一种陆地棉亚鸡脚叶种质材料的鉴定方法及其专用引物
阅读：949发布：2023-03-09
专利汇可以提供一种陆地棉亚鸡脚叶种质材料的鉴定方法及其专用引物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种陆地 棉 亚鸡脚叶种质材料的鉴定方法及其专用引物，可对陆地棉亚鸡脚叶种质材料所有具有的亚鸡脚叶性状进行早期快速鉴定，加快育种 进程 。以待测陆地棉的基因组DNA为模板，采用特定引物进行PCR扩增，根据PCR产物在凝胶上呈现的带型进行判断，只含有230bp带型的为亚鸡脚叶纯合体，含有200bp带型的为正常阔叶，二者都有的是亚鸡脚叶杂合体。本发明可在室内用 种子 或者小苗对亚鸡脚叶种质材料纯度进行鉴定，加快育种进程，提高优异亚鸡脚叶纯合材料的选择效率。，下面是一种陆地棉亚鸡脚叶种质材料的鉴定方法及其专用引物专利的具体信息内容。
1.一种陆地棉亚鸡脚叶种质材料的鉴定方法，其特征是，以待测陆地棉的基因组DNA为模板，采用引物对：正向引物5’—GATGCACCAGATCCTTTTAT—3’和反向引物5’—GGTACATCGGAATCACAGT—3’，进行PCR扩增，根据PCR产物在凝胶上呈现的带型进行判断，只含有230bp带型的为亚鸡脚叶纯合体，含有200bp带型的为正常阔叶，二者都有的为亚鸡脚叶杂合体。
2.用于鉴定陆地棉亚鸡脚叶种质材料的引物，其特征是，序列为：正向引物5’—GATGCACCAGATCCTTTTAT—3’，反向引物5’—GGTACATCGGAATCACAGT—3’。
3.权利要求2所述引物在制备用于鉴定或辅助鉴定陆地棉亚鸡脚叶种质材料的试剂盒中的应用。
4.一种用于鉴定或辅助鉴定陆地棉亚鸡脚叶种质材料的试剂盒，其特征是，含有权利要求2所述引物。
一种陆地棉亚鸡脚叶种质材料的鉴定方法及其专用引物
技术领域
背景技术
[0002] 棉花是我国重要的经济作物，其主产品棉纤维是重要的纺织工业原料，在纺织产业中发挥着无可替代的作用。叶片是棉花重要的光合器官，负责将光能转化成碳水化合物供植物体生长发育。叶片形状的变化对棉花的生长发育有很大影响，进而影响到棉纤维产量及品质。陆地棉叶形可分为正常叶和深裂叶。正常叶叶形为鸭掌型，叶裂较浅，叶面积大，管理不善通常容易造成棉花冠层郁蔽，使中下部棉铃因光照不足而产生严重脱落，阴雨年份容易造成烂铃，容易影响脱叶剂的喷施效果，影响机采棉品质。
[0003] 亚鸡脚叶属于棉花深裂叶，叶裂较深，叶面积系数适中；在有效改善棉花冠层结构的同时，可在一定程度上弥补鸡脚叶棉有效叶面积不足的问题；此外，亚鸡脚叶表型可作为形态标记用于区分真假杂种，在棉花杂种优势利用中有较大用途。
[0004] 目前，生产上一般通过在蕾期和花期调查叶形表型来鉴定亚鸡脚叶材料。对亚鸡脚叶纯合材料和杂合材料的鉴定通常需要将优选材料种成株行，于下一个季节株行叶形分离表型鉴定后方可判断该单株是否为纯合类型。
发明内容
[0006] 因此，本发明采取的技术方案如下：一种陆地棉亚鸡脚叶种质材料的鉴定方法，以待测陆地棉的基因组DNA为模板，采用引物对：正向引物5’—GATGCACCAGATCCTTTTAT—3’和反向引物5’—GGTACATCGGAATCACAGT—3’，进行PCR扩增，根据PCR产物在凝胶上呈现的带型进行判断，只含有230bp带型的为亚鸡脚叶纯合体，含有200bp带型的为正常阔叶，二者都有的为亚鸡脚叶杂合体。
[0007] 上述带型均为主带带型。
[0008] 所述PCR扩增反应体系和程序为：
[0009] PCR体系为20ul，包含2×EasyTaqPCR Supermix 10ul，DNA模板1ul，所述正向引物和反向引物各1ul，DDH2O 7ul；
[0012] 本发明还提供一种用于鉴定或辅助鉴定陆地棉亚鸡脚叶种质材料的试剂盒，含有所述引物。
[0013] 现有的对亚鸡脚叶材料进行鉴定的方法存在如下缺点：
[0014] 1.由于叶裂表型在棉花生育前期表现不是太明显，只能从蕾期开始鉴定，无法筛选苗期表现优异的亚鸡脚叶单株。
[0015] 2.叶形表型属于形态标记易受环境的影响，给表型鉴定的稳定性带来一定难度。
[0016] 3.从遗传角度上讲，亚鸡脚叶对正常叶是不完全显性遗传，但是在大田育种过程中纯合亚鸡脚叶纯合型和杂合型的区分难度较大，影响了优异纯合亚鸡脚叶材料的筛选效率，影响了育种进程。
[0017] 因此，针对上述现有技术的缺点，本发明选择了基于PCR分子标记的亚鸡脚叶材料筛选方法，本发明方法可以提前对亚鸡脚叶材料进行鉴定，并同时确保亚鸡脚叶材料筛选的准确性及高效性。
[0018] 与现有技术相比本发明具有以下优点：
[0020] 2.本发明使用的DNA分子标记属于中性标记，不受时期、环境及组织器官的影响，鉴定结果稳定可靠；
[0022] 图1为部分单株的形态表型和标记基因型统计对比。
具体实施方式
[0023] 下面结合具体试验方法对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0024] 本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
[0025] 下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所使用的各水物品种(品系)均为育种领域中常规使用的品种(品系)，通过国家审定认定或者技术鉴定，可在品种资源库获得或者市场采购。
[0026] 实施例一.一种陆地棉亚鸡脚叶种质材料的鉴定方法，步骤如下：
[0027] 1.种子或者苗期取陆地棉材料新鲜嫩叶，提取基因组DNA，并对DNA质量进行检测，稀释到50ng/ul；
[0028] 2.根据已知棉花EST系列，SSRhunter软件设计一对特异SSR标记引物，正向引物：5’—GATGCACCAGATCCTTTTAT—3’(SEQ ID No.1)；反向引物：5’—GGTACATCGGAATCACAGT—
3’(SEQ ID No.2)。
3’(SEQ ID No.2)。
[0029] 设计引物的EST序列如下(SEQ ID No.3)，下划线表示引物位置。
[0030] CTGGACTAACACCAATAATCACTAAACTTTGATTAAAATAACATTTCAGTTACTAAACTTTCAAAAGTGACAAATCAGTCATTAACATTTACGAAAAGTGACAAATTAGTCACCTGAGAGTGGACATCTGACGTGGCCCGTTAGGGTGCCACGTTGAACATGATCGGATGCACCAGATCCTTTTATTAGTTTATAAGGATTACCAACTAAATAGAAGAAGAAGAAGAAGAGGAAGAAGAAGAAGAAAAGGAAGAAGAAGAAGAAGAATAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAAAAGAGAAATGGAAATACCCACTGTGATTCCGATGTACCGTCATTTGGACGGAATTTAAAAGACACTTTAGTTGTTATTAAGAACTGATTTTTATTTGGATTTAAAAGAC
[0031] 3.以稀释的DNA为模板，进行PCR扩增，反应体系及运行程序如下：
[0032] PCR体系为20ul，包含2×EasyTaqPCR Supermix 10ul，DNA模板1ul，上游引物和下游引物各1ul，DDH2O 7ul；
[0033] PCR程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s(35个循环)72℃后延伸10min；
[0035] 5.标记基因型鉴定，根据PCR产物在凝胶上呈现的带型进行判断，只含有230bp带型的为亚鸡脚叶纯合体，含有200bp带型的为正常阔叶，二者都有的是亚鸡脚叶杂合体。
[0036] 实施例二.用本发明方法对100个样本进行亚鸡脚叶的鉴定
[0037] 1.材料：
[0038] 以正常阔叶材料鲁棉研28号为母本，亚鸡脚叶纯合材料S131189系为父本，构建包涵229个单株的亚鸡脚叶和正常阔叶分离F2群体。
[0039] 2.DNA提取：
[0040] 于苗期随机选取100个单株，提取幼嫩叶片，用CTAB法提取基因组DNA，并对DNA质量进行检测，浓度调整到50ng/ul。
[0041] 3.PCR反应：
[0042] PCR反应在ABI9700PCR仪上进行，体系为20ul，包括10ul的2×EasyPCR mix，1ul的DNA模板，上游引物和下游引物各1ul，7ul的DDH2O。反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，35循环，72℃延伸10min。
[0043] 4.电泳及基因型鉴定：
[0044] PCR产物在8％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，如图1所示，统计群体230bp(巴西014基因型)和200bp(S131189)带型。仅有230bp带型基因型记为B；仅有200bp带型基因型为A；同时包含两种230bp和200bp带型记为H。
[0045] 5.叶形表型鉴定：
[0046] 分别于蕾期和苗期对群体叶形的分离表型进行鉴定。正常阔叶标记为B，亚鸡脚叶纯合标记为A，亚鸡脚叶杂合标记为H。
[0047] 6.数据统计：
[0048] 对分离群体的形态表型及基因型分别统计，并核对基因型和表型的吻合情况。
[0049] 7.结果与分析：
[0050] 形态表型统计显示，在100个单株中，正常阔叶23株，亚鸡脚叶纯合32株，亚鸡脚叶杂合45株。基因型统计显示，100个个体中，基因型为A的个体为40，基因为H的个体36，基因型为B的个体23个。正常阔叶的表型和基因型表现一致，亚鸡脚叶纯合和杂合的表型和基因型有8个单株表现差异，6个基因型为A的表型表现为亚鸡脚叶杂合，2个基因型为H的表型表现为亚鸡脚叶纯合。将100个单株种成株行，92个基因型和表型吻合单株的株行表型未出现分离，6个基因型为A的单株的株行未出现叶形分离全部为亚鸡脚叶，说明该6个单株全部为亚鸡脚叶纯合单株。2个基因型为H，表型鉴定为A的单株，1个单株的株行全部为亚鸡脚叶，另外1个表现为亚鸡脚叶和正常叶形分离。
[0051] 通过比较可以得知，常规表型鉴定的准确率为92％，而本发明基因型鉴定的准确率为99％；且常规表型鉴定只能从蕾期开始鉴定，无法筛选苗期表现优异的亚鸡脚叶单株，而本发明基因型鉴定可提前到苗期，筛选出在苗期表现优异的亚鸡脚叶材料。这说明本发明基于分子标记的鉴定方法比形态鉴定更可靠。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 扩增子测序文库及其构建方法 | 2020-05-11 | 135 |
| 用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应 | 2020-05-11 | 550 |
| 一种用于扩增子测序的建库方法 | 2020-05-12 | 873 |
| 具有碱基配对的寡聚体的扩增报告子 | 2020-05-13 | 360 |
| 一种用于牛性状扩增子测序的引物组 | 2020-05-13 | 894 |
| 防止扩增过程中高分子量产物的方法 | 2020-05-12 | 851 |
| 使用饱和染料的扩增子解链分析 | 2020-05-12 | 655 |
| 使用连接扩增的分子检测 | 2020-05-12 | 810 |
| 进行扩增子挽救多重PCR的装置 | 2020-05-13 | 23 |
| 单引物至双引物扩增子转换 | 2020-05-11 | 182 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈