技术问题  本发明的目的在于公开一种细胞质雄性不育NAU4A，该不育胞质是通 过原生质体融合后代选育而得到的。油菜及十字花科杂种优势利用中，存在不育细 胞质单一，育性不稳定等问题，本发明的细胞质雄性不育为解决细胞质单一问题提 供了新手段，可用于油菜及其十字花科杂种优势利用。
技术方案
上述NAU4A雄性不育细胞质，属于新型细胞质雄性不育类型，可用于甘蓝型油菜、 白菜等十字花科植物的杂种优势利用。通过杂交、回交等育种方式，育成NAU4A细 胞质的雄性不育系。
ATGCCTCAACTGGATAAATTCACTTATTTTTCACAATTCTTCTGGTTATGCCTTTTC
TTCTTTACTTTCTATATTTTCATATGCAATGATGGAGATGGAGTACTTGGGATCAGC
AGAATTCTAAAACTACGGAACCAACTGCTTTCACACTGGGGTAAGAAGCTAAAG
CTTGGTGGAAAAGATCGTACAAGTAAGTTCGGGGTCTTAGCGTTCGCCACGCGCT
ATTTCCCATCCAGAGCACTCATGTTCGTGGTCCCAAAAATGCGGCTAGCTATATAT
CTAATATATGGTTTGAATTTTATTTTTGGGATTAAATGGGGGTTGCTAGGAAATGAG
ATATTTCAGTTCGGCGTCGGACCAGATGGCGTCGCGCCCCCAGCTCTAGATCTCA
ACGAGCGCCCGCCACTGCATCTTTTGTACGCGGATGTTGAGAGTTCCGACTCTCA
ACAAGCGCGGAATGCTGATATGCTAGCGCATATTAGCCGAGTGCAAGAGATAACC
CGTGACCTAGAGGGTGAGCATGATATCGCGCGGCGTCAAGCCCTCGTCGATATCA
TGAAGTGGGAGGTCAGGAGCTTGGATCACCACTTCCGGGTCTTTCGGTACCTAGA
CCGTCTGCGAGATTCGAAGAGAGCCAAGGTGAACGAAATACTCGATCTATTTCGA
TGA
该序列编码的重组蛋白序列(SEQ ID No.2)为：
MPQLDKFTYFSQFFWLCLFFFTFYIFICNDGDGVLGISRILKLRNQLLSHWGKKL
KLGGKDRTSKFGVLAFATRYFPSRALMFVVPKMRLAIYLIYGLNFIFGIKWGLLG
NEIFQFGVGPDGVAPPALDLNERPPLHLLYADVESSDSQQARNADMLAHISRVQEI
TRDLEGEHDIARRQALVDIMKWEVRSLDHHFRVFRYLDRLRDSKRAKVNEILDL
FR
有益效果
1、本发明的目的在于公开一种细胞质雄性不育NAU4A，该不育胞质是通过原生 质体融合后代选育而得到的。
2、油菜及十字花科杂种优势利用中，存在不育细胞质单一，育性不稳定等问题。 本发明人提供的细胞质是经过线粒体基因组重组而获得的，该重组类型不同于 已经大面积应用了20年的POLIMA不育胞质类型(pol)，该不育胞质的应用将 有利于解决不育细胞质单一的问题。而且该细胞质雄性不育类型的不育性比较 彻底，易于培育彻底稳定不育系。
3、本发明人提供的不育胞质是线粒体基因组重组的结果：利用具有NAP型胞质 的可育亲本原生质体融合，获得融合杂种；由于遗传的异质性，导致线粒体DNA 重组，从而可得到的不育胞质。线粒体DNA的分子实验证明了这个结论。本发 明的细胞质雄性不育不同于NAP型细胞质雄性不育，NAP型细胞质的恢复系是 NAU4A的保持系；也不同于POLIMA型细胞质雄性不育系，POLIMA型不育 系的线粒体编码ORF224蛋白，导致雄性不育，而本发明的不育胞质编码重组 型ORF222R4蛋白。从利用的角度看，NAP细胞质的利用价值不大，而本发明 的NAU4A细胞质利用价值很大。
4、本发明人提供的不育胞质可以通过种间杂交，转移到白菜、甘蓝等十字花科物 种中去，为这些十字花科物种的杂种优势利用，提供细胞质雄性不育，因此应 用可以很广泛。
5、研究中，通过基因表达分析，发现NAU4A的重组型基因ORF222R4在稳定不 育系中表达大，而在可育杂交组合中该重组型基因表达量低，说明该基因与雄 性不育的形成有关。

实施例1
以播娘蒿(Descurainian sophia)叶片和甘蓝型油菜(Brassica napus)子叶为 材料提取原生质体，采用PEG-高pH、高钙附加DMSO融合方法，液体浅层静 置培养，研究影响播娘蒿与甘蓝型油菜原生质体融合的因素，获得了19株再生植 株。结果表明：4％纤维素酶+0.5％离析酶+5mmol/L MES酶解10h和1％纤维 素酶+0.2％离析酶+3mmol/L MES酶解14h分别适合获得高产率播娘蒿与油菜 原生质体；30％PEG+0.3mol/L葡萄糖+50mmol/L CaCl2·2H2O+15％DMSO 获得了10％的融合率；改良B5培养基的原生质体培养效果较好；每次添加不同 的新鲜培养基和添加MES对于防止褐化具有很好的效果；适宜分化培养基为MS +4.0mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+5.0mg/L AgNO3；适宜生根培养基为MS+ 0.1mg/L IBA+0.1mg/L NAA。
甘蓝型油菜与播娘蒿的原生质体融合获得的再生植株移栽到田间后，对其进 行了形态学、细胞学及花粉活力观察。杂种植株生长缓慢、在叶型、叶片缺刻、 叶缘裂痕、茎杆分枝处颜色、花蕾初期颜色等形态学上表现出播娘蒿的特征，开 花期和成熟期相对较晚；杂种植株花比油菜花小，花粉活力低，结实率低。在融 合杂种中出现了7个不育株，用甘蓝型油菜与融合杂种进行杂交和回交研究。
实施例2
利用原生质体融合技术所获得的融合杂种中，出现了不育株。用不育株了与 NAU4B杂交，进一步从杂交F1开始选择彻底不育株与NAU4A回交，经过5代回 交，得到稳定的不育系NAU4A。NAU4A的不育性在年份间表现稳定不育。通过测 交，已经找到恢复系，实现了三系配套，为杂种优势利用提供了新的授粉控制系统。 研究开创了细胞质方法，通过该方法从融合杂种至回交一代，均发现细胞质重组； 基因克隆的研究表明，回交一代以后细胞质mtDNA保持稳定，不再发生重组。
NAU4A是通过原生质体融合获得的一系列重组细胞质的中的一个。本发明中， 选育不育胞质的方法体系中，结合了mtDNA重组方法以及和育种选择方法，最后 通过细胞质鉴定，得到了优良的不育细胞质。
实施例3
利用NAU4A不育胞质与白菜(Brassica napus)品种“上海青”杂交，F1代 仍然表现为不育，而NAP型胞质的甘蓝型油菜与上海青杂交后，F1有花粉量基本 正常，说明NAU4A不育胞质可以转移到油菜近缘中去，为杂种优势利用提供新手 段。
实验例4
选用甘蓝型油菜雄性不育细胞质NAU4A的新鲜幼嫩黄化叶片为材料，提取线粒 体DNA。依据数据库中NAP细胞质雄性不育高度相关的orf222设计引物：
上游引物P1：5’-TCATCGAAATAGATCGAGTA-3’；
下游引物P2：5’-TTATGAGCTAGATAAAGCTACT-3’；
以基因组DNA为模板，扩增目的基因。PCR反应条件优化后为：94℃预变性5min 后；94℃变性30s，54℃退火45s，72℃延伸60s，32个循环；72℃再延伸10min。扩 增出了一条600～700bp大小的特异条带。PCR回收产物连接到PGT克隆载体上，转 化到大肠杆菌TOP10中，以来自目的片段上的引物序列为引物，进行PCR扩增鉴定 目的片段。对此目的片段进行测序，结果表明特异片段大小为669bp，具有起始密 码子(ATG)和终止密码子(TGA)。开放阅读框完整。但是序列出现了重组，与NAP 型细胞质的ORF222不同，且具有这种重组序列的不育胞质与NAP型的“恢复系和 保持系”关系也不同。
实验例5：
以油菜NAU4A为材料，分别从其根、茎、叶、花蕾以及花等组织中，提取总 RNA，采用随机引物反转录cDNA第一条链，以cDNA第一条链为模板，采用RT-PCR 技术，检测油菜NAU4A不同组织的差异表达情况。
内参基因actin的引物序列：
actinF：5’-CGCCGAGCGGGAAATCGTC-3’；
actinR：5’-GGAAAGTGCTGAGGGATGC-3’。
以真核生物中组成性表达的基因EF1α为内标，对cDNA第一链进行半定量分 析，EF1α的PCR扩增程序为：95℃2min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，24个 循环；72℃，延伸10min。结果表明：基因在不育系的根、茎、叶、花蕾以及花中 都有表达，但在花器官和茎中的表达较高，均属于组成型表达；在可育杂交组合中 表达量低。说明不育性可能与ORF222有关。
综上所述，本发明人利用原生质体融合技术，得到了不育株，由不育株的杂交 和回交后代得到稳定不育系NAU4A，其细胞质经过分子鉴定，证明为新型雄性不 育胞质，在ORF222区域得到了重组型DNA序列和基因及其编码蛋白。本发明人 提供了一种新型雄性不育授粉控制系统，为油菜乃至油菜的十字花科近缘种的杂种 优势利用提供了新方法。
本发明涉及的序列及记号分列如下：
(1)SEQ ID NO.1的信息
(i)序列特征：
(A)长度：669bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.1
(2)SEQ ID NO.2的信息
(i)序列特征：
(A)长度：222a.a
(B)类型：氨基酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)序列描述：SEQ ID NO.2
(3)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征：
(A)长度：20b
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.3
(4)SEQ ID NO.4的信息
(i)序列特征：
(A)长度：22b
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.4
(5)SEQ ID NO.5的信息
(i)序列特征：
(A)长度：19b
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.5
(6)SEQ ID NO.6的信息
(i)序列特征：
(A)长度：19b
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.6
序列表
<110>南京农业大学
<120>油菜雄性不育细胞质NAU4A的育种方法
<130>NAU4A
<140>2009-7-6
<141>2009-07-06
<150>2009-6-30
<151>2009-06-30
<150>2009-7-5
<151>2009-07-05
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>669
<212>DNA
<213>Brassica napus
<400>1
atgcctcaac tggataaatt cacttatttt tcacaattct tctggttatg ccttttcttc     60
tttactttct atattttcat atgcaatgat ggagatggag tacttgggat cagcagaatt    120
ctaaaactac ggaaccaact gctttcacac tggggtaaga ccatccagag caagctaaag    180
catcgtacaa gtaagttcgg ggtcttagcg ttcgccacgc gctatttctt ggtggaaaag    240
ctcatgttcg tggtcccaaa aatgcggcta gctatatatc taatatatgg tttgaatttt    300
atttttggga ttaaatgggg gttgctagga aatgagatat ttcagttcgg cgtcggacca    360
gatggcgtcg cgcccccagc tctagatctc aacgagcgcc cgccactgca tcttttgtac    420
ggcgcggaat gctcatatgc tagcgcatat tcggatgttg agagttccga ctctcaacaa    480
agccgagtgc aagagataac ccgtgaccta gagggtaagc atgatatcgc gcggcgtcaa    540
gccctcgtcg atatcatgaa gtgggaggtc aggagcttgg atcaccactt ccgggtcttt    600
cggtacctag accgtctgcg agattcgaag agagccaagg tgaacgaaat actcgatcta    660
tttcgatga                                                            669
<210>2
<211>222
<212>PRT
<213>Brassica napus
<400>2
Met Pro Gln Leu Asp Lys Phe Thr Tyr Phe Ser Gln Phe Phe Trp Leu
1               5                   10                  15
Cys Leu Phe Phe Phe Thr Phe Tyr Ile Phe Ile Cys Asn Asp Gly Asp
            20                  25                  30
Gly Val Leu Gly Ile Ser Arg Ile Leu Lys Leu Arg Asn Gln Leu Leu
        35                  40                  45
Ser His Trp Gly Lys Lys Leu Lys Leu Gly Gly Lys Asp Arg Thr Ser
    50                  55                  60
Lys Phe Gly Val Leu Ala Phe Ala Thr Arg Tyr Phe Pro Ser Arg Ala
65                  70                  75                  80
Leu Met Phe Val Val Pro Lys Met Arg Leu Ala Ile Tyr Leu Ile Tyr
                85                  90                  95
Gly Leu Asn Phe Ile Phe Gly Ile Lys Trp Gly Leu Leu Gly Asn Glu
            100                 105                 110
Ile Phe Gln Phe Gly Val Gly Pro Asp Gly Val Ala Pro Pro Ala Leu
        115                 120                 125
Asp Leu Asn Glu Arg Pro Pro Leu His Leu Leu Tyr Ala Asp Val Glu
    130                 135                 140
Ser Ser Asp Ser Gln Gln Ala Arg Asn Ala Asp Met Leu Ala His Ile
145                 150                 155                 160
Ser Arg Val Gln Glu Ile Thr Arg Asp Leu Glu Gly Glu His Asp Ile
                165                 170                 175
Ala Arg Arg Gln Ala Leu Val Asp Ile Met Lys Trp Glu Val Arg Ser
            180                 185                 190
Leu Asp His His Phe Arg Val Phe Arg Tyr Leu Asp Arg Leu Arg Asp
        195                 200                 205
Ser Lys Arg Ala Lys Val Asn Glu Ile Leu Asp Leu Phe Arg
    210                 215                 220
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>Brassica napus
<400>3
tcatcgaaat agatcgagta                                            20
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>Brassica napus
<400>4
ttatgagcta gataaagcta ct                                         22
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>Brassica napus
<400>5
cgccgagcgg gaaatcgtc                                             19
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>Brassica napus
<400>6
ggaaagtgct gagggatgc                                             19