一种间充质干细胞提取灌溉培养系统
专利汇可以提供一种间充质干细胞提取灌溉培养系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种间充质干细胞提取 灌溉 培养系统，包括提取装置和灌流培养系统，所述的提取装置包括骨髓切割装置、反应池、过滤装置、滤液收集装置和 密度 梯度离心装置，所述的灌溉培养系统通过使用成分明确的培养系统，并且提供特定的营养成分和添加相关的小分子化合物等，维持细胞的多向分化潜能，让骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，低免疫原性，取材方便，扩增迅速，遗传背景稳定等特点，因此在组织工程和细胞及 基因 治疗 等方面具有广阔的应用前景。该骨髓间充质干细胞完全培养液的使用，为 基础 研究带来便捷，为临床应用带来前景。，下面是一种间充质干细胞提取灌溉培养系统专利的具体信息内容。
1.一种间充质干细胞提取灌溉培养系统，包括提取装置和灌流培养系统，提取装置与灌流培养系统密封无菌相连，其特征在于，
所述的提取装置包括骨髓切割装置、反应池、过滤装置、滤液收集装置和密度梯度离心装置，所述骨髓切割装置包括切割部件和连接部件，所述切割部件由切刀部件和底座组成，连接部件为一升降臂；所述连接部件连接所述底座和所述切刀部件；所述的切刀部件由纵横排列的横刀和纵刀组成；所述的底座设有与所述横刀和纵刀对应的纵向和横向排列的凹槽；所述连接部件与一双开关电控装置连接，电动控制所述连接部件上下伸缩；所述反应池通过传送装置与骨髓切割装置相连，切割后的骨髓碎块直接进入反应池与酶反应液反应；
所述过滤装置为金属过滤网与反应池相连；所述滤液收集装置与过滤装置相连；所述滤液收集装置与密度梯度离心装置相连；
灌流培养系统是直接使用该骨髓间充质干细胞培养液培养原代细胞，可高效促进细胞的贴壁，存活和增值；然后在后续传代过程中，不使用血清进行细胞培养，使用骨髓间充质干细胞完全培养液，完全培养液通过添加成分明确的血清替代物，一系列营养物质和小分子，维持骨髓间充质干细胞在体外培养的细胞活力，纯度和均匀的生物特性；在细胞汇合度达到90％以前，完全培养液每隔一天换液；超过90％以上，进行细胞传代，满足干细胞的营养需求，维持和控制骨髓间充质干细胞形态稳定，维持细胞多向分化的潜能,纯度高、活力强、生物特性均匀；
对获得的细胞进行周期检测；特征分子表达量检测；细胞成骨，成脂和成软骨的分化和鉴定；最终肯定培养所得的树鼩骨髓间充质干细胞可长期传代，并仍然维持较高纯度的间充质干细胞，具有较好的多向分化潜能。
2.如权利要求1所述的间充质干细胞提取灌溉培养系统，其特征在于间充质干细胞完全培养液的成分包括：
100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+低糖DMDM培养基(Gibco)+15％血清替代物KSR(Gibco)+10mM非必需氨基酸NEAA(Gibco)+10mMbeta巯基乙醇+5ng/mlbFGF+
15ng/mlEGF+3μMCHIR99021；其中：上述配方中，100U/ml青霉素(Sigma)+100μg/ml链霉素(Sigma)+低糖DMDM培养基(Gibco)为基础成分；其余为添加成分；
以上培养液，可以2-8℃储存1个月。
3.如权利要求1所述的间充质干细胞提取灌溉培养系统，其特征在于，其特征在于对获得的细胞进行周期检测；细胞在第4代，第8代，第12代，第20代消化后收集到1.5ml离心管中，每个代次收集细胞5x106以上，加入70％的酒精4℃过夜固定后，用PBS洗涤除去酒精，在PI溶液里(PI0.05mg/ml)重悬细胞，避光4℃孵育30分钟以上，通过流式细胞仪进行细胞周期检测。
4.如权利要求1所述的间充质干细胞提取灌溉培养系统，其特征在于，其特征在于对获得的细胞进行特征分子表达量检测；
通过实时荧光定量PCR检测间充质干细胞表达的分子标志物，利用定量的方法比较在新的培养体系和传统培养液中，树鼩间充质干细胞完全培养液第4代，第8代，第12代和第20代的特征分子标记物表达量，分子标志物主要有：CD44，CD29，CD73，CD90，CD106，CD166，CD34和CD45。
5.如权利要求1所述的间充质干细胞提取灌溉培养系统，其特征在于对获得的细胞进行细胞成骨，成脂和成软骨的分化和鉴定；
将第12代的骨髓间充质干细胞接种到24孔板中，分别用成骨分化液，成脂分化液和成软骨分化液诱导细胞，20天进行鉴定检测；
成骨分化液：高糖DMEM+10％FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+0.2mMascorbate-
2-phosphate+10mMbeta-glycerophosphate；
茜素红染色鉴定；
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用2％的茜素红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去茜素红染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组；
成脂分化液：
高糖DMEM+10％FBS+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素+1μmol/L地塞米松+200μM吲哚美辛+0.01mg/mL胰岛素+0.5mmol/LIBMX；
油红染色鉴定
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用油红染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组；
成软骨分化液：
高糖DMEM+10％FBS+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+100nM地塞米松+10ng/mlTGF-beta3+0.17Mmascorbate-2-phosphate+1/100100XITS+
alcianblue染色鉴定：
①将旧的诱导液吸除，将诱导后的细胞暴露，利用PBS清洗细胞3次；
②取含4％多聚甲醛的固定液固定细胞30min；
③去固定液，利用alcianblue染液，37℃，孵育30min，可放在培养箱中进行；
④弃去染色液，利用超纯水清洗3次以上，以避免出现假阳性；
⑤在倒置显微镜下拍照实验组和对照组。
6.如权利要求1所述的间充质干细胞提取灌溉培养系统，其特征在于，所述反应池位于骨髓切割装置的一侧，设有投料口、入液口和出液口、恒温装置、CO2通气装置、自动加液装置，所述的投料口和出液口位于反应池的两侧，入液口位于反应池的上表面。
一种间充质干细胞提取灌溉培养系统
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背景技术
发明内容
具体实施方式
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