一种猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方法
专利汇可以提供一种猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种快速有效的极小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells，VSELs)分离和纯化方法，包括以下步骤 ：1. 猪骨髓液红细胞裂解后经含FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞分离出猪骨髓总单个核细胞；2. 加入FcR封闭液，耦合CD133 抗体 或Lin抗体的免疫 磁珠 ，过柱分选，获得猪骨髓CD133（+）或Lin（-）细胞群；3. 采用CD133、CD45、Lin抗体标记流式细胞分选术获得猪骨髓CD133 (+) Lin (-) CD45 (-)极小胚胎样干细胞。本发明具有高效率、高纯度、高度稳定等优势，是首次分离、纯化出偶 蹄 类动物猪的VSELs，丰富了现有的干细胞库，有利于对大型偶蹄动物VSELs进一步研究，使VSELs更接近于临床应用。，下面是一种猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方法专利的具体信息内容。
1.一种猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）猪骨髓液红细胞裂解后经含FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞分离出猪骨髓总单个核细胞；
（2）按照1×108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液，耦合CD133抗体或Lin抗体的免疫磁珠，过柱分选，获得猪骨髓CD133（+）或Lin（-）细胞群；
（3）采用CD133、CD45、Lin抗体标记的流式细胞分选术获得猪骨髓CD133 (+) Lin (-) CD45 (-)极小胚胎样干细胞。
2.根据权利要求1 所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的分离出猪骨髓总单个核细胞，步骤包括：
（1）猪的麻醉
选取2-4月龄、体重(35±5kg)小型成体猪，予速眠新II和地西泮适量肌肉注射后20分钟，待猪处于适度麻醉时，将其固定于动物手术室洁净操作台上；
(2) 骨髓穿刺
以髂后或髂前上棘为穿刺点，于该点周围10cm范围备皮，继之用1%碘伏消毒三次，穿无菌手术衣、带无菌手套后进行骨髓穿刺，用含有肝素水的无菌注射器抽取骨髓50mL于预先抗凝的无菌试管中，并反复摇动试管以防骨髓液凝固；
(3) 去除脂肪及泡沫
将骨髓液平均分装于四只50mL离心管中，4℃条件下1000 rpm离心10分钟去除脂肪及泡沫；
(4) 红细胞裂解
按照红细胞裂解液与骨髓液4:1的比例加入红细胞裂解液，轻轻旋转离心管以充分混匀，室温下孵育10分钟，4℃下500 rpm离心10分钟，缓慢吸除上清液；按照裂解液与骨髓液
2:1比例再次加入裂解液重悬细胞，室温孵育10分钟，4℃下500 rpm离心10分钟，吸除上清液；
4℃下加入0.02%EDTA洗涤得细胞悬液；
(5) 总单个核细胞的分离
用30mL含2%FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，轻轻吹打，4℃下500 rpm离心10分钟，用
2ml含2% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，经40um滤网过滤后，以细胞计数板计数备用。
3.根据权利要求1 所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的获得猪骨髓CD133（+）细胞群，步骤包括：
(1) 加FcR非特异性吸附剂封闭细胞
将上述分离的总单个核细胞悬液4℃下500 rpm离心10分钟，按照1×108/300ul细胞浓
8
度加入缓冲液重悬细胞，按照1×10/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；
(2) 加CD133抗体免疫磁珠标记细胞
按照1×108/100ul细胞浓度加入耦合CD133抗体的免疫磁珠标记细胞，充分混匀，2℃～
8℃孵育30分钟，按照1×108/2ml细胞浓度加入缓冲液清洗细胞，4℃500 rpm离心10分钟，
8
小心吸除上清液后按照1×10/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞；
(3) 细胞过柱免疫磁珠分选获得CD133（+）细胞
将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每1ml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸取PBS缓冲液500uL注入分选柱中浸润，分选柱充分浸润后注入1ml细胞悬液，待细胞悬液流尽后，再从分离柱上端添加PBS缓冲液1ml冲洗，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，分选柱内磁珠结合的细胞即为CD133（+）细胞。
4.根据权利要求1 所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的获得猪骨髓Lin（-）细胞群，步骤包括：
(1) 加FcR非特异性吸附剂封闭细胞
将上述分离的总单个核细胞悬液，4℃下500 rpm离心10分钟，按照1×108/400ul细胞浓
8
度加入缓冲液重悬细胞，按照1×10/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；
(2) 加Lin抗体免疫磁珠标记细胞
按照1×108/100ul细胞浓度加入耦合Lin抗体免疫磁珠标记细胞，充分混匀，2℃～8℃孵育30分钟，按照1×108/5ml细胞浓度加入缓冲液清洗细胞，4℃500 rpm离心10分钟，吸除
8
上清液后按照1×10/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞；
(3) 细胞过柱免疫磁珠分选获得Lin（-）细胞
将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每1ml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸取PBS缓冲液500uL浸润分选柱，注入1ml细胞悬液，细胞悬液过柱后冲洗分选柱三次，每次加入1ml缓冲液，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，无菌管中细胞悬液即为Lin（-）细胞群。
5.根据权利要求1 所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的获得猪骨髓CD133 (+) Lin (-) CD45 (-)极小胚胎样干细胞，步骤包括：
(1) 细胞的标记
确定细胞悬液中的细胞数量，以1000 rpm离心10 分钟，弃去上清液，将细胞悬液分五组：空白对照组，CD133标记组，CD45标记组，Lin标记组，CD133/CD45/Lin标记组；
每107个细胞加入100ul 缓冲液以及10ul荧光素标记的抗体原液，轻轻吹打充分混匀，避光置于冰上孵育10分钟；添加3mL含有2% 的FBS的RPMI1640培养基清洗每组样本，以300 rpm离心10分钟，用培养基重悬细胞，过滤，置于冰中保存，备用；
(2) 微珠尺寸的确定
流式分选细胞样本之前，运行预先确定尺寸的微珠（以1、2、4、6、10和15μm标准直径的尺寸校准球体），吸取5种直径的微珠各200ul分别置于5个1.5ml的无菌管中，将五组细胞按顺序运行于流式细胞仪上，调整阈值使其能够发现介于2-10μm的所有物体；
(3) 流式分选
分别记录CD133 (+)、Lin (-)、CD45 (-)、CD133 (+) Lin (-) CD45 (-)细胞亚群在总细胞中所占比例，选用标准的高纯度分选模式，以保证所分选的细胞较高的恢复能力和纯度，收集CD133 (+)Lin (-)CD45 (-)即VSELs；
将流式分选后得到的VSELs加到无饲养层细胞的培养板中，置于37℃、5% CO2的培养箱中，同时添加双抗（青-链霉素储存液），LIF、bFGF、SCF等细胞因子的R/分钟I 1640条件培养基进行培养。
6.如权利要求2 所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的红细胞裂解液：由FACS溶血素与超纯水按照体积比1：10比例混匀，使用0.22um微孔滤膜过滤除菌，4℃保存，使用时预热至室温。
7.如权利要求2 所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的PBS缓冲液（不含Ca、Mg）：取Na2HPO4·12H2O 1.4425g，KH2PO4 0.1g，NaCl 4g，KCl 0.1g，溶解于500mL新制备的超纯水中，定容后调整PH至7.2，高压灭菌后，4℃保存。
8.如权利要求2所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的
0.02%EDTA:将0.02gEDTA溶于100mLPBS缓冲液中，将PH调整至7.2后使用0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃环境中备用。
9.如权利要3所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法, 其特征在于，所述的CD133抗体的免疫磁珠为CD133 MicroBead Kit- Hematopoietic Tissue。
10.如权利要求4所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的Lin抗体的免疫磁珠为Lineage Cell Depletion kit。
11.如权利要求5所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的荧光素标记的抗体原液为PerCP-Cy5.5-anti-CD45单克隆抗体、anti-Lin-FITC单克隆抗体和anti-CD133/2PE单克隆抗体。
12.如权利要求5所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，所述的双抗（青-链霉素储存液）：取青、链霉素各100万单位溶于100mLPBS缓冲液中。
13.如权利要求1 所述的方法，其特征在于，实施本方法涉及到的主要实验仪器，包括超净工作台、CO2恒温培养箱、倒置荧光显微镜、恒温水浴锅、微量移液枪、漩涡振荡仪、冰箱、电子天平制冰机、超纯水设备、免疫磁珠分选仪、流式细胞仪、5810R型低温高速离心机。
14.如权利要求1 所述的猪极小胚胎样干细胞的分离与纯化方法，其特征在于，实施本方法涉及到的主要实验器械，包括(1) 手术器械：骨髓穿刺包，1mL、5mL、20mL注射器；(2) 细胞培养相关实验器材：T 25细胞培养瓶、6孔、24孔及96孔细胞培养板，15mL及50mL离心管, 0.22um滤膜及塑料滤器,40um滤网，烧杯,量筒,细胞计数板。
一种猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方法
技术领域
背景技术
发明内容
（2）按照1×108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液，耦合CD133抗体或Lin抗体的免疫磁珠，过柱分选，获得猪骨髓CD133（+）或Lin（-）细胞群；
（3）采用CD133、CD45、Lin抗体标记的流式细胞分选术获得猪骨髓CD133 (+) Lin (-) CD45 (-)极小胚胎样干细胞。
数量达到1×10以上。与采用红细胞裂解法和经典流式细胞分选（公开号103396988A）相比效率提高3-4倍，单纯采用流式分选如达到一定数量级的目标细胞，每次须24-36小时、耗时长，细胞大量损伤且少量VSELs有可能已分化为较成熟细胞；与采用某一种单抗磁珠分选法（公开号102229910A）相比纯度显著增高。发明提出的高效VSELs的分离、方法具有巨大的应用前景，为VSELs的临床研究提供了重要的技术保障。
将上述分离的总单个核细胞悬液4℃下500 rpm离心10分钟，按照1×108/300ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞，按照1×108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；
(2) 加CD133抗体免疫磁珠标记细胞
按照1×108/100ul细胞浓度加入耦合CD133抗体的免疫磁珠标记细胞。充分混匀，2℃～8℃孵育30分钟。按照1×108/2ml细胞浓度加入缓冲液清洗细胞，4℃500 rpm离心10分钟。小心吸除上清液后按照1×108/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞；
(3) 细胞过柱免疫磁珠分选获得CD133（+）细胞
将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每1ml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸取PBS缓冲液500uL注入分选柱中浸润，分选柱充分浸润后注入1ml细胞悬液，待细胞悬液流尽后，再从分离柱上端添加PBS缓冲液1ml冲洗，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，分选柱内磁珠结合的细胞即为CD133（+）细胞。
将上述分离的总单个核细胞悬液，4℃下500 rpm离心10分钟，按照1×108/400ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞。按照1×108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；
(2) 加Lin抗体免疫磁珠标记细胞
按照1×108/100ul细胞浓度加入耦合Lin抗体的免疫磁珠，标记细胞。充分混匀，2℃～
8℃孵育30分钟。按照1×108/5ml细胞浓度加入缓冲液清洗细胞，4℃500 rpm离心10分钟。
小心吸除上清液后按照1×108/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞；
(3) 细胞过柱免疫磁珠分选获得Lin（-）细胞
将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每1ml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸取PBS缓冲液500uL浸润分选柱，注入1ml细胞悬液，细胞悬液过柱后冲洗分选柱三次，每次加入1ml缓冲液，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，无菌管中细胞悬液即为Lin（-）细胞群。
(2) 制备周期短，制备效率高，将红细胞裂解法、MACS和FACS三道程序科学组合，50ml猪骨髓液分离时间缩短至4-6小时；
(3) 方法实用、易行，可重复性强；
(4) 可靠性明显增加，细胞得率高、细胞数量达到1×105以上；
(5) 分离纯度显著增加，纯度达到95%以上，而采用一种单克隆抗体包被的免疫磁珠法，细胞繁杂，纯度不够；
(6) 为偶蹄类动物其它组织如外周血、脑、心肌、肾脏、胰腺等VSELs的制备提供了新的方法，同时也为偶蹄类动物VSELs细胞后续研究提供了方法和途径；
(7) 该技术也适用于其它物种如鼠、人、禽类等VSELs的制备，可用于珍贵物种的研究与开发。
附图说明
选取3-4月龄、35±5kg小型成体猪, 于臀大肌处10cm范围备皮后，采用1%碘伏溶液消毒3次，予速眠新II和地西泮适量肌肉注射, 20分钟后待猪麻醉时，将其固定于动物手术室洁净操作台上；
(2) 骨髓穿刺
以髂后或髂前上棘为穿刺点，用含有肝素水的无菌注射器抽取骨髓50mL于预先抗凝的无菌试管中，并反复摇动试管以防凝固；
(3) 去除脂肪及泡沫
将骨髓液平均分装于四只50mL离心管中，4℃条件下1000 rpm离心10分钟；
(4) 红细胞裂解
由FACS溶血素与超纯水按照体积比1：10比例混匀，使用0.22um微孔滤膜过滤除菌，制作红细胞裂解液，4℃保存，使用时预热至室温，按照红细胞裂解液与骨髓液4:1的比例加入红细胞裂解液，充分混匀，室温下孵育10分钟，4℃下500 rpm离心10分钟，缓慢吸除上清液。
再按照裂解液与骨髓液2:1比例再次加入裂解液重悬细胞，室温孵育10分钟，4℃下500 rpm离心10分钟，小心吸除上清液，4℃下加入0.02%EDTA洗涤得细胞悬液；
所加入的0.02%EDTA是将0.02gEDTA溶于100mLPBS缓冲液中，将PH调整至7.2后使用
0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃环境中，使用前取出；
(5) 总单个核细胞的分离
用30mL含2%FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，轻轻吹打，4℃下500 rpm离心10分钟；用
2ml含2% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，经40um滤网过滤后，计数备用。
(1) 加FcR非特异性吸附剂封闭细胞
将上述分离的总单个核细胞悬液4℃下500 rpm离心10分钟，按照1×108/300ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞。按照1×108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；
(2) 加CD133抗体免疫磁珠标记细胞
8
按照1×10/100ul细胞浓度加入耦合CD133抗体的免疫磁珠标记细胞；2℃～8℃孵育
30分钟，按照1×108/2ml细胞浓度加入PBS缓冲液清洗细胞，4℃500 rpm离心10分钟。按照1×108/500ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞；所述的CD133抗体的免疫磁珠为CD133 MicroBead Kit- Hematopoietic Tissue；
(3) 细胞过柱免疫磁珠分选获得CD133（+）细胞
将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每1ml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸取PBS缓冲液500uL注入分选柱中浸润，分选柱充分浸润后注入1ml细胞悬液，待细胞悬液流尽后，再从分离柱上端添加PBS缓冲液1ml冲洗，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，分选柱内细胞即为CD133（+）细胞；
所述的PBS缓冲液（不含Ca、Mg），是取Na2HPO4·12H2O 1.4425g，KH2PO4 0.1g，NaCl
4g，KCl 0.1g，溶解于500mL新制备的超纯水中，定容后调整PH至7.2，高压灭菌后，4℃保存。
将上述分离的总单个核细胞悬液，4℃下500 rpm离心10分钟，按照1×108/400ul细胞浓度加入缓冲液重悬细胞。按照1×108/100ul细胞浓度加入FcR封闭液；
(2) 加Lin抗体免疫磁珠标记细胞
按照1×108/100ul细胞浓度加入耦合Lin抗体的免疫磁珠，标记细胞。充分混匀，2℃～
8℃孵育30分钟。按照1×108/5ml细胞浓度加入2%PBS清洗细胞，4℃500 rpm离心10分钟。小心吸除上清液后按照1×108/500ul细胞浓度加入2%PBS重悬细胞；所述的Lin抗体的免疫磁珠为Lineage Cell Depletion kit；
图2所示为CD133阳性分选前后细胞数量对比，图3所示为Lin阴性分选前后数量对比，图2、3说明等量的总单个核细胞，经CD133阳性分选较Lin阴性分选所得细胞数量显著减少，也即CD133阳性分选效率更高；
(3) 细胞过柱免疫磁珠分选获得Lin（-）细胞
将细胞悬液置于免疫磁珠分选仪上过柱，每1ml细胞悬液使用一个MS型号的分选柱，吸取PBS缓冲液500uL浸润分选柱，注入1ml细胞悬液，细胞悬液过柱后冲洗分选柱三次，每次加入1mlPBS，用15ml无菌管接取流出的细胞悬液，无菌管中细胞悬液即为Lin（-）细胞群。
确定细胞悬液中的细胞数量，以300 rpm离心10 分钟，弃去上清液。将细胞悬液分五组：空白对照组，CD133标记组，CD45标记组，Lin标记组，CD133/CD45/Lin标记组。每107个细胞加入100ul 缓冲液以及10ul荧光素标记的抗体原液，轻轻吹打充分混匀，避光置于冰上孵育10分钟。添加3mL2% FBS的 RPMI 1640培养基清洗每组样本，以300 rpm离心10分钟。用培养基重悬细胞、过滤，置于冰中保存、备用；
所述的荧光素标记的抗体原液为PerCP-Cy5.5-anti-CD45单克隆抗体、anti-Lin-FITC单克隆抗体和anti-CD133/2PE单克隆抗体；
(2) 微珠尺寸的确定
流式分选细胞样本之前，运行预先确定尺寸的微珠（以1、2、4、6、10和15μm标准直径的尺寸校准球体），吸取5种直径的微珠各200ul分别置于5个1.5ml的无菌EP管中，按顺序运行于流式细胞仪上，调整阈值使机器能够发现介于2-10μm的所有物体；
(3) 流式分选
选用标准的高纯度分选模式，将五组细胞按顺序运行于流式细胞仪上，分别记录CD133 (+)、Lin (-)、CD45 (-)细胞亚群在总细胞中所占比例，筛选并收集CD133 (+) Lin (-) CD45 (-)即VSELs细胞，分选时，不要用过快的分选速度，以便保证所分选的细胞较高的恢复能力和纯度；
将流式分选后得到的VSELs加到无饲养层细胞的培养板中，置于37℃、5% CO2的培养箱中，同时添加双抗（青-链霉素储存液），LIF、bFGF、SCF等细胞因子于RPMI 1640条件培养基进行培养；
所述的双抗（青-链霉素储存液）是指取青、链霉素各100万单位溶于100mLPBS缓冲液中制作而成。
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