一种双层人工皮肤及其制备方法
专利汇可以提供一种双层人工皮肤及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种双层人工 皮肤 及其制备方法，本 发明 是由脱细胞膜状 生物 衍生材料作为表层，由 成 纤维 细胞 及其合成分泌的细胞外基质和细胞生长因子复合于生物 支架 材料内部形成真皮层，两者嵌合构成；其致密的表层结构可有效地减少 水 分、 电解 质和 蛋白质 由创面的丢失，阻止细菌对受损创面的入侵、繁殖，防止创面感染，有利于上皮增殖和生长；真皮层可直接修复创面，促进创周细胞的长入和血管的生成、诱导干细胞向皮肤细胞的分化，对创面愈合具有促进作用；该皮肤具有以下优点：可促进创面皮肤的再生，增强创面愈合后皮肤的弹性、柔韧性和机械 耐磨性 ，减少瘢痕增生，控制挛缩，有良好的 生物相容性 ，提高移植的成功率，改善愈合 质量 ；材料来源广泛、生产方法简单；适用于 炎症 、溃疡、烧烫伤、医源性等原因造成的皮肤缺损的临床 治疗 。，下面是一种双层人工皮肤及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种双层人工皮肤，包含有成纤维细胞，其特征在于，其是由脱细胞 膜状生物衍生材料作为表层，由成纤维细胞及其合成分泌的细胞外基质和细胞 生长因子复合于生物支架材料内部形成真皮层，两者嵌合构成；所述的脱细胞 膜状生物衍生材料为天然生物组织经脱细胞所形成的膜状生物医用材料；所 述的成纤维细胞为自体或异体来源的成纤维细胞，或可向成纤维细胞分化的 干细胞；所述的生物支架材料是能为细胞生长提供三维空间的支撑材料。
2.制备权利要求1所述的双层人工皮肤的方法，包括有细胞获取、脱 细胞生物衍生材料制备的步骤，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1).成纤维细胞的获取：成纤维细胞来自人体组织，按常规的培养 方法进行体外培养和大规模扩增；
步骤2).脱细胞生物衍生材料的制备：采用皮肤真皮层、筋膜、小肠粘 膜下层、羊膜、硬脑膜的任一种膜状生物材料制备；将材料置于含有过氧乙 酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小时，用磷酸盐缓冲液清洗后；将其 置于NaOH溶液浸泡处理；用磷酸盐缓冲液浸洗至pH中性，再将其置入含 有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中处理25分钟以上，用磷酸盐缓冲液 浸洗后在其上均匀制孔，再将无孔的与有孔的脱细胞生物衍生材料叠加压紧 使其紧密结合，干燥灭菌后成为双层脱细胞生物衍生材料；
步骤3).双层人工皮肤培养液的配制，其组分按体积百分比包括有：商 用最低必需培养液DMEM67.5％、商用培养液F1222.5％、胎牛血清5～15％， 碱性成纤维细胞生长因子2～100ng/ml、表皮细胞生长因子2～100ng/ml、 胰岛素1～50ng/ml、氢化可的松10～500ng/ml、腺嘌呤0.2～0.25mM、 转铁蛋白1～10μg/ml；
步骤4).双层人工皮肤的构建：先配制生物支架材料的凝胶溶液；将 制备的双层脱细胞生物衍生材料浸透凝胶溶液后，置于37℃环境下预固化； 将体外培养的成纤维细胞按104～106个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，再按 0.1～1ml/cm2滴加到预固化材料的有孔面上，置于5％CO2环境中37℃条件下 固化；再置入双层人工皮肤培养液中培养2～3天后，将其置于培养器皿内的 培养支架上继续培养5～8天，培养期间每天换液，培养完成；上述的培养条 件均为37℃，5％CO2环境。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中在所述脱 细胞生物衍生材料制孔的孔径为0.1～1mm，间距为0.5～5mm。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中所述的 过氧乙酸和乙醇的体积终浓度分别为0.1～0.5％和2～10％；所述DNA酶和α- 半乳糖苷酶的终浓度分别为30～50U/ml和10～25U/ml。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤2)中所述的浸 泡消毒清洗后，NaOH溶液浸泡前，将材料置于-80℃冷冻半小时以上，取出后 自然解冻，如此反复冻融2～5次，用磷酸盐缓冲液清洗后再于NaOH溶液浸泡。
技术领域
本发明属于组织工程的生物材料技术领域，具体涉及一种双层人工皮 肤及其制备方法。
背景技术
随着组织工程技术的发展，制备人工皮肤已成为皮肤缺损治疗的热点。 理想的组织工程化皮肤能够模仿天然皮肤的结构，具有表皮层和真皮层的复 合型皮肤。其中的真皮层成分与皮肤真皮的成分接近，利于真皮细胞的长入； 表皮层覆盖物起到隔离外界环境，防止水分蒸发，避免细菌入侵，同时复合 一些生长因子或者药物，可以起到促进创面愈合、治疗皮肤疾病的目的。
目前已商品化的双层人工皮肤有Integra(Integra LifeSciences公司生 产)，为双层基质的人工皮肤，真皮部分由牛肌腱的胶原蛋白及硫酸软骨素 制成具有一定孔洞大小的支架，表皮层则由硅胶膜组成，可以控制伤口水气 的蒸散，在伤口愈合过程，真皮层会与伤口结合，表皮层的硅胶膜可以在真 皮层愈合后去除，再进一步做自体皮肤移植，美国FDA已在1996年核准 Integra在烧烫伤治疗使用；其不足主要在于，由于其表面有不可降解的硅 胶膜，不易观察创面早期的感染情况，不利于创缘表皮细胞的爬行和创面的 封闭，后期揭掉硅胶膜还需要二次手术。Apligraf(Organogenesis公司生 产)也是双层的人工皮肤，真皮层是由人类真皮成纤维细胞种植在牛胶原蛋 白中，表皮层是由人表皮细胞构成，附着在真皮上形成表皮层；其不足主要 在于表皮层是由免疫原性较高的异体表皮细胞构成，增加了产品的免疫排斥 反应，同时使得生产工艺复杂、生产时间长、成本增加。
发明内容
本发明提出的双层人工皮肤，包含有成纤维细胞，其特征在于：是由脱 细胞膜状生物衍生材料作为表层，由成纤维细胞及其合成分泌的细胞外基质 和细胞生长因子复合于生物支架材料内部形成真皮层，两者嵌合构成；所述 的脱细胞膜状生物衍生材料为天然生物组织经脱细胞处理后所形成的膜状 生物医用材料，包括脱细胞小肠粘膜下层、脱细胞真皮基质、脱细胞筋膜、 脱细胞膀胱粘膜下层、脱细胞羊膜、脱细胞硬脑膜的任一种；所述的成纤维 细胞为自体或异体来源的成纤维细胞，或可向成纤维细胞分化的干细胞，包 括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、间充 质干细胞、肌肉干细胞，肝脏干细胞、神经干细胞的任一种；所述的生物支 架材料是能为细胞生长提供三维空间的支撑材料，包括纤维蛋白原、纤维蛋 白、海藻酸盐、胶原蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、壳聚糖、水凝胶、明胶、 聚乳酸、聚羟基乙酸的任一种或是几种的混合。
本发明所述的双层人工皮肤的制备方法，包括有成纤维细胞的获取、 脱细胞生物衍生材料的制备以及双层人工皮肤的构建，具体步骤如下：
步骤1).成纤维细胞的获取：成纤维细胞来自人体组织，按常规的细 胞培养方法进行体外培养，细胞的大规模扩增可采用已有的方法进行；
步骤2).脱细胞生物衍生材料的制备：将取自同种或异种的皮肤真皮 层、或筋膜、或小肠粘膜下层、或羊膜、或硬脑膜的任一种膜状生物材料， 置于含有过氧乙酸和乙醇的水溶液中浸泡消毒不低于1小时，用磷酸盐缓冲 液(PBS溶液)清洗；(若是采用较厚的生物材料，如皮肤真皮层，此时需置 于-80℃冷冻半小时以上，确保材料内外温度达到一致，取出后自然解冻， 如此反复冻融2～5次，使细胞完全破裂崩解，用PBS溶液清洗)；将其置 于0.1～1M的NaOH溶液浸泡进行脱脂、脱细胞处理；用PBS溶液浸洗至pH 中性，再将其置入含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的混合溶液中，37℃环境下 处理25分钟以上，去除残留的DNA和α-ga1天然抗原成分，降低免疫原性， 用PBS溶液清洗；为了使其与支架材料结合牢固，采用机械方法在其材料上 均匀制孔，孔径0.1～1mm，间距0.5～5mm，将无孔的脱细胞生物衍生材料 与有孔的脱细胞生物衍生材料叠加压紧使其紧密结合，干燥灭菌后成为双层 脱细胞生物衍生材料，备用；
其中，所述的过氧乙酸和乙醇的体积终浓度分别为0.1～0.5％和2～10％； 所述DNA酶和α-半乳糖苷酶的终浓度分别为30～50U/ml和10～25U/ml；
步骤3).双层人工皮肤培养液的配制，其组分按体积百分比包括有： 商用最低必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清5～15％， 碱性成纤维细胞生长因子2～100ng/ml、表皮细胞生长因子2～100ng/ml、 胰岛素1～50ng/ml、氢化可的松10～500ng/ml、腺嘌呤0.2～0.25mM、 转铁蛋白1～10μg/ml；
步骤4).双层人工皮肤的构建：配制生物支架材料的凝胶溶液；将制 备的双层脱细胞生物衍生材料浸透凝胶溶液后，置于37℃环境下预固化；将 体外培养的成纤维细胞按104～106个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，再按 0.1～1ml/cm2滴加到预固化的双层脱细胞生物衍生材料的有孔面上，置于5 ％CO2环境中37℃条件下固化；再置入双层皮肤培养液中培养2～3天后，将其 置于培养器皿内的培养支架上继续培养5～8天，培养期间每天换液，双层人 工皮肤培养完成；上述的培养条件均为37℃，5％CO2环境。
其中，所述的生物支架材料的凝胶溶液可以按以下配制：在4℃条件下， 按质量比将胶原7～10∶壳聚糖0.5～1∶透明质酸2～3∶硫酸软骨素 0.5～1混合，用0.1～0.5M的醋酸将其配制成浓度为6～20mg/ml溶液，冰 浴下紫外线照射后，按其体积加入10％的胎牛血清，再加入DMEM培养基使 其终浓度达到10mg/ml，调节pH值至7.2～7.4，制成凝胶溶液。也可采用 其他凝胶溶液的配方配制。
本发明所制备的双层人工皮肤，具有表层和真皮层双层结构，包含有来 自人体的活细胞，应用到创面后可在创面存活，可直接参与创面的修复；脱 细胞生物衍生材料所形成较致密的表层结构可以有效地减少水分、电解质和 蛋白质由创面的丢失，阻止细菌对受损创面的入侵、繁殖，防止创面感染， 诱导创周的表皮细胞向创面的迁移，有利于上皮的增殖和生长；真皮层与皮 肤真皮成分接近，包含有人体细胞及其合成分泌的细胞外基质和多种细胞生 长因子，可直接修复创面，良好的生物相容性可促进创周细胞的长入、血管 的生成、诱导干细胞向皮肤细胞的分化，可以明显促进创面的愈合。
本发明的双层人工皮肤，具有一定的弹性和韧性，大小厚度可以控制， 生产周期短，无明显免疫排斥反应，具有良好的生物相容性。其在临床应 用的作用有：作为皮肤大面积缺损患者的创面覆盖和供皮区的覆盖；修复 营养不良和感染创面；治疗慢性难愈性溃疡创面；术后创面的覆盖和预防 感染；促进创面肉芽组织、细胞的长入，促进受损皮肤的再生。
本发明制备的双层人工皮肤，与目前已有的皮肤替代产品相比，具有 以下优点：可以促进创面皮肤的再生，增强创面愈合后的皮肤弹性、柔韧 性和机械耐磨性，减少瘢痕增生，控制挛缩，有良好的生物相容性，可提 高人工皮肤移植成功率，并改善愈合质量；表层结构与真皮层嵌合在一起， 结合紧密；材料来源广泛、生产工艺简单；所制备的双层人工皮肤可直接 应用于炎症、溃疡、烧烫伤、医源性等原因造成的皮肤缺损的治疗，针对 不同疾病进行个性化治疗；皮肤的形状大小和厚度能根据具体需求制备。
具体实施方式
实施例1：
步骤1).成纤维细胞的获取：取新生儿切除术后包皮组织，消毒后用磷 酸盐缓冲液(PBS)冲洗，去除皮下脂肪及肌肉层，将皮肤剪成条状，用4U/ml 中性蛋白酶液消化2小时；去除表皮层，将真皮组织剪碎，用625U/ml的胶 原酶液消化2.5小时，收获成纤维细胞培养；将原代培养的成纤维细胞使用 细胞工厂、或旋转瓶培养系统、或生物反应器等方法扩大培养。
步骤2).脱细胞小肠粘膜下层的制备：将新鲜猪空肠用蒸馏水冲洗干净，切 成所需片段，置于含有0.2％过氧乙酸和10％乙醇的水溶液中浸泡消毒1小时， 用PBS液漂洗；机械刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用PBS漂洗干净，获得粘膜 下层；再将其置入1M的NaOH溶液中，于4±2℃条件下浸泡10分钟，用PBS 液漂洗至pH中性；将其置入含有40U/ml DNA酶和10U/ml α-半乳糖苷酶的混 合溶液中浸泡1小时，用PBS液漂洗干净；获得脱细胞小肠粘膜下层；使用制 孔机在脱细胞小肠粘膜下层上均匀制孔，孔径为0.2mm，间距1mm，用有孔的 脱细胞小肠粘膜下层与无孔的脱细胞小肠粘膜下层各取相同大小叠加、压紧 使其紧密结合，干燥后环氧乙烷灭菌，形成双层脱细胞小肠粘膜下层；
步骤3).双层皮肤培养液的配制，各组分按体积百分比包括有：商用最低 必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清10％，碱性成纤 维细胞生长因子10ng/ml、表皮细胞生长因子5ng/ml、胰岛素5ng/ml、 氢化可的松20ng/ml、腺嘌呤0.25mM、转铁蛋白5μg/ml；
步骤4).双层人工皮肤的构建：在4℃条件下，按质量比将胶原10∶壳聚 糖1∶透明质酸2∶硫酸软骨素0.5混合，用0.1M的醋酸将其配制成浓度为 10mg/ml的溶液，冰浴下紫外线照射，按其体积加入10％的胎牛血清，再加 入终浓度为10mg/ml的DMEM培养基，调节pH值为7.2～7.4，成为凝胶溶液； 将制备的双层脱细胞小肠粘膜下层浸透凝胶溶液，在培养皿中37℃环境下预 固化30分钟；将体外培养的成纤维细胞按106个/ml的浓度混合于上述凝胶 溶液中，再按1ml/cm2滴加到预固化的双层脱细胞小肠粘膜下层的有孔面上， 于5％CO2环境中37℃条件下固化30分钟后，置入双层皮肤培养液培养3天 后，再将其置于培养器皿内的培养支架上继续培养5天，期间每天换液，双 层人工皮肤培养完成；上述的培养条件均为37℃，5％CO2环境。
本实例制备的双层人工皮肤包含人成纤维细胞及其所合成、分泌的细胞 外基质和生长因子，便于临床使用，可直接参与创面的修复，适于皮肤组 织缺损的修复材料。
实施例2：
步骤1).成纤维细胞的获取：参照文献Dermal matrix as a carrier for in vivo delivery of human adipose-derived stem cells.Biomaterials. 2008 Apr；29(10)：1431-42.已证明脂肪间充质干细胞可以分化为成纤维细 胞。取手术中废弃的健康脂肪组织，消毒后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗， 剪碎脂肪组织，用625U/ml的胶原酶液消化150分钟，将收获的脂肪间充质 干细胞接种至培养瓶培养；再用细胞工厂、或旋转瓶培养系统、或生物反应 器的方法进行扩大培养。
步骤2).脱细胞真皮制备：将新鲜猪皮肤用蒸馏水冲洗干净，机械去除表 皮层和皮下组织层，切成0.4mm厚度、5cm2大小，置于含有0.2％(v/v)过氧 乙酸和10％(v/v)乙醇的水溶液中浸泡消毒1小时，用PBS漂洗；再置于-80 ℃冷冻半小时，确保材料内外温度达到一致，取出后自然解冻，如此反复冻 融3次，使细胞完全破裂崩解，用PBS溶液清洗；将其置入0.3M的NaOH溶 液中，于4±2℃条件下浸泡30分钟，用PBS漂洗至pH中性；再将其置入含 有30U/ml DNA酶和20U/ml α-半乳糖苷酶的溶液中浸泡1小时，用PBS漂洗 干净，获得脱细胞真皮；使用制孔机在脱细胞真皮上均匀制孔，孔径为0.5mm， 间距3mm，用无孔的脱细胞真皮与有孔的脱细胞真皮各取相同大小的叠加、压 紧使其紧密结合，干燥后环氧乙烷灭菌，形成双层脱细胞真皮材料；
步骤3).双层皮肤培养液的配制，各组分按体积百分比包括有：商用最低 必需培养液DMEM 67.5％、商用培养液F12 22.5％、胎牛血清10％，碱性成纤 维细胞生长因子10ng/ml、表皮细胞生长因子10ng/ml、胰岛素5ng/ml、 氢化可的松20ng/ml、腺嘌呤0.15mM、转铁蛋白5μg/ml；
步骤4).双层人工皮肤的构建：在4℃条件下，按质量比将胶原8∶壳聚 糖1∶透明质酸3∶硫酸软骨素1混合，用0.3M的醋酸将其配制成浓度为 6mg/ml溶液，冰浴下紫外线照射，按其体积加入10％的胎牛血清，再加入 DMEM培养基使其终浓度达到10mg/ml，调节pH值为7.2～7.4，成为凝胶溶 液；将制备的双层脱细胞真皮浸透凝胶溶液后，于37℃环境下预固化；将 体外培养的脂肪间充质干细胞按5×105个/ml的浓度混合于凝胶溶液中，再 将该凝胶溶液按1ml/cm2滴加到预固化的双层脱细胞真皮的有孔面上，置于 5％CO2环境37℃条件下固化后，加入双层皮肤培养液培养2天后，再将其 置于培养器皿内的培养支架上继续培养7天，期间每天换液，双层人工皮 肤培养完成；上述的培养条件均为37℃，5％CO2环境。
本实例制备的双层人工皮肤包含有人脂肪间充质干细胞，可在创面分化 为成纤维细胞直接参与创面的愈合，同时具有脂肪间充质干细胞来源不受 限制、增殖旺盛，促进创面愈合能力强的优点。
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