马铃薯疮痂病菌定量分子检测方法
专利汇可以提供马铃薯疮痂病菌定量分子检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了 马 铃薯疮痂病菌的定量分子检测方法，根据NCBI GenBank中已登记的马铃薯疮痂病菌特有的毒素合成基因簇中的txtA、txtB保守基因序列设计 荧光 定量PCR引物，筛选到符合qPCR条件的引物RTA1/RTA2，经检测，其在各测试菌株中的扩增结果稳定， 片段 大小符合要求，并且无引物二聚体形成，可以作为qPCR检测引物。分别对4种疮痂病菌测试菌株的孢悬液进行定量并提取DNA，稀释至不同浓度作为模板，利用qPCR技术建立标准曲线。利用建立的标准曲线对 土壤 样品及病组织样品进行测试，结果表明其可对样品进行定量测定( 附图 )。，下面是马铃薯疮痂病菌定量分子检测方法专利的具体信息内容。
1.马铃薯疮痂致病菌株qPCR技术通用引物的筛选方法，其特征在于：根据NCBI GenBank中已登记的疮痂病菌特有的毒素合成基因簇中的txtA、txtB保守的基因序列设计，以不同马铃薯疮痂病致病菌株CPS-1(S. scabies)、CPS-2(S. galilaeus)、CPS-3(S. acidiscabies)、SHXHZ-3(S. turgidiscabies)一定量孢子DNA为模板，进行PCR扩增，筛选并获得通用qPCR检测引物RTA1/RTA2。
2.根据权利要求1所述的方法，对孢子数进行定量及DNA提取，其特征在于：用平板计数法将燕麦固体培养基（OMA）上培养的菌株CPS-1(S. scabies)、CPS-2(S. galilaeus)、CPS-3(S. acidiscabies)、CPS-4(S. turgidiscabies)进行计数：将燕麦固体培养基上培
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养10 d的疮痂病菌孢子用无菌水洗下，把孢悬液进行10，10…10 倍梯度稀释，取稀释好的孢悬液50 mL涂布于燕麦固体培养基上，生长7 d后进行平皿计数，计算出样品的孢子总数，用CTAB法提取一定量菌株孢子的基因组DNA。
3.根据权利要求1和2所述的方法，采用的扩增反应条件，其特征在于：先将引物稀释成10 μmol/L，扩增反应体系为50 mL，模板(基因组DNA)：1 mL；引物：各1 mL；2×GC bufferⅡ：25 mL；dNTP(2 mM)：1 mL；Taq酶：0.7 mL；ddH2O：20.3 mL；扩增条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，62℃退火50 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸5 min，扩增结束后，取4mL的扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶90 V /40 min电泳检测。
4.根据权利要求2和3所述的方法，对模板进行进行浓度梯度的确定，其特征在于：
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将所提取的孢悬液DNA稀释成一样的浓度后进行10，10，4×10，8×10，10，4×10，
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6×10，8×10，10，2×10，4×10，8×10，10倍不同梯度稀释，确定反应体系的最低检测浓度，并根据孢悬液和孢悬液DNA的稀释度计算引物对病原菌孢子的最低检测阈值。
5.根据权利要求4所述的方法，建立应用标准曲线并进行样品测试，其特征在于：SYBR GreenⅠqPCR反应体系（10 mL）为：PCR Mix：51mL；引物：各0.2 mL；模板（孢子DNA）：0.2 mL；ddH2O：4.4 mL；SYBR GreenⅠqPCR反应程序：预变性：94℃，5 min；40个循环：变性：
94℃，5 s，复性：62℃，30 s ，分别建立不同致病种的标准曲线，利用建立的标准曲线对病田土壤样品进行检测，证明建立的定量检测方法灵敏度好，可用性高。
马铃薯疮痂病菌定量分子检测方法
技术领域
背景技术
（10~200kb），仅仅出现在致病株的染色体中，而在非致病株不存在 。引起疮痂病的thaxtomin A的生物合成是在疮痂病致病种的单基因座（txt）上，txtA和 txtB编码合成的
4-硝基吲哚和L-苯丙氨酸具有甲基化和环化二肽合成酶的功能。
发明内容
B、qPCR引物的设计及引物的筛选；
C、标准曲线建立点的筛选；
D、标准曲线的建立及应用。
各菌株不同浓度DNA下的Ct值和换算的孢子数见下表：
步骤A是用平板计数法将燕麦固体培养基（OMA）上培养的菌株CPS-1(S. scabies)、CPS-2(S. galilaeus)、CPS-3(S. acidiscabies)、CPS-4(S. turgidiscabies)培养10天
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的孢子用无菌水洗下，把孢悬液进行10，10…10 倍梯度稀释，取稀释好的孢悬液50 mL涂布于燕麦固体培养基上，生长7 d后进行平皿计数，计算出样品的孢子总数。用CTAB法提取一定量菌株孢子的基因组DNA，所提基因组DNA的浓度及各项参数由紫外分光光度仪测得，知道浓度后建立孢子数和浓度之间的关系。
62℃退火50 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸5 min。扩增结束后，取4mL的扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶90 V /40 min电泳检测。PCR产物在2.0％的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，将PCR产物连接到克隆载体pGM-T载体上，并转化到大肠杆菌DH5α上，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取3个阳性克隆进行测序，在国际基因库（GenBank）上进行序列分析，验证所得片段并选取效果最好的扩增片段作为检测探针，RTA1/RTA2扩增的目的片段测序结果稳定正确，扩增的条带大小符合qPCR所要求的条件，并且没有引物二聚体情况。
后进行10，10，4×10，8×10，10，4×10， 6×10，8×10，10，2×10，4×10，8×10，10倍不同梯度稀释。确定反应体系的最低检测浓度。并根据孢悬液和孢悬液DNA的稀释度计算引物对病原菌孢子的最低检测阈值。
具体实施方式
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培养10天的孢子用无菌水洗下，把孢悬液进行10，10…10 倍梯度稀释，取稀释好的孢悬液50 mL涂布于燕麦固体培养基上，生长7 d后进行平皿计数，计算出样品的孢子总数。用CTAB法提取一定量菌株孢子的基因组DNA，所提基因组DNA的浓度及各项参数由紫外分光光度仪测得，知道浓度后建立孢子数和浓度之间的关系。
95℃预变性5 min，95℃变性30 s，62℃退火50 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸5 min。扩增结束后，取4mL的扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶90 V /40 min电泳检测。
PCR产物在2.0％的琼脂糖凝胶电泳中进行检测，将PCR产物连接到克隆载体pGM-T载体上，并转化到大肠杆菌DH5α上，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取3个阳性克隆进行测序，在国际基因库（GenBank）上进行序列分析，验证所得片段并选取效果最好的扩增片段作为检测探针，RTA1/RTA2扩增的目的片段测序结果稳定正确，扩增的条带大小符合qPCR所要求的条件，并且没有引物二聚体情况。
稀释成一样的浓度后进行10，10，4×10，8×10，10，4×10， 6×10，8×10，10，2×10，
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4×10，8×10，10倍不同梯度稀释。确定反应体系的最低检测浓度。并根据孢悬液和孢悬液DNA的稀释度计算引物对病原菌孢子的最低检测阈值。
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