测百草枯的方法
技术领域
背景技术
[0002] 百草枯，化学名1，1-二甲基-4，4-联吡啶阳离子，属于有机杂环类季铵盐
除草剂。是一种快速灭生的除草剂，具有广谱速效和触杀的作用。它曾被人们认为是对环境无害的
农药，其产量和用量在世界上名列前位，被全球推广使用。然而，近年来，百草枯已被世界卫生组织分类为中等毒性农药，其毒性极大，会造成心
肺和肝肾等严重毒害，一旦中毒，无有效解毒药物，口服中毒死亡率达90％以上。据报道，每年在欧洲、亚洲、美洲均有大量百草枯致死的案例出现，大多案例为口服误食致死。我国是百草枯生产使用的大国，也是中毒者数量最多的国家之一。因此，加强百草枯检测方法学研究对于保障我国
食品安全和农产品贸易具有重要意义。
[0003] 目前，百草枯的检测方法主要有气相色谱法、液相色谱法、高效液相色谱
串联质谱法、拉曼
光谱法等。其中，气相色谱法仪器普遍、灵敏度较高，很早就开始被应用于百草枯的检测，但存在百草枯沸点高、难
裂解气化、前处理操作繁琐等不足；液相色谱法是百草枯检测最常用的方法，主要优点在于可以保留
碱性化合物，无需使用离子对
试剂，但其存在灵敏度不高、定性能
力较差等缺点。高效液相色谱-串联质谱技术作为近年来得到广泛应用的技术，具有高灵敏度、痕量检测和准确定性等特点，成为检测分析的重要手段，但其检测成本较大，且前处理过程较繁琐。
[0004]
生物传感器是一种集生物识别元素和
信号转换元素为一体的分析检测装置，其可选择性的提供定性或定量的分析信号，从而实现对目标物的准确测定。目前，生物传感器主要采用光学、电化学、热学、声学等方式来获取检测信号。其中，
光学传感器技术因具有分析成本低、分析时间短、操作简单，且可以进行原位甚至活体分析等优势，在临床诊断、生命过程研究、食品分析、药物分析、环境监测、以及生物芯片等领域具有十分广阔的应用前景。
[0005] 目前，光学传感领域的研究热点是以核酸为分子识别元素构建的生物传感器，由于其研究尚处初步阶段，在百草枯测定方面面临提高灵敏度等挑战。因此，迫切需要与其它方法和材料相结合，构建新型生物传感器，以满足百草枯的高选择、超灵敏检测。
发明内容
[0006] 本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种基于纳米金表面的化学发光共振能量转移传感器快速检测百草枯的方法，充分利用纳米金的
生物相容性、尺寸效应、增敏或
吸附作用，辣根过
氧化物酶的高特异性，将辣根过氧化物酶富集在纳米金表面，可为鲁米诺-过氧化氢-辣根过氧化物酶和纳米金之间的化学发光共振能量转移提供了必要条件，达到高敏度检测的目的。
[0007] 为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0008] 一种基于纳米金表面的化学发光共振能量转移传感器快速检测百草枯的方法，包括以下步骤：
[0009] S1.首先将纳米金与辣根过氧化物酶溶液在15～35℃下温育30～35min，得到辣根过氧化物酶-纳米金(HRP-AuNPs)
复合体。
[0010] S2.将步骤S1得到的辣根过氧化物酶-纳米金复合体与一系列百草枯标准液在15～35℃下混合温育30～35min，得到一系列辣根过氧化物酶-纳米金(HRP-AuNPs)、百草枯-纳米金混合溶液；该反应使金纳米表面富集更多的百草枯，使HRP远离纳米金表面，从而抑制了Luminol-H2O2-HRP-AuNPs之间的化学发光共振能量转移。
[0011] S3.将化学发光增敏液分别加入到S2得到的一系列辣根过氧化物酶-纳米金、百草枯-纳米金混合溶液中，得到Luminol-H2O2-HRP-AuNPs化学发光共振能量转移体系。
[0012] S4.在室温下用酶标仪测量化学发光共振能量转移体系的化学发光强度，绘制标准曲线。
[0013] 在无百草枯存在时，HRP吸附在AuNPs的表面，促进鲁米诺和AuNPs之间发生化学发光共振能量转移(化学发光被猝灭),能检测到较弱的化学发光强度。在百草枯存在下，HRP远离AuNPs表面，从而降低了鲁米诺和AuNPs两者间的化学发光共振能量转移效率，同一条件下，化学发光得到恢复，能检测到较强的化学发光强度。且相对化学发光强度ΔI(ΔI＝I/I0，I0为无百草枯存在时鲁米诺的化学发光强度，I为不同浓度的百草枯存在时鲁米诺的化学发光强度)与百草枯在一定浓度范围内成线性关系。
[0014] S5.将百草枯待测液代替百草枯标准液，重复步骤S1、S2和S3制备化学发光共振能量转移体系并测量其化学发光强度，达到对百草枯定量检测的目的。
[0015] 通过酶标仪读取结果，根据检测值和空白对照值的差异来判断待测的样本中是否含有百草枯，并根据标准曲线实现定量检测百草枯的目的。
[0016] 优选的，步骤S2中，一系列百草枯标准液的浓度分别为0.0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL。
[0017] 优选的，化学发光增敏液是按鲁米诺的浓度为0.5mmol/L～3mmol/L、4-咪唑
苯酚的浓度为0.1mmol/L～10mmol/L、过氧化氢的浓度为1mmol/L～10mmol/L、以浓度为0.1mol/L、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液为稀释液配制而成的溶液。
[0018] 优选的，步骤S4中，相对化学发光强度ΔI(ΔI＝I/I0，I0为无百草枯存在时鲁米诺的化学发光强度，I为不同浓度的百草枯存在时鲁米诺的化学发光强度)与百草枯在一定浓度范围内成线性关系；以百草枯浓度为横坐标，ΔI为纵坐标，得到标准曲线为y＝0.004x+0.9743。
[0019] 由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
[0020] 1.本发明的一种基于纳米金表面的化学发光共振能量转移传感器快速检测百草枯的方法，充分利用纳米金的生物相容性、尺寸效应、增敏或吸附作用，辣根过氧化物酶的高特异性，将辣根过氧化物酶富集在纳米金表面，可为鲁米诺-过氧化氢-辣根过氧化物酶和纳米金之间的化学发光共振能量转移提供了必要条件，达到高敏度检测的目的。
[0021] 2.本发明的一种基于纳米金表面的化学发光共振能量转移传感器快速检测百草枯的方法，辣根过氧化物酶(HRP)催化的化学发光增敏液(鲁米诺-过氧化氢-4-咪唑苯酚)的化学发光反应体系具有光量子产率高，发光时间长等独特光学性质，将辣根过氧化物酶(HRP)富集在纳米金表面，可为鲁米诺-过氧化氢-辣根过氧化物酶和纳米金之间的化学发光共振能量转移提供了必要条件。而百草枯可以有效的和辣根过氧化物酶竞争富集在在纳米金表面，从而降低化学发光共振能量转移效率，化学发光得到恢复，能检测到更强的化学发光强度。微孔板酶标仪具有高性能微孔板检测系统，在批量快速筛查作业中可以发挥独特优势。
附图说明
[0022] 图1为
实施例1基于纳米金表面的化学发光共振能量转移传感器检测测百草枯的标准曲线。
具体实施方式
[0023] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0024] 一、相关试剂材料
[0025] 纳米金(AuNPs)：表面带负电荷，
比表面积高，负载量高，易于表面功能化；产品分散性以及
稳定性俱佳(购于南京先锋
纳米材料科技有限公司)；
[0026] 辣根过氧化物酶(购于美国sigma)；
[0027] 百草枯(购于美国O2SI)。
[0028] 实施例1
[0029] 一种基于纳米金表面的化学发光共振能量转移传感器快速检测百草枯的方法，包括以下步骤：
[0030] S1.首先将纳米金与辣根过氧化物酶溶液在20℃下温育30min，得到辣根过氧化物酶-纳米金(HRP-AuNPs)复合体。
[0031] S2.将步骤S1得到的辣根过氧化物酶-纳米金复合体与一系列百草枯标准液在20℃下混合温育30～35min，得到一系列辣根过氧化物酶-纳米金(HRP-AuNPs)、百草枯-纳米金混合溶液；一系列百草枯标准液的浓度分别为0.0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL。该反应使金纳米表面富集更多的百草枯，使HRP远离纳米金表面，从而抑制了Luminol-H2O2-HRP-AuNPs之间的化学发光共振能量转移。
[0032] S3.将化学发光增敏液分别加入到S2得到的一系列辣根过氧化物酶-纳米金、百草枯-纳米金混合溶液中，得到Luminol-H2O2-HRP-AuNPs化学发光共振能量转移体系。
[0033] 化学发光增敏液是按鲁米诺的浓度为2mmol/L、4-咪唑苯酚的浓度为5mmol/L、过氧化氢的浓度为5mmol/L、以浓度为0.1mol/L、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液为稀释液配制而成的溶液。
[0034] S4.在室温下用酶标仪测量化学发光共振能量转移体系的化学发光强度，绘制标准曲线。
[0035] 在无百草枯存在时，HRP吸附在AuNPs的表面，促进鲁米诺和AuNPs之间发生化学发光共振能量转移(化学发光被猝灭),能检测到较弱的化学发光强度。在百草枯存在下，HRP远离AuNPs表面，从而阻止鲁米诺和AuNPs两者间的化学发光共振能量转移，同一条件下，化学发光得到恢复，能检测到较强的化学发光强度。且相对化学发光强度ΔI(ΔI＝I/I0，I0为无百草枯存在时鲁米诺的化学发光强度，I为不同浓度的百草枯存在时鲁米诺的化学发光强度)与百草枯在一定浓度范围内成线性关系。
[0036] S5.将百草枯待测液代替百草枯标准液，重复步骤S1、S2和S3制备化学发光共振能量转移体系并测量其化学发光强度，达到对百草枯定量检测的目的。
[0037] 通过酶标仪读取结果，根据检测值和空白对照值的差异来判断待测的样本中是否含有百草枯，并根据标准曲线实现定量检测百草枯的目的。
[0038] 实施例2
[0039] 一种基于纳米金表面的化学发光共振能量转移传感器快速检测百草枯的方法，包括以下步骤：
[0040] S1.首先将纳米金与辣根过氧化物酶溶液在15℃下温育35min，得到辣根过氧化物酶-纳米金(HRP-AuNPs)复合体。
[0041] S2.将步骤S1得到的辣根过氧化物酶-纳米金复合体与一系列百草枯标准液在15℃下混合温育35min，得到一系列辣根过氧化物酶-纳米金(HRP-AuNPs)、百草枯-纳米金混合溶液；一系列百草枯标准液的浓度分别为0.0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL。该反应使金纳米表面富集更多的百草枯，使HRP远离纳米金表面，从而抑制了Luminol-H2O2-HRP-AuNPs之间的化学发光共振能量转移。
[0042] S3.将化学发光增敏液分别加入到S2得到的一系列辣根过氧化物酶-纳米金、百草枯-纳米金混合溶液中，得到Luminol-H2O2-HRP-AuNPs化学发光共振能量转移体系。
[0043] 化学发光增敏液是按鲁米诺的浓度为3mmol/L、4-咪唑苯酚的浓度为10mmol/L、过氧化氢的浓度为1mmol/L、以浓度为0.1mol/L、pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液为稀释液配制而成的溶液。
[0044] S4.在室温下用酶标仪测量化学发光共振能量转移体系的化学发光强度，绘制标准曲线。
[0045] 在无百草枯存在时，HRP吸附在AuNPs的表面，促进鲁米诺和AuNPs之间发生化学发光共振能量转移(化学发光被猝灭),能检测到较弱的化学发光强度。在百草枯存在下，HRP远离AuNPs表面，从而降低鲁米诺和AuNPs两者间的化学发光共振能量转移效率，同一条件下，化学发光得到恢复，能检测到较强的化学发光强度。且相对化学发光强度ΔI(ΔI＝I/I0，I0为无百草枯存在时鲁米诺的化学发光强度，I为不同浓度的百草枯存在时鲁米诺的化学发光强度)与百草枯在一定浓度范围内成线性关系。
[0046] S5.将百草枯待测液代替百草枯标准液，重复步骤S1、S2和S3制备化学发光共振能量转移体系并测量其化学发光强度，达到对百草枯定量检测的目的。
[0047] 通过酶标仪读取结果，根据检测值和空白对照值的差异来判断待测的样本中是否含有百草枯，并根据标准曲线实现定量检测百草枯的目的。
[0048] 上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的
专利申请范围。凡本发明所提示的技术构思下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
