一种分离鉴定血液中有核红细胞的方法技术领域本发明涉及血液分离鉴定检测技术领域，特别涉及一种分离鉴定血液中 有核红细胞的方法。背景技术血样品分离成为各种细胞组分，就需要相应地调节血样的处理/加工技 术。将全血样品分离成为其各种细胞组分的常规方法是用离心的方法。虽然 此种方法是有效的，但是需要花很大的劳动、效率相当低而且需要用人工来 控制血样中的细胞部分。有核红细胞的分离，是基因分析的开端，也是较为困难的步骤之一。现 如今各国学者们己经尝试了各种不同的方法来分离有核红细胞，但仍未找到直接、可靠、高效率的分离途径。在试图用化学药剂来进行血样中的细胞部分的此种分离时，由于种种原 因，结果始终是不能令人完全满意的。更准确地说，细胞种群在活体内或体 外的生活强度和生存性，均取决于保持一种与保存实际细胞结构和细胞中的 化学平衡一致的准确生理环境。细胞膜的渗透性和运送特性可控制细胞中的 化学平衡。生理环境的改变又可以诱发细胞膜的应答或改变。细胞膜应答在性质上是"防御性的"；也就是说，细胞膜的生理应答是适合于保持细胞中 的化学平衡，因此是延续和不间断细胞的生存性现在已充分认识到，细胞只 能在一定的限度范围内耐受此种理想生理环境的改变;而且，还认识到如果 超过此种限度，细胞就会遭到永久性的损伤。在本技术领域中还进一步认识 到，此种生理环境的改变（即，稀释介质的毒性-即使是用蒸馏水）可影响 细胞的溶血作用。目前获取有核红细胞的途径主要有两条:①直接获取。利用有核红细胞 表面抗原如CD71, GPA, CD36等作为标记，通过磁激活细胞分选法(magneticactivated sorting, MACS)或焚光激活细胞分选法(fluorescenceactivated cell sorting, FACS)技术获取有核红细胞，或利用血液中Y珠蛋白链作为标记， 通过免疫组织化学等方法直接识别后，显微操作获取。②间接获取。以显微 操作法最具代表性，先染色，从形态上识别，借助高倍显微操作捕获单个有 核红细胞，再应用于基因分析。直接获取法成本高，或特异性不强，易受污 染，或操作繁瑣，技术要求高，其可靠性、实用性受到置疑，难以推广应用。 间接获取法可有效避免污染，随着单细胞PCR技术的发展，该法被视为获 取有核红细胞较理想的途径。发明内容本发明所要解决的技术问题是：建立一种快速有效的分离鉴定血液中有 核红细胞的方法，便于显微操作，能够高效、准确地获取有核红细胞进行后 续的细胞鉴定及基因分析。为解决上述技术问题，本发明提供了一种分离鉴定血液中有核红细胞的 方法，包括以下步骤：(一） 配制试剂(1 )多聚赖氨酸工作液：多聚赖氨酸储备液与双蒸水1: 10充分混合， 气泡消失后备用；(2 ) PH 7,4含0.5%BSA的O.Olmol/L PBS:氯化钠6.5gNa2HP04.12H20 4gNaH2P04.2H20 0.35g加双蒸水800ml,调节PH值至7.4,双蒸水补至1000ml, 0.01 mol/LPBS,高压灭菌后，加入5gBSA，40。C保存；(3 )含KOH 200 mmol/L, DTT 50 mmol/L的碱性细胞裂解液： 400 mmol/L KOH 1 ml lmol/LDTT 100 ul 灭菌注射用水850ul，充分混合，0.22(im微孔过滤器过滤后分装, -2(TC保存备用；(二） 制备防脱胶玻片(1)载玻片的预处理将普通载玻片用热肥皂水洗刷，自来水清洁干净，烘干，置于硫酸清洁液中浸泡24小时以上，自来水冲洗过夜，双蒸水冲洗3遍，烘干，95°/0乙 醇浸泡24小时，双蒸水沖洗3遍，烤干，15磅高压灭菌20min ; (2)多聚赖氨酸包被载玻片 将预处理后的玻片在多聚赖氨酸工作液中上下浸蘸10〜20秒，分散架于 玻片架上，60 。C以下烘干，4。C保存备用；(三） 选择有核红细胞染色方法；(四) 显微操作法获取血液中有核红细胞。 所述步骤(三）可以进一步包括以下步骤： 单密度梯度离心法收集有核血细胞：① 血液与等量含0.5 %BSA的0.01 mmol/L PBS混匀，轻轻叠加于淋巴 细胞分离液上，使两者形成一个清晰的界面，1800r/min水平离心20min, 吸取白膜状的单个核细胞层，移至预先用PBS湿润的洁净玻璃离心管中；② 加入2倍以上0.5 %BSA的O.01mmol/L PBS洗涤细胞，1500r/min水 平离心10min，弃上清，重复三次；③ 用0.01 mmol/L PBS稀释细胞至适合浓度后涂片，自然干燥。 所述步骤(三）可以进一步包括以下步骤： 采用瑞氏-吉姆萨染色法对有核血细胞染色：① 玻片置于染片架上，滴加3〜5滴瑞氏-吉姆萨复合染色液，使其 迅速覆盖标本1 min ;② 滴加緩冲液5-10滴，吸耳球对准玻片吹气，使缓沖液与染液充 分混合，染色5-10min;③ 双蒸水冲洗，晾干。所述步骤(三)可以进一步包括以下步骤： 采用联苯胺染色法对有核血细胞染色：① 玻片置于1。/o联苯胺曱醇溶液中浸泡2min ;② 往溶液中滴加10~20滴30%H2O2，使其与1%联苯胺曱醇溶液 之容积比为1:50，混匀，玻片继续浸泡l-2min;③ 双蒸水充分冲洗，晾干； (D苏木素复染。

所述步骤(四)可以进一步包括以下步骤：① 制备好的玻片放置于倒置相差显微镜下，400倍光镜下观察识别有 核红细胞并进行计数；② 在有核红细胞周围滴加10~20ul的0.25Q/。蛋白酶K,使之从玻片-上松懈，用显微操作器单个吸取；③ 将吸取到的细胞移至盛有2.5ul碱性细胞裂解液的PCR专用薄壁反 应管中，离心后于-2(TC低温冰箱保存备冲企。所述方法可以进一步包括以下从外周血中分离出单个核细胞的步骤：(1) 血样2000r/min离心10min,用吸管吸出每管中80 %的血浆；(2) 而后加入PBS进行稀释，此液含有一整个白细胞群，包括粒细胞、 淋巴细胞、单核细胞和部分红细胞；(3) 取2ml淋巴细胞分层液于离心管内，同时用毛细吸管吸取约2ml的 细胞悬液轻轻加入分层液上；以水平转子离心机2000r/min，离心20min后， 可见分成多层，最下层是红细胞，中间层是分层液，最上层是血浆；在血浆 层与分层液之间是一薄层较致密的白色层，即为单个核细胞层；(4) 用毛细吸管插入到单个核细胞层，吸取该层，放入另一试管中；以 Hanks液洗涤、离心。所述方法可以进一步包括以下有核红细胞的分离纯化步骤：(1) 尼龙毛柱的制备：① 取尼龙毛用0.2mol/LHCl浸泡处理过夜；② 用双蒸水洗净HC1，置37。C烘干备用；③ 称取90〜120mg尼龙毛，均匀分散，置Hanks液中浸泡；④ 取lml注射器，出口接塑料管，夹住； (D将尼龙毛均匀填塞入注射器中，排净空气，柱高7〜8cm; ⑥将制各好的柱高压灭菌各用；(2) 尼龙毛分离有核红细胞：① 取分离的单个核细胞，用细胞培养液将细胞配成400个/ml ;② 融化尼龙毛柱，以每分钟18 ~ 20滴的速度放出Hanks液，预温至37 °C的细胞培养液洗涤尼龙毛柱；③ 将细胞悬液加入尼龙毛柱中，待细胞悬液全部进入尼龙毛柱后，立即

加0.2ml细胞培养液，夹住塑料管；在37。C的饱和水汽二氧化碳培养箱中 静置l小时；④ 用5ml预温至37。C的细胞培养液洗脱细胞，再用5ml预温至37 。C的 细胞培养液洗涤尼龙毛柱，洗净粘附的细胞；⑤ 加入2ml细胞培养液，夹住塑料管，将尼龙毛柱置冰箱中冷却；用4 。C预冷的细胞培养液分3~4次洗脱尼龙毛柱，每次2ml;先夹住塑料管， 用玻璃棒或金属丝反复挤压尼龙毛以利于粘附细胞脱落，然后再洗脱；©离心，1000rpm, IO分钟，去上清液，用细胞培养液洗涤细胞1次； 计数细胞，用细胞培养液将细胞重悬。所述方法可以进一 步包括以下有核红细胞的分离纯化步骤：1) 抗凝血剂以等体积的生理盐水稀释；2) 緩漫地加于Ficoll液面上，血液与Ficoll的界面保持清晰；3) 2000rpm,离心20min;4) 吸取云雾状的单个核细胞层；5) 1000rpm,离心15min;6) 弃去上清，洗涤沉淀；7) 1000rpm,离心15min;8) 重复三次第6)、 7)步；9) 弃上清，沉淀。所述方法中使用的仪器设备可以为以下设备： RPM工1640培养基：美国Gibc公司； 细胞分离液：上海华精生物高乖日支有限公司； 血凝素PHA:广州市医药工业研究所； P-III型倒置显微镜：日本Nikon公司； 24孔细胞培养板：美国Corning公司； C02培养箱：美国Forma scientific公司；DL-CJ-2N高性能无菌实验台：哈尔滨市东联电子技术开发有限公 司北京分公司；0412-1型微量低速离心机：上海手术器械厂。 所述方法中PBS溶液的配置方法可以为：NaCL18.8g, KC10.2g， Na2HP04 3.488g，加双蒸水至1000ml,调PH值 为7.4， 15磅高压灭菌，4。C保存。本发明分离鉴定血液中有核红细胞的方法能有效识别有核红细胞，40 例样本均能检出有核红细胞，检出率100%，每例发现有核红细胞2x 106~ 6xl(^个/ml。本发明联苯胺染色后有核红细胞易于识别，熟练的显微操作 能迅速获取单个有核红细胞，为应用单个有核红细胞进行基因分析打下良好 的前期基础。有核红细胞可应用于某些基因分析和筛查。实现显微操作法获 取单个有核红细胞进行基因分析，首先必须从血液中识别分离有核红细胞。本发明采用联苯胺染色法识别有核红细胞，借助显微操作将其从血液中分 离，为基因分析和筛查打下基础。附图说明图1为本发明实施例所述有核红细胞瑞氏-吉姆萨染色图； 图2为本发明实施例所述有核红细胞联苯胺染色图。具体实施务式(一) 主要试剂配制1. 多聚赖氨酸工作液：多聚赖氨酸储备液与双蒸水1: IO充分混合， 待气泡消失后备用；2. 含0.5%BSA的0.01mol/L PBS(PH 7,4 )氯化钠6.5g Na2HP04.12H20 4g NaH2P04.2H20 0.35g加双蒸水800ml,调节PH值至7.4,双蒸水补至1000ml即配 成。0.01 mol/LPBS，高压灭菌后，加入5gBSA， 40。C保存。3. 碱性细胞裂解液(含KOH 200 mmol/L, DTT 50 mmol/L )400 mmol/L KOH 1 ml lmol/LDTT 100 ul灭菌注射用水 850~900ul,充分混合，0.22pm微孔过滤器过 滤后分装，-2(TC保存备用。(二) 防脱胶玻片制备

l.载玻片的预处理将普通载玻片用热肥皂水洗刷，自来水清洁千净，烘干，置于疏酸清洁液中浸泡24小时以上，自来水沖洗过夜，双蒸水冲洗3遍，烘干，95% 乙醇浸泡24小时，双蒸水冲洗3遍，烤干，15磅高压灭菌20min. 2.多聚赖氨酸包被载玻片将预处理后的玻片在多聚赖氨酸工作液中上下浸蘸10~20秒，分散 架于玻片架上，60 。C以下烘干，4。C保存备用。 (三)有核红细胞染色方法的选择 从外周血中分离出单个核细胞：(1) 血样2000r/min离心10min,用吸管吸出每管中绝大部分血浆；(2) 而后加入PBS进行稀释，此液含有一整个白细胞群，包括粒细 胞、淋巴细胞、单核细胞和部分红细胞；(3) 取2ml淋巴细胞分层液于离心管内，同时用毛细吸管吸取约2ml 的细胞悬液轻轻加入分层液上。以水平转子离心机2000r/min,离心20min 后，可见分成多层，最下层是红细胞，中间层是分层液，最上层是血浆。在 血浆层与分层液之间是一薄层较致密的白色层，即为单个核细胞层；(4) 用毛细吸管插入到单个核细胞层，吸取该层，放入另一试管中； 以Hanks液洗涤、离心，最后配制成适当的细月包浓度。有核红细胞分离纯化： l)尼龙毛柱的制各：① 取尼龙毛用0.2mol/LHCl浸泡处理过夜；② 用双蒸水洗净HC1，置37。C烘干各用；③ 称取90〜120mg尼龙毛，均匀分散，置Hanks液中浸泡；④ 取lml注射器，出口接塑料管，夹住；⑤ 将尼龙毛均匀填塞入注射器中，排净空气，柱高约7〜8cm;⑥ 将制各好的柱高压灭菌各用； (2)尼龙毛分离有核红细胞：① 取分离的单个核细胞，用细胞培养液将细胞配成400个/ml ;② 融化尼龙毛柱，以每分钟18~20滴的速度放出Hanks液，预温至37

°c的细胞培养液洗涤尼龙毛柱。③ 将细胞悬液加入尼龙毛柱中，待细胞悬液全部进入尼龙毛柱后，立即加0.2ml细胞培养液，夹住塑料管；在37。C的饱和水汽二氧化碳培养箱中 静置1小时；④ 用5ml预温至37t:的细胞培养液洗脱细胞，再用5ml预温至37。C的 细胞培养液洗涤尼龙毛柱，洗净粘附的细胞。⑤ 加入2ml细胞培养液，夹住塑料管，将尼龙毛柱置水箱中冷却；用4 。C预冷的细胞培养液分3~4次洗脱尼龙毛柱，每次2ml。先夹住塑料管， 用玻璃棒或金属丝反复挤压尼龙毛以利于粘附细胞脱落，然后再洗脱；©离心，1000rpm， IO分钟，去上清液，用细胞培养液洗涤细胞1次； 计数细月包，用细月包培养液将细月包重悬； 仪器：1. RPM工1640培养基(干粉):美国Gibc公司2. 细胞分离液((Ficoll):上海华精生物高乖日支有限公司3. 血凝素PHA ( 1 0mg/支):广州市医药工业研究所4. P-III型倒置显微镜：日本Nikon公司5. 24孔细胞培养板:美国Corning公司6. C02培养箱：美国Forma scientific 7>司7. DL-CJ-2N高性能无菌实验台:哈尔滨市东联电子技术开发有限公 司北京分公司8. 0412-1型微量低速离心机:上海手术器械厂PBS溶液:NaCL 18.8g， KCl 0.2g， Na2HP04 3.488g,加双蒸水至1000ml, 调PH值为7.4, 15磅高压灭菌，4'C保存。用Ficoll密度梯度离心法分离血样中的有核红细胞，具体步骤如下： 1 )抗凝血剂以等体积的生理盐水稀释；2) 緩漫地加于Ficoll液面上，血液与Ficoll的界面保持清晰；3) 2000rpm，离心20min;4) 吸取云雾状的单个核细胞层；5) 1000rpm,离心15min;6) 弃去上清，洗涤沉淀； 7) 1000rpm,离心15min;8) 重复一次第6)、 7)步； 9)弃上清，沉淀。单密度梯度离心法收集有核血细胞：① 血液与等量含0.5 %BSA的0.01 mmol/L PBS混匀，轻轻叠加于淋巴 细胞分离液上，1吏两者形成一个清晰的界面，1800r/min水平离心20min, 吸取白膜状的单个核细胞层，移至预先用PBS湿润的洁净玻璃离心管中。② 加入2倍以上0.5 % BSA的0.01mmol/L PBS洗涤细胞，1500r/min水 平离心10min,弃上清。重复一次。③ 用0.01 mmol/L PBS稀释细胞至适合浓度后涂片，自然干燥。 有核血细月包染色方法：(1) 瑞氏-吉姆萨染色法① 玻片置于染片架上，滴加3~5滴瑞氏-吉姆萨复合染色液，使其 迅速覆盖标本，约1 min 。② 滴加緩冲液5〜10滴，吸耳球对准玻片吹气，使緩冲液与染液充 分混合，染色5〜10min。③ 双蒸水冲洗，晾干。(2) 联苯胺染色法① 玻片置于P/。联苯胺曱醇溶液中浸泡2min 。② 往溶液中滴加10~20滴30%H2O2,使其与1%联苯胺甲醇溶液 之容积比为1:50,混勾，玻片继续浸泡l~2min.③ 双蒸水充分沖洗，晾干。④ 苏木素复染。(四)显微操作法获耳又血液中有核红细胞①制备好的玻片放置于倒置相差显微镜下，400倍光镜下观察识别 有核红细胞并进行计数。② 在有核红细胞周围滴加10~20ul的0.25。/。蛋白酶K，使之从玻片 上松懈，用显微操作器单个吸取。③ 将吸取到的细胞移至盛有2.5 ul碱性细胞裂解液的PCR专用薄壁反 应管中，离心后于-2(TC低温冰箱保存备检。

结果：一、 有核红细胞的富集单密度梯度离心分离出的细胞含有90%以上的淋巴细胞，少量单核 细胞和有核红细胞等等。二、 有核红细胞染色如图l所示，为本发明实施例所述有核红细胞瑞氏-吉姆萨染色图。 其中，瑞氏-吉姆萨染色为IOOO倍光镜下有核红细胞胞质呈紫蓝色，胞核呈 深蓝色，400倍光镜下有时难以与其它细胞尤其是淋巴细胞区分开。如图2所示，为本发明实施例所述有核红细胞联苯胺染色图。其中， 有核红细胞联苯胺染色：光学显微镜下可见有核红细胞细胞质呈棕黄色，苏 木素复染后胞核呈蓝色，明显区分于其它细胞，识别效果优于瑞氏-吉姆萨 染色。有核红细胞4企出率：40例样本均能检出有核红细胞，检出率100 % ,每例发现有核红细胞2 ~ 6个/ml，共获取157个。外周血中单个核细胞主要包括淋巴细胞、有核红细胞和单核细胞，其体 积、形态和密度与其他细胞不同。红细胞和多核粒细胞密度较大，为1.090 左右，而单个核细胞密度为1.075 - 1.090,血小板为1.030~ 1.035。如果利 用一种密度介于1.075 ~ 1.092之间而近于等渗的溶液(分层液)做密度梯度离 心，就能将各种不同密度的血细胞进行分离。本发明的分离介质是密度为 1.077的淋巴细胞分离液，水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的 液体和细胞带，与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界 面中，呈白膜状。用本发明方法分离的细胞，单个核细胞纯度可达95%，细 胞获得率达80%以上。用显微操作法分离有核红细胞时，识别是一个关键步骤。现有技术中常 用瑞氏-吉姆萨染色识别有核红细胞，然而，使用现有技术的方法，有核红 细胞在富集过程中，经过了多次洗涤、离心，制片后细胞均有不同程度的变 形、皱缩，用上述染色在400倍光镜下不易辨认有核红细胞，分离难度大。 红细胞中的血红蛋白或正铁血红素具有过氧化物酶样的活性，能使过氧化氬

释放出新生态氧，将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。因 此，本发明采用联苯胺染色，将有核红细胞胞质染成棕黄色，再进行苏木素复染，使胞核着色成蓝色，400倍光镜下能清楚识别，结合熟练的显微操作 技术，即能迅速、准确地捕获单个有核红细胞。本发明检验方法检出率100%， 40例样本均能检出有核红细胞，检出率 100%,每例发现有核红细胞2x l06~6x 106个/ml，出现频率高。使用本发明方法分离鉴定血液中的有核红细胞，检测费用低，操作简单， 联苯胺染色一苏木素复染后有核红细胞在400倍光镜下识别效果优于瑞氏-吉姆萨染色，镜下能更快速搜捕到目的细胞，更便于后期显微操作法捕获有 核红细月包。使用本发明鉴定方法，联苯胺染色后显微操作法能高效、准确地识别并 获取单个有核红细胞，结合全基因组扩增技术，可应用于基因分析技术。