与被治疗的疼痛、炎性疾患、神经疾患、 泌尿生殖器疾患或胃肠疾患有关的症状(如与门控离子通道介导活性有关 或由其所引起的症状)的减轻或缓和。在某些实施方案中，治疗包括用门控 离子通道调节化合物调节门控离子通道(如ASIC1a和/或ASIC3)的相互作 用，其又将减轻或缓和至少一种与被治疗的门控离子通道介导活性有关或 由其所引起的症状。例如，治疗可为一种或数种疾患症状的减轻或疾患的 完全根除。
[84]本文中用到的术语化合物的“治疗学有效量”为治疗或预防疼痛、炎 性疾患、神经疾患、胃肠疾患或泌尿生殖器疾患(如预防门控离子通道介导 活性的多种形态学和身体症状)所必要或足以治疗或预防上述疾患的量。在 一个实例中，化合物的有效量为足以缓和疾患(如对象中的疼痛、炎症、神 经疾患、胃肠疾患或泌尿生殖器疾患)的至少一种症状的量。
[85]术语“对象”包括能患门控离子通道相关病症或门控离子通道相关疾 患或任何直接或间接涉及门控离子通道活性的疾患或受其烦扰的动物。对 象的实例包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、老 鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方案中，对象为人，如患、 有风险患或可能患疼痛、炎症、神经疾患、胃肠疾患或泌尿生殖器疾患(如 伴随门通道相关活性)的人。
[86]术语“门控离子通道调节剂”指调节即抑制、促进或以其他方式改变 门控离子通道活性的化合物。例如，门控离子通道调节剂可抑制、促进或 以其他方式改变门控离子通道对例如电压(如膜去极化或过极化)、温度(如 高于或低于37℃)、pH(如高于或低于7.4的pH值)、配体浓度改变和/或 机械刺激的响应。门控离子通道调节剂的实例包括本发明的化合物(即式1、 2、3、4、5、5a、6、6a、7和8，包括其盐，如药学上可接受的盐)。门控 离子通道调节剂的其他实例包括表A、表B、表C、表D、表E和表F的 化合物或其衍生物和片段，包括其盐，如药学上可接受的盐。在特定的实 施方案中，本发明的门控离子通道调节剂(包括式1、2、3、4、5、5a、6、 6a、7和8化合物以及表A、表B、表C、表D、表E和表F的化合物) 可用来治疗病对象中与疼痛、炎症、神经疾患、胃肠疾患或泌尿生殖器疾 患有关的疾病或疾患。在另一实施方案中，本发明的化合物可用来治疗病 对象中的炎性疾患。
离子通道活性调节剂
[87]本发明提供了调节门控离子通道活性的化合物。在一些实施方案中， 本发明的化合物调节由属于DEG/ENaC、TRPV和/或P2X基因超家族的 至少一种亚基组成的门控离子通道的活性。在一些实施方案中，本发明的 化合物调节由选自αENaC、βENaC、γENaC、δENaC、ASIC1a、ASIC1b、 ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4、BLINaC、hINaC、P2X1、P2X2、P2X3、 P2X4、P2X5、P2X6、P2X7、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5 和TRPV6的至少一种亚基构成的门控离子通道的活性。在其他实施方案 中，本发明的化合物调节由选自αENaC、βENaC、γENaC、δENaC、 BLINaC、hINaC、ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4 的至少一种亚基构成的DEG/ENaC门控离子通道的活性。在某些实施方 案中，本发明的化合物调节由选自ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、 ASIC3和ASIC4的至少一种亚基构成的DEG/ENaC门控离子通道的活性。 在某些实施方案中，本发明的化合物调节由选自ASIC1a、ASIC1b、 ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4的至少两种亚基构成的DEG/ENaC 门控离子通道的活性。在其他实施方案中，本发明的化合物调节由选自 ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4的至少三种亚基 构成的DEG/ENaC门控离子通道的活性。在某些实施方案中，本发明的 化合物调节由ASIC(即ASIC1a或ASIC1b)构成的门控离子通道的活性。 在某些实施方案中，本发明的化合物调节由ASIC3构成的门控离子通道的 活性。在某些实施方案中，本发明的化合物调节由ASIC1a和ASIC2a； ASIC1a和ASIC2a；ASIC1a和ASIC3；ASIC1b和ASIC3；ASIC2a和 ASIC2b；ASIC2a和ASIC3；ASIC2b和ASIC3；ASIC1a和ASIC3；以 及ASIC1a、ASIC2a和ASIC3构成的门控离子通道的活性。在其他实施 方案中，本发明的化合物调节由选自P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、 P2X6和P2X7的至少一种亚基构成的P2X门控离子通道的活性。在某些实 施方案中，本发明的化合物调节由P2X2、P2X3或P2X4构成的门控离子 通道的活性。在某些实施方案中，本发明的化合物调节由P2X1和P2X2、 P2X1和P2X5、P2X2和P2X3、P2X2和P2X6以及P2X4和P2X6构成的门控 离子通道的活性。在本发明的另一方面中，本发明的化合物调节由选自 TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5和TRPV6的至少一种亚基 构成的TRPV门控离子通道的活性。在某些实施方案中，本发明的化合物 调节由TRPV1或TRPV2构成的门控离子通道的活性。在某些实施方案中， 本发明的化合物调节由TRPV1和TRPV2、TRPV1和TRPV4以及TRPV5 和TRPV6构成的门控离子通道的活性。
[88]在特定的实施方案中，本发明的化合物(包括式1、2和3化合物以 及式A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K化合物)调节ASIC1a和/或 ASIC3的活性。
[89]在一个方面中，调节门控离子通道活性的化合物为式1：

[90]或其药学上可接受的盐，其中虚线代表单或双键，其中当虚线代表 单键时，环的氮可键合到H或R1上。
[91]R1、R3和R4各自独立地选自氢、取代或未取代胺、氰基、硝基、 COOH、酰胺、卤素、卤素-C1-5-烷基、硝基、取代或未取代芳基、取代或 未取代环烷基、取代或未取代杂环、羟基、C1-5-烷基(其中C1-5-烷基可为O、 S或N(H)所中断)、羟基-C1-5-烷基、C1-5-烯基、C1-5-炔基、磺酰基、磺酰 胺、磺酸、(CH2)0-5OX6、(CH2)0-5CO2X6、N(H)(CH2)0-5OX6和 (CH2)0-5C(O)N(X6)2(其中X6独立地选自氢、C1-5-烷基、胺和-CO2X1，其中 X1选自氢、C1-5-烷基、氨基和取代或未取代芳基)；和其任意组合；
[92]R2选自氢、取代或未取代胺、酰胺、卤素、硝基、取代或未取代芳 基、取代或未取代环烷基、取代或未取代杂环、羟基、C1-5-烷基(其中C1-5- 烷基可为O、S或N(H)所中断)、羟基-C1-5-烷基、C1-5-烯基、C1-5-炔基、 磺酰基、磺酰胺、磺酸和-CO2X1(其中X1选自氢、C1-5-烷基、氨基和取代 或未取代芳基)；和其任意组合，或R2选自式I、II和III：

[93]其中，
[94]R8选自O、S和CH2；
[95]R6、R7、R9和R10各自独立地选自氢、C1-5-烷基(其中C1-5-烷基可为 O、S或N(H)所中断)、胺、取代或未取代芳基以及取代或未取代环烷基； n为0或1；m为0或1；X2为CH2、O或N(H)；X3和X4各自独立地为 N、C或C(H)；虚线代表单或双键；
[96]X5选自氢、C1-5-烷基、C1-5-烷氧基、(CH2)0-4-取代或未取代苯基、 (CH2)0-4-取代或未取代环己基、(CH2)0-4-苯并[1，3]二氧杂环戊烯 ((CH2)0-4-benzo[1，3]dioxole)，其中C1-5-烷基或CH2基团可为羰基或 -C(O)O-基团所中断；和
[97]R5为N、C或C(H)；
[98]其中R3和R4、R2和R3、R1和R4或R2和R4也能够形成稠合4、5 或6-元取代或未取代芳基、取代或未取代环烷基或取代或未取代杂环。
[99]在式1的另一实施方案中，虚线代表单或双键，其中当虚线代表单 键时，环的氮可键合到H或R1上；
[100]R1、R3和R4各自独立地选自氢、取代或未取代胺、氰基、硝基、 COOH、酰胺、卤素、卤素-C1-5-烷基、取代或未取代芳基、取代或未取代 环烷基、取代或未取代杂环、羟基、C1-5-烷基(其中C1-5-烷基可为O、S或 N(H)所中断)、羟基-C1-5-烷基、C1-5-烯基、C1-5-炔基、磺酰基、磺酰胺、磺 酸、(CH2)0-5OX6、(CH2)0-5CO2X6、N(H)(CH2)0-5OX6和(CH2)0-5C(O)N(X6)2(其 中X6独立地选自氢、C1-5-烷基、胺和-CO2X1，其中X1选自氢、C1-5-烷基、 氨基和取代或未取代芳基)；
[101]R2选自氢、取代或未取代胺、酰胺、卤素、硝基、取代或未取代芳 基、取代或未取代环烷基、取代或未取代杂环、羟基、C1-5-烷基(其中C1-5- 烷基可为O、S或N(H)所中断)、羟基-C1-5-烷基、C1-5-烯基、C1-5-炔基、 磺酰基、磺酰胺、磺酸和-CO2X1(其中X1选自氢、C1-5-烷基、氨基和取代 或未取代芳基)；或R2选自式I、II、III和IV：

[102]其中，
[103]R8选自O、S和CH2；
[104]R6、R7、R9和R10各自独立地选自氢、C1-5-烷基(其中C1-5-烷基可为 O、S或N(H)所中断)、胺、取代或未取代芳基以及取代或未取代环烷基； n为0或1；m为0或1；X2为CH2、O、N(C1-5-烷基)或N(H)；X3和X4 各自独立地为N、C或C(H)；虚线代表单或双键；
[105]X5选自氢、C1-5-烷基、C1-5-烷氧基、(CH2)0-4-取代或未取代苯基、 (CH2)0-4-取代或未取代吡啶基、C(O)Ph、(CH2)0-4-取代或未取代环己基、 (CH2)0-4-苯并[1，3]二氧杂环戊烯，其中C1-5-烷基或CH2基团可为羰基或 -C(O)O-基团所中断，其中CH2基团可为C1-5-烷基、卤素或CF3基团所取 代；
[106]a、b和c各自独立地为0或1；X7为C(H)、N或O；X8为H、C1-5- 烷基、芳基、OH、-O-C1-5-烷基或O-芳基；和R5为N、C或C(H)；
[107]其中R3和R4、R2和R3、R1和R4或R2和R4也能够形成稠合4、5 或6-元取代或未取代芳基、取代或未取代环烷基或取代或未取代杂环。
[108]在式1的另一实施方案中，式III的虚线代表单键。在式1的再一实 施方案中，R2为式III，m＝0，X3和X4为N，虚线代表单键。
[109]在式1的另一实施方案中，式1由式2代表：

[110]其中R1、R2、R3、R4和R5具有与式1中相同的含义。
[111]在式2的一个实施方案中，式2由式3代表：

[112]其中R1、R2、R3、R4和R5具有与式1中相同的含义。
[113]在式3的一个实施方案中，R1、R3和R4各自独立地选自氢、卤素、 C1-5-烷基、O-C1-5-烷基、卤素-C1-5-烷基、取代或未取代芳基、取代或未取 代杂环；
[114]R2选自氢、取代或未取代胺、酰胺、卤素、硝基、取代或未取代芳 基、取代或未取代环烷基、取代或未取代杂环、羟基、C1-5-烷基(其中C1-5- 烷基可为O、S或N(H)所中断)、羟基-C1-5-烷基、C1-5-烯基、C1-5-炔基、 磺酰基、磺酰胺、磺酸和-CO2X1(其中X1选自氢、C1-5-烷基、氨基和取代 或未取代芳基)；或R2选自式I、II和III：

[115]其中，
[116]R8选自O、S和CH2；R6、R7、R9和R10各自独立地选自氢、C1-5- 烷基(其中C1-5-烷基可为O、S或N(H)所中断)、胺、取代或未取代芳基以 及取代或未取代环烷基；n为0或1；m为0或1；X2为CH2、O、N(C1-5- 烷基)或N(H)；X3和X4各自独立地为N、C或C(H)；虚线代表单或双键； X5选自氢、C1-5-烷基、C1-5-烷氧基、(CH2)0-4-取代或未取代苯基、(CH2)0-4- 取代或未取代环己基、(CH2)0-4-苯并[1，3]二氧杂环戊烯，其中C1-5-烷基或 CH2基团可为羰基或-C(O)O-基团所中断；R5为N或C(H)。
[117]在式3的一个实施方案中，式III的虚线代表单键。在式3的另一实 施方案中，R3和R4各自独立地选自H、卤素、羟基、C1-5-烷基和C1-5-烷 氧基；
[118]R2选自C1-5-烷基、C1-5-烷氧基、CO2H和杂环；和
[119]R1选自杂环、为C1-5烷基所取代的杂环、和为羟基、C1-5-烷基或C1-5- 烷氧基一次或多次取代的苯基。
[120]在式3的另一实施方案中，R3和R4各自独立地选自H、Cl、Br、 OH和OCH3；R2选自CH3、CO2H和哌啶；R1选自哌嗪、为CH3所取代 的哌嗪、和为OH、OCH3或CH3一次或多次取代的苯基。
[121]在式3的一个实施方案中，式3由式4代表：

[122]其中，R1、R2、R4和R5具有与式2中相同的含义。
[123]在式4的一个实施方案中，R1选自氢、C1-5-烷基、O-C1-5-烷基、氟、 溴、三氟甲基、取代或未取代哌啶、取代或未取代哌嗪、取代或未取代吡 啶、取代或未取代吗啉、取代或未取代咪唑、取代或未取代吡唑、取代或 未取代二氮杂庚烷和取代或未取代苯基；
[124]R4选自氢、卤素、C1-5-烷基、CO2H和(CH2)0-3OH；
[125]R2选自氢、取代或未取代胺、酰胺、卤素、C1-5-烷基(其中C1-5-烷基 可为O、S或N(H)所中断)和-CO2X1(其中X1选自氢、C1-5-烷基、氨基和 取代或未取代芳基)；或R2选自式I、II和III：

[126]其中，
[127]R8选自O、S和CH2；R6、R7、R9和R10各自独立地选自氢、C1-5- 烷基(其中C1-5-烷基可为O、S或N(H)所中断)、胺、取代或未取代芳基以 及取代或未取代环烷基；n为0或1；m为0或1；X2为CH2、O或N(H)； X3和X4各自独立地为N、C或C(H)；虚线代表单或双键；X5选自氢、C1-5- 烷基、C1-5-烷氧基、(CH2)0-4-取代或未取代苯基、(CH2)0-4-取代或未取代环 己基、(CH2)0-4-苯并[1，3]二氧杂环戊烯，其中C1-5-烷基或CH2基团可为羰 基或-C(O)O-基团所中断；R5为N或C(H)。
[128]在式4的另一实施方案中，R1为吡啶，其可任选为OCH3、Cl、CH3 或NO2一次或多次取代；R5为C(H)；R2为式I或II；R4为卤素、(CH2)0-3OH 或CO2H。
[129]在式4的再一实施方案中，R2为式III，其中n为0，X2为N(H)或 N(C1-5-烷基)、X3为C(H)、X4为N、X5为(CH2)0-4-取代或未取代的苯基； R4为H；R1为C1-5-烷基。
[130]在式4的又一实施方案中，R1选自氢、甲基、乙基、甲氧基、氟、 溴、三氟甲基、甲基取代哌嗪、甲基取代二氮杂庚烷、吡啶、苯基、甲基 取代苯基以及为甲氧基、氟或溴一次或多次独立取代的苯基；
[131]R4选自H、Cl、Br和F；
[132]R2选自C1-5-烷基(其中C1-5-烷基可为O、S或N(H)所中断)和-CO2X1 (其中X1选自氢、C1-5-烷基、氨基和取代或未取代芳基)；或R2选自式III：

[133]其中n为0或1；m为0或1；X2为CH2、O或N(H)；X3和X4各 自独立地为N、C或C(H)；虚线代表单或双键；
[134]X5选自氢、C1-5-烷基、C1-5-烷氧基、(CH2)0-4-取代或未取代苯基、 (CH2)0-4-取代或未取代环己基、(CH2)0-4-苯并[1，3]二氧杂环戊烯，其中C1-5- 烷基或CH2基团可为羰基或-C(O)O-基团所中断；和
[135]R5为N或C(H)。
[136]在另一实施方案中，式3由式5代表：

[137]其中，R5为N或C(H)；R1选自氢、C1-5-烷基、氟、溴、三氟甲基、 取代或未取代哌啶、取代或未取代哌嗪、取代或未取代吗啉、取代或未取 代咪唑、取代或未取代吡唑、取代或未取代二氮杂庚烷和取代或未取代苯 基；R4选自氢、卤素、C1-5-烷基、CO2H和(CH2)0-3OH；w为0或1；R11 和R12各自独立地选自氢、C1-5-烷基(其中C1-5-烷基可为O、S或N(H)所中 断)、和取代或未取代苯基，或R11和R12能够形成如下6-元环：

[138]其中X5选自氢、C1-5-烷基、C1-5-烷氧基、(CH2)0-4-取代或未取代苯 基、(CH2)0-4-取代或未取代环己基、(CH2)0-4-苯并[1，3]二氧杂环戊烯，其中 C1-5-烷基或CH2基团可为羰基或-C(O)O-基团所中断。
[139]在另一实施方案中，式3由式5a代表：

[140]其中，
[141]R5为N或C(H)；R1选自氢、C1-5-烷基、O-C1-5-烷基、氟、溴、三 氟甲基、取代或未取代哌啶、取代或未取代哌嗪、取代或未取代吗啉、取 代或未取代咪唑、取代或未取代吡唑、取代或未取代二氮杂庚烷和取代或 未取代苯基；R4选自氢、卤素、C1-5-烷基、CO2H和(CH2)0-3OH；w为0 或1；和
[142]R11和R12各自独立地选自氢、C1-5-烷基(其中C1-5-烷基可为O、S或 N(H)所中断)、和取代或未取代苯基，或R11和R12能够形成如下6-元环：

[143]其中X5选自氢、C1-5-烷基、C1-5-烷氧基、(CH2)0-4-取代或未取代苯 基、(CH2)0-4-取代或未取代环己基、(CH2)0-4-苯并[1，3]二氧杂环戊烯，其中 C1-5-烷基或CH2基团可为羰基或-C(O)O-基团所中断。
[144]在式5a的一个实施方案中，w为0；R11为H或CH3；R12为 (CH2)1-4CO2H、(CH2)1-4CH3、为苄基所取代的哌啶或为CO2H所取代的苯 基；R1为氢、CH3、CH2CH3或为氯或CH3一次或多次取代的苯基；R4为 氢、氯或NO2。
[145]在式5的一个实施方案中，式5由式6代表：

[146]其中R4选自氢、卤素、C1-5-烷基、CO2H和(CH2)0-3OH；R1选自氢、 C1-5-烷基、氟、溴、三氟甲基、取代或未取代哌啶、取代或未取代哌嗪、 取代或未取代吗啉、取代或未取代咪唑、取代或未取代吡唑、取代或未取 代二氮杂庚烷和取代或未取代苯基；R5为N或C(H)；w为0或1；X5选 自氢、C1-5-烷基、C1-5-烷氧基、(CH2)0-4-取代或未取代苯基、(CH2)0-4-取代 或未取代环己基、(CH2)0-4-苯并[1，3]二氧杂环戊烯，其中C1-5-烷基或CH2 基团可为羰基或-C(O)O-基团所中断。
[147]在另一实施方案中，式5a由式6a代表：

[148]其中R4选自氢、卤素、C1-5-烷基、O-C1-5-烷基、CO2H和(CH2)0-3OH；
[149]R1选自氢、C1-5-烷基、氟、溴、三氟甲基、取代或未取代哌啶、取 代或未取代哌嗪、取代或未取代吗啉、取代或未取代咪唑、取代或未取代 吡唑、取代或未取代二氮杂庚烷和取代或未取代苯基；
[150]R5为N或C(H)；w为0或1；X5选自氢、C1-5-烷基、C1-5-烷氧基、 (CH2)0-4-取代或未取代苯基、(CH2)0-4-取代或未取代环己基、(CH2)0-4-苯并 [1，3]二氧杂环戊烯，其中C1-5-烷基或CH2基团可为羰基或-C(O)O-基团所 中断。
[151]在式6a的一个实施方案中，w为1；X5为(CH2)0-4-取代或未取代的 苯基、(CH2)0-4-C(O)-取代或未取代的苯基、(CH2)0-4-苯并[1，3]二氧杂环戊 烯、CH3或酰胺；R1为吡啶基、为OCH3、Cl或OH一次或多次独立取代 的苯基；R4为氢、卤素或OH。
[152]在式2的另一实施方案中，式6a由式7代表：

[153]其中，
[154]R4选自氢、卤素、C1-5-烷基、O-C1-5-烷基、CO2H和(CH2)0-3OH；
[155]R1选自氢、C1-5-烷基、氟、溴、三氟甲基、取代或未取代哌啶、取 代或未取代哌嗪、取代或未取代吗啉、取代或未取代咪唑、取代或未取代 吡唑、取代或未取代二氮杂庚烷和取代或未取代苯基；
[156]R5为N或C(H)；X5选自氢、C1-5-烷基、C1-5-烷氧基、(CH2)0-4-取代 或未取代苯基、(CH2)0-4-取代或未取代环己基、(CH2)0-4-苯并[1，3]二氧杂环 戊烯，其中C1-5-烷基或CH2基团可为羰基或-C(O)O-基团所中断。
[157]在式7的另一实施方案中，X5为H、C(O)O-叔丁基或为CN或NO2 所取代的苯基；R4为卤素，R1为C1-5-烷基。
[158]在式3的另一实施方案中，式3由式8代表：

[159]其中，
[160]R5为N或C(H)；R1选自氢、C1-5-烷基、氟、溴、三氟甲基、取代 或未取代哌啶、取代或未取代哌嗪、取代或未取代吗啉、取代或未取代咪 唑、取代或未取代吡唑、取代或未取代二氮杂庚烷和取代或未取代苯基；
[161]R4选自氢、卤素、C1-5-烷基、CO2H和(CH2)0-3OH；R11和R12各自 独立地选自氢、C1-5-烷基、C1-5-烷基-氨基(其中C1-5-烷基可为O、S或N(H) 所中断)、和取代或未取代苯基，或R11和R12能够形成如下6-元环：

[162]其中x和y各自独立地为0或1；
[163]其中X5选自氢、C1-5-烷基、C1-5-烷氧基、(CH2)0-4-取代或未取代芳 基、(CH2)0-4-取代或未取代环己基、(CH2)0-4-取代或未取代杂环、(CH2)0-4- 苯并[1，3]二氧杂环戊烯，其中C1-5-烷基或CH2基团可为羰基或-C(O)O-基 团所中断；
[164]其中由R11和R12形成的环可再为C1-5烷基、卤素或CO2H所取代。
[165]在式8的一个实施方案中，R1选自H、F、CH3、CF3、CN和为CH3 所取代的苯基；
[166]R4选自氢、F、OH、CH3、Br、Cl、OCH3、NO2和CF3；和
[167]R11和R12各自独立地选自氢、(CH2)1-4-卤素和(CH2)1-4N(CH3)CH2Ph， 或R11和R12能够形成如下环：

[168]其中x和y各自独立地为0或1；
[169]其中X5选自H、CH3、异丙基、叔丁基、环丙基、CH2-异丙基、CH2- 叔丁基、CH2-环丙基、CH2-环己基、CH2-CO2H、C(O)O-C1-5-烷基、C(O)Ph、 (CH2)1-4-吡啶基、CH(CH3)Ph、CH(CF3)Ph、CH(F)Ph和(CH2)1-4Ph，其中 所述苯基可为氯、CN、CO2H、NO2、Cl或OCH3一次或多次独立取代；
[170]其中由R11和R12形成的环可再为C1-5烷基、卤素或CO2H所取代。
[171]式1、2、3、4、5、5a、6、6a、7和8(包括其药学上可接受的盐及 其对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、非对映体、阻转 异构体或外消旋物)的优选实施方案在下面的表A、表B、表C、表D、表 E和表F中给出，并也视为“本发明的化合物”。本发明的化合物在本文中 也称“门控离子通道抑制剂”以及“ASIC抑制剂”。(“OX”＝OpusExpress； 参见实施例3；“Flex”＝FlexStation；参见实施例1；“PC”＝膜片钳；参见 实施例1)
































[172]本发明的化合物的酸加成盐最适宜自药学上可接受的酸形成，包括 例如与无机酸如盐酸、硫酸或磷酸和有机酸如琥珀酸、马来酸、乙酸或富 马酸形成的那些。其他非药学上可接受的盐如草酸盐可例如用在本发明的 化合物的分离中供实验室使用或供后续转化为药学上可接受的酸加成盐。 本发明的溶剂化物和水合物也包括在本发明的范围内。
[173]给定化合物盐向所需化合物盐的转化通过采用标准技术获得，在其 中，给定盐的水溶液经用碱如碳酸钠或氢氧化钾处理以释放游离碱，再将 游离碱提取进适宜的溶剂如醚中。然后从水部分分离出游离碱，干燥，并 用必要的酸处理得到所需的盐。
[174]本发明的某些化合物的活体内可水解的酯或酰胺可通过用所需酯的 酰氯在碱的存在下于惰性溶剂如二氯甲烷或氯仿的存在下处理这些具有 游离羟基或氨基官能的化合物形成。适宜的碱包括三乙胺或吡啶。相反， 具有游离羧基的本发明化合物可用标准条件酯化，其可包括活化、随后用 所需醇在适宜碱的存在下处理。
[175]药学上可接受的加成盐的实例包括但不限于无毒的无机和有机酸加 成盐，如源自盐酸的盐酸盐、源自氢溴酸的氢溴酸盐、源自硝酸的硝酸盐、 源自高氯酸的高氯酸盐、源自磷酸的磷酸盐、源自硫酸的硫酸盐、源自甲 酸的甲酸盐、源自乙酸的乙酸盐、源自乌头酸的乌头酸盐、源自抗坏血酸 的抗坏血酸盐、源自苯磺酸的苯磺酸盐、源自苯甲酸的苯甲酸盐、源自肉 桂酸的肉桂酸盐、源自柠檬酸的柠檬酸盐、源自扑酸的扑酸盐、源自庚酸 的庚酸盐、源自富马酸的富马酸盐、源自谷氨酸的谷氨酸盐、源自乙醇酸 的乙醇酸盐、源自乳酸的乳酸盐、源自马来酸的马来酸盐、源自丙二酸的 丙二酸盐、源自扁桃酸的扁桃酸盐、源自甲磺酸的甲磺酸盐、源自萘-2-磺 酸的萘-2-磺酸盐、源自苯二甲酸的苯二甲酸盐、源自水杨酸的水杨酸盐、 源自山梨酸的山梨酸盐、源自硬脂酸的硬脂酸盐、源自琥珀酸的琥珀酸盐、 源自酒石酸的酒石酸盐、源自对甲苯磺酸的对甲苯磺酸盐等。特别优选的 盐为本发明化合物的钠、赖氨酸和精氨酸盐。这类盐可通过本领域内众所 周知的程序形成。
[176]不可视为药学上可接受的其他酸如草酸可用于可用作获得本发明化 合物和其药学上可接受的酸加成盐中的中间体的盐的制备中。
[177]本发明的化合物的金属盐包括碱金属盐，如含羧基的本发明化合物 的钠盐。
[178]在本发明的上下文中，含N化合物的“鎓盐”也视为药学上可接受的 盐。优选的“鎓盐”包括烷基鎓盐、环烷基鎓盐和环烷基鎓盐。
[179]本发明的化合物可以可溶或不可溶的形式与药学上可接受的溶剂如 水、乙醇等一起提供。可溶形式也可包括水合形式如一水合物、二水合物、 半水合物、三水合物和四水合物等。一般来说，就本发明的目的而言，可 溶形式视为与不可溶的形式等价。
A.立体异构体
[180]本发明的化合物可以(+)和(-)形式以及外消旋形式存在。这些异构体 的外消旋物以及各异构体自身均在本发明的范围内。
[181]外消旋形式可用已知的方法和技术拆分为旋光对映体。一种分离非 对映异构体盐的方法是使用光活性酸并通过用碱处理释放光活性胺化合 物。拆分外消旋物为旋光对映体的另一种方法是基于光活性母体的色谱 法。本发明的外消旋化合物可因此例如通过例如d-或l-(酒石酸盐、扁桃酸 盐或樟脑磺酸盐)的分步结晶拆分为其旋光对映体。
[182]本发明的化合物也可通过使本发明的化合物与光活性活化羧酸如源 自(+)或(-)苯基丙氨酸、(+)或(-)苯基甘氨酸、(+)(-)樟脑酸的那些反应形成 非对映体酰胺或通过使本发明的化合物与光活性氯甲酸盐等反应形成非 对映体氨基甲酸盐而拆分。
[183]拆分光学异构体的其他方法是本领域内熟知的。这类方法包括 Jaques J，Collet A and Wilen S，“Enantiomers，Racemates，and Resolutions (对映体、外消旋物和拆分)”，John Wiley and Sons，New York(1981)中所描 述的那些。
[184]光活性化合物也可自光活性起始物料制备。
[185]此外，一些本发明的化合物为肟，其可因此以两种形式即顺-和反- 式(Z-和E-式)存在，具体取决于-C＝N-双键周围取代基的排列。本发明的 化合物可因此为顺-和反-式(Z-和E-式)或可为其混合物。应理解，特定化 合物的顺-和反-式(Z-和E-式)均在本发明的范围内，即便当所述化合物在 本文中以一种或另一种形式(即通过命名或分子的实际书法)所代表时。
[186]应理解，上述所有式1、2、3和4化合物还将应需要在相邻原子间 含双键以满足各原子的化合价。即加双键以提供每个下列类型原子总键数 量：碳：四个键；氮：三个键；氧：两个键；和硫：两到六个键。
[187]在另一实施方案中，本发明涉及本发明的门控离子通道调节剂，包 括其盐如药学上可接受的盐。本发明的特定实施方案涉及本发明的调节化 合物或其衍生物，包括其盐如药学上可接受的盐。
[188]在再一实施方案中，本发明涉及包含本文中所述门控离子通道调节 化合物和药学可接受载体的药物组合物。
[189]在另一实施方案中，本发明包括包含本文中所述本发明化合物的任 何新化合物或药物组合物。例如，包含本文中所述化合物(例如本发明的化 合物)的化合物和药物组合物是本发明的一部分，包括其盐如药学上可接受 的盐。
检测
[190]本发明涉及一种调节门控离子通道活性的方法。本文中用到的术语 “调节”的各种形式包括刺激(例如增加或上调特定响应或活性)和抑制(例如 降低或下调特定响应或活性)。在一个方面中，本发明的方法包括使细胞与 有效量的门控离子通道调节剂化合物如本发明的化合物接触，从而调节门 控离子通道的活性。在某些实施方案中，有效量的本发明化合物抑制门控 离子通道的活性。
[191]本发明的门控离子通道由属于DEG/ENaC、TRPV(也称香草酸) 和P2X基因超家族的至少一种亚基组成。在一个方面中，门控离子通道由 选自αENaC、βENaC、γENaC、δENaC、ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、 ASIC2b、ASIC3、ASIC4、BLINaC、hINaC、P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、 P2X5、P2X6、P2X7、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5和TRPV6 的至少一种亚基组成。在一个方面中，DEG/ENaC门控离子通道由选自 αENaC、βENaC、γENaC、δENaC、BLINaC、hINaC、ASIC1a、ASIC1b、 ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4的至少一种亚基组成。在某些实施方 案中，DEG/ENaC门控离子通道由选自ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、 ASIC2b、ASIC3和ASIC4的至少一种亚基组成。在某些实施方案中，门 控离子通道由ASIC1a、ASIC1b或ASIC3组成。在本发明的另一方面中， P2X门控离子通道由选自P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6和P2X7 的至少一种亚基组成。在本发明的又一方面中，TRPV门控离子通道由选 自TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5和TRPV6的至少一种亚 基组成。在另一方面中，门控离子通道为异源多聚体门控离子通道，包括 但不限于αENaC、βENaC和γENaC；αENaC、βENaC和δENaC；ASIC1a 和ASIC2a；ASIC1a和ASIC2b；ASIC1a和ASIC3；ASIC1b和ASIC3； ASIC2a和ASIC2b；ASIC2a和ASIC3；ASIC2b和ASIC3；ASIC1a、ASIC2a 和ASIC3；ASIC3和P2X(如P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、P2X5、P2X6 和P2X7)，优选ASIC3和P2X2；ASIC3和P2X3；和ASIC3、P2X2和P2X3； ASIC4与ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b和ASIC3中的至少一种； BLINaC(或hINaC)与ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和 ASIC4中的至少一种；δENaC与ASIC如ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、 ASIC2b、ASIC3和ASIC4中的至少一种；P2X1和P2X2、P2X1和P2X5、 P2X2和P2X3、P2X2和P2X6、P2X4和P2X6、TRPV1和TRPV2、TRPV5 和TRPV6、TRPV1和TRPV4。
[192]测定本发明范围内的化合物调节门控离子通道活性的能力的检测法 是本领域内熟知的，并在本文的实施例部分中描述。用于确定化合物调节 门控离子通道活性的能力的其他检测法对于熟练技术人员来说也是容易 的。
[193]本发明的门控离子通道调节化合物可用如下筛选法识别，所述方法 包括连续步骤
[194](i)使含门控离子通道的细胞受到选择性活化剂例如质子(通过调节 pH至酸性水平)、ATP(通过在灌注缓冲液中稀释足量的ATP)或温度(通过 加热灌注缓冲液至高于37℃的温度)的作用；
[195](ii)使含门控离子通道的细胞受到化合物(所述化合物可同时给药、 预先给药或后给药)的作用；和
[196](iii)监测活化剂如质子诱导的含门控离子通道细胞上膜电位或离子 电流的改变。或者可用荧光图像监测活化剂如质子在含门控离子通道细胞 上诱导的影响。
[197]可通过用任何方便的酸或缓冲液包括有机酸(如甲酸、乙酸、柠檬酸、 抗坏血酸、2-吗啉乙磺酸(MES)和乳酸)和无机酸(如盐酸、氢溴酸和硝酸、 高氯酸和磷酸)调节pH至酸性水平使含门控离子通道的细胞受到质子的作 用。
[198]在本发明的方法中，活化剂如质子诱导的流经含门控离子通道的细 胞的膜的电流通量可通过电生理学方法监测，例如膜片钳或两电极电压钳 技术。
[199]或者，门控离子通道活化剂如质子诱导的含门控离子通道的细胞的 膜电位的改变可用荧光法监测。当使用荧光法时，将含门控离子通道的细 胞用可测定所加活化剂如质子所引起的细胞膜电位的改变的膜电位指示 剂孵育。这类膜电位指示剂包括荧光指示剂，优选DiBAC4(3)、DiOC5(3)、 DiOC2(3)、DiSBAC2(3)和FMP(FLIPR膜电位)。
[200]在另一可选实施方案中，活化剂如质子在门控离子通道上诱导的门 控离子通道活性的改变可通过用荧光法评定细胞中某些离子如钙、钠、钾、 镁、质子和氯化物的细胞内浓度的改变测定。荧光检测可在多孔板中用平 板读数仪如FLIPR检测(荧光图像平板读数仪；可自Molecular Devices购 得，如FlexStation检测(可自Molecular Devices购得)，如使用如Sullivan E.等(1999)Methods Mol Biol.114：125-33，Jerman，J.C.等(2000)Br J Pharmacol 130(4)：916-22和美国专利6608671中所描述的荧光钙指示剂， 其内容各通过引用结合到本文中)进行。当使用这类荧光法时，将含门控离 子通道的细胞用可测定所加活化剂如质子所引起的细胞内离子浓度的改 变的选择性离子指示剂孵育。这类离子指示剂包括荧光钙指示剂(优选 Fura-2、Fluo-3、Fluo-4、Fluo4FF、Fluo-5F、Fluo-5N、Calcium Green、 CoroNa Green)、荧光钾指示剂(优选PBFI、CD222)、荧光镁指示剂(优选 Mag-Fluo-4、Mag-Fura-2、Mag-Fura-5、Mag-Fura-Red、Mag-indo-1、 Mag-rho-2、Magnesium Green)、荧光氯化物指示剂(优选SPQ、 Bis-DMXPQ、LZQ、MEQ和MQAE)、荧光pH指示剂(优选BCECF和 BCPCF)。当使用膜电位指示剂时，将含门控离子通道的细胞用FMP染料 (来自Molecular Devices)或其他膜电位改变指示剂孵育。膜电位的改变在 添加活化剂如质子后测定。
[201]本发明的门控离子通道拮抗化合物在低于2M、1.5M、1M、500mM、 250mM、100mM、750μM、500μM、250μM、100μM、75μM、 10μM、5μM、或低于1μM的浓度下表现出活性。在其最 优选的实施方案中，ASIC拮抗化合物在低微摩尔和纳摩尔范围内表现出 活性。
[202]本文中用到的术语“接触”(即，使细胞如神经元细胞与化合物接触) 包括活体外一起孵育所述化合物和细胞(如向培养中的细胞中加入化合物) 或向对象施用所述化合物以便化合物与对象的细胞在活体内接触。术语“接 触”不包括使细胞与对象中天然发生的调节剂或化合物接触(即可因天然的 生理学过程而发生的接触)。
A.活体外检测
[203]用于本文所述检测中的门控离子通道多肽可易于通过标准的生物技 术或通过化学合成生产。例如，可将转染了含编码所需门控离子通道的核 苷酸序列的表达载体的宿主细胞在适宜的条件下培养以使肽的表达发生。 或者，所述门控离子通道可通过培养可产生门控离子通道的原代细胞系或 已建立细胞系获得。
[204]本发明的方法可在活体外实施，例如在细胞培养筛选检测中以筛选 可能结合、活化或调节门控离子通道功能的化合物。在这样的方法中，所 述调节化合物可通过与样品或培养基中的门控离子通道相互作用并消除 其任何特定功能而起作用。所述调节化合物也可用来控制神经元细胞培养 中的门控离子通道活性。
[205]其中天然存在门控离子通道的活体外检测用细胞包括各种细胞，如 皮层神经元细胞(特别是小鼠或大鼠皮层神经元细胞)和人胚肾(HEK)细胞 (特别是HEK293细胞系)。例如，细胞可自人胚胎细胞、人新生儿细胞和 成人细胞培养。原代细胞培养也可用在本发明的方法中。例如，感觉神经 元细胞也可自不同的动物物种分离和培养。最广泛使用的方法使用自新生 鼠(Eckert，et al.(1997)J Neurosci Methods 77：183-190)和胚胎鼠(Vasko，et al.(1994)J Neurosci 14：4987-4997)分离到的感觉神经元。培养基中的三叉神经和背根神经 节感觉神经元具有活体内感觉神经元的某些特性。
[206]或者，所述门控离子通道(如门通道，如质子门控离子通道)对所讨论 的细胞而言可能是外源的，并可特别是通过重组DNA技术如转染、微注 射或注射引入。这类细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK细胞、非洲 绿猴肾细胞系(CV-1或源自CV-1的COS细胞如COS-1和COS-7)爪蟾卵 母细胞或任何其他能表达门控离子通道的细胞系。
[207]本发明的门控离子通道的核苷酸和氨基酸序列是本领域内熟知的。 例如，人门通道的序列可在Genbank GI登记号：GI：40556387(EnaCα智 人)、GI：4506815(EnaCα智人)、GI：4506816(EnaCβ智人)、GI：4506817 (EnaCβ智人)、GI：34101281(EnaCδ智人)、GI：34101282(EnaCδ智人)、 GI：42476332(EnaCγ智人)、GI：42476333(EnaCγ智人)、GI：31442760 (HINAC智人)、GI：31442761(HINAC智人)、GI：21536350(ASIC1a智人)、 GI：21536351(ASIC1a智人)、GI：21536348(ASIC1b智人)、GI：21536349 (ASIC1b智人)、GI：34452694(ASIC2；转录剪接体1智人)、GI：34452695 (ASIC2；异构体1智人)、GI：34452696(ASIC2；转录剪接体2智人)、 GI：9998944(ASIC2；异构体2智人)、GI：4757709(ASIC3；转录剪接体1 智人)、GI：4757710(ASIC3；异构体1智人)、GI：9998945(ASIC3；转录剪接 体2智人)、GI：9998946(ASIC3；异构体2智人)、GI：9998947(ASIC3；转 录剪接体3智人)、GI：9998948(ASIC3；异构体3智人)、GI：33519441 (ASIC4；转录剪接体1智人)、GI：33519442(ASIC4；异构体1智人)、 GI：33519443(ASIC4；转录剪接体2智人)、GI：33519444(ASIC4；异构体2 智人)、GI：27894283(P2X1智人)、GI：4505545(P2X1智人)、GI：28416917 (P2X2；转录剪接体1智人)、GI：25092719(P2X2；异构体A智人)、 GI：28416922(P2X2；转录剪接体2智人)、GI：28416923(P2X2；异构体B智 人)、GI：28416916(P2X2；转录剪接体3智人)、GI：7706629(P2X2；异构体 C智人)、GI：28416918(P2X2；转录剪接体4智人)、GI：25092733(P2X2；异 构体D智人)、GI：28416920(P2X2；转录剪接体5智人)、GI：28416921(P2X2； 异构体H智人)、GI：28416919(P2X2；转录剪接体6智人)、GI：27881423 (P2X2；异构体I智人)、GI：28416924(P2X3智人)、GI：28416925(P2X3智人)、 GI：28416926(P2X4；转录剪接体1智人)、GI：28416927(P2X4；异构体A智 人)、GI：28416928(P2X4；转录剪接体2智人)、GI：28416929(P2X4；异构 体B智人)、GI：28416930(P2X4；转录剪接体3智人)、GI：28416931(P2X4； 异构体C智人)、GI：28416932(P2X5；转录剪接体1智人)、GI：28416933 (P2X5；异构体A智人)、GI：28416934(P2X5；转录剪接体2智人)、 GI：28416935(P2X5；异构体B智人)、GI：28416936(P2X5；转录剪接体3智 人)、GI：28416937(P2X5；异构体C智人)、GI：38327545(P2X6智人)、 GI：4885535(P2X6智人)、GI：34335273(P2X7；转录剪接体1智人)、 GI：29294631(P2X7；异构体A智人)、GI：34335274(P2X7；转录剪接体2 智人)、GI：29294633(P2X7；异构体B智人)、GI：18375666(TRPV1；转录 剪接体1智人)、GI：18375667(TRPV1；香草酸受体亚型1智人)、 GI：18375664(TRPV1；转录剪接体2智人)、GI：18375665(TRPV1；香草酸 受体亚型1智人)、GI：18375670(TRPV1；转录剪接体3智人)、 GI：18375671(TRPV1；香草酸受体亚型1智人)、GI：18375668(TRPV1；转 录剪接体4智人)、GI：18375669(TRPV1；香草酸受体亚型1智人)、 GI：7706764(VRL-1；转录剪接体1智人)、GI：7706765(VRL-1；香草酸受 体亚型1智人)、GI：22547178(TRPV2；转录剪接体2智人)、GI：20127551 (TRPV2；香草酸受体样蛋白1智人)、GI：22547183(TRPV4；转录剪接体1 智人)、GI：22547184(TRPV4；异构体A智人)、GI：22547179(TRPV4；转 录剪接体2智人)、GI：22547180(TRPV4；异构体B智人)、GI：21361832 (TRPV5智人)、GI：17505200(TRPV5智人)、GI：21314681(TRPV6智人)、 GI：21314682(TRPV6智人)、GI：34452696(ACCN1；转录剪接体2智人) 中找到。各个这些记录的内容通过引用结合到本文中。此外，其他物种的 通道序列也是本领域技术人员易于得到的。
[208]用于本发明的方法中的编码门控离子通道的核酸分子可用cDNA、 mRNA或基因组DNA作为模板和适宜的寡核苷酸引物按标准的PCR扩增 技术扩增。这样扩增的核酸也可克隆进适宜的载体中并通过DNA序列分 析表征。通过使用所有或部分这些核酸序列，本发明的核酸分子可用标准 的杂交和克隆技术(如Sambrook et al.，ed.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中所述)分离。
[209]用标准技术将含编码门控离子通道的核酸的表达载体(如门控离子 通道亚基蛋白如ENaC、ENaC、ENaC、ENaC、ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、 ASIC2b、ASIC3、ASIC4、BLINaC、hINaC、P2X1、P2X2、P2X3、P2X4、 P2X5、P2X6、P2X7、TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5和TRPV6 蛋白(或其部分))引入到细胞中并可操作地连接到调控序列上。这类调控序 列见述于例如Goeddel，Methods in Enzymology：Gene Expression Technology(酶学方法：基因表达技术)vol.185，Academic Press，San Diego， CA(1991)中。调控序列包括在许多类型的宿主细胞中引导核苷酸序列的组 成型表达的那些以及仅在某些宿主细胞中引导核苷酸序列的直接表达的 那些(如组织特异性调控序列)。本领域技术人员应理解，表达载体的设计 可取决于待转化的细胞、所需的蛋白表达水平等因素。本发明的表达载体 可引入宿主细胞中从而产生由如本文中所述核酸编码的蛋白或肽(包括融 合蛋白或肽)。
[210]用于酿酒酵母(S.cerevisiae)中的表达的载体实例包括pYepSec1 (Baldari et al.，1987，EMBO J.6：229-234)、pMFa(Kurjan and Herskowitz， 1982，Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz et al.，1987，Gene 54：113-123)、 pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp， San Diego，CA)。
[211]可用于昆虫离体细胞(如Sf9细胞)中蛋白质表达的杆状病毒载体包 括pAc系列(Smith et al.，1983，Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列 (Lucklow and Summers，1989，Virology 170：31-39)。
[212]哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，1987，Nature 329：840)、pMT2PC(Kaufman et al.，1987，EMBO J.6：187-195)、pCDNA3。 当用于哺乳动物细胞中时，所述表达载体的控制功能通常由病毒调控元件 提供。例如，常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、细胞肥大病毒和猿 猴病毒40。对于真核细胞的其他适宜表达体系，参见Sambrook等的第16 和17章。
B.活体内检测
[213]如本文中所述用以调节一种或多种门控离子通道活性的本发明的化 合物(如门控离子通道调节剂，如本发明的化合物)的活性可在动物模型中 检测以确定使用这类药剂治疗的功效、毒性或副作用。或者，按本文中所 述识别出的药剂可用在动物模型中以确定这类药剂的作用机制。
[214]用于确定本发明的化合物调节门控离子通道生物活性的能力的动物 模型是本领域技术人员熟知并易于得到的。用于研究疼痛和炎症的动物模 型的实例包括但不限于表1中所列的模型。用于研究神经疾病的动物模型 包括但不限于Morris et al.，(Learn.Motiv.1981；12：239-60)和Abeliovitch et al.，Cell 1993；75：1263-71)中所描述的那些。用于研究精神和行为异常的 动物模型的实例为如Psychopharmacology(精神药理学)(Berl).1979 Apr 11；62(2)：117-21中所述的Geller-Seifter模型。
[215]泌尿生殖器模型包括通过向膀胱中或灌注硫酸鱼精蛋白和氯化钾 (参见Chuang，Y.C.et al.，Urology 61(3)：664-670(2003))或灌注稀醋酸(参 见Sasaki，K.et al.，J.Urol.168(3)：1259-1264(2002))而减小试验动物膀胱 容积的方法。对于涉及膀胱的尿路疾病，按Chuang et al.(2003)Urology 61： 664-70中所述采用膀胱内施用硫酸鱼精蛋白。这些方法也包括使用广为接 受的涉及膀胱的尿路疾病模型按Sasaki et al.(2002)J.Urol.168：1259-64 中所述采用膀胱内施用醋酸。治疗脊髓损伤病人的功效可用如Yoshiyama et al.(1999)Urology 54：929-33中所述方法测试。
[216]基于神经(主要是坐骨神经)损伤的神经性痛的动物模型见述于 Bennett et al.，1988，Pain 33：87-107；Seltzer et al.，1990，Pain 43：205-218；Kim et al.，1992，Pain 50：355-363；Decosterd et al.，2000，Pain 87：149-158和DeLeo et al.，1994，Pain 56：9-16中。也有糖尿病性神经病(STZ诱导糖尿病性神经 病-Courteix et al.，1994，Pain 57：153-160)和药物诱导神经病变(长春新碱 诱导神经病变-Aley et al.，1996，Neuroscience 73：259-265；肿瘤学相关免 疫疗法抗-GD2抗体-Slart et al.，1997，Pain 60：119-125)的模型。人类中的 急性痛可用化学刺激在鼠科动物中复制：Martinez et al.，Pain 81：179-186； 1999(小鼠腹膜内醋酸扭体试验)、Dubuisson et al.Pain 1977；4：161-74(脚 掌内注射福尔马林)。其他类型的急性痛模型见述于Whiteside et al.，2004， Br J Pharmacol 141：85-91(术后切口痛模型)和Johanek and Simone，2004， Pain 109：432-442(灼伤模型)中。使用完全弗氏佐剂的炎性痛动物模型(脚 掌内注射)见述于Jasmin et al.，1998，Pain 75：367-382中。动物中的关节炎 模型使用刺激剂(完全弗氏佐剂、碘醋酸盐、辣椒碱、尿酸盐晶体等)的囊 内注射实现(Fernihough et al.，2004，Pain 112：83-93；Coderre and Wall， 1987，Pain 28：379-393；Otsuki et al.，1986，Brain Res.365：235-240)。压力 诱导的痛觉过敏模型见述于Quintero et al.，2000，Pharmacology， Biochemistry and Behaviour 67：449-458中。其他用于研究疼痛的动物模 型在文章Walker et al.1999 Molecular Medicine Today 5：319-321中有讨 论，其中基于行为体征对用于不同类型疼痛(急性痛、慢性/炎性痛和慢性/ 神经性痛)的模型进行了比较。用于研究抑郁的动物模型见述于E. Tatarczynska et al.，Br.J.Pharmacol.132(7)：1423-1430(2001)和P.J.M. Will et al.，Trends in Pharmacological Sciences 22(7)：331-37(2001)中；用 于焦虑的模型见述于D.Treit.“Animal Models for the Study of Anti-anxiety Agents：A Review(用于抗焦虑剂研究的动物模型：综述)”， Neuroscience & Biobehavioral Reviews 9(2)：203-222(1985)。其他用于疼痛 研究的动物模型也在本文的实施例部分中有述。
[217]胃肠模型见述于Gawad，K.A.，et al.，Ambulatory long-term pH monitoring in pigs(猪中动态长期pH监测)，Surg Endosc，(2003)；Johnson， S.E.et al.，Esophageal Acid Clearance Test in Healthy Dogs(健康狗中食管 酸清除试验)，Can.J.Vet.Res.53(2)：244-7(1989)；and Cicente，Y. et al.， Esophageal Acid Clearance：More Volume-dependent Than Motility Dependent in Healthy Piglets(食管酸的清除：健康小猪中容积依赖性高于 运动依赖性)，J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.35(2)：173-9(2002)中。用于各 种检测的模型可用来评估对直肠扩张的内脏运动和疼痛反应。参见例如 Gunter et al.，Physiol.Behav.，69(3)：379-82(2000)，Depoortere et al.，J. Pharmacol.and Exp.Ther.，294(3)：983-990(2000)，Morteau et al.，Fund. Clin.Pharmacol.，8(6)：553-62(1994)，Gibson et al.，Gastroenterology (Suppl.1)，120(5)：A19-A20(2001)和Gschossmann et al.，Eur.J.Gastro. Hepat.，14(10)：1067-72(2002)，其全部内容通过引用结合到本文中。
[218]胃肠运动性可基于全动物中伴随肠道肌肉收缩的机械和电学变化的 活体内记录或活体外器官浴槽中记录的胃肠道肌肉标本活性进行评估(参 见例如Yaun et al.，Br.J.Pharmacol.，112(4)：1095-1100(1994)，Jin et al.，J. Pharm.Exp.Ther.，288(1)：93-97(1999)和Venkova et al.，J.Pharm.Exp. Ther.，300(3)：1046-1052(2002))。Tatersall et al.and Bountra et al.， European Journal of Pharmacology，250：(1993)R5 and 249：(1993)R3-R4 and Milano et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，274(2)：951-961(1995)。
                         表1


 性损伤  (CCI)或  Bennett知  Xie模型   械但也有   热   毛发或脚爪回缩试验(Hargreaves)测试   热或机械敏感性  神经元损伤可能是相关的临床比较  (Bennett & Xie，Neuropharmacology  1984；23：1415-1418.)  Chung模  型或脊神  经结扎模  型(SNL)   主要为机   械但也有   热   紧紧地绑扎坐骨神经的两个脊神经中   的一个。用Von Frey毛发或脚爪回缩试   验(Hargreaves)测试热或机械敏感性  同上：神经根卡压可能是相关的临床  比较  (Kim and Chung，Pain 1990；41：  235-251.)
[219]或者，本发明的化合物也可在含编码一个或多个门控离子通道的外 源序列的非人转基因动物中评估。本文中用到的“转基因动物”为非人动物， 优选哺乳动物，更优选啮齿动物如大鼠或小鼠，其中所述动物的一个或多 个细胞含转基因。转基因动物的其他实例包括非人灵长类动物、绵羊、狗、 奶牛、山羊、鸡、两栖动物等。通过胚胎操纵和微注射产生转基因动物特 别是动物如小鼠的方法在本领域内已成为常规，见述于例如美国专利 4,736,866和4,870,009、美国专利4,873,191以及Hogan，Manipulating the Mouse Embryo(操纵小鼠胚胎)，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，N.Y.，1986中。其他转基因动物的产生使用类似的方 法。
[220]也可用同源重组动物来评估本发明的化合物。这类动物可按众所周 知的技术产生(参见例如Thomas and Capecchi，1987，Cell 51：503；Li et al.， 1992，Cell 69：915；Bradley，Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach(畸胎癌和胚胎干细胞：实用方法)，Robertson，Ed.，IRL， Oxford，1987，pp.113-152；Bradley(1991)Current Opinion in Bio/Technology(生物/技术中的当前认识)2：823-829；及PCT公开WO 90/11354、WO 91/01140、WO 92/0968和WO 93/04169)。
[221]可产生其他有用的转基因非人动物，其含可调控转基因表达的选定 系统(参见例如Lakso et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89： 6232-6236)。重组酶系统的另一实例为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 的FLP重组酶系统。
药物组合物
[222]本发明也提供了药物组合物。这类组合物包含治疗学(或预防上)有效 量的门控离子通道调节剂(优选上面所述的一种或多种本发明的化合物)和 药学上可接受的载体或赋形剂。适宜的药学上可接受的载体包括但不限于 盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和其组合。所述载体和组合物 可为无菌的。制剂应与给药形式相适宜。
[223]术语“药学上可接受的载体”是本领域内公认的，包括适于向哺乳动 物施用本发明的化合物的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。所述载 体包括自一个器官或身体的部分向另一器官或身体的部分携带或输运目 标药剂中所涉及的液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊材料。 各载体在与制剂的其他成分相容的意义上必须是“可接受的”并对对象无 害。可用作药学可接受载体的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖、 右旋糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，如 羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、甲基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄芪胶； 麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、 红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油、蓖麻油、四甘醇和大豆油；二醇，如 丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙 酯、聚乙二醇的酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁、氢氧化钠、 氢氧化钾、碳酸盐、三乙醇胺、醋酸盐、乳酸盐、柠檬酸钾和氢氧化铝； 褐藻酸；超纯水；等渗盐水；Ringer溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和药 物制剂中采用的其他无毒相容物质。
[224]润湿剂、乳化剂和润滑剂(如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁)以及着色 剂、脱模剂、包衣剂、增甜剂、调味和加香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存 在于本发明的组合物中。
[225]药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血 酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫酸钠等；油溶性抗氧化 剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、 卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚和衍生物如维他命E生育酚等；和金属 螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸、柠 檬酸钠等。
[226]适宜的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液(如NaCl)、醇、 阿拉伯树胶、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物(如乳糖、直 链淀粉或淀粉)、环糊精、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂 肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。所述药物制剂可为无菌的， 如果需要，可与不与活性化合物发生有害反应的辅剂如润滑剂、防腐剂、 稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色、调味和/或芳 香物质等混合。所述药学上可接受的载体也可包括张度调节剂如右旋糖、 甘油、甘露醇和氯化钠。
[227]如果需要，所述组合物也可含小量润湿或乳化剂或pH缓冲剂。所 述组合物可为液体溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释 放剂或粉剂。所述组合物可用常规粘合剂如甘油三酸酯配制为栓剂。口服 制剂可含标准载体如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯 烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
[228]所述组合物可按适于向人静脉内给药的药物组合物的常规程序配 制。通常，用于静脉内给药的组合物为无菌等渗水性缓冲剂中的溶液。必 要时，所述组合物也可含增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射点的疼痛。通常， 各成分或单独或以单位剂型混合于一起提供，例如以指示了活性剂的量的 密闭容器如安瓿或小袋中的冻干粉或无水浓缩物提供。当组合物待通过灌 注给药时，可使用含无菌药物级水、盐水或右旋糖/水的输液瓶施用。当组 合物待通过注射给药时，可提供注射用无菌水或盐水的安瓿以便可在给药 前混合各成分。
[229]本发明的药物组合物也可含控制门控离子通道调节剂化合物的释放 的药剂，从而提供定时或持续释放的组合物。
[230]本发明也涉及本文所公开门控离子通道调节剂的前药以及包含这类 前药的药物组合物。例如，含酸官能团或羟基官能团的本发明化合物也可 作为与适宜醇或酸的相应酯制备和给药。所述酯然后可通过对象内的内源 酶分裂产生活性剂。
[231]本发明的制剂包括适于口服、鼻腔、局部、粘膜、透皮、口腔、舌 下、直肠、阴道和/或肠胃外给药的那些。所述制剂可方便地呈单位剂型并 可通过药学领域熟知的任何方法制备。可与载体物质合用以产生单位剂型 的活性成分的量一般为产生治疗效果的化合物的量。通常，在总的百分之 百中，活性成分的量占约1％到约99％，优选约5％到约70％，最优选约 10％到约30％。
[232]制备这些制剂或组合物的方法包括使本发明的化合物与载体以及任 选一种或多种辅助成分混合的步骤。一般来说，所述制剂通过均匀紧密混 合本发明的化合物与液体载体或细小的固体载体或二者、然后使产品成型 (如果需要)制备。
[233]适于口服的本发明制剂可呈胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使 用调味基体，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉剂、粒剂或水性或非水 性液体中的溶液剂或混悬剂或水包油或油包水乳液或酏剂或糖浆或锭剂 (使用惰性基体，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或含漱剂等，其各 含预定量的本发明化合物作为活性成分。本发明的化合物也可以大丸剂、 药糖剂或糊剂给药。
[234]在用于口服的本发明固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖锭剂、粉剂、 粒剂等)中，活性成分与一种或多种药学上可接受的载体混合，如柠檬酸钠 或磷酸二钙和/或下述之任何一种：填料或补充剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、 葡萄糖、甘露醇、和/或硅酸；粘合剂，如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、 聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；保湿剂，如甘油；甭解剂，如琼脂、 碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐、和碳酸钠；溶液阻滞 剂，如石蜡；吸收促进剂，如季铵化合物；润湿剂，如鲸蜡醇和甘油单硬 脂酸酯；吸收剂，如高岭土和膨润土；润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂 酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、和其混合物；和着色剂。在胶囊 剂、片剂和丸剂情况下，所述药物组合物也可包含缓冲剂。也可采用用赋 形剂如乳糖以及高分子量聚乙二醇等使填料处于软和硬填充明胶胶囊中 的类似类型固体组合物。
[235]片剂可任选与一种或多种辅助成分一起通过压制或模制生产。压制 片剂可用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、 防腐剂、甭解剂(例如羟基乙酸淀粉钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活 性或分散剂制备。模制片剂可通过在适宜的机器中模制为惰性液体稀释剂 所润湿的粉状化合物的混合物制备。
[236]本发明的药物组合物的片剂和其他固体剂型如糖锭剂、胶囊剂、丸 剂和粒剂可任选获得或制备为带包衣或外壳，如肠溶衣和药物配制领域中 熟知的其他包衣。其也可配制为使其中的活性成分缓慢或受控释放，例如 用不同比例的羟丙基甲基纤维素(以提供所需的释放特性)、其他聚合母体、 脂质体和/或微球。其可通过例如经细菌滤器过滤或通过加入灭菌剂灭菌， 呈使用前即刻可溶于无菌水或一些其他无菌可注射介质中的无菌固体组 合物的形式。这些组合物也可任选含遮光剂并可为任选以延迟方式仅或优 选在胃肠道的某些部分释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实 例包括聚合物和蜡。活性成分也可酌情呈与一种或多种上述赋形剂的微胶 囊形式。
[237]本发明的化合物的口服液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、 溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除活性成分外，液体剂型可还含常用于 本领域内的惰性稀释剂(如水或其他溶剂)、增溶剂和乳化剂(如乙醇、异丙 醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、 油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、 甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和失水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物)。
[238]除惰性稀释剂外，口服组合物也可含佐剂如润湿剂、乳化和悬浮剂、 增甜、调味、着色、加香和防腐剂。
[239]混悬剂除含活性成分外还含悬浮剂如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯 山梨醇和失水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪 胶及其混合物。
[240]用于直肠或阴道给药的本发明的药物组合物制剂可呈栓剂，其可通 过混合一种或多种本发明的化合物与一种或多种适宜的无刺激性赋形剂 或载体制备，所述赋形剂或载体包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水 杨酸盐，且其在室温下为固体，但在体温下为液体，因此将在直肠或阴道 腔中熔融而释放活性化合物。
[241]适于阴道给药的本发明的制剂也包括含本领域内已知的适宜载体的 阴道栓剂、棉塞、膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷剂。
[242]本发明的化合物用于局部或透皮给药的剂型包括粉剂、喷剂、软膏 剂、糊剂、膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴片剂和吸入剂。活性化合物 可在无菌条件下与药学上可接受的载体以及可能需要的任何防腐剂、缓冲 剂或推进剂混合。
[243]除本发明的活性化合物外，软膏剂、糊剂、膏剂和凝胶剂还可含赋 形剂如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、 聚乙二醇、硅油、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。
[244]除本发明的化合物外，粉剂和喷剂还可含赋形剂如乳糖、滑石、硅 酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉或这些物质的混合物。喷剂可还含常规 推动剂如氯氟烃和挥发性未取代烃如丁烷和丙烷。
[245]透皮贴片剂具有向身体受控传递本发明化合物的附加好处。这类剂 型可通过溶解或分散化合物于适宜的介质中制得。也可使用吸收促进剂来 增大化合物穿过皮肤的通量。这类通量率可通过控制膜或分散活性化合物 于聚合母体或凝胶中的速率控制。
[246]眼用制剂、眼膏、粉剂、溶液剂等也涵盖在本发明的范围之内。
[247]适于肠胃外给药的本发明的药物组合物包含一种或多种本发明的化 合物以及一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散 体、混悬体或乳剂或可在使用前即刻复合进无菌可注射溶液或分散体中的 无菌粉，其可含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、赋予制剂与预期受体的血液 等渗性的溶质或悬浮或增稠剂。
[248]可用于本发明的药物组合物中的适宜的水性或非水性载体的实例包 括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适宜的混合物、 植物油如橄榄油、和可注射的有机酯如油酸乙酯。适宜的流动性可例如通 过使用包衣材料如卵磷脂、在分散体的情况下通过保持所需粒径以及通过 表面活性剂的使用保持。
[249]这些组合物也可含佐剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生 物作用的防止可通过引入各种抗细菌和抗真菌剂确保，例如paraben、氯 丁醇、苯酚山梨酸等。也可能需要向组合物中加入等渗剂如糖、氯化钠等。 此外，可注射药物形式的延长吸收可通过延迟吸收的药剂如单硬脂酸铝和 明胶的加入实现。
[250]有时，为延长药物的效果，需要减慢药物自皮下或肌肉注射的吸收。 这可通过具有低水溶性的晶体或非晶物质的液体悬浮实现。这样，药物的 吸收速率将取决于其溶解速率，溶解速率又取决于晶体大小和晶形。或者， 肠胃外给药剂型的延迟吸收通过溶解或悬浮药物于油性载体中实现。
[251]可积存注射剂型通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯 中形成目标化合物的微囊母体制备。取决于药物与聚合物的比率以及所用 特定聚合物的性质，药物释放的速率可以得到控制。其他可生物降解的聚 合物的实例包括聚原酸酯和聚(酸酐)。可积存注射制剂也通过使药物截留 在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中制备。
给药方法
[252]本发明提供了一种治疗对象中由门控离子通道活性介导的病症的方 法，所述疾病包括但不限于疼痛、炎性疾患、神经疾患、胃肠疾患和泌尿 生殖器疾患。所述方法包括向对象施用治疗学有效量的门控离子通道调节 剂的步骤。待治疗的所述病症可为任何至少部分由门控离子通道(如 ASIC1a和/或ASIC3)的活性介导的病症。
[253]待施用的给定化合物的量将以个体为基础确定并至少部分考虑个体 的大小、待治疗的症状的严重性以及想要的结果。本文中所述门控离子通 道活性调节剂可单独给药或在包含所述调节剂、可接受的载体或稀释剂以 及任选一种或多种其他药物的药物组合物中给药。
[254]这些化合物可通过任何适宜的给药途径施用给待治疗的人和其他动 物。所述门控离子通道调节剂可以皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、真皮 内、肌内、局部、消化道(如口服)、直肠、鼻腔、口腔、舌下、全身、阴 道方式、通过雾化吸入、通过药泵或通过含常规无毒生理学可接受的载体 或媒介物的埋植式给药装置给药。优选的给药方法为经口给药。给药的剂 型(如糖浆剂、酏剂、胶囊剂、片剂、溶液剂、泡沫剂、乳剂、凝胶、溶胶 剂)将部分取决于给药的途径。例如，对于粘膜(如口腔粘膜、直肠粘膜、 肠粘膜、支气管粘膜)给药，可使用滴鼻剂、气雾剂、吸入剂、喷雾剂、滴 眼剂或栓剂。本发明的化合物和药剂可与其他生物活性剂如镇痛剂(如阿片 剂)、抗炎剂(如NSAID)、麻醉剂和能控制门控离子通道介导病症的一种或 多种症状或诱因的其他药剂一起施用。
[255]在特定的实施方案中，可能需要向需要治疗的局部区域局部地施用 本发明的药剂；这可通过例如但不限于手术期间局部灌注、局部施用、透 皮贴片、通过注射、借助导管、借助栓剂或借助移植物达到，所述移植物 为多孔、非多孔或胶状材料，包括膜如硅橡胶(sialastic)膜或纤维。例如， 所述药剂可注射到关节或膀胱中。
[256]本发明的化合物可任选与一种或多种已知的治疗和/或减轻门控离 子通道(如ASIC1a和/或ASIC3)介导病症的症状用的其他药物一起施用。 所述其他药物可与本发明的化合物同时或顺序施用。例如，本发明的化合 物可结合镇痛剂、抗炎剂、麻醉剂、皮质类固醇(如地塞米松、倍氯美松双 丙酸酯(BDP)治疗剂)、抗惊厥剂、抗抑郁剂、抗恶心剂、精神病药、心血 管作用药(如β-阻断剂)或癌症治疗剂中的至少一种施用。在一些实施方案 中，本发明的化合物结合疼痛药施用。本文中用到的术语“疼痛药”指镇痛 剂、抗炎剂、麻醉剂、皮质类固醇、抗癫痫剂、巴比妥酸盐、抗抑郁剂和 大麻。
[257]上述结合治疗可在施用本发明的组合物之前、同时或之后开始。因 此，本发明的方法可还包括施用第二治疗剂的步骤，如用于疾病或疾患的 第二治疗剂以改善其他治疗剂的副作用。这类第二治疗剂可包括例如抗炎 药物和针对疼痛治疗的任何治疗剂。此外或或者，进一步的治疗可包括施 用药物以进一步治疗疾病或治疗疾病或其他治疗剂(如抗恶心药、抗炎药、 抗抑郁剂、精神病药、抗癫痫药、类固醇、心血管作用药和癌症化疗剂) 的副作用。
[258]本文中用到的“镇痛剂”为解除或减轻疼痛或其任何体征或症状(如 痛觉过敏、痛觉异常、感觉迟钝、感觉过敏、痛觉过敏、感觉异常)并也可 使炎症减轻的药剂，如抗炎剂。镇痛剂可细分为NSAIDs(非类固醇抗炎 药)、麻醉性镇痛剂(包括阿片类镇痛剂)和非麻醉性镇痛剂。NSAIDs可再 细分为非选择性COX(环加氧酶)抑制剂和选择性COX2抑制剂。阿片类 镇痛剂可为天然的、合成的或半合成的阿片类镇痛剂，包括例如吗啡、可 待因、度冷丁、右丙氧芬、氧可酮、二氢吗啡酮、海洛因、曲马多和芬太 尼。非麻醉性镇痛剂(也称非阿片类镇痛剂)包括例如醋氨酚、可乐定、 NMDA拮抗剂、香草酸受体拮抗剂(如TRPV1拮抗剂)、普瑞巴林 (pregabalin)、大麻素(endocannabinoid)和大麻素(cannabinoid)。非选择性 COX抑制剂包括但不限于乙酰水杨酸(ASA)、布洛芬、萘普生、酮洛芬、 吡罗昔康、依托度酸和溴芬酸。选择性COX2抑制剂包括但不限于塞来昔 布(celecoxib)、戊地昔布(valdecoxib)、帕瑞昔布(parecoxib)和依托昔布 (etoricoxib)。
[259]本文中用到的“麻醉剂”为干扰给药点附近感性知觉(局部麻醉剂)或 导致知觉改变或失去(如全身性麻醉剂)的药剂。局部麻醉剂包括但不限于 利多卡因和布比卡因。
[260]抗癫痫剂的非限制性实例为氨甲酰氮卓、苯妥英和加巴喷丁 (gabapentin)。抗抑郁剂的非限制性实例为阿米替林和去甲丙米嗪。
[261]抗炎药的非限制性实例包括皮质类固醇(如氢化可的松、可的松、强 的松、强的松龙、甲基强的松龙、醋酸去炎松、氟强的松龙、倍他米松和 地塞米松)、水杨酸盐、NSAIDs、抗组胺剂和H2受体拮抗剂。
[262]术语“肠胃外给药”在本文中指非消化道和局部给药的给药方式，通 常通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、 心内、真皮内、腹膜内、气管内、皮下、表皮下、关节内、包囊下、蛛网 膜下、脊柱内和胸骨内注射和灌注。
[263]本文中用到的术语“全身给药”“外周给药”指非直接向中枢神经系统 中施用化合物、药物或其他物质，以便其进入对象全身并经历代谢和其他 类似过程，例如皮下给药。
[264]无论选择了何种给药途径，本发明的化合物(其可以适宜的水合形式 使用)和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员熟知的常规方法配制 为药学上可接受的剂型。
[265]可改变本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平以获得针对 特定对象、组合物和给药方式而言有效达到所需治疗反应而对对象无毒的 活性成分的量。
[266]剂量水平的选择应取决于多种因素，包括所采用的本发明的特定化 合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所采用的特定化合 物的排泄率、治疗时间长短、与所采用的特定化合物结合使用的其他药物、 化合物和/或材料、被治疗的对象的年龄、性别、体重、疾病、总体健康状 况和先前病史、以及医学领域中熟知的其他因素。
[267]本领域内具有一般技术的医师或兽医可轻易确定所需药物组合物的 有效量并开处方。例如，本发明的化合物的剂量可用针对待治疗病症的动 物模型通过剂量-反应曲线推导确定。例如，医师或兽医可从药物组合物中 所用本发明化合物的剂量比为获得所需治疗效果所需水平低的水平开始 并逐渐增大剂量至获得所需的效果。
[268]一般来说，本发明的化合物的适宜日剂量为有效产生治疗效果的最 低剂量的化合物的量。这样的有效剂量通常取决于上述因素。通常，对于 对象来说，当用于指定的镇痛效果时，本发明的化合物的静脉内和皮下剂 量为约0.0001到约100mg每千克体重每天，更优选约0.01到约100mg每 千克每天，还更优选约1.0到约50mg每千克每天。有效量为治疗门控离 子通道相关状态或门控离子通道疾患的量。
[269]如果需要，活性化合物的有效日剂量可在整天中以适宜的时间间隔 作为二、三、四、五、六或更多亚剂量任选以单位剂型分别施用。
[270]虽然本发明的化合物可单独施用，但优选作为药物组合物施用。
治疗方法
[271]上述化合物可用来施用给对象以调节疼痛、炎性疾患、神经疾患以 及至少部分通过门控离子通道介导活性调节的细胞、器官或生理学系统的 任何功能异常中(但不限于此)所涉及的门控离子通道介导活性。此外，应 理解本发明的化合物也可减轻或治疗本文中所讨论的疾病或疾患的一种 或多种其他症状。
[272]因此，在一个方面中，本发明的化合物可用来治疗疼痛，包括急性、 慢性、恶性和非恶性躯体痛(包括皮肤痛和深部躯体痛)、内脏痛和神经性 痛。还应理解，所述化合物也可减轻或治疗疼痛和感觉缺陷的一种或多种 其他体征或症状(如痛觉过敏、痛觉异常、感觉迟钝、感觉过敏、痛觉过敏、 感觉异常)。
[273]在本发明的该方面的一些实施方案中，本发明的化合物可用来治疗 伴随皮肤和相关器官的损伤、炎症、疾病和疾患(包括但不限于切伤、烧伤、 裂伤、刺伤、割伤、手术痛、术后痛、口牙手术、牛皮癣、湿疹、皮炎和 过敏症)的躯体痛或皮肤痛。本发明的化合物也可用来治疗伴随皮肤和相关 器官的恶性和非恶性瘤(如黑素瘤、基底细胞癌)的躯体痛。
[274]在本发明的该方面的另一实施方案中，本发明的化合物可用来治疗 伴随肌肉骨骼和结缔组织的损伤、炎症、疾病和疾患(包括但不限于关节痛、 肌痛、纤维肌痛、肌筋膜疼痛综合征、牙痛、腰脊痛、分娩过程中的疼痛、 手术痛、术后痛、头痛、偏头痛、自发痛疾患、扭伤、骨折、骨损伤、骨 质疏松、重度烧伤、通风、关节炎、骨关节炎、肌炎和背部病(如椎骨脱离、 不全脱位、坐骨神经痛和斜颈))的深部躯体痛。本发明的化合物也可用来 治疗伴随肌肉骨骼和结缔组织的恶性和非恶性瘤(如肉瘤、横纹肌肉瘤和骨 癌)的深部躯体痛。
[275]在本发明的该方面的另一实施方案中，本发明的化合物可用来治疗 伴随循环系统、呼吸系统、泌尿生殖系统、胃肠系统和眼、耳、鼻、喉的 损伤、炎症、疾病或疾患的内脏痛。
[276]例如，本发明的化合物可用来治疗伴随循环系统的损伤、炎症和疾 患(包括但不限于局部缺血病、局部缺血性心脏病(如心绞痛、急性心肌梗 死、冠状动脉血栓症、冠状动脉供血不足)、血管和淋巴管的疾病(如周围 性血管疾病、间歇性跛行、静脉曲张、痔疮、静脉栓塞或血栓、静脉炎、 血栓性静脉炎、淋巴腺炎、淋巴管炎))的内脏痛及伴随循环系统的恶性和 非恶性瘤(如淋巴瘤、骨髓瘤、霍奇金病)的内脏痛。
[277]在另一实例中，本发明的化合物可用来治疗伴随呼吸系统的损伤、 炎症、疾病和疾患(包括但不限于上呼吸道感染(如鼻咽炎、鼻窦炎和鼻炎)、 流感、肺炎(如细菌性、病毒性、寄生虫性和真菌性)、下呼吸道感染(如支 气管炎、毛细支气管炎、气管支气管炎)、间质性肺病、肺气肿、支气管扩 张、气喘状态、哮喘、肺纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、胸膜疾病)的 内脏痛及伴随呼吸系统的恶性和非恶性瘤(如小细胞癌、肺癌、气管瘤、喉 瘤)的内脏痛。
[278]在另一实例中，本发明的化合物可用来治疗伴随胃肠系统的损伤、 炎症和疾患(包括但不限于牙和口腔粘膜的损伤、炎症和疾患(如埋伏牙、 齿龋、牙周病、口疮、牙髓炎、龈炎、牙周炎和口腔炎)；食管、胃和十二 指肠的损伤、炎症和疾患(如溃疡、消化不良、食道炎、胃炎、十二指肠炎、 憩室炎和阑尾炎)；肠的损伤、炎症和疾患(如克罗恩氏病、麻痹性肠梗阻、 肠梗阻、过敏性肠综合征、神经性肠、巨结肠、炎症性肠病、溃疡性结肠 炎和肠胃炎)；腹膜的损伤、炎症和疾患(如腹膜炎)；肝脏的损伤、炎症和 疾患(如肝炎、肝坏死、肝梗死、肝静脉闭塞病)；胆囊、胆道和胰腺的损 伤、炎症和疾患(如胆石病、胆囊石病、胆总管结石病、胆囊炎和胰腺炎)； 功能性腹痛综合征(FAPS)；胃肠疾患)的内脏痛以及伴随胃肠系统的恶性和 非恶性瘤(如食管瘤、胃瘤、小肠瘤、结肠瘤、肝瘤和胰腺瘤)的内脏痛。
[279]在另一实例中，本发明的化合物可用来治疗伴随泌尿生殖系统的损 伤、炎症和疾患(包括但不限于肾的损伤、炎症和疾患(如肾石病、肾小球 性肾炎、肾炎、间质性肾炎、肾盂炎、肾盂肾炎)；尿路的损伤、炎症和疾 患(如包括尿石病、尿道炎、尿路感染)；膀胱的损伤、炎症和疾患(如膀胱 炎、神经性膀胱、神经源性膀胱疾患、膀胱过度活动症、膀胱颈梗阻)；男 性生殖器官的损伤、炎症和疾患(如前列腺炎、睾丸炎和附睾炎)；女性生 殖器官的损伤、炎症和疾患(如盆腔炎症性疾病、子宫内膜异位、痛经、卵 巢囊肿))的内脏痛以及伴随泌尿生殖系统的恶性和非恶性瘤(如膀胱瘤、前 列腺瘤、乳腺瘤和卵巢瘤)的疼痛。
[280]在本发明的该方面的其他实施方案中，本发明的化合物可用来治疗 伴随神经系统(包括中枢神经系统和周围神经系统)的损伤、炎症、疾病和 疾患的神经性痛。这类伴随神经性痛的损伤、炎症、疾病或疾患的实例包 括但不限于神经病(如糖尿病性神经病、药物诱导神经性、放疗诱导神经 性)、神经炎、神经根病、脊神经根炎、神经退化病(如肌肉萎缩)、脊髓损 伤、周围神经损伤、伴随癌症的神经损伤、跖骨间神经瘤(Morton’s neuroma)、头痛(如非器质性慢性头痛、紧张型头痛、丛集性头痛和偏头 痛)、偏头痛、多发性躯体化综合征、带状疱疹神经痛(带状疱疹)、三叉神 经痛、复杂性区域疼痛综合征(也称灼痛或反射性交感神经营养不良)、神 经根痛、幻肢痛、慢性头痛、神经干痛、躯体形式疼痛疾患、中枢疼痛、 非心源性胸痛、中风后中枢性疼痛。
[281]在另一方面中，本发明的化合物可用来治疗伴随皮肤和相关器官、 肌肉骨骼和结缔组织系统、呼吸系统、循环系统、泌尿生殖系统和胃肠系 统的损伤、疾病或疾患的炎症。
[282]在本发明的该方面的一些实施方案中，可用本发明的化合物治疗的 皮肤和相关器官的炎性病症、疾病或疾患的实例包括但不限于过敏症、特 异性皮炎、牛皮癣和皮炎。
[283]在本发明的该方面的另一实施方案中，可用本发明的化合物治疗的 肌肉骨骼和结缔组织系统的炎性病症、疾病或疾患的实例包括但不限于关 节炎、骨关节炎和肌炎。
[284]在本发明的该方面的另一实施方案中，可用本发明的化合物治疗的 呼吸系统的炎性病症、疾病或疾患的实例包括但不限于过敏症、哮喘、鼻 炎、神经源性炎症、肺纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、成人呼吸窘迫综 合征、鼻咽炎、鼻窦炎和支气管炎。
[285]在本发明的该方面的再一实施方案中，可用本发明的化合物治疗的 循环系统的炎性病症、疾病或疾患的实例包括但不限于心内膜炎、心包炎、 心肌炎、静脉炎、淋巴腺炎和动脉粥样硬化。
[286]在本发明的该方面的又一实施方案中，可用本发明的化合物治疗的 泌尿生殖系统的炎性病症、疾病或疾患包括但不限于肾脏炎症(如肾炎、间 质性肾炎)、膀胱炎症(如膀胱炎)、尿道炎症(如尿道炎)、男性生殖器官炎 症(如前列腺炎)和女性生殖器官炎症(如盆腔炎症性疾病)。
[287]在本发明的该方面的再一实施方案中，可用本发明的化合物治疗的 胃肠系统的炎性病症、疾病或疾患包括但不限于胃炎、胃肠炎、结肠炎(如 溃疡性结肠炎)、炎性肠综合征、克罗恩氏病、胆囊炎、胰腺炎和阑尾炎。
[288]在本发明的该方面的又一实施方案中，可用本发明的化合物治疗的 炎性病症、疾病或疾患包括但不限于伴随微生物感染(如细菌、病毒和真菌 感染)、物理因素(如烧伤、辐射和损伤)、化学因素(如毒素和腐蚀性物质)、 组织坏死及各类免疫反应和自体免疫疾病(如红斑性狼疮)的炎症。
[289]在另一方面中，本发明的化合物可用来治疗神经系统的损伤、疾病 或疾患，包括但不限于神经退行性疾病(如阿尔茨海默氏病、杜兴氏病)、 癫痫症、多发性硬化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、中风、大脑局部缺血、 神经病(如化疗诱导神经病、糖尿病性神经病)、视网膜色素变性、中枢神 经系统损伤(如脊髓损伤)、神经系统癌症(如成神经细胞瘤、成视网膜细胞 瘤、脑癌和神经胶质瘤)和其他某些癌症(如黑素瘤、胰腺癌)。
[290]在本发明的又一方面中，本发明的化合物也可用来治疗皮肤和相关 器官(如脱发)、循环系统(如心律失常和纤维性颤动及交感神经过度再生) 和泌尿生殖系统(如神经源性膀胱疾患和膀胱过度活动症)的其他疾患。
[291]本发明提供了一种治疗可受益于施用本发明的组合物的对象的方 法。可自门控离子通道调节剂受益的任何治疗适应症均可通过本发明的方 法治疗。所述方法包括向对象施用给本发明的组合物以治疗疾病或疾患的 步骤。
[292]本发明还提供了一种预防对象中可经施用给本发明的组合物治疗的 疾病或疾患的方法。“有风险的”对象在本文所述的治疗方法之前可有或可 没有可检测的疾病并可已或可未表现出可检测的疾病。“有风险的”指基于 常规的风险评估方法确定为更可能出现症状或具有一个或多个与可按本 发明的方法治疗的疾病或疾患的发生相关联的风险因素的个体。例如，风 险因素包括家族史、病史和与已知或怀疑会增大疾病风险的环境物质的接 触史。对可用本文中所述药剂治疗的疾病或病症有风险的对象也可通过例 如本领域技术人员熟知的任何诊断或预后分析或其组合确定。预防剂可在 疾病或疾患的症状特征表现出之前施用给，以便所述疾病或疾患得到预防 或其进程得到延缓。
实施例
[293]下面通过可用来考察本发明的化合物的门控离子通道调节活性以及 制备本发明的化合物的实施例对本发明施用给进一步的说明。这些实施例 不应理解为进一步的限制。整个实施例中所用的动物模型均为得到公认的 动物模型，且可自这些动物模型中功效的证实推测在人中的功效。
实施例1：用钙成像识别ASIC拮抗剂
细胞培养
[294]使表达ASIC1a的HEK293或CHO细胞在聚苯乙烯培养瓶(175mm2) 中于37℃和含5％CO2的加湿气氛下在培养基(DMEM+10％FBS)中生 长。接种日细胞的汇合应达80-90％。用10ml的PBS冲洗细胞，加入培 养基再悬浮，并用25ml的移液管研碎。
[295]以约1×105个细胞/ml(对于HEK293)和8×104个细胞/ml(对于 CHO细胞)的密度将细胞接种于经用poly-D-lysin预处理的黑壁、透明底 部的96孔板中(100μl/孔)。装载染料之前让接种的细胞繁殖48h。 装载荧光钙染料Fluo-4/AM
[296]将Fluo-4/AM(1mg，分子探针)溶解在912μl DMSO中。将 Fluo-4/AM储备溶液(1mM)用培养基稀释至最终浓度为2μM(装载溶液)。
[297]从孔中吸出培养基，向各孔中加入80μl Fluo-4/AM装载溶液。细胞 在37℃下孵育30min。当使用CHO细胞时，在装载溶液中加入2.5mM的 丙磺舒。
钙的测定
[298]装载期(15-20min)后吸出装载溶液，用10μl的改性检测缓冲液(145 mM NaCl，5mM KCl，5mM CaCl2，1mM MgCl2，10mM HEPES，pH 7.4) 洗涤细胞两次以除去细胞外的染料。第二次洗涤后，向各孔中加入100μl 的改性检测缓冲液并在FLIPRTM或FlexStationTM(Molecular Devices，USA) 或本领域技术人员熟知的任何其他适宜设备中测定荧光。当使用CHO细 胞时，在洗涤缓冲液中加入2.5mM(最终浓度)的丙磺舒。
装载荧光膜电位染料(FMP)
[299]将一小瓶FMP染料(Molecular Devices)再悬浮于10.5ml的检测缓冲 液(48.3mM NaCl，93mM NMDG，5mM KCl，5mM CaCl2，1mM MgCl2， 10mM HEPES，pH 7.4)中。从孔中吸出培养基，向各孔中加入100μl的 FMP装载溶液。将细胞在37℃下孵育30min。
膜电位测定
[300]装载期后使装载溶液留在细胞上，并在FLIPRTM或FlexStationTM (Molecular Devices，USA)或本领域技术人员熟知的任何其他适宜设备中测 定膜电位诱导的荧光。
FLIPR的设置(ASIC1a)
[301]温度：室温(20-22℃)
[302]第一次添加：50μl试验溶液，速率30μl/秒，起始高度100μl
[303]第二次添加：50μl MES溶液(20mM，最终浓度5mM)，速率35μl/ 秒，起始高度150μl
[304]读数间隔：预孵育-10秒×7和3秒×3，拮抗阶段-3秒×17和10 秒×12
[305]将添加板(化合物试验板和MES板)分别置于FLIPR托盘的右和左 位置上。将细胞板置于中间位置上，开始ASIC1a程序。FLIPR将按上述 的间隔设置进行适当的测定。刺激后得到的荧光经校正后用作平均基础荧 光(改性检测缓冲液中)。
FlexStation的设置(ASIC1a)
[306]温度：25℃
[307]第一次添加：50μl试验溶液，速率26μl/秒，起始高度125μl
[308]第二次添加：50μl MES溶液(20mM，最终浓度5mM)，速率26μl/ 秒，起始高度115μl
[309]读数间隔：预孵育-120秒。拮抗阶段，在145秒时加入MES，带激 动剂的读数时间为100秒(总的运行时间240秒)
[310]刺激后得到的荧光经校正后用作平均基础荧光(改性检测缓冲液中)。
[311]对于共表达ASIC1a和ASIC3通道的细胞(如HEK293细胞)，使用 膜电位染料(FMP染料)，且FlexStation的设置如上。
活性物质的命中确认和表征
[312]试验物质存在下MES-诱导的钙响应峰(或膜电位改变)表达为单与 MES响应有关。对阻断MES-诱导钙响应(或膜电位改变)的试验物质重复 试验三次。得到确认的命中物再通过全剂量-响应曲线表征以确定各命中化 合物的效力(以IC50值表示)(即抑制50％的MES-诱导钙和/或膜电位响应的 试验化合物浓度；参见例如图1)。
[313]钙动员检测中获得的本发明化合物的IC50值汇总如下。n＝3-7

[314]表H中所示数据用实施例1中所述FlexStation检测在表达hASIC3 (h3)和/或hASIC1a(h1a)的HEK293细胞上获得。

*在一个实验中，EC50(μM)＞20
**在一个实验中，EC50(μM)＞10
实施例2：异源表达系统中ASIC拮抗剂的筛选和生物分析
[315]本实施例描述本发明化合物的活性的另一活体外评价。
[316]活体外评价法的另一实例包括使用哺乳动物异源表达系统，其是本 领域技术人员熟知的，包括多种哺乳动物细胞系如COS、HEK(如HEK293 和/或CHO)细胞。细胞系经门控离子通道转染后用来进行如下电生理学测 试：
[317]所有实验均在室温(20-25℃)下电压钳中用常规全细胞膜片钳方法 (Neher，E.，et al.(1978)Pfluegers Arch 375：219-228)进行。
[318]所用放大器为EPC-9(HEKA-electronics，Lambrect，Germany)，其 在Macintosh G3计算机上运行，接口为ITC-16。实验条件由放大器所带 的Pulse软件设置。数据经低通滤波并以3倍于截止频率的速率直接传至 硬盘。
[319]用水平电极拉制器(Zeitz-Instrumente，Augsburg，Germany)从硼硅 玻璃拉制微吸管。在这些实验所用的盐溶液中微吸管电阻为2-3MOhm。 微吸管电极为氯化银丝，参比为固定于实验室上的氯化银片状电极(In Vivo Metric，Healdsburg，USA)。密封之前在浴中用开口微吸管对电极调零。
[320]将带细胞的盖玻片转移至安装在装配有Nomarski光学器件的倒置 显微镜(IMT-2，Olympus)的载物台上的15μl实验室中。以2.5ml/min的速 率不断用细胞外盐水灌流细胞。形成高阻密封后，通过抽吸获得全细胞形 态。将细胞吸持在-60mV的吸持电压下，且在各个实验开始时不断测定电 流(45s)以确保基线稳定。低pH(＜7)溶液通过定制的重力驱动输送管输送 到实验室内，输送管的尖端置于与细胞约50μm处。当与输送管相连的管 道被Pulse软件所控制的阀门施压时，施加被触发。最初，每60s施加5s 低pH(一般pH 6.5)。施加过程中的取样间隔为550μs。获得稳定的响应后， 将细胞外盐水以及低pH溶液换为含待测试化合物的溶液。使化合物存在 到获得具有可重复幅值的响应。测定响应峰处的电流幅值，并计算化合物 的效果，算法是用化合物平衡时的幅值除以加入化合物前即刻脉冲所引起 电流的幅值。
[321]使用下面的盐溶液：细胞外溶液(mM)：NaCl(140)，KCl(4)，CaCl2 (2)，MgCl2(4)，HEPES(10，pH 7.4)；细胞内溶液(mM)：KCl(120)，KOH (31)，MgCl2(1.785)，EGTA(10)，HEPES(10，pH 7.2)。一般来说，试验化合 物以500倍于所用最高浓度的浓度溶解于50％的DMSO中。
[322]化合物B和化合物R的膜片钳实验表明了其抑制重组人ASIC-门通 道的功效，如图2A和2B中所示。CHO细胞经用hASIC1a转染后用来作 化合物B和化合物R的全剂量-抑制曲线。结果以对无试验化合物的情况 下获得的对照峰电流的分数表示。这些数据表明，在该检测中，化合物B 和R均能剂量依赖性地降低hASIC1a的活性。
[323]图3比较了化合物R对人ASIC1a与对人ASIC3的选择性，二者均 在CHO细胞中稳定转染。图3A示出了化合物R对hASIC1a电流幅值和 动力学的影响。1μM的浓度使电流幅值平均降低50％。一冲洗除去化合物 后，该影响完全反转。相比之下，图3B示出了化合物R对酸引发hASIC3 电流的幅值和动力学的影响。即便在30μM的浓度下，化合物也未能降低 电流的幅值。图3C比较了化合物R对hASIC1a和hASIC3的剂量-响应 关系[通过测定响应曲线下的面积(总电荷转移)确定并将对照组响应计为 1]。化合物R明显地以剂量依赖方式降低了pH-诱导hASIC1a响应，但未 影响hASIC3，这表明该化合物对特定的ASIC亚基有选择性。
实施例3：爪蟾卵母细胞中ASIC拮抗剂的筛选和生物分析
[324]本实施例描述本发明化合物的活性的活体外评价。
[325]表达门控离子通道的爪蟾卵母细胞中双电极电压钳电生理检测按如 下所述进行：
[326]通过手术从成年爪蟾取得卵母细胞，室温下用1mg/ml的I型胶原酶 (Sigma)/Barth溶液在温和的搅拌下处理2h。在细胞核显微注射2.5-5ng的 适宜表达载体(如pCDNA3，包含编码门控离子通道亚基蛋白的核苷酸序 列)前将选定的第IV-V期的卵母细胞人工除去滤泡膜。在这样的实验中， 卵母细胞表达同源多聚体蛋白-门控离子通道于其表面上。在可选的实验 中，卵母细胞细胞核中共同注射一种、两种、三种或更多种包含编码各门 控离子通道亚基的序列的载体。在后一种情况下，卵母细胞表达异源多聚 体蛋白-门控离子通道。例如，pcDNA3载体中的ASIC2a和/或ASIC3亚 基以1∶1的cDNA比率共同注射。在含50mg/ml庆大霉素和1.8mM CaCl2 的Barth溶液中于19℃下表达2-4天后，通过施加酸性溶液(pH＜7)将门控 离子通道激活，并用OC-725B放大器(Warner Instruments)在双电极电压 钳模式下记录电流。电流在500Hz下于带A/D NB-MIO-16XL接口 (National Instruments)的Apple Imac G3计算机上获得并数字化，记录道 在Axograph(Axon Instruments)中于100Hz下后滤波(Beher，E.and Sakmann，B.(1976)Nature 260：799-802)。一旦经微电极穿刺，不断用含 97mM NaCl、2mM KCl、1.8mM CaCl2和10mM HEPES并用NaOH调 节至pH 7.4的改性Ringer溶液(对照Ringer)以10-12ml/min的速率灌流卵 母细胞。试验Ringer溶液通过用MES取代HEPES并调节pH至所需酸 性值制备。本发明的化合物同时在对照和试验Ringer溶液中制备并于室温 下通过计算机控制的开关阀系统施加给卵母细胞。用氯化胆碱将所有溶液 的克分子渗透压浓度调节至235mOsm。同样，也可在自动化多通道卵母 细胞系统如OpusExpressTM(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)中获 得记录。
[327]图4A、4B、4C和4D分别示出了化合物A、R、7和32的剂量-响 应关系(基于在OpusExpressTM系统中施加pH 6.5的试验Ringer溶液所引 发的hASIC1a电流)。记录用如本文中所述的双电极电压钳模式程序自表 达同源hASIC1a的卵母细胞获得。这些图中的数据表明化合物A、R、7 和32是这些门控离子通道的活性的有效调节剂。
实施例4：原代细胞系统中ASIC拮抗剂的筛选和生物分析
[328]本实施例用原代培养中感觉神经元的膜片钳电生理学描述本发明化 合物的抑制活性的另一预言性活体外评价。
[329]可自不同的动物物种分离和活体外培养感觉神经元。最广泛使用的 方法使用自新生鼠(Eckert，et al.(1997)J Neurosci Methods 77：183-190)和 胚胎鼠(Vasko，et al.(1994)J Neurosci 14：4987-4997)分离得到的感觉神经 元。三叉神经和背根神经节感觉神经元具有活体内感觉神经元的某些特 性。电生理检测按与上面实施例2中所述类似地进行。在电压钳模式中记 录跨膜电流。在电流钳模式中记录跨膜电位的改变。
实施例5：福尔马林模型-急性强直性痛模型
[330]本实施例描述本发明化合物的抑制活性的活体内评价。
[331]若干已确立的疼痛模型在文献中有描述并为本领域技术人员所熟知 (参见例如表1)。本实施例描述福尔马林试验的使用。
[332]将雄性Sprague-Dawley大鼠以三只为一组于标准条件下关在一起， 食物和水的摄取不受限制。所有实验均按有知觉动物中实验性疼痛研究道 德指南(Zimmerman，1983)进行。
[333]正常未损伤大鼠(体重150-180g)中福尔马林诱导的缩爪行为的评价 用Automated Nociception Analyser(自动化伤害性感受分析仪)(University of California，San Diego，USA)进行。简单来说，这涉及将一小的C形金属 带(10mm宽×27mm长)置于受试大鼠的后爪上。然后在按后述实验范式施 用给药物或媒介物之前将大鼠(各试验阶段涉及四只大鼠)置于圆柱形有机 玻璃观察室(直径30.5cm，高15cm)中适应20min。适应后，温和束缚各大 鼠并用27G针向后爪跖面中注射福尔马林(5％/盐水，50μl，s.c.)。然后使 大鼠回到其各自的观察室，再使各观察室位于封闭的检测设备上，所述检 测设备由两个设计以产生电磁场的电磁线圈组成，这样金属带的运动可记 录在其中。然后将模拟信号数字化并采用软件算法(LabView)来从其他爪 子运动中辨识出缩爪行为。使用1min的取样间隔，在所得响应规律的基 础上识别伤害性感受行为的5个阶段并记分：第一阶段(P1；0-5min)、中间 阶段(Int；6-15min)、第二阶段(P2；60min)、阶段2A(P2A；16-40min)和阶 段2B(P2B；41-60min)。
[334]伤害性感受行为也以人工方式每5min测定一次，做法是通过测定四 种行为类别中的每一种所花的时间量进行：0，注射后爪与对侧爪难以区分； 1，注射爪很少或没有负重；2，注射爪抬起而不与任何表面接触；3，舔、 咬或摇动注射爪。计算伤害性感受加权分数(0-3)，算法是用各类别所花的 时间乘以类别权重，对这些乘积求和，再除以由各5min时间段组成的总 时间(Coderre et al.，Pain 1993；54：43)。在所得响应规律的基础上识别伤害 性感受行为的2个阶段并记分：第一阶段(P1；0-5min)、中间阶段(Int； 6-15min)、第二阶段(P2；60min)、阶段2A(P2A；16-40min)和阶段2B(P2B； 41-60min)。
[335]用PrismTM 4.01软件包(GraphPad，San Diego，CA，USA)进行统计分 析。治疗组和对照媒介组之间响应水平的差异按Bonferroni方法用 ANOVA分析进行验后多重比较。p值＜0.05被认为是有明显差异。
[336]图5-7为化合物A和R对跖内福尔马林注射诱导的疼痛的剂量依赖 性效果的代表性实例。在图5中，化合物A先于福尔马林30分钟腹腔注 射。从用上述自动式损伤害性感受分析仪进行的评价可见，化合物A能在 福尔马林试验(n＝6)的第2阶段中减轻总的疼痛行为(缩爪、舔爪、咬爪)。
[337]化合物R得到了类似的结果(图6和7)(n＝6)。在该实例中，疼痛行 为用上述人工方法评价。化合物R对跖内福尔马林诱导的总体疼痛行为(图 6A)特别是咬爪和抬爪行为(图6B)有剂量依赖性效果。该效果的剂量依赖 性汇总于图7中(该检测中化合物R的ED50为约50mg/kg)。这些结果一起 证明了化合物A和R阻断爪子中注射福尔马林所诱导的急性强直性痛的功 效。
实施例6：CFA模型-慢性炎性痛模型
[338]向大鼠后爪中注射完全氟氏佐剂(CFA)已经表明将产生持久性的炎 性病症，其伴随注射点行为上的痛觉过敏和痛觉异常(Hylden et al.，Pain 37： 229-243，1989)(Blackburn-Munro et al.，2002)。在短时氟烷麻醉后向大鼠 (体重260-300g)后爪跖面中皮下注射CFA(50％/盐水，100μl，Sigma)。24h 后用Incapacitance Tester(Linton Instrumentation，UK)(Zhu et al.，2005) 测试其后爪承重响应。该仪器具有双通道刻度盘，其分别测定分配到各后 爪上的动物重量。由于正常大鼠的体重在两个后爪之间均匀分配(50-50)， 故受伤和未受伤爪之间重量分配的差异自然将反映受伤爪中的不适程度 (伤害防御行为)。将大鼠置于设计以使各后爪停靠在单独的传感器垫上的 塑料室中。设置平均器以记录5s的时间段内传感器上的载荷，所显示的两 个数代表大鼠体重在各爪上的分配，单位为克(g)。对于各大鼠，自各爪取 三个读数然后平均。计算三次试验中两个后爪之间差异(右爪读数-左爪读 数)绝对值的平均值作为两侧的承重差异。
[339]热痛觉过敏的评价：对有害热刺激的基线和治疗后回缩潜伏期按 Hargreaves(Hargreaves et al.，1988)方法用足底试验测痛仪(IITC， Woodland Hills，CA，model #336)测定。刺激强度设置为最大输出的30％， 截止时间设置为30秒。将大鼠置于加热至28℃的玻璃板上并在各试验阶 段之前使其在试验室中至少适应15分钟。向爪子的跖面施加热刺激，以各 爪子上三个潜伏期读数的平均值作为各时间点的潜伏期值。热阈值定义为 第一个疼痛行为的潜伏期，单位为秒，所述第一个疼痛行为包括伤害防御 性缩爪、缩、咬和/或舔受刺激的爪子。为各治疗组的受伤和正常爪子确定 平均值(SEM)的平均和标准误差。
实施例7：ASIC的克隆和表达
[340]ASIC1a和ASIC3(或其他ASIC亚型)的cDNA可按Hesselager et al. (J Biol Chem.279(12)：11006-152004)自大鼠/人poly(A)+mRNA克隆并置 于表达载体中。所构建的表达载体在CHO-K1细胞(ATCC no.CCL61)或 HEK293细胞中表达。将CHO-K1细胞在37℃下于5％CO2和95％空气 的潮湿环境中培养并每周传代两次。使细胞保持在加有10％胎牛血清和2 mM L-脯氨酸(Life Technologies)的DMEM(10mM HEPES，2mM glutamax)中。用Lipofectamine PLUS转染试剂盒(Life Technologies)或 Lipofectamine 2000(Invitrogen)按生产商的说明用含ASIC的质粒和编码 增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒共转染CHO-K1细胞。对于各转染， 设法用产生合理范围内(0.5nA-10nA)的全细胞电流的DNA量以避免膜片 钳放大器的饱和(对于ASIC1a和ASIC3约为50ng)。转染后16-48小时进 行电生理学测定。在进行电生理学记录的当天使细胞胰蛋白酶化并接种于 预先涂覆有poly-D-lysine的盖玻片上。通过特异性抗生素(即G418，Zeocin) 筛选获得表达ASIC通道的稳定克隆。
实施例8：合成程序
[341]代表性喹啉化合物(化合物R)的合成程序

[342]向1-苄基-4-羟基-哌啶(198mg，1.0mmol)/DMF(5ML)溶液中加入 NaH(95％，38mg，1.5mmol)，悬浮液于室温下搅拌15min后加入氯喹啉 (178mg，1.0mmol)。然后用微波将反应混合物在150℃下加热15min。蒸发 除去DMF并加入水猝灭反应。水溶液用EtOAc萃取三次。粗产物用柱色 谱(Biotage)纯化得到230mg纯净产物，产率为70％。
[343]代表性喹唑啉化合物(化合物K)的合成程序

[344]步骤1：将邻氨基苯甲酰胺(1.36g，10mmol)和碳酸钾(2.07g，15mmol) 悬浮在68ml乙醚中并加热以回流(reflux)。向回流混合物中缓慢加入对 甲基苯甲酰氯(1.72ml，13mmol)。回流3h后让反应混合物冷却至室温。蒸 发除去乙醚，过滤所得残留物，用水洗涤并用乙醚处理，得到相当纯净的 产物。
[345]步骤2：将粗产物(2.2g)悬浮在5％的NaOH(40ml)中并沸腾12小时。 冷却后加入HOAc以调节pH至5。过滤固体物并用水洗涤，然后干燥。
粗产物用柱色谱(Biotage)纯化得到1.85g纯净产物，两步的产率为76％。
[346]步骤3：向羟基喹唑啉(472mg，2.0mmol)/苯(20ml)的悬浮液中加入 SOCl2(1.5ml，20mmol)。混合物回流3-6小时，直至变为澄清溶液。蒸发 除去溶剂。将固体残留物溶解进二氯甲烷中并用碳酸氢钠水溶液洗涤，然 后干燥。粗产物用柱色谱(Biotage)纯化得到460mg纯净产物，产率为90％。
[347]步骤4：将氯喹唑啉(254mg，1.0mmol)和氨基苯甲酸(137mg，1.0mmol) 溶解在DMF(5ml)中，用微波将反应混合物在150℃下加热15min。蒸发 除去DMF并加入水猝灭反应。过滤固体物，用水洗涤，然后干燥。粗产 物用柱色谱(Biotage)纯化得到286mg纯净产物，产率为80％。1HNMR (CDCl3，400Hz)：δppm 12.82(1H，br.s)，10.09(1H，s)，8.60(1H，d，J＝8.0 Hz)，8.37(2H，d，J＝8.0Hz)，8.17(2H，d，J＝8.0Hz)，8.05(2H，d，J＝8.0 Hz)，7.89(2H，d，J＝3.2Hz)，7.64(1H，m)，7.36(2H，d，J＝8.0Hz)，2.39(3H， s)。
[348]代表性喹唑啉化合物(化合物32和33)的合成程序
[349](步骤1和2)

[350]向搅拌下的邻氨基苯甲酰胺(4.00g，29.38mmol)/干醚(30mL)溶液中 加入K2CO3(5.70g，41.14mmol)，然后加入丙酰氯(3.30mL，38.19mmol)。反 应混合物于室温下搅拌15小时，然后回流4小时。除去醚，过滤白色固体 并用水洗涤。将产物直接悬浮在5％的NaOH溶液(40mL)中并回流3小时。 用乙酸中和反应混合物，过滤沉淀物，然后用水洗涤。减压干燥白色固体， 得到4.42g(86％)中间体。
[351](步骤3)

[352]向搅拌下的喹唑啉酮(0.20g，1.14mmol)/干THF(6mL)溶液中加入苯 基醚(0.18mL，1.14mmol)，然后加入BOP(0.66g，1.48mmol)和DBU(0.26ml， 1.71mmol)。然后向反应混合物中逐滴加入胺。反应混合物于室温搅拌过 夜。产物(化合物33)经减压浓缩和快速色谱纯化。
[353](步骤4)

[354]向搅拌下的化合物33(60mg，0.17mmol)/干DMF(2mL)溶液中加入 NaH(14.0mg，0.58mmol)，然后加入MeI(50μL，0.80mmol)。反应混合物经 搅拌1小时，然后用水猝灭。分离有机层并减压浓缩。产物(化合物32)用 PREP HPLC纯化分离。
[355]代表性喹啉化合物(化合物7)的合成程序

[356]6-溴-4-羟基喹哪啶按先前发表(J.Org.Chem.1964，29，3548； Biochem.Pharm.1996，52，551)的程序合成。将4-溴苯胺(2g，0.012mol)、 乙酰乙酸乙酯(2.96mL，0.024mol)和5g多磷酸在搅拌下于170℃加热1h。 反应用2％的NaOH水溶液中和，4-羟基喹哪啶沉淀物用水洗涤，加乙醚 研细并干燥，得到6-溴-4-羟基喹哪啶。
[357]向6-溴-4-羟基喹哪啶(0.270g，1.134mmol)中加入POCl3(5mL)，溶液 加热回流1h。减压除去溶剂，向残留物中加入冰水，并用10％的NaOH 水溶液碱化。滤出固体物，再溶解在乙醚中，滤出不溶物。滤液经减压浓 缩得到6-溴-4-氯喹哪啶。

[358]将6-溴-4-氯喹哪啶(0.120g，0.468mmol)、1-苄基-4-羟基哌啶(0.045g， 0.234mmol)和NaH 95％(0.012g，0.468mmol)溶解在DMF(5mL)中并在微 波中于75℃加热1h。使反应混合物冷却至室温并加入0.5mL水。减压除 去溶剂，残留物用水稀释，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，用水、食盐水洗涤， 并用MgSO4干燥。减压除去溶剂，粗产物用柱色谱(EtOAc/己烷：20/80- 100％EtOAc)纯化得到化合物7(0.045g，47％)。
[359]图8示出了化合物36、37和38的制备的合成示意图。
[360]图9A、9B、9C和9D示出了化合物39和47的制备的合成示意图 以及本发明的一般化合物的预言性合成示意图。
[361]图10示出了化合物108的制备的合成示意图。
[362]图11A和11B示出了化合物103和104的制备的合成示意图。
[363]图12示出了可用于本发明化合物的制备的中间体其制备的合成示 意图。
[364]图13A、13B和13C示出了化合物107、105和106的制备的合成示 意图。
等价方案
[365]仅使用常规实验，本领域技术人员即将确认或能确定本文中所述本 发明的特定实施方案的许多等价方案。这样的等价方案涵盖在附随的权利 要求内。
相关申请
[01]本申请要求2005年12月21日提交的美国临时申请第60/753,201号 (名称为“调节门控离子通道的组合物和方法”，代理人卷号PCI-032-1) 的优先权。本说明书中提到的任何专利、专利申请和参考文献的内容在文 中通过参引将其全文引用结合到本文中。
通过参引引入
[366]本文中所提到的所有专利、公开的专利申请和其他参考文献的全部 内容在此通过其全文引用明确结合于本文中。