巨细胞病毒疫苗及其制备方法
阅读：1023发布：2021-01-16
专利汇可以提供巨细胞病毒疫苗及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 揭示通过选择繁殖巨细胞病毒的细胞型增加巨细胞病毒 疫苗 多样性的方法，和由所述方法所制备的巨细胞病毒在疫苗组合物研发中的用途。本发明还揭示包含从上皮细胞分离的CMV的疫苗组合物。，下面是巨细胞病毒疫苗及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种制备巨细胞病毒(CMV)疫苗的方法，所述巨细胞病毒疫苗包含减毒活CMV或灭活CMV，所述方法包含：
a)在成纤维细胞中传代CMV病毒株或分离株，
b)在上皮细胞中扩增所述CMV病毒株或分离株，从而制备细胞型条件性CMV；以及c)由所述细胞型条件性CMV制备CMV疫苗；其中所述细胞型条件性CMV的特征在于在随后感染的宿主细胞中的一个或一个以上包含以下的特征：
i)通过与宿主细胞质膜融合进入所述宿主细胞中；
ii)与从培养的成纤维细胞中分离的相同CMV群体相比，所述宿主细胞的由病毒粒子介导的细胞-细胞融合更多；
iii)与从培养的成纤维细胞中分离的相同CMV群体相比，所述宿主细胞中的病毒生长加速；
iv)引发细胞应答，其涉及与由从培养的成纤维细胞中分离的相同CMV群体在感染后
10小时所引发的应答相比，约三分之二以下的基因的表达改变大于或等于2.5倍；或v)引发细胞应答，其涉及一个或一个以上由以下基因库登录号表示的基因的表达改变：AK094860、NM_145023、NM_133492、NM_001039580、NM_001004301、NM_001034、AI369525、AK123066、NM_005345、NM_020731、BC071797、NM_003414、NM_000800、NM_138467、AK090803、AL133118、NM_001165、BG001037、NM_024861、NM_001043、NM_016239、NM_001018084、NM_001037442、NM_017600、NM_022097、NM_175868、NM_032266、NM_003841、NM_005039、NM_145051、NM_004294、AW856073、NM_024050、AF085968、NM_080927、NM_022115、AK056703、NM_000808、NM_012377、NM_006793、NM_031466、NM_005185、NM_139173、BX360933、NM_016125、NM_002104、NM_032188、NM_004185、NM_004843或NM_173550。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述CMV病毒株或分离株是人CMV病毒株或分离株。
3.根据权利要求1所述的方法，其还包含传代和扩增两种或两种以上CMV病毒株或分离株。
4.一种CMV疫苗，其由根据权利要求1所述的方法制备。
5.一种疫苗组合物，其包含与适合的药用载体或佐剂混合的包含减毒活CMV或灭活CMV的巨细胞病毒(CMV)群体或其病毒粒子组分，其中所述CMV群体在成纤维细胞中传代和在上皮细胞中扩增；
其中从上皮细胞中分离的CMV群体的特征在于在随后感染的宿主细胞中的一个或一个以上包含以下的特征：
i)通过与宿主细胞质膜融合进入所述宿主细胞中；
ii)与从培养的成纤维细胞中分离的相同CMV群体相比，所述宿主细胞的由病毒粒子介导的细胞-细胞融合更多；
iii)与从培养的成纤维细胞中分离的相同CMV群体相比，所述宿主细胞中的病毒生长加速；
iv)引发细胞应答，其涉及与由从培养的成纤维细胞中分离的相同CMV群体在感染后
10小时所引发的应答相比，约三分之二以下的基因的表达改变大于或等于2.5倍；或v)引发细胞应答，其涉及一个或一个以上由以下基因库登录号表示的基因的表达改变：AK094860、NM_145023、NM_133492、NM_001039580、NM_001004301、NM_001034、AI369525、AK123066、NM_005345、NM_020731、BC071797、NM_003414、NM_000800、NM_138467、AK090803、AL133118、NM_001165、BG001037、NM_024861、NM_001043、NM_016239、NM_001018084、NM_001037442、NM_017600、NM_022097、NM_175868、NM_032266、NM_003841、NM_005039、NM_145051、NM_004294、AW856073、NM_024050、AF085968、NM_080927、NM_022115、AK056703、NM_000808、NM_012377、NM_006793、NM_031466、NM_005185、NM_139173、BX360933、NM_016125、NM_002104、NM_032188、NM_004185、NM_004843或NM_173550。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中，所述CMV是人类CMV。
7.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中所述CMV群体包含两种或两种以上在上皮细胞培养物中扩增的CMV病毒株或临床分离株。
8.一种包含减毒活CMV或灭活CMV的巨细胞病毒(CMV)群体或其病毒粒子组分的应用，其用于制造使个体对CMV免疫的CMV疫苗组合物，其中CMV群体或其病毒粒子组分与适合的药用载体或佐剂混合，和其中所述CMV群体在成纤维细胞中传代和在上皮细胞中扩增；
其中从上皮细胞中分离的CMV群体的特征在于在随后感染的宿主细胞中的一个或一个以上包含以下的特征：
a)通过与宿主细胞质膜融合进入所述宿主细胞中；
b)与从培养的成纤维细胞中分离的相同CMV群体相比，所述宿主细胞的由病毒粒子介导的细胞-细胞融合更多；
c)与从培养的成纤维细胞中分离的相同CMV群体相比，所述宿主细胞中的病毒生长加速；
d)引发细胞应答，其涉及与由从培养的成纤维细胞中分离的相同CMV群体在感染后10小时所引发的应答相比，约三分之二以下的基因的表达改变大于或等于2.5倍；或e)引发细胞应答，其涉及一个或一个以上由以下基因库登录号表示的基因的表达改变：AK094860、NM_145023、NM_133492、NM_001039580、NM_001004301、NM_001034、AI369525、AK123066、NM_005345、NM_020731、BC071797、NM_003414、NM_000800、NM_138467、AK090803、AL133118、NM_001165、BG001037、NM_024861、NM_001043、NM_016239、NM_001018084、NM_001037442、NM_017600、NM_022097、NM_175868、NM_032266、NM_003841、NM_005039、NM_145051、NM_004294、AW856073、NM_024050、AF085968、NM_080927、NM_022115、AK056703、NM_000808、NM_012377、NM_006793、NM_031466、NM_005185、NM_139173、BX360933、NM_016125、NM_002104、NM_032188、NM_004185、NM_004843或NM_173550。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述个体是人。
巨细胞病毒疫苗及其制备方法
[0002] 根据35 U.S.C.§202(c)，承认美国政府可具有本发明的某些权利，本发明部分用美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)的批准号为CA85786、CA82396、AI54430及GM71508的基金完成。
技术领域
[0003] 本发明大体来说涉及疫苗研发领域。更具体来说，本发明涉及通过选择繁殖巨细胞病毒的细胞型增加巨细胞病毒疫苗多样性的方法，以及由这些方法制备的巨细胞病毒在疫苗组合物研发中的用途。
背景技术
[0004] 本说明书通篇引用各种公开案，包含专利、公开申请案、技术文献和学术文章。这些引用的公开案各以全文引用的方式并入本文中。本说明书最后列出说明书内以圆括号中的数字提及的完全引用或未完全引用的公开案。
[0005] 巨细胞病毒(CMV)是归为疱疹病毒科β亚科的成员的疱疹病毒。根据疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)，发现CMV感染颇为普遍地存在于人类群体中，据估算40-80％的美国成人群体受感染。这一病毒主要通过体液传播，且时常从怀孕母体传递给胎儿或新生儿。虽然CMV感染在大多数个体中是潜伏性的，但病毒激活(virus activation)会引发高烧、寒战、疲劳、头痛、恶心和脾肿大。
[0006] 虽然大多数人类CMV感染是无症状的，但免疫不成熟或免疫受损个体(诸如新生儿、HIV阳性患者、同种异体移植患者和癌症患者)的CMV感染尤其是个问题。这些个体的CMV感染除其它有害病况外还会引发危重症，包括肺炎、肝炎、脑炎、结肠炎、葡萄膜炎、视网膜炎、失明和神经病。另外，CMV是先天缺陷的主要原因。目前，尚无治愈或预防CMV感染的疫苗。
[0007] 疱疹病毒进入细胞是一个复杂的过程，从吸附和受体结合开始，接着是病毒包膜与细胞膜融合。融合发生在质膜或内体膜上。举例来说，EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)通过受体介导的胞吞作用进入初级B细胞(1，2)，又通过使病毒粒子包膜与质膜融合感染上皮细胞或转化的B细胞(1)。虽然单纯疱疹病毒与一些细胞型的质膜融合，但通过胞吞作用进入其他细胞型(3-6)。人巨细胞病毒(HCMV)活体内感染多种细胞型，包括上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞(7)。虽然其与成纤维细胞的质膜融合(8)，但通过胞吞作用进入视网膜色素上皮细胞和脐静脉内皮细胞(9，10)。
[0008] 疱疹病毒“选择”其进入途径的机理尚不清楚。虽然一般认为进入途径主要由宿主细胞决定，但病毒粒子糖蛋白的趋性角色(tropic role)优先(11)。EBV病毒粒子含有两种gH复合物，即gH/gL和gH/gL/gp42(12，13)，其具有互斥功能(11)。虽然与B细胞质膜融合由gH/gL/gp42介导(14-16)，但进入上皮细胞由gH/gL引发(11，12，17)。制备EBV的细胞型可改变EBV的趋性。B细胞衍生的EBV病毒粒子所含的gH-gL-gp42少于上皮细胞衍生的病毒粒子。因此，B细胞产生的病毒对上皮细胞更具感染性，而上皮细胞衍生的病毒具B细胞趋性的(18)。
[0009] HCMV还编码两种gH/gL复合物：gH/gL/gO和gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131(19，20)。含gO的复合物足以用于成纤维细胞感染，而含pUL128/pUL130/pUL131的复合物为感染内皮细胞和上皮细胞所需(19-21)。AD169实验室病毒株在其病毒粒子中仅含有gH/gL/gO复合物(19)。第二种gH/gL复合物的缺乏造成HCMV实验室病毒株的上皮细胞和内皮细胞趋性丧失(19-22)。
[0010] 需要CMV疫苗变种和CMV疫苗多样性，且需要控制病毒传播和激活、尤其免疫受损个体和孕妇的病毒传播和激活的有效方法。本发明解决这一需要。
发明内容
[0011] 本发明的一个方面提供一种制备巨细胞病毒(CMV)疫苗的方法。这一方法包含在选定细胞型的培养细胞中繁殖CMV病毒株或分离株，从而制备细胞型条件性CMV，和由所述细胞型条件性CMV制备CMV疫苗。在某些实施例中，CMV病毒株或分离株是人CMV(HCMV)病毒株或分离株。有多种多样的细胞型适用于这一方法，包括(但不限于)：上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、神经元细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、树突状细胞和基质细胞。在一个具体实施例中，选定的细胞型是上皮细胞。
[0012] 上述方法可进一步包含在两种或两种以上不同的选定细胞型中制备细胞型条件性CMV和合并这些CMV来制备CMV疫苗。可选地或另外地，这一方法包含提供两种或两种以上CMV病毒株或分离株，使这些病毒株或分离株的每一株在包含选定细胞型或两种或两种以上不同的选定细胞型的培养细胞中生长和合并由此制备的所有CMV来制备CMV疫苗。
[0013] 在某些实施例中，这一方法包含制备减毒活CMV疫苗。在另一实施例中，其包含制备灭活或死CMV疫苗。在其它实施例中，其包含制备包含一种或一种以上减毒活病毒、灭活病毒和其它免疫原性组分(例如免疫原性CMV蛋白和肽)等的组合疫苗。
[0014] 由上述方法制备的CMV疫苗也属于本发明的范畴。
[0015] 本发明的另一方面提供一种实施本发明方法的试剂盒。这些试剂盒通常包括内部含有一种或一种以上CMV病毒株或临床分离株、一种或一种以上选定细胞型的培养细胞的包装，以及关于使用培养细胞和CMV病毒株或分离株制备用于CMV疫苗的细胞型条件性CMV的说明书。
[0016] 本发明的另一方面提供一种疫苗组合物，其包含与适合的药用载体或佐剂混合的巨细胞病毒(CMV)群体或其病毒粒子组分，其中所述CMV群体从选定细胞型的培养细胞中分离。在一个实施例中，选定的细胞型是上皮细胞。在一个实施例中，疫苗组合物包含人巨细胞病毒(HCMV)。
[0017] 在疫苗组合物的各个实施例中，从上皮细胞培养物中分离的CMV群体的特征在于在随后感染的宿主细胞中的一个或一个以上特征，包括(但不限于)：(a)通过与宿主细胞质膜融合进入宿主细胞中；(b)与从培养的成纤维细胞中分离的相同CMV群体相比，宿主细胞的由病毒粒子介导的细胞-细胞融合更多；(c)与从培养的成纤维细胞中分离的相同CMV群体相比，宿主细胞中的病毒生长加速；(d)引发细胞应答，包括与由从培养的成纤维细胞中分离的相同CMV群体在感染后10小时所引发的应答相比，约三分之二以下的基因的表达改变大于或等于2.5倍；或(e)引发细胞应答，包括如本文中表2和表4中所示的一个或一个以上基因的表达发生变化，所述基因由以下基因库登录号(GenBank Accession Nos)表示：AK094860、NM_145023、NM_133492、NM_001039580、NM_001004301、NM_001034、AI369525、AK123066、NM_005345、NM_020731、BC071797、NM_003414、NM_000800、NM_138467、AK090803、AL133118、NM_001165、BG001037、NM_024861、NM_001043、NM_016239、NM_001018084、NM_001037442、NM_017600、NM_022097、NM_175868、NM_032266、NM_003841、NM_005039、NM_145051、NM_004294、AW856073、NM_024050、AF085968、NM_080927、NM_022115、AK056703、NM_000808、NM_012377、NM_006793、NM_031466、NM_005185、NM_139173、BX360933、NM_016125、NM_002104、NM_032188、NM_004185、NM_004843或NM_173550。
[0018] 在某些实施例中，疫苗组合物包含从两种或两种以上不同的选定细胞型的细胞培养物中分离的CMV群体或其病毒粒子组分。举例来说，CMV群体可从上皮细胞和另一细胞型(诸如成纤维细胞型)的细胞中分离。在其它实施例中，CMV群体包含两种或两种以上在选定细胞型中生长的CMV病毒株或临床分离株。某些实施例可包含多种在多种不同细胞型的细胞培养物中生长的CMV病毒株或临床分离株。
[0019] 在一个实施例中，疫苗组合物包含减毒活CMV疫苗。在另一实施例中，其包含灭活CMV疫苗。在其它实施例中，疫苗组合物可为包含减毒活病毒或其组分、灭活病毒或其组分和/或其它免疫原性CMV肽或蛋白中的一种或一种以上病毒株的组合疫苗。
[0020] 本发明的另一方面提供一种使个体对CMV免疫的方法，其包含向个体给药由上述方法制备和/或包含上述特征的CMV疫苗组合物。在一个实施例中，待免疫的个体是人类。
附图说明
[0022] 图1 HCMV IE1于ARPE-19细胞中表达的动力学。(A)在指定时间时固定感染细胞(每个细胞0.1pfu)，且对IE1(彩色照片中为绿色，黑白照片中为浅灰色)、Sp100(彩色照片中为红色，黑白照片中为极深的灰色)和DNA(彩色照片中为蓝色，黑白照片中为深灰色)进行染色。(B)在感染(每个细胞0.1pfu)后各时间点，定量表达IE1的细胞的百分比；结果显示于图中。
[0023] 图2HCMV进入ARPE-19细胞的电子显微镜分析。在4℃下使epiBADrUL131或fibroBADrUL131粒子(每个细胞50pfu)与细胞结合，随后在37℃下内化15分钟。呈示代表性图像。
[0024] 图3内体酸化抑制剂和病毒粒子源对HCMV进入ARPE-19细胞的作用。一式三份进行实验，且相对于未处理培养物，记录经药物处理的培养物中阳性细胞的数目。(A)用NH4Cl或BFA预处理细胞1小时，接种epiBADrUL131或fibroBADrUL131(每个细胞1pfu)，且16小时后对IE1进行染色。(B)用50mM NH4Cl或40nM BFA预处理细胞1小时，随后接种指定细胞型中所制备的BADrUL131(每个细胞0.1pfu)或FIXwt(每个细胞0.01pfu)，且16小时后对IE1进行染色。
[0025] 图4由上皮细胞衍生的病毒诱导的从ARPE-19细胞外部的融合。(A)给细胞接种epiBADrUL131或fibroBADrUL131(每个细胞20pfu)，随后维持在含200μg/ml PFA的培养基中。感染后16小时，获取相衬图像(Phase contrastimage)。(B)在4℃下用epiBADrUL131或fibroBADrUL131(每个细胞20pfu)感染报告分子(reporter)与效应细胞(effector cell)的混合物1小时。随后使培养物转变到37℃历时6小时，此后测量相对荧光素酶活性。
[0026] 图5pUL130特异性中和抗体对HCMV感染和进入的作用。(A)与各种浓度的抗pUL130一起培育上皮细胞或成纤维细胞衍生的病毒，且测定残余感染性。(B)用最终浓度为20μg/ml的抗pUL130或用PBS预处理上皮细胞或成纤维细胞衍生的病毒粒子，随后在4℃下吸附于ARPE-19细胞1小时。用冷PBS洗涤细胞两次，且提取与细胞相关的病毒DNA测定附着于细胞的粒子的相对数目。或者，使细胞转变到37℃历时2小时以使病毒进入。
利用EDTA-胰蛋白酶处理移除未穿透细胞的病毒粒子。接着利用实时PCR定量内化的病毒DNA。
利用EDTA-胰蛋白酶处理移除未穿透细胞的病毒粒子。接着利用实时PCR定量内化的病毒DNA。
[0027] 图6上皮细胞中所制备的HCMV相对于成纤维细胞中所制备的HCMV对ARPE-19转录组(transcriptome)的调节。(A)文氏图(Venn diagram)描绘相对于模拟感染，经epiBADrUL131或fibroBADrUL131(每个细胞3pfui)感染后6小时或10小时，分化调控基因的分布。(B)实时RT PCR测定的相对RNA水平的变化。所测试的基因是羟甲基胆素合成酶(HMBS，NM_000190)、与发病机理相关的GLI 1(胶质瘤)(GliPR，NM_006851)、由IL-1β快速诱导的与穿透素(pentraxin)相关的基因(PTX3，NM_002852)、2′-5′-寡腺苷酸合成酶3(OAS3，NM_006187)、干扰素诱导的蛋白44(IFI44，NM_006417)、v-rel网状内皮组织增殖病毒致癌基因同系物B B细胞中κ轻链多肽基因强化子的核因子3(relB，NM_006509)和ATP结合盒子族C(CFTR/MRP)成员3(MRP3，NM_003786)。
具体实施方式
[0028] 本说明书和权利要求书通篇使用与本发明方法和其它方面有关的各种术语。除非另作定义，否则本文中所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。虽然任何与本文所述的方法和材料类似或相同的方法和材料都可用于测试本发明的实践中，但本文描述优选材料和方法。在描述和主张本发明时，将使用以下术语。应理解，本文中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的且不打算限制本发明。
[0029] 定义：
[0030] 如本说明书和随附权利要求书中所使用，除非另外明确说明，否则单数形式“一(a，an)”和“所述(the)”包括多个指示物。因此，例如提及“一个细胞”包含两个或两个以上细胞的组合等。
[0031] 如本文所使用的“约”当提及诸如量、持续时间(temporal duration)等可测量值时，打算涵盖距指定值±20％或±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％且更优选±0.1％的变动，因为这些变动适于进行所揭示的方法。
[0032] 术语“扩增”、“繁殖”和“生长”在本文中可互换使用，是指根据病毒学家和医学生物学家熟知的方法在允许病毒在细胞内复制和增殖的条件下向培养细胞中引入病毒或用病毒感染细胞的一般方法。具体来说，这些术语在本文中用于指本发明方法中CMV通过在选定细胞型上繁殖而“条件化”的步骤，该步骤之后为使用条件性CMV制备疫苗。
[0034] “细胞培养物”一般指取自活生物体且在控制条件下(“在培养物中”或“培养”)生长的细胞。“原代细胞培养物”是在第一继代培养之前直接取自生物体的细胞、组织或器官的培养物。“细胞系”是由原代细胞培养物的一次或一次以上继代培养所形成的细胞群体。
[0035] 基因的“编码区”由基因的编码链的核苷酸残基和基因的非编码链的核苷酸组成，所述链各别与基因转录所制备的mRNA分子的编码区同源或互补。
[0036] mRNA分子的“编码区”也由mRNA分子的核苷酸残基组成，这些残基在mRNA分子翻译期间与转移RNA分子的反密码子区匹配或编码终止密码子。因此，编码区可包括对应于不存在于mRNA分子编码的成熟蛋白质中的氨基酸残基(例如蛋白质输出信号序列中的氨基酸残基)的核苷酸残基。
[0037] 术 语“条 件 性 病 毒 (conditioned virus)”、“细 胞 型 条 件 性 病 毒(celltype-conditioned virus)”、“条件性CMV(conditioned CMV)”或“细胞型条件性CMV(cell type-conditioned CMV)”是指根据本文所述的方法在用于制备疫苗之前已在选定细胞型中繁殖的CMV。这些术语打算类似于术语“条件性培养基”，描述已生长特定细胞型或细胞系随后移出且含有细胞制备的组分或因子，从而改变培养基的功能的培养基。出于本申请案的目的，术语“条件性病毒(conditioned virus)”类似地指已在选定细胞型中生长，随后从这些细胞中移出的病毒，其中病毒此后展现一种或一种以上因在这种细胞型中生长而产生的改变的功能特征。
[0038] “编码”是指诸如基因、cDNA或mRNA的多核苷酸中的核苷酸的特定序列用作生物过程中合成具有确定序列的核苷酸(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定序列的氨基酸的其它聚合物和大分子的模板的固有性质和由此产生的生物性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中制备蛋白质，那么这一基因编码蛋白质。核苷酸序列与mRNA序列一致且通常提供于序列表中的编码链与用作基因或cDNA转录模板的非编码链可称作编码这一基因或cDNA的蛋白质或其它产物。除非另作说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
[0039] “有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，且指如本文所述有效实现特定生物结果的化合物、调配物、物质或组合物的量。这些结果可包括(但不限于)如任何适于所属领域的方法所确定的对病毒感染的抑制。
[0040] 如本文所使用的“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统或生物体、细胞、组织或系统内部所制备的任何物质。“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或在生物体、细胞、组织或系统外部所制备的任何物质。
[0041] 如本文所使用的术语“表达”定义为在启动子驱动下转录和/或翻译特定核苷酸序列。
[0042] 如本文所使用的“免疫”或“疫苗接种”在本文中可互换使用且意指预防性或治疗性免疫或疫苗接种。“治疗性疫苗接种”意思是给CMV感染患者接种疫苗。
[0043] “分离”意思是从自然状态变更或移出。举例来说，天然存在于活的动物中的核酸或肽不是“分离”的，而部分或完全与其自然状态的共存物质分离的相同核酸或肽是“分离”的。分离的核酸或蛋白质可以实质上纯的形式存在，或可存在于非原生环境(诸如宿主细胞)中。除非本文另外特别说明，否则形成本发明标的物的蛋白质、病毒粒子复合物、抗体和其它生物分子都是分离的或可被分离。
[0044] 术语“患者”、“个体”等在本文中可互换使用，且指任何可被CMV感染的动物或其活体外或原位细胞。在某些非限制性实施例中，患者或个体是人类。
[0045] 免疫原性或疫苗组合物的“肠外”给药包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。
[0046] 如本文所使用的术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所使用的核酸与多核苷酸可互换。所属领域的技术人员一般认为核酸是多核苷酸，其可水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可水解成核苷。如本文所使用的多核苷酸包括(但不限于)由所属领域中可利用的任何方法获得的所有核酸序列，所述方法包括(但不限于)重组方法(即使用普通克隆和扩增技术等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列)和合成方法。
[0047] 如本文所使用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，且指包含经肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，且对蛋白质或肽序列可包含的氨基酸的最大数目无限制。多肽包括包含两个或两个以上经肽键相互连接的氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所使用，这一术语是指短链(在所属领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚物)与长链(在所属领域中一般称为蛋白质，其有许多类型)。“多肽”尤其包括例如生物活性片段、实质上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽变异体、经修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
[0048] “医药学上可接受”是指就组合物、调配物、稳定性、患者接受性和生物可用性来说，从药理学/毒理学角度患者可接受且从物理/化学角度医药制备化学家可接受的性质和/或物质。“医药学上可接受的载体”是指不干扰活性成分的生物活性效果且对给药所述载体的宿主无毒的介质。
[0049] 术语“单个包装”意思是试剂盒的组分在实体上位于一个或一个以上容器中或与所述容器相关且视为一个制备、分配、销售或使用单元。容器包括(但不限于)袋、盒、瓶、热缩包装(shrink wrap package)、主要或附加组件或其组合。“单个包装”还可包括虚拟组件。举例来说，试剂盒可含有实体包装内部所含的简化的实体说明书和从例如网站等虚拟环境获取更详细说明书的说明书。
[0050] 如本文所使用的术语“治疗性”意思是治疗和/或预防。通过消除、延迟、抑制、缓解或根除与CMV感染相关的疾病状态获得治疗性作用。
[0051] 如本发明上下文所使用的术语“治疗”打算包括对疾病或病症的治疗性治疗和预防或抑制措施。因此，例如术语治疗包括在疾病或病症发作之前或之后给药药剂，从而预防或消除疾病或病症的所有病征。另一实例为，在疾病临床表现之后给药药剂以对抗疾病症状包含“治疗”疾病。此包括例如预防CMV繁殖到生物体的未感染细胞中。短语“减弱CMV感染”在本文中有时用于指包括如临床医师熟知的方法所确定降低感染CMV的患者的感染程度的治疗方法。
[0052] 描述：
[0053] 巨细胞病毒(CMV)活体内感染多种细胞型，包括上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞。如以上背景材料中所概述，各种研究已报导虽然病毒与成纤维细胞质膜融合，但通过胞吞作用进入视网膜色素上皮细胞和脐静脉内皮细胞。由于与上皮细胞或内皮细胞培养物相比，在培养的成纤维细胞中繁殖CMV相对容易，因此诸如上述研究等研究已使用成纤维细胞繁殖的CMV病毒株执行。同样，培养的成纤维细胞通常是繁殖CMV用于临床应用(诸如研发用于疫苗的减毒病毒株)的所选细胞型。
[0054] 根据本发明现已证明，制备CMV粒子的细胞型对CMV粒子在后续一系列感染中的特性具有重大影响。因此，例如当迄今报导CMV通过胞吞作用进入上皮细胞时，本发明发明者已证明这是在成纤维细胞中繁殖的CMV的进入方式，而不是在培养上皮细胞中繁殖的CMV的进入方式。上皮细胞繁殖的CMV主要通过与质膜融合进入上皮细胞。这种不同的进入方式产生多种生理学结果：影响感染继续进行的动力学且显著影响对感染的细胞应答。举例来说，与经在成纤维细胞中生长的病毒感染的细胞相比，在上皮细胞中生长的病毒引起显著减弱的细胞应答。许多在经成纤维细胞中生长的病毒感染之后表达的细胞抗病毒基因在经上皮细胞中生长的病毒感染之后不表达。因此，预测在上皮细胞中生长的CMV与疫苗和在成纤维细胞中生长的CMV的作用方式不同，从而为CMV疫苗的产生提供一种新颖且出乎意料多样性来源。同样，在CMV能够感染的诸如内皮细胞或特殊细胞型等其它细胞型(例如神经元、中枢或周围神经系统的其它细胞、平滑肌细胞、肝细胞、基质细胞、巨噬细胞或树突状细胞)中繁殖CMV应为CMV疫苗的产生提供其它新颖的多样性来源。
[0055] 因此，本发明的一个方面提供利用与选择繁殖病毒的细胞型相关的变化性制备CMV疫苗的方法。另一方面提供实施上述方法的试剂盒。本发明的另一方面提供预防或治疗CMV感染的疫苗组合物和使用这些组合物使个体免疫的方法。下文阐述本发明这些方面的各种实施例。
[0056] 制备CMV疫苗的方法：
[0057] 根据本发明的一个方面的方法包含(1)提供CMV病毒株或分离株；(2)在选定细胞型的细胞培养物中繁殖病毒株或分离株；和(3)收集通过在这一细胞型中生长所制备的CMV病毒粒子(本文中称为“细胞型条件性CMV”以用于制备CMV疫苗。
[0058] 在CMV用于疫苗研发之前经选择用于繁殖CMV的细胞型可以是制备一定产量病毒粒子的容许CMV感染的任何细胞系。病毒粒子在一些测定中可能具高感染性，或粒子在许多测定中可能展现有限的感染性或无感染性。适合的细胞型包括(但不限于)(1)上皮细胞系，诸如本文中举例说明的ARPE-19和其它视网膜色素上皮细胞系(例如上皮细胞系K-1034)(Ando，Y.等人，1997，Arch.Virol.142(8)：1645-1658)、源自正常人类结肠粘膜的HCMC(Smith，JD，1986，J Virol.60(2)：583-588)、Caco-2肠上皮细胞(Esclatine.A.等人，2000，J.ofVirol.74(1)：513-51)、SW480、HCT116、HeLa、H1299和MCF-7(关于后五者，参考Wang.D.和T.Shenk，2005.J.Virol.79：10330)；(2)内皮细胞系，诸如HMEC-1，一种人类微血管内皮细胞系，SV-40病毒大T抗原使之永生化(Guetta.E.等人，2001.Cardiovascular Research 50：538-546)、HUVEC和LMVEC(关于后两者，参见Wang.D.和T.Shenk.2005，J.Virol.79：10330)；(3)神经元细胞，诸如SK-N-SH、SK-N-AS和IMR-32(参见Wang，D.和T.Shenk，2005.J.Virol.79：10330)和源自多种组织/器官源的初级上皮、内皮、平滑肌、巨噬细胞和树突状细胞。
[0059] 能够研发成疫苗的任何CMV或CMV的组合都适于用作这一方法的CMV源，只要其可在至少一种选定细胞型中生长。在一个实施例中，CMV是人CMV(HCMV)，为先前已分离且特性化的分离株或新颖的HCMV分离株或HCMV样病毒。在另一个实施例中，CMV起源于另一种灵长类动物，包括(但不限于)黑猩猩(Davison.AJ等人，2003，J.Gen.Virol.84：17-28)和猕猴(Hansen.SG等人，2003.J.Virol.77：6620-36；Rivailler.P等人，2006.J.Virol.80：4179-82)。CMV可以是来自选定来源的未经修饰的病毒，或其可以是通过遗传修饰或合并来自两个或两个以上不同CMV病毒株或分离株的成分制备的嵌合病毒。
[0060] 所属领域中已知制备嵌合病毒的方法。为此目的，克隆至少6种人类CMV病毒株作为感染性细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)并测序(Murphy.E等人，2003.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：14976-14981)。BAC序列可由以下基因库登录号获得：AC146999(实验室病毒株AD 169，由其制备本文所述的BADrUL131变异体)；AC146851(实验室病毒株Towne)；AC146904(临床分离株PH)；AC146905(临床样分离株Toledo)；AC146906(临床分离株TR)；和AC146907(临床分离株FIX)。未进行先前BAC克隆，已测序至少两种人类CMV病毒株，且其可由以下基因库登录号获得：BK000394(实验室病毒株AD169)和AY446894(临床分离株Merlin)。黑猩猩CMV病毒株的整个基因组可以基因库登录号AF480884获得。也可获得两种猕猴CMV病毒株的基因组序列(登录号AY186194和DQ205516)。利用本申请案的教示，所属领域的技术人员将能够使用任何前述序列或任何其它公开可用的CMV序列来制备嵌合CMV或对CMV进行遗传修饰。
[0061] 根据本发明已证明，可通过在选定细胞型上繁殖成功条件化已在成纤维细胞中重复传代的CMV实验室病毒株。举例来说，如本文实例中所述，通过电穿孔将BADrUL131(一种重复传代的AD169 HCMV病毒株的UL131 ORF已修复的BAC克隆)引入培养人类包皮成纤维细胞中，且在上皮细胞系ARPE-19中扩增所得病毒制剂一次。因此，本发明的各种实施例包含使用已在不同于选择用于条件化步骤的细胞型的细胞型中传代的CMV(或CMV基因组)。举例来说，可使CMV病毒株在成纤维细胞中传代多次，随后在上皮细胞中扩增，此后用于制备疫苗。应了解，CMV可在选定的细胞型中扩增/繁殖一次或一次以上。
[0062] 在优选实施例中，本发明方法用于制备减毒活CMV以用作疫苗。所属领域中已知使病毒减毒的方法。减毒CMV优选展现减弱的包括潜伏和激活的感染性和/或病原性，但仍能够诱导治疗或保护宿主抵抗CMV感染的免疫应答。减毒CMV病毒株的实例包括(但不限于)实验室病毒株，诸如AD169和Towne，其几乎仅在成纤维细胞中复制。这些减毒病毒株，必要时经工程改造以制备必需的表面蛋白质或蛋白质复合物以获得适当的趋性，其可如以上所讨论，在上皮细胞中，或在成纤维细胞中生长此后在上皮细胞中生长，以用于本发明的疫苗组合物中。
[0063] 可使用在培养细胞、尤其成纤维细胞中连续传代使CMV减毒。活体外进行病毒感染宿主细胞的重复传代直到充分使病毒减毒。传代可在诸如调节的温度、pH值、湿度等特定环境条件下进行以选择感染性或病原性降低的病毒。如果使用这种减毒方法，那么随后在选定的细胞型中扩增连续传代的病毒一代或一代以上以制备CMV供本发明疫苗组合物使用。
[0064] 也可利用诱变使病毒减毒。举例来说，根据所属领域中已知的技术，可将CMV病毒粒子暴露于紫外线或电离辐射或化学诱变剂中。除用于制备嵌合病毒外，重组技术还可用于制备减毒的CMV病毒粒子。举例来说，可使用定点诱变、基因置换或基因剔除技术来获得感染性、病原性或潜伏性减弱的病毒株。WO/2007/038316中阐述通过剔除诱变修饰CMV的实例，其描述基因组缺失一个或一个以上潜伏促进基因的CMV，显现改变的进入或维持潜伏状态的能力。
[0065] 在其它实施例中，灭活或杀死从选定的细胞培养物中分离的CMV且用于疫苗组合物中。所属领域中熟知灭活或杀死病毒的方法，例如用诸如福尔马林(formalin)等化学品灭活或杀死病毒。所属领域的技术人员应了解，杀死或灭活的CMV应包含病毒粒子的所有或大部分组分，如此在疫苗组合物中维持通过在选定细胞型中扩增所产生的多样性。
[0066] 可使用本发明方法产生在不同选定细胞型中繁殖的CMV的组合，从而赋予所制备的疫苗另一层面的多样性。在一个实施例中，使用单个CMV分离株或病毒株感染两个或两个以上不同类型的不同培养细胞系，例如视网膜上皮细胞和内皮细胞。随后合并通过在各别细胞型中扩增所制备的CMV而用于单个疫苗中。在另一个实施例中，使用两个或两个以上不同CMV临床分离株或病毒株感染单个选定的细胞系，且使用通过扩增在这一细胞型中制备的多病毒株或多分离株CMV群体制备疫苗。在又一个实施例中，使用多个分离株或病毒株感染两个或两个以上不同类型的不同培养细胞系，且合并通过在各别细胞型中扩增制备的CMV群体而用于疫苗中。
[0067] 本发明的另一方面提供根据上述方法制备CMV疫苗物质的试剂盒。视使用和试剂盒组分而定，试剂盒在单个包装的各别容器或虚拟包装的各别容器中包含一种或一种以上选定细胞型的细胞系的等分试样和一个或一个以上CMV分离株或病毒株或待引入选定培养细胞系中并在所述细胞系中扩增的携带这些CMV病毒株的基因组的载体。这些试剂盒通常还含有说明书或说明书链接以说明如何进行这一方法的各个步骤。试剂盒任选地还可包含培养基和其它适于进行细胞培养和病毒操作的试剂。
[0068] 疫苗组合物和使用方法：
[0069] 本发明的另一方面提供免疫原性组合物(本文可互换称为疫苗组合物)，其包含与适合的药用载体或佐剂混合的巨细胞病毒(CMV)群体或其病毒粒子组分，其中CMV通过在例如上皮细胞培养物等选定细胞型中繁殖获得。如上所提及，CMV疫苗迄今通常使用在成纤维细胞中繁殖的CMV制得。然而，根据本发明已证明，在上皮细胞中繁殖产生的病毒在许多不同方面与成纤维细胞中繁殖的病毒不同。上皮细胞中所制备的病毒优先与质膜融合，而成纤维细胞衍生的病毒主要通过受体介导的胞吞作用进入。另外，上皮细胞产生的病毒粒子的内在“从外部融合”活性高于成纤维细胞中产生的粒子，此影响感染的动力学。此外，受感染上皮细胞的转录概况的显著不同的差异提供证据表明，这两种病毒制剂引发不同细胞信号传导反应。
[0070] 具体来说，在上皮细胞中繁殖制备的CMV与通过在成纤维细胞中繁殖而制备的所述病毒的相同病毒株或分离株相比具有一个或一个以上以下特征。第一，如上所提及，不同之处可在于其通过与宿主细胞质膜融合进入宿主细胞。上皮细胞上所制备的CMV还显示，与从培养的成纤维细胞分离的相同CMV群体相比，宿主细胞的病毒粒子介导的细胞-细胞融合较多，以及与从培养的成纤维细胞分离的相同CMV群体相比，宿主细胞中的病毒生长加速。另外，与在成纤维细胞中繁殖的相同CMV相比，其引发的细胞应答减弱。感染后10小时，约三分之二以下的基因(约50个基因对约150个基因)展现2.5倍或2.5倍以上的表达水平变化。另外，上皮细胞中生长的CMV的特性可在于宿主基因的特定概况，所述基因在感染后表达发生变化(增加或减小)。实例中详细描述这些基因表达概况，且可包括一个或一个以上由以下基因库登录号表示的基因的表达改变：AK094860、NM_145023、NM_133492、NM_001039580、NM_001004301、NM_001034、AI369525、AK123066、NM_005345、NM_020731、BC071797、NM_003414、NM_000800、NM_138467、AK090803、AL133118、NM_001165、BG001037、NM_024861、NM_001043、NM_016239、NM_001018084、NM_001037442、NM_017600、NM_022097、NM_175868、NM_032266、NM_003841、NM_005039、NM_145051、NM_004294、AW856073、NM_024050、AF085968、NM_080927、NM_022115、AK056703、NM_000808、NM_012377、NM_006793、NM_031466、NM_005185、NM_139173、BX360933、NM_016125、NM_002104、NM_032188、NM_004185、NM_004843或NM_173550。
[0071] 在本发明的这一方面，如在本发明的上述方面，能够研发成疫苗的CMV或CMV的组合都适于用作上述CMV群体来源，只要其可在至少一种上皮细胞系中或另一选定细胞型中生长。在一个实施例中，CMV是HCMV或HCMV样病毒。在另一个实施例中，如上所述，CMV起源于另一种灵长类动物，包括(但不限于)黑猩猩和猕猴。如上所述，CMV可以是来自选定来源的未经修饰的病毒，或其可以是通过遗传修饰或合并来自两个或两个以上不同CMV病毒株或分离株的成分制备的嵌合病毒。
[0072] 在优选实施例中，疫苗组合物包含减毒活CMV，所述减毒活CMV可利用上述方法制备，所有上述方法都为所属领域的技术人员所熟知。在其它实施例中，灭活或杀死从选定的细胞培养物中分离的CMV且用于疫苗组合物中。
[0073] 疫苗组合物可包含不同CMV病毒株或分离株的组合以便再产生多样性，所述CMV病毒株或分离株可在单个上皮细胞培养物上繁殖或在若干不同上皮细胞培养物上繁殖或在另一细胞型的细胞上繁殖。此外，可合并减毒活CMV与死或灭活CMV或CMV的免疫原性组分以制备组合疫苗，例如合并减毒活CMV与热杀死的CMV，或合并减毒活CMV与亚单位疫苗用物质，或合并所有三种类型的物质。标题为“Cytomegalovirus Surface Protein Complex for Use inVaccines and as a Drug Target(用于疫苗和作为药物靶的用途的巨细胞病毒表面蛋白复合物)”的WO 2007/146024中描述适于亚单位疫苗的免疫原性CMV多肽和复合物的实例。
[0074] 疫苗组合物可进一步包含一种或一种以上佐剂。佐剂可以是增强对疫苗中的抗原的免疫应答的任何物质。适用于本发明的佐剂的非限制性实例包括弗氏佐剂(Freund′s adjuvant)；不完全弗氏佐剂(incomplete Freund′s adjuvant)；皂甙；表面活性剂，诸如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂(lysolecithin)、脱甲基二-十八基溴化铵、N，N-二-十八基-N′-N-双(2-羟乙基丙二胺)、甲氧基十六基甘油、氧化异丙烯多元醇(pluronic polyol)；聚阴离子，诸如吡喃、二乙氨基乙基(DEAE)葡聚糖、硫酸葡聚糖、凝聚胺(polybrene)、聚IC、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、卡波普(carbopol)、乙烯马来酸(ethylene maleic acid)、氢氧化铝和磷酸铝肽；油或烃乳液等。
[0075] 疫苗可在水溶液(诸如水或乙醇)或生理学上相容的缓冲液(诸如汉氏溶液(Hanks′solution)、林格氏溶液(Ringer′s solution)或生理盐水缓冲液(包括PBS))中调配。疫苗调配物也可制成固体型制剂，所述固体型制剂打算例如通过在即将使用之前用适合的媒剂(诸如无菌水、生理盐水溶液或乙醇)复原，在使用前即刻转化成适于向个体给药的液体型制剂。
[0076] 疫苗组合物还可使用持续释放媒剂或长效型制剂(depot preparation)调配。这些长效作用调配物可通过植入(例如皮下或肌肉内)或肌肉内注射给药。因此，例如疫苗可与适合的聚合或疏水性物质一起调配(例如调配成于可接受的油中的乳液)或与离子交换树脂一起调配，或调配成微溶衍生物(例如微溶盐)。可使用脂质体和乳液作为适于供疏水性调配物使用的传递媒剂。视化学性质而定，持续释放媒剂释放抗原的时间可在数小时至数天至数周至数月范围内。
[0077] 疫苗组合物可进一步包括一种或一种以上抗氧化剂。例示性还原剂包括巯基丙酰基甘氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、β-巯基乙胺、谷胱甘肽、抗坏血酸和其盐、亚硫酸盐或偏亚硫酸氢钠或类似物质。另外，抗氧化剂还可包括天然抗氧化剂，诸如维生素E、维生素C、黄质素(leutein)、黄嘌呤、β胡萝卜素和矿物(诸如锌和硒)。
[0078] 疫苗组合物可进一步合并其它物质来充当稳定剂、防腐剂、缓冲剂、润湿剂、乳化剂、分散剂并且合并单糖、多糖和改变渗透平衡的盐。疫苗可进一步包含增强疫苗功效的免疫刺激分子。这些分子可加强免疫应答，可诱发炎症且可以是任何淋巴因子或细胞因子。细胞因子的非限制性实例包括白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13、粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(GMCSF)、巨噬细胞炎症因子等。
[0079] 疫苗可经调配用于输注或注射(静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、鞘内、十二指肠内、腹膜内等)或通过输注或注射给药。疫苗还可通过鼻内、阴道、直肠、经口、局部、经颊、经粘膜或经皮方式给药。
[0080] 可由所属领域非常完善的方法凭经验确定治疗CMV感染的有效抗原剂量。疫苗的有效剂量可取决于若干变量，包括(但不限于)个体的体型、身高、体重、年龄、性别、总体健康状况、调配物类型、给药模式或方式、病毒是活性的还是潜伏性的、患者是否二次感染或罹患其它相关病况。
[0081] 疫苗方案也可基于上述因素。疫苗接种可在个体生命周期(包括从胎儿发育成成人)的任何时候进行。为完全保护，可能需要补充给药或增强免疫。为确定是否已实现足够的免疫保护，可在疫苗接种后监测患者的血清转化和抗体效价。
[0082] 提供以下实例以更详细地描述本发明。这个实例打算说明本发明，而不限制本发明。
[0083] 实例
[0084] 人类巨细胞病毒使用两种不同途径进入视网膜色素上皮细胞
[0085] 这一实例中描述的实验结果证明，两种不同细胞型中所制备的HCMV通过不同途径进入上皮细胞。上皮细胞中产生的病毒粒子优先通过在质膜处融合进入，而来自成纤维细胞的病毒粒子通过pH依赖性胞吞作用进入。这两种病毒制剂诱导显著不同的细胞应答。
[0086] 材料和方法
[0087] 生物试剂：将第10至15代的人类包皮成纤维细胞(HFF)维持在含10％新生牛血清的培养基中。将第24至34代人类MRC-5胚胎肺成纤维细胞和ARPE-19视网膜色素上皮细胞(美国典型微生物菌种保藏中心(American TypeCulture Collection)维持在含10％胎牛血清的培养基中。使人类近端肾小管上皮细胞(hRPTEC)(Cambrex)在含10％胎牛血清的培养基中生长且使用第4至5代。
[0088] BADwt衍生自AD169 HCMV病毒株的BAC克隆；BADrUL131(19，21)是UL131 ORF已修复的BADwt衍生物；BFXwt衍生自VR1814临床HCMV分离株的BAC克隆。通过将BAC DNA电穿孔于HFF中制备病毒，且除非另作说明，否则在ARPE-19细胞或HFF中扩增所得病毒制剂一次。通过经由山梨醇垫(sorbitol cushion)离心部分纯化无细胞的病毒粒子，且再悬浮于无血清培养基中。利用空斑测定(plaque assay)测定MRC-5细胞的病毒效价。利用空斑还原测定(19)使用纯化的抗pUL130单克隆抗体(3E3)(19)测定BADrUL131的中和。
[0089] 先前已描述抗IE1单克隆抗体1B12(21)。使用兔抗Sp100多克隆抗体(Chemicon)观察ND10。
[0090] 电镜：将ARPE-19细胞在4℃下暴露于病毒中1小时，通过用冷PBS洗涤两次移除未结合病毒，添加生长培养基(37℃)15分钟，用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)清洗细胞，固定且处理以进行电镜检查，且用FEI Tecnai-T12显微镜在80kv下检查。
[0091] 关于感染对内体酸化的依赖性的测定：在37℃下用NH4Cl或巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1，BFA)(Sigma)预处理ARPE-19细胞1小时，接着在抑制剂继续存在的情况下感染。16小时后，将培养物固定在2％三聚甲醛中，且用0.1％曲通(Triton)X-100渗透。利用免疫荧光使用单克隆抗体1B12(21)加Alexa 546结合二次抗体鉴别IE1，且用DAPI对核进行染色。以表达IE1的药物处理的细胞相对于未处理细胞的百分比计算抑制。
[0092] 病毒粒子蛋白质的融合活性的分析：为测定“从外部的融合”，使ARPE-19细胞生长到汇合度为90％且使之感染。在37℃下1小时后，移除接种物，且添加含200μg/ml膦甲酸(PFA)的培养基来抑制病毒DNA合成。通过目测检查合胞体形成来监测融合。
[0093] 使荧光素酶报告分子测定适于定量分析病毒粒子融合活性。分别用携带荧光素酶基因的质粒在T7启动子控制下和用pcDNA3-T7聚合酶质粒通过电穿孔(效率为90-95％)制备报告分子和效应ARPE-19细胞。转染后24小时，以1∶1的比率混合细胞，且在37℃下再培育16小时。随后将混合群体在4℃下暴露于HCMV病毒粒子中1小时，此后用冷PBS洗涤单层两次，接着添加缓冲液(含10mM 2-(N-吗啉基)乙烷磺酸和10mM HEPES的磷酸盐缓冲溶液(PBS))，最终pH值在4.5至8范围内。在37℃下3分钟之后，移除缓冲液，且添加正常生长培养基。感染后6小时，溶解细胞，且使用荧光素酶报告分子测定系统(普洛麦格(Promega))测定荧光素酶活性。
[0094] 细胞转录反应的测定：使汇合的ARPE-19细胞血清饥饿24小时，接着进行模拟感染或感染。在感染后6小时或10小时，使用Trizol(英杰(Invitrogen))提取总RNA，且经RNeasy管柱(凯杰(Qiagen))纯化。扩增RNA样品，且用安捷伦(Agilent)低RNA输入荧光线性扩增试剂盒作标记(菁-3)。为控制芯片间的变化(chip to chip variation)，给参考RNA(克隆技术(Clontech))作标记(菁-5)且将其与由模拟感染或HCMV感染细胞制备的探针共杂交。一式两份用Aligent人类44K寡核苷酸阵列进行杂交。使用Agilent扫描仪在5微米分辨率下扫描阵列，且用安捷伦特征提取(Agilent Feature Extraction)软件分析图像以确定杂交点样和本底扣除的荧光信号的强度。使用AgilentGeneSpring GX软件归一化和定量相对RNA变化。
[0095] 结果
[0096] 成纤维细胞衍生的病毒粒子激活ARPE-19细胞中的即刻早期基因表达，其中动力学比上皮细胞衍生的病毒粒子慢。AD169 HCMV病毒株(BADwt)因UL131基因突变而在ARPE-19上皮细胞中不良复制(10，21)。制备BADrUL131的AD169突变的修复通过制备成功进入上皮细胞中所需的gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131病毒粒子糖蛋白复合物(19，20)，使这些细胞的趋性恢复(21)。
[0097] 在ARPE-19上皮细胞中生长的BADrUL131(epiBADrUL131)启动上皮细胞中的基因表达程序的速度大于在HFF成纤维细胞中生长的BADrUL131(fibroBADrUL131)(图1A)。当ARPE-19细胞受epiBADrUL131感染时，约17％的细胞在感染后(hpi)6小时表达可检测的IE1蛋白。IE1表达的同时伴随核中ND10的破坏。相比之下，fibroBADrUL131感染在感染后6小时仅在2.8％的ARPE-19细胞中引起IE1表达。然而，表达IE1的细胞的数目随时间增加。经两种细胞型中制备的病毒感染后24小时，表达IE1的ARPE-19细胞的百分比并无显著差异(图1B)。
[0098] 在HFF中所制备的病毒粒子相对于在ARPE-19细胞中制备的病毒粒子通过不同途径进入ARPE-19细胞。电镜检查病毒进入来确定是否ARPE-19细胞衍生的病毒相对于HFF衍生的病毒的IE1积聚的不同动力学由病毒基因表达开始之前的事件引起。在4℃下使得与epiBADrUL131或fibroBADrUL131一起培育的ARPE-19细胞附着于细胞表面，且培养物转变到37℃历时15分钟以内化，之后处理以进行镜检。每个样品检查40-50个细胞，至少90％的细胞显示完整的病毒粒子或衣壳。各细胞中病毒粒子的数目在2-8个不等，大多数细胞显示2-3个粒子。
[0099] 在受epiBADrUL131感染的ARPE-19细胞中，发现病毒粒子几乎仅位于细胞表面，约97％的病毒粒子在顶膜上。一些粒子靠近细胞，但这部分未显示接触的证据(图2A，图a)，且在融合过程中，其它粒子被捕捉在质膜上(图2A，图b和图c)。很少观察到膜内表面下面的衣壳，实际上，仅鉴别到两个实例(图2A，图d和图e)。细胞内部未发现包膜的病毒粒子。这一结果表明，epiBADrUL131通过与质膜融合进入ARPE-19细胞。相反，经fibroBADrUL131感染的细胞在细胞膜上(约占总数的65％)和细胞内部在囊泡中(约占总数的35％)含有病毒粒子(图2B)。囊泡内的粒子被包膜，表明其通过胞吞作用进入。
[0100] 还检查在成纤维细胞中繁殖的BFXwt临床分离株的进入。这一临床分离株积聚在ARPE-19细胞内的囊泡中(图2C)，表明BADrUL131作为HCMV临床分离株的细胞进入模型是有效的。
[0101] 成纤维细胞衍生的病毒对ARPE-19细胞的感染是pH依赖性的，但上皮细胞衍生的病毒不是。许多通过胞吞作用进入细胞的病毒(1，4，10)需要酸化内体以便病毒粒子包膜与内体膜融合并将衣壳释放到细胞质中。测试缓冲内体pH值的NH4Cl和阻断内体ATP酶质子泵的巴弗洛霉素A1(BFA)对ARPE-19细胞感染的影响。用任一试剂预处理之后，感染细胞且在含药物培养基中再培养16小时。通过测定IE1阳性细胞对成功的感染进行评分。与上述超微结构分析一致，用任一试剂预处理仅对epiBADrUL131感染产生适度影响(图
3A)。相反，这两种试剂在fibroBADrUL131感染之后以剂量依赖性方式抑制IE1表达，表明成纤维细胞产生的病毒的进入取决于内体酸化。所述试剂对epiBADrUL131的进入几乎不产生影响的事实显示对fibroBADrUL131的抑制不是由毒性产生。
3A)。相反，这两种试剂在fibroBADrUL131感染之后以剂量依赖性方式抑制IE1表达，表明成纤维细胞产生的病毒的进入取决于内体酸化。所述试剂对epiBADrUL131的进入几乎不产生影响的事实显示对fibroBADrUL131的抑制不是由毒性产生。
[0102] 接着，确定在其它类型上皮细胞和成纤维细胞中生长的病毒是否显示与ARPE19衍生的病毒粒子和HFF衍生的病毒粒子相同的性质。在用NH4Cl或BFA处理之后，使用来自hRPTEC上皮细胞和MRC-5成纤维细胞的病毒母液(virus stock)感染ARPE-19细胞，且其对抑制剂的反应完全与在ARPE-19细胞或HFF中生长的病毒相同(图3B，左图)。因此，在两种不同成纤维细胞中制备的BADrUL131对抑制剂的敏感性实质上大于在两种不同上皮细胞系中制备的病毒。
[0103] 还测定内体pH值对BFXwt临床分离株进入ARPE-19细胞的影响(图3B，右图)。虽然NH4Cl或BFA显著降低因受成纤维细胞产生的BFXwt感染制备的IE1阳性ARPE-19细胞的数目，但经上皮细胞衍生的BFXwt感染之后，仅观察到轻微的抑制。
[0104] 上皮细胞中制备的病毒粒子的内在融合活性大于成纤维细胞中制备的病毒粒子。其它疱疹病毒的情况也是这样。HCMV临床分离株促进细胞-细胞融合，所述融合早在感染后3-5小时即可检测到。无需从头合成病毒包膜蛋白而快速产生合胞体表明，此受“从外部融合”促进，从外部融合是一种包膜的病毒粒子直接融合靶细胞的过程。因为上皮细胞中制备的BADrUL131相对于成纤维细胞中制备的BADrUL131以不同方式进入上皮细胞中，所以测试其会展现不同的“从外部融合”活性的可能性。
[0105] 模拟感染的ARPE-19细胞不展现合胞体(图4A)，且在经fibroBADrUL131感染后，合胞体也很罕见(图4B)。相反，暴露于epiBADrUL131之后，早在感染后6小时即检测到细胞-细胞融合，且在感染后24小时，20-30％的核聚集在合胞体中(图4C)。用阻断发展成感染晚期的PFA处理细胞，因此融合必定已被epiBADrUL131粒子诱发，但未被新表达的病毒粒子蛋白诱发。
[0106] 使用荧光素酶报告分子测定定量病毒粒子的融合活性以及pH值对从外部融合的影响。报告分子和效应细胞各别接受由T7启动子驱动的含荧光素酶基因的质粒或T7 RNA聚合酶表达质粒。混合这两种ARPE-19衍生物，且通过测定荧光素酶表达定量感染依赖性融合，epiBADrUL131诱导的融合活性始终高于fibroBADrUL131(图4D)。在pH 7-8时，fibroBADrUL131的活性是epiBADrUL131的活性约三分之一。当病毒吸附后用低pH值缓冲液处理细胞时，这两种病毒制剂介导适度增强的融合。在这一测定中，BADwt不诱导融合。
[0107] 进入的方式不改变HCMV细胞趋性。如以上所讨论，取决于感染病毒在哪种细胞中制备，疱疹病毒优先偏爱进入特定细胞型。这一现象不同于如上所述所观察到的现象，即来自不同细胞型的HCMV制剂利用不同机理进入上皮细胞。尽管如此，不同进入机理仍有可能会影响复制效率和产率，从而产生趋性作用。因此，进行实验以确定进入方式是否影响上皮细胞上的HCMV空斑产生，与成纤维细胞作比较(表1)。在ARPE-19、hRPTEC、HFF或MRC-5细胞中制备BADrUL131母液，且测定ARPE-19或MRC-5细胞上的空斑形成(表1)。虽然ARPE-19上产生的空斑稍多于MRC-5细胞，但上皮细胞衍生的病毒与成纤维细胞衍生的病毒相较于另一细胞型都不优先在一种细胞型上产生空斑。
[0108] 表1.ARPE19和MRC5细胞(×105个)中的上皮细胞衍生或成纤维细胞衍生的BADrUL131的效价测定
[0109]a 5
[0110] 使用最初在HFF中测定效价的2×10 pfu BADrUL131来感染ARPE-19或MRC5细胞。
[0111] bARPE-19效价相对于MRC5效价之比。
[0112] pUL130特异性抗体阻断上皮细胞衍生和成纤维细胞衍生的病毒对ARPE-19的感染。中和上皮细胞的HCMV感染(19)的pUL130特异性抗体能够阻断由任一进入方式对ARPE-19的感染(图5A)。其以剂量依赖性方式抑制这两种病毒的感染，但epiBADrUL131对中和的敏感性稍大于fibroBADrUL131。抗体抑制这两种进入方式的能力增强了如下结论：无论融合发生在质膜上还是内体膜上，含pUL130的复合物都起作用。
[0113] 先前已报导，gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131复合物不为内皮细胞或上皮细胞内化HCMV所必需，因为缺乏这一复合物的实验室病毒株有效被胞吞(10)。然而，与内体膜的后续融合和逸入细胞质中需要这一复合物。与这些早期结果一致，当针对ARPE-19细胞测定时，pUL130的抗体不阻断epiBADrUL131、fibroBADrUL131或BADwt的结合或内化(图5B)。然而，内化的成纤维细胞衍生的病毒的总量低于上皮细胞衍生的病毒的总量。这可能反映内化率降低，此可与成纤维细胞衍生的病毒延迟IE1表达的开始一致(图1)。
[0114] epiBADrUL131和fibroBADrUL131在ARPE-19细胞中诱导不同的转录反应。如同许多其它病毒，HCMV调节进入期间的细胞信号传导途径。细胞内信号传导变更的一个结果是细胞转录组显著变化，此实质上由病毒粒子糖蛋白与宿主细胞接触所引起。
[0115] 因此，研究这两种进入途径对ARPE-19细胞的转录反应的影响。模拟感染或用epiBADrUL131或fibroBADrUL131感染细胞，且6小时或10小时后纯化总RNA。通过使用微阵列分析相对RNA水平，并且鉴别相对于模拟感染对照组水平变化≥2.5倍的感染细胞RNA(表2-5)。用图6A中的文氏图描绘表达增加或减小的RNA的分布。
[0116] 表2.感染后6小时，由经epiBADrUL131感染的ARP19细胞分化转录的基因[0117]
[0118]
[0119] 表3.感染后6小时，由经fibroBADrUL13l感染的ARP19细胞分化转录的基因[0120]
[0121]
[0122]
[0123] 表4.感染后10小时，由经epiBADrUL131感染的ARP19细胞分化转录的基因[0124]
[0125]
[0126] 将与epiBADrUL131感染的ARPE-19细胞的经标记RNA杂交的微阵列靶与模拟感染细胞作比较，且列出水平变化≥2.5倍的探针组。列出基因库编号、变化倍数和基因名称。
[0127] 表5.感染后10小时，由经fibroBADrUL131感染的ARP19细胞分化转录的基因[0128]
[0129]
[0130]
[0131]
[0132] 将与fibroBADrUL131感染的ARPE-19细胞的经标记RNA杂交的微阵列靶与模拟感染细胞作比较，且列出水平变化≥2.5倍的探针组。列出基因库编号、变化倍数和基因名称。
[0133] epiBADrUL131感染后6小时，与模拟感染细胞相比，47个RNA的水平发生变化；且相对于模拟感染细胞，fibroBADrUL131感染细胞的121个RNA改变。这两种病毒的调节的RNA组实质上不同；经epiBADrUL131或fibroBADrUL131感染后，仅19个RNA改变。虽然可能在数种情况下基因会因一种病毒而改变≥2.5倍，而另一种病毒诱导低于这一临界值的更适度改变，但对数据的检查表明这并不常见。感染后10小时，epiBADrUL131调节的宿主细胞RNA的数目仅稍有增加(50个RNA)，而fibroBADrUL131观察到的较大幅度的增加(153个RNA)。此后，这两种病毒调节的RNA数目增加的程度有限(28个RNA)。微阵列结果由1个未改变的RNA和6个因感染而改变的RNA的实时RT-PCR得到证实(图6B)。
[0134] 为进一步比较fibroBADrUL131与epiBADrUL131对RNA水平的调节，使用包含以下四个基因本体(Gene Ontology)组的基因列表过滤阵列结果：宿主-病原体相互作用(GO：0030383)、细胞通讯(GO：0007154)、病毒生命周期(GO：0016032)以及细胞-细胞信号传导(GO：0007267)。在fibroBADrUL131感染的ARPE-19细胞中调节大于2.5倍的约三分之一的mRNA(222个中的70个)出现在并入的组中(表6)。与之形成鲜明对比，在这四个基因本体组中仅发现epiBADrUL131诱导的86个RNA中的1个。这两种病毒制剂在感染上皮细胞后产生实质上不同的转录反应。
[0135] 表6.经fibroBADrUL131修饰的细胞RNA水平
[0136]
[0137]
[0138] 并入四个GO组：宿主-病原体相互作用(GO：0030383)、细胞通讯(GO：0007154)、病毒生命周期(GO：0016032)以及细胞-细胞信号传导(GO：0007267)。使用含9276个基因的组过滤fibroBADrUL131感染的ARPE-19细胞的阵列结果。显示基因库识别号和基因名称以及感染后6小时和10小时的诱导或抑制倍数。与模拟感染细胞相比改变不大于且不等于2.5的探针组由表示无变化的“nc”表示。
[0139] 讨论
[0140] ARPE-19上皮细胞可通过两种不同途径被HCMV感染，在质膜处融合，或融合之后，在内体膜处胞吞。这两种进入方式引发产毒感染(productiveinfection)。进入途径取决于病毒繁殖所在细胞型。上皮细胞制备的HCMV通过前一种途径进入，而在成纤维细胞中生长的病毒遵循后一种途径。这个结论由超微结构分析和感染对阻断内体酸化的试剂的敏感性有差异得出。在上皮细胞中生长的病毒的“从外部融合”活性大于在成纤维细胞中制备的病毒的观察结果增强如下观点：这两种病毒制剂以根本上不同的方式与ARPE-19细胞相互作用。重要的是，这两种进入方式需要pUL130功能，因为pUL130抗体中和由任一来源制备的病毒的感染。如果感染病毒已在上皮细胞中制备，那么gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131复合物在ARPE-19质膜处起作用，且如果病毒在成纤维细胞中生长，那么所述复合物在内体膜处起作用。在内体中中和的病毒不能逃逸，且估计可能遭受与缺乏含pUL130复合物的AD169相同的命运，且积聚在上皮细胞内体中但未引发产毒感染(10)。
[0141] 在成纤维细胞中生长的病毒相对于来自上皮细胞的病毒在延迟后诱导IE1蛋白积聚在ARPE-19细胞中，表明相较于通过在质膜处融合进入，通过胞吞作用进入的某个方面进行得较慢。成纤维细胞产生的病毒进入后，内体中显而易见许多病毒粒子，但在细胞质内未见到衣壳；且在受上皮细胞制备的病毒感染的细胞的细胞质中也很少发现衣壳。显然，病毒粒子在内体中逗留一段时间，而一旦衣壳无包膜且到达细胞质，其即快速分解。
[0142] HCMV病毒粒子是如何在两种不同细胞型中制备的？看来不同的“从外部融合”活性提供暗示。不仅epiBADrUL131诱导融合的效率大于fibroBADrUL131，而且pH值降低会增强两种病毒制剂的活性。不打算受任何机理解释的约束或限制，膜的融合有可能需要一定阈值的融合活性。因为pUL130抗体中和这两种病毒制剂的能力表明两者都取决于用于融合的gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131复合物，所以设计实验来假设病毒含有不同量的复合物。测定数个其组成部分，且发现epiBADrUL131粒子中呈现的gH/gL/pUL128/pUL130/pUL131与gH/gL/gO的比率稍高于(约2倍)fibroBADrUL131粒子中。gB、pp28以及pp65的水平在这两种病毒粒子制剂中类似。
[0143] EBV中优先制备含不同相对量的gH复合物的病毒；由B细胞制备的粒子缺乏gH/gL/gp42(18)。然而，可能涉及其它因子。复合物的未测定的组成部分可能改变。或者，gH复合物与一种或一种以上其它病毒粒子糖蛋白复合物的比率可能改变融合活性。最后，当在上皮细胞或成纤维细胞内制备病毒粒子时，供应给病毒粒子的未鉴别的细胞蛋白质可能改变复合物。
[0144] 两种进入方式是否有生理学结果？epiBADrUL131和fibroBADrUL131在感染ARPE-19细胞后诱导显著不同的细胞转录反应。假定差异确实由病毒粒子或病毒粒子加特定相关的细胞因子所致，那么微阵列实验证明对感染的转录反应惊人地不同。胞吞作用密切参与细胞表面分子的信号传导的调控。因此，如果病毒通过在质膜处融合进入，相对于通过胞吞作用进入，病毒可以不同方式调节细胞信号传导和细胞转录组。细胞信号传导的差异很可能产生在培养细胞中未检测到的生理学结果，诸如对病毒传播、免疫逃逸或毒力的影响。
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