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胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法

阅读：543发布：2023-02-27

专利汇可以提供胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，步骤一：提取胶质瘤细胞；步骤二：细胞培养；步骤三：药物处理；步骤四：mRNA提取；步骤五：反应：95℃预变性30s；95℃变性20S，60℃ 退火 15s;72℃延伸15s，扩增40个循环；步骤六：计算：样品以GAPDH基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量(2‑△△CT)法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。引物的序列为：GAPDH：F:5’TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3’；R:5’AGATCCACAACGGATACATT3’GDNF:F:5’GACTTGGGTTTGGGCTACGA3’；R:5’TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3’。通过本发明通过本发明处理过程后，经过检测的胶质瘤细胞2^‑△△CT表达水平更高，同时通过两者方差对比，本发明的检测方法，2^‑△△CT的表达水平更加稳定。，下面是胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于：
步骤一：提取胶质瘤细胞：取48h内的胶质瘤样本，首先剪碎并用清洗，加入0.25 %胰酶溶液在37℃条件下消化5min；收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，每周换液两次；在原代培养7-9天后，将培养瓶置于恒温摇床37℃，200rpm，20h震荡纯化，以去除小胶质细胞及少突胶质细胞；
经GFAP 免疫荧光鉴定阳性的细胞视为成熟的细胞，取第4代的处于对数生长期为胶质瘤细胞株；
步骤二：细胞培养：胶质瘤细胞株用含10%胎牛血清、100U/ml 青霉素，100U/ml 链霉素的培养基，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；
步骤三：药物处理：取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，加入终浓度为
25~100μmol/L的姜黄素继续培养24h；
步骤四：mRNA提取，采用TRIzol一步法从细胞中提取总 RNA，取RNA模板2μg用Prime Script II逆转录试剂盒行逆转录反应合成cD-NA第一链，再以逆转录反应液1μl作为模板，加入相应引物进行PCR扩增，所述引物的序列为：
GAPDH：F:5’ TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3’
      R:5’ AGATCCACAACGGATACATT3’
GDNF: F:5’ GACTTGGGTTTGGGCTACGA3’
      R:5’ TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3’；
步骤五：反应：95 ℃预变性30s；95℃变性20S，60℃退火15s; 72℃延伸15s，扩增40个循环；
步骤六：计算：样品以GAPDH 基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量 (2^-△△CT) 法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。
2.根据权利要求1所述的大鼠 C6 胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于：所述步骤一中，在将样本剪碎后，通过75%的酒精进行一次清洗，之后通过清洗液中浸泡
15min后，在用清洗液冲洗至少三次，所述清洗液包括下列重量份组成：
去离子水    800~1000份
 氯化钠      5~10份
氯化钾      0.1~1份
磷酸二氢钾  0.1~1份
磷酸氢二钠  1~2份
磷酸甘油    1~2份
海藻糖 0.1~1份；
再加入0.25 %胰酶溶液在37℃条件下消化5min，所述胰酶溶液包括：0.25%的胰酶、
0.02%的EDTA、0.02%的海藻糖、5%的丙三醇、0.5%的磷酸甘油，余量为PBS缓冲液。
3.根据权利要求1所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于：所述步骤二中，培养基为以DMEM/F12培养液为基体，再添加海藻糖、壳聚糖、巯基乙醇、亚硒酸钠，所述海藻糖添加量为DMEM/F12培养液质量的0.5%,壳聚糖为DMEM/F12培养液质量的1~5 %，所述亚硒酸钠最终浓度为5~7ng/L。
4.根据权利要求1所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于：所述步骤三中，在加入姜黄素进行乙酰化的过程中，同时加入去甲氧基姜黄素，所述去甲氧基姜黄素用量为姜黄素用量的1~5%。
5.根据权利要求1所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子mRNA检测方法，其特征在于：所述步骤一中，胰酶溶液完成消化后，加入胰酶抑制剂解除胰酶溶液的消化作用，之后加入PBS缓冲液、甘油醇进行稀释，通过高速离心机将整个混合液进行离心，将上清液弃去后，收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。
6.根据权利要求5所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于：所述步骤一种，分离得到去胰酶的细胞后，再通过清洗液浸泡5min，浸泡过后在使用清洗剂清洗至少三次，收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。
7.根据权利要求1所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于：所述步骤二中的培养基中还添加有载体，所述载体为聚乳酸、淀粉、聚苯乙烯以葡萄糖水溶液为介质在60~80℃下通过聚合反应生成的微孔材料。
8.根据权利要求7所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子mRNA检测方法，其特征在于：所述载体中以重量份计：聚苯乙烯为30~50份，聚乳酸为5~15份，淀粉为5~15份，葡萄糖水溶液浓度为5~10%。
9.根据权利要求8所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于：所述步骤二中，在培养过程中，保持搅拌，所述搅拌速度为30~50r/min。
10.根据权利要求9所述的胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法，其特征在于：所述步骤三中，在提取细胞时，先在步骤二培养基中加入0.25%的胰酶、0.02%的EDTA、0.02%的海藻糖、5%的丙三醇、0.5%的磷酸甘油，余量为PBS缓冲液，消化5min后，使得细胞从载体上脱落，取出载体，通过PBS缓冲液冲洗至少三次，冲下来的液体倒回原培养基，加入胰酶抑制剂解除胰酶溶液的消化作用，之后加入PBS缓冲液、甘油醇进行稀释，经过高速离心后的到的细胞，取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，加入终浓度为25~100μmol/L的姜黄素继续培养24h。

说明书全文

胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法

[0001]

技术领域

[0002] 本发明涉及医学检测方法，更具体的说是涉及一种胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法。

背景技术

[0003] 胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）是胶质瘤发性胶质瘤细胞的重要促生长因子，在原发性胶质瘤组织和多种胶质瘤细胞系中转录异常升高。目前，基因高转录对胶质瘤细胞恶性增殖与迁移机制的研究已经很多，然而鲜见对其高转录发生机制的报道。本课题组前期的研究发现，gdnf 基因的高转录与基因突变无关，推测基于非DNA 序列改变的表观遗传修饰可能参与其高转录调控过程。近来的研究表明，翻译后组蛋白的乙酰化修饰在调节基因转录过程中发挥了重要作用。

[0004] 通过现有技术的发展，GDNF 基因 mRNA表达及其启动子Ⅰ区组蛋白 H3K9 的乙酰化修饰状态，GDNF 基因上mRNA与基因癌变有重要关系，现有技术中也有记载检测GDNF 基因上mRNA的方法，但是现有技术中的方法由于受到外界影响过大，检测出来的未定型不高。

发明内容

[0005] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种高稳定性胶质瘤细胞中GDNF基因启动子mRNA检测方法。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种胶质瘤细胞中GDNF基因启动子mRNA检测方法，步骤一：提取胶质瘤细胞：取48h内的胶质瘤样本，首先剪碎并用清洗，加入0.25 %胰酶溶液在37℃条件下消化5min；收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，每周换液两次；在原代培养7-9天后，将培养瓶置于恒温摇床37℃，200rpm，20h震荡纯化，以去除小胶质细胞及少突胶质细胞；
经GFAP 免疫荧光鉴定阳性的细胞视为成熟的细胞，取第4代的处于对数生长期为胶质瘤细胞株；
步骤二：细胞培养：胶质瘤细胞株用含10%胎牛血清、100U/ml 青霉素，100U/ml 链霉素的培养基，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；
步骤三：药物处理：取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，加入终浓度为
25~100μmol/L的姜黄素继续培养24h；
步骤四：mRNA提取，采用TRIzol一步法从细胞中提取总 RNA，取RNA模板2μg用Prime Script II逆转录试剂盒行逆转录反应合成cD-NA第一链，再以逆转录反应液1μl作为模板，加入相应引物进行PCR扩增，所述引物的序列为：
GAPDH：F:5’ TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3’
       R:5’ AGATCCACAACGGATACATT3’
GDNF:  F:5’ GACTTGGGTTTGGGCTACGA3’
       R:5’ TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3’；
步骤五：反应：95 ℃预变性30s；95℃变性20S，60℃退火15s; 72℃延伸15s，扩增40个循环；
步骤六：计算：样品以GAPDH 基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量 (2^-△△CT) 法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。

[0007] 作为本发明的进一步改进：所述步骤一中，在将样本剪碎后，通过75%的酒精进行一次清洗，之后通过清洗液中浸泡15min后，在用清洗液冲洗至少三次，所述清洗液包括下列重量份组成：去离子水    800~1000份
 氯化钠      5~10份
氯化钾      0.1~1份
磷酸二氢钾  0.1~1份
磷酸氢二钠  1~2份
磷酸甘油    1~2份
海藻糖 0.1~1份；
再加入0.25 %胰酶溶液在37℃条件下消化5min，所述胰酶溶液包括：0.25%的胰酶、
0.02%的EDTA、0.02%的海藻糖、5%的丙三醇、0.5%的磷酸甘油，余量为PBS缓冲液。

[0008] 作为本发明的进一步改进：所述步骤二中，培养基为以DMEM/F12培养液为基体，再添加海藻糖、壳聚糖、巯基乙醇、亚硒酸钠，所述海藻糖添加量为DMEM/F12培养液质量的0.5%,壳聚糖为DMEM/F12培养液质量的1~5 %，所述亚硒酸钠最终浓度为5~7ng/L。

[0009] 作为本发明的进一步改进：所述步骤三中，在加入姜黄素进行乙酰化的过程中，同时加入去甲氧基姜黄素，所述去甲氧基姜黄素用量为姜黄素用量的1~5%。

[0010] 作为本发明的进一步改进：所述步骤一中，胰酶溶液完成消化后，加入胰酶抑制剂解除胰酶溶液的消化作用，之后加入PBS缓冲液、甘油醇进行稀释，通过高速离心机将整个混合液进行离心，将上清液弃去后，收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。

[0011] 作为本发明的进一步改进：所述步骤一种，分离得到去胰酶的细胞后，再通过清洗液浸泡5min，浸泡过后在使用清洗剂清洗至少三次，收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。

[0012] 作为本发明的进一步改进：所述步骤二中的培养基中还添加有载体，所述载体为聚乳酸、淀粉、聚苯乙烯以葡萄糖水溶液为介质在60~80℃下通过聚合反应生成的微孔材料。

[0013] 作为本发明的进一步改进：所述载体中以重量份计：聚苯乙烯为30~50份，聚乳酸为5~15份，淀粉为5~15份，葡萄糖水溶液浓度为5~10%。

[0014] 作为本发明的进一步改进：所述步骤二中，在培养过程中，保持搅拌，所述搅拌速度为30~50r/min。

[0015] 作为本发明的进一步改进：所述步骤三中，在提取细胞时，先在步骤二培养基中加入0.25%的胰酶、0.02%的EDTA、0.02%的海藻糖、5%的丙三醇、0.5%的磷酸甘油，余量为PBS缓冲液，消化5min后，使得细胞从载体上脱落，取出载体，通过PBS缓冲液冲洗至少三次，冲下来的液体倒回原培养基，加入胰酶抑制剂解除胰酶溶液的消化作用，之后加入PBS缓冲液、甘油醇进行稀释，经过告诉离心后的到的细胞，取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，加入终浓度为25~100μmol/L的姜黄素继续培养24h。

[0016] 本发明的有益效果，通过本发明的方法进行检测的胶质瘤细胞GDNF基因mRNA的表达更加稳定。

[0017] 首先，经过步骤一处理的胶质瘤细胞，能够在被处理完过后，仍然能够保持较好的活性，加入胰酶，将细胞与细胞之间分离，以便后续处理能够是的细胞能够以单个细胞存在。胰酶的处理时间不宜过长，过长会导致细胞被胰酶分解，从而被破坏。之后将分离的细胞放入培养基中培养。这样就能够培养出完整性较好的细胞。最后制得细胞株。

[0018] 之后将细胞株进一步培养，胎牛血清主要是给细胞生长提供营养，而青霉素和链霉素主要是保证细胞不会被感染，保证细胞的存活率的同时，也保证不会导入其他DNA或者RNA。

[0019] 而步骤三中，选用姜黄素作为乙酰化的试剂，能够更好地将组织蛋白乙酰化。乙酰化程度更高。使得之后进入步骤四mRNA提取过程中，逆转录的表达更加准确。

[0020] 在步骤五中，通过设定的参数，能够得到更加准确的诗句。最后通过对比，得到mRNA的表达水平。

[0021] 而在步骤一中，先将样本碎片通过酒精清洗，先初步清洗掉黏附在样本细胞表面的杂质，之后通过清洗剂浸泡，清洗剂中的去离子水、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠能够形成适应细胞生存的体系，特别是胶质瘤细胞，其细胞活性能够得到极大限度的保证，同时通过磷酸甘油和海藻糖的加入，能够进一步保证细胞的活性，特别是蛋白质的活性，是的后期mRNA的表达更加准确。同时，胰酶溶液中EDTA能够提高胰酶的分离细胞的效果，同时海藻糖、丙三醇、磷酸甘油的加入，一方面保证了胰酶溶液的活性，同时液保护细胞组织不会被胰酶过度分解导致细胞失活。

[0022] 另外在步骤二中的培养基中添加海藻糖、壳聚糖、巯基乙醇、亚硒酸钠，海藻糖能够对肿瘤细胞起到保护作用，使得细胞活性更高，同时亚硒酸钠能够提供细胞生长所需要的微量元素，而壳聚糖不仅仅能够起到保护细胞，提高活性，还能够调整整体液体的粘稠度，是使得细胞生存的环境更加稳定。

[0023] 在步骤三中姜黄素乙酰化过长中加入去甲氧基姜黄素，能够提高姜黄素的稳定性，提高其乙酰化的表达。

[0024] 步骤一中，在完成胰酶消化后，通过胰酶抑制剂的加入能够彻底抑制胰酶的分解反应，使得胰酶失活，而不会造成肿瘤细胞的失活，之后再清洗过程中，加入的甘油醇也同样能够对肿瘤细胞形成保护，目的是为了防止胰酶抑制剂对肿瘤细胞产生损伤。

[0025] 在分离胰酶后，浸泡清洗液也是为了能够去除肿瘤细胞表面的杂质以外，还能够对肿瘤细胞起到一个保护作用。使得后期培养前就保证了肿瘤细胞的活性。

[0026] 另外，在培养过程中，加入了载体，通过聚乳酸、淀粉、聚苯乙烯制备的载体，是一种环保型载体，给细胞生长提供了一个优质的环境，载体是一个多孔材料是的细胞生长能够有更多的贴壁面积，更好的模拟了生物体内的环境，保证了其细胞培养的成活率以及活性。

[0027] 而在使用载体后，为了使得细胞从载体上脱落就需要用胰酶溶液进行浸泡，之后冲洗，冲洗下来的冲洗液为了充分利用，倒回到培养基中，进行肿瘤细胞的提取。

具体实施方式

[0028]实施例：
步骤一：提取胶质瘤细胞：取48h内的胶质瘤样本，首先剪碎并用清洗，加入0.25 %胰酶溶液在37℃条件下消化5min；收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，每周换液两次；在原代培养7-9天后，将培养瓶置于恒温摇床37℃，200rpm，20h震荡纯化，以去除小胶质细胞及少突胶质细胞；
经GFAP 免疫荧光鉴定阳性的细胞视为成熟的细胞，取第4代的处于对数生长期为胶质瘤细胞株；
所述步骤一中，在将样本剪碎后，通过75%的酒精进行一次清洗，之后通过清洗液中浸泡15min后，在用清洗液冲洗至少三次，所述清洗液包括下列重量份组成：
去离子水    800~1000份
氯化钠      5~10份
氯化钾      0.1~1份
磷酸二氢钾  0.1~1份
磷酸氢二钠  1~2份
磷酸甘油    1~2份
海藻糖 0.1~1份；
再加入0.25 %胰酶溶液在37℃条件下消化5min，所述胰酶溶液包括：0.25%的胰酶、
0.02%的EDTA、0.02%的海藻糖、5%的丙三醇、0.5%的磷酸甘油，余量为PBS缓冲液。

[0029] 所述步骤一中，分离得到去胰酶的细胞后，再通过清洗液浸泡5min，浸泡过后在使用清洗剂清洗至少三次，收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。

[0030] 步骤二：细胞培养：胶质瘤细胞株用含10%胎牛血清、100U/ml 青霉素，100U/ml链霉素的培养基，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；所述步骤二中，培养基为以DMEM/F12培养液为基体，再添加海藻糖、壳聚糖、巯基乙醇、亚硒酸钠，所述海藻糖添加量为DMEM/F12培养液质量的0.5%,壳聚糖为DMEM/F12培养液质量的1~5 %，所述亚硒酸钠最终浓度为5~7ng/L。所述步骤二中的培养基中还添加有载体，所述载体为聚乳酸、淀粉、聚苯乙烯以葡萄糖水溶液为介质在60~80℃下通过聚合反应生成的微孔材料。在培养过程中，保持搅拌，所述搅拌速度为30~50r/min。

[0031] 所述载体中以重量份计：聚苯乙烯为30~50份，聚乳酸为5~15份，淀粉为5~15份，葡萄糖水溶液浓度为5~10%。

[0032] 步骤三：药物处理：取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，加入终浓度为25~100μmol/L的姜黄素继续培养24h；所述步骤三中，在加入姜黄素进行乙酰化的过程中，同时加入去甲氧基姜黄素，所述去甲氧基姜黄素用量为姜黄素用量的1~5%。

[0033] 作为本发明的进一步改进：所述步骤一中，胰酶溶液完成消化后，加入胰酶抑制剂解除胰酶溶液的消化作用，之后加入PBS缓冲液、甘油醇进行稀释，通过高速离心机将整个混合液进行离心，将上清液弃去后，收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。

[0034] 所述步骤三中，在提取细胞时，先在步骤二培养基中加入0.25%的胰酶、0.02%的EDTA、0.02%的海藻糖、5%的丙三醇、0.5%的磷酸甘油，余量为PBS缓冲液，消化5min后，使得细胞从载体上脱落，取出载体，通过PBS缓冲液冲洗至少三次，冲下来的液体倒回原培养基，加入胰酶抑制剂解除胰酶溶液的消化作用，之后加入PBS缓冲液、甘油醇进行稀释，经过告诉离心后的到的细胞，取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，加入终浓度为25~100μmol/L的姜黄素继续培养24h。

[0035] 步骤四：mRNA提取，采用TRIzol一步法从细胞中提取总 RNA，取RNA模板2μg用Prime Script II逆转录试剂盒行逆转录反应合成cD-NA第一链，再以逆转录反应液1μl作为模板，加入相应引物进行PCR扩增，所述引物的序列为：GAPDH：F:5’ TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3’
       R:5’ AGATCCACAACGGATACATT3’
GDNF:  F:5’ GACTTGGGTTTGGGCTACGA3’
       R:5’ TGGTAAACCAGGCTGTCGTC3’；
步骤五：反应：95 ℃预变性30s；95℃变性20S，60℃退火15s; 72℃延伸15s，扩增40个循环；
步骤六：计算：样品以GAPDH 基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量 (2^-△△CT) 法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。

[0036] 本发明的有益效果，通过本发明的方法进行检测的胶质瘤细胞GDNF基因mRNA的表达更加稳定。

[0037] 首先，经过步骤一处理的胶质瘤细胞，能够在被处理完过后，仍然能够保持较好的活性，加入胰酶，将细胞与细胞之间分离，以便后续处理能够是的细胞能够以单个细胞存在。胰酶的处理时间不宜过长，过长会导致细胞被胰酶分解，从而被破坏。之后将分离的细胞放入培养基中培养。这样就能够培养出完整性较好的细胞。最后制得细胞株。

[0038] 之后将细胞株进一步培养，胎牛血清主要是给细胞生长提供营养，而青霉素和链霉素主要是保证细胞不会被感染，保证细胞的存活率的同时，也保证不会导入其他DNA或者RNA。

[0039] 而步骤三中，选用姜黄素作为乙酰化的试剂，能够更好地将组织蛋白乙酰化。乙酰化程度更高。使得之后进入步骤四mRNA提取过程中，逆转录的表达更加准确。

[0040] 在步骤五中，通过设定的参数，能够得到更加准确的诗句。最后通过对比，得到mRNA的表达水平。

[0041] 而在步骤一中，先将样本碎片通过酒精清洗，先初步清洗掉黏附在样本细胞表面的杂质，之后通过清洗剂浸泡，清洗剂中的去离子水、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠能够形成适应细胞生存的体系，特别是胶质瘤细胞，其细胞活性能够得到极大限度的保证，同时通过磷酸甘油和海藻糖的加入，能够进一步保证细胞的活性，特别是蛋白质的活性，是的后期mRNA的表达更加准确。同时，胰酶溶液中EDTA能够提高胰酶的分离细胞的效果，同时海藻糖、丙三醇、磷酸甘油的加入，一方面保证了胰酶溶液的活性，同时液保护细胞组织不会被胰酶过度分解导致细胞失活。

[0042] 另外在步骤二中的培养基中添加海藻糖、壳聚糖、巯基乙醇、亚硒酸钠，海藻糖能够对肿瘤细胞起到保护作用，使得细胞活性更高，同时亚硒酸钠能够提供细胞生长所需要的微量元素，而壳聚糖不仅仅能够起到保护细胞，提高活性，还能够调整整体液体的粘稠度，是使得细胞生存的环境更加稳定。

[0043] 在步骤三中姜黄素乙酰化过长中加入去甲氧基姜黄素，能够提高姜黄素的稳定性，提高其乙酰化的表达。

[0044] 步骤一中，在完成胰酶消化后，通过胰酶抑制剂的加入能够彻底抑制胰酶的分解反应，使得胰酶失活，而不会造成肿瘤细胞的失活，之后再清洗过程中，加入的甘油醇也同样能够对肿瘤细胞形成保护，目的是为了防止胰酶抑制剂对肿瘤细胞产生损伤。

[0045] 在分离胰酶后，浸泡清洗液也是为了能够去除肿瘤细胞表面的杂质以外，还能够对肿瘤细胞起到一个保护作用。使得后期培养前就保证了肿瘤细胞的活性。

[0046] 另外，在培养过程中，加入了载体，通过聚乳酸、淀粉、聚苯乙烯制备的载体，是一种环保型载体，给细胞生长提供了一个优质的环境，载体是一个多孔材料是的细胞生长能够有更多的贴壁面积，更好的模拟了生物体内的环境，保证了其细胞培养的成活率以及活性。

[0047] 而在使用载体后，为了使得细胞从载体上脱落就需要用胰酶溶液进行浸泡，之后冲洗，冲洗下来的冲洗液为了充分利用，倒回到培养基中，进行肿瘤细胞的提取。

[0048] 对比例1：选用中国科学院细胞库的大鼠 C6 胶质瘤细胞株，大鼠 C6 胶质瘤细胞株用含10%胎牛血清、100U/ml 青霉素，100U/ml链霉素的DMEM/F12培养基，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞培养24 h同步化后进行药物处理，分别加入Curcumin 继续培养
24h。

[0049] 采用TRIzol一步法从细胞中提取总 RNA，取RNA模板2μg用Prime ScriptTM II逆转录试剂盒行逆转录反应合成cD-NA第一链，再以逆转录反应液1μl作为模板，加入相应引物进行PCR扩增。引物序列见表1。反应条件设置如下：95 ℃预变性30s；95℃变性20S，60℃退火15s; 72℃延伸15s，扩增40个循环。通过溶解曲线分析PCR 产物特异性。每个样品以GAPDH 基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量 (2-△△CT) 法计算目的基因在各样品中相对mRNA的表达水平。

[0050] 对比例二：取出生48 h 内的SD大鼠的双侧大脑皮质，剪碎并用PBS冲洗数次，加入0.25 %胰酶37℃消化5min。收集细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，每周换液两次。在原代培养7-9天后，将培养瓶置于恒温摇床37℃，200rpm，20h震荡纯化，以去除小胶质细胞及少突胶质细胞。经GFAP 免疫荧光鉴定阳性的细胞视为成熟的星形胶质细胞。取第4代的处于对数生长期的细胞用于实验研究。

[0051] 采用TRIzol一步法从细胞中提取总 RNA，取RNA模板2μg用Prime ScriptTM II逆转录试剂盒行逆转录反应合成cD-NA第一链，再以逆转录反应液1μl作为模板，加入相应引物进行PCR扩增。引物序列见表1。反应条件设置如下：95 ℃预变性30s；95℃变性20S，60℃退火15s; 72℃延伸15s，扩增40个循环。通过溶解曲线分析PCR 产物特异性。每个样品以GAPDH 基因的mRNA表达作为内参照，通过相对定量 (2^-△△CT) 法计算目的基因在各样

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使用连接扩增的分子检测	2020-05-12	810
进行扩增子挽救多重PCR的装置	2020-05-13	23
单引物至双引物扩增子转换	2020-05-11	182

胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法

胶质瘤细胞中GDNF基因启动子检测方法

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