一种扩增人类PKD1基因1-33号外显子的PCR引物组和扩增
体系
技术领域
[0001] 本
发明涉及遗传病基因检测领域，更具体地，涉及一种可以区分成人型多囊肾治病基因PKD1基因和其假基因的引物组和扩增体系。
背景技术
[0002] 常
染色体显性多囊肾病(ADPKD)通常是一种迟发性多系统
疾病，发病率在 1/400-1/1000，患者常在30-50岁双侧肾脏出现大小不一的囊泡，其特征在于：双侧肾囊肿，还会涉及包括肝脏、精囊、胰腺和蛛网膜在内的其他器官囊肿；血管异常包括颅内
动脉瘤，主动脉根部扩张和胸主动脉的异常；二尖瓣脱垂和腹壁疝气。肾脏方面的表现包括
高血压，肾痛和肾功能不全。大约有50％的ADPKD 患者在60岁后发展为终末期肾病(ESRD)。肝囊肿是ADPKD最常见的肾外表现，随着年龄的增长而增加，并可能被超声探测所忽略。动脉瘤或蛛网膜下腔出血患者的颅内动脉瘤患病率(22％)高于没有这种家族史的患者(6％)。多达25％的受累个体会发生二尖瓣脱垂，是最常见的瓣膜异常。不同严重程度的肾脏疾病和其他肾外表现甚至发生在同一家庭内。
[0003] ADPKD的诊断主要通过肾的影像学来确定。在患有ADPKD的个体中，PKD1中的85％基因突变是致病的，而PKD2中只有大约15％的基因突变是致病的。ADPKD 以常染色体显性方式遗传。大约95％的ADPKD患者的父母会受到影响；至少10％的家庭发现有新发突变，受影响个体的每个孩子有50％的机会继承致病变异。 ADPKD具有发病率高、病情严重、
预后差、肾功能衰竭快等特点，在产前、移植前胚胎检测、不孕不育、遗传筛查等领域中应用基因检测是非常必要的。
[0004] PKD1基因位于16号染色体短臂上，共有46个外显子，其中1-33号外显子在基因组上存在6个高度同源的假基因，相似度达97.7％，普通PCR以及高通量测序技术很难区分PKD1基因和假基因，给临床诊断带来了困扰。现有的检测PKD1 基因突变的方法常有长
片段PCR和巢式PCR扩增。
专利申请号为 CN201510017500.0的发明公开了一种通过长片段PCR和高通量测序技术检测 PKD1基因突变的方法。该方法需要首先获得长片段PCR产物，然后将扩增产物酶切打断后富集建库并进行高通量测序。该方法需要针对PKD1基因进行单独建库，然后进行高通量测序，很难和其它基因组合成panel建库，无疑增加了测序的成本。而巢式PCR扩增需要用两对以上的引物组合对PKD1基因进行特异性扩增。该方法对一个位点需要进行两次以上的PCR扩增，操作过程较为繁琐，不够简便。
[0005] 目前，遗传筛查的应用趋势越来越趋向于使用多个基因的中大型panel，以往的这种通过长片段PCR和巢式PCR将PKD1真基因扩增出来再进行测序的方式，并不能很好与现有的二代测序基因相互配合，也不符合目前遗传筛查的技术发展趋势，更为有效的筛查方式应该是，先利用二代测序进行广泛的筛选，如果出现 PKD1相关突变，再用sanger测序去验证是否该突变发生在真基因上。因此，本领域仍然需要对PKD1基因突变进行更简便高效，低廉的检测。
发明内容
[0006] 为了克服
现有技术存在假基因干扰、成本高昂、操作流程复杂、时效性差的问题，本发明公开了一种简便高效地检测PKD1基因突变的方法。该方法仅需要一对引物，经过一次PCR扩增就可以特异性扩增出PKD1基因外显子短片段，该产物可以直接进行sanger测序验证PKD1基因突变。该方法可以结合现有的基因检测
试剂盒，首先从高通量数据中发现有意义的PKD1基因突变位点，然后利用本方法选择合适的引物对，经过一次PCR扩增，将扩增产物进行sanger验证。
[0007] 本发明还公开了一组可以区分PKD1基因1-33号外显子和其假基因的引物组，该引物组共包括18对引物，分别如下：用于扩增PKD1基因外显子1的引物，其正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示；用于扩增PKD1 基因外显子2-5a的引物，其正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:4所示；用于扩增PKD1基因外显子5b-6的引物，其正向引物如SEQ ID NO:5 所示，反向引物如SEQ ID NO:6所示；用于扩增PKD1基因外显子7-8的引物，其正向引物如SEQ ID NO:7所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示；用于扩增PKD1 基因外显子9-10的引物，其正向引物如SEQ ID NO:9所示，反向引物如SEQ ID NO:10所示；用于扩增PKD1基因外显子11的引物，其正向引物如SEQ ID NO:11 所示，反向引物如SEQ ID NO:12所示；用于扩增PKD1基因外显子12的引物，其正向引物如SEQ ID NO:13所示，反向引物如SEQ ID NO:14所示；用于扩增 PKD1基因外显子13-15a的引物，其正向引物如SEQ ID NO:15所示，反向引物如SEQ ID NO:16所示；用于扩增PKD1基因外显子15b的引物，其正向引物如SEQ ID NO:17所示，反向引物如SEQ ID NO:18所示；用于扩增PKD1基因外显子15c 的引物，其正向引物如SEQ ID NO:19所示，反向引物如SEQ ID NO:20所示；用于扩增PKD1基因外显子15d-16的引物，其正向引物如SEQ ID NO:21所示，反向引物如SEQ ID NO:22所示；用于扩增PKD1基因外显子17-20的引物，其正向引物如SEQ ID NO:23所示，反向引物如SEQ ID NO:24所示；用于扩增PKD1基因外显子21的引物，其正向引物如SEQ ID NO:25所示，反向引物如SEQ ID NO:26 所示；用于扩增PKD1基因外显子22的引物，其正向引物如SEQ ID NO:27所示，反向引物如SEQ ID NO:28所示；用于扩增PKD1基因外显子23-24的引物，其正向引物如SEQ ID NO:29所示，反向引物如SEQ ID NO:30所示；用于扩增PKD1 基因外显子25-26的引物，其正向引物如SEQ ID NO:31所示，反向引物如SEQ ID NO:32所示；用于扩增PKD1基因外显子27-30的引物，其正向引物如SEQ ID NO:33 所示，反向引物如SEQ ID NO:34所示；用于扩增PKD1基因外显子31-33的引物，其正向引物如SEQ ID NO:35所示，反向引物如SEQ ID NO:36所示。
[0008] 本发明还公布了一种扩增PKD1基因1-33号外显子的PCR反应体系，包括上述的引物组中的任何一对引物，还包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、Rnase酶、dNTP 混合物。在优选的实施方案中，所述DNA聚合酶为TaKaRa LA Taq DNA聚合酶。在总体积为20μL的PCR反应体系中含有下述成分：10μmol/L的正向引物和反向引物各0.4μL，TaKaRa 2×Buffer 10μL，2.5mmol/L dNTP混合物3.2 μL，5U/μL TaKaRa LA Taq 0.2μL，10ng/μL DNA模板1μL。
附图说明
[0009] 图1是PKD1基因1-33号外显子PCR扩增产物
电泳图。其中1和20泳道M为1500 bp Marker，片段长度由上而下依次为1500bp，1000bp，900bp，800bp，700 bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp；2泳道为外显子1的扩增产物，大小为1312bp；3泳道为外显子2-
5a的扩增产物，大小为1224bp； 4泳道为外显子5b-6的扩增产物，大小为904bp；5泳道为外显子7-8的扩增产物，大小为1214bp；6泳道为外显子9-10的扩增产物，大小为1084bp；7 泳道为外显子11的扩增产物，大小为1014bp；8泳道为外显子12的扩增产物，大小为863bp；9泳道为外显子13-15a的扩增产物，大小为1390bp；10泳道为外显子15b的扩增产物，大小为
1543bp；11泳道为外显子15c的扩增产物，大小为1495bp；12泳道为外显子15d-16的扩增产物，大小为1468bp；13泳道为外显子17-20的扩增产物，大小为1243bp；14泳道为外显子21的扩增产物，大小为475bp；15泳道为外显子22的扩增产物，大小为470bp；16泳道为外显子23-
24的扩增产物，大小为1280bp；17泳道为外显子25-26的扩增产物，大小为1329bp；18泳道为外显子27-30的扩增产物，大小为1249bp；19 泳道为外显子31-33的扩增产物，大小为
686bp。
[0010] 图2是外显子1扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1基因参考序列，下图第2至4行为假基因序列。
[0011] 图3是外显子2-5a扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1 基因参考序列，下图第2至5行为假基因序列。
[0012] 图4是外显子5b-6扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1 基因参考序列，下图第2、3行为假基因序列。
[0013] 图5是外显子7-8扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1基因参考序列，下图第2至7行为假基因序列。
[0014] 图6是外显子9-10扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1 基因参考序列，下图第2至5行为假基因序列。
[0015] 图7是外显子11扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1基因参考序列，下图第2至5行为假基因序列。
[0016] 图8是外显子12扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1基因参考序列，下图第2至5行为假基因序列。
[0017] 图9是外显子13-15a扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1 基因参考序列，下图第2至5行为假基因序列。
[0018] 图10是外显子15b扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1 基因参考序列，下图第2至5行为假基因序列。
[0019] 图11是外显子15c扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1 基因参考序列，下图第2至5行为假基因序列。
[0020] 图12是外显子15d-16扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1 基因参考序列，下图第2至5行为假基因序列。
[0021] 图13是外显子17-20扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1 基因参考序列，下图第2至6行为假基因序列。
[0022] 图14是外显子21扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1基因参考序列，下图第2至5行为假基因序列。
[0023] 图15是外显子22扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1基因参考序列，下图第2、3行为假基因序列。
[0024] 图16是外显子23-24扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1 基因参考序列，下图第2至5行为假基因序列。
[0025] 图17是外显子25-26扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1 基因参考序列，下图第2-5行为假基因序列。
[0026] 图18是外显子27-30扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1 基因参考序列，下图第2、3行为假基因序列。
[0027] 图19是外显子31-33扩增产物Sanger法测序结果与PKD1基因及其假基因序列对比示意图。其中上图为Sanger法测序结果，下图第一行带阴影的区域为PKD1 基因参考序列，下图第2、3行为假基因序列。
[0028] 图20是PKD1基因1-33号外显子引物设计的示意图。根据PKD1基因和其假基因的序列特征，以及经过
发明人的大量实验摸索，将PKD1基因具有高度同源的假基因的1-33号外显子分成了18个扩增区域，针对每一个扩增区域进行特异性的引物设计。
具体实施方式
[0029] 下面将详细地描述本发明的优选实施方式。
[0030]
实施例一(本实施例适用于扩增PKD1基因外显子2-5a，外显子5b-6，外显子 7-8，外显子11，外显子13-15a，外显子15b，外显子15c，外显子15d-16，外显子17-20，外显子21，外显子22，外显子23-24，外显子25-26，外显子27-30，外显子31-33)
[0031] 1，需要准备的样本和试剂有：
[0032] 待测样本提取的基因组DNA(gDNA)，A260-280在1.8-2.0之间，用nuclease free water稀释至10ng/μL；如SEQ ID NO:1-36所示
碱基序列的引物，用 nuclease free water稀释至10μmmol/L；Rnase酶稀释至5mU/μL；5U/ μL TaKaRa LA Taq DNA聚合酶；2.5mmol/L dNTP混合物；TaKaRa 2×GC Buffer Ⅰ。
[0033] 2，以待测样本gDNA为模板，扩增PKD1基因1-33号外显子。按照以下体系在灭菌PCR管中配制PCR反应体系。
[0034] 20μL PCR反应体系如下：
[0035]PCR成分 加入体积(μL)
gDNA(10ng/μL) 1
2×GC BufferⅠ 10
2.5mmol/L dNTP混合物 3.2
正向引物(10μmmol/L) 0.4
反向引物(10μmmol/L) 0.4
Rnase酶(5mU/μL) 2
TaKaRa LA Taq 0.2
nuclease free water 2.8
[0036] 3，将PCR管混匀离心后放置在PCR热循环仪中，设置如下扩增程序并启动PCR 反应。
[0037] 扩增程序：
[0038] 94℃
热启动和预变性1min；94℃变性30sec，65℃
退火和延伸1min，共40 个循环；4℃保存。
[0039] 4，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，由图1可见，扩增产物大小和预期目的片段大小一致，用胶回收试剂盒回收目的片段并进行sanger测序。
[0040] 表1扩增PKD1基因1-33号外显子的引物和产物片段长度
[0041]
[0042]
[0043]
[0044] 实施例二(本实施例适用于扩增PKD1基因外显子1，外显子9-10，外显子12) 1，需要准备的样本和试剂有：
[0045] 待测样本提取的基因组DNA(gDNA)，A260-280在1.8-2.0之间，用nuclease free water稀释至10ng/μL；如SEQ ID NO:1-36所示碱基序列的引物，用 nuclease free water稀释至10μmmol/L；Rnase酶稀释至5mU/μL；5U/ μL TaKaRa LA Taq DNA聚合酶；2.5mmol/L dNTP混合物；TaKaRa 2×GC Buffer Ⅱ。
[0046] 2，以待测样本gDNA为模板，扩增PKD1基因1-33号外显子。按照以下体系在灭菌PCR管中配制PCR反应体系。
[0047] 20μL PCR反应体系如下：
[0048]PCR成分 加入体积(μL)
gDNA(10ng/μL) 1
2×GC BufferⅡ 10
2.5mmol/L dNTP混合物 3.2
正向引物(10μmmol/L) 0.4
反向引物(10μmmol/L) 0.4
Rnase(5mU/μL) 2
TaKaRa LA Taq 0.2
nuclease free water 2.8
[0049] 3，将PCR管混匀离心后放置在PCR热循环仪中，设置如下扩增程序并启动PCR 反应。
[0050] 扩增程序：
[0051] 94℃热启动和预变性1min；94℃变性30sec，65℃退火和延伸2min，共40 个循环；4℃保存。
[0052] 4，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，由图1可见，扩增产物大小和预期目的片段大小一致，用胶回收试剂盒回收目的片段并进行sanger测序。
[0053] 实施例三(本实施例分别用巢式PCR和本发明扩增体系对NGS数据进行验证)[0054] 1，本实施例中涉及多囊肾患病家系，包括先证者，先证者弟弟，先证者父亲和先证者母亲共四例成员。其中先证者的临床症状为多囊肾伴射精管囊肿，无精子症；先证者弟弟的临床症状为多囊肾，精子活
力及
密度正常，精子畸形率99％；父亲多囊肾，母亲表型正常。通过对该家系四例样本以及一个对照样本的全外显子二代高通量数据进行
生物信息学分析和根据《ACMG遗传变异分类标准与指南》进行遗传咨询分析，发现一个致病变异，如图20所示。该致病变异为：PKD1基因的NM_000296.3:c.4997G>A变异(p.W1666X)，基因组
位置chr16:2160171，位于PKD1基因第15号外显子，该变异为stopgain无义突变。分析中发现的c.4997G>A变异按照《ACMG遗传变异分类标准与指南》评估为致病性变异(pathogenic)，其符合PVS1(LOF变异),PM2(ESP
数据库、千人数据库、EXAC数据库中正常对照人群中未发现的变异),PP3(多种统计方法预测出该变异会对基因或基因产物造成有害的影响，包括保守性预测、进化预测、剪接位点影响等)。该变异在先证者、先证者父亲(患者) 及先证者弟弟(患者)中均有杂合变异，经上述评估表明该变异会导致常染色体显性遗传性多囊性肾病的发生。同时先证者母亲样本中未发现该变异，说明该变异符合家系共分离。
[0055] 2，采用巢式PCR对该致病变异位点进行二轮PCR扩增，对第二轮PCR产物进行 Sanger测序，Sanger测序结果表明先证者，先证者父亲，先证者弟弟的PKD1 基因发生了c.4997G>A的杂合突变，先证者的母亲正常，与NGS数据一致。
[0056] a)所用DNA聚合酶为2×KAPA HiFi Ready Mix，所用引物如SEQ ID NO:37-SEQ ID NO:40所示，用nuclease free water稀释至10μmmol/L，提取待测样本基因组DNA(gDNA)，A260-280在1.8-2.0之间，并用 nuclease free water稀释至20ng/μL。按照以下体系在灭菌PCR管中配制第一轮PCR反应体系。
[0057] 25μL PCR反应体系如下：
[0058]
[0059]
[0060] b)将PCR管混匀离心后放置在PCR热循环仪中，设置如下扩增程序并启动第一轮PCR反应。扩增程序：
[0061] c)95℃热启动和预变性5min；95℃变性15sec，64℃退火20sec，72℃延伸15sec，共35个循环；72℃最终延伸10min；4℃保存。
[0062] d)对一轮PCR产物进行纯化并测定DNA浓度，用nuclease free water稀释至1ng/μL。
[0063] e)按照以下体系在灭菌PCR管中配制第二轮PCR反应体系。50μL PCR反应体系如下：
[0064]
[0065] f)将PCR管混匀离心后放置在PCR热循环仪中，设置如下扩增程序并启动第二轮PCR反应。扩增程序：95℃热启动和预变性5min；95℃变性15sec， 65℃退火20sec，72℃延伸15sec，共25个循环；72℃最终延伸10min； 4℃保存。
[0066] 表2验证PKD1基因c.4997G>A变异的巢式PCR引物序列
[0067]
[0068]
[0069] 3，为了与巢式PCR的结果进行对比，我们使用实施例一中的扩增体系和扩增程序对该家系四例成员的PKD1基因外显子15c区域进行扩增，对PCR产物进行 Sanger测序，Sanger测序结果表明先证者，先证者父亲，先证者弟弟的PKD1 基因发生了c.4997G>A的杂合突变，先证者的母亲正常，与NGS数据一致。
[0070] a)提取待测样本基因组DNA(gDNA)，A260-280在1.8-2.0之间，用nuclease free water稀释至10ng/μL；准备如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示碱基序列的引物，用nuclease free water稀释至10μmmol/L；Rnase酶稀释至5mU/μL；5U/μL TaKaRa LA Taq DNA聚合酶；2.5mmol/L dNTP 混合物；TaKaRa 2×GC BufferⅠ。按照以下体系在灭菌PCR管中配制PCR 反应体系。20μL PCR反应体系如下：
[0071]
[0072] b)将PCR管混匀离心后放置在PCR热循环仪中，设置如下扩增程序并启动 PCR反应。
[0073] c)扩增程序：94℃热启动和预变性1min；94℃变性30sec，65℃退火和延伸1min，共40个循环；4℃保存。
[0074] 实施例四
[0075] 1，本实施例针对9例不同样本的突变位点采用实施例一中的扩增体系和扩增程序对相应外显子区域(如表2所示)进行扩增以及对PCR产物进行Sanger 测序，这些突变位点信息都是从高通量二代测序数据中检测获得的，Sanger 测序结果和NGS数据一致。
[0076] 2，提取待测样本基因组DNA(gDNA)，A260-280在1.8-2.0之间，用nuclease free water稀释至10ng/μL；准备如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示碱基序列的引物，用nuclease free water稀释至10μmmol/L；Rnase酶稀释至5mU/μL；5U/μL TaKaRa LA Taq DNA聚合酶；2.5mmol/L dNTP 混合物；TaKaRa 2×GC BufferⅠ。
[0077] 3，按照以下体系在灭菌PCR管中配制PCR反应体系。
[0078] 20μL PCR反应体系如下：
[0079]
[0080] 4，将PCR管混匀离心后放置在PCR热循环仪中，设置如下扩增程序并启动PCR 反应。
[0081] 扩增程序：
[0082] 94℃热启动和预变性1min；94℃变性30sec，65℃退火和延伸1min，[0083] 共40个循环；4℃保存。
[0084] 表2 9例样本中PKD1基因突变的位点及在染色体上的位置
[0085]
[0086]
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091]
[0092]
[0093]
[0094]
