松墨天牛锌指蛋白FRU B isoform基因全长序列及其克隆 方法
技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物基因工程领域，具体是涉及松墨天牛锌指蛋白FRU B isoform基 因序列及其克隆方法。该基因编码锌指蛋白FRU B isoform，该基因与昆虫性别及昆虫求偶 行为的分子机理有密切关系。 技术背景
[0002] 锌指蛋白FRU(fruitless zinc-finger)，研究表明其通过不同的剪切方式产生特 异性产物，利用这些产物来控制雌雄果蝇的求偶行为，它们的剪切方式是雌雄果蝇求偶行 为和性别决定所必需的。据此推测锌指蛋白FRU与昆虫性别决定及昆虫求偶行为的分子机 理有密切关系。
[0003] 松墨天牛(Monochamus alternatus)，主要危害
马尾松、黑松、油松等针叶树的树 干和枝条的韧皮部和木质部，同时也是松材
线虫萎蔫病的主要传播媒介。目前对于对于松 墨天牛锌指蛋白FRU B isoform基因及其对松墨天牛性别决定及求偶行为的分子调控机理 尚无人研究。
发明内容
[0004]本发明的目的在于提供松松墨天牛锌指蛋白FRU B isoform基因全长序列及其克 隆方法。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0006] 1、总RNA的提取
[0007] 对松墨天牛成虫活体样品用液氮急冻处理，置于-8 0 °C备用。采用E . Z . N. A. T Μ Total RNA Kit II总RNA提取
试剂盒提取松墨天牛成虫总RNA。
[0008] 2、引物设计和3'RACE扩增
[0009] 根据本实验构建的CDNA文库中所获得的松墨天牛锌指蛋白FRU B isoform的5'端 序列，本发明在此
基础上进行3'RACE扩增，以获得松墨天牛锌指蛋白FRU B isoform基因全 长序列。
[0010] 3'RACE扩增的特异性引物为：
[0011] MB-NC0A7-37-Outer：CGAAACACCACCCATACCT
[0012] MB-NC0A7-37-Inner：GAGACGATGTGTTCTGTGTGG
[0013] 3、目的基因克隆及测序
[0014]套式PCR产物经由1.5%琼脂糖凝胶
电泳检测，回收目的0财
片段，与?1«)20-1'载体 连接，将连接产物转化E. co 1 i DH5a感受态细胞，进行AMP抗性蓝白斑筛选，挑选阳性菌落经 菌落PCR鉴定后测序。
[0015] 4、序列拼接
[0016] 将测序结果正确的序列与构建的cDNA文库松墨天牛锌指蛋白FRU B isoform基因 5'端序列拼接，获得松墨天牛锌指蛋白FRU B isoform基因全长序列。 [0017] 松墨天牛锌指蛋白FRUB isoform基因全长序列，该序列如下：
[0018]
[0019]序列中下划线所标示的atg为初始密码子，下划线所标示的taa为终止密码子。 [0020]根据松墨天牛锌指蛋白FRU B isoform基因全长序列，得到其
氨基酸序列。该序列 如下：
[0022]本发明利用基因克隆技术，对松墨天牛成虫进行RNA提取，并以3'RACE技术扩增松 墨天牛锌指蛋白FRU B isoform基因片段，在感受态细胞上进行目的基因克隆并测序，将测 序结果正确的序列与构建的cDNA文库松墨天牛锌指蛋白FRU B isoform基因 5'端序列拼 接，获得松墨天牛锌指蛋白FRU B isoform基因全长序列。对进一步研究松墨天牛性别决定 及求偶行为的分子机理以及
预防松材线虫萎蔫病的传播提供了有利支持。
具体实施方式
[0024] 1、松墨天牛总RNA提取
[0025]松墨天牛成虫采自广州市从化马尾松林。新鲜活虫用液氮急冻后保存于50mL冻虫 管中，置于_80°C
冰箱内保存备用。
[0026] 采用E.Z.N.A.TM Total RNA Kit II总RNA提取试剂盒提取松墨天牛成虫总RNA， 具体方法如下：
[0027] 1)在经液氮充分预冷的研钵中
研磨样品至粉末状，取不多于O.lg样品粉末放入 经液氮充分预冷的1.5mL离心管中，待液氮完全
蒸发完后，加入lmL RNA-Solv Reagent。
[0028] 2)将加入裂解液的样品室温放置2-3min，使得样品完全裂解。
[0029] 3)加入200yL氯仿，祸旋15s，冰上孵化10min;4°C下12000rcf离心15min，出现上层
水相。
[0030] 4)转移600yL上层水相至新的1.5mL离心管，加入200yL无水
乙醇，剧烈震荡15s，转 移全部
混合液到试剂盒提供的2mL Collecting tube，室温下lOOOOrcf离心lmin。
[0031] 5)将收集管中液体再次转移至
吸附柱中，室温下lOOOOrcf离心lmin。
[0032] 6)将吸附柱放入新的2mL Collecting tube，加入300yL RNA wash Bufferl，室温 下1 OOOOrcf离心lmin，弃废液。
[0033] 7)将吸附柱放回收集管中，加入400yL RNA wash Bufferl，室温下lOOOOrcf离心 lmin，弃废液。
[0034] 8)将吸附柱放回收集管中，加入500yL经添加48mL无水乙醇稀释的RNA wash Buff er2，室温下1 OOOOrcf离心lmin，弃废液。
[0035] 9)重复上一步骤。
[0036] 10)再次室温下 13000rcf 离心 2min。
[0037] 11)将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央悬空滴加40yL DEPC Water，室温静置2min，室温下13000rcf离心lmin，将所得的RNA溶液置于-80°C冰箱保存。 [0038] 注意事项：用于RNA实验的试剂，需使用干热灭菌（180°C，60min)或使用上述方法 进行DEPC
水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用 的无菌水须用0.1 %的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验使用的试剂盒无菌水都应 专用，避免混用后交叉污染。
[0039] 2、cDNA 3'末端扩增
[0040] 按照3'Full RACE Core Set Ver.2.0 kit试剂盒进行，具体操作步骤如下：
[0041] 1)反转录反应 [0042] 反应体系如下：
[0043] PCR 反应程序为:42 °C 反应 60min，70 °C 反应 15min。
[0044] 2)套式PCR扩增
[0045] a)0uter PCR扩增 反应体系如下：
[0046] PCR 反应程序为：94°C 预变性 3min，94°C30s，55 °C 30s，72 °C lmin，20 个循环，然后 72 °C延伸1 Omin。PCR产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。
[0047] b)Inner PCR扩增 反应体系如下：
[0048] PCR 反应程序为：94°C 预变性 3min，94°C30s，55 °C 30s，72 °C lmin，30 个循环，然后 72 °C延伸1 Omin。PCR产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。
[0049] 3、目的基因克隆及测序
[0050] 1)从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
[0051] a)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500yL平衡液BL，室温 下，12000rcf离心lmin，弃废液。
[0052] b)将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶切下（尽量
切除多余部分)放入干净的1.5mL 离心管中，称取重量。
[0053] c)向胶
块中加入等倍体积溶液PC(如果凝胶重为0. lg，其体积可视为100yL，则加 入100yL PC溶液），50°C水浴lOmin左右，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分 溶解。
[0054] d)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），12000rcf离 心lmin，弃废液。
[0055] e)向吸附柱CB2中加入600yL漂洗液PW(使用前先加入60mL无水乙醇稀释），静置3_ 4min，12000rcf 离心 lmin，弃废液。
[0056] f)重复上一步骤。
[0057] g)再次12000rcf离心2min，尽量除去漂洗液。室温放置3min，彻底晾干。
[0058] h)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间悬空滴加40yL洗脱缓冲液EB，室温放 置 2min，12000rcf 离心 2min。
[0059] i)将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12000rcf离心2min， 收集DNA溶液到200yL PCR管中，置于-20°C冰箱保存备用。
[0060] 2)T载体连接[0061 ] PCR管中依次加入：pMD20-T Vector lyL，回收的目标DNA片段产物3yL， Sterilized water lyL，加入5yL的Solution I至最终体积为10yL，4°C静置过夜。
[0062] 3)转化感受态细胞
[0063] a)从-80 °C冰箱取出感受态细胞放在冰上解冻，冰融后，轻柔混合，加入50yL感受 态细胞于1.5mL离心管中。
[0064] b)加入4yL T载体连接产物(连接产物的加入量不能超过感受态细胞体积的十分 之一），缓慢混均。
[0065] c)冰上孵化 30min。
[0066] d)置于42°C水浴锅中，热激45s。
[0067] e)冰上静置lmin，加入S0C(事先从-20°C冰箱取出并置于37°C解冻)446yL定容至 500yL〇
[0068] f)37°C 下，225rpm 摇菌 lh。
[0069] g)震荡后，每个培养基加入100此菌液，用无菌三
角弯头玻棒轻轻地将菌液均匀涂 开，用
锡纸严实包裹平板，
正面静置2h后倒置平板，37 °C，培养12-16h。
[0070] 4)阳性重组子的鉴定及测序
[0071] a)在1.5mL离心管中加入600yL含氨苄的培养液，挑选白色菌落放入培养液中，37 。(:下，225rpm 培养 3h。
[0072] b)菌落 PCR 反应体系如下：
[0073] 反应条件为：94°(：预变性3111丨11;941€3〇8;55 1€3〇8 30个循环；72°(：1111丨11;721€ 10min。反应结束后取5yL反应产物，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0074] c)将包含正确重组子的克隆送至生工生物进行测序。
[0075] 4、将测序正确的序列除去重叠部分，与构建的cDNA文库松墨天牛锌指蛋白FRU B isoform基因5'端序列拼接，获得松墨天牛锌指蛋白FRU B isoform基因全长序列。
