肝细胞癌标记物
阅读：457发布：2020-05-11
专利汇可以提供肝细胞癌标记物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种使用 肝细胞 癌标记物来诊断肝细胞癌的方法，尤其用于肝硬化和肝细胞癌的区别诊断，该肝细胞癌标记物含有以下式(1)-(7)之任一项表示的糖链。，下面是肝细胞癌标记物专利的具体信息内容。
1.一种含有下式(1)-(7)之任一项表示的糖链的肝细胞癌标记物，
化学式1
化学式2
化学式3
化学式4
化学式5
化学式6
化学式7
2.一种用于受试动物中诊断肝细胞癌的测定方法，其特征在于，测定从所述动物采集的体液中的权利要求1所述的肝细胞癌标记物的量，并以所述肝细胞癌标记物的量或基于所述肝细胞癌标记物的量计算出的值为指标。
3.如权利要求2所述的用于诊断肝细胞癌的测定方法，其中，所述测定权利要求1所述的肝细胞癌标记物的量的步骤包括：从所述体液中，使用与结合在作为所述标记物的糖链上的蛋白质特异性结合的物质，预先提取含有所述蛋白质和糖链的复合物。
4.一种在动物中进行的肝细胞癌的预防或治疗效果的评价方法，其特征在于，将肝细胞癌预防或治疗药物给予有必要进行肝细胞癌预防或治疗的动物后，测定从所述动物采集的体液中的权利要求1所述的肝细胞癌标记物的量，并以所述肝细胞癌标记物的量或基于所述肝细胞癌标记物的量计算出的值为指标。
5.如权利要求4所述的肝细胞癌的预防或治疗效果的评价方法，其中，所述测定权利要求1所述的肝细胞癌标记物的量的步骤包括：从所述体液中，使用与结合在作为所述标记物的糖链上的蛋白质特异性结合的物质，预先提取含有所述蛋白质和糖链的复合物。
6.一种候选药物化合物的肝细胞癌的预防或治疗效果的评价方法，其特征在于，将所述候选药物化合物给予有必要进行肝细胞癌的预防或治疗的动物后，测定从所述动物采集的体液中的权利要求1所述的肝细胞癌标记物的量，并以所述肝细胞癌标记物的量或基于所述肝细胞癌标记物的量计算出的值为指标。
7.如权利要求6所述的候选药物化合物的肝细胞癌的预防或治疗效果的评价方法，其中，所述测定权利要求1所述的肝细胞癌标记物的量的步骤包括：从所述体液中，使用与结合在作为所述标记物的糖链上的蛋白质特异性结合的物质，预先提取含有所述蛋白质和糖链的复合物。
8.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其特征在于，基于所述肝细胞癌标记物的量计算出的值是使用糖链与所述肝细胞癌标记物的量的比值计算出的值，所述糖链是其在样品中的含量在健康动物与患有肝细胞癌的动物间没有显著差异的糖链。
9.一种用于肝细胞癌诊断、肝细胞癌治疗效果评价或候选药物化合物的肝细胞癌预防或治疗效果评价的试剂盒，其中，所述试剂盒含有能够测定权利要求1所述的任意肝细胞癌标记物的量的试剂。
肝细胞癌标记物
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于在受试动物中诊断肝细胞癌的肝细胞癌标记物以及使用该标记物区别诊断肝硬化和肝细胞癌的方法。
背景技术
[0003] 有报道表明，在复杂的糖链结构内，即使只有一个糖存在，结合有糖链的蛋白质所具有的功能也会改变。例如，血清中大量存在的免疫球蛋白，在其Fc区域具有N-连接型糖链的结合位点。有报道表明，在该结合位点结合的糖链结构中具有在还原末端的GlcNAc处连接有岩藻糖的糖链结构的免疫球蛋白，与具有未连接岩藻糖的糖链结构的免疫球蛋白相比，其具有的抗体依赖性细胞毒性相差100倍以上。
[0004] 然而，纯化糖蛋白糖链需要大量的时间，糖链结构的系统性分析方法尚不成熟，因此，尚不能简单、灵敏并且定量地分析糖蛋白糖链。
[0005] 在这种情况下，本发明者之一的池中等人，通过使用HPLC系统的方法，发现一种具有一个岩藻糖基化外臂的三天线型三半乳糖基化结构(triantennary trigalactosylated structure with one outer arm fucosylation)(下文中称为A3G3Fo)的糖链，其在肺癌患者血清中有所增加(非专利文献1、2)。此外，在专利文献1中，基于A3G3Fo检测肺癌的癌症检测法以及用于该方法中的癌症检测物质已被公开。
[0007] 已知的是，肝脏合成和分泌血液中几乎所有的糖蛋白，所以，当体内引起炎症或肝脏本身的功能发生损害时，就会观察到血清中糖蛋白的表达发生变化。目前，临床上使用的肝细胞癌标记物有甲胎蛋白(AFP)和维生素K缺乏诱导的蛋白II(protein induced vitamin K II)(PIVKAII)，发现不仅是肝细胞癌的情况下标记物会上升，炎症反应等情况下标记物也有所上升。而且，早期肝细胞癌中，标记物经常不上升。即，这些标记物用于检测肝细胞癌的准确度和特异性方面并不够。其中，就AFP而言，检测的是具有岩藻糖基化糖链的AFP，已知可以提高肝细胞癌的诊断准确度(特异性)，但是，至今尚不存在能对肝硬化和肝细胞癌进行准确的区别诊断的标记物。
[0008] 近年来的一系列研究中有报道称，在肝细胞癌患者的血清中和肝脏细胞的前体细胞中，合成糖链的糖基转移酶的活性提高，表达出正常成熟肝脏细胞中未发现的糖链结构。但是，尚未发现能对肝硬化和肝细胞癌进行准确的区别诊断的作为指标的分子。
[0009] 在这样的背景下，期待一种检测方法来分析肝病患者的血清中糖蛋白糖链的异常，进而区分肝硬化和肝细胞癌，并且准确地诊断出早期肝细胞癌。
[0010] 现有技术文献
[0011] 专利文献
[0012] 专利文献1：特开2001-289860号公报
[0013] 非专利文献
[0014] 非专利文献1：J.Biochem.129，537-542，2001
[0015] 非专利文献2：Anal.Biochem.267，336-343，1996
发明内容
[0016] 本发明的目的是提供一种生物标记物以及使用该标记物来诊断肝细胞癌的方法等，所述生物标记物用于诊断受试动物中的肝细胞癌，尤其是用于肝硬化和肝细胞癌的区别诊断。
[0017] 本发明人等认真研究解决上述问题，结果发现，在检测受试者血清中二天线型的N-连接型糖链(尤其是中性糖链型M5A、A2G0、A2G0B、A2G1(6)FB、A2G2B；脱唾液酸糖链型A2G2B和A2G2Fo2)时，肝细胞癌患者血清中含有的量与健康者和肝硬化患者血清中含有的量相比有明显的差别。此外，发现以中性糖链型M5、A2G0B、A2G1(6)FB和A2G2B在受试者血清中的量为指标时，有可能诊断出按TNM分类为I期的早期肝细胞癌患者，可以区别诊断肝硬化和肝细胞癌。而且，这些肝细胞癌标记物可以检测出以往的肝细胞癌标记物AFP和PIVKAII无法检测出的早期肝细胞癌，从而完成本发明。
[0018] 本发明提供如下内容。
[0019] (1)一种含有下式(1)-(7)之任一项表示的糖链的肝细胞癌标记物，[0020] 化学式1
[0021]
[0022] 化学式2
[0023]
[0024] 化学式3
[0025]
[0026] 化学式4
[0027]
[0028] 化学式5
[0029]
[0030] 化学式6
[0031]
[0032] 化学式7
[0033]
[0034] (2)一种用于受试动物中诊断肝细胞癌的测定方法，其特征在于，测定从所述动物采集的体液中的上述(1)所述的肝细胞癌标记物的量，并以所述肝细胞癌标记物的量或基于所述肝细胞癌标记物的量计算出的值为指标。
[0035] (3)如上述(2)所述的用于诊断肝细胞癌的测定方法，其中，所述测定上述(1)所述的肝细胞癌标记物的量的步骤包括：从所述体液中，使用与结合在作为所述标记物的糖链上的蛋白质特异性结合的物质，预先提取含有所述蛋白质和糖链的复合物。
[0036] (4)一种在动物中进行的肝细胞癌的预防或治疗效果的评价方法，其特征在于，将肝细胞癌预防或治疗药物给予有必要进行肝细胞癌预防或治疗的动物后，测定从所述动物采集的体液中的上述(1)所述的肝细胞癌标记物的量，并以所述肝细胞癌标记物的量或基于所述肝细胞癌标记物的量计算出的值为指标。
[0037] (5)如上述(4)所述的肝细胞癌的预防或治疗效果的评价方法，其中，测定上述(1)所述的肝细胞癌标记物的量的步骤包括：从所述体液中，使用与结合在作为所述标记物的糖链上的蛋白质特异性结合的物质，预先提取含有所述蛋白质和糖链的复合物。
[0038] (6)一种候选药物化合物的肝细胞癌的预防或治疗效果的评价方法，其特征在于，将所述候选药物化合物给予有必要进行肝细胞癌的预防或治疗的动物后，测定从所述动物采集的体液中的上述(1)所述的肝细胞癌标记物的量，并以所述肝细胞癌标记物的量或基于所述肝细胞癌标记物的量计算出的值为指标。
[0039] (7)如上述(6)所述的候选药物化合物的肝细胞癌的预防或治疗效果的评价方法，其中，测定上述(1)所述的肝细胞癌标记物的量的步骤包括：从所述体液中，使用与结合在作为所述标记物的糖链上的蛋白质特异性结合的物质，预先提取含有所述蛋白质和糖链的复合物。
[0040] (8)如上述(2)-(7)中任一项所述的方法，其特征在于，基于所述肝细胞癌标记物的量计算出的值是使用糖链与所述肝细胞癌标记物的量的比值计算出的值，所述糖链是其在样品中的含量在健康动物与患有肝细胞癌的动物间没有显著差异的糖链。
[0043] 图1表示标准糖链的二维图。
[0044] 图2-1为绘制各种疾病患者血清中本发明的肝细胞癌标记物(A2G0B)存在量值的图。
[0045] 图2-2为绘制各种疾病患者血清中本发明的肝细胞癌标记物(A2G0)存在量值的图。
[0046] 图2-3为绘制各种疾病患者血清中本发明的肝细胞癌标记物(M5A)存在量值的图。
[0047] 图2-4为绘制各种疾病患者血清中本发明的肝细胞癌标记物(A2G1(6)FB)存在量值的图。
[0048] 图2-5为绘制各种疾病患者血清中本发明的肝细胞癌标记物(A2G2B)存在量值的图。
[0049] 图2-6为绘制各种疾病患者血清中本发明的肝细胞癌标记物(脱唾液酸A2G2Fo2)存在量值的图。
[0050] 图2-7为绘制各种疾病患者血清中本发明的肝细胞癌标记物(脱唾液酸A2G2B)存在量值的图。
[0051] 图3为绘制肝细胞癌样品中AFP的诊疗检测值(纵轴)、A2G1(6)FB的诊疗检测值(横轴)的图。
[0052] 图4为绘制肝细胞癌样品中PIVKAII的诊疗检测值(纵轴)、A2G1(6)FB的诊疗检测值(横轴)的图。
具体实施方式
[0053] 肝细胞癌标记物
[0054] 本发明的肝细胞癌标记物至少含有上述化学结构式(1)-(7)之任一项表示的糖链。
[0055] 式(1)表示的糖链，下文中称为“A2G2B”。
[0056] 式(2)表示的糖链，下文中称为“A2G0B”。
[0057] 式(3)表示的糖链，下文中称为“A2G1(6)FB”。
[0058] 式(4)表示的糖链，下文中称为“A2G0”。
[0059] 式(5)表示的糖链，下文中称为“M5A”。
[0061] 式(7)表示的糖链，下文中称为“唾液酸化的A2G2B”。该糖链在血清中含有唾液酸作为侧链，但也包括用已知的方法将其除去的脱唾液酸型(下文中称为“脱唾液酸A2G2B”)。
[0062] 本发明的肝细胞癌标记物包含肝细胞癌患者血清中富含的糖蛋白的糖链部分，除了上述的糖链外，本发明的肝细胞癌标记物也包括在该糖链上结合有肽的物质。
[0063] 诊断肝细胞癌的方法
[0064] 本发明进一步包括一种诊断肝细胞癌的方法，测定所述肝细胞癌标记物的量，并以该肝细胞癌标记物的量或基于所述肝细胞癌标记物的量计算出的值为指标。作为本测定法的样品，使用从可能患有肝细胞癌的受试动物采集的体液。作为体液，使用血液、淋巴液、脊髓液、尿及它们的处理物等，优选使用血液，更优选使用分离该血液所得到的血清。此外，作为肝细胞癌诊断方法的对象，作为受试动物优选为人类。
[0065] 为了测定该样品中作为本发明肝细胞癌标记物的糖链(下文中称为“标记物糖链”)的含量，将该样品中含有的标记物糖链从与之结合的蛋白质切离是必要的。从蛋白质切离标记物糖链的方法列举本身公知的通常使用的方法，具体举例为肼分解法、酶(N-聚糖酶)消化法等。其中，优选定量地切断糖链的肼分解法，例如，优选使用Y.Otake等，J Biochem(Tokyo)129(2001)537-42记载的方法等。本文中，在使用肼分解法的情况下，通过肼分解而脱离的乙酰基有必要重新乙酰化。具体来说，例如，使用K.Tanabe等，Anal.Biochem.348(2006)324-6记载的方法等。此外，对于唾液酸化糖链的情况，可以使用神经氨酸酶等唾液酸裂解酶将唾液酸切断，再使用离子交换色谱法等纯化。
[0066] 在将上述蛋白质和标记物糖链切离前，使用与结合在标记物糖链上的蛋白质特异性结合的物质，具体地使用抗体等，从该样品取得的体液中提取含有所述蛋白质和糖链的复合物，在之后的糖链结构分析时可更为高效地进行，因此是优选的。用与该蛋白质特异性结合的物质进行提取时，可以使用本身已知的通用的方法。作为结合在本发明的标记物糖链上的蛋白质，例如列举表1记载的蛋白质。
[0067]
[0068] 表1
[0069]
[0070] 如有必要，对游离出的标记物糖链进行标记。对标记方法没有特别限制，如果使用质谱分析仪器，特别优选使用提高离子化效率的TMAPA(三甲基(4-氨苯基)氯化铵)；如果使用荧光检测器，优选使用2-氨基吡啶。对于衍生化方法而言，如果使用TMAPA，采用M.Okamoto等，Rapid Commun Mass Spectrom 9(1995)641-3记载的方法；如果使用2-氨基吡啶，采用Y.Otake等，J Biochem(Tokyo)129(2001)537-42记载的方法等。
[0071] 对作为肝细胞癌标记物的糖链的检测及含量测定方法，只要是能检出和测定本发明的标记物糖链的方法，就没有特别限制，可使用的方法为正相和反相高效液相色谱、质谱分析、核磁共振和使用对本发明的标记物糖链具有特异性的抗体或凝集素的方法。本发明的肝细胞癌标记物的糖链为N-连接型糖链，可以通过简便、高度准确且以定量指标检测出N-连接型糖链之一的平分型(bisecting type)、路易斯X型糖链结构的检测方法检出。本发明中，平分型糖链结构是在二天线型N-连接型糖链结构中含有的三甘露糖基化核(trimannosyl core)结构的甘露糖(Man)残基的4位上结合有GlcNAc的结构。本发明中，路易斯X型糖链结构是在N-连接型糖链结构的非还原末端的GlcNAc残基的3位上具有岩藻糖的结构。
[0072] 将本发明的标记物糖链与血清中存在的类似的糖链进行分离是十分困难的，因此，优选使用液相色谱和质谱分析仪联用进行检测、测定的方法(下文称为“LC-MS法”)或使用液相色谱检测、测定的方法。此外，糖链的结构可以用任何方法分析，但具体而言，例如利用正相(或反相)液相色谱(下文称为“正相HPLC”)由内标计算出市售甘露糖标准糖链的甘露糖标准糖链色谱峰，利用反相(或正相)液相色谱(下文称为“反相HPLC”)由内标计算出市售半乳糖标准糖链的半乳糖标准糖链色谱峰，制成甘露糖标准糖链色谱峰和半乳糖标准糖链色谱峰的二维图(如图1所示)，有望使用该图来进行鉴定。
[0073] 作为使用LC-MS法的本发明的标记物糖链的测定方法，例如使用以下详述的方法。只要液相色谱可以稳定地输送液体，对其没有特别的限制。除ESI以外，离子化法可选择APCI等，但最优选为ESI。质谱分析仪除四极杆型以外，可选择TOF型、离子阱型、磁场型、傅立叶变换型的任一种，但特别优选为定量性高的四极杆型、灵敏度高的TOF型和离子阱型。
[0074] 只要可以分离多种糖链，使用的色谱柱可以是正相柱、反相柱和吸附柱中任一类型，但优选为反相类的C8、C18、C30柱，更优选为C30柱。对色谱柱尺寸没有特别限定，优选流速小、灵敏度提高的内径为2.1mm以下的色谱柱，更优选为内径为1.5mm以下的色谱柱。
[0075] 根据色谱柱的性质选择最优的洗脱液，但使用C30柱时，例如使用洗脱液A为5mM醋酸铵水溶液(pH＝4)、洗脱液B为90％5mM醋酸铵水溶液(pH＝4)+10％乙腈的混合液，进样前，需要用B溶液0-30％(相当于A溶液100-70％；下文省略A溶液浓度)的溶液充分平衡。平衡时B溶液浓度优选为10-25％，特别优选为15-20％。
[0076] 注入约20μL样品溶液，进样的同时，作为洗脱液组成，利用约50分钟的时间，将B溶液从约20％线性变化至约50％。进一步地，从50分钟到60分钟，可保持B溶液组成约50％，梯度洗脱的条件受制于色谱柱的种类，因此不作限定。对质谱分析仪的测定条件，只要在可以分离本发明的标记物糖链的范围内，就没有其他特别的限定，例如：毛细管电压(离子化电压)为4000V；雾化器气体压力为45psi；干燥气体流量和温度分别为10L/分钟、350℃，可以良好地进行检测。
[0077] 检测方法在使用四极杆型质谱分析仪的情况下，最优选SIM(选择离子监测，Selective Ion Monitoring)，这种情况下的检测离子，设定为本发明的任一标记物糖链的离子，或在作为内标使用其他糖链的情况下，设定为其m/z等的离子。
[0078] 在TOF型、离子阱型的情况下，可以是扫描模式，在这种情况下，优选设定质量范围为400-4000。在上述分析条件下，在以下的保留时间和m/z检出标记物糖链，但这些参数根据选择的色谱柱和洗脱液而改变，因此没有特别的限定。此外，检测离子不限定为母离子，可以是碎片离子、负载离子、二聚体离子等相关离子均可。
[0079] 在使用液相色谱法进行检测和测量的情况下，只要液相色谱可以稳定地输送液体，对其没有特别的限制。具体而言，列举例如下述方法：在正相HPLC，使用Asahipak NH2P-50 4.6mm I.D.×250mm(shodex公司制造)的色谱柱，流速为0.6ml/min；柱温为30℃；溶剂A为93％乙腈、0.009％醋酸，使用25％氨水调整pH至6.8的溶液；溶剂B为
20％乙腈、0.009％醋酸，使用25％氨水调整pH至6.8的溶液；开始时，溶剂A∶溶剂B的比为75∶25，在样品进样后180分钟的时间段内，溶剂B的比例线性增加至42％；使用Prominence(Shimadzu公司制造)进行HPLC分析，使用LC工作站(Shimadzu公司制造)对各个色谱峰进行定量。
20％乙腈、0.009％醋酸，使用25％氨水调整pH至6.8的溶液；开始时，溶剂A∶溶剂B的比为75∶25，在样品进样后180分钟的时间段内，溶剂B的比例线性增加至42％；使用Prominence(Shimadzu公司制造)进行HPLC分析，使用LC工作站(Shimadzu公司制造)对各个色谱峰进行定量。
[0080] 此外，优选以下方法：以标准糖链(例如，PA-糖链M2A、M3B、M4B、M5A、M6B、M7A、M8A、M9A；TaKaRa公司制造等)的流出时间作为内标(甘露糖单元，MU)，算出流出的荧光标记糖链的MU，对根据甘露糖单元分出的各个峰，就各样品进行峰面积的定量分析来计算糖链含量。
[0081] 根据上述的方法检测出标记物糖链的含量或基于该肝细胞癌标记物的量计算出的值，以此为指标可判断出提供该样品的患者患有肝细胞癌的可能性。本发明的肝细胞癌的诊断法中，没有要求测得的标记物糖链的含量一定是绝对量，可以是按上述方法等检测出的各个标记物糖链固有的色谱峰进行数值化求出的值。作为具体的方法，有对检测出的各峰的高度进行数值化的方法和对峰面积进行数值化的方法等；液相色谱法为具有定量性的测定方法，因此，没有限定为其中的任何一种，但优选为LC-MS，其对峰面积进行数值化的方法准确度高。此外，可以使用特异性识别本发明的标记物糖链的凝集素或抗体，通过通常使用的方法，可以测定出该标记物糖链的存在量。用于检测本发明的肝细胞癌检测物质的凝集素是一种具有对N-连接型糖链中的平分型糖链结构具有特异性结合活性的物质。在下文中，由此求出的色谱峰数值化的值称为“峰强度”。
[0082] 本发明的肝细胞癌的诊断法中，优选使用上述以标记物糖链的量作为指标的方法和基于上述的标记物糖链的量计算出的值作为指标的方法。作为具体的计算方法，只要是使本发明测定法中作为指标的数值经过校正后正确反映受试者体内状态的方法，就可以是任意的方法。例如，使用待处理的血清液量的校正方法或待处理的蛋白重量的校正方法等。而且，基于随疾病不变化或者变化小的糖链(即，体液中的含量在健康者和肝细胞癌患者间没有显著差异的糖链)的量(下文中称为内标)，根据该糖链的量与标记物糖链量的比来计算的方法也有效。
[0083] 基于上述标记物糖链的量计算出的值是在样品使用血清的情况下，可以使用上述标记物糖链的量或经内标校正过的值。本文中，作为内标，例如列举其在样品中的含量在健康动物和患有肝细胞癌的动物间没有显著差异的糖链等。
[0084] 本发明的肝细胞癌标记物在肝硬化患者和肝细胞癌患者的血清中的存在量有显著的差异，在区别诊断两者时优选使用。肝硬化的特征是在肝脏中形成大范围的结节、大范围的纤维化、肝细胞坏死、肝脏内的血流现象、胆红素分泌降低和黄疸等。由此，肝硬化的疾病状态下，观察到腹腔积水、食道静脉曲张和肝性脑病等并发症。本发明中所述的肝硬化是指虽然由于感染了HCV的状态观察到大范围的纤维化，但用已知的肝细胞癌标记物和影像诊断(超声，US；计算机断层成像，CT；磁共振成像，MRI)却无法确认癌症的存在且无法观察到肝硬化伴随的并发症的状态。
[0085] 本发明的标记物糖链在健康者中含量少，在肝细胞癌患者中含量显著增多，因此该肝细胞癌标记物的含量或基于该肝细胞癌标记物的量计算出的值比健康者的值大时，可以诊断其受试者肝细胞癌发病的可能性高。此外，本发明的标记物糖链在肝细胞癌患者中的含量也比肝硬化患者中的含量高，因此，可以使用本发明的标记物糖链，与肝硬化相区别进而诊断肝细胞癌。
[0086] 进一步地，观察到本发明的糖链标记物中，M5A、A2G0B、A2G1(6)FB和A2G2B在早期肝细胞癌(TNM分类中的I期)患者与健康者间也具有显著的差异。因此，检测出这些标记物糖链，可以诊断至今为止报道的肝细胞癌标记物均无法检测出的早期肝细胞癌。
[0087] 而且，随着肝细胞癌分期的进展，本发明的糖链标记物含量有增加的趋势(图2)，因此，以本发明的肝细胞癌标记物的含量或基于该肝细胞癌标记物的量计算出的值为指标，还能辨别肝细胞癌的进展程度。
[0089] 肝细胞癌治疗或预防药物的评价方法
[0090] 此外，将肝细胞癌预防或治疗药物给予有必要进行肝细胞癌预防或治疗的动物后，测定从该动物采集的体液中所述肝细胞癌标记物的含量，并以该肝细胞癌标记物的含量或基于该肝细胞癌标记物的量计算出的值为指标，可以在该动物中进行肝细胞癌预防或治疗效果的评价。
[0091] 例如，在肝细胞癌预防或治疗药物给药前与给药后数天-数月的时间点，比较上述肝细胞癌标记物的含量或基于该肝细胞癌标记物的量计算出的值，若后者的肝细胞癌标记物的含量或基于该肝细胞癌标记物的量计算出的值低的话，可以判断所述药物具有预防或治疗效果。
[0092] 作为评价对象的动物优选为人类。
[0093] 作为肝细胞癌治疗药物，例如，替加氟(通用名为尿嘧啶)、表柔比星(通用名)、丝裂霉素C(通用名)、氟尿嘧啶(通用名)、环磷酰胺(通用名)、米托蒽醌(通用名)等。
[0094] 肝细胞癌治疗或预防药物候选化合物的评价方法
[0095] 进一步地，将肝细胞癌预防或治疗药物的候选化合物给予有必要进行肝细胞癌预防或治疗的动物后，测定从该动物采集的体液中所述肝细胞癌标记物的量，并以该肝细胞癌标记物的量或基于该肝细胞癌标记物的量计算出的值为指标，可以对该候选化合物的肝细胞癌预防或治疗效果进行评价。
[0096] 例如，在候选化合物给药前与给药后数天-数月的时间点，比较上述肝细胞癌标记物的含量或基于该肝细胞癌标记物的量计算出的值，若后者的肝细胞癌标记物的含量或基于该肝细胞癌标记物的量计算出的值低的话，可以判断该化合物是肝细胞癌预防药或治疗药的有潜力的候选物质。
[0097] 作为候选化合物，可以为低分子化合物，也可以为肽或蛋白质等。此外，作为评价对象的动物优选为人类。
[0098] 用于肝细胞癌诊断、肝细胞癌治疗效果评价或候选药物化合物的肝细胞癌预防或治疗效果评价的试剂盒
[0099] 本发明涉及一种用于肝细胞癌诊断、肝细胞癌治疗效果评价或候选药物化合物的肝细胞癌预防或治疗效果评价的试剂盒，其中，所述试剂盒含有能够测定一种以上的本发明肝细胞癌标记物的试剂。这样的试剂包括使用正相或反相高效液相色谱、质谱分析和核磁共振等中作为标准物质使用的上述糖链、或特异性识别本发明的标记物糖链的抗体或凝集素等。特异性识别本发明的标记物糖链的抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体以及这些抗体的片段中的任一种，可以将所述标记物糖链作为抗原，采用已知的方法获得这些抗体。另外，特异性识别本发明标记物糖链的凝集素是上述那些被使用的物质。
[0100] 实施例
[0101] 下面通过实施例更加具体地描述本发明。然而应当理解本发明并不限于这些实施例。
[0102] 实施例1肝细胞癌标记物的确定
[0103] (1)测量样品血清中的标记物糖链的存在量
[0104] 以在临床上诊断为患有肝细胞癌的患者(下文中，称为肝细胞癌)、在临床上诊断为伴有HCV感染的肝硬化患者(下文中，称为肝硬化)以及没有任何肝疾病症状的健康者(下文中，称为健康者)为对象，获得血清。具体来说，使用69例健康者、7例慢性肝炎、8例肝硬化、55例肝细胞癌患者的血清，对糖蛋白糖链进行分析。按表2记载那样，将55例肝细胞癌患者根据进展状态分类为4期(TNM分类)。69例健康者血清是由综合医学研究所得到知情同意并收集。肝脏疾病患者血清是由香川大学医学部得到知情同意并收集。样品的详细信息如表2所示。
[0105] 表2
[0106]
[0107] 作为样品的前处理，在采取的血清中，加入9倍量的-20℃丙酮，充分混合。静置片刻后，离心，弃上清。冷冻干燥沉淀物，向干燥质量为2mg的样品中加入无水肼，在100℃，利用10小时的时间进行肼分解，从蛋白质中分出糖链。其次，使用特开2005-308697号公报以及Anal.Biochem.384，324-326，2006记载方法的一部分，使用固相提取型石墨碳柱(GL science公司制造)，对蒸馏除去肼和重新乙酰化后的糖链进行纯化。
[0108] 用2-氨基吡啶氨基化(2-氨基吡啶；PA，Nacarai tesque公司制造)对纯化的糖链进行荧光标记。为了除去未反应的PA，使液体通过固相型纤维柱。固相型纤维柱所使用的清洗溶液为由66.7％1-丁醇、16.7％乙醇和100mM醋酸铵制成的溶液；洗脱荧光标记糖链的洗脱溶液为由33％乙醇和15mM碳酸氢铵制成的溶液。从得到的荧光标记血清糖链的混合液中，使用离子交换色谱法(DE52、Whatman公司制造)分离血清中存在的中性糖链。此时，使用的溶液A是用25％氨水将纯净水调整pH至9.0后的溶液，溶液B是用25％氨水将500mM醋酸铵溶液调整pH至9.0后的溶液。
[0109] 另一方面，与此同时，取等量的血清糖链的混合液，在37℃条件下，使用神经氨酸酶(神经氨酸酶，产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)，Nacarai tesque公司制造)处理12小时后，进行离子交换色谱，仅对切断位于侧链上的唾液酸后的脱唾液酸糖链进行纯化。
[0110] 对上述荧光标记的中性糖链组和脱唾液酸糖链组，利用正相高效液相色谱法(正相HPLC)、使用荧光检测器检测糖链的量。在正相HPLC中，使用Asahipak NH2P-50 4.6mm I.D.×250mm(shodex公司制造)的色谱柱，流速为0.6ml/min；柱温为30℃；溶剂A为93％乙腈、0.009％醋酸、使用25％氨水调整pH至6.8的溶液；溶剂B为20％乙腈、0.009％醋酸、使用25％氨水调整pH至6.8的溶液；开始时，溶剂A∶溶剂B的比为75∶25，在样品进样后180分钟的时间段内，溶剂B的比例线性增加至42％；使用Prominence(Shimadzu公司制造)进行HPLC分析，使用LC工作站(Shimadzu公司制造)对各个色谱峰进行定量。
[0111] 此外，以标准糖链(例如，PA-糖链M2A、M3B、M4B、M5A、M6B、M7A、M8A、M9A；TaKaRa公司制造)的流出时间作为内标(甘露糖单元，MU)，算出流出的荧光标记糖链的MU，对根据甘露糖单元分出的各个峰，就各样品进行峰面积的定量分析。
[0112] 糖链结构的鉴定是利用MU和GU的二维示意图(图1)，利用正相HPLC和反相HPLC测定市售标准糖链，正相HPLC的内标计算出MU，反相HPLC的内标(葡萄糖单元，GU3-22，TaKaRa公司制造)算出GU。
[0113] 在 反 相 HPLC中，使 用Develosil C30(Nomura Kagakus公 司 制 造 )4.6mm I.D.×150mm的色谱柱；流速0.5ml/min；柱温30℃；溶剂A为调整到5mM醋酸铵(pH 4.0)的溶液；溶剂B是调整到10％乙腈、5mM醋酸铵(pH 4.0)的溶液；开始时，溶剂A∶溶剂B的比为75∶25。在样品进样后60分钟的时间段内，溶剂B的比例线性增加至42％。
[0114] 表3表示受测定和鉴定的健康者(A)、肝硬化(B)、肝细胞癌(C)的N-连接型糖链所鉴定的糖链结构和存在量。显而易见，如表3所示，观察到：在健康者血清和肝硬化血清中，糖链的存在量少，在肝细胞癌血清中的含量非常多。此外，除肝细胞癌、肝硬化以外，在肝炎、伴随并发症的肝硬化、胃癌、胰腺癌、消化系统疾病、腺瘤或息肉以及中枢神经系统疾病的患者中也进行了同样的测定，测定的值绘制于图2。
[0115] 表3
[0116]
[0117] (2)检测标记物糖链
[0118] 对通过上述糖蛋白糖链分析确定的检测肝细胞癌的标记物糖链，示出其灵敏度、特异性以及阳性预测值(Positive Predictive Value；PPV)的值。灵敏度表示患有肝细胞癌的样品中各标记物的阳性率。特异性表示未患肝细胞癌的样品的各标记物的阴性率。PPV表示各标记物为阳性的情况下患有肝细胞癌的概率。在这种情况下，使用的临界值为高于肝硬化患者血清中观察到的各标记物存在量的平均值的1.2倍。
[0119] 如表4所示，中性糖链A2G0B的灵敏度为91％、特异性为96％以及PPV为96％。此外，中性糖链A2G1(6)FB的灵敏度为89％、特异性为96％以及PPV为94％。
[0120] 表4
[0121]
[0122] 另 一 方 面，如 J.Gastroenterol.Hepatol.14.436-445，1999 以 及 Cancer Research 53，5419-5423，1993记载的那样，报道已知的肝细胞癌标记物AFP的灵敏度为70％、特异性70％(临界值：20ng/ml)；AFP-L3的灵敏度为70％、特异性为90％以及PPV为
77％。而且，近年来，显示作为肝细胞癌标记物的N-连接型糖链之一的分支α(1，3)-岩藻糖化三天线型聚糖(a branch alpha(1，3)-fucosylated triantennary glycan)是在肝细胞癌患者血清中增多的肝细胞癌标记物(Hepatology 46，1426-1435，2008)，灵敏度为
57％、特异性为88％、PPV为81％(限于HBV为阳性的肝硬化和肝细胞癌)。
77％。而且，近年来，显示作为肝细胞癌标记物的N-连接型糖链之一的分支α(1，3)-岩藻糖化三天线型聚糖(a branch alpha(1，3)-fucosylated triantennary glycan)是在肝细胞癌患者血清中增多的肝细胞癌标记物(Hepatology 46，1426-1435，2008)，灵敏度为
57％、特异性为88％、PPV为81％(限于HBV为阳性的肝硬化和肝细胞癌)。
[0123] 其次，表5显示的是使用学生t检验(P值)分析健康者与肝硬化、肝硬化与肝细胞癌、肝硬化与进展程度不同的肝细胞癌之间各糖链标记物变化的显著性的结果。表中，括号内表示对照组，0.05以下的P值判断其具有生物学上的显著差异。
[0124] 表5
[0125]
[0126] 从表5显而易见的是，本发明中性糖链的各标记物糖链M5A、A2G0、A2G0B、A2G1(6)FB、A2G2B以及脱唾液酸A2G2B、脱唾液酸A2G2Fo2在健康者和肝细胞癌患者之间其数值都具有显著差异。此外，本发明的标记物糖链A2G1(6)FB和A2G2B在肝硬化和健康者之间也具有显著差异，例如，通过定期性检查从HCV感染向肝硬化、肝细胞癌的病情进展进行追踪时，具有有效利用的可能性。
[0127] 特别是，本发明的糖链标记物中，观察到中性糖链M5A、A2G0B、A2G1(6)FB、A2G2B在早期肝细胞癌(I期)患者和健康者之间也具有显著差异。因此，通过检测上述这些标记物糖链，可以诊断至今为止报道的肝细胞癌标记物均无法检测出的早期肝细胞癌。
[0128] J.Proteome Res.8，595-602，2009和特表2008-541060号公报公开报道了作为肝细胞癌标记物的岩藻糖基化血红素结合蛋白。岩藻糖基化血红素结合蛋白作为肝细胞癌标记物，其灵敏度为92％、特异性为92％、PPV为100％。但是，检测岩藻糖基化血红素结合蛋白是否可以准确地诊断早期肝细胞癌(TNM分类的I期)尚不明确。另一方面，本发明的肝细胞癌标记物M5、A2G0B、A2G1(6)FB和A2G2B在与上述文献中等同的患者组(所有肝细胞癌)中也具有同等程度或更高程度的显著性。
[0129] (3)与现有标记物的比较
[0130] 上述(1)中得到的从诊断为肝细胞癌患者所得的样品中，现有的肝细胞癌标记物AFP为阴性(＜30ng/ml)(21/55样品)、同样现有的肝细胞癌标记物的PIVKAII为阴性(＜40mAU/ml)(18/55样品)、AFP阴性且PIVKAII为阴性(11/55样品)的样品中，本发明的标记物糖链的肝细胞癌检出率如表6所示(使用的临界值为高于肝硬化患者血清中的糖链标记物表达量的平均值的1.2倍)。AFP和PIVKAII的值是委托其他的检验机构检验的。检验方法是常用的EIA法。
[0131] 表6
[0132]
[0133] 从表6显而易见的是，对于AFP阴性的肝细胞癌样品中的90％(19/21样品)，本发明的糖链标记物中的A2G0B可以大于临界值的值而检出。另外，对于PIVKAII阴性的肝细胞癌样品中的94％(17/18样品)，本发明的糖链标记物中的A2G0B可以大于临界值的值而检出。此外，对于AFP阴性且PIVKAII阴性的肝细胞癌样品中(11/56样品)有91％(10/11样品)，本发明的糖链标记物中的A2G0B可以大于临界值的值而检出。肝细胞癌血清中的糖链标记物的表达量和现有的肝细胞癌标记物AFP和PIVKAII值之间没有相关性(图3和图4)。
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