具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法
阅读：256发布：2021-06-14
专利汇可以提供具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种人工 生物 瓣瓣膜的制备方法，属于 生物材料 领域。本发明以动物或人异体 心脏瓣膜 为原料，以化学方法脱去动物或人异体心脏瓣膜的细胞，得到脱细胞瓣膜的胞外基质材料。将此材料浸入不同浓度、不同比例的原花青素溶液中，在适当 温度 条件下，摇动交联，从而得到无毒性、不皱缩的人工生物瓣瓣膜材料，用作制备临床心脏瓣膜置换、修复和再生。本发明方法可通过调节交联剂原花青素溶液的浓度、交联的时间和清洗时间等，实现交联的 力 学强度、抗酶解能力、交联剂释放、促进组织再生能力等方面的可调控。本发明工艺简单易行，且便于推广。，下面是具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法，包括交联前处理、交联和 交联后处理及保存，其特征在于采用原花青素作为联剂交联脱细胞心脏瓣膜， 其方法是按每片瓣膜浸泡于1-20ml，含原花青素为0.01-20mg/ml的 D-Hanks液溶液，作脱细胞心脏瓣膜交联；交联脱细胞心脏瓣膜的温度1- 40℃，交联在摇床摇动条件下完成，其摇动速度为10-300rpm，交联时间为 1分钟-240小时；所述的D-Hanks为无Ca+、Mg+的离子的磷酸缓冲溶液， 其组成为KCl 0.4g/L，KH2PO4 40.06g/L，NaCl 8.00g/L，NaHCO3 0.35g/L， Na2HPO4·7H2O 0.09g/L，酚红0或0.01g/L。
2.按权利要求1所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法，其特征在 于按每片瓣膜浸泡于1-10ml的含原花青素为0.06-10mg/ml的无Ca+、Mg+ 的离子的磷酸缓冲溶液。
3.按权利要求1所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法，其特征在 于交联前处理包含心脏瓣膜原材料收集与脱细胞处理和前处理，步骤是：
(a)清洗：
在屠宰场将刚宰杀的猪心脏内主动脉瓣膜或肺动脉瓣膜连同周围血管剪下， 置于无Ca2+、Mg2+离子的磷酸缓冲溶液中于4℃下1小时内带回，并剪取瓣 膜叶片，用D-Hanks液清洗干净；
(b)脱细胞：
脱细胞液分A液和B液，都以D-Hanks液为基配制。瓣膜分两步脱细胞，第 一步用A液，第二步用B液；每一步均按每片瓣膜加入2-20ml的比例加入； 脱细胞液A液从以下三种溶液配方中的任选一种：
配方1，含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二钠；
配方2，含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.5％非离子去垢剂聚乙二醇辛基苯 基醚、0.5％脱氧胆酸钠和0.02％乙二胺四乙酸二钠；
配方3，含0.5％聚乙二醇辛基苯基醚、0.5％脱氧胆酸钠和0.02％乙二 胺四乙酸二钠；
配方1，2和3中百分数为每100ml中所含的质量数。
脱细胞液B液配方为D-Hanks液配制的20μg/ml的核酸酶和0.2mg/ml的脱 氧核酸酶混合液；
脱细胞的工艺处理条件是温度为1-40℃，摇床摇动速度为0-300rpm，空气 湿度为30％-95％，CO2浓度为0.3％-5％，时间为10分钟-100小时。
4.按权利要求1或3所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法，其特 征在于脱细胞工艺处理温度为20-37℃，摇床摇动温度120-240rpm，空气 温度为50-95％，时间为1-48小时。
5.按权利要求1所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法，其特征在 于交联过后以每片瓣膜加2-20ml的比例加入D-Hanks的溶液浸泡瓣膜，清 洗0-480小时，清洗是在0-40℃、摇床在0-300rpm摇动条件下完成。
6.按权利要求1或5所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法，其特 征在于交联后清洗时间为5分钟-1小时，清洗温度20-37℃，摇床速度为 60-120rpm。
7.按权利要求1所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法，其特征在 于清洗后瓣膜保存在1-10℃的D-Hanks溶液中。
8.按权利要求1或7所述的具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法，其特 征在于清洗后瓣膜保存在4℃的D-Hanks溶液中。
技术领域
本发明涉及一种具有生物活性人工生物瓣瓣膜的制备方法，属生物医学工程 领域。
背景技术
心脏瓣膜病是危及人类健康的一种严重疾病，目前对于心脏瓣膜病人主要采 用人工心脏瓣膜置换手术治疗[Julie R，Boris AN，Vacanti JP.Tissue engineering：a 21st century solution to surgical reconstruction.Ann thorac surg，2001，72：577-591.]。人工心脏瓣膜包括机械瓣和生物瓣两类， 它们各有其成功和不足之处。机械瓣体内植入寿命可达25年之久，因而是目前 使用最多的人工瓣膜。但机械瓣存在难以克服的严重缺陷，如非生理性、对正常 血液流动状态的阻碍、手术后必须终身服用抗凝药物而引起的出血合并症、每年 高达5％的血栓率、不能随青少年心脏发育长大而长大等。这些问题使机械瓣的 使用潜伏着多项危险因素。也使国际上对人工心脏瓣膜的研究热点转向了生物瓣 [Julie R，Boris AN，Vacanti JP.Tissue engineering：a 21st century solution to surgical reconstruction.Ann thorac surg，2001，72：577-591.]。
生物瓣是用与人体结构功能相近的动物或人的心脏瓣膜或心包膜加工而成 的瓣膜假体[Schmidt CE，Baier JM.Acellular vascular tissue：natural biomaterals for tissue repair and tissue engineering. Biomaterals，2000，21(2000)：2215-2231.]。就生物瓣来说，同种异体瓣临床 应用成功率较高，但其来源有限；异种瓣虽来源广泛，但有抗原性，必须经过戊 二醛交联处理才能使用。经戊二醛交联的猪主动脉瓣有一定的强度和韧性，基本 保留了猪心脏瓣膜的胶原结构，减少了免疫原性，很大程度上避免了机械瓣置换 后需终身抗凝的缺点。然而将这种瓣膜直接植入体内后，往往会出现严重的钙化， 加之戊二醛处理后戊二醛本身的残留毒性以及瓣膜组织残留的免疫原性，极大地 降低了其体内工作寿命[Schmidt CE，Baier JM.Acellular vascular tissue： natural biomaterals for tissue repair and tissue engineering. Biomaterals，2000，21(2000)：2215-2231.]。另外，不经任何交联固定的脱细 胞人工瓣膜容易传染某些病源菌或病毒病，如Creutzfeldt-Jakob氏病等缺点。 Martin等和Walles等已检测并证实了猪内源性逆转录病毒可在人细胞内表达 [Neuenschwander S，Hoerstrup SP.Heart valve tissue engineering. Transplant immunology，2004，12(3-4)：359-365.]。因而急需一种新型的无毒、 抗菌、抗病毒和抗炎的交联剂替代戊二醛交联天然瓣膜材料。
以去垢剂、酶消化和超声清洗等方法彻底抽提动物瓣膜的细胞，保留由胶原 蛋白、弹性蛋白、纤粘连蛋白(fibronectin)和层粘连蛋白(laminin)组成的 天然三维支架结构，这种支架结构由于是细胞外基质，含有糖蛋白和蛋白聚糖等 多种功能性蛋白，有较好的生物相容性。另外，这种支架保持了瓣膜天然形态， 不象高分子材料支架需要根据血流动力学塑形[Schmidt CE，Baier JM. Acellular vascular tissue：natural biomaterals for tissue repair and tissue engineering.Biomaterals，2000，21(2000)：2215-2231.]。但是， SYNERGRAFT公司采用这种不经任何交联固定工艺生产的人工瓣膜SYNERGRAFTTM， 在应用于临床后，不但不能在体内原位再生出瓣膜内皮，反而引起强烈的免疫炎 性反应，造成多例病人手术后1-2年内死亡的悲剧[Simon P.，Kasimir M.T.， Seebacher G.et al.Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFTTM in pediatric patients.European Journal of Cardio-thoracic Surgery.23(2003)：1002-1006.]。看来，应用天然脱细胞瓣 膜材料也需要一种新型的无毒、抗菌、抗病毒和抗炎的交联剂对其交联处理。
为克服上述缺陷，交联固定工艺是重要处理方法，人们已找到多种交联剂可 交联处理动物瓣膜支架，如多聚环氧化物(PC)、丙三醇、α-氨基油酸(AOA)、 NO-ReactTM、cyanimide、碳二亚胺(1-ethyl-3(-3 dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC)、adipyl dichlorid、环己二异氰酸盐 (hexamethylene diisocyanate，HMDC)、藻酸叠氮化物(alginate azide)和 藻酸钠(sodium alginate)等[Julie R，Boris AN，Vacanti JP.Tissue engineering：a 21st century solution to surgical reconstruction.Ann thorac surg，2001，72：577-591.，Schmidt CE，Baier JM.Acellular vascular tissue：natural biomaterals for tissue repair and tissue engineering. Biomaterals，2000，21(2000)：2215-2231.]，但是由于其交联效果、交联剂本 身的毒性等原因，使交联所得生物瓣的性能仍不理想。所以仍须寻找到更加适合 的交联剂，使交联处理的瓣膜具有适当的力学特性、较强的稳定性和耐久性、较 低的毒性，利于瓣膜组成细胞的长入，以及能够抗菌、抗病毒、抗炎等。
原花青素是一类广泛存在于水果、蔬菜、花瓣、种子以及树皮中的植物次生 代谢产物，也是红葡萄酒的重要成分，被用作食品、天然抗氧化物和药品等，可 清除自由基、保护心脑血管，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌等活性，其体内代 谢途径清楚，而且没有毒性[Packer L.，Rimbach，and Virgili F.Antioxidant activity and biologic properties of a procyanidin-rich extract from pine (Pinus Maritima)bark，pycnogenol.Free Radical Biology & Medicine，27(5/6)：704-724，1999.]。虽然Nimni等证明原花青素可用来交联牛 肌腱和心包膜等[Bo Han，Jason Jaurequi，Bao Wei Tang，Marcel E.Nimni. Proanthocyanidin：A natural crosslinking reagent for stabilizing collagen matrics.J Biomed Mater Res.65A：118-124，2003.]，但运用原花 青素交联脱细胞心脏瓣膜，制备生物瓣或制备组织工程心脏瓣膜支架材料的工艺 技术尚未见报道。这构成了本发明的创意。
生物瓣是用与人体结构功能相近的动物或人的心脏瓣膜或心包膜加工而成 的瓣膜假体[Schmidt CE，Baier JM.Acellular vascular tissue：natural biomaterals for tissue repair and tissue engineering. Biomaterals，2000，21(2000)：2215-2231.]。就生物瓣来说，同种异体瓣临床 应用成功率较高，但其来源有限；异种瓣虽来源广泛，但有抗原性，必须经过戊 二醛交联处理才能使用。经戊二醛交联的猪主动脉瓣有一定的强度和韧性，基本 保留了猪心脏瓣膜的胶原结构，减少了免疫原性，很大程度上避免了机械瓣置换 后需终身抗凝的缺点。然而将这种瓣膜直接植入体内后，往往会出现严重的钙化， 加之戊二醛处理后戊二醛本身的残留毒性以及瓣膜组织残留的免疫原性，极大地 降低了其体内工作寿命[Schmidt CE，Baier JM.Acellular vascular tissue： natural biomaterals for tissue repair and tissue engineering. Biomaterals，2000，21(2000)：2215-2231.]。另外，不经任何交联固定的脱细 胞人工瓣膜容易传染某些病源菌或病毒病，如Creutzfeldt-Jakob氏病等缺点。 Martin等和Walles等已检测并证实了猪内源性逆转录病毒可在人细胞内表达 [Neuenschwander S，Hoerstrup SP.Heart valve tissue engineering. Transplant immunology，2004，12(3-4)：359-365.]。因而急需一种新型的无毒、 抗菌、抗病毒和抗炎的交联剂替代戊二醛交联天然瓣膜材料。
以去垢剂、酶消化和超声清洗等方法彻底抽提动物瓣膜的细胞，保留由胶原 蛋白、弹性蛋白、纤粘连蛋白(fibronectin)和层粘连蛋白(laminin)组成的 天然三维支架结构，这种支架结构由于是细胞外基质，含有糖蛋白和蛋白聚糖等 多种功能性蛋白，有较好的生物相容性。另外，这种支架保持了瓣膜天然形态， 不象高分子材料支架需要根据血流动力学塑形[Schmidt CE，Baier JM. Acellular vascular tissue：natural biomaterals for tissue repair and tissue engineering.Biomaterals，2000，21(2000)：2215-2231.]。但是， SYNERGRAFT公司采用这种不经任何交联固定工艺生产的人工瓣膜SYNERGRAFTTM， 在应用于临床后，不但不能在体内原位再生出瓣膜内皮，反而引起强烈的免疫炎 性反应，造成多例病人手术后1-2年内死亡的悲剧[Simon P.，Kasimir M.T.， Seebacher G.et al.Early failure of the tissue engineered porcine heart valve SYNERGRAFTTM in pediatric patients.European Journal of Cardio-thoracic Surgery.23(2003)：1002-1006.]。看来，应用天然脱细胞瓣 膜材料也需要一种新型的无毒、抗菌、抗病毒和抗炎的交联剂对其交联处理。
为克服上述缺陷，交联固定工艺是重要处理方法，人们已找到多种交联剂可 交联处理动物瓣膜支架，如多聚环氧化物(PC)、丙三醇、α-氨基油酸(AOA)、 NO-ReactTM、cyanimide、碳二亚胺(1-ethyl-3(-3 dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDC)、adipyl dichlorid、环己二异氰酸盐 (hexamethylene diisocyanate，HMDC)、藻酸叠氮化物(alginate azide)和 藻酸钠(sodium alginate)等[Julie R，Boris AN，Vacanti JP.Tissue engineering：a 21st century solution to surgical reconstruction.Ann thorac surg，2001，72：577-591.，Schmidt CE，Baier JM.Acellular vascular tissue：natural biomaterals for tissue repair and tissue engineering. Biomaterals，2000，21(2000)：2215-2231.]，但是由于其交联效果、交联剂本 身的毒性等原因，使交联所得生物瓣的性能仍不理想。所以仍须寻找到更加适合 的交联剂，使交联处理的瓣膜具有适当的力学特性、较强的稳定性和耐久性、较 低的毒性，利于瓣膜组成细胞的长入，以及能够抗菌、抗病毒、抗炎等。
原花青素是一类广泛存在于水果、蔬菜、花瓣、种子以及树皮中的植物次生 代谢产物，也是红葡萄酒的重要成分，被用作食品、天然抗氧化物和药品等，可 清除自由基、保护心脑血管，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗癌等活性，其体内代 谢途径清楚，而且没有毒性[Packer L.，Rimbach，and Virgili F.Antioxidant activity and biologic properties of a procyanidin-rich extract from pine (Pinus Maritima)bark，pycnogenol.Free Radical Biology & Medicine，27(5/6)：704-724，1999.]。虽然Nimni等证明原花青素可用来交联牛 肌腱和心包膜等[Bo Han，Jason Jaurequi，Bao Wei Tang，Marcel E.Nimni. Proanthocyanidin：A natural crosslinking reagent for stabilizing collagen matrics.J Biomed Mater Res.65A：118-124，2003.]，但运用原花 青素交联脱细胞心脏瓣膜，制备生物瓣或制备组织工程心脏瓣膜支架材料的工艺 技术尚未见报道。这构成了本发明的创意。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有生物活性的人工生物瓣瓣膜的制备方法，本 发明旨在通过采用原花青素作为新型交联剂交联脱细胞心脏瓣膜，提供一种具有 生物活性的生物瓣膜，使之具有力学特性、稳定性、耐久性和生物相容性优良， 且没有毒性等优点，以满足新一代生物瓣膜研制和生产的需要。
本发明是以动物心脏瓣膜为原料，以化学方法脱去动物或心脏瓣膜的细胞， 得到瓣膜脱细胞的胞外基质作为交联对象，将瓣膜胞外基质浸入不同浓度、不同 比例的原花青素溶液中，在不同温度条件下，摇动交联一定时间，可以得到最大 抗拉强度在8.0Mpa以上、明显高于新鲜猪瓣或戊二醛交联处理的猪瓣抗拉强度 的瓣膜材料，其稳定性高、抗酶解能力强、交联剂释放没有毒性。通过调节交联 剂原花青素的浓度、交联温度、摇动速度、交联时间和交联后的保存方法，可调 控瓣膜或支架的力学强度、抗酶解能力、交联剂释放速度、促进组织再生能力等。 本发明所使用的交联剂原花青素，其交联对象还可为一切含胶原蛋白成分的人工 或天然材料。交联所得脱细胞瓣膜材料，既可直接用作人工生物瓣瓣膜，也可用 作组织工程心脏瓣膜支架，以便用于心脏瓣膜进一步制备或构建、临床置换、修 复和再生。原花青素本身不但有交联作用，而且还具有清除自由基、抗氧化、抗 癌、抗炎症、心脑血管保护和促进组织再生功效。采用本发明提供的方法，可以 根据不同的组织损伤程度，在修复时对生物瓣瓣膜或组织工程心脏瓣膜支架的不 同要求，制备出具有不同特性的产品，以满足临床应用的需要。
本发明所述的具有生物活性的人工生物瓣膜的制备方法，包括交联前处理\ 交联过程以及交联后处理和保存.现分述如下：
1交联前处理工艺
该工艺目的在于获得充分清洗过的脱细胞心脏瓣膜，包括二步：
1)心脏瓣膜原材料收集和脱细胞处理
本发明是以脱细胞猪心脏瓣膜或脱细胞人异体心脏瓣膜为交联对象的。在屠 宰场将刚宰杀的猪心脏内主动脉瓣膜或肺动脉瓣膜连同周围血管剪下，置于无 Ca2+、Mg2+离子的磷酸缓冲溶液(即D-Hanks液，配方见表1)中于4℃下1小时 内带回，立即小心剪取瓣膜叶片，用D-Hanks液清洗干净，按下列方法脱细胞：
脱细胞液分A液和B液，都以D-Hanks液配制。瓣膜分两步脱细胞，第一步 用A液，第二步用B液。每一步均按每片瓣膜加入2-20ml的比例加入。A液和 B液的配方如下：
脱细胞液A液可用以下三种溶液配方(1)、(2)、(3)中的任一种。
配方(1)含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二钠 (Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA)。
配方(2)含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.5％非离子去垢剂聚乙二醇辛基苯基 醚(4-(1，1，3，3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol，商品名为 Triton X-100)、0.5％脱氧胆酸钠和0.02％EDTA。
配方(3)含0.5％Triton X-100、0.5％脱氧胆酸钠和0.02％EDTA。
以上3个配方中所含的胰蛋白酶等均为质量百分比，即每100ml中含有的质 量数。
脱细胞液B液配方为D-Hanks液配制的20μg/ml的核酸酶(RNase)和0.2 mg/ml的脱氧核酸酶(DNase)混合液。
表1.无Ca2+、Mg2+离子的磷酸缓冲溶液配方(即D-Hanks溶液)。 成分 用量(g/L) KCl KH2PO4 NaCl NaHCO3 Na2HPO4·7H2O 酚红 0.4 40.06 8.00 0.35 0.09 0或0.01
用作制备人工生物瓣瓣膜的动物或人异体心脏瓣膜脱细胞所需要的条件：温 度为1-40℃，优选为20-37℃；摇床摇动速度为0-300rpm(包括不摇动)，优 选为120-240rpm；空气湿度为30％-95％，优选为50％-95％；CO2浓度为0.3％ -5％，优选为0.3％或5％；时间为10分钟-100小时，优选为1-48小时。
2)交联前处理
经上述脱细胞处理后，再按以下方法作交联前处理：将每片瓣膜浸泡于 5-10ml的D-Hanks液清洗。清洗所需要的条件：摇床摇动速度0-300rpm(包括 不摇动)，优选为120-240rpm；时间为0.5-480小时，为48-240小时；每 天更换D-Hanks液。
2交联过程
将用上述方法充分清洗过的脱细胞心脏瓣膜，按每片瓣膜浸泡于1-20ml的 0.01-20mg/ml(质量-体积比)的比例配制的原花青素D-Hanks液溶液，作脱 细胞心脏瓣膜交联；优选的比例为每片瓣膜浸泡于1-10ml的0.06-10mg/ml(质 量-体积比)原花青素的D-Hanks液的比例。交联脱细胞心脏瓣膜的温度1-40℃， 优选为20-37℃。交联在摇床摇动条件下完成，其摇动速度优选为10-300rpm， 优选为60-120rpm。交联时间为1分钟-240小时，优选为0.5-48小时。
3交联后处理和保存
所交联的脱细胞动物心脏瓣膜，在交联过后以每片瓣膜加2-20ml的比例加 入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，清洗0-480小时(包括不清洗)，优选清洗时间为5 分钟-1小时。清洗在1-40℃、优选温度为20-37℃、摇床在0-300rpm(包括 不摇动)摇动条件下完成，其摇动速度优选60-120rpm。按此方法即可制得具 有上述特征的人工生物瓣瓣膜材料或组织工程心脏瓣膜支架。保存在1-10℃的 D-Hanks液中直至使用。最佳保存的温度为4℃。
本发明所述的采用原花青素交联方法制备具有生物活性人工生物瓣膜性能 是用下述四种方法进行评价的。
1扫描电镜观察
按上述方法制备的脱细胞心脏瓣膜经2.5％戊二醛固定后，再经50％、80％、 95％和100％乙醇脱水，以及6-甲基二硅烷(hexamethyldisilanzane，HMDS)干 燥处理，扫描电镜观察脱细胞后的瓣膜胞外基质形态和脱细胞是否全面。
2最大抗拉强度测定
将本发明所制备的不同浓度原花青素交联的瓣叶，沿纤维方向剪成4mm宽、 25mm长的条带。每片瓣叶剪取一条，每个浓度6条。检测在SHIMADZU万能力 学测试机上进行，拉伸速率为2mm/min。
3交联稳定性检测
3.1力学稳定性检测
将本发明所制备的以10mg/ml浓度原花青素交联的瓣叶，浸泡于D-Hanks 液中，每天更换D-Hanks液。分别于不同浸泡时间后，取出瓣叶，按2.2中 所述方法测定最大抗拉强度。
3.2抗酶解能力检测
将本发明所制备的不同浓度原花青素交联的瓣叶，浸泡于以D-Hanks液 配制的浓度为1000U/ml的2型胶原酶液中，于37℃、120rpm摇动条件下， 酶解消化1、3、7和24小时，测定各浓度原花青素交联的瓣叶重量(Wt)， 按下式计算各浓度原花青素交联的瓣叶相对于原重(W0)减少的百分率(即 酶解消化率，ΔW％)。
ΔW％＝(W0-Wt)/W0×100
ΔW％值越大，则抗酶解能力越小。
3.3交联后交联剂释放速率测定
将本发明所制备的以10mg/ml浓度原花青素交联的瓣叶，浸泡于D-Hanks 液中，于37℃、5％CO2环境中保存，每天更换D-Hanks液，使交联剂原花青素 释放。将更换的含有释放出原花青素的D-Hanks液，用分光光度计测定吸光 度，依据标准曲线计算出释放浓度。具体方法：取1ml待测原花青素式样加 入12％香兰素的甲醇溶液3ml，再加入1.2M的HCl的甲醇溶液6ml混合， 25分钟后将混合液分4等份在波长为500nm处测定吸光度。
4交联剂对瓣膜间质细胞增殖潜力和毒性的检测
4.1瓣膜间质细胞培养
取新鲜的出生不到24小时的小牛心脏主动脉瓣膜叶片，刮去内皮细胞， 剪成1-2mm2的小块，用以无血清的M199培养液配制的浓度为2mg/ml的II 型胶原酶液，37℃、120rpm摇动条件下消化1小时，所得细胞用含20％胎牛 血清的M199培养液，在37℃、5％CO2环境中培养，每2-3天换液一次，以2-4 代细胞用于实验。
4.2原花青素对细胞增殖潜力抑制和细胞毒性的检测
将瓣膜间质细胞以每孔1000细胞的密度接种于96孔板，1天后换成含 不同浓度原花青素的上述培养液培养6天，用MTT法检测细胞活力。具体方 法是，培养到期后，培养经清洗，加入含0.5mg/ml的MTT无血清的细胞培 养液100μl/孔，继续在正常条件下培养4小时，弃去培养液，加入100μl 二甲亚砜充分溶解紫色物质，分光光度计上490nm波长检测吸光度值，依据 标准曲线推算出细胞数。活力越高则细胞数越多，细胞增殖潜力抑制就越小； 保持原细胞数的原花青素浓度越高，则毒性越小。
本发明使用原花青素作为交联剂交联脱细胞心脏瓣膜，直接制备生物瓣或制 备组织工程心脏瓣膜支架，与戊二醛交联效果相比，具有力学特性、稳定性、耐 久性和生物相容性优良，且没有毒性等优点，加上原花青素本身的抗菌、抗病毒、 抗炎、抗癌和心脑血管保护等活性，使得运用本发明工艺技术直接制备的生物瓣 材料具有极好的应用前景。同时，本发明的工艺简单易行，而且容易实施和推广。
综上所述，本发明的具有力学强度、抗酶解能力、交联剂释放速度、促进组 织再生能力等可调控的生物瓣瓣膜，作为人体病损心脏瓣膜损伤修复材料或组织 工程心脏瓣膜支架具有独特优势。
附图说明
图1为猪心脏主动脉瓣膜在脱细胞后经过本发明方法清洗后的扫描电镜照 片。
图2为本发明所用交联剂原花青素交联的脱细胞瓣膜的光学显微镜照片。
图3为本发明所用交联剂原花青素所交联的脱细胞瓣膜(浓度为2.5mg/ml、 5mg/ml、10mg/ml到20mg/ml)与戊二醛(6.25mg/ml)交联的脱细胞瓣膜、 不交联的脱细胞瓣膜(0mg/ml)以及新鲜瓣膜的最大抗拉强度比较。图中“*” 表示p＜0.05，组间有显著差异
图4为本发明所用原花青素以10mg/ml浓度交联的脱细胞瓣膜在D-Hanks 液中浸泡不同天数后的最大抗拉强度变化。
图5为本发明所用原花青素以不同浓度(2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml 和20mg/ml)交联的脱细胞瓣膜和戊二醛交联的脱细胞瓣膜(6.25mg/ml)、以 及不交联的脱细胞瓣膜(0mg/ml)在不同时间(1、2、4和24小时)的抗胶原 酶降解能力比较图。
图6为本发明所用原花青素交联的脱细胞瓣膜在D-Hanks液中浸泡45天时， 交联剂原花青素释放过程。图中右上角是原花青素吸光度-浓度标准曲线。
图7为本发明所使用的交联剂原花青素对瓣膜间质细胞的增殖潜力抑制和 毒性试验结果。图中“*”表示p＜0.05，组间有显著差异。
图8为本发明所用原花青素按每片瓣膜加入20ml、0.0625mg/ml浓度、4℃ 下、120rpm摇动交联240小时的脱细胞瓣膜
图9为本发明所用原花青素按5mg/ml浓度、每片瓣膜加入20ml、37℃、以 120rpm摇动条件下，分别交联0.5、1、3和7小时的脱细胞瓣膜(依次为2、3、 4、5，图中瓣膜1为未交联的脱细胞瓣膜)。
本发明是以动物心脏瓣膜为原料，以化学方法脱去动物或心脏瓣膜的细胞， 得到瓣膜脱细胞的胞外基质作为交联对象，将瓣膜胞外基质浸入不同浓度、不同 比例的原花青素溶液中，在不同温度条件下，摇动交联一定时间，可以得到最大 抗拉强度在8.0Mpa以上、明显高于新鲜猪瓣或戊二醛交联处理的猪瓣抗拉强度 的瓣膜材料，其稳定性高、抗酶解能力强、交联剂释放没有毒性。通过调节交联 剂原花青素的浓度、交联温度、摇动速度、交联时间和交联后的保存方法，可调 控瓣膜或支架的力学强度、抗酶解能力、交联剂释放速度、促进组织再生能力等。 本发明所使用的交联剂原花青素，其交联对象还可为一切含胶原蛋白成分的人工 或天然材料。交联所得脱细胞瓣膜材料，既可直接用作人工生物瓣瓣膜，也可用 作组织工程心脏瓣膜支架，以便用于心脏瓣膜进一步制备或构建、临床置换、修 复和再生。原花青素本身不但有交联作用，而且还具有清除自由基、抗氧化、抗 癌、抗炎症、心脑血管保护和促进组织再生功效。采用本发明提供的方法，可以 根据不同的组织损伤程度，在修复时对生物瓣瓣膜或组织工程心脏瓣膜支架的不 同要求，制备出具有不同特性的产品，以满足临床应用的需要。
本发明所述的具有生物活性的人工生物瓣膜的制备方法，包括交联前处理\ 交联过程以及交联后处理和保存.现分述如下：
1交联前处理工艺
该工艺目的在于获得充分清洗过的脱细胞心脏瓣膜，包括二步：
1)心脏瓣膜原材料收集和脱细胞处理
本发明是以脱细胞猪心脏瓣膜或脱细胞人异体心脏瓣膜为交联对象的。在屠 宰场将刚宰杀的猪心脏内主动脉瓣膜或肺动脉瓣膜连同周围血管剪下，置于无 Ca2+、Mg2+离子的磷酸缓冲溶液(即D-Hanks液，配方见表1)中于4℃下1小时 内带回，立即小心剪取瓣膜叶片，用D-Hanks液清洗干净，按下列方法脱细胞：
脱细胞液分A液和B液，都以D-Hanks液配制。瓣膜分两步脱细胞，第一步 用A液，第二步用B液。每一步均按每片瓣膜加入2-20ml的比例加入。A液和 B液的配方如下：
脱细胞液A液可用以下三种溶液配方(1)、(2)、(3)中的任一种。
配方(1)含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.02％乙二胺四乙酸二钠 (Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA)。
配方(2)含0.05％或0.1％胰蛋白酶、0.5％非离子去垢剂聚乙二醇辛基苯基 醚(4-(1，1，3，3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol，商品名为 Triton X-100)、0.5％脱氧胆酸钠和0.02％EDTA。
配方(3)含0.5％Triton X-100、0.5％脱氧胆酸钠和0.02％EDTA。
以上3个配方中所含的胰蛋白酶等均为质量百分比，即每100ml中含有的质 量数。
脱细胞液B液配方为D-Hanks液配制的20μg/ml的核酸酶(RNase)和0.2 mg/ml的脱氧核酸酶(DNase)混合液。
表1.无Ca2+、Mg2+离子的磷酸缓冲溶液配方(即D-Hanks溶液)。 成分 用量(g/L) KCl KH2PO4 NaCl NaHCO3 Na2HPO4·7H2O 酚红 0.4 40.06 8.00 0.35 0.09 0或0.01
用作制备人工生物瓣瓣膜的动物或人异体心脏瓣膜脱细胞所需要的条件：温 度为1-40℃，优选为20-37℃；摇床摇动速度为0-300rpm(包括不摇动)，优 选为120-240rpm；空气湿度为30％-95％，优选为50％-95％；CO2浓度为0.3％ -5％，优选为0.3％或5％；时间为10分钟-100小时，优选为1-48小时。
2)交联前处理
经上述脱细胞处理后，再按以下方法作交联前处理：将每片瓣膜浸泡于 5-10ml的D-Hanks液清洗。清洗所需要的条件：摇床摇动速度0-300rpm(包括 不摇动)，优选为120-240rpm；时间为0.5-480小时，为48-240小时；每 天更换D-Hanks液。
2交联过程
将用上述方法充分清洗过的脱细胞心脏瓣膜，按每片瓣膜浸泡于1-20ml的 0.01-20mg/ml(质量-体积比)的比例配制的原花青素D-Hanks液溶液，作脱 细胞心脏瓣膜交联；优选的比例为每片瓣膜浸泡于1-10ml的0.06-10mg/ml(质 量-体积比)原花青素的D-Hanks液的比例。交联脱细胞心脏瓣膜的温度1-40℃， 优选为20-37℃。交联在摇床摇动条件下完成，其摇动速度优选为10-300rpm， 优选为60-120rpm。交联时间为1分钟-240小时，优选为0.5-48小时。
3交联后处理和保存
所交联的脱细胞动物心脏瓣膜，在交联过后以每片瓣膜加2-20ml的比例加 入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，清洗0-480小时(包括不清洗)，优选清洗时间为5 分钟-1小时。清洗在1-40℃、优选温度为20-37℃、摇床在0-300rpm(包括 不摇动)摇动条件下完成，其摇动速度优选60-120rpm。按此方法即可制得具 有上述特征的人工生物瓣瓣膜材料或组织工程心脏瓣膜支架。保存在1-10℃的 D-Hanks液中直至使用。最佳保存的温度为4℃。
本发明所述的采用原花青素交联方法制备具有生物活性人工生物瓣膜性能 是用下述四种方法进行评价的。
1扫描电镜观察
按上述方法制备的脱细胞心脏瓣膜经2.5％戊二醛固定后，再经50％、80％、 95％和100％乙醇脱水，以及6-甲基二硅烷(hexamethyldisilanzane，HMDS)干 燥处理，扫描电镜观察脱细胞后的瓣膜胞外基质形态和脱细胞是否全面。
2最大抗拉强度测定
将本发明所制备的不同浓度原花青素交联的瓣叶，沿纤维方向剪成4mm宽、 25mm长的条带。每片瓣叶剪取一条，每个浓度6条。检测在SHIMADZU万能力 学测试机上进行，拉伸速率为2mm/min。
3交联稳定性检测
3.1力学稳定性检测
将本发明所制备的以10mg/ml浓度原花青素交联的瓣叶，浸泡于D-Hanks 液中，每天更换D-Hanks液。分别于不同浸泡时间后，取出瓣叶，按2.2中 所述方法测定最大抗拉强度。
3.2抗酶解能力检测
将本发明所制备的不同浓度原花青素交联的瓣叶，浸泡于以D-Hanks液 配制的浓度为1000U/ml的2型胶原酶液中，于37℃、120rpm摇动条件下， 酶解消化1、3、7和24小时，测定各浓度原花青素交联的瓣叶重量(Wt)， 按下式计算各浓度原花青素交联的瓣叶相对于原重(W0)减少的百分率(即 酶解消化率，ΔW％)。
ΔW％＝(W0-Wt)/W0×100
ΔW％值越大，则抗酶解能力越小。
3.3交联后交联剂释放速率测定
将本发明所制备的以10mg/ml浓度原花青素交联的瓣叶，浸泡于D-Hanks 液中，于37℃、5％CO2环境中保存，每天更换D-Hanks液，使交联剂原花青素 释放。将更换的含有释放出原花青素的D-Hanks液，用分光光度计测定吸光 度，依据标准曲线计算出释放浓度。具体方法：取1ml待测原花青素式样加 入12％香兰素的甲醇溶液3ml，再加入1.2M的HCl的甲醇溶液6ml混合， 25分钟后将混合液分4等份在波长为500nm处测定吸光度。
4交联剂对瓣膜间质细胞增殖潜力和毒性的检测
4.1瓣膜间质细胞培养
取新鲜的出生不到24小时的小牛心脏主动脉瓣膜叶片，刮去内皮细胞， 剪成1-2mm2的小块，用以无血清的M199培养液配制的浓度为2mg/ml的II 型胶原酶液，37℃、120rpm摇动条件下消化1小时，所得细胞用含20％胎牛 血清的M199培养液，在37℃、5％CO2环境中培养，每2-3天换液一次，以2-4 代细胞用于实验。
4.2原花青素对细胞增殖潜力抑制和细胞毒性的检测
将瓣膜间质细胞以每孔1000细胞的密度接种于96孔板，1天后换成含 不同浓度原花青素的上述培养液培养6天，用MTT法检测细胞活力。具体方 法是，培养到期后，培养经清洗，加入含0.5mg/ml的MTT无血清的细胞培 养液100μl/孔，继续在正常条件下培养4小时，弃去培养液，加入100μl 二甲亚砜充分溶解紫色物质，分光光度计上490nm波长检测吸光度值，依据 标准曲线推算出细胞数。活力越高则细胞数越多，细胞增殖潜力抑制就越小； 保持原细胞数的原花青素浓度越高，则毒性越小。
本发明使用原花青素作为交联剂交联脱细胞心脏瓣膜，直接制备生物瓣或制 备组织工程心脏瓣膜支架，与戊二醛交联效果相比，具有力学特性、稳定性、耐 久性和生物相容性优良，且没有毒性等优点，加上原花青素本身的抗菌、抗病毒、 抗炎、抗癌和心脑血管保护等活性，使得运用本发明工艺技术直接制备的生物瓣 材料具有极好的应用前景。同时，本发明的工艺简单易行，而且容易实施和推广。
综上所述，本发明的具有力学强度、抗酶解能力、交联剂释放速度、促进组 织再生能力等可调控的生物瓣瓣膜，作为人体病损心脏瓣膜损伤修复材料或组织 工程心脏瓣膜支架具有独特优势。
附图说明
图1为猪心脏主动脉瓣膜在脱细胞后经过本发明方法清洗后的扫描电镜照 片。
图2为本发明所用交联剂原花青素交联的脱细胞瓣膜的光学显微镜照片。
图3为本发明所用交联剂原花青素所交联的脱细胞瓣膜(浓度为2.5mg/ml、 5mg/ml、10mg/ml到20mg/ml)与戊二醛(6.25mg/ml)交联的脱细胞瓣膜、 不交联的脱细胞瓣膜(0mg/ml)以及新鲜瓣膜的最大抗拉强度比较。图中“*” 表示p＜0.05，组间有显著差异
图4为本发明所用原花青素以10mg/ml浓度交联的脱细胞瓣膜在D-Hanks 液中浸泡不同天数后的最大抗拉强度变化。
图5为本发明所用原花青素以不同浓度(2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml 和20mg/ml)交联的脱细胞瓣膜和戊二醛交联的脱细胞瓣膜(6.25mg/ml)、以 及不交联的脱细胞瓣膜(0mg/ml)在不同时间(1、2、4和24小时)的抗胶原 酶降解能力比较图。
图6为本发明所用原花青素交联的脱细胞瓣膜在D-Hanks液中浸泡45天时， 交联剂原花青素释放过程。图中右上角是原花青素吸光度-浓度标准曲线。
图7为本发明所使用的交联剂原花青素对瓣膜间质细胞的增殖潜力抑制和 毒性试验结果。图中“*”表示p＜0.05，组间有显著差异。
图8为本发明所用原花青素按每片瓣膜加入20ml、0.0625mg/ml浓度、4℃ 下、120rpm摇动交联240小时的脱细胞瓣膜
图9为本发明所用原花青素按5mg/ml浓度、每片瓣膜加入20ml、37℃、以 120rpm摇动条件下，分别交联0.5、1、3和7小时的脱细胞瓣膜(依次为2、3、 4、5，图中瓣膜1为未交联的脱细胞瓣膜)。
具体实施方式
通过下面具体实施例介绍，以进一步阐明本发明的实质性特点和显著的进步， 但本发明决非仅局限于实施例。
实施例1
脱细胞猪心脏主动脉瓣膜制备方法按前述方法制备，图1显示猪心脏主动脉 瓣膜细胞及其成分已经脱洗干净，胞外基质保留完好。以每片瓣膜加2ml的比 例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、240rpm摇动清洗0.5小时。然后以 每片瓣膜加2ml的比例加入10mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡，120rpm 的摇动速度，37℃下交联48小时。再以每片瓣膜加2ml的比例加入D-Hanks 溶液浸泡瓣膜，在37℃下、120rpm摇动清洗240小时，每24小时换液一次。 这样所制得的本发明的人工生物瓣瓣膜材料，作上述性能评价，图2中1为6.25 mg/ml戊二醛交联的脱细胞瓣膜，有较明显的皱缩，而图中2、3、4和5为本发 明所用交联剂原花青素以2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml到20mg/ml浓度交联 的脱细胞瓣膜，交联后柔润而不皱缩。图3显示原花青素交联的脱细胞瓣膜最大 抗拉强度为11MPa，优于戊二醛交联的脱细胞瓣膜，也优于不交联的脱细胞瓣 膜。图4显示原花青素交联后的脱细胞瓣膜在D-Hanks液中浸泡45天时最大抗 拉强度与刚交联结束时的相近，没有减小。表明本发明所用交联剂原花青素对脱 细胞瓣膜交联的稳定性良好。图5显示本发明的不同浓度原花青素交联的脱细胞 瓣膜和戊二醛交联的脱细胞瓣膜，均有较强的抗酶解能力。相对于不交联的脱细 胞瓣膜，两种交联剂交联的脱细胞瓣膜的降解率都很低，表明脱细胞瓣膜的组成 分子分别被原花青素和戊二醛交联修饰。原花青素酶降解率仅为6.94％，说明原 花青素具有良好的交联作用，效果良好。图6显示原花青素交联的脱细胞瓣膜在 交联后释放原花青素主要集中在前期4天内，浓度由234.6μg/ml下降为3.2μ g/ml。这可能是由于交联过程中剩余的过量原花青素在清洗后少量残留引起的。 4天之后释放量极小，这可能是交联后力学强度稳定性良好的原因。图7显示本 发明所使用的交联剂原花青素在浓度为125μg/ml以下时对瓣膜间质细胞的增 殖潜力没有抑制，甚至反有促进，在浓度大于250μg/ml时细胞数量小于初时 接种数，表现有毒性；而戊二醛直到浓度为0.0313μg/ml时才对瓣膜间质细胞 的增殖潜力没有抑制，浓度为0.313μg/ml时已有明显抑制，在浓度大于2.5μ g/ml时细胞数量小于初时接种数，表现有毒性。该结果显示原花青素对瓣膜间 质细胞的增殖潜力抑制较戊二醛小40000倍(125∶0.0313)，毒性小100倍(250∶ 2.5)。残余交联剂原花青素在4天内的释放量在其毒性范围以下，无任何毒性。
实施例2
脱细胞猪心脏主动脉瓣膜制备方法按前述方法制备，以每片瓣膜加2ml的 比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、以240rpm摇动清洗0.5小时。 然后以每片瓣膜加20ml的比例加入0.0625mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸 泡，以120rpm的摇动速度，4℃下交联120小时。再以每片瓣膜加2ml的比 例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、以240rpm摇动清洗24小。可以制 得本发明的人工生物瓣瓣膜材料，其最大抗拉强度为8.8MPa，酶降解率为 14.69％，交联剂可在1天内基本释放且无任何毒性。图8中瓣膜1和2显示交联 完成后不皱缩，稳定性良好，可保存在4℃下或37℃下D-Hanks溶液中至少45 天。
实施例3：
脱细胞猪心脏主动脉瓣膜制备方法按前述方法制备，以每片瓣膜加8ml的 比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、静止不摇动(0rpm)状态下清洗 96小时。然后以每片瓣膜加10ml的比例加入0.625mg/ml原花青素的D-Hanks 溶液浸泡，以120rpm的摇动速度，4℃下交联144小时。以每片瓣膜加8ml 的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在4℃下、手工晃动清洗10分钟。这样所 制得的本发明的人工生物瓣瓣膜材料，作前述性能评价，其最大抗拉强度为11.6 MPa，酶降解率为9.24％，交联剂可在1天内基本释放且无任何毒性。图8中瓣 膜3和4显示交联完成后不皱缩，稳定性良好，可保存在4℃下或37℃下D-Hanks 溶液中至少45天。
实施例4：
脱细胞猪心脏主动脉瓣膜制备方法按实施例3方法制备、清洗。然后以每片 瓣膜加2ml的比例加入10mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡，以120rpm 的摇动速度，37℃下交联3分钟。再以每片瓣膜加2ml的比例加入D-Hanks溶 液浸泡瓣膜，在37℃下、120rpm摇动清洗1小时。也可制得本发明的人工生物 瓣瓣膜材料，其最大抗拉强度为9.4Mpa，酶降解率为8.98％，交联剂可在1天 内基本释放且无任何毒性。图8中瓣膜6显示交联完成后不皱缩，稳定性良好， 可保存在4℃下或37℃下D-Hanks溶液中至少45天。
实施例5：
脱细胞猪心脏主动脉瓣膜制备方法按实施例3方法制备、清洗。然后以每片 瓣膜加20ml的比例加入5mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡，以120rpm 的摇动速度，37℃下分别交联0.5、1、3和7小时。再按实施例3方法作交联后 清洗。也可制得本发明的人工生物瓣瓣膜材料，其最大抗拉强度为9.4Mpa，酶 降解率为8.89％，交联剂可在1天内基本释放且无任何毒性。图9显示交联完成 后不皱缩，稳定性良好，可保存在4℃下或37℃下D-Hanks溶液中至少45天。
实施例1
脱细胞猪心脏主动脉瓣膜制备方法按前述方法制备，图1显示猪心脏主动脉 瓣膜细胞及其成分已经脱洗干净，胞外基质保留完好。以每片瓣膜加2ml的比 例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、240rpm摇动清洗0.5小时。然后以 每片瓣膜加2ml的比例加入10mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡，120rpm 的摇动速度，37℃下交联48小时。再以每片瓣膜加2ml的比例加入D-Hanks 溶液浸泡瓣膜，在37℃下、120rpm摇动清洗240小时，每24小时换液一次。 这样所制得的本发明的人工生物瓣瓣膜材料，作上述性能评价，图2中1为6.25 mg/ml戊二醛交联的脱细胞瓣膜，有较明显的皱缩，而图中2、3、4和5为本发 明所用交联剂原花青素以2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml到20mg/ml浓度交联 的脱细胞瓣膜，交联后柔润而不皱缩。图3显示原花青素交联的脱细胞瓣膜最大 抗拉强度为11MPa，优于戊二醛交联的脱细胞瓣膜，也优于不交联的脱细胞瓣 膜。图4显示原花青素交联后的脱细胞瓣膜在D-Hanks液中浸泡45天时最大抗 拉强度与刚交联结束时的相近，没有减小。表明本发明所用交联剂原花青素对脱 细胞瓣膜交联的稳定性良好。图5显示本发明的不同浓度原花青素交联的脱细胞 瓣膜和戊二醛交联的脱细胞瓣膜，均有较强的抗酶解能力。相对于不交联的脱细 胞瓣膜，两种交联剂交联的脱细胞瓣膜的降解率都很低，表明脱细胞瓣膜的组成 分子分别被原花青素和戊二醛交联修饰。原花青素酶降解率仅为6.94％，说明原 花青素具有良好的交联作用，效果良好。图6显示原花青素交联的脱细胞瓣膜在 交联后释放原花青素主要集中在前期4天内，浓度由234.6μg/ml下降为3.2μ g/ml。这可能是由于交联过程中剩余的过量原花青素在清洗后少量残留引起的。 4天之后释放量极小，这可能是交联后力学强度稳定性良好的原因。图7显示本 发明所使用的交联剂原花青素在浓度为125μg/ml以下时对瓣膜间质细胞的增 殖潜力没有抑制，甚至反有促进，在浓度大于250μg/ml时细胞数量小于初时 接种数，表现有毒性；而戊二醛直到浓度为0.0313μg/ml时才对瓣膜间质细胞 的增殖潜力没有抑制，浓度为0.313μg/ml时已有明显抑制，在浓度大于2.5μ g/ml时细胞数量小于初时接种数，表现有毒性。该结果显示原花青素对瓣膜间 质细胞的增殖潜力抑制较戊二醛小40000倍(125∶0.0313)，毒性小100倍(250∶ 2.5)。残余交联剂原花青素在4天内的释放量在其毒性范围以下，无任何毒性。
实施例2
脱细胞猪心脏主动脉瓣膜制备方法按前述方法制备，以每片瓣膜加2ml的 比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、以240rpm摇动清洗0.5小时。 然后以每片瓣膜加20ml的比例加入0.0625mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸 泡，以120rpm的摇动速度，4℃下交联120小时。再以每片瓣膜加2ml的比 例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、以240rpm摇动清洗24小。可以制 得本发明的人工生物瓣瓣膜材料，其最大抗拉强度为8.8MPa，酶降解率为 14.69％，交联剂可在1天内基本释放且无任何毒性。图8中瓣膜1和2显示交联 完成后不皱缩，稳定性良好，可保存在4℃下或37℃下D-Hanks溶液中至少45 天。
实施例3：
脱细胞猪心脏主动脉瓣膜制备方法按前述方法制备，以每片瓣膜加8ml的 比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在37℃下、静止不摇动(0rpm)状态下清洗 96小时。然后以每片瓣膜加10ml的比例加入0.625mg/ml原花青素的D-Hanks 溶液浸泡，以120rpm的摇动速度，4℃下交联144小时。以每片瓣膜加8ml 的比例加入D-Hanks溶液浸泡瓣膜，在4℃下、手工晃动清洗10分钟。这样所 制得的本发明的人工生物瓣瓣膜材料，作前述性能评价，其最大抗拉强度为11.6 MPa，酶降解率为9.24％，交联剂可在1天内基本释放且无任何毒性。图8中瓣 膜3和4显示交联完成后不皱缩，稳定性良好，可保存在4℃下或37℃下D-Hanks 溶液中至少45天。
实施例4：
脱细胞猪心脏主动脉瓣膜制备方法按实施例3方法制备、清洗。然后以每片 瓣膜加2ml的比例加入10mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡，以120rpm 的摇动速度，37℃下交联3分钟。再以每片瓣膜加2ml的比例加入D-Hanks溶 液浸泡瓣膜，在37℃下、120rpm摇动清洗1小时。也可制得本发明的人工生物 瓣瓣膜材料，其最大抗拉强度为9.4Mpa，酶降解率为8.98％，交联剂可在1天 内基本释放且无任何毒性。图8中瓣膜6显示交联完成后不皱缩，稳定性良好， 可保存在4℃下或37℃下D-Hanks溶液中至少45天。
实施例5：
脱细胞猪心脏主动脉瓣膜制备方法按实施例3方法制备、清洗。然后以每片 瓣膜加20ml的比例加入5mg/ml原花青素的D-Hanks溶液浸泡，以120rpm 的摇动速度，37℃下分别交联0.5、1、3和7小时。再按实施例3方法作交联后 清洗。也可制得本发明的人工生物瓣瓣膜材料，其最大抗拉强度为9.4Mpa，酶 降解率为8.89％，交联剂可在1天内基本释放且无任何毒性。图9显示交联完成 后不皱缩，稳定性良好，可保存在4℃下或37℃下D-Hanks溶液中至少45天。
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