技术领域
[0001] 本
发明涉及分子技术领域，具体涉及用于鉴别野牡丹属种的RAPD专用引物和方法。
背景技术
[0002] 野牡丹科(Melastomaceae)
植物全世界约240个属，共3000余个种。野牡丹属(Melastoma)属于野牡丹科，大约有100个种，分布中心处于东南亚一带，我国有9个种和1个变种，主要分布带处于长江以南各个省区。野牡丹属植物花色有白色系、粉色系、紫色系，花期长、花量大，株型从地被、灌木到小乔木均有分布，具备良好的观赏性状；此外，该属植物的药用价值近来也有陆续的深入研究，发展前景广泛。目前，绝大多数的野牡丹属植物仍未被人工开发利用，已在野牡丹属种质资源的收集及评价、栽培技术、脱毒育苗、传粉特性以及
种子发育等方面进行研究。
[0003] 目前，针对野牡丹属的分类研究主要集中于宏观形态学、细胞遗传学、孢粉学、细胞学、表型多样性等方面，利用分子标记对野牡丹种质资源的遗传性进行研究还比较少。
发明内容
[0004] 本发明提供了一种用于鉴别野牡丹属种的RAPD专用引物和方法。
[0005] 本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：
[0006] 一种用于鉴别野牡丹属种的RAPD专用引物，其特征在于：它包括两条引物：
[0007] 1)S19，其序列为ACCCCCGAAG；
[0008] 2)S43，其序列为GTCGCCGTCA。
[0009] 2.一种用于鉴别野牡丹属种的方法，包括如下步骤：
[0010] 1)根据前述的S19和S43引物，建立野牡丹RAPD指纹图谱；
[0011] 2)提取野牡丹基因组DNA；
[0012] 3)提供前述的UBC857和UBC811引物，进行PCR扩增；
[0013] 4)扩增产物凝胶
电泳，分析条带，并与野牡丹RAPD指纹图谱比对，确定野牡丹属种。
[0014] 其中，步骤2)的基因组DNA优选来自
叶片，也可以来自其它部位。
[0015] 其中，步骤3)在如下反应条件下进行：
[0016] DNA模板(20ng/ul)1.5μl，10×Taq Green Buffer(含Mg2+)2ul，引物(10uM)0.7ul，dNTP(10mM)0.4ul，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，ddH2O定容20μl。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min；38℃
退火40sec；72℃延伸2min；45℃循环；最后72℃延伸5min后于4℃保存。
[0017] 本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
[0018] 利用引物S19可以鉴别出30份野牡丹属种质资源，利用引物S43可以鉴别出29份野牡丹种质资源，而采用引物S19和S43组合可以鉴别出供试的44份野牡丹属种质资源。利用这2条RAPD核心引物可建立44份野牡丹种质资源的指纹图谱，每个品种都有唯一的指纹图谱。
附图说明
[0019] 下面结合附图和
实施例对本发明作进一步说明。
[0020] 图1 S19引物对供试样品的ISSR图谱。M:分子量标记；1-44见表1中的序号。
[0021] 图2基于引物S19和S43扩增结果的44份野牡丹属种质资源基因组DNA的RAPD指纹图谱。
具体实施方式
[0022] 实施例1
[0023] 参见表1，本研究供试材料为野牡丹属野生种质资源共44份，来源于福建、广东、广西、海南、
云南五个省份。采集新鲜叶片冻于液氮，保存在-80℃。
[0024] 表1野牡丹属44份供试种质资源
[0025] Table 1 44 individuals of Melastoma
[0026]
[0027]
[0028] 实施例2 DNA提取
[0029] 采用前期试验确定的改良CTAB法提取野牡丹基因组DNA，主要步骤为：
[0030] (1)取约1g新鲜嫩叶，放入预冷的研钵中，在液氮中迅速
研磨成粉末，转入预冷的10mL离心管中，加入4mL预热至65℃的CTAB抽提液，同时加入80μLβ-巯基
乙醇，缓慢上下颠倒混匀，65℃
水浴60min(期间每10min颠倒混匀1次)。
[0031] (2)取出离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀，放在水平摇床上缓慢摇晃30min，静置后于4℃、7 500g离心5min，回收上(水)相。
[0032] (3)在回收的上层相中加入1/10体积的CTAB/NaCl溶液(65℃)，颠倒混匀。重复步骤2。若上清混浊，将上清液转入另一只10mL离心管中，再加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀，放在水平摇床上缓慢摇晃30min，静置后于4℃、7 500g离心5min。
[0033] (4)加入1倍体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀。如果看不到沉淀，于65℃温育30min。然后于4℃、9 000g离心5min。用0.5mL高盐TE缓冲液重悬沉淀，如果沉淀难重悬，于65℃温育30min，重复，直至所有的或大部分沉淀溶解。
[0034] (5)加入0.6体积预冷异丙醇，混匀，静置后于4℃、7500g离心15min，弃上清得到白色DNA，加入1mL 80％乙醇漂洗2次，再加入1mL无水乙醇漂洗1次，
风干DNA沉淀，加入0.1mL TE缓冲液，待DNA沉淀溶解后，于4℃保存备用。
[0035] 通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，并用分光光度法定量后，-20℃保存备用。
[0036] PCR反应
[0037] RAPD反应体系：DNA模板(20ng/ul)1.5μl，10×Taq Green Buffer(含Mg2+)2ul，引物(10uM)0.7ul，dNTP(10mM)0.4ul，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，ddH2O定容20μl。
[0038] 反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min；38℃退火40sec；72℃延伸2min；45℃循环；最后72℃延伸5min后于4℃保存。
[0039] 引物筛选：筛选出16条多态性好、条带清晰的RAPD引物(如表2)。
[0040] 表2 RAPD随机引物序列
[0041] Table 2 Primer sequence of RAPD
[0042]
[0043] 指纹图谱建立
[0044] 根据RAPD专用引物方法通过PCR反应扩增出的条带图片，对同一引物所扩增出迁移率相同的条带计为一个位点，有条带的
位置计为“1”，无条带位置计为“0”，所得数据输入Excel2003工作表建成原始“0/1”数据矩阵，利用NTSYS
聚类分析软件进行聚类分析。针对所有供试品 种，对11条RAPD引物扩增出的条带进行比对，选出鉴别能
力较强的引物，然后对由这些引物经PCR反应跑出的电泳条带进行形象化处理，同一位点上记为“1”的电泳条带用黑色方
块表示，记为“0”的条带用白色方块表示，据此构建出供试的44份野牡丹属种质资源的DNA指纹图谱。见图2。
[0045] RAPD-PCR扩增结果，16条引物共扩增出113条谱带,其中101条多态性条带，多态性比率为89.38％。扩增产物大小集中在2 00bp～2000bp之间。扩增位点最多的引物是S1、S19、S43，位点数均为9。其中引物S19对44份野牡丹属种质DNA的扩增图谱见图1。
[0046] 从筛选16条ARAPD引物中选择多态性好、鉴别效率高的核心引物S19和S43，建立44份野牡丹属种质资源的指纹图谱(图2)。利用引物S19可以鉴别出30份野牡丹属种质资源，利用引物S43可以鉴别出29份野牡丹种质资源，而采用引物S19和S43组合可以鉴别出供试的44份野牡丹属种质资源。由图2可知，利用2条RAPD核心引物可建立44份野牡丹种质资源的指纹图谱，每个品种都有唯一的指纹图谱。
