适用于扩增子测序文库构建的引物及扩增子测序文库的构建方法
阅读：428发布：2020-05-11
专利汇可以提供适用于扩增子测序文库构建的引物及扩增子测序文库的构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种适用于 扩增子 测序文库构建的引物及扩增子测序文库的构建方法。该引物由一条上游引物和一条下游引物构成，且上游引物和下游引物按照从5’端至3’端的顺序均包括接头序列、测序引物序列和目的 片段 扩增引物序列。本发明所提供的引物，通过将接头序列、测序引物序列和目的片段扩增引物序列整合在于一对引物上，使得利用该引物够经一步扩增完成文库构建，不仅提高测序文库 质量 及建库效率，而且构建所得的扩增子测序文库因具有常规测序平台上所使用的接头序列以及测序引物序列，使得该测序文库能够利用常规上机测序所用的 试剂 进行高通量测序，而无需额外提供测序引物以及对所混入的PHiX文库的测序引物进行变更。，下面是适用于扩增子测序文库构建的引物及扩增子测序文库的构建方法专利的具体信息内容。
1.一种适用于扩增子测序文库构建的引物，其特征在于，所述引物由一条上游引物和一条下游引物构成，且所述上游引物和下游引物按照从5’端至3’端的顺序均包括接头序列、测序引物序列和目的片段扩增引物序列。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述上游引物中的接头序列为P5端接头序列，所述下游引物中的接头序列为P7端接头序列，所述下游引物中的测序引物序列还包括标签序列，所述标签序列为6～10个碱基按不同的排列组合所形成的序列。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，所述引物用于构建16S rDNA v4区、18S rDNA、ITS或功能基因的扩增子测序文库。
4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，当所述引物用于构建16S rDNA v4区的扩增子测序文库时，所述引物包括：
SEQ ID NO.1所示的上游引物；以及
SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的任一条下游引物。
5.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，当所述引物用于构建18S rDNA、ITS或功能基因的扩增子测序文库时，所述引物中的所述目的片段扩增引物序列为18S rDNA、ITS或功能基因上的保守序列。
6.一种扩增子测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法通过利用权利要求1至5中任一项的所述引物经一步扩增步骤得到所述扩增子测序文库。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法在所述一步扩增步骤后，还包括以下步骤：
对扩增产物进行混合，得到混合样品；
对所述混合样品进行电泳纯化，得到所述扩增子测序文库。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述电泳纯化步骤中采用Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit进行纯化。
9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，在得到所述扩增子测序文库后，并在进行高通量测序之前，还包括对所述扩增子测序文库进行质检的步骤。
10.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述扩增子测序文库利用Illumina Miseq配套试剂进行高通量测序。
适用于扩增子测序文库构建的引物及扩增子测序文库的构
建方法
技术领域
[0001] 本发明涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种适用于扩增子测序文库构建的引物及扩增子测序文库的构建方法。
背景技术
[0002] 扩增子测序是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，主要包括16S rDNA测序、18S rDNA测序、ITS测序及功能基因检测等。采用Illumina MiSeq第二代高通量测序平台测定的16S/18S/ITS某个高变区域的序列，来反应环境样品在细菌、真菌、古细菌分类方面物种之间的差异，对研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成有重要的指导作用；同样，也可通过对某些功能基因片段的测序，挖掘更多的生物学信息。
[0003] 16S rDNA为编码原核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，采用MiSeq测序仪，对16S rDNA某个高变区进行测序，以进一步对环境微生物中的细菌或古细菌的多样性进行分析。
[0004] 为完成16S rDNA的测序，首先需要基于Illumina测序仪进行相应的文库构建，目前基于Illumina测序平台的建库方法主要有两种，包括两步扩增建库方法以及一步扩增建库方法。第一种建库方法为较早的建库方法，为两步扩增建库，即使用两对引物进行两轮PCR进行建库。第二种方法为Illumina官方推荐的一步扩增方法，该方法目前使用比较广泛，即通过一步扩增完成建库过程。
[0005] 上述两种建库方法中，两步扩增方法虽然可以直接使用Illumina Miseq相配套的试剂进行测序，但建库过程中需要经过两次扩增，步骤较为繁琐，且经过两次扩增引入的污染较多，使得后续信息分析准确度降低。一步扩增方法虽然可以较为方便地通过一步PCR扩增完成建库，但该方法在进行上机测序时，不能使用Illumina Miseq相配套的试剂进行测序，需要自定义目的片段的测序引物以及每个样品的index测序引物，而且，同时还需要对混入的λ-DNA文库(PhiX文库)的相应测序引物进行变更才可进行测序。
[0006] 因此，仍需要对现有的建库方法进行改进，以便提供一种快捷、污染较少的扩增子测序文库构建方法，而且后续上机测序步骤也比较方便。
发明内容
[0008] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种适用于扩增子测序文库构建的引物，该引物仅由一对引物构成，且一对引物中的上游引物和下游引物按照从5’端至3’端的顺序均包括接头序列、测序引物序列和目的片段扩增引物序列。
[0009] 进一步地，上游引物中的接头序列为P5端接头序列，下游引物中的接头序列为P7端接头序列，下游引物中的测序引物序列还包括标签序列，标签序列为6～10个碱基按不同的排列组合所形成的序列。
[0010] 进一步地，引物用于构建16S rDNA v4区、18S rDNA、ITS或功能基因的扩增子测序文库。
[0011] 进一步地，当引物用于构建16S rDNA v4区的扩增子测序文库时，引物包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物；以及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的任一条下游引物。
[0012] 进一步地，当引物用于构建18S rDNA、ITS或功能基因的扩增子测序文库时，引物中的目的片段扩增引物序列为18S rDNA、ITS或功能基因上的保守序列。
[0013] 根据本发明的另一方面，还提供了一种扩增子测序文库的构建方法，该构建方法通过利用上述任一对引物经一步扩增步骤得到扩增子测序文库。
[0014] 进一步地，构建方法在一步扩增步骤后，还包括：对扩增产物进行混合，得到混合样品；对混合样品进行电泳纯化，得到扩增子测序文库。进一步地，电泳纯化步骤中采用Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit进行纯化。
[0015] 进一步地，在得到扩增子测序文库后，并在进行高通量测序之前，还包括对扩增子测序文库进行质检的步骤。
[0016] 进一步地，扩增子测序文库利用Illumina Miseq配套试剂进行高通量测序。
[0017] 应用本发明的技术方案，通过将接头序列、测序引物序列和目的片段扩增引物序列这三种序列整合在上、下游扩增的一对引物上，使得利用该引物够通过一步扩增完成文库构建，不仅提高测序文库质量及建库效率，而且构建所得的扩增子测序文库因具有常规测序平台上所使用的接头序列以及测序引物序列，使得该测序文库能够利用常规上机测序所用的试剂进行高通量测序，而无需额外提供测序引物以及对所混入的PHiX文库的测序引物进行变更。附图说明
[0019] 图1示出了本发明一种优选实施例中所提供的引物结构示意图；以及
[0020] 图2示出了本发明实施例1通过一步扩增后所得到扩增子测序文库经电泳检测的结果。
具体实施方式
[0021] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0022] 如背景技术部分所提到的，在现有技术中存在的扩增子测序文库的构建方法存在步骤繁琐或容易污染且不方便上机操作的缺陷。为了克服上述缺陷，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种适用于扩增子测序文库构建的引物，由图1所示，该引物仅由一对引物构成，且这一对引物中的上游引物和下游引物按照从5’端至3’端的顺序均包括接头序列、测序引物序列和目的片段扩增引物序列。
[0023] 本发明所提供的引物，通过将接头序列、测序引物序列和目的片段扩增引物序列这三种序列整合在上、下游扩增的一对引物上，使得利用该引物够通过一步扩增完成文库构建，不仅提高测序文库质量及建库效率，而且构建所得的扩增子测序文库因具有常规测序平台上所使用的接头序列以及测序引物序列，使得该测序文库能够利用常规上机测序所用的试剂进行高通量测序，而无需额外提供测序引物以及对所混入的PHiX文库的测序引物进行变更。
[0024] 本发明的上述引物中，上游引物中的接头序列为P5端接头序列，下游引物中的接头序列为P7端接头序列，下游引物中的测序引物序列还包括标签序列，标签序列为6～10个碱基按不同的排列组合所形成的序列。采用上述接头序列和标签序列使得利用本发明的上述引物既能一步完成扩增子测序文库的构建，而且所构建的扩增子测序文库能够与Illumina MiSeq测序平台的试剂配套使用进行高通量测序。
[0025] 本发明的上述引物，可用于构建任何目的片段的扩增子测序文库。既可以是能够体现生物多样性的16S rDNA v4区、18S rDNA、ITS区域的扩增子测序文库，也可以是研究人员所感兴趣的某些功能基因及其基因片段的扩增子测序文库。不同的扩增子测序文库，只需要将上述引物中的目的片度扩增引物替换成所感兴趣的基因片段的引物即可。比如，当引物用于构建16S rDNA v4区、18S rDNA、ITS或功能基因的扩增子测序文库时，引物中的目的片段扩增引物序列为16S rDNA v4区、18S rDNA、ITS或功能基因上的保守序列。
[0026] 在本发明一种优选的实施例中，当上述引物用于构建16S rDNA v4区的扩增子测序文库时，引物包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物；以及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的任一条下游引物。
[0027] 利用本发明所提供的上述用于构建16S rDNA v4区的扩增子测序文库的引物，不仅能够使16S rDNA v4区的扩增子测序文库通过一步扩增步骤完成，而且所构建的文库能够利用Illumina MiSeq测序平台的配套试剂进行高通量测序，不需要进行测序引物以及PhiX文库的变更，使得16S rDNA v4区扩增子更加方便快捷的完成测序文库构建以及上机测序过程。
[0028] 在本发明另一种典型的实施方式中，还提供了一种扩增子测序文库的构建方法，该构建方法中，利用上述任一对引物经一步扩增步骤完成扩增子测序文库的构建。本发明的构建方法所用的引物在目的片段扩增引物序列的上游还包括了后续高通量测序时用于文库扩增的两端接头引物序列以及测序时所用的测序引物，因而仅通过对目的片度扩增一步就完成了后续步骤所用到的引物，而且还能够与常规的测序平台所用的其他试剂配套使用，不仅高效、快捷地完成扩增子测序文库的构建，而且也便于后续上机操作，提高了扩增子测序的整体效率。
[0029] 在本发明的上述构建方法中，在一步扩增步骤后，根据所得的扩增子测序文库的质量差异(包括扩增效率以及扩增纯度等的不同)决定是否有必要进行纯化步骤。在本发明中，为了进一步确认所得的扩增子测序文库的大小以及进一步提高扩增子测序文库的纯度，在本发明一种优选的实施例中，上述构建方法在一步扩增步骤后，还包括：对扩增产物进行混合，得到混合样品；对混合样品进行电泳纯化，得到扩增子测序文库。
[0030] 上述优选实施例通过对目的基因片段进行扩增后对得到不同片段的扩增子测序文库进行混合，由于不同样品扩增产物中的标签序列不同，且片段的扩增子文库能够采用通用的接头引物序列和测序引物序列来进行后续上机的高通量测序，因此可以将产物混在一起；然后进行电泳纯化是通过电泳将非特异扩增的片段从目的片段中去除掉，从而使待测序的扩增子文库纯度更高，得到的测序数据质量也更好。
[0031] 在本发明的上述电泳纯化步骤中，本发明优选采用Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit进行纯化，该试剂盒纯化效果相比其他同类的纯化试剂盒，纯度更高。
[0032] 在本发明的上述构建方法与其他高通量测序文库构建步骤一样，在得到扩增子测序文库后，并在进行高通量测序之前，还包括对扩增子测序文库进行质检的步骤。通过质检检测所构建的文库的片段大小是否合适，以及浓度大小是否达到上机要求，并根据浓度的大小决定上机所使用的浓度。
[0033] 本发明的上述构建方法中，所得到的扩增子测序文库由于具有Illumina MiSeq测序平台后续测序所用的文库扩增引物及测序引物，因而可以利用Illumina Miseq配套试剂进行高通量测序。
[0034] 下面将结合具体的实施例来说明本发明的有益效果。
[0035] 应用于Illumina MiSeq测序的16S rDNA v4区扩增子测序文库的构建方法，包括如下实验步骤：
[0036] (1)根据样品16S rDNA DNA浓度，使用无菌水将样品稀释至1ng/μl，如果样品中存在大量的RNA污染则需要先使用RNase消化后再进行稀释。
[0037] (2)PCR扩增。使用表1中所示的已经合成好的引物进行扩增，其中SEQ ID NO.1为扩增的上游引物，其中，第1～21位碱基为上游接头序列，第22～58位碱基为上游测序引物序列，第59～77位碱基为上游目的片段扩增引物序列。
[0038] SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.25为下游引物，其中，第1～24位碱基为下游接头序列，第25～30位碱基为标签序列，第31～64位碱基为下游测序引物序列，第65～84位碱基为下游目的片段扩增引物序列。
[0039] 上述任一下游引物与SEQ ID NO.1上游引物组成一对引物对16S rDNA v4区进行扩增。
[0040] 表1：
[0041]编号 引物序列
SEQ ID NO.1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGCCAGCMGCCGCGGTAASEQ ID NO.2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCTGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.10CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.11CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.12CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTGTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.13CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.14CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTTCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.15CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.16CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCGTCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.17CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.18CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCCGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.19CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGAAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.20CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.21CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTTTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.22CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.23CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAGTGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.24CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGTAGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.25CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAAT[0042] 反应体系如下：
SEQ ID NO.1 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGCCAGCMGCCGCGGTAASEQ ID NO.2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGCTGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.10CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.11CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.12CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTGTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.13CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTCAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.14CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGTTCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.15CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.16CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCGTCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.17CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.18CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCCGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.19CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGAAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.20CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.21CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTTTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.22CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.23CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGAGTGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.24CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGTAGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAATSEQ ID NO.25CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAAT[0042] 反应体系如下：
[0043] 16S V4区域PCR反应体系(30μl)：
[0044]
[0045] 反应程序如下：
[0046]
[0047]
[0048] (3)电泳检测PCR产物。对每个样品取3μl进行产物检测，检测如图2所示。
[0049] 图2中，从左至右分别表示SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.25扩增所得到产物。其中，指示DNA分子大小的条带(marker)从下往上分别为：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1500bp。正常16S rDNA V4区的大小为
300bp左右，上下游引物总长约160bp的，因此，扩增得到的总长应为450bp左右。
300bp左右，上下游引物总长约160bp的，因此，扩增得到的总长应为450bp左右。
[0050] 图2中所示的PCR产物大小约400-450bp左右，可见，利用本发明的上述引物括扩增得到的16S rDNA v4区的扩增子测序文库的大小是符合预期的。
[0051] (4)PCR产物混样并进行电泳纯化，完成目的片段文库的构建。对PCR产物进行等质量混样，进行电泳，切取目的片段，使用Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit进行回收，回收后即可完成文库构建。
[0052] (5)利用安捷伦2100和realtime-PCR对所得的扩增子测序文库进行目的片段大小、文库浓度进行质检，合格后即可使用Miseq进行上机测序。
[0053] (6)对获得的数据进行信息分析。
[0054] 从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例按照本发明的思想所提供的上述引物，通过一步扩增迅速完成建库过程，并且所构建的文库可以直接使用Illumina Miseq相配套的试剂进行上机测序，不需要进行测序引物的合成以及PhiX文库的变更，使得16S rDNA v4区以及其他扩增子测序更加方便快捷的完成建库以及上机测序过程。
[0055] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0056]
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